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KR101806567B1 - 매우 순수한 신경독을 제조하기 위한 수단 및 방법 - Google Patents

매우 순수한 신경독을 제조하기 위한 수단 및 방법 Download PDF

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KR101806567B1
KR101806567B1 KR1020117021889A KR20117021889A KR101806567B1 KR 101806567 B1 KR101806567 B1 KR 101806567B1 KR 1020117021889 A KR1020117021889 A KR 1020117021889A KR 20117021889 A KR20117021889 A KR 20117021889A KR 101806567 B1 KR101806567 B1 KR 101806567B1
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메르츠 파마 게엠베하 운트 코. 카가아
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Abstract

본 발명은 미처리된 및/또는 부분적으로 처리된 신경독 폴리펩티드에 특이적으로 결합한 항체 또는 SEQ ID NOs: 1 내지 16 중 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩티드로 이루어진 에피토프에 특이적으로 결합한 항체 및 이러한 항체의 제조방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 미처리된 또는 부분적으로 처리된 신경독 폴리펩티드를 함유하지 않는 처리된 신경독 폴리펩티드를 포함한 조성물 및 본 발명의 항체에 기초한 상기 신경독 폴리펩티드의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명은 미처리된 또는 부분적으로 처리된 신경독 폴리펩티드로부터 처리된 신경독 폴리펩티드를 분리하거나 미처리된 또는 부분적으로 처리된 신경독 폴리펩티드를 결정하기 위한 상기 항체의 사용에 관한 것이다. 본 발명은 약제의 제조방법에 관한 것이다.

Description

매우 순수한 신경독을 제조하기 위한 수단 및 방법{MEANS AND METHODS FOR MANUFACTURING HIGHLY PURE NEUROTOXIN}
본 발명은 미처리된 및/또는 부분적으로 처리된 신경독 폴리펩티드에 특이적으로 결합한 항체 또는 SEQ ID NO: 1 내지 16 중 어느 하나에 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드로 이루어진 에피토프에 특이적으로 결합한 항체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 신경독 폴리펩티드를 제조하기 위한 방법에 관한 것으로, 이는 단백질 분해효소 처리된, 부분적으로 처리된 및/또는 미처리된 신경독 폴리펩티드의 혼합물을 함유하는 용액을, 미처리된 또는 부분적으로 처리된 신경독 폴리펩티드에 특이적으로 결합하지만 처리된 신경독 폴리펩티드에 결합하지 않은 제제와, 상기 제제를 상기 미처리된 또는 부분적으로 처리된 신경독 폴리펩티드에 결합하는 조건하에서 접촉시킴으로써 항원-제제 복합물을 형성하는 단계, 및 형성된 항원-제제 복합물을 제거함으로써 미처리되거나 부분적으로 처리된 신경독 폴리펩티드를 함유하지 않은 처리된 신경독 폴리펩티드를 함유하는 용액을 얻는 단계를 포함한다. 본 발명은 미처리되거나 부분적으로 처리된 신경독 폴리펩티드로부터 단백질 분해효소 처리된 신경독 폴리펩티드를 분리하기 위한 상술한 항체의 사용에 관한 것이다. 본 발명은 상기 방법의 단계 및 약제로서 단백질 분해효소 처리된 신경독 폴리펩티드를 제형하는 단계를 포함하는 약제의 제조 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상술한 방법에 의해서 얻어진 단백질 분해효소 처리된 신경독 폴리펩티드를 포함한 조성물에 관한 것이다.
Clostridium botulinum and Clostridium tetani 는 매우 강력한 신경독, 즉 보툴리눔 독소(BoNT) 및 파상풍 독소 (TeNT)를 생성한다. 이들 크로스티리디아성 신경독은 뉴런 세포에 특이적으로 결합하고 신경전달물질 방출을 파괴한다. 각각의 독소는 비활성 미처리된 약 150 kDa 단쇄 단백질로서 합성된다. 번역후 처리는 디설피드 가교의 형성 및 세균성 단백질 분해효소에 의한 한정된 단백질 분해(상성)를 수반한다. 활성 절단 신경독은 2개의 사슬, 대략 50 kDa의 N-말단 경쇄 및 대략 100kDa의 중쇄로 이루어지고, 이들은 디술피드 결합에 의해서 결합된다. CNT는 구조적으로 3개의 영역; 즉 촉매 경쇄, 전좌영역 (N-말단 절반) 및 수용기 결합 영역(C-말단 절반)을 포함한 중쇄로 이루어진다. (Krieglstein 1990, Eur J Biochem 188, 39; Krieglstein 1991, Eur J Biochem 202, 41; Krieglstein 1994, J Protein Chem 13, 49 참조.)
Clostridium botulinum 는 7개의 항원에 관련된 독특한 항원형 A 내지 G 보툴리눔 신경독 (BoNT)를 분비한다. Clostridium tetani에 의해 분비된 관련된 파상풍 신경독(TeNT)와 함께 모든 항원형은 SNARE 단백질을 절단한 시냅스 엑소사이토시스를 차단하는 Zn2 + 엔도프로테아제이다. CNT는 보툴리눔 중독증 및 파상풍에서 발견된 이완성 근육 마비를 일으킨다 (Fischer 2007, PNAS 104, 10447 참조).
독성 작용에도 불구하고, 보툴리눔 독소 복합물은 많은 질병에서 치료제로서 사용되었다. 보툴리눔 독소 항원형 A는 사시성, 안검경련 및 다른 장애의 치료용 1989년 미국에서 인간에 대해서 입증되었다. 예를 들면, 상품명 BOTOX (Allergan Inc), 상품명 DYSPORT (Ipsen Ltd)하에서 보툴리눔 독소 A 단백질 제제로서 시판된다. 치료 적용에 대해서, 복합물을 근육에 직접 주입해서 치료한다. 약리적인 pH에서, 단백질 복합물로부터 독소를 방출하고 소망의 약리작용이 발생한다. 복합 단백질이 함유되지 않은 개선된 BoNT/A 제제는 상품 XEOMIN (Merz Pharmaceuticals GmbH)으로 시판된다. 보툴리눔 독소의 작용은 일시적이고, 이는 치료작용을 유지하기 위해서 보툴리눔 독소의 반복적인 투여를 필요로 하는 이유이다.
크로스티리디아성 신경독은 수의근 강도를 약하게 하고, 사시증, 국소성 근긴장이상증, 예를 들면 경부 근긴장이상증 및 양성 본태성 안검경련의 치료에 효과적이다. 이들은 안면경련 경감, 및 국소경직 경감시키고, 또한 광범위한 지표, 예를 들면 유장관 장애, 다한증 및 미용성 주름 개선에서 효과적인 것을 나타낸다(Jost 2007, Drugs 67, 669 을 참조한다).
크로스티리디아성 신경독의 제조하기 위해서, 발효액을 함유한 신경독의 제조가 특히 중요하다. 이러한 점에서, 다른 석출 및 추출 단계 후, 농축 단계, 및 특별한 크로마토그래피 단계는 정제된 신경독을 얻기 위해서 사용된다 (DasGupta 1984, Toxicon 22, 415; Sathyamoorthy 1985, J Biol Chemistry 260, 10461 참조). 현재, 시판되는 신경독 제제는 소망의 활성 (처리된) 신경독와 더불어, 단백질 분해효소 미처리된 전구체 및/또는 부분적으로 처리된 신경독 폴리펩티드를 포함한다. 단백질 분해효소 미처리된 전구체 또는 부분적으로 처리된 폴리펩티드는 약간의 아미노산만의 서열에 의한 활성 (처리) 신경독 폴리펩티드와 다르다. 따라서, 이들은 화학적 및 물리적 특성에 기초해서 구분하기 어렵다. 한편, 총 단백질 비율 중 단백질 분해효소 미처리된 전구체 및/또는 부분적으로 처리된 신경독 폴리펩티드의 비율은 이러한 제제에서 중요하다. 상기 비율은 생체계에 의한 것으로, 생합성 및 발효공정의 조건에 의해서 결정된다. 따라서, 신경독 제제에서 원하지 않은 단백질 분해효소 미처리된 전구체 및/또는 부분적으로 처리된 신경독 폴리펩티드의 양은 사전에 정의되고, 감소시키는 것은 곤란하다.
미처리된 및/또는 부분적으로 처리된 신경독 폴리펩티드의 양을 감소시킴으로써 신경독 제제의 특성을 개선하기 위한 수단 및 방법은 매우 바람직하지만 아직 실현되지 않았다.
따라서, 본 발명의 기술적인 문제는 상기의 필요성을 수반하고, 신경독 폴리펩티드의 제조를 개선하기 위한 수단 및 방법을 제공한다. 기술적인 문제는 청구범위를 특징으로 하고 후술된 실시형태에 의해서 해결된다.
본 발명은 SEQ ID NOs: 1 내지 16의 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩티드로 이루어진 에피토프에 특이하게 결합한 항체에 관한 것이다.
본원에 "항체"는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 단쇄 항체, 인간, 인간화, 성숙화(primatized), 또는 키메라 항체, 이중특이성 항체, 합성 항체, 화학적으로 또는 효소적으로 개질된 유도체, 자연적으로 발생하는 및/또는 화학적으로 개질된 핵산으로 이루어진 상기 항체 또는 압타머(aptamer) 중 어느 하나의 파편을 포함한다. 상기 항체의 파편은 F(ab')2, F(ab), Fv 또는 scFv 파편 또는 이들 파편 중 어느 하나의 화학적으로 또는 효소적으로 개질한 유도체를 포함한다. 본 발명의 항체는 상기 펩티드는 부분적으로 처리되거나 미처리된 신경독 폴리펩티드로 합성된다면 상기 펩티드로 이루어진 에피토프에 특이적으로 결합할 것이다.
본 발명에 따른 "에피토프"는 본 발명의 항체에 의해서 인지된 항원 결정기(determinant)에 관한 것이다. SEQ ID NOs: 1 내지 16 중 어느 하나에 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드로 이루어진다. 본 발명의 형태에서 상기 에피토프는 신경독 처리 효소에 대한 절단 부위에 의해서 양옆으로(flanked) 배치되거나 절단 부위를 덮는 펩티드를 나타내고, 하기 표 1 및 2 참조한다. 본 발명의 형태에서 에피토프는 단백질 효소의 미처리된 신경독 폴리펩티드 또는 부분적으로 처리된 신경독 폴리펩티드로 이루어진다. 부분적으로 처리된 신경독 폴리펩티드는 SEQ ID NOs: 1 내지 8 중 어느 하나에 나타낸 펩티드 배열을 갖는 신장된 신경독 폴리펩티드의 경쇄 또는 SEQ ID NOs: 1 내지 8 중 어느 하나에 나타낸 펩티드 배열을 갖는 신장된 신경독 폴리펩티드의 중쇄일 수 있다. 상기 에피토프의 존재에 의해서, 미처리되거나 부분적으로 처리된 신경독 폴리펩티드는 항체에 의해서 특이적으로 결합할 수 있다.
에피토프의 아미노산 서열 및 신경독 항원형 폴리펩티드 전체길이의 아미노산 서열
SEQ ID NO : 적출된 펩 티드의 서열 절단부위
신경독 /
박테리아 변종 		SEQ ID NO :
(신경독 전체길이) 		Accession - NO :
1b TKSLDKGYNK K438 / T439
K448 / A449		 BoNT/A (Hall/62A) 17 ABD65472
2c CKSVKAPGIC K441 / A442 BoNT/B
(Okra)		 18 BAE48264
3d SLYNK R444 / S445
K449 / T450		 BoNT/C1
(C-6814)		 19 BAA89713
4d NSR K442 / N443
R445 / D446		 BoNT/D
(CB16)		 20 BAA90661
5e GIR K419 / G420
R422 / K423		 BoNT/E
(Beluga)		 21 CAA43999
6d KGTK R435 / K436
K439 / A440		 BoNT/F
(NCTC10281)		 22 CAA73972
7 NGTK nn BoNT/G 23 CAA52275
8a ENLYNR R449 (z.T. R455) TeNT 24 P04958
a Krieglstein et al. 1991, Eur J Biochem 202, 41-51.; Krieglstein et al. 1990, Eur J Biochem 188, 39-45.
b Beecher and DasGupta 1997, J Protein Chem 16, 701-712.; Krieglstein et al. 1994, J Protein Chem 13, 49-57.
c Antharavally and DasGupta 1998, J Protein Chem 17, 417-428.
d Sagane et al. 1999, J Protein Chem 18, 885-892.
e Antharavally and DasGupta 1997, J Protein Chem 16, 787-799.
신경독 항원형 절단 부위를 포함한 아미노산 서열
SEQ ID NO : 절단부위를 포함한 서열
(강조) 		신경독
(박테리아 변종)
9 KLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALN....DLCIKV BoNT/A (Hall/62A)
10 IQMCKSVKAPG...................ICIDV BoNT/B (Okra)
11 TKFCHKAIDGRSL .... YNKTL......DCRELLV BoNT/C1 (C-6814)
12 TKVCLRLTK.........NSRD......DSTCIKV BoNT/D
13 IRFCKNIVSVKG ...... IRK........SICIEI BoNT/E (Beluga)
14 VKFCKSVIPRKG ...... TKAP......PRLCIRV BoNT/F (NCTC10281)
15 IAMCKPVMYKNT......GKS........EQCIIV BoNT/G
16 IGLCKKIIPPTNIRENLYNRTASLTDLGGELCIKI TeNT
"특이적으로 결합"은 본 발명의 항체가 일반적으로 상기 부분적으로 처리된, 또는 상기 미처리된 신경독 폴리펩티드 또는 다른 폴리펩티드에 다른 에피토프와 상당한 정도로 교차 반응하지 않는 것을 의미한다. 본 발명의 형태에서, 본 발명의 항체는 상기 활성적인, 완전히 처리된 신경독 폴리펩티드와 교차 반응하지 않는다. 에피토프 특이성은 본 발명의 항체의 중요한 특징이다. 처리된 신경독에 대한 부분적으로 처리된 또는 미처리된 신경독에 대해서 항체의 특이성은 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97% 또는 적어도 98%, 적어도 99%이다. 특이적 결합은 각종 공지의 방법, 예를 들면 경쟁적인 연구에 의해서 시험할 수 있다. 또 다른 중요한 특성은 항체의 감도이다. 본 발명의 형태에서, 감도는 시료로 이루어진 처리된 신경독의 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%가 결합되도록 할 것이다. 감도는 공지의 방법에 의해서 시험할 것이다. 당업자는 일상 실험을 사용하여 각각의 결정을 위한 조작 및 최적의 분석 조건을 결정할 수 있다. 결합 연구에 대한 종래의 방법은 방사면역측정, ELISA, 평형 투석, 등온 미소열량 측정, BIACORE® 분석 (표면 플라즈몬 공명, SPR) 또는 다른 표면 흡착 방법을 포함한다. BIACORE® SPR 시스템은 항체-항원 상호작용을 측정한다. SPR 반응은 분석물이 결합하거나 해리할 때 디렉터 표면에서 질량 농도의 변화를 반영한다. SPR에 기초해서, 이들이 발생할 때 리얼 타임 BIACORE®측정은 상호작용을 직접 모니터링한다. (BIAapplications Handbook, version AB (reprinted 1998), BIACORE®code No: BR-1001-86; BIAtechnology Handbook, version AB (reprinted 1998), BIACORE®code No: BR-1001-84 참조). 본 발명의 항체의 감도와 같은 결합 특성은 특히 센서 표면에 나타낸 비동기화 항원(리간드)을 사용하여 결합 연구에 의해서 결정될 수 있다. 시험될 항체(검체)는 이동 상태, 즉 용액에 제공될 것이다. 일부 경우에, 항원은 본 발명의 포착이라고 부르는 또 다른 비동기화 분자에 결합에 의해서 표면에 간접적으로 부착된다. 항체는 비동기화 항원을 갖는 표면에 특정한 펄스로 주입하면, 필수적으로 3개의 상태로 나눌수 있다: (i) 시료 주입중에 항원과 항체의 결합, (ii) 항체 결합 속도가 항체-항원 복합물로부터 해리되어 균형을 유지하는 시료 주입중에 평형 또는 정상상태, (iii) 버퍼흐름동안 표면으로부터 항체의 해리. 이러한 분석은 이동 상태로서 항원 함유 용액 및 조사될 비동기화 항체를 이용하여 교대로 실시될 수 있다. 결합 및 해리 상태는 검체-리간드 상호작용의 키네틱에 대한 정보를 제공한다 (ka 및 kd, 복합물 형성 및 해리 속도, kd/ka=KD). 평형상태는 검체-리간드 상호작용(KD)의 친화성에 대한 정보를 제공한다. 본 발명의 형태에서, 본 발명의 항체는 0.5μM 미만의 KD를 갖고, 일 형태에서 0.05μM 미만, 또 다른 형태에서 0.02μM 미만이다.
