ES2705485T3 - Medios y métodos para fabricar una neurotoxina altamente pura - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a un epitopo que consiste en un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO:1.

Description

DESCRIPCIÓN

Medios y métodos para fabricar una neurotoxina altamente pura

La invención se refiere al anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1. La invención se refiere además al método para la fabricación de un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido de neurotoxina BoNT/A no procesado y/o parcialmente procesado, según la reivindicación 3, y a un anticuerpo que puede obtenerse mediante dicho método, según la reivindicación 8. La invención también se refiere al uso de los anticuerpos mencionados para la retirada del polipéptido de neurotoxina BoNT/A parcialmente procesado y/o no procesado del BoNT/A procesado según la reivindicación 11, o para detectar la BoNT/A parcialmente procesada y/o no procesada en una muestra según la reivindicación 12. Además, la invención se refiere a un método para la fabricación de un polipéptido de neurotoxina BoNT/A procesado, según la reivindicación 13, y a un método para la fabricación de un medicamento, según la reivindicación 14.

Clostridium botulinum y Clostridium tetani producen neurotoxinas muy potentes, concretamente las toxinas botulínicas (BoNT) y la toxina del tétanos (TeNT), respectivamente. Estas neurotoxinas clostridiales ("clostridial neurotoxins", CNT) se unen específicamente a células neuronales y alteran la liberación de neurotransmisores. Cada toxina se sintetiza como una proteína monocatenaria de aproximadamente 150 kDa no procesada inactiva. El procesamiento postraduccional implica la formación de puentes disulfuro y una proteolisis limitada (melladura, "nicking") por una o más proteasas bacterianas. La neurotoxina dicatenaria activa consiste en dos cadenas, una cadena ligera N-terminal de aproximadamente 50 kDa y una cadena pesada de aproximadamente 100 kDa unidas por un enlace disulfuro. Las CNT consisten, desde el punto de vista estructural, en tres dominios, concretamente la cadena ligera catalítica, la cadena pesada que incluye el dominio de translocación (mitad N-terminal) y el dominio de unión al receptor (mitad C-terminal); véase, Krieglstein, 1990, Eur. J. Biochem., 188, 39; Krieglstein, 1991, Eur. J. Biochem., 202, 41; Krieglstein, 1994, J. Protein Chem., 13, 49.

Clostridium botulinum segrega siete serotipos antigénicamente diferenciados denominados A a G de la neurotoxina botulínica (BoNT). Todos los serotipos, junto con la neurotoxina del tétanos (TeNT) relacionada, segregados por Clostridium tetani, son Zn2+-endoproteasas que bloquean la exocitosis sináptica rompiendo las proteínas SNAR^e . Las CNT provocan la parálisis muscular flácida observada en el botulismo y el tétanos; véase Fischer, 2007, PNAS, 104, 10447.

A pesar de sus efectos tóxicos, el complejo de la toxina botulínica se ha empleado como agente terapéutico en un gran número de enfermedades. La toxina botulínica de serotipo A ha sido aprobada para un uso humano en EE. UU. en 1989 para el tratamiento del estrabismo, el blefaroespasmo, y otros trastornos. Está disponible en el mercado como una preparación de proteínas de la toxina botulínica A, por ejemplo, bajo el nombre comercial BOTOX (Allergan, Inc.) o bajo el nombre comercial DYSPORT (Ipsen Ltd). Para aplicaciones terapéuticas, la preparación se inyecta directamente en el músculo que se va a tratar. A pH fisiológico, la toxina se libera del complejo de proteínas y se produce el efecto farmacológico deseado. Está disponible una preparación de BoNT/A mejorada que está exenta de proteínas complejantes con el nombre comercial XEOMIN (Merz Pharmaceuticals GmbH). El efecto de la toxina botulínica solo es temporal, lo cual constituye la razón de que puede ser necesaria la administración repetida de la toxina botulínica para mantener un efecto terapéutico.

Las neurotoxinas clostridiales debilitan la fuerza de los músculos voluntarios y son una terapia eficaz para el estrabismo, la distonía focal, incluyendo la distonía cervical, y el blefaroespasmo esencial benigno. También se ha demostrado que alivian el espasmo hemifacial y la espasticidad focal y, además, son eficaces en una amplia gama de indicaciones distintas, tales como trastornos gastrointestinales, hiperhidrosis, y corrección de arrugas cosmética; véase Jost, 2007, Drugs, 67, 669.

Para la fabricación de las neurotoxinas clostridiales es especialmente importante la purificación de la disolución de fermentación que contiene neurotoxinas. En este contexto, habitualmente se aplican diferentes etapas de precipitación y extracción, seguidas de una etapa de concentración y otras etapas cromatográficas diferenciadas para obtener la neurotoxina purificada; véase DasGupta, 1984, Toxicon, 22, 415; Sathyamoorthy, 1985, J. Biol. Chemistry, 260, 10461. El documento US 2008/171347 describe composiciones de péptidos de BoNT/A, composiciones tolerizantes, composiciones que inducen respuestas inmunológicas a BoNT/A y composiciones de anticuerpos. Además, describe métodos para determinar la inmunorresistencia a la terapia con toxina botulínica en un individuo, métodos para prevenir o reducir la inmunorresistencia a la terapia con toxina botulínica en un individuo, métodos para vacunar a un individuo contra la toxina botulínica, métodos para preparar anticuerpos anti-BoNT/A, y métodos para tratar la toxicidad botulínica en un individuo, y métodos para reducir los anticuerpos antitoxina botulínica en un individuo. En la actualidad, las preparaciones de neurotoxinas disponibles comprenden, además de la neurotoxina activa deseada (procesada), un precursor proteolíticamente no procesado y/o un polipéptido de neurotoxina parcialmente procesado. El precursor proteolíticamente no procesado o el polipéptido parcialmente procesado se diferencian del polipéptido de neurotoxina activo (procesado) en una secuencia de tan solo unos pocos aminoácidos. Por tanto, apenas pueden distinguirse basándose en sus propiedades químicas y físicas. Por otra parte, la proporción de precursor proteolíticamente no procesado y/o polipéptido de neurotoxina parcialmente procesado con respecto a la proporción total de proteínas sigue siendo significativa en dichas preparaciones. Dicha proporción es debida al sistema biológico y es determinada por la biosíntesis y las condiciones del proceso de fermentación. Así, la cantidad de precursor proteolíticamente no procesado y/o polipéptido de neurotoxina parcialmente procesado no deseados en las preparaciones de neurotoxinas está predefinida y, en la actualidad, es bastante difícil de reducir.

Son muy deseables medios y métodos para reducir la cantidad de polipéptidos de neurotoxina no procesados y/o parcialmente procesados y, con ello, mejorar la calidad de las preparaciones de neurotoxinas, pero todavía no están disponibles.

Así, el problema técnico que subyace a la presente invención puede considerarse como el suministro de medios y métodos para mejorar la fabricación de polipéptidos de neurotoxina mediante la satisfacción de las necesidades anteriormente mencionadas. El problema técnico es resuelto por las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones y a continuación.

La presente invención se refiere a un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a un epitopo que consiste en un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO:1.

El término "anticuerpo", tal como se emplea en la presente, incluye un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monocatenario, un anticuerpo quimerizado, primatizado, humanizado o humano, un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo sintético, derivados química o enzimáticamente modificados, un fragmento de cualquiera de dichos anticuerpos o aptámeros que consisten en los ácidos nucleicos naturales y/o químicamente modificados. Los fragmentos de dichos anticuerpos incluyen fragmentos F(ab')2, F(ab), Fv o scFv, o derivados química o enzimáticamente modificados de cualquiera de estos fragmentos. El anticuerpo de la presente invención se unirá específicamente al epitopo que consiste en el péptido mencionado anteriormente si dicho péptido está formado por el polipéptido neurotoxina parcialmente procesado o no procesado.

El término "epitopo", según la presente invención, se refiere al determinante antigénico que es reconocido por el anticuerpo de la presente invención. Consiste en un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en in SEQ ID NO:1. El epitopo mencionado anteriormente representa, en un aspecto de la invención, un péptido que está flanqueado por los sitios de ruptura para las enzimas procesadoras de neurotoxinas o que cubre dicho sitio o sitios de ruptura; véanse las siguientes tablas 1 y 2. El epitopo, en un aspecto de la invención, está formado por un polipéptido de neurotoxina BoNT/A proteolíticamente no procesado o por un polipéptido de neurotoxina BoNT/A parcialmente procesado. El polipéptido de neurotoxina parcialmente procesado puede ser la cadena ligera del polipéptido de neurotoxina BoNT/A alargada con la secuencia peptídica según se muestra en SEQ ID NO:1, o la cadena pesada del polipéptido de neurotoxina BoNT/A alargada con la secuencia peptídica según se muestra en SEQ ID NO:1. Debido a la presencia de dicho epitopo, el polipéptido de neurotoxina BoNT/A no procesado o parcialmente procesado puede unirse específicamente al anticuerpo.

