KR101724370B1 - Trsv 재조합 벡터 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 TRSV(tobacco ringspot virus) 재조합 벡터 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에서 제조된 TRSV를 이용한 재조합 벡터는 담배, 애기장대, 박과, 콩과 등 폭넓은 기주 식물에서 원하는 유전자를 효율적으로 침묵(silencing)시켜 유전자의 고유 기능 연구를 가능하게 할 뿐만 아니라 경제적으로 가치 있는 유용 유전자들의 탐색에 매우 유용할 것으로 여겨진다. 또한, 유용 유전자들을 이용한 식물의 새로운 품종 육성을 기대할 수 있으며 특허를 통한 원천기술 확보에도 유용할 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 TRSV 재조합 벡터 및 이의 용도에 관한 것이다.
식물 바이러스-기반 벡터는 식물체에서 타깃 외래 단백질의 효과적인 발현을 하기 위한 유용한 도구이다. 식물 발현 시스템은 재조합 단백질 생산의 다른 방법들과 비교하여 상당한 이점을 가지고 있는데, 그 이유는 세포 배양 방법들과 비교하여 식물체는 재배를 하는 데 있어 훨씬 저렴하고 쉽기 때문이다. 이 시스템은 식물체에서 이질의 유전자의 빠르고 일시적인 발현을 제공한다. 이들 바이러스-기반 벡터들은 의약 유전자, 농업경영 가치가 있는 유전자를 발현하는데 이용되며, 또한 미지의 유전자의 기능을 결정하기 위하여 유전적으로 도미넌트하거나 또는 유전자-침묵(gene silencing) 형질을 유발하는 데 이용될 수 있다. 또한, 이 시스템은 암 백신치료제로 이용될 수 있는 백신 성분들을 생산하거나 또는 다양한 치료제로 적용될 수 있는 단백질들을 생산하는데 이용될 수 있다. 바이러스 발현벡터에 의한 식물체에서의 서열 발현은, 바이러스-유도 유전자-침묵(VIGS) 효과 또는 단백질 발현을 통하여 식물체에서 특정 대사경로의 재프로그래밍을 초래한다. 이에 유전자 침묵 현상 또는/및 안정적인 외래 단백질 발현을 실현하기 위한 바이러스 벡터 개발이 이루어지고 있다. 아직까지도 다양한 작물에 작용 가능한 바이러스 벡터 개발이 미흡한 실정이다.
담배 둥근무늬 바이러스(Tobacco ringspot virus; TRSV)는 분류학적으로 네포바이러스(Nepovirus) 속에 속하며, 바이러스 Group IV (+) 센스 단일가닥RNA(sense ssRNA) 바이러스로 분류된다. TRSV의 입자는 지름이 약 28 nm인 정방형이며, 핵산은 단일 가닥 RNA(single stranded RNA)로 약 7,500bp와 3,900bp의 2 종류가 있다. TRSV는 식물 병원성 바이러스로, 감염된 식물에서는 전체적으로 과실과 꼬투리의 변형과 기형이 일어나고, 뿌리가 썩는 현상이 병증으로 나타난다. 줄기에서는 잎마름병과 동고병이 발생하며, 감염된 식물은 전체적으로 왜소화 현상이 나타나는데, 이 때문에 작물의 양적, 질적 손실이 발생한다. TRSV는 꽃이 피는 시기, 과실이 열리는 시기 및 발아 직전 시기 등 식물의 생장기 전체에 감염될 수 있는 위험이 있다.
TRSV는 종자 감염이 될 수 있으며, 접목법, 기계적 접종 및 벡터에 의해 식물에서 식물로 전염이 가능하고, 다양한 선충들을 벡터로 감염된 사례가 보고되고 있다. 고추, 수박, 멜론, 오이, 색동호박, 글라디올러스, 콩, 토마토, 담배 및 블루베리를 주요 기주로 활동하며, 제라늄, 단양 앵두, 가지, 까마중(까마종이), 감자 및 포도에도 감염될 수 있다. 예를 들어 대두에서는 싹갯병(bud blight disease)을 야기시키고, 박의 경우에는 잎의 모틀(mottled leaves) 증상을 야기한다.
본 발명자들은 TRSV를 분리 동정하여 전장 염기서열을 NCBI genebank에 등록 하였으며, TRSV 유래 재조합 감염성 클론을 제조하여 다양한 기주 식물에서 이용할 수 있는 바이러스 기반 벡터로 유전자 침묵을 통한 유전자 기능 연구와 식물체 내 외래 단백질 발현이 동시에 가능한 식물 바이러스 벡터를 제조하고자 하였다.
