KR101726757B1

KR101726757B1 - 황칠나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 갱년기 질환 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101726757B1
Application number: KR1020150190242A
Authority: KR
Inventors: 박영준; 장민선; 오성문; 김성환
Original assignee: 아주대학교산학협력단; 제삼바이오잠(주)
Priority date: 2015-12-30
Filing date: 2015-12-30
Publication date: 2017-04-13
Also published as: CN108463231B; US10675316B2; WO2017116045A1; US20180353559A1; CN108463231A

Abstract

본 발명은 황칠나무(Dendropanax morbifera LEV.) 추출물을 유효성분으로 함유하는 갱년기 질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 황칠나무 추출물은 세포내에서 유의적으로 ER 작용제 활성을 나타내고, EC₅₀ 값이 약 100 μg/ml로, 매우 강력한 ER 작용제(Full agonist) 활성을 내므로, 에스트로겐과 유사한 식물 대사물질(plant metabolites)을 고함량으로 포함하고 있는 황칠나무 추출물은 갱년기 여성에서 에스트로겐 결핍으로 유래된 다양한 증상을 개선시킬 수 있는 호르몬대체요법으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

황칠나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 갱년기 질환 예방 및 치료용 조성물{Composition for prevention and treatment of climacteric disorder comprising extracts of Dendropanax morbifera as an active ingredient}

본 발명은 황칠나무(Dendropanax morbifera LEV.) 추출물을 유효성분으로 함유하는 여성 갱년기 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물, 및 상기 질환 예방 및 개선용 건강식품에 관한 것이다.

과학과 문명의 발달로 산업화된 현대를 살아가는데 있어서 인간은 그 수명이 점차 연장됨과 동시에 각종 스트레스, 공해 및 자연발생적인 노화 현상 등으로 인하여 면역력이 저하되고 노화가 진행되게 된다. 특히 여성의 경우 40대 이후 서서히 시작되는 갱년기 증상으로 인해 신체적 및 정신적 어려움을 겪고 있다.

한편, 갱년기란 내분비 증후군의 일종으로 난소기능의 전반적이고 점진적인 노화로 인한 여성호르몬, 즉 에스트로겐의 감소로 인해 생리적 기능 및 성기능이 감소 내지 소실되는 과도기를 말한다. 이러한 갱년기의 증상으로는 안면홍조, 빈맥, 발한 또는 두통과 같은 혈관성 변화에 의한 증상이 있고, 근육통, 관절통 및 요통과 같은 근골격계 변화에 의한 증상이 있으며, 빈뇨 또는 요실금과 같은 비뇨생식기 변화에 의한 증상이 있고, 기억력 감퇴, 우울증, 집중력 감퇴 및 현기증과 같은 뇌신경계 변화에 의한 증상이 있으며, 이 외에도 시력감퇴 및 피부와 모발이 변화되는 증상들이 발생되며, 호르몬 변화로 인한 골다공증이나 심혈관계 질환 등 여성의 건강에 치명적인 질환이 발생되기도 한다.

따라서 중년 여성들의 신체적, 정신적 건강 및 삶의 질을 개선하기 위하여 갱년기 증상을 개선할 수 있는 치료제의 개발이 요구되었으며, 이러한 갱년기 증상의 개선을 위해 호르몬 대체요법 및 비스테로이드계 제제 등의 약물들이 개발된 바 있다. 그러나 이들 약물의 경우 대부분이 두통 및 체중증가 등의 부작용이 있는 것으로 알려져 있으며, 특히, 에스트로겐 대체요법의 경우에도 인위적으로 체내에 호르몬을 투여하는 것이기 때문에 이에 대한 거부반응과 함께 자궁출혈, 뇌졸중, 심장발작, 유방암 및 자궁암의 발생 위험이 증가될 수 있는 것으로 알려져 있다(Swaran L., et. al., Obstetrics & Gynecology, 91, 678-684, 1998).