Tabla 1: Secuencias de aminoácidos de los epitopos y de los polipéptidos de longitud completa de los serotipos de neurotoxinas

Tabla 2: Secuencias de aminoácidos que incluyen los sitios de ruptura de los serotipos de neurotoxinas

La expresión "se une específicamente" significa que el anticuerpo de la presente invención no presenta reacción cruzada en un grado significativo con otros epitopos sobre dichos polipéptidos de neurotoxina B^oN^t /A parcialmente procesados o sobre dichos polipéptidos de neurotoxina BoNT/A no procesados, o sobre otros polipéptidos en general. En un aspecto de la invención, el anticuerpo de la presente invención no presenta reacción cruzada con dicho polipéptido de neurotoxina BoNT/A activo completamente procesado. La especificidad de epitopo es una característica importante del anticuerpo de la presente invención. La especificidad del anticuerpo con respecto a la neurotoxina BoNT/A parcialmente procesada o no procesada frente a la neurotoxina BoNT/A procesada será, en un aspecto, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%. La unión específica puede ensayarse mediante diversas técnicas muy conocidas, que incluyen, por ejemplo, estudios de competición. Otra característica importante es la sensibilidad del anticuerpo. La sensibilidad, en un aspecto de la invención, será de tal forma que se una al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95% de la neurotoxina BoNT/A procesada comprendida en una muestra. La sensibilidad puede ensayarse mediante técnicas muy conocidas. Los expertos en la técnica serán capaces de determinar las condiciones de ensayo operativas y óptimas para cada determinación empleando la experimentación habitual. Las técnicas convencionales para los estudios de unión incluyen el radioinmunoensayo, ELISA, diálisis en equilibrio, microcalorimetría isotérmica, ensayos BIACORE® (resonancia de plasmón de superficie, "surface plasmon reasonance", SPR) u otros métodos de adsorción sobre una superficie. El sistema BIACORE® SPR mide la interacción anticuerpo-antígeno. La respuesta de SPR refleja un cambio en la concentración de masa en la superficie del detector a medida que los analitos se unen o se disocian. Basándose en SPR, las mediciones de BIACORE® a tiempo real controlan las interacciones directamente a medida que suceden; véase BIAapplications Handbook, versión AB (reeditado en 1998), n.° de código de BIACORE®: BR-1001-86; BIAtechnology Handbook, versión AB (reeditado en 1998), n.° de código de BIACORE®: BR-1001-84. Las propiedades de unión, tales como la sensibilidad, de un anticuerpo de la presente invención pueden determinarse, en principio, mediante estudios de unión empleando un antígeno inmovilizado (el ligando) presentado sobre una superficie detectora. El anticuerpo que se va a ensayar (el analito) se proporcionará en la fase móvil, es decir, en una disolución. En algunos casos, el antígeno se une de modo indirecto a la superficie a través de la unión a otra molécula inmovilizada que se denomina molécula de captura. Cuando el anticuerpo se inyecta en un pulso discreto a través de la superficie con los antígenos inmovilizados, esto se puede subdividir fundamentalmente en tres fases: (i) asociación del anticuerpo con el antígeno durante la inyección de la muestra; (ii) estado en equilibrio o estacionario durante la inyección de la muestra, en el que la tasa de unión del anticuerpo es equilibrada por la disociación del complejo de anticuerpo-antígeno; (iii) disociación del anticuerpo de la superficie durante el flujo del tampón. Se entenderá que dicho ensayo puede realizarse, como alternativa, con los anticuerpos inmovilizados que se van a investigar y con una disolución que contiene antígeno como fase móvil. Las fases de asociación y disociación proporcionan información sobre la cinética de la interacción de analito-ligando (ka y kd, las tasas de formación de complejos y de disociación, kd/ka = K^d). La fase en equilibrio proporciona información sobre la afinidad de la interacción analito-ligando (K^d). En un aspecto de la invención, el anticuerpo de la presente invención tiene una KD menor que 0,5 |iM, en un aspecto, menor que 0,05 |iM y, en otro aspecto, menor que 0,02 |iM.

El anticuerpo mencionado en la presente invención puede fabricarse empleando métodos descritos, por ejemplo, en Harlow y Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988. Pueden prepararse anticuerpos monoclonales mediante las técnicas descritas originariamente en Kohler, 1975, Nature, 256, 495; y Galfré, 1981, Meth. Enzymol., 73, 3. Dichas técnicas comprenden la fusión de células de mieloma de ratón con células de bazo derivadas de mamíferos inmunizados. Los anticuerpos pueden mejorarse aún más mediante técnicas muy conocidas en la técnica. Por ejemplo, la resonancia de plasmón de superficie, tal como se emplea en el sistema BIACORE®, puede emplearse para aumentar la eficacia de anticuerpos de fagos que se unen al epitopo mencionado anteriormente dentro del polipéptido de neurotoxina proteolíticamente no procesado; véase Schier, 1996, Human Antibodies Hybridomas, 7, 97; Malmborg, 1995, J. Immunol. Methods, 183, 7.

En un aspecto de la invención, el anticuerpo según la presente invención es producido, en un aspecto, empleando un oligopéptido que comprende el epitopo mencionado anteriormente. Dicho oligopéptido puede producirse de modo sintético o mediante expresión recombinante. Como alternativa, el anticuerpo de la invención puede producirse aplicando un polipéptido de neurotoxina BoNT/A no procesado o parcialmente procesado natural. En este último caso, debe entenderse que los anticuerpos resultantes se ensayarán posteriormente para determinar su especificidad con respecto al polipéptido o polipéptidos de neurotoxina BoNT/A no procesados y/o parcialmente procesados. En otro aspecto de la invención, el anticuerpo monoclonal de la invención se produce empleando un polipéptido de neurotoxina BoNT/A parcialmente procesado o no procesado, que puede tratarse con un detergente para hacer que el epitopo esté inmunológicamente disponible. Sin embargo, se entenderá que, en el caso en que el anticuerpo se dirija contra un epitopo conformacional, no debe realizarse este tratamiento con detergente. En otro aspecto, también pueden aplicarse agentes de inmunoestimulación, tales como hemocianina de lapa ("keyhole limpet hemocyanin", KLH), en dicho proceso, en especial cuando se usa un oligopéptido sintético.

El anticuerpo indicado en la presente invención puede utilizarse, por ejemplo, para una cromatografía de afinidad, para la inmunoprecipitación, y la inmunolocalización del polipéptido de neurotoxina BoNT/A parcialmente procesado o no procesado, así como para controlar la presencia de dicho polipéptido en muestras o en organismos recombinantes.

Se describe el polipéptido de neurotoxina parcialmente procesado o no procesado procedente de Clostridium spp. En un aspecto de la invención, procede de Clostridium botulinum seleccionado del grupo de Clostridium botulinum ATCC 3502, Clostridium botulinum ATCC 3502 - cepa Hall. La estructura primaria de dicho polipéptido de neurotoxina no procesado procedente de Clostridium botulinum se describe en Krieglstein, 1994, J. Protein Chem., 13,49.

Clostridium spp., según se indica en la presente, es el género de bacterias Gram-positivas, formador de endosporas y anaerobio obligado que pertenece a Firmicutes. Las neurotoxinas clostridiales pueden ser producidas por clostridios diferentes desde el punto de vista fenotípico y genético que pertenecen a las especies Clostridium botulinum, Clostridium butyricum, Clostridium barati, y Clostridium tetani. Clostridium botulinum, tal como se emplea en la presente, es una especie de bacteria con forma de varilla, Gram-positiva y anaerobia obligada que produce, además de las neurotoxinas, endosporas ovales y subterminales, y que se encuentra habitualmente en el suelo. Además, en otro aspecto del anticuerpo de la presente invención, dicho anticuerpo está unido a un vehículo polipeptídico. En un aspecto del anticuerpo de la presente invención, dicho vehículo polipeptídico se selecciona del grupo que consiste en: una proteína de unión a FC, proteína A y proteína G, y un anticuerpo que se une específicamente al anticuerpo de la presente invención. Este puede ser, por ejemplo, en un aspecto, un anticuerpo que es específico de especie. Dicho anticuerpo se une específicamente a la porción FC o F(ab) del anticuerpo de la invención. En otro aspecto del anticuerpo de la presente invención, dicho vehículo polipeptídico es la proteína A procedente de Staphylococcus aureus. Dicho vehículo polipeptídico puede usarse, en un aspecto de la invención, para aislar el anticuerpo de la presente invención.

Además, en otro aspecto del anticuerpo de la presente invención, dicho anticuerpo está unido a una matriz. En un aspecto, dicha matriz es una matriz sólida.

El término "unido", tal como se emplea en la presente, se refiere a cualquier tipo de conexión entre el anticuerpo y la matriz, con la condición de que dicha conexión no interfiera fundamentalmente con la unión del anticuerpo al polipéptido de neurotoxina B^oN^t /A parcialmente procesado y/o no procesado. Dicha conexión puede establecerse mediante interacciones que incluyen enlaces indirectos o directos, no reversibles o reversibles, físicos y químicos, electrostáticos y/o covalentes. En un aspecto, el anticuerpo está covalentemente unido, directamente o a través de una molécula conectora, a la matriz.

El término "matriz", tal como se emplea según la presente invención, se refiere a una estructura tridimensional o disposición espacial capaz de unirse a un antígeno o a un anticuerpo. Las matrices conocidas comprenden polipéptidos, vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, polietilenglicol (PEG), dextrano, nailon, amilasas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, gabros, y magnetita. Una matriz sólida, en un aspecto de la invención, es una matriz de polisacáridos seleccionada del grupo que consiste en Sepharose, Sephadex; agarosa, Sephacell, microcelulosa, y esferas de alginato. En otro aspecto, dicha matriz sólida puede consistir en esferas de vidrio y/o matrices polipeptídicas.

El anticuerpo puede unirse a dicha matriz a través de un conector, que incluye compuestos de molécula pequeña, moléculas de conectores peptídicos y esferas. La matriz puede tener casi cualquier disposición o configuración estructural posible, con la condición de que el anticuerpo acoplado sea capaz de unirse a su antígeno. Así, la matriz puede ser esférica, tal como sucede en una esfera, o cilíndrica, tal como sucede en la superficie interna de un tubo de ensayo, o la superficie externa de una varilla. Como alternativa, la superficie puede ser irregular o plana, tal como una lámina, una tira de ensayo, etc. En un aspecto, dichos soportes incluyen esferas de poliestireno.