한국등록특허 제0795367호에는 '병원균에 저항성을 갖는 고추의 전사 조절 유전자를 담배 래틀 바이러스 벡터에 삽입시켜 구축한 발현 벡터'가 개시되어 있으며, 한국등록특허 제1590404호에는 '신규한 오이과실모틀모자이크바이러스 유래 서브 게놈 프로모터와 발현벡터 제작 및 이의 이용'이 개시되어 있다. 그러나 본 발명에서와 같이 TRSV 재조합 벡터 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 전혀 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 유전자 침묵을 통한 유전자 기능 연구와 식물체 내 외래 단백질 발현이 동시에 가능한 식물 바이러스 벡터로서 TRSV(tobacco ringspot virus)를 이용하여 재조합 벡터를 구축하였고, 상기 발현 벡터는 담배, 애기장대, 박과, 콩과 등 다양한 식물체에서 유전자 침묵현상 및 외래 단백질 발현이 효율적으로 나타나는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 TRSV(tobacco ringspot virus) RNA2의 P2A(protein 2A) 코딩 유전자; MP(movement protein) 코딩 유전자; MP(movement protein) 코딩 유전자 및 CP(coat protein) 코딩 유전자 사이의 절단부위(cleavage site); 상기 절단부위의 하부에 위치하는 발현시키고자 하는 외래 유전자를 삽입할 수 있는 MCS1(multiple cloning site1); 상기 MCS1의 하부에 위치하는 자가 절단성 펩티드를 코딩하는 서열; CP(coat protein) 코딩 유전자; CP의 하부에 위치하는 침묵시키고자 하는 목적 유전자를 삽입할 수 있는 MCS2(multiple cloning site2);을 포함하는 카세트를 포함하는 TRSV RNA2 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 TRSV RNA2 재조합 벡터에 발현시키고자 하는 외래 유전자를 MCS1(multiple cloning site1)에 삽입하여 TRSV RNA2 재조합 벡터를 제조하는 단계를 포함하는 식물체 내에서의 외래 유전자를 과발현시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 TRSV RNA2 재조합 벡터에 침묵시키고자 하는 목적 유전자를 MCS2(multiple cloning site2)에 삽입하여 TRSV RNA2 재조합 벡터를 제조하는 단계를 포함하는 식물체 내에서의 목적 유전자를 침묵시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 TRSV RNA2 재조합 벡터에 발현시키고자 하는 외래 유전자를 MCS1(multiple cloning site1)에 삽입하고, 침묵시키고자 하는 목적 유전자를 MCS2(multiple cloning site2)에 삽입하여 TRSV RNA2 재조합 벡터를 제조하는 단계를 포함하는 식물체 내에서의 외래 유전자를 과발현시키고 목적 유전자를 침묵시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 TRSV RNA2 재조합 벡터에 발현시키고자 하는 외래 유전자를 MCS1(multiple cloning site1)에 삽입하여 TRSV RNA2 재조합 벡터를 제조하는 단계를 포함하는 외래 유전자가 과발현된 식물체의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 외래 유전자가 과발현된 식물체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 TRSV RNA2 재조합 벡터에 침묵시키고자 하는 목적 유전자를 MCS2(multiple cloning site2)에 삽입하여 TRSV RNA2 재조합 벡터를 제조하는 단계를 포함하는 목적 유전자가 침묵된 식물체의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 목적 유전자가 침묵된 식물체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 TRSV RNA2 재조합 벡터에 발현시키고자 하는 외래 유전자를 MCS1(multiple cloning site1)에 삽입하고, 침묵시키고자 하는 목적 유전자를 MCS2(multiple cloning site2)에 삽입하여 TRSV RNA2 재조합 벡터를 제조하는 단계를 포함하는 외래 유전자가 과발현되고, 목적 유전자가 침묵된 식물체의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 외래 유전자가 발현되고 목적 유전자가 침묵된 식물체를 제공한다.
본 발명에 따른 TRSV 재조합 벡터는 식물에서 유전자 침묵 또는/및 유전자 발현을 효과적으로 유도할 수 있다. 이는 유전자 침묵현상과 외래단백질의 체내 발현 연구에 적용 가능한데 특히 담배, 애기장대, 박과, 콩과 등 폭넓은 기주 식물에서 효과적으로 사용할 수 있다. 본 발명의 재조합 벡터를 이용함으로써, 원하는 유전자를 효율적으로 침묵(silencing)시켜 유전자의 고유 기능 연구를 가능하게 할 뿐만 아니라 경제적으로 가치 있는 유용 유전자들의 탐색에 매우 유용할 것으로 여겨진다. 또한, 유용 유전자들을 이용한 식물의 새로운 품종 육성을 기대할 수 있으며 특허를 통한 원천기술 확보에도 유용할 것으로 기대된다.
도 1은 TRSV RNA1 및 TRSV RNA2를 이용하여 제작한 TRSV viral 벡터들의 모식도를 나타낸다. A. 각각의 TRSV RNA1 및 TRSV RNA2를 포함하는 cDNA 감염성 클론(pTRSR1 및 pTRSR2); B. TRSV-기반 GFP 발현 벡터를 위한 pT2C2AGFP 벡터; C. TRSV-기반 발현 벡터를 위한 pT2S 벡터; D. TRSV-기반 유전자 발현 또는 침묵을 위한 pT2C2AS 벡터.
도 2는 TRSV-기반 발현 벡터를 이용한 GFP 발현을 담배에서 확인한 결과를 나타낸다. A. 접종된 담배 잎(Mock: 완충액-접종 담배 잎, TC2A: TC2A-접종 담배 잎, TC2AGFP: TC2AGFP-접종 담배 잎)을 자연광(상) 및 UV(하)에서 찍은 사진이다. B. 항GFP 항체를 통해 접종된 담배잎으로부터 추출한 총 단백질로부터 웨스턴 블롯으로 GFP 발현을 확인한 결과이다. 레인 1, mock; 레인 2, TC2A-접종; 레인3~6, TC2AGFP-접종 담배의 8th 내지 10th 잎(레인3-5) 또는 곁눈(axillary bud)(레인6).