본 발명에서 칭하는 항체는, 예를 들면 Harlow 및 Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988에 기재된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 모노클로날 항체는 Kohler 1975, Nature 256, 495, 및 Galfre, 1981, Meth Enzymol 73, 3에 기재된 방법에 의해서 제조될 수 있다. 상기 방법은 면역된 포유류로부터 유도된 생쥐골수종 세포와 비장세포의 결합을 포함한다. 항체는 공지된 방법에 의해서 더욱 개선될 수 있다. 예를 들면, BIACORE®system 에서 사용된 표면 플라즈몬 공명이 사용되어 단백질 분해효소 미처리된 신경독 폴리펩티드 내에 상술한 에피토프에 결합한 파지 항체의 효율을 증가시킬 수 있다. (Schier 1996, Human Antibodies Hybridomas 7, 97; Malmborg 1995, J. Immunol Methods 183, 7 참조)
본 발명의 일 형태에서, 본 발명에 따른 항체는 상술한 에피토프를 포함한 올리고펩티드를 사용하여 제조된다. 이러한 올리고펩티드는 합성적으로 또는 재조합 발현에 의해서 제조될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 자연 발생 미처리된 또는 부분적으로 처리된 신경독 폴리펩티드를 적용함으로써 제조될 수 있다. 후자는 얻어진 항체가 미처리된 및/또는 부분적으로 처리된 신경독 폴리펩티드에 대한 특이성에 대해서 더욱 시험할 것이다. 본 발명의 형태에 대해서, 본 발명의 모노클로날 항체는 면역학적으로 유용한 에피토프를 제조하기 위해서 세제에 의해서 처리될 수 있는 부분적으로 처리된 또는 미처리된 신경독 폴리펩티드를 사용함으로써 제조된다. 그러나, 항체가 배좌의 에피토프를 향하게 하는 경우, 이러한 세제 처리는 실시되지 않는 것으로 이해될 것이다. 또 다른 형태에서, 면역자극제, 예를 들면 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH) 는 이러한 방법에서 특히 합성 올리고펩티드를 사용할 때 적용될 것이다.
본 발명에서 칭하는 항체는, 예를 들면 부분적으로 처리된 및/또는 미처리된 신경독 폴리펩티드의 친화성 크로마토그래피, 면역침강 및 면역학적 국재결정(immulocalization), 또한 시료 또는 재조합 조직에서 상기 폴리펩티드의 존재의 모니터링에 대해서 사용할 수 있다.
본 발명의 형태에서, 부분적으로 처리된 및/또는 미처리된 신경독 폴리펩티드는 Clostridium spp .에 의한 것이다. 본 발명의 또 다른 형태에서, Clostridium botulinum ATCC 3502, Clostridium botulinum ATCC 3502 -Hall strain로부터 선택된 Clostridium botulinum에 의한 것이다. Clostridium botulinum로부터 상기 미처리된 신경독 폴리펩티드의 주요한 구조는 Krieglstein 1994, J Protein Chem 13, 49에 기재된다.
본원에서 말하는 Clostridium spp. 은 피루미쿠트에 속하는 그램 양성, 내생포자 형성, 완전 혐기성 박테리아속이다. 크로스티리디아성 신경독은 Clostridium botulinum, Clostridium butyricum, Clostridium barati, 및 Clostridium tetani에 속하는 표현 및 유전자의 다른 클로스트리디아(phenotypic 및 genetic different clostridia)에 의해서 제조될 수 있다. 본원에 사용된 Clostridium botulinum은 신경독 이외에 난형(oval), 준말단 내생포자를 생성하고 일반적으로 흙에서 발견되는 로드형, 그램양성, 완전 혐기성 박테리아의 종이다.
또한, 본 발명의 항체의 형태에서, 상기 항체는 폴리펩티드 캐리어에 결합된다. 본 발명의 항체의 형태에서, 상기 폴리펩티드 캐리어는 FC 결합 단백질, 단백질 A 및 G 및 본 발명의 항체에 특이적으로 결합된 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이는, 예를 들면 종 특이성인 항체일 수 있다. 이러한 항체는 본 발명의 항체의 FC 부분 또는 F(ab)에 특이적으로 결합한다. 본 발명의 항체의 또 다른 형태에서, 상기 폴리펩티드 캐리어는 Staphylococcus aureus로부터 단백질 A이다. 상기 폴리펩티드 캐리어는 본 발명의 항체를 분리하기 위해서 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 항체의 또 다른 형태에서, 상기 항체는 매트릭스에 결합된다. 형태에서, 상기 매트릭스는 고체 매트릭스이다.
본원에 사용된 "결합"은 상기 결합은 부분적으로 처리된 및/또는 미처리된 신경독 폴리펩티드에 항체의 결합을 방해하지 않는 것이면, 항체와 매트릭스 사이 결합의 임의의 형태에 관한 것이다. 상기 결합은 간접적인 또는 직접적인, 비기역성 또는 가역성, 물리적 및 화학적, 정전기 및/또는 공유결합을 포함한 상호작용에 의해서 실시될 수 있다. 일 형태에서, 상기 항체는 매트릭스에 직접적으로 또는 링커 분자를 통해서 공유결합으로 연결된다.
본 발명에 따라서 사용된 "매트릭스"는 항원 또는 항체에 결합가능한 3차원 구조 또는 공간 배열을 말한다. 공지된 매트릭스는 폴리펩티드, 유리, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 덱스트란, 나일론, 아밀라제, 천연 및 개질 셀룰로오스, 폴리아크릴아미드, 반려암 및 자철석을 포함한다. 본 발명의 형태에서 고체 매트릭스는 세파로오스, 세파덱스; 아가로스, 세파셀, 마이크로셀룰로오스 및 알기네이트-비즈로 이루어진 군으로부터 선택된 다당류 매트릭스이다. 또 다른 형태에서, 상기 고체 매트릭스는 유리 비즈 및/또는 폴리펩티드 매트릭스로 구성될 수 있다.
항체는 링커, 예를 들면 작은 분자 화합물, 펩티드 링커분자 및 비즈를 통해서 상기 매트릭스에 결합될 것이다. 매트릭스는 상기 결합된 항체가 그 항원에 결합가능한 것이면, 사실상 임의의 가능한 구조적 구성 또는 배열을 가질 수 있다. 따라서, 매트릭스는 비드에서와 같이 구형, 또는 시험관의 내측면, 또는 로드의 외측면과 같이 원통형일 수 있다. 또한, 표면은 불균일 또는 플랫, 예를 들면 시트, 시험 스트립 (test strip) 등일 수 있다. 일 형태에서, 상기 지지체는 폴리스티렌 비즈를 포함한다.
본 발명의 형태에서, 상기 매트릭스는 본 발명의 항체에 대한 적어도 하나의 결합 부위를 갖는다. 본 발명의 형태에서, 상기 매트릭스는 다른 에피토프를 인지하는 또 다른 항체에 대한 추가의 결합 부위를 갖는다. 일 형태에서, 상기 에피토프는 부분적으로 처리된 및/또는 미처리된 신경독 폴리펩티드의 특이적 결합을 행하는 다른 에피토프이다. 매트릭스에 비동기화 항체는 신경독 폴리펩티드 이외에 박테리아 폴리펩티드를 인지하는 항체를 포함한다. 상기 매트릭스로 이루어진 이러한 항체는 신경독 제제의 정제 목적으로, 원하지 않은 폴리펩티드를 제거하기 위해서 사용될 수 있다. 그러나, 또 다른 형태에서, 처리된 신경독은 매트릭스에 비동기화된 항체에 의해서 특이적으로 결합되지 않는 것으로 이해된다.
본 발명의 상술한 항체는 이는 상기 특징적인 에피토프에 특이적으로 결합해서 부분적으로 처리된 또는 미처리된 신경독 폴리펩티드를 결합하고 상기 활성 처리된 신경독 폴리펩티드로부터 분리하기 때문에, 처리된 신경독 폴리펩티드의 제조에 적당하다. 원하지 않는 부분적으로 처리된 및 미처리된 신경독 폴리펩티드를 결합하고 제거할 수 있는 항체는 그 생물활성을 유지하는 활성 처리된 신경독 폴리펩티드와 상호작용을 피한다. 본 발명에 의해서, 신경독의 정제가 가능함으로써 소망의 활성 폴리펩티드는 그 활성에서 본질적으로 영향을 받지않는다. 당업자는 "활성"은 상기 미처리된 전구체가 일부 생물적 기능을 발휘할 수 있는 경우에도 미처리된 전구체 신경독 폴리펩티드의 단백질 분해효소에 의한 절단 후에 얻어지는 것을 알고 있다. 따라서, 본 발명의 형태에서 "단백질 분해효소 처리된 신경독 폴리펩티드"는 생물적으로 활성 신경독 폴리펩티드이다. 본 발명에서 사용된 "생물학적 활성"은 다음의 수용체 결합, 내면화, 엔도솜 멤브레인을 통해서 시토솔로 전좌, 및/또는 시냅스 소포 멤브레인 결합에서 수반된 하나 이상의 단백질의 세포내 단백질 분해에 의한 절단 가능성에 관한 것이다.
상기 용어의 정의 및 설명은 달리 나타낸 것을 제외하고, 명세서에서 기재된 모든 형태에 대해서 필요에 따라서 적용되는 것을 이해한다.
본 발명의 또 다른 형태에서, 미처리된 및/또는 부분적으로 처리된 신경독 폴리펩티드에 특이적으로 결합한 항체의 제조방법이 제공되고, 상기 방법은:
a) SEQ ID NO: 25에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 면역원을 사용하여 면역된 비-인간 동물 유래의 폴리클로날 항혈청을, SEQ ID NO: 25을 갖는 펩티드와, 상기 펩티드 및 미처리 또는 부분적으로 처리된 신경독 폴리펩티드 BoNT/A에 특이적으로 결합한 항체를 포함하는 복합물의 형성을 가능하게 하는 조건하에서 접촉시키는 단계;
b) 상기 항혈청으로부터 단계 a)에서 형성된 복합물을 제거하는 단계; 및
c) 상기 복합물로부터 미처리된 또는 부분적으로 처리된 신경독 폴리펩티드에 특이적으로 결합한 항체를 방출하는 단계를 포함한다.
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상기 기재된 "펩티드 면역원"은 비인간 동물의 면역 반응을 유도하는 방법으로 제공된, SEQ ID NO: 25에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 올리고펩티드를 말한다. 일 형태에서, 상기 면역원은 KLH를 더욱 포함하고, 더욱 다른 형태에서 상기 KLH는 시스테인, 일 형태에서 C-말단 시스테인을 통해서 링커 N-[감마-말레이미도부티릴옥시]숙신이미드 에스테르(GMBS)를 통해서 SEQ ID NO: 25을 갖는 펩티드에 결합된다. 링커 분자, 예를 들면 GMBS에 의해서 펩티드에 KLH를 결합하는 방법은 종래에 공지되어 있거나 후술한 실시예에서 기재되어 있다. 또 다른 형태에서, 비인간 동물은 포유류이고, 일형태에서는 쥐, 생쥐, 토끼, 양, 또는 염소이다. 본 발명의 방법을 실시하기 전에, 폴리콜로날 항혈청의 소스인 비인간동물은 상술한 펩티드 면역원을 사용해서 면역될 것이다. 비인간동물의 면역 방법은 종래공지되어 있거나 후술한 실시예에 기재되어 있다. 상기 면역 결과, 비인간 동물은 펩티드 면역원에 대해서 폴리클로날 항체를 생성할 것이다.
폴리클로날 항혈청은 다양한 방법에 의해서 비인간 동물로부터 얻어질 수 있다. 일 형태에서, 공지되어 있고 후술한 실시예에서 기재된 표준 방법에 의해서 혈액, 혈청 또는 혈장으로부터 얻어진다. "폴리클로날 항혈청"은 상기 동물로부터 정제되고 부분적으로 정제된 혈청을 포함한다. 이러한 폴리클로날 항혈청은 상술한 방법의 원료이다. 미처리된 및/또는 부분적으로 처리된 신경독 폴리펩티드에 특이적으로 결합한 소망의 항체(또는 항체들) 이외에, 폴리클로날 항혈청은 미처리된 및/또는 부분적으로 처리된 신경독 폴리펩티드에 특이적으로 결합하지 않는 추가의 항체를 포함할 수 있다. 이들 항체는 폴리클로날 항혈청을 SEQ ID NO: 25에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩티드와 접촉시킴으로써 소망의 특이적 항체로부터 분리한다. 일 형태에서, 상기 펩티드는 본원에서 상세하게 기재된 캐리어에 비동기화된다. 상기 접촉의 결과로서, 폴리클로날 혈청으로부터 제거될 수 있는 펩티드와 특이적 항체의 복합물이 형성된다. 특이적 항체는 제거된 복합물로부터 방출될 수 있다. 이러한 복합물로부터 항체를 방출하는 데에 적당한 방법은 본원에 기재된다.