La matriz mencionada anteriormente, en un aspecto de la invención, tiene al menos un sitio de unión para el anticuerpo de la presente invención. En otro aspecto de la invención, dicha matriz tiene otros sitios de unión para otros anticuerpos que reconocen otros epitopos. En un aspecto, dichos epitopos son otros epitopos que permiten la unión específica del polipéptido de neurotoxina BoNT/A parcialmente procesado y/o no procesado. Otros anticuerpos inmovilizados sobre la matriz también incluyen anticuerpos que reconocen polipéptidos bacterianos distintos a los polipéptidos de neurotoxina BoNT/A. Estos otros anticuerpos comprendidos por la matriz pueden usarse para retirar otros polipéptidos no deseados y, así, con el objetivo de purificar aún más una preparación de neurotoxina BoNT/A. Sin embargo, debe entenderse que, en otro aspecto, la neurotoxina BoNT/A procesada no será unida específicamente por los anticuerpos inmovilizados sobre la matriz.

El anticuerpo de la presente invención mencionado anteriormente es adecuado para la fabricación de un polipéptido de neurotoxina B^oN^t /A procesado porque se une específicamente al epitopo caracterizado anteriormente, y así permite la unión del polipéptido de neurotoxina BoNT/A parcialmente procesado o no procesado y después lo separa del polipéptido de neurotoxina BoNT/A procesado activo. Un anticuerpo que es capaz de unirse y retirar el polipéptido de neurotoxina BoNT/A parcialmente procesado y no procesado evita, en un aspecto de la invención, la interacción con el polipéptido de neurotoxina BoNT/A procesado activo que conserva su actividad biológica. Gracias a la presente invención, es posible la purificación de la neurotoxina BoNT/A, por la cual el polipéptido activo deseado no ve afectada fundamentalmente su actividad. Los expertos en la técnica saben que se obtiene "actividad" solo después de la ruptura proteolítica del precursor de polipéptido de neurotoxina BoNT/A no procesado, aunque dicho precursor no procesado puede ejercer algunas funciones biológicas. Por consiguiente, el "polipéptido de neurotoxina BoNT/A proteolíticamente procesado", en un aspecto de la invención, es el polipéptido de neurotoxina BoNT/A biológicamente activo. La expresión "biológicamente activo", tal como se emplea en la presente invención, se refiere a la capacidad del polipéptido de neurotoxina BoNT/A para llevar a cabo una posterior unión al receptor, internalización, translocación a través de la membrana endosómica hacia el citosol y/o ruptura endoproteolítica de una o más proteínas implicadas en la fusión de membranas de vesículas sinápticas.

Debe entenderse que las definiciones y las explicaciones de los términos y las expresiones dadas anteriormente se aplican, mutatis mutandis, a todos los aspectos descritos en esta memoria descriptiva a continuación, excepto que se indique lo contrario.

En otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para la fabricación de un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido de neurotoxina BoNT/A no procesado y/o parcialmente procesado, que comprende las etapas de:

a) poner en contacto un antisuero policlonal procedente de un animal no humano que ha sido inmunizado empleando un inmunógeno de péptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se indica en SEQ ID NO:25, con un péptido que tiene SEQ ID NO:25, bajo condiciones que permiten la formación de un complejo que comprende el péptido mencionado anteriormente y un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido de neurotoxina BoNT/A no procesado o parcialmente procesado;

b) retirar el complejo formado en la etapa a) del antisuero; y

c) liberar el anticuerpo que se une específicamente al polipéptido de neurotoxina BoNT/A no procesado o parcialmente procesado de dicho complejo,

en el que dicho método comprende además, antes de la etapa a), las etapas de:

i) poner en contacto dicho antisuero policlonal procedente de un animal no humano que ha sido inmunizado empleando un inmunógeno de péptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se indica en SEQ ID NO:25, con los siguientes péptidos de captura indicados en SEQ ID NO:26 a 28, bajo condiciones que permiten la formación de complejos de captura que comprenden los anticuerpos no específicos incluidos en el antisuero policlonal y los péptidos de captura; y

ii) retirar los complejos de captura del antisuero policlonal.

La expresión "inmunógeno de péptido", tal como se empleó anteriormente, se refiere a un oligopéptido que tiene una secuencia de aminoácidos como se indica en SEQ ID NO:25, que se proporciona de una manera que permite suscitar una respuesta inmunológica en un animal no humano. En un aspecto, dicho inmunógeno comprende además KLH, y en otro aspecto, dicha KLH está unida a través de una cisteína y, en un aspecto, una cisteína C-terminal, al péptido que tiene SEQ ID NO:25 a través del conector N-[gamma-maleimidobutiriloxi]succinimida éster (GMBS). El modo de unir KLH a un péptido a través de una molécula conectora, tal como GMBS, es muy conocido en la técnica o se describe en los ejemplos adjuntos que aparecen a continuación. En otro aspecto, el animal no humano es un mamífero, y en un aspecto es una rata, ratón, conejo, oveja o cabra. Antes de realizar el método de la invención, un animal no humano que será la fuente del antisuero policlonal se inmunizará empleando el inmunógeno de péptido mencionado anteriormente. El modo de inmunizar un animal no humano es muy conocido en la técnica y se describe en los ejemplos adjuntos que aparecen a continuación. Como resultado de dicha inmunización, el animal no humano producirá anticuerpos policlonales contra el inmunógeno de péptido.

Puede obtenerse un antisuero policlonal a partir del animal no humano mediante diversas técnicas. En un aspecto se obtiene de sangre, suero o plasma mediante técnicas convencionales muy conocidas en la técnica y descritas en los ejemplos adjuntos que aparecen a continuación. Así, la expresión "antisuero policlonal", incluye suero purificado y parcialmente purificado procedente de dicho animal. Dicho antisuero policlonal es el material de partida para el método mencionado anteriormente. Además del anticuerpo (o anticuerpos) deseado que une específicamente al polipéptido de neurotoxina BoNT/A no procesado y/o parcialmente procesado, el antisuero policlonal puede comprender otros anticuerpos que no se unen específicamente al polipéptido de neurotoxina BoNT/A no procesado y/o parcialmente procesado. Estos anticuerpos se separan de los anticuerpos específicos deseados poniendo en contacto el antisuero policlonal con un péptido que también tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO:25. En un aspecto, dicho péptido se inmoviliza sobre un vehículo, tal como se describe en detalle en otro punto de la presente. Como resultado de dicho contacto se forma un complejo del péptido y los anticuerpos específicos que después puede retirarse del suero policlonal. Los anticuerpos específicos pueden liberarse del complejo retirado. Las técnicas adecuadas para liberar anticuerpos de dicho complejo se describen en otro punto de la presente.

En otro aspecto, dicho método comprende además, antes de la etapa a), las etapas de:

i) poner en contacto dicho antisuero policlonal procedente de un animal no humano que ha sido inmunizado empleando un inmunógeno de péptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se indica en SEQ ID NO:25, con los siguientes péptidos de captura SLD, LDK, e YNK, bajo condiciones que permiten la formación de complejos de captura que comprenden los anticuerpos no específicos incluidos en el antisuero policlonal y los péptidos de captura; y

ii) retirar los complejos de captura del antisuero policlonal.

En los estudios que subyacen a la invención, se generó un suero policlonal contra la neurotoxina botulínica no procesada de tipo A (BoNT/A), empleando el péptido conector acoplado a KLH como inmunógeno (suero de antipéptido conector de scBoNT/A) en cabras. Incluso después de la purificación de afinidad, el suero muestra reactividad cruzada con BoNT/A procesada en una transferencia Western. Se demostró que la reactividad cruzada depende del reconocimiento de tripéptidos (SLD, LDK e YNK) que aparecen en el péptido conector, así como en las cadenas ligera y pesada de BoNT/A procesada. Un segundo lote de inmunosuero de cabra se purificó mediante una cromatografía de afinidad de dos etapas, retirando los anticuerpos de tripéptidos con reactividad cruzada. El segundo suero de antipéptido conector de scBoNT/A no mostró reactividad cruzada con BoNT/A procesada en una transferencia Western. Los tripéptidos pueden aplicarse, en un aspecto, a la purificación de afinidad en forma de los derivados mostrados en cualquiera de SEQ ID NO:26 a 28.

En un aspecto del método, las etapas a) a c) se realizan por medio una cromatografía de afinidad.

Una cromatografía de afinidad, tal como se emplea en la presente invención, se refiere a una técnica para separar moléculas en una fase móvil basándose en sus diferentes afinidades por una fase estacionaria empleada en la cromatografía. En un aspecto, dicha técnica se refiere a la adsorción selectiva y la posterior recuperación de un compuesto desde un ligando inmovilizado. En otro aspecto, dicha técnica se diseña para la purificación altamente específica y eficaz de proteínas y compuestos relacionados utilizando ligandos selectivos apropiados sobre matrices de esferas y porosas para la unión de compuestos diana, que después pueden recuperarse bajo condiciones suaves. Dicha técnica se basa en una interacción altamente específica, tal como la que se produce entre un antígeno y un anticuerpo, una enzima y un sustrato, o un receptor y un ligando. En otro aspecto, dicha cromatografía de afinidad se realiza como una cromatografía en columna. La cromatografía de afinidad, según se ha caracterizado en detalle anteriormente, es, en un aspecto, una cromatografía inmunoabsorbente y una cromatografía de interacción hidrófoba ("hydrophobic interaction chromatography", HIC), una cromatografía en fase inversa y, en otro aspecto, una cromatografía de inmunoafinidad que aplica el agente de unión que, en otro aspecto, es el anticuerpo de la presente invención. Una fase estacionaria, tal como se menciona en la presente, consiste, en un aspecto, en el agente mencionado anteriormente como matriz sólida. Dicho agente, en un aspecto, está unido a un vehículo polipeptídico acoplado a una matriz sólida y, en otro aspecto, está unido a proteína A acoplada a una matriz sólida. En otro aspecto del método mencionado anteriormente, las etapas i) y ii) se realizan por medio de una cromatografía de afinidad.

Se describe un método para identificar un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido de neurotoxina no procesado y/o parcialmente procesado, que comprende las etapas de:

a) determinar si el anticuerpo se une a un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO:25; y

b) determinar si el anticuerpo se une a péptidos que tienen las siguientes secuencias de aminoácidos SLD, LDK e YNK,

en el que un anticuerpo que se une a un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO:25, pero no a péptidos que tienen las siguientes secuencias de aminoácidos SLD, LDK e YNK, se identifica como un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido de neurotoxina no procesado y/o parcialmente procesado.