도 3은 담배에서 TRSV 발현 벡터를 이용한 NbPDS 유전자 침묵 현상을 확인한 결과를 나타낸다. A는 TSNbPDS 접종 후 23일 경과된 담배 사진 및 semi-q RT-PCR를 이용한 NbPDS 전사체 발현을 확인한 결과를 나타낸다. B는 TC2ASNbPDS 접종 후 30일 경과된 담배 사진 및 semi-q RT-PCR를 이용한 NbPDS 전사체 발현을 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 담배에서 단일 벡터를 이용한 GFP 발현 및 NbPDS 유전자 침묵 현상을 확인한 결과를 나타낸다. TC2ASGFPNbPDS215 또는 TC2ASGFPNbPDS215a 벡터 접종 후 자연광 또는 UV에서 8일 및 30일 경과된 담배를 찍은 사진이다.
도 5는 TRSV 발현 벡터를 애기장대에서 즙액 접종 후 AtPDS 유전자 침묵 현상을 확인한 결과를 나타낸다. A는 TSAtPDS250(좌) 및 TSAtPDS250a(우) 접종 14일 경과 후 애기장대 사진이다. B. TSAtPDS250 (right) 및 TS 접종 후 애기장대 줄기, 곁눈 및 꽃받침(sepal) 사진. C. TS(좌), TSAtPDS250(중) 및 TSAtPDS250a(우) 접종 37일 경과 후 애기장대 사진. D. TS(좌) 및 TSAtPDS250a(우) 접종 후 애기장대 실리크(silique) 사진. E. semi-q RT-PCR를 이용한 AtPDS 전사체 발현을 확인한 결과.
도 6은 다양한 박과 식물에서의 TSCuPDS 벡터 접종 후 CuPDS 유전자 침묵 현상을 확인한 결과를 나타낸다. A는 멜론(상)(21dpi), 참외(중)(23dpi) 및 오이(하)(34dpi)의 TSCuPDS 벡터 접종 후 사진이다. B. semi-q RT-PCR를 이용한 CuPDS 전사체 발현을 확인한 결과.
도 7은 각 담배(A), 멜론(B의 상) 및 참외(B의 하)의 꽃과 오이 열매(C)에서의 PDS 유전자의 바이러스 유도 유전자 침묵 현상을 확인한 결과를 나타낸다.
도 8은 콩류 식물의 GmPDS 유전자의 바이러스 유도 유전자 침묵 현상을 확인한 결과를 나타낸다. A는 대두 '윌리엄스 82(williams 82)' 품종(상)과 야생형(하)의 TS(좌), TGmPDS209(중) 및 TGmPDS209a(우) 벡터의 즙액 접종 후 사진이다. B. semi-q RT-PCR를 이용한 GmPDS 전사체 발현을 확인한 결과.
도 2는 TRSV-기반 발현 벡터를 이용한 GFP 발현을 담배에서 확인한 결과를 나타낸다. A. 접종된 담배 잎(Mock: 완충액-접종 담배 잎, TC2A: TC2A-접종 담배 잎, TC2AGFP: TC2AGFP-접종 담배 잎)을 자연광(상) 및 UV(하)에서 찍은 사진이다. B. 항GFP 항체를 통해 접종된 담배잎으로부터 추출한 총 단백질로부터 웨스턴 블롯으로 GFP 발현을 확인한 결과이다. 레인 1, mock; 레인 2, TC2A-접종; 레인3~6, TC2AGFP-접종 담배의 8th 내지 10th 잎(레인3-5) 또는 곁눈(axillary bud)(레인6).
도 3은 담배에서 TRSV 발현 벡터를 이용한 NbPDS 유전자 침묵 현상을 확인한 결과를 나타낸다. A는 TSNbPDS 접종 후 23일 경과된 담배 사진 및 semi-q RT-PCR를 이용한 NbPDS 전사체 발현을 확인한 결과를 나타낸다. B는 TC2ASNbPDS 접종 후 30일 경과된 담배 사진 및 semi-q RT-PCR를 이용한 NbPDS 전사체 발현을 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 담배에서 단일 벡터를 이용한 GFP 발현 및 NbPDS 유전자 침묵 현상을 확인한 결과를 나타낸다. TC2ASGFPNbPDS215 또는 TC2ASGFPNbPDS215a 벡터 접종 후 자연광 또는 UV에서 8일 및 30일 경과된 담배를 찍은 사진이다.
도 5는 TRSV 발현 벡터를 애기장대에서 즙액 접종 후 AtPDS 유전자 침묵 현상을 확인한 결과를 나타낸다. A는 TSAtPDS250(좌) 및 TSAtPDS250a(우) 접종 14일 경과 후 애기장대 사진이다. B. TSAtPDS250 (right) 및 TS 접종 후 애기장대 줄기, 곁눈 및 꽃받침(sepal) 사진. C. TS(좌), TSAtPDS250(중) 및 TSAtPDS250a(우) 접종 37일 경과 후 애기장대 사진. D. TS(좌) 및 TSAtPDS250a(우) 접종 후 애기장대 실리크(silique) 사진. E. semi-q RT-PCR를 이용한 AtPDS 전사체 발현을 확인한 결과.
도 6은 다양한 박과 식물에서의 TSCuPDS 벡터 접종 후 CuPDS 유전자 침묵 현상을 확인한 결과를 나타낸다. A는 멜론(상)(21dpi), 참외(중)(23dpi) 및 오이(하)(34dpi)의 TSCuPDS 벡터 접종 후 사진이다. B. semi-q RT-PCR를 이용한 CuPDS 전사체 발현을 확인한 결과.
도 7은 각 담배(A), 멜론(B의 상) 및 참외(B의 하)의 꽃과 오이 열매(C)에서의 PDS 유전자의 바이러스 유도 유전자 침묵 현상을 확인한 결과를 나타낸다.