또 다른 형태에서, 상기 방법은 a) 단계 전에:
i) SEQ ID NO: 25에 나타낸 아미노산 서열을 포함한 펩티드 면역원을 사용해서 면역된 비-인간 동물 유래의 상기 폴리클로날 항혈청을, 다음의 포착 펩티드 SLD, LDK, 및 YNK와, 폴리클로날 항혈청에 포함되는 비특이성 항체 및 포착된 펩티드를 포함하는 포착 복합물을 형성을 가능하게 하는 조건하에서, 접촉시키는 단계; 및
ii) 폴리클로날 항혈청으로부터 포착 복합물을 제거하는 단계를 포함한다.
본 발명의 검토에서, 폴리클로날 혈청은 염소의 면역원(항링커 펩티드 scBoNT/A-serum)으로서 KLH에 결합된 링커 펩티드를 사용해서 미처리된 보툴리눔 신경독형 A(BoNT/A)을 공격한다. 친화성 정제후에도, 혈청은 웨스턴 블롯(Western blot)에서 처리된 BoNT/A에 대해서 크로스 반응성을 나타냈다. 크로스 반응성은 링커 펩티드, 또한 처리된 BoNT/A의 경쇄 및 중쇄에서 발생하는 트리펩티드(SLD, LDK 및 YNK)의 인지에 의존한다. 염소 면역혈청의 제 2 배치는 2단계 친화성 크로마토그래피를 통해서 정제되고, 크로스 반응 트리펩티드 항체를 제거했다. 제 2의 항링커 펩티드 ScBoNT/A-혈청은 웨스턴 블롯에서 처리된 BoNT/A에 대해서 크로스 반응성을 나타내지 않았다. 일 형태에서 트리펩티드는 SEQ ID Nos. 26 내지 28 중 어느 하나에 나타낸 유도체의 형태로 친화성 정제에 적용될 수 있다.
상기 방법의 일 형태에서, 단계 a) 내지 c)는 친화성 크로마토그래피에 의해서 실시된다.
본 발명에서 사용된 친화성 크로마토그래피는 크로마토그래피에서 사용된 정지상에 대해서 다른 친화성에 기초한 이동상으로 분자를 분리하는 방법을 말한다. 일 형태에서, 상기 방법은 비동기화 리간드로부터 화합물의 선택적 흡착 및 회수를 말한다. 또 다른 형태에서, 상기 방법은 대상화합물을 결합하기 위해서 비즈 및 다공성 매트릭스에 대한 적당한 선택적인 리간드를 사용해서 관련된 화합물 및 단백질의 매우 특이적이고 효율적으로 정제 후, 온화한 조건하에서 회수될 수 있는 것으로 고안된다. 상기 방법은 매우 특이적 상호작용, 예를 들면 항원과 항체 사이, 효소와 기질 사이 또는 수용체와 리간드사이의 상호작용에 기초한다. 또 다른 형태에서, 상기 친화성 크로마토그래피는 칼럼 크로마토그래피로서 실시된다. 상기 기재된 친화성 크로마토그래피는 일 형태에서 면역흡수체 크로마토그래피 및, 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC), 가역 상태 크로마토그래피 및 또 다른 형태에서, 본 발명의 항체인 결합제를 적용한 면역친화성 크로마토그래피이다. 일 형태에서, 본원에서 말하는 정지상은 고체 매트릭스로서 상술한 제제로 구성된다. 상기 제제는 일 형태로 고체 매트릭스에 결합된 폴리펩티드 캐리어에 결합되고, 또 다른 형태에서 고체 매트릭스에 커플링된 단백질 A에 결합된다.
상술한 방법의 또 다른 형태에서, 상기 단계 i) 및 ii)는 친화성 크로마토그래피에 의해서 실시된다.
본 발명은 미처리된 및/또는 부분적으로 처리된 신경독 폴리펩티드에 특이적으로 결합한 항체를 식별하기 위한 방법에 관한 것으로, 상기 방법은:
a) 항체가 SEQ ID NO: 25에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩티드에 결합하는 지를 결정하는 단계; 및
b) 항체가 하기의 아미노산 서열 SLD, LDK 및 YNK를 갖는 펩티드에 결합하는 지를 결정하는 단계를 포함하고,
SEQ ID NO: 25에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩티드에 결합하지만, 하기의 아미노산 서열 SLD, LDK 및 YNK을 갖는 펩티드에 결합하지 않는 항체는 미처리된 및/또는 부분적으로 처리된 신경독 폴리펩티드에 특이적으로 결합한 항체로서 식별된다.
항체를 식별하기 위한 방법에 따라서 사용된 "결정"은 소정의 펩티드에 항체가 결합하는 지를 결정하는 방법, 예를 들면 면역 블롯팅 방법(Western- 또는 Dot- blot 방법), 친화성 크로마토그래피, 혈장 표면 공명 방법(BIACORE®Assays)등을 포함한다. 일 형태에서, 항체가 상기 펩티드 또는 펩티드에 대한 상술한 결합은 특이적 결합(즉, 크로스 반응성 없는 결합)인 것으로 이해될 것이다.
일 형태에서, 항체를 식별하기 위한 상술한 방법은 모노클로날 항체에 대해서 실시된다. 일 형태에서, 하이브리도마 세포 라인을 선별하고, 미처리된 및/또는 부분적으로 처리된 신경독 폴리펩티드에 특이적으로 결합한 모노클로날 항체를 생성하는 데에 사용된다. 또 다른 형태에서, 상기 방법은 미처리된 및/또는 부분적으로 처리된 신경독 폴리펩티드에 특이적으로 결합한 폴리클로날 항체, 예를 들면 펩티드 항체를 선별하기 위해서 적용될 수 있다. 일 형태에서, 상기 방법은 본 명세서에서 달리 말하는 본 발명의 방법에 의해서 제조된 항체의 특이성을 확인하기 위해서 적용될 수 있다.
본 발명은 상술한 방법에 의해서 얻어진 항체에 관한 것이다. 일 형태에서, 항체는 폴리클로날 항체이다. 또 다른 형태에서, 상기 항체는 고체 지지체에 결합된다.
일 형태에서, 본 발명의 항체는 높은 선택도 및 특이성을 갖는 부분적으로 처리된 및/또는 미처리된 신경독 폴리펩티드를 검출한다. 일 형태에서 50 내지 80 pg/ml, 일 형태에서 69 pg/ml의 검출 한계를 갖는다.
원칙적으로, 상술한 항체는 처리된 신경독 폴리펩티드로부터 부분적으로 처리된 및/또는 미처리된 신경독 폴리펩티드를 제거하고, 또는 시료에서 부분적으로 처리된 및/또는 미처리된 BoNT/A를 검출하기 위해서 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 신경독 폴리펩티드를 제조하기 위한 방법에 관한 것이다:
a) 단백질 분해효소 처리된, 부분적으로 처리된 및/또는 미처리된 신경독 폴리펩티드의 혼합물을 함유하는 용액을, 미처리된 또는 부분적으로 처리된 신경독 폴리펩티드에 특이적으로 결합하지만 처리된 신경독 폴리펩티드에 결합하지 않는 제제와, 미처리된 또는 부분적으로 처리된 신경독 폴리펩티드에 상기 제제를 결합하는 조건하에서 접촉시킴으로써 제제-복합물이 형성되는 단계;
b) 단계 a)에서 형성된 제제-복합물을 제거함으로써 미처리된 또는 부분적으로 처리된 신경독 폴리펩티드를 함유하지 않은 처리된 신경독 폴리펩티드를 함유한 용액이 얻어지는 단계.
본원에 사용된 "접촉"은 다른 적어도 2개의 화합물을 물리적으로 근접시켜서 상기 화합물의 물리적 및/또는 화학적 상호작용을 일으키는 것을 말한다. 일 형태에서, 본 발명의 방법에 따라서, 상기 2개의 다른 화합물은 부분적으로 처리된 또는 미처리된 신경독 폴리펩티드를 특이적으로 결합한, 용액으로 구성된 제제이다. 본원에 의미하는 접촉은 상기 제제와, 부분적으로 처리된 또는 미처리된 신경독 폴리펩티드의 상호작용을 일으키는 조건 및 충분한 시간동안 실시된다. 상기 상호작용은 부분적으로 처리된 또는 미처리된 신경독 폴리펩티드를 상기 제제에 결합함으로써 항원-제제 복합물을 형성할 것이다. 본원에서 달리 기재된 바와 같이, 상기 상호작용은 직접적 및 간접적, 비가역 및 가역 측정수단과 같은 다양한 결합을 포함한다. 적당한 조건은 상기 제제와 용액의 특이한 상호작용을 일으킨다. 이는 당업자에게 공지되어 있고, 상기 조건은 즉시 결정된 방법에서 적용될 용액 및 제제에 따라서 다르다. 또한, 상호작용에 충분한 시간은 당업자에 의해서 즉시 결정될 수 있다. 제제로서 항체의 조건은 후술한 실시예에서 기재되어 있다.
본원에 사용된 용액은 신경독 폴리펩티드, 그 부분적으로 처리된 및/또는 미처리된 신경독 폴리펩티드를 함유한 임의의 용제 시스템을 말한다. 상기 용제 시스템은 또한 용제를 포함한다. 본 발명의 다양한 형태에서 용제는 물, 버퍼 수계 시스템, 유기 용제 및 이온액이다. 본 발명의 일형태에서, 수계 용제 시스템이다. 또한, 용제 시스템은 신경독 폴리펩티드 및 용제 이외에 박테리아 폴리펩티드를 포함한 분자를 포함할 것이다.
본원에서 사용된 "제제"는 부분적으로 처리된 또는 미처리된 신경독 폴리펩티드를 특이적으로 결합할 수 있는 화합물을 말한다. 적당한 화합물은 폴리펩티드, 펩티드, 항체 및 유기 화학분자를 포함한다. 본 발명의 일 형태에서, 상기 제제는 본원에 달리 기재된 폴리펩티드, 펩티드 또는 항체이다. 또한, 형태에서, 본 발명의 상기 제제는 부분적으로 처리된 또는 미처리된 신경독 폴리펩티드의 적어도 하나의 결합 부위를 갖는다. 본 발명의 또 다른 형태에서, 상기 제제는 상기 제제를 특이적으로 결합가능한 더욱 항체의 추가의 결합 부위를 갖는다. 본 발명의 추가의 형태에서, 상기 제제는 상기 기재된 바와 같은 본 발명의 항체이다. 또한, 또 다른 형태에서, 상기 제제는 본 발명의 다른 항체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 제제로서 부분적으로 처리된 신경독 폴리펩티드에 특이적으로 결합한 본 발명에 따른 항체는 미처리된 신경독 폴리펩티드에 특이적으로 결합한 본 발명의 항체와 함께 사용된다. 또한, 본 발명의 제제는 본 발명의 2개 이상의 다른 항체를 포함하고, 각각의 항체는 부분적으로 처리된 및 미처리된 신경독 폴리펩티드에 존재하는 다른 에피토프에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 방법의 형태에서, 상기 제제는 본원에 기재된 바와 같이 매트릭스에 비동기화된다. 또 다른 형태에서, 비동기화된 매트릭스에 상기 제제의 직접적 또는 간접적 공유 결합에 의해서 달성된다.
본원에서 사용된 "특이적 결합"은 상기 제제를, 다른 신경독, 호스트 셀 단백질 또는 다른 펩티드, 폴리펩티드, 또는 다른 화합물과의 임의의 크로스 반응 없이 부분적으로 처리된 및/또는 미처리된 신경독 폴리펩티드와 결합하는 것을 말한다. 특이적 결합은 각종 공지된 방법에 의해서 시험할 수 있다. 이러한 점에서, 필요에 따라서 적용된 본 발명의 항체에 관련된 정의이다.
본원에 사용된 "제제-복합물" 은 부분적으로 처리된 또는 미처리된 신경독 폴리펩티드에 결합된 제제를 말한다. 그러나, 또한, 복합물은 분자를 더욱 포함한다. 본 발명의 형태에서, 복합물은 상기 복합물을 안정화시키거나 예를 들면 복합물과 분자를 반응시킴으로써 정제를 용이하게 하고, 또는 복합물의 석출을 용이하게 하는 분자를 포함할 수 있다. 본 발명의 일 형태에서, 복합물로 구성된 추가의 분자는 상기 제제 또는 복합물에 특이적으로 결합한 제 2 항체를 포함한다. 상기 제 2 항체는 또는 항체 또는 상호작용 분자, 예를 들면 폴리펩티드 캐리어에 의해서 직접적 또는 간접적으로 결합될 수 있다. 상기 복합물은 박테리아 폴리펩티드 또는 상기 용액으로 구성된 다른 분자를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용된 항원-제제 복합물을 "제거하는" 이란 활성, 처리된 신경독 함유 용액으로부터 복합의 부분적으로 처리된 및 복합의 미처리된 신경독 폴리펩티드의 분리를 말한다. 본 발명의 일 형태에서, 상기 제거는 친화성 크로마토그래피, 예를 들면 면역비즈 또는 면역석출에 의해서 실시된다.
부분적으로 처리된 및 미처리된 신경독 폴리펩티드의 제거 결과, 본 발명의 방법은, 일 형태에서 활성 처리된 신경독 폴리펩티드를 매우 순수한 형태로 제공한다. 본원에 사용된 "매우 순수한 형태"는 일 형태에서 부분적으로 처리된 또는 미처리된 신경독 폴리펩티드가 검출되지 않는 활성 처리된 신경독 폴리펩티드를 말한다. 또 다른 형태에서 다른 불순물이 검출되지 않는 활성 처리된 신경독 폴리펩티드를 말한다. 일 형태에서, 부분적으로 처리된 또는 미처리된 신경독의 검출량은 2.5% 미만, 1% 미만이고, 또 다른 형태에서 0.1% 미만이다. 본 발명의 형태에서, 활성 처리된 신경독 타입 A 폴리펩티드는 환원 조건하에서 100 kDa에서 검출가능한 싱글 밴드, 및 50kDa에서 검출가능한 싱글 밴드를 나타내지만, 예를 들면 SDS-PAGE에 의해서 분석될 때 부분적으로 처리된 또는 미처리된 신경독 타입 A 폴리펩티드는 정상적으로 발생하는 150 kDa에서 밴드를 나타내지 않는다. 다른 폴리펩티드 불순물은 SDS PAGE 에 의해서 결정될 수 있는 것으로 이해된다. 활성 처리된 신경독의 다른 항원형은 각각 분석될 수 있다.