El término "determinar", tal como se emplea según el método para identificar un anticuerpo, incluye técnicas bien establecidas para determinar la unión de un anticuerpo a un péptido concreto, tal como las técnicas de inmunotransferencia (técnicas de transferencia por puntos o Western), cromatografía de afinidad, técnicas de resonancia de plasma de superficie (ensayos BIA^{c o} R^e®) y similares. Se entenderá que, en un aspecto, la unión mencionada anteriormente del anticuerpo al péptido o péptidos es una unión específica (es decir, una unión sin reactividad cruzada).

En un aspecto, el método mencionado anteriormente para identificar un anticuerpo se realiza con anticuerpos monoclonales. En un aspecto, el método se emplea para seleccionar líneas celulares de hibridoma y posteriormente producir anticuerpos monoclonales que se unen específicamente al polipéptido de neurotoxina no procesado y/o parcialmente procesado. En otro aspecto, el método puede aplicarse para seleccionar anticuerpos policlonales, por ejemplo, anticuerpos de péptidos, que se unen específicamente al polipéptido de neurotoxina no procesado y/o parcialmente procesado. En un aspecto, el método puede aplicarse para la confirmación de la especificidad de un anticuerpo fabricado mediante un método de la presente invención mencionado en otro punto en esta memoria descriptiva.

La presente invención también se refiere a un anticuerpo que puede obtenerse mediante el método mencionado anteriormente para la fabricación de un anticuerpo que se une específicamente a la BoNT/A no procesada y/o parcialmente procesada. En un aspecto, el anticuerpo es un anticuerpo policlonal. En otro aspecto, dicho anticuerpo está acoplado a un soporte sólido.

El anticuerpo de la invención, en un aspecto, permite la detección del polipéptido de neurotoxina BoNT/A parcialmente procesado y/o no procesado con una alta sensibilidad y especificidad, en un aspecto con un límite de detección de 50 a 80 pg/ml, en un aspecto 69 pg/ml.

En principio, el anticuerpo mencionado anteriormente puede usarse para la retirada del polipéptido de neurotoxina BoNT/A parcialmente procesado y/o no procesado del polipéptido de neurotoxina BoNT/A procesado, o para detectar BoNT/A parcialmente procesada y/o no procesada en una muestra.

Además, la presente invención se refiere a un método para fabricar un polipéptido de neurotoxina BoNT/A que comprende las etapas de:

a) poner en contacto una disolución que contiene una mezcla de polipéptidos de neurotoxina BoNT/A proteolíticamente procesados, parcialmente procesados y/o no procesados, con un anticuerpo que se une específicamente a los polipéptidos de neurotoxina BoNT/A no procesados o parcialmente procesados, pero no al polipéptido de neurotoxina BoNT/A procesado, bajo condiciones que permiten la unión de dicho anticuerpo al polipéptido de neurotoxina BoNT/A no procesado o parcialmente procesado, por lo cual se forma un complejo de anticuerpo, y

b) retirar el complejo de anticuerpo formado en la etapa a), por lo cual se obtiene una disolución que contiene el polipéptido de neurotoxina B^oN^t /A procesado sin polipéptidos de neurotoxina BoNT/A no procesados o parcialmente procesados.

La expresión "poner en contacto", tal como se emplea en la presente, se refiere a poner en proximidad física al menos dos compuestos diferentes para permitir la interacción física y/o química de dichos compuestos. Según el método de esta invención, dichos dos compuestos diferentes son, en un aspecto, el anticuerpo que se une específicamente al polipéptido de neurotoxina BoNT/A parcialmente procesado o no procesado que está incluido en la disolución. El contacto, con el significado dado en la presente, se realiza bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la interacción del anticuerpo y el polipéptido de neurotoxina BoNT/A parcialmente procesado o no procesado. Dicha interacción provocará la unión del polipéptido de neurotoxina BoNT/A parcialmente procesado o no procesado al anticuerpo, por lo cual se forma un complejo de antígeno-anticuerpo. Tal como se indica en otro punto en la presente, dicha interacción comprende diversos tipos de unión, tales como medidas indirectas y directas, no reversibles y reversibles. Las condiciones adecuadas que permiten la interacción específica del anticuerpo y la disolución son muy conocidas por los expertos en la técnica y dichas condiciones pueden depender del anticuerpo y de la disolución que se van a aplicar en el método determinadas sin más. Además, los expertos en la técnica también pueden determinar sin más un tiempo que es suficiente para permitir la interacción. Las condiciones para los anticuerpos se describen en los ejemplos adjuntos que aparecen a continuación.

Una disolución, tal como se emplea en la presente, se refiere a cualquier sistema de disolvente que contenga el polipéptido de neurotoxina BoNT/A y sus polipéptidos de neurotoxina BoNT/A parcialmente procesados y/o no procesados. El sistema de disolvente comprende además un disolvente. Los disolventes incluidos en diversos aspectos de la invención son agua, sistemas de tampones acuosos, disolventes orgánicos y líquidos iónicos. En un aspecto de la invención, es un sistema de disolvente acuoso. Además, el sistema de disolvente, aparte del polipéptido de neurotoxina BoNT/A y del disolvente, puede comprender también otras moléculas, que incluyen otros polipéptidos bacterianos.

El término "agente", tal como se emplea en la presente, se refiere a un compuesto que es capaz de unirse específicamente al polipéptido de neurotoxina parcialmente procesado o no procesado. Los compuestos adecuados comprenden polipéptidos, péptidos, anticuerpos y moléculas químicas orgánicas. En un aspecto de la presente invención, un agente es un anticuerpo, tal como se especifica en otro punto en la presente. Dicho agente, en otro aspecto de la presente invención, contiene al menos un sitio de unión para el polipéptido de neurotoxina BoNT/A parcialmente procesado o no procesado. En otro aspecto de la invención, dicho agente contiene sitios de unión adicionales para otros anticuerpos que son capaces de unirse específicamente al agente. En otro aspecto de la invención, el agente es el anticuerpo de la presente invención, según se especificó anteriormente. Además, en otro aspecto, el agente puede comprender diferentes anticuerpos de la invención. Por ejemplo, es concebible que, como agente en el sentido de la invención, se emplee un anticuerpo según la invención que se une específicamente al polipéptido de neurotoxina BoNT/A parcialmente procesado, en combinación con un anticuerpo de la invención que se une específicamente al polipéptido de neurotoxina BoNT/A no procesado. Como alternativa, un agente en el sentido de la invención puede comprender dos o más anticuerpos diferentes de la invención, en los que cada anticuerpo se une específicamente a un epitopo diferente presente en el polipéptido de neurotoxina BoNT/A parcialmente procesado y no procesado.

En un aspecto del método de la invención, el anticuerpo se inmoviliza sobre una matriz como se indica en otro punto en la presente. En otro aspecto, la inmovilización se logra mediante enlace covalente directo o unión indirecta del anticuerpo a la matriz.

La expresión "unión específica", tal como se emplea en la presente, se refiere a la unión del anticuerpo al polipéptido de neurotoxina BoNT/A parcialmente procesado y/o no procesado sin que exista reacción cruzada con otras neurotoxinas, proteínas de la célula hospedante u otros péptidos, polipéptidos u otros compuestos. La unión específica puede ensayarse mediante diversas técnicas muy conocidas. A este respecto, se remite a las definiciones realizadas anteriormente en conexión con el anticuerpo de la invención, las cuales se aplican mutatis mutandis. La expresión "complejo de anticuerpo", tal como se emplea en la presente invención, se refiere al anticuerpo unido al polipéptido de neurotoxina BoNT/A parcialmente procesado o no procesado. Sin embargo, el complejo puede comprender, además, otras moléculas. En un aspecto de la invención, el complejo puede comprender moléculas que estabilizan el complejo o que facilitan la purificación, por ejemplo, permitiendo la interacción del complejo con otras moléculas o que facilitan la precipitación del complejo. Las otras moléculas incluidas en el complejo, en un aspecto de la invención, incluyen anticuerpos secundarios que se unen específicamente al anticuerpo o al complejo como tal. Dichos anticuerpos secundarios después pueden unirse a otros anticuerpos o moléculas de interacción, tales como vehículos polipeptídicos de modo directo o indirecto. Debe entenderse que el complejo también puede comprender otros polipéptidos bacterianos u otras moléculas incluidas en la disolución.

El término "retirar" el complejo de antígeno-anticuerpo, tal como se emplea en la presente invención, se refiere a la separación del polipéptido de neurotoxina BoNT/A parcialmente procesado complejado y del polipéptido de neurotoxina BoNT/A no procesado complejado de la disolución que contiene la neurotoxina de BoNT/A procesada activa. En un aspecto de la invención, dicha retirada se realiza por medio de una cromatografía de afinidad, por ejemplo, empleando inmunoesferas, o mediante inmunoprecipitación.

Como consecuencia de la retirada del polipéptido de neurotoxina BoNT/A parcialmente procesado y del polipéptido de neurotoxina BoNT/A no procesado, el método de la presente invención, en un aspecto, proporciona el polipéptido de neurotoxina BoNT/A procesado activo en una forma altamente pura. La expresión "forma altamente pura", tal como se emplea en la presente, se refiere, en un aspecto, al polipéptido de neurotoxina BoNT/A procesado activo exento de cantidades detectables de sus polipéptidos de neurotoxina BoNT/A parcialmente procesados o no procesados y, en otro aspecto, al polipéptido de neurotoxina BoNT/A procesado activo también exento de cantidades detectables de otras impurezas. En un aspecto, la cantidad detectable de la neurotoxina BoNT/A parcialmente procesada o no procesada es menor que 2,5%, menor que 1% o, en otro aspecto, menor que 0,1%. En otro aspecto de la presente invención, el polipéptido de neurotoxina BoNT/A de tipo A procesado activo, tal como se menciona en la presente, muestra, bajo condiciones reductoras, una única banda detectable a 100 kDa, y una única banda detectable a 50 kDa, pero no una banda a 150 kDa, que sería donde aparecen normalmente los polipéptidos de neurotoxina de tipo A parcialmente procesados o no procesados cuando se analiza, por ejemplo, mediante SDS-PAGE. Debe entenderse que otras impurezas de polipéptidos también pueden ser determinadas mediante SDS-PAGE. También debe entenderse que pueden analizarse otros serotipos de neurotoxinas procesadas activas, respectivamente.