도 8은 콩류 식물의 GmPDS 유전자의 바이러스 유도 유전자 침묵 현상을 확인한 결과를 나타낸다. A는 대두 '윌리엄스 82(williams 82)' 품종(상)과 야생형(하)의 TS(좌), TGmPDS209(중) 및 TGmPDS209a(우) 벡터의 즙액 접종 후 사진이다. B. semi-q RT-PCR를 이용한 GmPDS 전사체 발현을 확인한 결과.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 TRSV(tobacco ringspot virus) RNA2의 P2A(protein 2A) 코딩 유전자; MP(movement protein) 코딩 유전자; MP(movement protein) 코딩 유전자 및 CP(coat protein) 코딩 유전자 사이의 절단부위(cleavage site); 상기 절단부위의 하부에 위치하는 발현시키고자 하는 외래 유전자를 삽입할 수 있는 MCS1(multiple cloning site1); 상기 MCS1의 하부에 위치하는 자가 절단성 펩티드를 코딩하는 서열; CP(coat protein) 코딩 유전자; CP의 하부에 위치하는 침묵시키고자 하는 목적 유전자를 삽입할 수 있는 MCS2(multiple cloning site2);를 포함하는 카세트를 포함하는 TRSV RNA2 재조합 벡터를 제공한다.
용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 코딩된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 단편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다.
본 발명에서 사용되는 카세트는 TRSV(tobacco ringspot virus) RNA2의 P2A(protein 2A) 코딩 유전자; MP(movement protein) 코딩 유전자; MP(movement protein) 코딩 유전자 및 CP(coat protein) 코딩 유전자 사이의 절단부위(cleavage site); 상기 절단부위의 하부에 위치하는 발현시키고자 하는 외래 유전자를 삽입할 수 있는 MCS1(multiple cloning site1); 상기 MCS1의 하부에 위치하는 자가 절단성 펩티드를 코딩하는 서열; CP(coat protein) 코딩 유전자; CP의 하부에 위치하는 침묵시키고자 하는 목적 유전자를 삽입할 수 있는 MCS2(multiple cloning site2);를 포함한다.
상기 카세트는 바람직하게는 서열번호 1의 염기 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 염기 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열 (추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제 (즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 카세트는 도 1의 D에 기재된 카세트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 카세트가 포함된 TRSV RNA2 재조합 벡터를 pT2C2AS라고 칭하기도 한다.
바람직한 자가 절단 펩티드(소위 "cis-작용 가수분해성 요소", CHYSEL이라 칭함; 참조: deFelipe (2002) Curr. Gene Ther. 2, 355-378)는 포티바이러스 및 카르디오바이러스 2A 펩티드로부터 유도된다. 더욱 바람직한 자가 절단 펩티드는 FMDV(수족구병 바이러스), 말 비염 A 바이러스, 토세아 아시그나(Thosea asigna) 바이러스 및 돼지 테초바이러스(teschovirus)로부터 유도된 2A 펩티드로부터 선택된다. 더 더욱 바람직한 자가 절단 펩티드는 FMDA로부터 유도된 2A 펩티드일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
본 발명의 "MCS(multiple cloning site)"는 다양한 제한효소에 의해 인식되고 절단되는 부위인 제한효소 인식부위를 갖는 DNA 단편을 의미하고, 상기 MCS는 특정 제한효소(restriction enzyme)에 의해 인지되어 절단되므로 절단된 MCS의 부위에 목적 유전자의 삽입을 가능하게 한다. 상기 MCS는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 공지된 MCS라면 제한 없이 사용할 수 있으며, 본 발명의 카세트의 MCS에 목적 유전자를 삽입하고자 할 때, 식물 바이러스 유전자에 존재하지 않는 제한효소 자리를 이용할 수 있다.
본 발명의 상기 MCS1는 발현시키고자 하는 외래 유전자를 삽입할 수 있는 부위로서, MP(movement protein) 코딩 유전자 및 CP(coat protein) 코딩 유전자 사이의 절단부위(cleavage site) 하부에 위치한다. 바람직하게는 상기 MCS1은 BamHI, MluI 및 SpeI 제한효소 인식부위를 포함할 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
본 발명의 벡터에 도입될 수 있는 외래 유전자에는 어떠한 제한도 없다. 상기 외래 유전자는 바람직하게는 유용 단백질을 코딩하는 유전자일 수 있다. 유용 단백질은 현재, 식물 생명공학을 이용하여 상업적으로 생산이 이루어지고 있는 의약 및 산업용 등의 모든 단백질로 고부가가치의 유용 단백질로, 예컨대 효소, 호르몬, 항체, 사이토카인 등의 의학적 활용성이 있거나, 사람을 포함한 동물의 건강을 증진시킬 수 있는 영양성분을 다량 축적할 수 있는 단백질이나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 제초제 저항성 유전자, 질병 저항성 유전자, 살충제 저항성 유전자, 곡식 또는 과실의 품질에 영향을 주는 유전자, 스크리닝 가능한 표식 유전자, 환경 또는 스트레스 저항성 유전자 등이 포함될 수 있다. 더욱 상세하게는 제초제 글리포세이트(Glyphosate)의 저항성 유전자인 5-EPSP 신타아제(5-Enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase), 제초제 비알라포스(바스타) (bialaphos(Basta))의 저항성 유전자인 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제 (phosphinothricin acetyltransferase), 바이러스 저항성 단백질인 외피 단백질 (coat protein)을 코딩하는 유전자, 해충 저항성 유전자인 바실러스 투린지엔시스 (Bacillus thuringiensis)로부터 분리한 Bt 독소(Bt toxin) 생성 유전자, 과실 완숙 방지를 위한 ACC 디아미나아제(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid deaminase) 유전자, 바이러스 저항성 식물을 용이하게 선발할 수 있는 식물체 세포의 괴사유발 유전자인 INF1(Phytophthora infestans elicitin gene) 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 실시예에서는 외래 유전자를 대신하여 리포터 유전자(reporter gene)인 GFP(green fluorescent protein) 유전자가 사용될 수 있다. GFP는 장파장의 자외선 조사에 의해서 녹색 형광을 관찰할 수 있으므로, 형질전환된 식물체를 확인하는데 있어서 매우 유용하다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 상기 MCS2는 침묵시키고자 하는 목적 유전자를 삽입할 수 있는 부위로서, 바람직하게는 CP(coat protein) 코딩 유전자 하부에 위치할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 MCS2는 SnaBI 제한효소 인식부위를 포함하고, 상기 SnaBI 제한효소 인식부위 사이에 침묵시키고자 하는 목적 유전자가 삽입될 수 있다.