본 발명의 방법은, 상기 신경독 폴리펩티드는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다.
a) 신경독 폴리펩티드 BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G 또는 TeNT
b) a)의 신경독 폴리펩티드의 아미노산 서열과 적어도 40% 동일한 아미노산 서열을 갖는 신경독 폴리펩티드
본 발명에 사용된 "신경독"는 항원과 관련해서 보툴리눔 신경독의 다른 항원형, 즉 BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G 및 파상풍 신경독 (TeNT)을 말한다. 일 형태에서, 상기 BoNT/A는 SEQ ID NO: 17에 나타낸 아미노산 서열을 갖고, BoNT/B는 SEQ ID NO: 18에 나타낸 아미노산 서열을 갖고, BoNT/C1는 SEQ ID NO: 19에 나타낸 아미노산 서열을 갖고, BoNT/D는 SEQ ID NO: 20에 나타낸 아미노산 서열을 갖고, BoNT/E는 SEQ ID NO: 21에 나타낸 아미노산 서열을 갖고, BoNT/F는 SEQ ID NO: 22에 나타낸 아미노산 서열을 갖고, BoNT/G는 SEQ ID NO: 23에 나타낸 아미노산 서열을 갖고, TeNT는 SEQ ID NO: 24에 나타낸 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 방법의 또 다른 형태에서, 상기 신경독 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 17 내지 24 중 어느 하나에 대해서, 아미노산 치환, 추가 및/또는 제거 중 적어도 하나를 포함한 서열을 갖는 상술한 신경독 폴리펩티드 중 어느 하나의 변종이다. 또 다른 형태에서, 상기 변종 신경독 폴리펩티드는 BoNT/A (SEQ ID NO: 17), BoNT/B (SEQ ID NO: 18), BoNT/C1 (SEQ ID NO: 19), BoNT/D (SEQ ID NO: 20), BoNT/E (SEQ ID NO: 21), BoNT/F (SEQ ID NO: 22), BoNT/G (SEQ ID NO: 23), 또는 TeNT (SEQ ID NO: 24)의 아미노산 서열과 적어도 40% 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 본 발명의 또 다른 형태에서, 신경독 폴리펩티드는 BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G 또는 TeNT의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 본 발명에서 사용된 "동일"은 아미노산 서열의 동일성의 결정을 특징으로 하는 서열 동일성을 말하고, 상기 서열은 고차 매칭(highest order matching)이 얻어지도록 배열되고, 예를 들면 BLASTP, BLASTN, FASTA, Altschul 1990, J Mol Biol 215, 403과 같은 컴퓨터 프로그램에서 한정된 방법 또는 공지된 방법을 사용해서 산출될 수 있다. 동일성 값은 일 형태에서 전체의 아미노산 서열에 대해서 산출된다. 다양한 알고리즘에 기초한 일련의 프로그램은 다른 서열과 비교하기 위해서 당업자에게 이용가능하다. 이러한 점에서, Needleman 및 Wunsch or Smith 및 Waterman의 알고리즘은 특히 신뢰할만한 결과를 제공한다. 서열 배열을 실시하기 위해서, GCG software packet (Genetics Computer Group 1991, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711)의 일부분인, 프로그램 PileUp (1987, J Mol Evolution 25, 351; Higgins 1989 CABIOS 5, 151) 또는 프로그램 Gap 및 BestFit (Needleman 및 Wunsch 1970, J Mol Biol 48; 443; Smith 및 Waterman 1981, Adv Appl Math 2, 482)이 사용된다. 상기 %로 기재된 동일성 값은 본 발명의 일 형태에서 전체의 영역에 대해서 프로그램 GAP를 사용하여 결정되고, 달리 기재되어 있지 않으면 하기의 셋팅: Gap Weight: 50, Length Weight:　3, Average Match: 10.000 및 Average Mismatch: 0.000을 갖고 서열 배열의 표준 셋팅으로 사용될 것이다.
본 발명의 일 형태에서 상기 변종은 신경독의 생물적 특성을 유지하는 것으로 이해될 것이다. 이는 미처리된 전구체는 일부 생물적 기능 또는 부분적으로 활성일 수 있는 것이 가능하지만 당업자에게 충분한 생물적 활성은 단백질 효소분해 활성 후에만 달성되는 것으로 인지될 것이다. 본원에 사용된 "생물적 특성" 은 (a)수용체 결합, (b) 내면화, (c) 엔도솜 멤브레인에 걸쳐서 시토콜로 전좌 및/또는 (d) 시냅스 소포 멤브레인 결합에서 수반된 단백질의 세포내 단백질 분해 절단에 관한 것이다. 생물적 활성을 평가하기 위한 생체내 실험 분석은 Pearce LB, Borodic GE, First ER, MacCallum RD (1994) (Measurement of botulinum toxin activity: evaluation of the lethality assay. Toxicol Appl Pharmacol 128: 69-77) 및 Dressler D, Lange M, Bigalke H (2005) (The mouse diaphragm assay for detection of antibodies against botulinum toxin type B. Mov Disord 20:1617-1619)에 기재된 생쥐 LD50분석 및 생체외 생쥐 편측 횡격막 분석을 포함한다. 생물적 활성은 일반적으로 생쥐 유닛(MU)으로 나타낸다. 본원에 사용된 바와 같이, 1 MU는 신경독 성분의 양으로, 복강내 주입 후 특이한 생쥐 개체수의 50%를 죽이는, 즉 생쥐의 LD50(Schantz & Kauter, 1978)이다. 또 다른 형태에서, 변종은 개선된 또는 변경된 생물적 특성, 예를 들면 효소 인식에 대해서 개선되거나 수용체 결합 또는 상기 기재된 임의의 다른 특성에 대해서 개선된 절단 부위를 포함한 특성을 갖는 신경독일 수 있다. 본 발명의 개념은 상기 제제가 부분적으로 처리되거나 미처리된 신경독 폴리펩티드에 대해서 특이적인 것이면, 경쇄 및 중쇄의 신경독 폴리펩티드 사이의 1개, 2개 이상의 절단 부위에 의존하지만, 이들 사이의 절단 부위 특성 및 특정한 아미노산 서열은 중요하지 않다. 따라서, 중쇄 및 경쇄의 신경독 폴리펩티드 사이의 단백질 분해효소 인지 부위 및 링커 펩티드 또는 상기 절단 부위를 둘러싼 측면 서열 (하나의 절단 부위의 경우에) 을 대체한다.
또 다른 형태에서, 본 발명의 방법에 따른 신경독 폴리펩티드는 키메라 분자일 수 있다. 일 형태에서 이러한 상기 키메라 분자는 치환된 하나의 영역을 가질 수 있다. 따라서, 또 다른 형태에서, 신경독 중쇄의 부분은 항체의 FC 영역의 일부에 의해서 대체된다.
일 형태에서, 본 발명의 방법에 따라서 제조된 신경독 폴리펩티드는 ELISA, ELISA의 항원, 제어 표준을 포함한 분석적 수단에 대해서 사용될 수 있다.
다른 불순물을 함유하지 않은 신경독 제제를 얻기 위해서, 공지된 정제 단계는 본 발명의 상술한 방법에 추가되고 하기에서 설명될 것이다.
본 발명의 방법의 하나의 형태에서 상기 방법은 친화성 크로마토그래피에 의해서 실시된다.
본 발명의 또 다른 형태에서, 특이한 면역흡수체는 하기와 같이 면역친화성 크로마토그래피에 대해서 제조된다:
- 미처리되거나 부분적으로 처리된 전구체 폴리펩티드의 특이한 올리고펩티드의 합성(SEQ ID NOs: 1 내지 16 또는 25 중 어느 하나로 나타냄), 특히 합성 올리고펩티드의 제조;
- 면역에 적당한 캐리어에 대한 펩티드의 콘쥬게이션(헤모시아닌, BSA, 지질다당류 및 기타), 특이적으로 폴리펩티드 캐리어에 올리고펩티드의 결합
- 폴리- 또는 모노클로날 항체를 생성하기 위해 동물의 면역, 특히 폴리클로날을 제조하기 위해서 토끼 또는 염소의 면역, 및 모노클로날 항체를 생성하기 위한 쥐의 면역(친화성 항체를 얻기 위해서 적어도 10마리의 동물이 면역될 필요가 있다)
-하이브리도마 셀라인이 발생되어 모노클로날 항체를 생성한다;
-종래의 및 친화성 크로마토그래피에 의한 항체의 정체를 사용해서 (후자는 올리고펩티드가 캐리어에 결합될 것이다), 구체적으로 항체는 예를 들면 단백질 A 또는 G를 사용하고 및/또는 캐리어에 결합된 올리고펩티드(후자는 면역을 위해서 사용됨) 또는 비특이성 항체를 제거한 후 친화성 크로마토그래피를 실시한 펩티드 친화성 크로마토그래피를 통해서 정제한다;
-Fab 파편에서 특이적 항체, 특히 특이적 항체의 절단은 각각의 Fab 파편을 얻기 위해서 파파인과 같은 프로테아제에 의해서 처리된다;
-Fab 파편은 적용되기 전에 결합 특성을 갖는 것을 특징으로 한다;
-항체는 활성화된 세파로스와 같은 칼럼 매트릭스에 결합되고, 특히 특이적 Fab 파편은 캐리어 물질의 활성 연결기에 결합된다;
-면역흡수체(칼럼내의)는 적당한 버퍼 시스템을 사용하여 세정되고 평형으로 만든다.
-미처리된 또는 부분적으로 처리된 전구체 신경독 폴리펩티드는 면역흡수체에 특이적으로 결합되고, 반면 활성, 처리된 신경독 폴리펩티드는 변화되지 않은 칼럼을 통과시키고(결합되지 않고) 수집될 것이다.
본 발명의 방법의 또 다른 형태에서, 크기 배제 크로마토그래피가 실시된다. 본 발명에서 사용된 크기 배제 크로마토그래피에 의해서 입자는 이들의 크기, 즉 이들의 유체역학적 부피에 기초해서 분리된다. 이동상은 시료를 이동시키기 위해서 사용된 수용액(겔 여과 크로마토그래피) 또는 유기 용매(겔침투 크로마토그래피)이다. 정지상은 저압하에서 겔매체(폴리아크릴아미드, 덱스트란 또는 아가로스) 및 필터 또는 고압하에서 실리카 또는 가교된 폴리스티렌 매체이다. 또 다른 형태에서, 상기 크기 배제 크로마토그래피는 칼럼 크로마토그래피로서 실시된다. 본 발명의 방법의 또 다른 형태에서, 상기 크기 배제 크로마토그래피는 독특한 기공크기를 갖는 분자량 씨브, 예를 들면 활성탄, 실리카겔, 제올라이트를 사용하여 실시된다.
본 발명의 방법은 또 다른 형태에서 이온교환 크로마토그래피를 포함한다.
본 발명에 사용된 이온 교환 크로마토그래피는 전체 전하의 단백질 및 관련된 화합물 사이의 차이에 기초한 분자를 분리한다. 단백질 정제, 올리고뉴클레오티드, 펩티드 또는 다른 충전된 분자의 정제에 사용된다. 이러한 분자는 오염물로서 정제 방법에 적용될 용액 내에 존재할 수 있다. 신경독이 존재하는 경우에 흥미 있는 단백질 또는 관련 화합물은 결합하기 위해서 수지에 접착된 관능기의 전하와 반대의 전하를 가져야 한다. 이러한 상호작용은 이온성이기 때문에, 결합은 낮은 이온 조건하에서 발생해야 한다. 용출은 이온 강도를 증가시키거나 이온 상호작용을 파괴하거나 단백질의 pH를 변화시킴으로써 달성된다. 본 발명의 방법에 대해서, 상기 교환 크로마토그래피는 칼럼 크로마토그래피로서 실시된다.
일 형태에서, 본 발명에 따라서 사용된 교환 크로마토그래피는 이온 교환 크로마토그래피이다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명에 사용된 이온 교환 크로마토그래피는 양이온 및/또는 음이온 크로마토그래피에 의해서 실시된다. 본 발명에 사용된 음이온 교환 크로마토그래피에 있어서, 결합한 상기 용질(단백질, 펩티드, 헥산, 엔도톡신)의 표면 전하는 네트 네가티브이므로 특이한 단백질의 결합을 얻기 위해서는 단백질의 pI 근방이거나 클 필요가 있다. 일반적으로 사용된 음이온 교환 수지는 Q-수지(Q 세파로스), 4급 아민; 및 DEAE(디에틸아미노에탄) 수지이다. 일반적으로, 이온 교환 수지는 인공적인 제올라이트로서 사용된, 대전된 표면을 갖는 작은 비즈의 불용성 매트릭스이다. 다른 형태의 수지는 강산성 수지(술폰산기, 예를 들면 소디움 폴리스티렌 설포네이트 또는 polyAMPS), 강염기성 수지(4급 아미노기, 예를 들면, 트리메틸암모늄기, 예를 들면 polyPTAC), 약산성 수지(대부분 카르복실산기), 약염기성 수지(1차, 2차, 및/또는 3차 아미노기, 예를 들면 폴리에틸렌아민)을 포함하는 기능성기에 기초해서 구별될 수 있다. 특별한 형태의 수지는 킬레이트 수지(이미노디아세트산, 티오우레아)를 포함해서 구분될 수 있다.
본원에 사용된 양이온 교환 크로마토그래피에서, 결합한 용질(단백질, 펩티드, 핵산, 엔도톡신)의 표면 저하는 네트 포지티브이므로, 특이한 단백질의 결합을 얻기 위해서는 단백질의 pI 근방이거나 작을 필요가 있다. 일반적으로 양이온 교환 수지는 S-세린, 설페이트 유도체; 및 CM 수지, 카르복실레이트 유도 이온이 사용된다.
본 발명의 방법의 형태에 있어서, 상기 이온 교환 크로마토그래피는 친화성 크로마토그래피의 전 및/또는 후에 실시된다. 본 발명의 방법의 또 다른 형태에 있어서, 본 발명에서 사용된 상기 이온 교환 크로마토그래피는 본 발명의 친화성 크로마토그래피 전에 실시된다.
이러한 수단에 의해서, 친화성 크로마토그래피 중에 잠재적인 크로스 반응성 또는 비특이성 결합의 위험이 더욱 피해지고 감소될 수 있다.
본 발명의 방법은 미처리된 또는 부분적으로 처리된 전구체 폴리펩티드를 함유하지 않은 활성 처리된 신경독을 제조하므로 대량의 활성 처리된 신경독 폴리펩티드를 얻는다.
본 발명은 미처리된 또는 부분적으로 처리된 전구체 폴리펩티드로부터 활성 처리된 신경독을 분리하기 위해서 본 발명의 항체를 사용하는 것을 말한다. 일 형태에서, 본 발명의 항체는 상기 폴리펩티드의 혼합물을 함유하는 용액에서 활성 처리된 신경독 폴리펩티드로부터 미처리되거나 부분적으로 처리된 전구체 신경독 폴리펩티드의 분리에 사용되어 본원에 기재된 미처리된 또는 부분적으로 처리된 전구체 신경독 폴리펩티드를 함유하지 않는 활성 처리된 신경독 폴리펩티드를 얻는다.