En el método de la presente invención, dicho polipéptido de neurotoxina es un polipéptido de neurotoxina BoNT/A.

El término "neurotoxina", tal como se emplea en la presente, se refiere a serotipos antigénicamente diferentes de neurotoxinas botulínicas, concretamente, BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, y a la neurotoxina de tétanos (TeNT). En un aspecto, dicha BoNT/A tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO:17, BoNT/B tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO:18, BoNT/C1 tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO:19, BoNT/D tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO:20, BoNT/E tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO:21, BoNT/F tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO:22, BoNT/G tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO:23, y TeNT tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO:24.

Se indica que dicho polipéptido de neurotoxina es un variante de uno cualquiera de los polipéptidos de neurotoxina mencionados anteriormente que tiene una secuencia comprende al menos una sustitución, adición y/o deleción de aminoácido con respecto a una cualquiera de SEQ ID NO:17 a 24. En otro aspecto, dicho polipéptido de neurotoxina variante tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 40% idéntica a la secuencia de aminoácidos de BoNT/A (SEQ ID NO:17), BoNT/B (SEQ ID NO:18), BoNT/C1 (SEQ ID NO:19), BoNT/D (SEQ ID NO:20), BoNT/E (SEQ ID NO:21), BoNT/F (SEQ ID NO:22), BoNT/G (SEQ ID NO:23), o TeNT (SEQ ID NO:24). En otro aspecto, el polipéptido de neurotoxina tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G o TeNT. El término "idéntica", tal como se emplea en la presente, se refiere a la identidad de una secuencia caracterizada determinando la identidad de las secuencias de aminoácidos, en la que las secuencias se alinean de modo que se obtiene el apareamiento de orden mayor, y puede calcularse usando técnica publicadas o métodos codificados en programas informáticos tales como, por ejemplo, BLASTP, BLASTN, FASTA; Altschul, 1990, J. Mol. Biol., 215, 403. Los valores de porcentaje de identidad se calculan, en un aspecto, a lo largo de la secuencia de aminoácidos completa. Para los expertos en la técnica están disponibles una serie de programas basados en una diversidad de algoritmos para comparar secuencias diferentes. En este contexto, los algoritmos de Needleman y Wunsch o de Smith y Waterman producen resultados particularmente fiables. Para realizar los alineamientos de las secuencias, se emplea el programa PileUp (1987, J. Mol. Evolution, 25, 351; Higgins, 1989, CABIOS, 5, 151) o los programas Gap y BestFit (Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol., 48; 443; Smith y Waterman, 1981, Adv. Appl. Math., 2, 482), que son parte del paquete de software GCG (Genetics Computer Group, 1991, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, EE. UU. 53711). Los valores de identidad de secuencia indicados anteriormente en porcentaje (%) se determinan, en un aspecto, empleando el programa GAP a lo largo de la región de secuencia completa con los siguientes ajustes: peso de hueco: 50, anchura de longitud: 3, apareamiento promedio: 10,000 y desapareamiento promedio: 0,000, que, a menos que se especifique lo contrario, siempre se utilizarán como ajustes estándar para los alineamientos de las secuencias.

Se entenderá que los variantes mencionados anteriormente, en un aspecto, conservarán las propiedades biológicas de las neurotoxinas. Los expertos en la técnica apreciarán que la actividad biológica completa solo se logra después de la activación proteolítica, aunque es concebible que el precursor no procesado pueda ejercer ciertas funciones biológicas o ser parcialmente activo. Las "propiedades biológicas", tal como se emplean en la presente, se refieren a (a) la unión al receptor, (b) la internalización, (c) la translocación a través de la membrana endosómica hacia el citosol y/o (d) la ruptura endoproteolítica de proteínas implicadas en la fusión de membranas de vesículas sinápticas. Los ensayos in vivo para evaluar la actividad biológica incluyen el ensayo de LD50 (LD: dosis letal) de ratón y el ensayo de hemidiafragma de ratón ex vivo según describen Pearce L.B., Borodic G.E., First E.R., MacCallum R.D. (1994), Measurement of botulinum toxin activity: evaluation of the lethality assay, Toxicol. Appl. Pharmacol., 128: 69­ 77; y Dressler D., Lange M., Bigalke H. (2005), The mouse diaphragm assay for detection of antibodies against botulinum toxin type B, Mov. Disord., 20:1617-1619. La actividad biológica se expresa habitualmente en unidades de ratón ("Mouse Units", MU). Tal como se emplea en la presente, 1 MU es la cantidad de componente neurotóxico que mata 50% de una población de ratones especificada después de una inyección intraperitoneal, es decir la LD50 i.p. de ratón (Schantz y Kauter, 1978). En otro aspecto, los variantes puede ser neurotoxinas que presentan propiedades biológicas mejoradas o alteradas, por ejemplo, pueden comprender sitios de ruptura que están mejorados para el reconocimiento de enzimas o que pueden mejorarse para la unión al receptor o cualquier otra propiedad especificada anteriormente. Es concebible que el concepto de la presente invención se base en la presencia de uno, dos o más sitios de ruptura entre la cadena ligera y pesada del polipéptido de neurotoxina, aunque la naturaleza del sitio o sitios de ruptura y la secuencia de aminoácidos concreta entre ellos no importe, siempre que el agente sea específico para el polipéptido de neurotoxina parcialmente procesado o no procesado. Por consiguiente, otro aspecto lo constituye el reemplazo de sitios de reconocimiento de proteasas y del péptido conector entre la cadena pesada y ligera del polipéptido de neurotoxina o de las secuencias flanqueantes que rodean al sitio de ruptura (en el caso de un único sitio de ruptura).

En otro aspecto, el polipéptido de neurotoxina BoNT/A según el método de la invención puede ser una molécula quimérica. Dicha molécula quimérica, en un aspecto, puede presentar dominios individuales sustituidos. Por consiguiente, en otro aspecto, la porción de cadena pesada de la neurotoxina BoNT/A está reemplazada por una porción de un dominio FC de un anticuerpo.

En un aspecto, el polipéptido de neurotoxina BoNT/A producido según el método de la presente invención puede usarse para herramientas analíticas, que incluyen ELISA, antígenos para ELISA, y patrones control.

Para lograr que una preparación de neurotoxina BoNT/A también esté exenta de impurezas, pueden añadirse otras etapas de purificación muy conocidas en la técnica al método de la presente invención mencionado anteriormente, el cual se explicará a continuación.

Tal como se sigue del texto anterior, en un aspecto del método de la presente invención, dicho método se realiza por medio de una cromatografía de afinidad.

En otro aspecto de la invención, el inmunoabsorbente específico para la cromatografía de inmunoafinidad se prepara como sigue:

- síntesis del oligopéptido específico (representado por SEQ ID NO:1 o 25) del precursor del polipéptido de BoNT/A no procesado o parcialmente procesado, en particular, preparación de un oligopéptido sintético;

- conjugación del péptido con un vehículo adecuado para la inmunización (que incluye hemocianina, BSA, lipopolisacáridos y otros), específicamente, la unión del oligopéptido a un vehículo polipeptídico;

- inmunización de animales para producir anticuerpos policlonales o monoclonales, en particular, inmunización de conejos o cabras para producir anticuerpos policlonales e inmunización de ratones para producir anticuerpos monoclonales (es necesario inmunizar al menos diez animales para obtener un anticuerpo de afinidad);

- generación de líneas celulares de hibridoma para producir anticuerpos monoclonales;

- purificación de los anticuerpos mediante cromatografía convencional y de afinidad (para la última, el oligopéptido se unirá a un vehículo), específicamente, los anticuerpos se purifican empleando, por ejemplo, proteína A o G y/o a través del oligopéptido unido a un vehículo (este último se empleó para la inmunización) o a través de una cromatografía de afinidad del péptido para retirar los anticuerpos no específicos, seguido de una cromatografía de afinidad;

- ruptura de los anticuerpos específicos en fragmentos Fab, en particular, los anticuerpos específicos se tratan con una proteasa, tal como papaína, para obtener los respectivos fragmentos Fab;

- los fragmentos Fab se caracterizan por sus propiedades de unión antes de posteriores aplicaciones;

- los anticuerpos se acoplarán a una matriz en columna, tal como Sepharose activada, en particular, los fragmentos Fab específicos se acoplan a un grupo de enlace activo de un material vehículo;

- el inmunoabsorbente (en una columna) se lava y se equilibra usando un sistema de tampón adecuado;

- el precursor del polipéptido de neurotoxina BoNT/A no procesado o parcialmente procesado se une específicamente al inmunoabsorbente, mientras que el polipéptido de neurotoxina BoNT/A procesado activo pasa a través de la columna sin modificarse (sin que se una a ella) y se recogerá.

En otro aspecto del método de la invención, se realiza además una cromatografía de exclusión molecular. Mediante la cromatografía de exclusión molecular, tal como se usa en la presente invención, las partículas se separan basándose en su tamaño, concretamente en su volumen hidrodinámico. Una fase móvil es una disolución acuosa empleada para transportar la muestra (cromatografía de filtración en gel) o es un disolvente orgánico (cromatografía de permeación en gel). Una fase estacionaria es un medio en gel (poliacrilamida, dextrano o agarosa) que se filtra a baja presión, o es sílice o es un medio de poliestireno reticulado que se filtra a presión mayor. En otro aspecto, dicha cromatografía de exclusión molecular se realiza como una cromatografía en columna. En otro aspecto del método de la invención, dicha cromatografía de exclusión molecular se realiza empleando tamices molecular con tamaños de poro diferenciados, tales como carbono activado, gel de sílice, zeolita.