따라서 이와 같은 문제점들 때문에 식품이나 첨가물의 형태로 섭취하는 자연적인 방법으로 에스트로겐 요법을 대체하고자 하는 관심이 높아지고 있으며, 부작용이 없으면서도 갱년기의 증상을 완화시키는 효과가 우수한 새로운 갱년기 치료제의 개발이 요구되고 있는 실정이다.

한편, 에스트로겐(estrogen)은 세포 수의 증가와 분화를 포함하는 다양한 생물학적 작용을 한다. 에스트로겐의 생물학적 작용들은 핵 수용체 슈퍼 패밀리(family)에 속하는 두 개의 에스트로겐 수용체 알파(ER-α; estrogen receptor-α)와 에스트로겐 수용체 베타(ER-β)를 통하여 그 활성을 발휘한다(Nilsson et al., 2001, Physiol. Rev., 81(4):1535-1565.). 에스트로겐 수용체(ER)의 작용메커니즘은 에스트로겐과 세포 내 에스트로겐 수용체들과의 결합으로 수용체들의 이합체(dimer)를 형성하고 이들이 표적 유전자(target gene)의 프로모터(promoters)에 위치한 특정한 에스트로겐 반응서열(estrogen response elements, EREs)와 결합함으로써 표적 유전자의 발현을 조절한다. 두 개의 에스트로겐 수용체는 서로 다른 조직분포 패턴, 리간드 결합력을 가지므로 이러한 차이는 다른 조직에서 에스트로겐 수용체의 작용제(agonists)와 길항제(antagonists)의 서로 다른 선택적 역할을 가능하게 한다(Kuiper et al., 1997, Endocrinology, 138(3):863-870.). 아울러, 에스트로겐 수용체에 작용하는 물질들은 폐경기여성의 호르몬대체요법과 생식기암의 화학요법제 개발을 위한 표적으로 활용되고 있다. 따라서, 인체에 부적용이 없는 천연물을 대상으로 에스트로겐 수용체를 활성화시키는 천연물을 발굴한다면, 여성 갱년기 질환 치료 및 예방에 유용하게 사용될 수 있으므로, 관련 연구가 꾸준히 진행되고 있는 실정이다.

황칠나무(Dendropanax morbifera LEV.)는 두릅나무에 속하는 상록 활엽교목으로 우리나라의 제주도와 완도, 보길도, 해남 등 남ㆍ서해안 일대에 자생하고 있는 우리나라 특산 수종이다. 황칠나무에 함유된 정향성분은 소량의 터펜(Terpene)류와 다량의 세스퀴터펜(Sesquiterpene)류가 포함되어 있는데, 채취시기나 장소에 따라서 차이가 있지만 germacrene-d, β-selinene,α-amorphene, α-selinene, δ-cadinene, γ-cadinene, T-muurolol, β-elemene, bicyclo[4,4,0]dec-1-en-2-isopropyl-5-methyl-9-methylene, β-cadinene, germacrene-B, α-copaene, α-humulene, α-cadinene과 소량의 linalool L, α-terpinene, α-cubebene, α-ylangene,(+)-calarene, 3,7-guaiadine, (-)-isoledene, β-cubebene, limonene, aromadendrene, cadina-1,4-diene 등이 함유되어 있다(Jeollanam do, 1996). 한편, 황칠나무는 술 해독, 안질 및 황달치료, 화상치료, 나병에 효과가 있으며 인체에 무해하다는 기록이 전해지고 있고(이시진, 본초강목, 중국문광도서, 1590), 진정작용과 강장작용을 나타낸다고 알려져 왔다(고유농수산품목 세계화 대상품목의 연구조사(황칠편), 전라남도, 1996). 또한, 잎 추출물 분획은 항암작용과 α-토코페롤보다 다소 약한 항산화작용이 있음이 밝혀져 있다고 알려져 있으나(특허 공개 제 2000-0004499호, 박호근 등, 1998), 여성갱년기에 대한 효과에 대해서는 전혀 알려진 바 없다.