본 발명의 벡터에 도입될 수 있는 침묵시키고자 하는 목적 유전자에는 어떠한 제한도 없다. 상기 침묵시키고자 하는 목적 유전자는 바람직하게는 목적 유전자 침묵을 유도하기 위한 센스 가닥 또는 안티센스 가닥이 상보적으로 결합된 핵산 서열일 수 있다. 상기 침묵시키고자 하는 목적 유전자는 센스 또는 안티센스 방향으로 삽입될 수 있다.
용어 "VIGS(Virus-induced gene silencing)"는 바이러스 벡터에 식물유전자를 도입한 후 식물체를 감염시키면, 그 도입된 유전자의 내인성 식물유전자가 발현이 억제되는 현상을 말한다. 이는 PTGS(Post-transcriptional gene silencing)의 일종으로서, 전사-후(post-transcriptional), RNA 턴오버(RNA turnover) 및 뉴클레오티드 서열 특이적(nucleotide sequence-specific) 이라는 특징들을 가진다. 따라서, VIGS를 이용하면 도입유전자의 기능을 신속하고 간편하게 대량으로 분석할 수 있다.
본 발명의 실시예에서는 침묵시키고자 하는 목적 유전자를 대신하여 200~350bp 길이의 PDS (phytoene desaturase) 유전자 단편이 안티센스 또는 센스 방향으로 삽입된 재조합 벡터를 사용될 수 있다. PDS 유전자는 카로티노이드 (carotenoid) 생합성에 관여하는 효소를 코딩하고 있으므로, 이 유전자가 억제되는 경우 식물 잎의 백화현상을 관찰할 수 있으므로, VIGS의 성공 여부를 확인하는데 있어서 매우 유용하다.
본 발명의 재조합 벡터는 프로모터를 포함할 수 있다. 상기 프로모터는 시험관 내 전사 또는 형질전환에 적합한 프로모터들로서, 바람직하게는 T7 프로모터, SP6 프로모터, CaMV 35S 프로모터, 액틴 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, pEMU 프로모터, MAS 프로모터 또는 히스톤 프로모터일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 T7 프로모터, SP6 프로모터 또는 CaMV 35S 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 중합효소가 결합하는 DNA 분자를 말한다.
본 발명의 재조합 벡터는 MCS2의 하부에 터미네이터를 포함할 수 있다. 상기 터미네이터는 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 제조합 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신, G418, 블레오마이신 (Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin) 또는 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한 본 발명은
(1) TRSV(tobacco ringspot virus) RNA1의 폴리프로테인(polyprotein) 코딩 유전자를 포함하는 TRSV RNA1 재조합 벡터를 제조하는 단계;
(2) 본 발명의 TRSV RNA2 재조합 벡터에 발현시키고자 하는 외래 유전자를 MCS1(multiple cloning site1)에 삽입하여 TRSV RNA2 재조합 벡터를 제조하는 단계;
(3) 상기 (1) 및 (2) 단계에서 제조된 각각의 재조합 벡터로 아그로박테리움을 형질전환하여 각각의 형질전환체를 얻는 단계; 및
(4) 상기 각각의 아그로박테리움 형질전환체의 혼합액을 식물체에 인필트레이션(infiltration) 또는 즙액 접종(sap inoculation)하는 단계;를 포함하는 식물체 내에서의 외래 유전자를 과발현시키는 방법을 제공한다.
상기 TRSV(tobacco ringspot virus) RNA1의 폴리프로테인(polyprotein) 코딩 유전자는 바람직하게는 서열번호 2의 염기 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 염기 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함될 수 있으며, 상동체의 구체적 내용은 전술한 바와 같다.
본 발명의 일 구현예에서 상기 TRSV RNA1 재조합 벡터를 pTRSR1이라고 칭하기도 한다.
본 발명의 상기 외래 유전자는 유용 단백질을 코딩하는 유전자일 수 있으며, 상기 유용 단백질을 코딩하는 유전자는 전술한 바와 같다.