El método de la presente invención, en otro aspecto, comprende además una cromatografía de intercambio iónico. Una cromatografía de intercambio iónico, tal como se usa en la presente invención, separa las moléculas basándose en las diferencias entre la carga global de las proteínas y los compuestos relacionados. Se emplea para la purificación de proteínas, para la purificación de oligonucleótidos, péptidos u otras moléculas cargadas. Dichas moléculas deben estar presentes en la disolución que se va a aplicar al método de purificación como contaminantes.

La proteína o el compuesto relacionado de interés, en el caso presente la neurotoxina BoNT/A, debe tener una carga opuesta a la del grupo funcional unido a la resina para que pueda unirse. Debido a que esta interacción es iónica, la unión debe realizarse bajo condiciones de baja ionicidad. La elución se logra aumentando la fuerza iónica para romper la interacción iónica o cambiando el pH de la proteína. En un aspecto del método de la invención, dicha cromatografía de intercambio se realiza como una cromatografía en columna.

En un aspecto, la cromatografía de intercambio, tal como se usa según la presente invención, es una cromatografía de intercambio iónico.

La cromatografía de intercambio iónico, tal como se usa en la presente invención, se realiza, en otro aspecto, por medio de una cromatografía de intercambio catiónico y/o aniónico. En una cromatografía de intercambio aniónico, tal como se emplea en la presente, la carga superficial de los solutos (proteínas, péptidos, ácidos nucleicos, endotoxinas) que se van a unir será una carga neta negativa, por tanto para que una proteína específica se una, se debe lograr un pI cercano o mayor que el pI de esa proteína. Las resinas de intercambio aniónico que se emplean habitualmente son Q-resinas (Q Sepharose), una amina cuaternaria; y resina de DEAE (dietilaminoetano). En general, una resina de intercambio iónico es una matriz insoluble de esferas pequeñas que tienen una superficie cargada, que se emplea como una zeolita artificial. Los diferentes tipos de resinas pueden distinguirse basándose en sus grupos funcionales e incluyen resinas muy ácidas (grupos ácido sulfónico, por ejemplo, sulfonato de poliestireno sodio o poliAMPS), resinas muy básicas (grupos amino cuaternario, por ejemplo, grupos trimetilamonio, por ejemplo, poliAPTAC), resinas débilmente ácidas (en su mayor parte, grupos ácidos carboxílico), resinas débilmente básicas (grupos amino primario, secundario y/o ternario, por ejemplo, polietilenamina). También existen tipos especializados de resinas que incluyen las resinas quelantes (ácido iminodiacético, tiourea).

En una cromatografía de intercambio catiónico, tal como se emplea en la presente, la carga superficial de los solutos (proteínas, péptidos, ácidos nucleicos, endotoxinas) que se van a unir será una carga neta positiva, por tanto para que una proteína específica se una, se debe lograr un pI cercano o menor que el pI de esa proteína. Las resinas de intercambio catiónico que se emplean habitualmente son S-resinas, derivados de sulfato; y resinas CM, iones derivados de carboxilato.

En un aspecto del método de la invención, dicha cromatografía de intercambio iónico se realiza antes y/o después de la cromatografía de afinidad. En otro aspecto del método de la invención, dicha cromatografía de intercambio iónico, tal como se usa en la presente, se realiza antes de la cromatografía de afinidad de la presente invención. Debido a esta medida, el riesgo de reactividad cruzada potencial o de que se produzca una unión no específica durante la cromatografía de afinidad puede evitarse y reducirse aún más.

El método de la presente invención permite la fabricación de neurotoxina BoNT/A procesada activa exenta del precursor del polipéptido de neurotoxina BoNT/Ano procesado o parcialmente procesado y, así, se obtienen cantidades mayores del polipéptido de neurotoxina BoNT/A procesado activo.

La presente invención se refiere, en principio, al uso del anticuerpo de la presente invención para separar la neurotoxina BoNT/A procesada activa de su precursor del polipéptido de BoNT/A no procesado o parcialmente procesado. En un aspecto, el anticuerpo de la presente invención se usa para la separación del precursor del polipéptido de neurotoxina BoNT/A no procesado o parcialmente procesado del polipéptido de neurotoxina BoNT/A procesado activo, en una disolución que contiene una mezcla de dichos polipéptidos, y así obtener el polipéptido de neurotoxina BoNT/A procesado activo exento del precursor del polipéptido de neurotoxina BoNT/A no procesado o parcialmente procesado, tal como se describe en detalle en otro punto en la presente.

La presente invención también se refiere a un método para la fabricación de un medicamento que comprende las etapas del método mencionado anteriormente y la etapa adicional de formular el polipéptido de neurotoxina BoNT/A proteolíticamente procesado como un medicamento.

El término "medicamento", tal como se emplea en la presente, se refiere, en un aspecto, a una composición farmacéutica que contiene el polipéptido de neurotoxina BoNT/A biológicamente activo (proteolíticamente procesado) como compuesto activo farmacéutico, en la que la composición farmacéutica puede usarse para la terapia humana o no humana de diversas enfermedades o trastornos en una dosis terapéuticamente eficaz.

Una composición farmacéutica, tal como se usa en la presente, comprende el polipéptido de neurotoxina BoNT/A biológicamente activo (proteolíticamente procesado) preparado mediante el método de la presente invención y, en un aspecto, uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables. La neurotoxina BoNT/A activa puede estar presente en forma líquida o liofilizada. En un aspecto, dicho compuesto puede estar presente junto con glicerol, estabilizantes de proteínas (por ejemplo, albúmina de suero humana (HAS)) o estabilizantes que no son proteínas. La composición farmacéutica, en un aspecto, se administra por vía tópica. La administración de fármacos que se emplea de modo convencional es la administración intramuscular, subcutánea (cerca de glándulas). Sin embargo, dependiendo de la naturaleza y del modo de acción de un compuesto, la composición farmacéutica puede administrarse también por otras vías.

El compuesto, es decir, el polipéptido de neurotoxina BoNT/A biológicamente activo (proteolíticamente procesado) es el ingrediente activo de la composición y, en un aspecto, se administra en formas de dosificación convencionales preparadas combinando el fármaco con vehículos farmacéuticos convencionales según procedimientos convencionales. Estos procedimientos pueden implicar mezclar, granular y comprimir, o disolver los ingredientes según sea apropiado para la preparación deseada. Se apreciará que la forma y el carácter del vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable vienen dictados por la cantidad de ingrediente activo que se va a combinar, por la vía de administración y por otras variables muy conocidas.

El vehículo o vehículos deben ser aceptables en el sentido de ser compatibles con los otros ingredientes de la formulación y no ser perjudiciales para el receptor de esta. El vehículo farmacéutico empleado puede incluir un sólido, un gel, o un líquido. Los ejemplos de vehículos sólidos son lactosa, sulfato de calcio dihidratado, sacarosa, talco, gelatina, agar, pectina, goma arábiga, estearato de magnesio, ácido esteárico y similares. Los ejemplos de vehículos líquidos son disolución salina tamponada con fosfato, jarabe, aceite, agua, emulsiones, diversos tipos de agentes humectantes y similares. De forma similar, el vehículo o diluyente puede incluir un material de retraso en el tiempo muy conocido en la técnica, tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo, por sí solo o con una cera. Los vehículos adecuados comprenden los mencionados anteriormente y otros muy conocidos en la técnica; véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pensilvania. El diluyente o diluyentes se seleccionan para que no afecten a la actividad biológica de la combinación. Los ejemplos de dichos diluyentes son agua destilada, disolución salina fisiológica, disoluciones de Ringer, disolución de dextrosa y disolución de Hank. Además, la composición o formulación farmacéutica también puede incluir otros vehículos, adyuvantes, o estabilizantes no tóxicos, no terapéuticos, no inmunogénicos y similares.

Una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a una cantidad del compuesto que se va a usar en una composición farmacéutica de la presente invención que previene, mejora o trata los síntomas que acompañan a una enfermedad o un trastorno indicado en esta memoria descriptiva. La eficacia terapéutica y la toxicidad del compuesto pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos celulares o animales de experimentación, por ejemplo, DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en 50% de la población) y DL50 (la dosis letal para 50% de la población). La proporción de dosis entre los efectos terapéuticos y tóxicos es el índice terapéutico, y puede expresarse como la proporción DL50/DE50.

El régimen de dosificación será determinado por el médico encargado y por otros factores clínicos. Tal como se conoce en la técnica médica, las dosificaciones para cualquier paciente concreto dependen de muchos factores, que incluyen el tamaño del paciente, la superficie específica del cuerpo, la edad, el compuesto concreto que se va a administrar, el sexo, el momento y la vía de administración, la salud general y otros fármacos que se estén administrando al mismo tiempo. El avance puede controlarse mediante una evaluación periódica.

Las composiciones y formulaciones farmacéuticas mencionadas en la presente se administran al menos una vez para tratar o mejorar o prevenir una enfermedad o un trastorno indicado en esta memoria descriptiva. Sin embargo, dichas composiciones farmacéuticas pueden administrarse más de una vez.

Las composiciones farmacéuticas específicas se preparan de una manera conocida en la técnica farmacéutica y comprenden al menos un compuesto activo mencionado anteriormente en la presente, mezclado o asociado de otro modo con un vehículo o un diluyente farmacéuticamente aceptable. Para fabricar estas composiciones farmacéuticas, el compuesto o compuestos activos habitualmente se mezclarán con un vehículo o con el diluyente. Las formulaciones resultantes deben adaptarse al modo de administración. Las recomendaciones de dosificación serán indicadas en las instrucciones del prescriptor o usuario para prever los ajustes de la dosis dependiendo del receptor considerado.