이에 본 발명자들은 인체에 안전한 천연물 유래 여성 갱년기 질환 치료 물질을 개발하기 위해 노력한 결과, 황칠나무 추출물이 세포내에서 유의적으로 ER 작용제 활성을 나타내고, EC₅₀ 값이 약 100 μg/ml로, 매우 강력한 ER 작용제(Full agonist) 활성을 나타냄을 확인함으로써, 에스트로겐과 유사한 식물 대사물질(plant metabolites)을 고함량으로 포함하고 있는 황칠나무 추출물을 갱년기 여성에서 에스트로겐 결핍으로 유래된 다양한 증상을 개선시킬 수 있는 호르몬대체요법으로 사용될 수 있음을 밝힘으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 목적은 황칠나무(Dendropanax morbifera LEV.) 추출물을 유효성분으로 함유하는 여성 갱년기 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물, 및 상기 질환 예방 및 개선용 건강식품을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 황칠나무(Dendropanax morbifera LEV.) 추출물을 유효성분으로 함유하는 여성 갱년기 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

아울러, 본 발명은 황칠나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 여성 갱년기 질환 예방 및 개선용 건강식품을 제공한다.

본 발명의 황칠나무(Dendropanax morbifera LEV.) 추출물은 세포내에서 유의적으로 ER 작용제 활성을 나타내고, EC₅₀ 값이 약 100 μg/ml로, 매우 강력한 ER 작용제(Full agonist) 활성을 내므로, 에스트로겐과 유사한 식물 대사물질(plant metabolites)을 고함량으로 포함하고 있는 황칠나무 추출물은 갱년기 여성에서 에스트로겐 결핍으로 유래된 다양한 증상을 개선시킬 수 있는 호르몬대체요법으로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 ER-ERE 루시페라제 활성평가(luciferase assay) 개요를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 황칠나무(Dendropanax morbifera LEV.) 추출물을 유효성분으로 함유하는 여성 갱년기 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 유효성분인 황칠나무 추출물은 하기의 단계들을 포함하는 방법에 의해 제조되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다:

1) 황칠나무 잎, 줄기, 뿌리 및 수액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 추출용매를 가하여 추출하는 단계;

2) 단계 1)의 추출물을 여과하는 단계;

3) 단계 2)의 여과물을 감압 농축하는 단계; 및

4) 단계 3)의 농축물을 건조하는 단계.

본 발명의 제조방법에 있어서, 단계 1)의 황칠나무는 재배한 것 또는 시판되는 것을 제한 없이 사용할 수 있다.

본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 단계 1)의 추출용매는 물, 알코올 또는 이의 혼합물을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 알코올로는 C₁ 내지 C₂의 저급 알코올 이용하는 것이 바람직하며, 저급 알코올로는 에탄올 또는 메탄올을 이용하는 것이 바람직하다. 추출방법으로는 진탕추출, Soxhelt 추출 또는 환류 추출을 이용하는 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다. 상기 추출용매를 세척하고 잘 건조된 황칠나무 잎, 줄기, 뿌리 또는 채취한 수액 분량의 1 내지 15배 첨가하여 추출하는 것이 바람직하며, 2 내지 10배 첨가하여 추출하는 것이 더욱 바람직하다. 추출 온도는 20℃ 내지 110℃인 것이 바람직하며, 30℃ 내지 105℃인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정하지 않는다. 또한, 추출시간은 1 내지 72시간이 바람직하며, 2 내지 48시간이 더욱 바람직하고, 2 내지 5시간이 가장 바람직하나, 이에 한정하지 않는다. 아울러 추출 횟수는 1 내지 5회인 것이 바람직하며, 3 내지 4회 반복 추출하는 것이 더욱 바람직하고, 3회인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 제조방법에 있어서, 단계 3)의 감압농축은 진공 감압 농축기 또는 진공회전증발기를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조 또는 동결건조하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

황칠나무에서 얻어진 것이 수액인 경우에는 물 또는 저가 알콜로 추출하여 사용하는 것이 바람직하나, 수액에 분말화 부형제와 혼합하여 사용할 수도 있다.