본 발명의 일 구현예에 따른 식물체 내에서의 외래 유전자를 과발현시키는 방법은 외래 유전자가 삽입된 재조합 발현 벡터로 형질전환된 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)를 이용한 인필트레이션 방법 또는 즙액 접종(sap inoculation) 방법이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 아그로박테리움 매개 형질전환법 또는 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있으며, 바람직하게는 아그로박테리움 매개 형질전환법 또는 유전자 밤바드먼트를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용되는 "인필트레이션(infiltration)"이라는 용어는 식물체 내로 유전자를 도입하여 발현시키거나 식물체 내에서 원하는 단백질을 생산하기 위한 방법을 의미한다. 이동시키고자 하는 유전자를 가진 아그로박테리움의 현탁액을 바늘이 없는 주사기를 사용해서 압력을 줌으로써 식물의 잎에 주입하여 식물체 세포로 원하는 유전자를 이동시키는 방법이다. 이는 전통적인 식물 형질전환과 비교하면 신속하고 편리하다는 장점이 있다.
본 발명에서 사용되는 "즙액 접종(sap inoculation)"이라는 용어는 식물체 내로 유전자를 도입하는 방법 중의 하나로 럽(rub) 접종, 도말 접종 또는 기계적 접종(mechanical inoculation)이라고도 부른다. 이 방법은 일반적으로 카보런덤 (carborundum)과 같은 마찰제로 식물체에 상처를 낸 후, 도입하고자 하는 유전자를 가진 접종액(벡터)을 상처낸 식물체에 접촉시켜 식물체 내로 유전자를 도입하는 방법이다. 그밖에 바늘을 다발로 만들어 병든 잎을 접종엽면과 겹쳐서 찌르는 자침(刺針) 접종, 병든 잎을 겹쳐서 예리한 칼날로 절단한 후에 마찰제를 미리 처리한 접종엽면에 절단면을 직접 칠하는 신속법, 즙액을 가압분무하는 방법 등이 있다. 자침법이나 신속법은 즙액 접종이 곤란한 활성화하기 어려운 바이러스 접종에 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, TRSV에 의해 감염되는 식물체는 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 담배, 애기장대, 박과식물 및 콩과 식물일 수 있다.
또한, 본 발명은
(1) TRSV(tobacco ringspot virus) RNA1의 폴리프로테인(polyprotein) 코딩 유전자를 포함하는 TRSV RNA1 재조합 벡터를 제조하는 단계;
(2) 본 발명의 TRSV RNA2 재조합 벡터에 침묵시키고자 하는 목적 유전자를 MCS2(multiple cloning site2)에 삽입하여 TRSV RNA2 재조합 벡터를 제조하는 단계;
(3) 상기 (1) 및 (2) 단계에서 제조된 각각의 재조합 벡터로 아그로박테리움을 형질전환하여 각각의 형질전환체를 얻는 단계; 및
(4) 상기 각각의 아그로박테리움 형질전환체의 혼합액을 식물체에 인필트레이션(infiltration) 또는 즙액 접종(sap inoculation)하는 단계;를 포함하는 식물체 내에서의 목적 유전자를 침묵시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 식물체 내에서의 목적 유전자를 침묵시키는 방법은 상기 TRSV RNA2 재조합 벡터에 침묵시키고자 하는 목적 유전자를 MCS2(multiple cloning site2)에 삽입하여 TRSV RNA2 재조합 벡터를 제조하는 단계를 포함한다. 이 때 상기 침묵시키고자 하는 목적 유전자는 MCS2에 삽입되며, 바람직하게는 CP 코딩 유전자의 하부에 위치한 SnaBI 제한효소 인식부위 사이에 삽입될 수 있다. 또한 삽입되는 방향은 센스 또는 안티센스 방향으로 삽입될 수 있으며, 가장 바람직하게는 안티센스 방향으로 삽입될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
용어 "침묵"이란 일반적으로 유전자의 발현이 하향조절(downregulation) 또는 완전히 억제(suppression)되는 현상을 말한다.
본 발명의 식물체 내에서의 내인성 목적 유전자를 침묵시키는 방법에서, (2) 단계를 제외한, 각 단계는 식물체 내에서 외래 유전자를 과발현시키는 방법에서 전술한 바와 같다.
또한 본 발명은
(1) TRSV(tobacco ringspot virus) RNA1의 폴리프로테인(polyprotein) 코딩 유전자를 포함하는 TRSV RNA1 재조합 벡터를 제조하는 단계;
(2) 본 발명의 TRSV RNA2 재조합 벡터에 발현시키고자 하는 외래 유전자를 MCS1(multiple cloning site1)에 삽입하고, 침묵시키고자 하는 목적 유전자를 MCS2(multiple cloning site2)에 삽입하여 TRSV RNA2 재조합 벡터를 제조하는 단계;
(3) 상기 (1) 및 (2) 단계에서 제조된 각각의 재조합 벡터로 아그로박테리움을 형질전환하여 각각의 형질전환체를 얻는 단계; 및
(4) 상기 각각의 아그로박테리움 형질전환체의 혼합액을 식물체에 인필트레이션(infiltration) 또는 즙액 접종(sap inoculation)하는 단계;를 포함하는 식물체 내에서의 외래 유전자를 과발현시키고 목적 유전자를 침묵시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 식물체 내에서의 외래 유전자를 과발현시키고 목적 유전자를 침묵시키는 방법에서, 상기 TRSV RNA2 재조합 벡터에 발현시키고자 하는 외래 유전자를 MCS1(multiple cloning site1)에 삽입하고, 침묵시키고자 하는 목적 유전자를 MCS2(multiple cloning site2)에 삽입하여 TRSV RNA2 재조합 벡터를 제조하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서 삽입할 수 있는 외래 유전자는 유용 단백질을 코딩하는 유전자일 수 있으며, 침묵시키고자 하는 목적 유전자는 식물 내인성 목적 유전자를 침묵시킬 수 있는 핵산 서열일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은
(1) TRSV(tobacco ringspot virus) RNA1의 폴리프로테인(polyprotein) 코딩 유전자를 포함하는 TRSV RNA1 재조합 벡터를 제조하는 단계;
(2) 본 발명의 TRSV RNA2 재조합 벡터에 발현시키고자 하는 외래 유전자를 MCS1(multiple cloning site1)에 삽입하여 TRSV RNA2 재조합 벡터를 제조하는 단계;
(3) 상기 (1) 및 (2) 단계에서 제조된 각각의 재조합 벡터로 아그로박테리움(Agrobacterium)를 형질전환하여 각각의 형질전환체를 얻는 단계; 및
(4) 상기 각각의 아그로박테리움(Agrobacterium) 형질전환체의 혼합액을 식물체에 인필트레이션(infiltration) 또는 즙액 접종(sap inoculation)하는 단계;를 포함하는 외래 유전자가 과발현된 식물체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 외래 유전자가 과발현된 식물체의 제조 방법에서, 각 단계는 식물체 내에서 외래 유전자를 과발현시키는 방법에서 기재한 바와 같다.