본 발명은 상술한 방법의 단계 및 약제로서 단백질 분해효소 처리된 신경독 폴리펩티드를 제형하는 단계를 포함하는 약제의 제조방법에 관한 것이다.
일 형태에서 본원에 사용되는 "약제"는 약학적 활성 화합물로서 생물적으로 활성 (단백질분해 처리된) 신경독 폴리펩티드를 함유한 약제 조성물을 말하고 상기 약학적 조성물은 치료 유효량으로 다양한 질병 또는 장애를 가진 인간 또는 비인간의 치료에 대해 사용될 수 있다.
본원에 사용된 약학적 조성물은 본 발명의 생물적으로 활성적인(단백질 분해효소 처리) 신경독 폴리펩티드를 포함하고, 일 형태에서 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 캐리어를 포함한다. 활성 신경독은 액체 또는 건조 형태로 존재될 수 있다. 일 형태에서, 상기 화합물은 글리세롤, 단백질 안정화제(예를 들면, 인간 혈청 알부민(HAS)) 또는 비단백질 안정화제와 함께 존재할 수 있다.
일 형태에서 약학적 조성물은 국소적으로 투여된다. 종래에 사용된 약물 투여는 근육내, 피하(피부근방)에 투여된다. 그러나, 화합물의 작용 모드 및 특성에 따라서, 약학적 조성물은 다른 루트에 의해서 투여될 수 있다.
화합물, 즉 생물적 활성 (단백질 분해효소 처리) 신경독 폴리펩티드는 상기 조성물의 활성 성분이며, 종래의 절차에 따라서 표준 약학적 캐리어와 함께 약물을 결합함으로써 제조된 종래의 투약 형태로 투여된다. 이들 절차는 소망의 제제에 적당한 혼합, 입상화, 및 압축 또는 용해를 수반할 것이다. 약학적 허용가능한 캐리어 또는 희석액의 형태 및 특성은 결합된 활성성분의 양, 투여 경로 및 다른 공지된 변수에 의해서 결정되는 것으로 이해된다.
캐리어는 제형의 다른 성분과 양립가능하고 그 수용체에 해롭지 않은 것이 허용가능하다. 사용된 약학적 캐리어는 고체, 겔, 또는 액체를 포함할 것이다. 고체 캐리어로는 락토오스, 테라, 알바, 슈크로오스, 탈크, 겔라틴, 아가, 펙틴, 아카시아, 마그네슘 스테아레이트, 스테아린산, 등을 들 수 있다. 액체 캐리어로는 인산 완충 식염수, 시럽, 오일, 물, 에멀젼, 다양한 형태의 습윤제 등을 들 수 있다. 마찬가지로, 캐리어 또는 희석액은 공지된 시간 지연 물질, 예를 들면 글리세릴 모노-스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트를 단독으로 또는 왁스와 함께 포함할 것이다. 상기 적당한 캐리어는 상술한 것 및 공지된 다른 것을 포함하고, 예를 들면 Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania을 참조한다.
희석액은 결합의 생물적 활성에 영향을 미치지 않도록 선택된다. 이러한 희석액로는 증류수, 생리식염수, 링거액, 덱스트로스 용액, 및 Hank 용액을 들 수 있다. 또한, 약학적 조성물 또는 제형은 다른 캐리어, 보조제 또는 비독성, 비치료의, 비면역성 안정화제 등을 포함한다.
치료 유효량은 본 명세서에 말한 질병 또는 상태를 수반한 징후를 예방하고, 개선하거나 치료하는 본 발명의 약학적 조성물에 사용될 화합물의 양을 말한다. 화합물의 치료적 효능 및 독성은 셀 배양물 또는 실험적 동물에서 표준 약학적 절차, 예를 들면 ED50(개체수의 50%에서 치료적으로 유효한 양) 및 LD50(개체수의 50%의 치사량)에 의해서 결정될 수 있다.
치료 및 독성 효능 사이의 투여량 비율은 치료 지수이고 이는 LD50/ED50으로 나타낼 수 있다.
투여방법은 주치의 및 다른 임상 요소에 의해서 결정될 것이다. 의료 행위에서 공지된 바와 같이, 임의의 환자의 투여방법은 많은 요소, 예를 들면 환자의 신장, 체표면적, 나이, 투여될 입상 화합물, 성별, 투여의 시간 및 경로, 일반적인 건강상태에 의존하고 다른 약물이 동시에 투여된다. 진행상태를 주기적으로 모니터링할 수 있다.
본원에서 말하는 약학적 조성물 및 제형은 본 명세서에서 기재한 질병 또는 상태를 치료 또는 개선 또는 예방하기 위해서 적어도 1회 투여된다. 그러나, 상기 약학적 조성물은 1회를 초과해서 투여될 수 있다.
특이적 약학적 조성물은 약학적으로 공지된 방법으로 제조되고 약학적 허용가능한 캐리어 또는 희석액에 관련된 혼합물에서 본원에서 말하는 적어도 하나의 활성 화합물을 포함한다. 이러한 특이적 약학적 조성물을 제조하기 위해서, 활성 화합물은 일반적으로 캐리어 또는 희석액와 혼합될 것이다. 얻어진 제형은 투여의 형태로 채택되기 쉽다. 투여형태 추천은 고려된 수령체에 따라서 투여량 조절을 예상하기 위해서 처방자 또는 사용자 지시에서 나타낼 것이다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명에 따른 약제는 제형중에 약학적 조성물에 첨가된 생물학적으로 활성(단백질 분해효소 처리된) 신경독 폴리펩티드 이외에 약물을 포함할 것이다. 마지막으로, 약학적 조성물의 제형은 품질, 약학적 안전 및 약제의 효능을 보장하기 위해서 GMP 표준화 상태하에서 발생하는 것으로 이해된다.
일반적으로, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해서 얻어진 단백질 분해효소 처리된 신경독 폴리펩티드를 포함한 조성물을 고려한다.
"조성물"은 고체, 액체, 에어로졸(또는 기상) 형태로 제형된 임의의 조성물을 말한다. 상기 조성물은 선택적으로 적당한 보조의 화합물, 예를 들면 희석액 또는 캐리어 또는 또 다른 성분과 함께 본 발명의 화합물을 포함한다. 이러한 점에서, 본 발명은 보조 화합물, 즉 목적을 위해서 조성물의 적용시에 본 발명의 화합물에 의해서 유도된 효과에 기여하지 않는 화합물, 및 또 다른 성분, 즉 본 발명 화합물의 추가의 효과에 기여하거나 그 효과를 변경한 화합물로 본 발명에 대해서 구분된다. 적당한 희석액 및/또는 캐리어는 상기 조성물이 사용되기 위한 목적 및 다른 성분에 따라서 의존한다. 당업자는 이러한 적당한 희석액 및/또는 캐리어를 지체 없이 결정할 수 있다. 적당한 캐리어 및/또는 희석액로는 본원에 기재된다.
본 발명의 형태에서, 상술한 조성물은 보다 상세하게 기재된 약제이다. 일 형태에서, 상기 약제는 적어도 하나의 하기의 질병 및 장애 중 어느 하나의 예방 및/또는 치료하기 위해서 사용될 수 있다: 자발적인 근육 강도, 국소 근긴장이상 예를 들면 경부, 두부성 근긴장이상, 및 양성 본태성 안검 경련증, 반측성 안면 경련증, 및 국소강직, 위장장애, 다한증, 및 미용주름 개선을 포함하고, 또한 일 형태에서 안검경련, 입턱근육긴장이상, 턱관절 개구, 턱관절 폐쇄, 이갈이, 메이그증후군, 혀 긴장이상, 눈뜨기 장애, 목 근 긴장 이상, 앞으로 숙여지는 증상(antecollis), 뒤로 제켜지는 증상(retrocollis), 옆으로 기우는 증상(laterocollis), 사경(torticollis), 인두근긴장이상, 후두 근긴장이상, 경련성 발음장애/내전근, 경련성 발음장애/외전근, 경련성 호흡곤란, 사지 근긴장이상, 팔 근긴장이상, 태스크 특이성 근긴장이상(task specific dystonia), 서경증, 연주자 경련, 골퍼 경련, 다리 근긴장이상, 다리 오므리기(thigh adduction), 다리오므리기 무릎 굴곡, 무릎 신전, 슬관절 굴곡, 슬관절 신전, 내반족, 기형발 근긴장이상, 선조발가락(strial toe), 발가락 굴곡, 발가락 신전, 축성 근긴장이상증, 피사 증후군, 밸리댄서 근긴장이상, 체절성 근긴장이상 편측근긴장이상, 전신성 근긴장이상, 루박병의 근긴장이상, 피질기저퇴화의 근긴장이상, 루박병의 근긴장이상, 지연성 근긴장이상, 척수소뇌성 운동실조의 근긴장이상, 파킨슨병의 근긴장이상, 헌팅턴병 의 근긴장이상, 할러보덴-스파츠병의 근긴장이상, 도파 유도성 운동이상증 /도파 유도성 근긴장이상, 지연성운동장애/지연성 근긴장이상, 발작적 운동장애/근긴장이상, 운동유발성(혹은 비운동 유발성)구개 간대성근경련, 간대성근경련(myoclonus myokymia), 경직, 양성근경련, 유전성 턱경련, 역설성 턱근육 활동, 편측성 저작근경련, 비대성 기관지 근질환(hypertrophic branchial myopathy), 교근비대증(maseteric hypertrophy), 전경골근 비대, 안구진탕증, 동요시핵상 안구운동마비, 간질, 지속적 경련, 경련성 사경 수술 요법, 외전근 성대마비, 난치성 변이성 발음장애, 상부식도 괄약근 장애, 성대 육아종, stuttering Gilles de Ia Tourette 증후군, 중이근경련, 후두폐색 보호(protective larynx closure), 포스트절제, 연설 실패, 안검하수 보호(protective ptosis), 안검내반 오디괄약근 이상(entropion sphincter Odii dysfunction), 유사이완불능(pseudoachalasia), 비-이완불능(nonachalsia), 식도운동 장애, 질경, 수술후 부동화 떨림(postoperative immobilisation tremor), 방광의 기능장애, 배뇨근-괄약근부조, 방광괄약근경련(bladder sphincter spasm), 반측안면 경련, 신경재생 운동장애(reinnervation dyskinesias), 눈가주름 화장품 사용(cosmetic use craw's feet), 안면비대칭(frowning facial asymmetries), 턱끝보조개 (mentalis dimples), 강직인간증후군(stiff person syndrome), 파상풍전립선이상증식(tetanus prostate hyperplasia), 비만증 (Adipositas) 치료, 유아뇌성마비성사시 (infantile cerebral palsy strabismus) , 혼합 마비성 삼출(mixed paralytic concomitant), 망막분리수술후(retinal detachment surgery), 백내장수술후(cataract surgery), 무수정체 근염 사시(aphakia myositic strabismus), 근육병증사시(myopathic strabismus), 해리수직편위(dissociated vertical deviation), 사시수술(strabismus surgery)의 부가물, 내사시(esotropia), 외사시(exotropia), 이완불능증(achalasia), 치열 항문파열(anal fissures), 외분비샘과다활동(exocrine gland hyperactivity), 플레이증후군(Frey syndrome), 악어눈물증후군(Crocodile Tears syndrome), 다한증(hyperhidrosis), 겨드랑이 손바닥 발바닥 비루(axillar palmar plantar rhinorrhea), 중풍(stroke), 파킨슨씨병(Parkinsosn), 근위축성 측삭 경화증 경직 상태(amyotrophic lateral sclerosis spastic conditions), 뇌염(encephalitis), 척수염 자가면역과정(myelitis autoimmune processes)에서 상대적인 타액과다분비(hypersalivation), 다발경화증(multiple sclerosis), 횡단성 척수염(transverse myelitis), 데빅증후군(Devic syndrome), 바이러스감염증(viral infections), 박테리아 감염증(bacterial infections), 기생충감염증(parasitic infections), 진균감염증(fungal infections), 뇌졸중후의 유전성 경직 하반신부전마비증후군 반구상 경색(hereditary spastic paraparesis postapoplectic syndrome hemispheric infarction), 뇌간 경색(brainstem infarction), 척수 경색(myelon infarction), 중추신경계 외상(central nervous system trauma), 반구상 병변(hemispheric lesions), 뇌간 병변(brainstem lesions), 척수 병변(myelon lesion), 중추 신경계 출혈(central nervous system hemorrhage), 뇌내 출혈(intracerebral hemorrhage), 지주막하 출혈(subarachnoidal hemorrhage), 경막하 출혈(subdural hemorrhage), 척수강내 출혈(intraspinal hemorrhage), 종양형성(neoplasias), 반구상 종양(hemispheric tumors), 뇌간 종양(brainstem tumors), 척수 종양(myelon tumors)을 들 수 있다. 세부사항 및 징후에 대해서는, Jost 2007, Drugs 67(5), 669 또는 Dressier 2000 in Botulinum Toxin Therapy, Thieme Verlag, Stuttgart, New York을 참조.
본 발명의 또 다른 형태에서, 조성물은 상기 약학적 조성물에 기재된 바와 같이 제형될 수 있는 화장품용 조성물이다. 마찬가지로, 화장품용 조성물에 대해서, 본 발명의 화합물은 일 형태로 실질적으로 순수한 형태로 사용되는 것으로 생각된다. 화장품용 조성물은 또 다른 형태로 근육내에 적용된다. 본 발명의 더욱 다른 형태에서, 신경독을 포함한 화장품용 조성물은 주름방지 용액으로 제형될 수 있다.
본 명세서에서 인용된 모든 참조문헌은 그 전체 내용 및 명세서에서 구체적으로 언급한 내용에 대해서 참조로 포함되어 있다.
본 발명은 미처리된 및/또는 부분적으로 처리된 신경독 폴리펩티드에 특이적으로 결합한 항체 또는 SEQ ID NOs: 1 내지 16 중 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩티드로 이루어진 에피토프에 특이적으로 결합한 항체 및 이러한 항체의 제조방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 미처리된 또는 부분적으로 처리된 신경독 폴리펩티드를 함유하지 않는 처리된 신경독 폴리펩티드를 포함한 조성물 및 본 발명의 항체에 기초한 상기 신경독 폴리펩티드의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명은 미처리된 또는 부분적으로 처리된 신경독 폴리펩티드로부터 처리된 신경독 폴리펩티드를 분리하거나 미처리된 또는 부분적으로 처리된 신경독 폴리펩티드를 결정하기 위한 상기 항체의 사용에 관한 것이다. 본 발명은 약제의 제조방법에 관한 것이다.