El medicamento puede comprender, en otro aspecto de la invención, otros fármacos además del polipéptido de neurotoxina BoNT/A biológicamente activo (proteolíticamente procesado) que se añaden a la composición farmacéutica durante su formulación. Por último, debe entenderse que la formulación de una composición farmacéutica se realiza bajo condiciones convencionales de GMP o similares para asegurar la calidad, la seguridad farmacéutica y la eficacia del medicamento.

Se describe una composición que comprende un polipéptido de neurotoxina BoNT/A proteolíticamente procesado que puede obtenerse mediante el método de la presente invención.

El término "composición" se refiere a cualquier composición formulada en forma sólida, líquida, en aerosol (o gaseosa). Dicha composición comprende el compuesto opcionalmente junto con compuestos auxiliares adecuados, tales como diluyentes o vehículos u otros ingredientes. En este contexto, en la presente invención se distingue entre compuestos auxiliares, es decir, compuestos que no contribuyen a los efectos suscitados por el compuesto tras la aplicación de la composición para su objetivo deseado, y otros ingredientes, concretamente compuestos que contribuyen con otro efecto o que modulan el efecto del compuesto. Los diluyentes y/o vehículos adecuados dependen del objetivo para el cual se va a usar la composición y los otros ingredientes. Los expertos en la técnica pueden determinar sin más dichos diluyentes y/o vehículos adecuados. Los ejemplos de vehículos y/o diluyentes adecuados se describen en otro punto en la presente.

La composición mencionada anteriormente es un medicamento, tal como se especifica con más detalle en otro punto de la descripción. En un aspecto, dicho medicamento puede usarse para la prevención y/o el tratamiento de al menos una de las siguientes enfermedades y trastornos: trastornos de la fuerza de los músculos voluntarios, distonía focal, que incluye distonía cervical, craneal, y blefaroespasmo esencial benigno, espasmo hemifacial, y espasticidad focal, trastornos gastrointestinales, hiperhidrosis, y corrección de arrugas cosmética, en otro aspecto también el blefaroespasmo, distonía oromandibular, del tipo de apertura de mandíbula, del tipo de cierre de mandíbula, bruxismo, síndrome de Meig, distonía lingual, apraxia del párpado, distonía cervical de apertura, antecollis, retrocollis, laterocollis, tortícolis, distonía faríngea, distonía laríngea, disfonía espasmódica/de tipo abductor, disnea espasmódica, distonía de extremidades, distonía del brazo, distonía específica de tareas, calambre del escritor, calambre del músico, calambre del golfista, distonía de pierna, abducción del muslo, abducción del muslo y flexión de la rodilla, extensión de la rodilla, flexión del tobillo, extensión del tobillo, equinovarus, distonía de deformidad del pie, dedo estriatal, flexión del dedo del pie, extensión del dedo del pie, distonía axial, síndrome de Pisa, distonía de la bailarina del vientre, distonía segmental, hemidistonía, distonía generalizada, distonía en el síndrome de Lubag, distonía en la degeneración corticobasal, distonía tardía, distonía en la ataxia espinocerebelar, distonía en la enfermedad de Parkinson, distonía en la enfermedad de Huntington, distonía en la enfermedad de Hallervorden-Spatz, disquinesias inducidas por DOPA/distonía inducida por DOPA, disquinesias tardías/distonía tardía, disquinesias/distonía paroxísmicas, mioclonus palatal inducido por la acción quinesiogénica no quinesiogénica, mioclonia mioquimia, rigidez, espasmos musculares benignos, temblor de la barbilla hereditario, actividad paradójica del músculo de la mandíbula, espasmos hemimasticatorios, miopatía branquial hipertrófica, hipertrofia masetérica, hipertrofia anterior tibial, nistagmo, oscilopsia, parálisis supranuclear progresiva, epilepsia, epilepsia partialis continua, planificación de una operación de tortícolis espasmódica, parálisis de las cuerdas vocales abductoras, disfonía mutacional recalcitrante, disfunción del esfínter esofágico superior, granuloma de pliegue vocal, tartamudeo del síndrome de Gilles de la Tourette, mioclonus del oído medio, cierre protector de la laringe, postlaringectomía, fallos del habla, ptosis protectora, entropión de disfunción del esfínter de Odii, pseudoacalasia, no acalsia, trastornos motores esofágicos, vaginismo, temblor de inmovilización postoperatorio, disfunción de la vejiga, disinergía del esfínter detrusor, espasmo del esfínter y vejiga, espasmo hemifacial, disquinesias de reinervación, uso cosmético para las patas de gallo, asimetrías faciales de fruncimiento de ceño, barbilla rocosa, síndrome de la persona rígida, hiperplasia de próstata por tétanos, adipositas, tratamiento del estrabismo por parálisis cerebral infantil, paralítico mixto concomitante, después de cirugía de desprendimiento de retina, después de cirugía de cataratas, en estrabismo miosítico por afaquia, estrabismo miopático, desviación vertical disociada, como adjunto a la cirugía por estrabismo, esotropía, exotropía, acalasia, fisuras anales, hiperactividad de las glándulas exocrinas, síndrome de Frey, síndrome de las lágrimas de cocodrilo, hiperhidrosis, rinorrea plantar, palmar y axilar, hipersalivación relativa en el ictus, en la enfermedad de Parkinson, en la esclerosis amiotrófica lateral, trastornos espásticos, en procesos autoinmunológicos de la encefalitis y mielitis, esclerosis múltiple, mielitis transversal, síndrome de Devic, infecciones víricas, infecciones bacterianas, infecciones parasitarias, infecciones fúngicas, en la paraparesis espástica hereditaria, síndrome postapoplético, infarto hemisférico, infarto del tronco cerebral, infarto de la médula espinal, en traumatismos del sistema nervioso central, lesiones hemisféricas, lesiones del tronco cerebral, lesiones de la médula espinal, en hemorragias del sistema nervioso central, hemorragia intracerebral, hemorragia subaracnoidea, hemorragia subdural, hemorragia intraespinal, en neoplasias, tumores hemisféricos, tumores del tronco cerebral, y tumores de la médula espinal. Para los detalles y los síntomas, véase, por ejemplo, Jost, 2007, Drugs, 67(5), 669, o Dressier, 2000, en Botulinum Toxin Therapy, Thieme Verlag, Stuttgart, Nueva York.

Se indica que la composición es una composición cosmética que puede formularse como se ha descrito anteriormente para una composición farmacéutica. De forma similar, para una composición cosmética se contempla que el compuesto, en un aspecto, se use en forma sustancialmente pura. Las composiciones cosméticas, en otro aspecto, se aplicarán por vía intramuscular. En otro aspecto, las composiciones cosméticas que comprenden la neurotoxina BoNT/A pueden formularse como una disolución antiarrugas.

Las figuras muestran:

Figura 1: Esquema de la purificación cromatográfica convencional del polipéptido de neurotoxina.

Figura 2: Esquema de la purificación cromatográfica del polipéptido de neurotoxina biológicamente activo (proteolíticamente procesado) y la separación de su precursor de polipéptido parcialmente procesado o no procesado según la presente invención.

Figura 3: Transferencia Western que emplea un anticuerpo que reconoce específicamente a SEQ ID NO:25 y que se ha obtenido mediante el método de la presente invención. El tamaño de las bandas se indica en kDa. Los carriles individuales se explican en los ejemplos.

Los siguientes ejemplos ilustran la invención y no deben considerarse, de ninguna manera, limitantes de su alcance.

Ejemplos

Ejemplo 1: Generación de inmunógenos y anticuerpos

Generación de inmunógenos

1. Péptido conector-inmunógeno I: El péptido con la secuencia NH2-TKSLDKGYNK-C-COOH fue generado por un suministrador externo y después se acopló a través del conector GMBS a la proteína vehículo KLH.

2. Péptido conector-inmunógeno II: a) Activación de la ovoalbúmina: 2,18 mg de sulfo-smcc (sulfosuccinimidil-4(N-maleimidometil)ciclohexan-1-carboxilato) se disolvieron en 50 |il de DMSO. Después, se añadieron 2,5 ml de disolución de ovoalbúmina que contenía ovoalbúmina 7,5 mg/ml (tampón: fosfato de sodio 5 mM, NaCl al 0,9%) y la disolución se incubó durante 1 h a temperatura ambiente con rotación. Se realizó un cambio de tampón empleando columnas PD10, y la ovoalbúmina activada se eluyó en 3,5 ml de tampón que contenía fosfato de sodio 10 mM, NaCl al 0,9%. b) Acoplamiento del péptido a la ovoalbúmina: se disolvieron 8 mg del péptido Ac-DKGYNC-OH en 250 |il de H2O y 2,5 |il de TCEP HCl 500 mM (HCl de tris[2-carboxietil]fosfina) y posteriormente se neutralizó con NaOH 1 mM. Por último, se añadió ovoalbúmina activada y la mezcla de reacción se incubó a temperatura ambiente durante 4,4 h con rotación. Mediante la adición de una disolución de cisteína 10 mM se bloquearon los restos reactivos remanentes mediante una incubación durante 1 h con rotación. Se realizó una diálisis empleando fosfato de sodio 10 mM, NaCl al 0,9%.

Inmunización

Se obtuvieron antisueros mediante inmunización.

1. ) Suero de antipéptido conector de scBoNT/A I: Como inmunógeno se empleó el inmunógeno de péptido conector I que se acopló a través del conector GMBS a la proteína vehículo KLH. Se inmunizaron por vía subcutánea dos cabras simultáneamente, primero cada una con 300 |ig de inmunógeno de decapéptido en adyuvante de Freud y, por último, se inmunizaron cuatro veces a un ritmo de 2 semanas con 100 |ig del inmunógeno en adyuvante de Freud incompleto. Después de 49, 63, 77 y 84 días se recogió el antisuero. Se realizó una cromatografía de afinidad empleando el suero recogido del último sangrado en el día 84.