상기 여성 갱년기 질환이란, 난소의 노화로 인하여 에스트로겐의 분비가 감소됨에 따라 폐경을 전후로 걸쳐 여성에게 나타나는 증상 및 질환을 총칭하는 것으로, 안면홍조, 발한, 피부건조, 질건조증, 질위축, 하부 요도 위축, 질염, 방광염, 배뇨통, 급뇨, 집중장애, 단기 기억장애, 불안, 신경과민, 기억력 감퇴, 근육통, 관절통 또는 골다공증인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 조성물은 에스트로겐 수용체(estrogen receptor) 작용제(agonist)활성을 나타내어, 여성 갱년기 질환 치료 효과를 갖는다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 황칠나무 추출물을 제조한 후, 황칠나무 추출물의 ER 작용(agonist) 또는 길항(antagonist) 활성을 확인하기 위하여, ERE-Luciferase를 포함하는 플라스미드(plasmid)를 세포내에 형질전환(transfection) 시킨 후, 황칠나무 추출물을 처리한 후, 루시페린(luciferin)을 효소 분해하여 생성된 산물의 발광정도를 luminometer를 이용하여 정량적으로 측정한 결과, 본 발명의 황칠나무 추출물 분말 농도 100 μg/ml에서 E2 대비 50% 이상의 효능이 나타났으며, 200 μg/ml 농도에서 E2 대비 80%의 효능을 나타냄을 확인하였다. 따라서, 황칠나무 추출물은 EC₅₀ 값이 약 100 μg/ml으로, 매우 강력한 ER 작용제(Full agonist)임을 확인하였다(표 1 참조).

또한, 본 발명자들은 황칠나무 추출물의 길항 활성을 확인한 결과, 황칠나무 추출물은 세가지 시험농도(50, 100, 200 μg/ml)에서 E2가 가지고 있는 ER작용제의 활성에 영향을 미치지 않음을 확인하였다(표 2 참조).

따라서, 본 발명의 황칠나무 추출물은 세포내에서 유의적으로 ER 작용제 활성을 나타내고, EC₅₀ 값이 약 100 μg/ml로, 매우 강력한 ER 작용제(Full agonist) 활성을 내므로, 에스트로겐과 유사한 식물 대사물질(plant metabolites)을 고함량으로 포함하고 있는 황칠나무 추출물은 갱년기 여성에서 에스트로겐 결핍으로 유래된 다양한 증상을 예방 또는 치료할 수 있는 약학적 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구 투여(예를 들어, 도포 또는 정맥 내, 피하, 복강 내 주사)할 수 있으나 경구 투여가 바람직하다. 비경구 투여를 위한 제제로는 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 멸균된 수용액, 액제, 비수성용제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 좌제, 에어로졸 등의 외용제 및 멸균 주사제제의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 바람직하게는 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플 라스마제의 피부 외용 약학적 조성물을 제조하여 사용할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다. 국소 투여의 조성물은 임상적 처방에 따라 무수형 또는 수성형일 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 연질캅셀제, 환 등이 포함된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 에어로졸 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

상기 조성물은 투여를 위해서 황칠나무 추출물 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈, 말토 덱스트린, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형 등으로 제제화할 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적으로 허용가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1~90 중량부 포함되는 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 환자의 연령, 성별 및 비만의 정도에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 경구 투여제의 경우 일반적으로 성인에게 1일에 체중 1㎏당 본 발명의 조성물을 1일 0.0001 내지 100 ㎎/㎏으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 ㎎/㎏으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 황칠나무 추출물에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