본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조된 외래 유전자가 과발현된 식물체를 제공한다.
또한 본 발명은
(1) TRSV(tobacco ringspot virus) RNA1의 폴리프로테인(polyprotein) 코딩 유전자를 포함하는 TRSV RNA1 재조합 벡터를 제조하는 단계;
(2) 본 발명의 TRSV RNA2 재조합 벡터에 침묵시키고자 하는 목적 유전자를 MCS2(multiple cloning site2)에 삽입하여 TRSV RNA2 재조합 벡터를 제조하는 단계;
(3) 상기 (1) 및 (2) 단계에서 제조된 각각의 재조합 벡터로 아그로박테리움(Agrobacterium)를 형질전환하여 각각의 형질전환체를 얻는 단계; 및
(4) 상기 각각의 아그로박테리움(Agrobacterium) 형질전환체의 혼합액을 식물체에 인필트레이션(infiltration) 또는 즙액 접종(sap inoculation)하는 단계;를 포함하는 목적 유전자가 침묵된 식물체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 목적 유전자가 침묵된 식물체의 제조 방법에서, 각 단계는 식물체 내에서 목적 유전자를 침묵시키는 방법에서 기재한 바와 같다.
본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조된 목적 유전자가 침묵된 식물체를 제공한다.
또한 본 발명은
(1) TRSV(tobacco ringspot virus) RNA1의 폴리프로테인(polyprotein) 코딩 유전자를 포함하는 TRSV RNA1 재조합 벡터를 제조하는 단계;
(2) 본 발명의 TRSV RNA2 재조합 벡터에 발현시키고자 하는 외래 유전자를 MCS1(multiple cloning site1)에 삽입하고, 침묵시키고자 하는 목적 유전자를 MCS2(multiple cloning site2)에 삽입하여 TRSV RNA2 재조합 벡터를 제조하는 단계;
(3) 상기 (1) 및 (2) 단계에서 제조된 각각의 재조합 벡터로 아그로박테리움을 형질전환하여 각각의 형질전환체를 얻는 단계; 및
(4) 상기 각각의 아그로박테리움 형질전환체의 혼합액을 식물체에 인필트레이션(infiltration) 또는 즙액 접종(sap inoculation)하는 단계;를 포함하는 외래 유전자가 과발현되고, 목적 유전자가 침묵된 식물체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 외래 유전자가 과발현되고, 목적 유전자가 침묵된 식물체의 제조 방법에서, 각 단계는 식물체 내에서 외래 유전자를 과발현시키고 목적 유전자를 침묵시키는 방법에서 기재한 바와 같다.
본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조된 외래 유전자가 과발현되고, 목적 유전자가 침묵된 식물체를 제공한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. GFP 발현을 위한 TRSV-기반 재조합 벡터의 제조
본 발명자는 두 종의 TRSV 감염성 cDNA 클론(infectious cDNA clone)인 pTRSR1 및 pTRSR2 벡터를 제작하였다(Zhao 등, 2015, Virus Genes 51;163-166)(도 1A). 본 발명에서 외래 유전자 발현 또는 VIGS를 위한 구축물은 PCR를 이용하여 pTRSV2 벡터를 변형함으로써 제작하였다.
시스테인/알라닌(Cys/Ala, C/A) 절단 부위(cleavage site)의 효율적인 가공 과정을 획득하기 위해, CP의 N 말단의 19개의 아미노산을 선택, 중복하는데 축퇴성 코돈(degenerate codons)을 위해서 몇 개의 뉴클레오티드는 치환하였다. FMDV(foot-and-mouth disease virus) 2A 펩티드를 암호화하는 서열을 표 1의 프라이머로부터 삽입하였다. 상기 추가 19개 아미노산을 암호화하는 서열은 MCS(multicloing site, BamHI-MluI-SpeI)에 연결되어 pTRSR2Part2에 삽입되었다. PCR I 단편은 pTRSR2을 주형으로 하여 T2-1167F 및 2AMCS-R 프라이머 세트를 이용하여 증폭하였고, PCR II 단편은 pTRSR2을 주형으로 하여 2AMCS-F 및 RZNOS-75R 프라이머 세트를 이용하여 증폭하였다. 두 PCR 단편(PCR I 및 PCR II 단편)을 동량 혼합하여 T2-1167F 및 RZNOS-15R 프라이머 세트를 이용한 오버래핑 PCR을 수행한 후 XbaI 및 SalI 제한효소로 절단하여 pPZP211NOS 벡터의 XbaI/SalI 사이트에 삽입함으로써 pT2C2APart2를 제조하였다. 상기 pT2C2APart2의 SacI/XbaI 사이트에 절편 I(fragment I)을 삽입하여 pT2C2A를 제조하였다(도 1B). GFP을 암호화하는 서열은 pGFP(Clontech, 미국)을 주형으로 GFPBamH-F 및 GFPSpe-R 프라이머 세트를 이용한 PCR로 얻었으며, 상기 PCR 단편은 BamHI 및 SpeI로 절단하여 BamHI/SpeI으로 처리된 pT2C2A vector에 삽입하여 pT2C2AGFP을 제조하였다(도 1B).