도 1은 신경독 폴리펩티드의 종래의 크로마토그래피 정제의 개략도이다.
도 2는 생물학적 활성(단백질 분해효소 처리) 신경독 폴리펩티드의 크로마토그래피 정제 및 본 발명에 따른 부분적으로 처리된 또는 미처리된 폴리펩티드 전구체의 분리의 개략도이다.
도 3은 본 발명의 방법에 의해서 얻어진 SEQ ID NO: 25 를 특이적으로 인식하는 항체를 사용한 웨스턴 블롯이다. 밴드의 크기는 kDa로 나타낸다. 개개의 레인은 실시예에서 설명된다.
실시예 1: 면역원 및 항체의 발생
면역원의 발생
1. 링커펩티드-면역원 I: 서열 NH2-TKSLDKGYNK-C-COOH 을 갖는 펩티드는 외부의 공급자에 의해서 발생한 후 링커 GMBS에 의해서 캐리어-단백질 KLH에 결합된다.
2. 링커펩티드-면역원 II: a)오발부민의 활성; 2.18mg의 설포-smcc(설퍼숙신이미딜-4(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트)를 50㎕ DMSO에서 용해시켰다. 그 다음에 7.5mg/ml 오발부민(버퍼:5mM 소디움포스페이트; 0.9% NaCl)을 함유하는 2.5mL의 오발부민 용액을 첨가하고, 그 용액을 실온에서 1시간동안 회전배양했다. 버퍼는 PD10 칼럼을 사용하여 변경하고, 10 mM 소디움포스페이트; 0.9% NaCl을 함유하는 3.5 ml 버퍼에서 활성화된 오발부민을 용출시켰다. b)오발부민에 펩티드의 결합; 8mg의 펩티드 Ac-DKGYNC-OH 을 250㎕ H2O 및 2.5㎕ 500 mM TCEP HCL(트리스[2-카르복시에틸]포스핀 HCL)에 용해하고, 그 다음에 1mM NaOH로 중화시켰다. 마지막으로, 활성화된 오발부민을 첨가하고, 그 반응 혼합물을 실온에서 4.4h동안 회전 배양했다. 10 mM 시스테인 용액을 첨가함으로써, 잔류하는 반응 잔사를 1h동안 회전배양에 의해서 차단했다. 투석을 10 mM 소디움 포스페이트; 0.9% NaCl을 사용하여 실시했다.
면역
면역에 의해서 항혈청을 얻었다.
1)항링커펩티드 scBoNT/A-혈청 I: 면역원으로서 상기 링커펩티드 면역원 I은 링커 GMBS에 의해서 캐리어-단백질 KLH에 결합된 것을 사용하였다. 2마리 염소 각각에 우선 Freud' schem 보조제에서 300㎍의 데카펩티드 면역원으로 피하에 면역시키고 마지막으로 불완전한 Freud' schem 보조제에서 100㎍의 데카펩티드 면역원으로 2주 간격으로 4회동안 면역시켰다. 49, 63, 77 및 84 일후에 항형철을 수집했다. 친화성 크로마토그래피는 마지막 84일의 채혈로부터 수집된 혈청을 사용하여 실시했다.
2)항링커펩티드 scBoNT/A-혈청 II: 면역원으로서 링커 SMCC에 의해서 캐리어-단백질 오발부민에 결합된 상기 링커펩티드 면역원 II을 사용하였다. 2마리 토끼 각각에 우선 Freud' schem 보조제에서 300㎍의 링커펩티드 면역원 II으로 피내에 면역시키고 마지막으로 2주 간격으로 5회 동안 Montanide ISA 206에서 150㎍의 링커펩티드 면역원 II으로 면역시켰다. 친화성 크로마토그래피는 60일 또는 110일의 채혈로부터 수집된 혈청을 사용하여 실시했다.
혈청의 2단계 친화성 크로마토그래피
1. 매트릭스의 발생: 2단계 친화성 크로마토그래피에 대해서, 다른 펩티드를 함유하는 2개의 다른 울트라 링크 요오드아세틸 매트릭스를 발생시켰다.
일측에, 크로스 반응 펩티드, SLD, LDK 및 YNK 는 하기의 펩티드의 형태로 나타내고, 하기의 일반적인 설명에 따라서 매트릭스에 결합되었다: Ac-ELDKYN-C-COOH (SEQ ID NO: 26), NH2-NISLDL-C-COOH (SEEQ ID NO: 27) 및 NH2-YYNKF-C-COOH (SEQ ID NO: 28). 타측에, 링커 펩티드(SEQ ID NO: 25)를 하기의 일반적인 설명에 따라서 하기 유도체의 형태로 매트릭스에 결합하였다: Ac-TKSLDKGYNKA-C-COOH
일반적인 설명:
커플링 버퍼: 50 mM Tris, 5 mM EDTA-Na, pH 8.5. 사용될 UltraLink® Iodoacyl Gel의 20배와 동일한 체적의 버퍼를 제조했다.
L-시스테인 HCL; 세정액: 1 mM 소디움클로라이드 (NaCl).
상부 및 하부에서 캡핑된 gravity-flow 또는 spin column을 비우는 단계:
펩티드 또는 단백질 시료를 제조하는 단계
상기 펩티드를 결합 버퍼로 용해하는 단계
UltraLink®Iodoacyl Gel에 결합:
1. gravity-flow olumn에 하부 캡을 갖고, 원하는 양의 UltraLink®Iodoacyl Gel 슬러리를 첨가하여 겔을 15분 동안 배치하는 단계;
2. 팩킹된 칼럼으로부터 액체를 배수하고, UltraLink®Iodoacyl Gel을 칼럼으로부터 배수된 겔베드의 상부에 버퍼를 첨가함으로써 5 겔-베드 체적의 결합 버퍼로 세정/평형화하는 단계. 겔베드를 건조시키지 않는다.
3. 하부 캡을 대체하고 상기 제조된 술피드릴 함유 시료를 첨가하는 단계
UltraLink®Iodoacyl Gel 1mL 당 시료의 대략 1mL를 가할 수 있다.
4. 상부 캡을 대체하고 실온에서 15분동안 칼럼을 혼합하는 단계
5. 칼럼을 똑바로 세우고, 실온에서 30분동안 혼합없이 배양하는 단계
6. 상부 및 하부 칼럼 캡을 제거하고 상기 용액을 배수하는 단계
7. 칼럼을 3 겔-배드 체적의 결합 버퍼로 세정하는 단계
겔에 비특이성 결합 부위를 차단.
1. 칼럼에 하부 캡을 대체하는 단계
2. 결합버퍼에서 50 mM L-시스테인 HCL의 용액을 제조하고, 1mL 용액을 각각 겔 1mL에 대한 칼럼에 첨가하는 단계
3. 상부 캡을 대체하고 실온에서 15분동안 혼합한 후, 상기 반응을 실온에서 추가의 30분동안 혼합없이 배양하는 단계
2. 2단계의 친화성 크로마토그래피:
우선, 정제된 혈청은 혈액으로부터 분리된다.
조-혈청을 크로스 반응 트리펩티드를 함유하는 칼럼에서 제공된다. 크로스 반응 항체는 트리펩티드에 결합되고 상기 조 혈청으로부터 분리된다. 제 1 칼럼의 여액은 결합된 링커펩티드를 함유한 제 2 칼럼으로 제공된다. 상기 링커펩티드 특이성 항체는 링커펩티드에 결합한다. 낮은 친화성 항-링커펩티드 scBoNT/A 항체는 PBS 버퍼(0.5 M NaCl)로 매우 엄격한 세정에 의해서 칼럼으로부터 제거한다. 그 다음에, 결합된 높은 친화성 항링커펩티드 scBoNT/A 항체는 용출되고 농축된다. 이러한 농축액은 사용된 항 링커펩티드 scBoNT/A 혈청에 상응한다.
실시예 2: 항체 특이성의 시험 및 확인
시약 ELISA:
코팅 버퍼: 0.005 M-1M Tris; 0.9 % NaCl, 바람직하게 0.01 M -0.2 M Tris; 0.9 % NaCl, pH = 8.5.
캐처 항체 (Catcher antibody): 항링커펩티드 scBoNT/A 혈청.
차단 및 항체 희석액 버퍼: 0.01 M 소디움 포스페이트에서 0.5% - 5% BSA; 0.9% NaCl, pH = 7.4.
시료 버퍼: 0.005 M-1 M 소디움 포스페이트에서 0.5 % - 5 % BSA; 0.1 - 0.5 M NaCl; 0.005 -0.1 M 소디움 포스페이트에서 0.01 % - 1 % Tween 20, 바람직하게 1 % - 3 % BSA; 0.15 M-0.4 M NaCl; 0.05 % - 0.5 % Tween 20, pH = 7.4.
세정 버퍼: 0.01 M 소디움 포스페이트; 0.9 % NaCl; 0.05 % Tween 20, pH = 7.4.
검출 항체: BoNT/A에 대한 모노클로날 항체.
제 2 항체: 페록시다제에 결합된 폴리클로날 항 생쥐 IgG (H&L) 항체.
기질: 시판 TMB.
2. 웨스턴 블롯 시약:
시판되는 시료 버퍼 변성
시판 SDS 겔
MES 러닝버퍼 (SDS PAGE): 시판.
PVDF membrane: 시판.
트랜스퍼 버퍼 (Western Blot): 시판.
시료: Dichain-BoNT/A 및 scBoNT/A를 갖는 보툴리눔 신경독 A.
제 1 항체: 항 링커펩티드 scBoNT/A 혈청.
제 2 항체: 알칼리성 포스파타제에 결합된 폴리클로날 당나귀 안티 염소 항체 IgG (H&L).
차단 및 항체 희석액 버퍼: 0.01 M - 0.1 M Tris에서 0.5 % - 5 % BSA; 0.9 % NaCl; 0.05 % - 5 % Tween 20, pH = 7.4.
세정 버퍼: 0.01 M -0.1 M Tris; 0.9 % NaCl; 0.05 % - 5 % Tween 20, pH = 7.4.
Tris 버퍼: 0.025 M Tris, pH = 8.0.
기질: BCIP/NBT, 시판.
BoNT/B 및 BoNT/E에 대한 항혈청의 특이성: BoNT/B 및 BoNT/E에 대한 항혈청의 특이성을 결정하기 위해서, ELISA에서 기질의 회복속도를 분석했다. 미세적정판은 0.5 ㎍ 항링커펩티드 scBoNT/A-혈청/mL 을 함유하는 100 ㎕/웰의 코팅 버퍼로 실온에서 16h동안 배양한 후 세정 버퍼로 3회 세정했다. 200㎕/웰 차단 용액을 미세적정판에 첨가하고 실온에서 1h동안 배양했다. 항원 scBoNT/A (시료 버퍼 내의 희석액 시리즈; pg/ml 농도) 는 검량 기준 물질로서 사용되고, 미세적정판은 100㎕/웰 검량 기준물질로 배양했다. BoNT/B 또는 BoNT/E은 시료 버퍼에서 희석되고 미세적정판에 100㎕/웰의 부피로 도포했다. 양측 기판은 과잉으로 도포되고, 200ng/mL의 희석액이 사용된다. 시료 및 기준물질은 37℃에서 2h동안 배양했다. 미세적정판은 세정 버퍼로 3회 세정했다. 100 ㎕의 검출 버퍼/웰을 첨가하고 실온에서 1h동안 배양했다. 미세적정판은 세정버퍼로 3회세정했다. 그 다음에 실온에서 제 2 항체의 100㎕/웰의 배양이 1시간동안 실시된다. 그 다음에, 미세적정판은 세정 버퍼로 3회 세정했다.
검출 반응은 100㎕기질/웰의 첨가에 의해서 시작된다. 실온에서 30분간 배양후, 반응은 50㎕의 2M H2SO4/웰을 첨가해서 중단하고 흡수율은 450nm에서 결정한다. 특이성을 결정하기 위해서, BoNT/b 및 BoNT/E 농도는 표준화에 의해서 산출된다. 회복률을 산출함으로써, 스테로타입 B 및 C의 항 링커펩티드 scBoNT/A를 결정할 수 있다. 회복률이 낮을수록, 크로스 반응성이 낮고, scBoNT/A에 따라서 혈청의 특이성이 양호하게 된다.
b) Dichain BoNT/A에 대한 항링커펩티드scBoNT/A 의 특이성: 활성화 Dichain-BoNT/A 에 따른 항혈청의 특이성을 결정하기 위해서, 웨스턴 블롯팅에 의한 면역조직학적 검출이 실시된다. NT 시료(사용된 시료에 의존하는 Dichain-BoNT/A 적어도 50ng의 scBoNT/A)는 SDS-PAGE에 의해서 환원조건하에서 분자량에 따라서 scBoNT/A, LC 및 HC (Dichain-BoNT/A) 로 분리된다. 단백질은 PVDF 막에 블롯팅된다. 막은 실온에서 1h동안 20 mL 차단 버퍼로 차단된다. 상기 차단 버퍼를 제거하고 0.005 mg/ml 항 링커펩티드 scBoNT/A 혈청을 함유한 20mL의 제 1 항체 용액을 첨가한다. 제 1 항체는 4℃에서 1일밤 배양한다. 항체 함유 용액을 제거하고 상기 막을 37℃에서 20 mL 세정버퍼로 30분간 3회 세정한다. 그 다음에, 상기 막을 실온에서 20mL의 제 2 항체를 0.4㎍/mL 농도로 3h동안 배양한다. 제 2 항체 용액이 제거되고 상기 막은 37℃에서 20mL의 세정 버퍼로 30분간 3회 세정한다. 또한, 상기 막을 실온에서 5분간 20mL의 25mM TRIS 버퍼로 1회 세정한다.
검출 반응은 기질 첨가에 실시된다. 기질은 15분동안 배양되고 착색반응을 물을 첨가해서 중단한다. 특이성은 150kDa에서 scBoNT/A band 의 염색에 의해서 결정된다. 항 링커펩티드의 특이성은 150kDa 특이성 밴드가 검출되지만 100kDa (HC) 및 50kDa (LC)에서 Dichain BoNT/A 에 대한 밴드 특이성을 검출되지 않을 때 결정된다. 도 3은 레인 3에서 BoNT/A 제조(NT시료, 상기 참조)의 150 kDa scBoNT/A 에 대한 특이성을 나타낸다. 100 kDa 또는 50 kDa에서 밴드가 나타나지 않고 scBoNT/A 만 인지된다. 비교하기 위해서, 레인 4에서 부분적으로 처리된 및 미처리된 scBoNT/A의 혼합물을 나타내고 레인 5에는 비절단 scBoNT/A 대조군을 나타낸다. 버퍼 제어는 레인 2에서 나타낸다.