본 발명의 황칠나무 추출물은 세포내에서 유의적으로 ER 작용제 활성을 나타내고, EC₅₀ 값이 약 100 μg/ml로, 매우 강력한 ER 작용제 활성을 내므로, 에스트로겐과 유사한 식물 대사물질을 고함량으로 포함하고 있는 황칠나무 추출물은 갱년기 여성에서 에스트로겐 결핍으로 유래된 다양한 증상을 예방 또는 개선할 수 있는 건강식품의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 황칠나무 추출물은 식품학적으로 허용된 담체와 혼합하여 식품 조성물로서 제공될 수 있다.

본 발명의 황칠나무 추출물을 식품 또는 음료 첨가물로 사용할 경우, 상기 황칠나무 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 상기 황칠나무 추출물의 혼합양은 그의 사용목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우, 상기 황칠나무 추출물은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에, 장기간 복용이 가능하다. 상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 초콜릿류, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있다. 음료수로 제형화할 경우에 황칠나무 추출물 이외에 첨가되는 액체 성분으로는 이제 한정되지는 않으나, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드(예, 포도당, 과당 등), 디사카라이드(예, 말토오스, 수크로오스 등) 및 폴리사카라이드(예, 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당), 및 자일리톨, 소르비톨, 에리스리톨 등의 당 알코올이다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖ 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제[타우마린, 스테비아 추출물(예, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)] 및 합성 향미제(예, 사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.

다른 양태로서, 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 증진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 또한 본 발명의 식품 조성물은 과일 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 단독으로 또는 조합으로 사용될 수 있으며, 이러한 첨가제의 비율은 조성물 전체 중량당 0.001 내지 50 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하 본 발명을 실시예, 실험예 및 제조예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예, 실험예 및 제조예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예, 실험예 및 제조예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 황칠나무( Dendropanax morbifera LEV .) 추출물 의 제조

<1-1> 황칠나무 열수 추출물의 제조

황칠나무의 잎, 줄기, 뿌리부분을 채취하여 세척하고 잘 건조하고 조말 크기로 분쇄한 다음 125 g 분량을 정확히 측량하여 추출탱크에 넣고 정제수 875 g을 첨가하여 100℃에서 12시간 추출하였다. 추출한 추출액을 100 um 필터를 거쳐 여가한 후 농축탱크에 이송하여 600 mmhg의 감압하에 60℃에서 25% 고형분이 될 때까지 농축하였다. 농축액을 동결건조하여 추출물을 분말화하였다.

<1-2> 황칠나무 열수 추출물 및 말토덱스트린 혼합물의 제조

황칠나무의 잎, 줄기, 뿌리부분을 채취하여 세척하고 잘 건조하고 조말 크기로 분쇄한 다음 125 g 분량을 정확히 측량하여 추출탱크에 넣고 정제수 875 g을 첨가하여 100℃에서 12시간 추출하였다. 추출한 추출액을 100 um 필터를 거쳐 여가한 후 농축탱크에 이송하여 600 mmhg의 감압하에 60℃에서 25% 고형분이 될 때까지 농축하였다. 농축액 50%와 말토덱스트린 50%를 넣어 건조된 황칠 추출물을 제조하였다.

<1-3> 황칠나무 30% 에탄올 추출물의 제조

황칠나무의 잎, 줄기, 뿌리부분을 채취하여 세척하고 잘 건조하고 조말 크기로 분쇄한 다음 125 g 분량을 정확히 측량하여 추출탱크에 넣고 30% 에탄올 수용액 600 g을 첨가하여 50℃에서 6시간 추출하였다. 위의 추출과정을 2회 더 반복하였다. 추출한 추출액을 100 um 필터를 거쳐 여가한 후 농축탱크에 이송하여 600 mmhg의 감압하에 60℃에서 25% 고형분이 될 때까지 농축하였다. 농축액을 동결건조하여 추출물을 분말화하였다.