2. ) Suero de antipéptido conector de scBoNT/A II: Como inmunógeno se empleó el inmunógeno de péptido conector II que se acopló a través del conector SMCC a la proteína vehículo ovoalbúmina. Se inmunizaron por vía intradérmica dos conejos, primero cada uno con 300 |ig de inmunógeno de péptido conector II en adyuvante de Freud y, por último, se inmunizaron cinco veces a un ritmo de 2 semanas con 150 |ig de inmunógeno de péptido conector II en Montanide ISA 206. Se realizó una cromatografía de afinidad empleando el suero recogido del sangrado en el día 60 o 110, respectivamente.

Cromatografía de afinidad en dos etapas del suero

1. Generación de la matriz: Para la cromatografía de afinidad en dos etapas se generaron dos matrices de yodoacetilo de ultraunión diferentes que contenían péptidos diferentes.

Por una parte, los péptidos de reactividad cruzada SLD, LDK e YNK se presentaron en forma de los siguientes péptidos: Ac-ELDKYN-C-COOH (SEQ ID NO:26), NH2-NISLDL-C-COOH (SEQ ID NO:27) y NH2-YYNKF-C-COOH (SEQ ID NO:28) y se acoplaron a la matriz empleando la descripción general indicada a continuación. Por otra parte, el péptido conector (SEQ ID NO:25) se acopló a la matriz empleando la descripción general indicada a continuación en forma del siguiente derivado: A^c-TKSL^d K^g YNKA-C-CO^o H.

Descripción general:

Tampón de acoplamiento - Tris 50 mM, EDTA-Na 5 mM, pH 8,5. Preparar un volumen de tampón igual a 20 veces el volumen del gel de yodoacilo UltraLink® que se va a emplear. L-cisteína HCl; disolución de lavado: cloruro de sodio (NaCl) 1 mM. Se emplea una columna de flujo por gravedad o de rotación vacía que pueda cerrarse por arriba y por abajo.

Preparar la muestra de péptido o proteína.

Disolver el péptido con tampón de acoplamiento.

Acoplar al gel de yodoacilo UltraLink®:

1. Tras haber colocado un tapón en la parte inferior de una columna de flujo por gravedad, añadir la cantidad deseada de suspensión de gel de yodoacilo UltraLink® y dejar que el gel se asiente durante 15 minutos.

2. Drenar el líquido de la columna cargada y lavar/equilibrar el gel de yodoacilo UltraLink® con 5 volúmenes de lecho del gel de tampón de acoplamiento añadiendo el tampón por la parte de arriba del lecho del gel y dejando que drene a través de la columna. No dejar que el lecho del gel se seque.

3. Volver a colocar el tapón en la parte inferior y añadir la muestra que contiene sulfhidrilo preparada. Puede aplicarse aproximadamente 1 ml de disolución de muestra por ml de gel de yodoacilo UltraLink®.

4. Volver a colocar el tapón en la parte superior y mezclar la columna a temperatura ambiente durante 15 minutos.

5. Dejar la columna en posición erguida e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos sin mezclar.

6. Retirar secuencialmente los tapones de la parte superior e inferior de la columna y dejar que la disolución drene.

7. Lavar la columna con tres volúmenes de lecho del gel de tampón de acoplamiento.

Bloquear los sitios de unión no específica en el gel.

1. Volver a colocar el tapón en la parte inferior de la columna.

2. Preparar una disolución de L-cisteína HCl 50 mM en tampón de acoplamiento y añadir 1 de esta disolución a la columna por cada mililitro de gel.

3. Volver a colocar el tapón en la parte superior y mezclar durante 15 minutos a temperatura ambiente, después incubar la reacción sin mezclar durante 30 minutos más a temperatura ambiente.

2. Cromatografía de afinidad en dos etapas:

El suero que se va a purificar primero se separa de la sangre.

El suero bruto se introduce en la primera columna que contiene los tripéptidos de reactividad cruzada. Los anticuerpos de reactividad cruzada se unen a los tripéptidos y se separan del suero bruto. El filtrado de esta primera columna se introduce en la segunda columna que contiene el péptido conector unido. Los anticuerpos específicos del péptido conector se unen al péptido conector. Los anticuerpos antipéptido conector de scBoNT/A de baja afinidad se retiran de la columna mediante un lavado de alta rigurosidad con tampón PBS (NaCl 0,5 M). Después, los anticuerpos antipéptido conector de scBoNT/A de alta afinidad unidos se eluyen y se concentran. Este concentrado se corresponde con el suero de antipéptido conector de scBoNT/A usado.

Ejemplo 2: Ensayo y verificación de la especificidad del anticuerpo

Reactivos de ELISA:

Tampón de revestimiento - Tris 0,005 M-1 M, NaCl al 0,9% NaCl, preferiblemente Tris 0,01 M-0,2 M, NaCl al 0,9%, pH = 8,5.

Anticuerpo de captura - suero de antipéptido conector de scBoNT/A.

Tampón de bloqueo y diluyente del anticuerpo - BSA al 0,5%-5% en fosfato de sodio 0,01 M, NaCl al 0,9%, pH = 7,4. Tampón de muestras - BSA al 0,5%-5% en fosfato de sodio 0,005 M-1 M, NaCl 0,1-0,5 M, Tween 20 al 0,01%-1%, preferiblemente BSA al 1%-3% en fosfato de sodio 0,005-0,1 M, NaCl 0,15 M-0,4 M, Tween 20 al 0,05%-0,5%, pH = 7,4.

Tampón de lavado - fosfato de sodio 0,01 M, NaCl al 0,9%, Tween 20 al 0,05%, pH = 7,4.

Anticuerpo de detección - anticuerpo monoclonal contra BoNT/A.

Anticuerpo secundario - un anticuerpo policlonal anti-IgG de ratón (H&L) conjugado con peroxidasa.

Sustrato - TMB, disponible en el mercado.

2. Reactivos de la transferencia Western:

Tampón de muestras desnaturalizante - disponible en el mercado.

Gel de SDS - disponible en el mercado.

Tampón de ejecución de MES (SDS-PAGE) - disponible en el mercado.

Membrana de PVDF - disponible en el mercado.

Tampón de transferencia (Western) - disponible en el mercado.

Muestra - neurotoxina botulínica A con BoNT/A dicatenaria y scBoNT/A (monocatenaria).

Anticuerpo primario - suero de antipéptido conector de scBoNT/A.

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. - Un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a un epitopo que consiste en un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO:1.

2. - El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que dicho epitopo está comprendido en un polipéptido de neurotoxina BoNT/A proteolíticamente no procesado o parcialmente procesado.

3. - Un método para la fabricación de un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido de neurotoxina BoNT/A no procesado y/o parcialmente procesado, que comprende las etapas de:

a) poner en contacto un antisuero policlonal procedente de un animal no humano que ha sido inmunizado empleando un inmunógeno de péptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se indica en SEQ ID NO:25, con un péptido que tiene SEQ ⁱD NO:25, bajo condiciones que permiten la formación de un complejo que comprende el péptido mencionado anteriormente y un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido de neurotoxina BoNT/A no procesado o parcialmente procesado;

b) retirar el complejo formado en la etapa a) del antisuero; y

c) liberar el anticuerpo que se une específicamente al polipéptido de neurotoxina BoNT/A no procesado o parcialmente procesado de dicho complejo,

en el que dicho método comprende además, antes de la etapa a), las etapas de:

i) poner en contacto dicho antisuero policlonal procedente de un animal no humano que ha sido inmunizado empleando un inmunógeno de péptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se indica en SEQ ID NO:25, con los siguientes péptidos de captura indicados en SEQ ID NO:26 a 28, bajo condiciones que permiten la formación de complejos de captura que comprenden los anticuerpos no específicos incluidos en el antisuero policlonal y los péptidos de captura; y

ii) retirar los complejos de captura del antisuero policlonal.

4. - El método de la reivindicación 3, en el que dicho inmunógeno comprende además KLH.

5. - El método de la reivindicación 4, en el que dicha KLH está unida al péptido que tiene SEQ ID NO:25 a través del conector N-[gamma-maleimidobutiriloxi]succinimida éster (GMBS).

6. - El método de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en el que las etapas a) a c) se realizan por medio de una cromatografía de afinidad.

7. - El método de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, en el que las etapas i) y ii) se realizan por medio de una cromatografía de afinidad.

8. - Un anticuerpo que puede obtenerse mediante el método de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7.

9. - El anticuerpo de la reivindicación 8 que es un anticuerpo policlonal.

10. - El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 8 o 9, en el que dicho anticuerpo está acoplado a un soporte sólido.

11. - El uso del anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1,2, 8 a 10 para la retirada del polipéptido de neurotoxina BoNT/A parcialmente procesado y/o no procesado del polipéptido de neurotoxina BoNT/A procesado.

12. - El uso del anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 8 a 10 para detectar la BoNT/A parcialmente procesada y/o no procesada en una muestra.

13. - Un método para la fabricación de un polipéptido de neurotoxina BoNT/A procesado, que comprende las etapas de: a) poner en contacto una disolución que contiene una mezcla de polipéptidos de neurotoxina BoNT/A procesados, parcialmente procesados y/o no procesados, con un anticuerpo de las reivindicaciones 1,2, 8 a 10, bajo condiciones que permiten la unión de dicho anticuerpo a los polipéptidos de neurotoxina BoNT/A no procesados y/o parcialmente procesados, por lo cual se forman complejos que comprenden dicho anticuerpo y el polipéptido de neurotoxina BoNT/A parcialmente procesado o no procesado, y

b) retirar dichos complejos formados en la etapa a), por lo cual se obtiene una disolución que contiene el polipéptido de neurotoxina BoNT/A procesado sin polipéptidos de neurotoxina BoNT/A no procesados y/o parcialmente procesados.

14. - Un método para la fabricación de un medicamento que comprende las etapas del método de la reivindicación 13 y la etapa adicional de formular dicha disolución que contiene el polipéptido de neurotoxina BoNT/A procesado sin polipéptidos de neurotoxina BoNT/A no procesados o parcialmente procesados como un medicamento.