<110> MERZ PHARMA GMBH & CO. KGAA <120> MEANS AND METHODS FOR MANUFACTURING HIGHLY PURE NEUROTOXIN <130> IP-2011-0597 <150> US 61/207,989 <151> 2009-02-19 <150> EP 09153226.7 <151> 2009-02-19 <150> EP 09168679.0 <151> 2009-08-26 <150> US 61/275,173 <151> 2009-08-26 <160> 28 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium botulinum <400> 1 Thr Lys Ser Leu Asp Lys Gly Tyr Asn Lys 1 5 10 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Clostridium botulinum <400> 2 Cys Lys Ser Val Lys Ala Pro Gly Ile Cys 1 5 10 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Clostridium botulinum <400> 3 Ser Leu Tyr Asn Lys 1 5 <210> 4 <211> 3 <212> PRT <213> Clostridium botulinum <400> 4 Asn Ser Arg 1 <210> 5 <211> 3 <212> PRT <213> Clostridium botulinum <400> 5 Gly Ile Arg 1 <210> 6 <211> 4 <212> PRT <213> Clostridium botulinum <400> 6 Lys Gly Thr Lys 1 <210> 7 <211> 4 <212> PRT <213> Clostridium botulinum <400> 7 Asn Gly Thr Lys 1 <210> 8 <211> 6 <212> PRT <213> Clostridium tetani <400> 8 Glu Asn Leu Tyr Asn Arg 1 5 <210> 9 <211> 31 <212> PRT <213> Clostridium botulinum <400> 9 Lys Leu Leu Cys Val Arg Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu 1 5 10 15 Asp Lys Gly Tyr Asn Lys Ala Leu Asn Asp Leu Cys Ile Lys Val 20 25 30 <210> 10 <211> 16 <212> PRT <213> Clostridium botulinum <400> 10 Ile Gln Met Cys Lys Ser Val Lys Ala Pro Gly Ile Cys Ile Asp Val 1 5 10 15 <210> 11 <211> 25 <212> PRT <213> Clostridium botulinum <400> 11 Thr Lys Phe Cys His Lys Ala Ile Asp Gly Arg Ser Leu Tyr Asn Lys 1 5 10 15 Thr Leu Asp Cys Arg Glu Leu Leu Val 20 25 <210> 12 <211> 20 <212> PRT <213> Clostridium botulinum <400> 12 Thr Lys Val Cys Leu Arg Leu Thr Lys Asn Ser Arg Asp Asp Ser Thr 1 5 10 15 Cys Ile Lys Val 20 <210> 13 <211> 21 <212> PRT <213> Clostridium botulinum <400> 13 Ile Arg Phe Cys Lys Asn Ile Val Ser Val Lys Gly Ile Arg Lys Ser 1 5 10 15 Ile Cys Ile Glu Ile 20 <210> 14 <211> 23 <212> PRT <213> Clostridium botulinum <400> 14 Val Lys Phe Cys Lys Ser Val Ile Pro Arg Lys Gly Thr Lys Ala Pro 1 5 10 15 Pro Arg Leu Cys Ile Arg Val 20 <210> 15 <211> 21 <212> PRT <213> Clostridium botulinum <400> 15 Ile Ala Met Cys Lys Pro Val Met Tyr Lys Asn Thr Gly Lys Ser Glu 1 5 10 15 Gln Cys Ile Ile Val 20 <210> 16 <211> 35 <212> PRT <213> Clostridium tetani <400> 16 Ile Gly Leu Cys Lys Lys Ile Ile Pro Pro Thr Asn Ile Arg Glu Asn 1 5 10 15 Leu Tyr Asn Arg Thr Ala Ser Leu Thr Asp Leu Gly Gly Glu Leu Cys 20 25 30 Ile Lys Ile 35 <210> 17 <211> 1296 <212> PRT <213> Clostridium botulinum <400> 17 Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly 1 5 10 15 Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro 20 25 30 Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg 35 40 45 Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu 50 55 60 Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr 65 70 75 80 Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu 85 90 95 Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val 100 105 110 Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser 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Asn 1090 1095 1100 Lys Lys Tyr Tyr Leu Phe Asn Leu Leu Arg Lys Asp Lys Tyr Ile Thr 1105 1110 1115 1120 Arg Asn Ser Gly Ile Leu Asn Ile Asn Gln Gln Arg Gly Val Thr Gly 1125 1130 1135 Gly Ile Ser Val Phe Leu Asn Tyr Lys Leu Tyr Glu Gly Val Glu Val 1140 1145 1150 Ile Ile Arg Lys Asn Ala Pro Ile Asp Ile Ser Asn Thr Asp Asn Phe 1155 1160 1165 Val Arg Lys Asn Asp Leu Ala Tyr Ile Asn Val Val Asp His Gly Val 1170 1175 1180 Glu Tyr Arg Leu Tyr Ala Asp Ile Ser Ile Thr Lys Ser Glu Lys Ile 1185 1190 1195 1200 Ile Lys Leu Ile Arg Thr Ser Asn Pro Asn Asp Ser Leu Gly Gln Ile 1205 1210 1215 Ile Val Met Asp Ser Ile Gly Asn Asn Cys Thr Met Asn Phe Gln Asn 1220 1225 1230 Asn Asp Gly Ser Asn Ile Gly Leu Leu Gly Phe His Ser Asp Asp Leu 1235 1240 1245 Val Ala Ser Ser Trp Tyr Tyr Asn His Ile Arg Arg Asn Thr Ser Ser 1250 1255 1260 Asn Gly Cys Phe Trp Ser Phe Ile Ser Lys Glu His Gly Trp Lys Glu 1265 1270 1275 1280 <210> 23 <211> 1297 <212> PRT <213> Clostridium botulinum <220> <221> misc_feature <222> (7)...(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 23 Met Pro Val Asn Ile Lys Xaa Phe Asn Tyr Asn Asp Pro Ile Asn Asn 1 5 10 15 Asp Asp Ile Ile Met Met Glu Pro Phe Asn Asp Pro Gly Pro Gly Thr 20 25 30 Tyr Tyr Lys Ala Phe Arg Ile Ile Asp Arg Ile Trp Ile Val Pro Glu 35 40 45 Arg Phe Thr Tyr Gly Phe Gln Pro Asp Gln Phe Asn Ala Ser Thr Gly 50 55 60 Val Phe Ser Lys Asp Val Tyr Glu Tyr Tyr Asp Pro Thr Tyr Leu Lys 65 70 75 80 Thr Asp Ala Glu Lys Asp Lys Phe Leu Lys Thr Met Ile Lys Leu Phe 85 90 95 Asn Arg Ile Asn Ser Lys Pro Ser Gly Gln Arg Leu Leu Asp Met Ile 100 105 110 Val Asp Ala Ile Pro Tyr Leu Gly Asn Ala Ser Thr Pro Pro Asp Lys 115 120 125 Phe Ala Ala Asn Val Ala Asn Val Ser Ile Asn Lys Lys Ile Ile Gln 130 135 140 Pro Gly Ala Glu Asp Gln Ile Lys Gly Leu Met Thr Asn Leu Ile Ile 145 150 155 160 Phe Gly Pro Gly Pro Val Leu Ser Asp Asn Phe Thr Asp Ser Met Ile 165 170 175 Met Asn Gly His Ser Pro Ile Ser Glu Gly Phe Gly Ala Arg Met Met 180 185 190 Ile Arg Phe Cys Pro Ser Cys Leu Asn Val Phe Asn Asn Val Gln Glu 195 200 205 Asn Lys Asp Thr Ser Ile Phe Ser Arg Arg Ala Tyr Phe Ala Asp Pro 210 215 220 Ala Leu Thr Leu Met His Glu Leu Ile His Val Leu His Gly Leu Tyr 225 230 235 240 Gly Ile Lys Ile Ser Asn Leu Pro Ile Thr Pro Asn Thr Lys Glu Phe 245 250 255 Phe Met Gln His Ser Asp Pro Val Gln Ala Glu Glu Leu Tyr Thr Phe 260 265 270 Gly Gly His Asp Pro Ser Val Ile Ser Pro Ser Thr Asp Met Asn Ile 275 280 285 Tyr Asn Lys Ala Leu Gln Asn Phe Gln Asp Ile Ala Asn Arg Leu Asn 290 295 300 Ile Val Ser Ser Ala Gln Gly Ser Gly Ile Asp Ile Ser Leu Tyr Lys 305 310 315 320 Gln Ile Tyr Lys Asn Lys Tyr Asp Phe Val Glu Asp Pro Asn Gly Lys 325 330 335 Tyr Ser Val Asp Lys Asp Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Ala Leu Met 340 345 350 Phe Gly Phe Thr Glu Thr Asn Leu Ala Gly Glu Tyr Gly Ile Lys Thr 355 360 365 Arg Tyr Ser Tyr Phe Ser Glu Tyr Leu Pro Pro Ile Lys Thr Glu Lys 370 375 380 Leu Leu Asp Asn Thr Ile Tyr Thr Gln Asn Glu Gly Phe Asn Ile Ala 385 390 395 400 Ser Lys Asn Leu Lys Thr Glu Phe Asn Gly Gln Asn Lys Ala Val Asn 405 410 415 Lys Glu Ala Tyr Glu Glu Ile Ser Leu Glu His Leu Val Ile Tyr Arg 420 425 430 Ile Ala Met Cys Lys Pro Val Met Tyr Lys Asn Thr Gly Lys Ser Glu 435 440 445 Gln Cys Ile Ile Val Asn Asn Glu Asp Leu Phe Phe Ile Ala Asn Lys 450 455 460 Asp Ser Phe Ser Lys Asp Leu Ala Lys Ala Glu Thr Ile Ala Tyr Asn 465 470 475 480 Thr Gln Asn Asn Thr Ile Glu Asn Asn Phe Ser Ile Asp Gln Leu Ile 485 490 495 Leu Asp Asn Asp Leu Ser Ser Gly Ile Asp Leu Pro Asn Glu Asn Thr 500 505 510 Glu Pro Phe Thr Asn Phe Asp Asp Ile Asp Ile Pro Val Tyr Ile Lys 515 520 525 Gln Ser Ala Leu Lys Lys Ile Phe Val Asp Gly Asp Ser Leu Phe Glu 530 535 540 Tyr Leu His Ala Gln Thr Phe Pro Ser Asn Ile Glu Asn Leu Gln Leu 545 550 555 560 Thr Asn Ser Leu Asn Asp Ala Leu Arg Asn Asn Asn Lys Val Tyr Thr 565 570 575 Phe Phe Ser Thr Asn Leu Val Glu Lys Ala Asn Thr Val Val Gly Ala 580 585 590 Ser Leu Phe Val Asn Trp Val Lys Gly Val Ile Asp Asp Phe Thr Ser 595 600 605 Glu Ser Thr Gln Lys Ser Thr Ile 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Glu Val Asn Ile Leu Lys Ser Lys 820 825 830 Val Asn Arg His Leu Lys Asp Ser Ile Pro Phe Asp Leu Ser Leu Tyr 835 840 845 Thr Lys Asp Thr Ile Leu Ile Gln Val Phe Asn Asn Tyr Ile Ser Asn 850 855 860 Ile Ser Ser Asn Ala Ile Leu Ser Leu Ser Tyr Arg Gly Gly Arg Leu 865 870 875 880 Ile Asp Ser Ser Gly Tyr Gly Ala Thr Met Asn Val Gly Ser Asp Val 885 890 895 Ile Phe Asn Asp Ile Gly Asn Gly Gln Phe Lys Leu Asn Asn Ser Glu 900 905 910 Asn Ser Asn Ile Thr Ala His Gln Ser Lys Phe Val Val Tyr Asp Ser 915 920 925 Met Phe Asp Asn Phe Ser Ile Asn Phe Trp Val Arg Thr Pro Lys Tyr 930 935 940 Asn Asn Asn Asp Ile Gln Thr Tyr Leu Gln Asn Glu Tyr Thr Ile Ile 945 950 955 960 Ser Cys Ile Lys Asn Asp Ser Gly Trp Lys Val Ser Ile Lys Gly Asn 965 970 975 Arg Ile Ile Trp Thr Leu Ile Asp Val Asn Ala Lys Ser Lys Ser Ile 980 985 990 Phe Phe Glu Tyr Ser Ile Lys Asp Asn Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Lys 995 1000 1005 Trp Phe Ser Ile Thr Ile Thr Asn Asp Arg Leu Gly Asn Ala Asn Ile 1010 1015 1020 Tyr Ile Asn Gly Ser Leu Lys Lys Ser Glu Lys Ile Leu Asn Leu Asp 1025 1030 1035 1040 Arg Ile Asn Ser Ser Asn Asp Ile Asp Phe Lys Leu Ile Asn Cys Thr 1045 1050 1055 Asp Thr Thr Lys Phe Val Trp Ile Lys Asp Phe Asn Ile Phe Gly Arg 1060 1065 1070 Glu Leu Asn Ala Thr Glu Val Ser Ser Leu Tyr Trp Ile Gln Ser Ser 1075 1080 1085 Thr Asn Thr Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asn Pro Leu Arg Tyr Asp Thr 1090 1095 1100 Gln Tyr Tyr Leu Phe Asn Gln Gly Met Gln Asn Ile Tyr Ile Lys Tyr 1105 1110 1115 1120 Phe Ser Lys Ala Ser Met Gly Glu Thr Ala Pro Arg Thr Asn Phe Asn 1125 1130 1135 Asn Ala Ala Ile Asn Tyr Gln Asn Leu Tyr Leu Gly Leu Arg Phe Ile 1140 1145 1150 Ile Lys Lys Ala Ser Asn Ser Arg Asn Ile Asn Asn Asp Asn Ile Val 1155 1160 1165 Arg Glu Gly Asp Tyr Ile Tyr Leu Asn Ile Asp Asn Ile Ser Asp Glu 1170 1175 1180 Ser Tyr Arg Val Tyr Val Leu Val Asn Ser Lys Glu Ile Gln Thr Gln 1185 1190 1195 1200 Leu Phe Leu Ala Pro Ile Asn Asp Asp Pro Thr Phe Tyr Asp Val Leu 1205 1210 