<1-4> 황칠나무 수액 열수 추출물의 제조

황칠나무의 수액을 채취하여 100 g 분량을 정확히 측량하여 추출탱크에 넣고 정제수 100 g을 첨가하여 20℃에서 4시간 추출하였다. 추출한 추출액을 100 um 필터를 거쳐 여가한 후 농축탱크에 이송하여 600 mmhg의 감압하에 60℃에서 25% 고형분이 될 때까지 농축하였다. 농축액 50%와 말토덱스트린 50%를 넣어 건조된 황칠 추출물을 제조하였다.

<1-5> 황칠나무 수액 열수 추출물 및 말토덱스트린 혼합물의 제조

황칠나무의 수액을 채취하여 100 g 분량을 정확히 측량하고, 추출액 50%와 말토덱스트린 50%를 넣어 건조된 황칠 추출물을 제조하였다.

하기 실험을 위하여, 상기 제조한 <1-1>에서 제조한 황칠나무 추출물은 DMSO를 용매로 하여 100 mg/㎕ 저장(stock) 용액을 제조하였다. DMSO를 가한 후 교반(vortexing)을 통해서 시료를 용해시켰으며, 13,000 rpm, 10분간 원심분리하여 녹지 않을 수 있는 미량의 분말은 제거하였다.

< 실시예 2> 세포배양

American Type Culture Collection (ATCC)에서 구입한 에스트로겐 수용체-양성 유방암 세포주 MCF-7는 RPMI 1680 배지(media)에 비-필수 아미노산(non-essential amino acids), 항생제/항진균제(antibiotics/antimycotics), 피루브산나트륨(sodium pyruvate) 및 10% 소태아혈청(fetal bovine serum)을 첨가한 용액을 기본배지로 하여 세포를 배양하였다. 평균 일주일에 1회 계대배양(subculture)하였다. 세포 접종(Cell seeding)을 하기 48~60 시간(2-3일) 전 혈청을 덱스트론-차콜(dextran-charcoal)로 3회 처리한 “stripped serum”을 함유하고, 페놀-레드(phenol-red)가 없는 RPMI 1680으로 제조된 배지를 이용하여 세포를 배양하였다. 이 배지는 루시페라제 활성평가(luciferase assay)가 끝나는 시점까지 계속 사용하였다. 상기 배지를 사용하는 이유는 페놀-레드 자체의 에스트로겐 특성(estrogenic property)과 혈청에 다량 포함되어 있는 호르몬(hormone) 및 성장인자(growth factor) 등에 의한 에스트로겐 수용체(estrogen receptor) 상호작용에 의한 결과를 배제하기 위함이다.

< 실험예 1> 황칠나무 추출물의 ER 작용( agonist ) 또는 길항(antagonist) 활성 확인

황칠나무 추출물의 ER 작용 또는 길항 활성을 확인하기 위하여, ERE-Luciferase를 포함하는 플라스미드(plasmid)를 세포내에 형질전환(transfection)시킨 후, 황칠나무 추출물을 처리한 후, 루시페린(luciferin)을 효소 분해하여 생성된 산물의 발광정도를 luminometer를 이용하여 정량적으로 측정함으로써, 전사활성 정도를 측정하였다(도 1).

구체적으로, 상기 <실시예 2>에서 배양한 유방암 세포는 24-웰 플레이트(well plate)에 형질전환 하루 전에 접종(10⁵ cells/well)한 다음, ERE-luciferase plasmid DNA(0.25 ㎍/well)를 Lipofectamine 2000 transfection reagent(Invitrogen)을 이용하여 상기 유방암 세포에 형질전환하였다.