1215 Gln Ile Lys Lys Tyr Tyr Glu Lys Thr Thr Tyr Asn Cys Gln Ile Leu 1220 1225 1230 Cys Glu Lys Asp Thr Lys Thr Phe Gly Leu Phe Gly Ile Gly Lys Phe 1235 1240 1245 Val Lys Asp Tyr Gly Tyr Val Trp Asp Thr Tyr Asp Asn Tyr Phe Cys 1250 1255 1260 Ile Ser Gln Trp Tyr Leu Arg Arg Ile Ser Glu Asn Ile Asn Lys Leu 1265 1270 1275 1280 Arg Leu Gly Cys Asn Trp Gln Phe Ile Pro Val Asp Glu Gly Trp Thr 1285 1290 1295 Glu <210> 24 <211> 1315 <212> PRT <213> Clostridium tetani <400> 24 Met Pro Ile Thr Ile Asn Asn Phe Arg Tyr Ser Asp Pro Val Asn Asn 1 5 10 15 Asp Thr Ile Ile Met Met Glu Pro Pro Tyr Cys Lys Gly Leu Asp Ile 20 25 30 Tyr Tyr Lys Ala Phe Lys Ile Thr Asp Arg Ile Trp Ile Val Pro Glu 35 40 45 Arg Tyr Glu Phe Gly Thr Lys Pro Glu Asp Phe Asn Pro Pro Ser Ser 50 55 60 Leu Ile Glu Gly Ala Ser Glu Tyr Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Arg Thr 65 70 75 80 Asp Ser Asp Lys Asp Arg Phe Leu Gln Thr Met Val Lys Leu Phe Asn 85 90 95 Arg Ile Lys Asn Asn Val Ala Gly Glu Ala Leu Leu Asp Lys Ile Ile 100 105 110 Asn Ala Ile Pro Tyr Leu Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Leu Asp Lys Phe 115 120 125 Asp Thr Asn Ser Asn Ser Val Ser Phe Asn Leu Leu Glu Gln Asp Pro 130 135 140 Ser Gly Ala Thr Thr Lys Ser Ala Met Leu Thr Asn Leu Ile Ile Phe 145 150 155 160 Gly Pro Gly Pro Val Leu Asn Lys Asn Glu Val Arg Gly Ile Val Leu 165 170 175 Arg Val Asp Asn Lys Asn Tyr Phe Pro Cys Arg Asp Gly Phe Gly Ser 180 185 190 Ile Met Gln Met Ala Phe Cys Pro Glu Tyr Val Pro Thr Phe Asp Asn 195 200 205 Val Ile Glu Asn Ile Thr Ser Leu Thr Ile Gly Lys Ser Lys Tyr Phe 210 215 220 Gln Asp Pro Ala Leu Leu Leu Met His Glu Leu Ile His Val Leu His 225 230 235 240 Gly Leu Tyr Gly Met Gln Val Ser Ser His Glu Ile Ile Pro Ser Lys 245 250 255 Gln Glu Ile Tyr Met Gln His Thr Tyr Pro Ile Ser Ala Glu Glu Leu 260 265 270 Phe Thr Phe Gly Gly Gln Asp Ala Asn Leu Ile Ser Ile Asp Ile Lys 275 280 285 Asn Asp Leu Tyr Glu Lys Thr Leu Asn Asp Tyr Lys Ala Ile Ala Asn 290 295 300 Lys Leu Ser Gln Val Thr Ser Cys Asn Asp Pro Asn Ile Asp Ile Asp 305 310 315 320 Ser Tyr Lys Gln Ile Tyr Gln Gln Lys Tyr Gln Phe Asp Lys Asp Ser 325 330 335 Asn Gly Gln Tyr Ile Val Asn Glu Asp Lys Phe Gln Ile Leu Tyr Asn 340 345 350 Ser Ile Met Tyr Gly Phe Thr Glu Ile Glu Leu Gly Lys Lys Phe Asn 355 360 365 Ile Lys Thr Arg Leu Ser Tyr Phe Ser Met Asn His Asp Pro Val Lys 370 375 380 Ile Pro Asn Leu Leu Asp Asp Thr Ile Tyr Asn Asp Thr Glu Gly Phe 385 390 395 400 Asn Ile Glu Ser Lys Asp Leu Lys Ser Glu Tyr Lys Gly Gln Asn Met 405 410 415 Arg Val Asn Thr Asn Ala Phe Arg Asn Val Asp Gly Ser Gly Leu Val 420 425 430 Ser Lys Leu Ile Gly Leu Cys Lys Lys Ile Ile Pro Pro Thr Asn Ile 435 440 445 Arg Glu Asn Leu Tyr Asn Arg Thr Ala Ser Leu Thr Asp Leu Gly Gly 450 455 460 Glu Leu Cys Ile Lys Ile Lys Asn Glu Asp Leu Thr Phe Ile Ala Glu 465 470 475 480 Lys Asn Ser Phe Ser Glu Glu Pro Phe Gln Asp Glu Ile Val Ser Tyr 485 490 495 Asn Thr Lys Asn Lys Pro Leu Asn Phe Asn Tyr Ser Leu Asp Lys Ile 500 505 510 Ile Val Asp Tyr Asn Leu Gln Ser Lys Ile Thr Leu Pro Asn Asp Arg 515 520 525 Thr Thr Pro Val Thr Lys Gly Ile Pro Tyr Ala Pro Glu Tyr Lys Ser 530 535 540 Asn Ala Ala Ser Thr Ile Glu Ile His Asn Ile Asp Asp Asn Thr Ile 545 550 555 560 Tyr Gln Tyr Leu Tyr Ala Gln Lys Ser Pro Thr Thr Leu Gln Arg Ile 565 570 575 Thr Met Thr Asn Ser Val Asp Asp Ala Leu Ile Asn Ser Thr Lys Ile 580 585 590 Tyr Ser Tyr Phe Pro Ser Val Ile Ser Lys Val Asn Gln Gly Ala Gln 595 600 605 Gly Ile Leu Phe Leu Gln Trp Val Arg Asp Ile Ile Asp Asp Phe Thr 610 615 620 Asn Glu Ser Ser Gln Lys Thr Thr Ile Asp Lys Ile Ser Asp Val Ser 625 630 635 640 Thr Ile Val Pro Tyr Ile Gly Pro Ala Leu Asn Ile Val Lys Gln Gly 645 650 655 Tyr Glu Gly Asn Phe Ile Gly Ala Leu Glu Thr Thr Gly Val Val Leu 660 665 670 Leu Leu Glu Tyr Ile Pro Glu Ile Thr Leu Pro Val Ile Ala Ala Leu 675 680 685 Ser Ile Ala Glu Ser Ser Thr Gln Lys Glu Lys Ile Ile Lys Thr Ile 690 695 700 Asp Asn Phe Leu Glu Lys Arg Tyr Glu Lys Trp Ile Glu Val Tyr Lys 705 710 715 720 Leu Val Lys Ala Lys Trp Leu Gly Thr Val Asn Thr Gln Phe Gln Lys 725 730 735 Arg Ser Tyr Gln Met Tyr Arg Ser Leu Glu Tyr Gln Val Asp Ala Ile 740 745 750 Lys Lys Ile Ile Asp Tyr Glu Tyr Lys Ile Tyr Ser Gly Pro Asp Lys 755 760 765 Glu Gln Ile Ala Asp Glu Ile Asn Asn Leu Lys Asn Lys Leu Glu Glu 770 775 780 Lys Ala Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile Asn Ile Phe Met Arg Glu Ser 785 790 795 800 Ser Arg Ser Phe Leu Val Asn Gln Met Ile Asn Glu Ala Lys Lys Gln 805 810 815 Leu Leu Glu Phe Asp Thr Gln Ser Lys Asn Ile Leu Met Gln Tyr Ile 820 825 830 Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys Lys Leu Glu 835 840 845 Ser Lys Ile Asn Lys Val Phe Ser Thr Pro Ile Pro Phe Ser Tyr Ser 850 855 860 Lys Asn Leu Asp Cys Trp Val Asp Asn Glu Glu Asp Ile Asp Val Ile 865 870 875 880 Leu Lys Lys Ser Thr Ile Leu Asn Leu Asp Ile Asn Asn Asp Ile Ile 885 890 895 Ser Asp Ile Ser Gly Phe Asn Ser Ser Val Ile Thr Tyr Pro Asp Ala 900 905 910 Gln Leu Val Pro Gly Ile Asn Gly Lys Ala Ile His Leu Val Asn Asn 915 920 925 Glu Ser Ser Glu Val Ile Val His Lys Ala Met Asp Ile Glu Tyr Asn 930 935 940 Asp Met Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys 945 950 955 960 Val Ser Ala Ser His Leu Glu Gln Tyr Gly Thr Asn Glu Tyr Ser Ile 965 970 975 Ile Ser Ser Met Lys Lys His Ser Leu Ser Ile Gly Ser Gly Trp Ser 980 985 990 Val Ser Leu Lys Gly Asn Asn Leu Ile Trp Thr Leu Lys Asp Ser Ala 995 1000 1005 Gly Glu Val Arg Gln Ile Thr Phe Arg Asp Leu Pro Asp Lys Phe Asn 1010 1015 1020 Ala Tyr Leu Ala Asn Lys Trp Val Phe Ile Thr Ile Thr Asn Asp Arg 1025 1030 1035 1040 Leu Ser Ser Ala Asn Leu Tyr Ile Asn Gly Val Leu Met Gly Ser Ala 1045 1050 1055 Glu Ile Thr Gly Leu Gly Ala Ile Arg Glu Asp Asn Asn Ile Thr Leu 1060 1065 1070 Lys Leu Asp Arg Cys Asn Asn Asn Asn Gln Tyr Val Ser Ile Asp Lys 1075 1080 1085 Phe Arg Ile Phe Cys Lys Ala Leu Asn Pro Lys Glu Ile Glu Lys Leu 1090 1095 1100 Tyr Thr Ser Tyr Leu Ser Ile Thr Phe Leu Arg Asp Phe Trp Gly Asn 1105 1110 1115 1120 Pro Leu Arg Tyr Asp Thr Glu Tyr Tyr Leu Ile Pro Val Ala Ser Ser 1125 1130 1135 Ser Lys Asp Val Gln Leu Lys Asn Ile Thr Asp Tyr Met Tyr Leu Thr 1140 1145 1150 Asn Ala Pro Ser Tyr Thr Asn Gly Lys Leu Asn Ile Tyr Tyr Arg 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Tyr Asn Cys 1 5 <210> 27 <211> 7 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Tripeptide for affinity purification 2 <400> 27 Asn Ile Ser Leu Asp Leu Cys 1 5 <210> 28 <211> 6 <212> PRT <213> artificial seqience <220> <223> Tripeptide for affinity purification 3 <400> 28 Tyr Tyr Asn Lys Phe Cys 1 5

Claims (20)

  1. SEQ ID NO: 1에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 에피토프에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체.
  2. 삭제
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 에피토프는 단백질 분해효소 미처리된 또는 부분적으로 처리된 신경독 BoNT/A 폴리펩티드에 포함된 것을 특징으로 하는 모노클로날 항체.
  4. 삭제
  5. 단백질 분해효소 미처리된, 또는 부분적으로 처리된 신경독 폴리펩티드 BoNT/A에 특이적으로 결합하는 항체의 제조방법으로,
    a) SEQ ID NO: 25에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 면역원을 사용하여 면역된 비-인간 동물 유래의 폴리클로날 항혈청을,
    SEQ ID NO: 25의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드와,
    상기 펩티드 및 단백질 분해효소 미처리 또는 부분적으로 처리된 신경독 폴리펩티드 BoNT/A에 특이적으로 결합한 항체를 포함하는 복합물의 형성을 가능하게 하는 조건하에서 접촉시키는 단계;
    b) 상기 항혈청으로부터 단계 a)에서 형성된 복합물을 제거하는 단계; 및
    c) 상기 복합물로부터 단백질 분해효소 미처리 또는 부분적으로 처리된 신경독 폴리펩티드 BoNT/A에 특이적으로 결합하는 항체를 방출시키는 단계를 포함하는, 신경독 폴리펩티드 BoNT/A에 특이적으로 결합하는 항체의 제조방법.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 방법은 a) 단계 전에:
    i) SEQ ID NO: 25에 나타낸 아미노산 서열을 포함한 펩티드 면역원을 사용해서 면역된 비-인간 동물 유래의 상기 폴리클로날 항혈청을,
    다음의 포착 펩티드 SLD, LDK, 및 YNK와,
    폴리클로날 항혈청에 포함되는 비특이성 항체 및 포착된 펩티드를 포함하는 포착 복합물을 형성을 가능하게 하는 조건하에서, 접촉시키는 단계; 및
    ii) 폴리클로날 항혈청으로부터 포착 복합물을 제거하는 단계를 포함한 것을 특징으로 하는 항체의 제조방법.
  7. 청구항 5 또는 6에 있어서, 상기 면역원은 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 항체의 제조방법.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)은 링커 N-[감마-말레이미도부티릴옥시]숙신이미드 에스테르(GMBS)를 통해서 SEQ ID NO: 25를 포함하는 펩티드에 연결된 것을 특징으로 하는 항체의 제조방법.
  9. 청구항 5에 있어서, 단계 a) 내지 c)는 친화성 크로마토그래피에 의해서 실시된 것을 특징으로 하는 항체의 제조방법.
  10. 청구항 6에 있어서, 단계 i) 및 ii)는 친화성 크로마토그래피에 의해서 실시된 것을 특징으로 하는 항체의 제조방법.
  11. 청구항 5에 기재된 방법에 의해서 얻어진 항체.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 항체는 폴리클로날 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
  13. 청구항 11에 있어서, 상기 항체는 고체 지지체에 결합된 것을 특징으로 하는 항체.
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 단백질 분해효소 처리된 신경독 폴리펩티드 BoNT/A의 제조방법으로,
    a) 단백질 분해효소 처리된, 및 부분적으로 처리된 또는 미처리된 신경독 폴리펩티드 BoNT/A의 혼합물을 함유하는 용액을, 청구항 11에 기재된 항체와 접촉시키는데, 상기 항체가 단백질 분해효소 부분적으로 처리된 또는 미처리된 신경독 폴리펩티드 BoNT/A에 결합할 수 있도록 하고, 그에 따라 상기 항체 및 단백질 분해효소 부분적으로 처리된 또는 미처리된 신경독 폴리펩티드 BoNT/A를 포함하는 복합물이 형성되는 조건하에서, 접촉시키는 단계, 및
    b) 단계 a)에서 형성된 상기 복합물을 제거하여, 그에 따라 단백질 분해효소 부분적으로 처리된 또는 미처리된 신경독 폴리펩티드 BoNT/A가 없는, 처리된 신경독 폴리펩티드 BoNT/A를 함유하는 용액을 얻는 단계를 포함하는, 처리된 신경독 폴리펩티드 BoNT/A의 제조방법.
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 청구항 16에 기재된 방법의 단계, 및 단백질 분해효소 미처리 또는 부분적으로 처리된 신경독 폴리펩티드 BoNT/A가 없는, 처리된 신경독 폴리펩티드 BoNT/A를 함유하는 용액을 약제로써 제형화하는 추가 단계를 포함하는, 약제의 제조방법.
  20. 삭제
KR1020117021889A 2009-02-19 2010-02-17 매우 순수한 신경독을 제조하기 위한 수단 및 방법 KR101806567B1 (ko)

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