그런 다음, 양성 대조군으로 E2(17β-estradiol)(ER agonist, 1 nM)(Sigma) 및 ICI 182,780(Tocris) (Pure ER antagonist, 1 μM)을 사용하였다. 또한, 상기 <실시예 1>에서 제조한 본 발명의 황칠나무 추출물은 50 μg/ml, 100 μg/ml 및 200 μg/ml의 세가지 농도에서 실험을 진행하였다. 이러한 농도조건은 1 ~ 200 μg/ml에서 수행한 예비실험을 통해서 루시페라제 활성이 적절하게 나타나는 농도점으로서 50, 100, 200 μg/ml을 지정하게 되었다. 최종 DMSO의 양은 배지 부피의 0.2%가 넘지 않으며, 이러한 DMSO 양은 최종실험결과에 전혀 영향을 미치지 않음을, 독립적인 실험을 통해 확인하였다. 아울러, ER 작용 활성검토를 위해서는 본 발명의 황칠나무 추출물을 단독 처리하는 반면, ER 길항 활성을 확인하기 위해서는 E2 1nM과 본 발명의 황칠나무 추출물을 동시 투여하였다. 한편, 황칠나무 추출물, 및 대조군을 세포에 처리하고, 평균 18~24시간을 더 배양한 후 루시페라제 활성평가(luciferase assay)를 수행하였으며, 상기 루시페라제 활성평가는 배지를 제거한 후 세포를 cold PBS로 2회 세척한 후, 1X passive lysis buffer로 세포수용성물질(lysate)을 추출하였고, 50 μl의 lysate에 50 μl luciferase assay reagent (Promega, luciferase의 기질이 되는 luciferin과 효소반응에 적당한 완충액을 포함하는 용액)를 혼합한 후, 발생한 luminescence 세기를 SpectraMax M5e(Molecular Device)를 이용하여 측정하였다.

<1-1> 대조군 약물 처리에 의한 ER-ERE 루시페라제 활성평가법의 밸리데이션

Vehicle 대조군으로 사용된 용매 DMSO의 루시페라제 활성(unit 없음)은 57.8 (E2 1 nM값의 2.0%), E2 1 nM; 2859 (100%), E2+ICI (1 μM) 47.8 (E2 1 nM값의 1.7%)로서, 본 발명의 모든 대조군 값은 경험적인 실험값 범위 내에 속하며, 각 약물의 루시페라제 활성은 약물의 특성에 적합하게 도출되었음을 확인하였다.

<1-2> 황칠나무 추출물의 ER 작용 활성 확인

E2 1 nM이 나타내는 루시페라제 활성도를 100%로 잡았을 때 황칠나무 추출물의 활성도를 %값으로 나타내었다.

그 결과, 하기 [표 1]에 나타낸 바와 같이, 황칠나무 추출물 분말 농도 100 μg/ml에서 E2 대비 50% 이상의 효능이 나타났으며, 200 μg/ml 농도에서 E2 대비 80%의 효능을 나타냄을 확인하였다. 따라서, 황칠나무 추출물은 EC₅₀ 값이 약 100 μg/ml으로, 매우 강력한 ER 작용제(Full agonist)임을 확인하였다(표 1).

시료	E2 최대 활성에 대한 %(단독처리)
황칠나무 추출물 50 μg/ml	33%
황칠나무 추출물은 100 μg/ml	56%
황칠나무 추출물은 200 μg/ml	80%

<1-3> 황칠나무 추출물의 ER 길항 활성 확인

황칠나무 추출물을 E2 1 nM과 동시에 처리한 후 얻어진 루시페라제 활성도를 기록하였으며, 상기 실험예 <1-1> 동일하게 E2 1 nM 100%로 잡았을 때 실험군의 활성도를 %값으로 나타내었다.

그 결과, 하기 [표 2]에 나타낸 바와 같이, 황칠나무 추출물은 세가지 시험농도(50, 100, 200 μg/ml)에서 E2가 가지고 있는 ER작용제의 활성에 영향을 미치지 않음을 확인하였다(표 2).

따라서, 황칠나무 추출물은 ER 길항제로서의 활성이 없음을 확인하였다.

시료	E2 최대 활성에 대한 %(단독처리)
DMSO	3%
E2	100%
E2 + ICI	2%
E2 및 황칠나무 추출물 100 μg/ml	116%

< 제조예 1> 약학적 제제의 제조

<1-1> 산제의 제조

본 발명의 황칠나무 추출물 2 g

유당 1 g

상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

<1-2> 정제의 제조

본 발명의 황칠나무 추출물 100 ㎎

미결정셀룰로오스 100 ㎎

유당 100 ㎎

전분글리콘산 나트륨 18 mg

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

<1-3> 캡슐제의 제조

본 발명의 황칠나무 추출물 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

<1-4> 환의 제조

본 발명의 황칠나무 추출물 1 g

유당 1.5 g

글리세린 1 g

자일리톨 0.5 g

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 1 환 당 4 g이 되도록 제조하였다.

<1-5> 과립의 제조

본 발명의 황칠나무 추출물 150 ㎎

대두 추출물 50 ㎎

포도당 200 ㎎

전분 600 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 30% 에탄올 100 ㎎을 첨가하여 60℃에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.

< 제조예 2> 식품의 제조

<2-1> 과자 및 분식의 제조

본 발명의 황칠나무 추출물 0.5~5.0 중량부를 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.

<2-2> 유제품의 제조

본 발명의 황칠나무 추출물 5~10 중량부를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

<2-3> 선식의 제조

현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다. 검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.

본 발명의 황칠나무 추출물을 진공 농축기에서 감압 농축하고, 분무, 열풍건조기로 건조하여 얻은 건조물을 분쇄기로 입도 60 메쉬로 분쇄하여 건조분말을 얻었다. 상기에서 제조한 곡물류, 종실류 및 SBE의 건조분말을 다음의 비율로 배합하여 제조하였다.

곡물류(현미 30 중량부, 율무 15 중량부, 보리 20 중량부),

종실류(들깨 7 중량부, 검정콩 8 중량부, 검정깨 7 중량부),

본 발명의 황칠나무 추출물 건조분말(3 중량부),

영지(0.5 중량부), 및 지황(0.5 중량부)

< 제조예 3> 음료의 제조

본 발명의 황칠나무 추출물 1000 ㎎

구연산 1000 ㎎

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수를 가하여 전체 900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 ℓ용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강식품 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호 음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용 용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims

에스트로겐 수용체(estrogen receptor) 작용제(agonist)로서 황칠나무(Dendropanax morbifera LEV.) 추출물을 유효성분으로 함유하고, 에스트로겐 활성을 갖는, 여성 갱년기 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 황칠나무 추출물은 물, C₁내지 C₂의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출한 것을 특징으로 하는 여성 갱년기 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 2항에 있어서, 상기 저급 알코올은 에탄올 또는 메탄올인 것을 특징으로 하는 여성 갱년기 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 여성 갱년기 질환은 안면홍조, 발한, 피부건조, 질건조증, 질위축, 하부 요도 위축, 질염, 방광염, 배뇨통, 급뇨, 집중장애, 단기 기억장애, 불안, 신경과민, 기억력 감퇴, 근육통, 관절통 및 골다공증으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 여성 갱년기 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
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에스트로겐 수용체 작용제로서 황칠나무 추출물을 유효성분으로 함유하고, 에스트로겐 활성을 갖는, 여성 갱년기 질환 예방 및 개선용 건강식품.
제 6항에 있어서, 상기 여성 갱년기 질환은 안면홍조, 발한, 피부건조, 질건조증, 질위축, 하부 요도 위축, 질염, 방광염, 배뇨통, 급뇨, 집중장애, 단기 기억장애, 불안, 신경과민, 기억력 감퇴, 근육통, 관절통 및 골다공증으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 여성 갱년기 질환 예방 및 개선용 건강식품.
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