2. VIGS을 위한 TRSV-기반 재조합 벡터의 제조
CP 코딩 영역의 종결코돈 하부에 SnaBI 사이트를 제조하기 위하여, T2-1167F/TRSCP-R 또는 TRSCP3UTR-F/RZNOS-75R 프라이머 세트를 이용하여 두 PCR 단편을 각각 증폭한 후, 이어 두 단편은 T2-1167F 및 RZNOS-15R 프라이머 세트를 이용하여 오버래핑 PCR을 수행하여 획득한 최종 PCR 산물은 XbaI/SalI로 절단하여 pPZP211NOS 벡터에 서브클로닝하여 pT2SPart2로 제작하였다(도 1C).
담배 유래 PDS 유전자(N. benthamiana PDS, NbPDS)(GenBank accession no.: EU165355)의 두 종의 cDNA 절편(215 bp 및 345 bp)은 각각 NbPDSSnaB-743F/957R 및 NbPDSSnaB-743F/1087R 프라이머 세트를 이용한 PCR로 증폭하였다(표 1). 애기장대 생태형 Col-0 유래 PDS 유전자(AtPDS)(GenBank accession no.: NM_117498)의 250bp 절편은 AtPDSSnaB-1151F/1400R 프라이머 세트를 이용한 PCR로 증폭하였다(표 1). 오이 유래 PDS 유전자(CuPDS)(GenBank accession no.: XM_011654729)의 300bp 절편은 CuPDSSnaB-952F/1251R 프라이머 세트를 이용한 PCR로 증폭하였다(표 1). 대두 유래 PDS 유전자(Glycine max PDS, GmPDS)(GenBank accession no.: M64704)의 209bp 절편은 GmPDSSnaB-1353F/1561R 프라이머 세트를 이용한 PCR로 증폭하였다(표 1). 각각의 PDS 유전자의 PCR 산물을 SnaBI으로 절단하여 SnaBI-처리 및 비인산화된 pT2S 벡터에 센스 또는 안티센트 방향으로 삽입하여 pT2SNbPDS, pT2SAtPDS, pT2SCuPDS 및 pT2SGmPDS를 제작하였다. 상기 벡터는 담배, 애기장대, 오이류(cucurbits), 콩류(legumes)에서 상응하는 PDS 유전자를 침묵하기 위해 사용되었다. pT2SNbPDS 벡터는 pT2SNbPDS215, pT2SNbPDS215a, pT2SNbPDS345 및 pT2SNbPDS345a를 포함하였다. pT2SAtPDS 벡터는 pT2SAtPDS250 및 pT2SAtPDS250a를 포함하였다. pT2SCuPDS 벡터는 pT2SCuPDS300 및 pT2SCuPDS300a를 포함하였다. pT2SGmPDS 벡터는 pT2SGmPDS209 및 pT2SGmPDS209a를 포함하였다. VIGS을 위해 사용된 또 다른 pT2C2AS 벡터는 SnaBI-처리 및 비인산화된 pT2S 벡터에 SnaBI 사이트가 삽입되어 제작되었다. pT2C2ASNbPDS215, pT2C2ASNbPDS215a, pT2C2ASNbPDS345 및pT2C2ASNbPDS345a을 포함하는 pT2C2ASNbPDS 벡터는 담배의 NbPDS 유전자를 침묵하기 위해 제작되어 유전자 침묵 능력을 확인하였다. pT2C2ASGFPNbPDS215 및 pT2C2ASGFPNbPDS215a 벡터는 pT2C2ASNbPDS215, pT2C2ASNbPDS215a 각각에 BamHI/SpeI에 GFP를 삽입하여 제작하였다.
3. 식물 생장 조건, 아그로인필트레이션 및 진액 접종
본 발명에 사용된 모든 식물은 23℃, 16/8시간 광주기 조건의 온실에서 재배되었다.
아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 균주 GV3101가 실험에 사용된 식물 내 벡터를 전달하기 위해 사용되었다. 아그로인필트레이션(agroinfiltration)을 위하여, 형질전환된 아그로박테리움 튜머파시엔스는 28℃, 50㎍/ml의 리팜피신(rifampicin) 및 100㎍/ml의 스펙토마이신(spectomycin)이 포함된 LB(Luria-Bertani) 배지에서 배양하였다. 밤새 배양 후, 원심분리로 세포를 수확하여 인필트레이션 완충액(10mM MES, pH 5.6, 10mM MgCl2, 200μM acetosyringone)으로 희석하여, 아그로인필트레이션 이전에 상온에서 3~4시간 배양하였다. 6주령(대략 7개 잎) 담배 묘목의 4번째 및 5번째 잎에 1ml 시린지를 사용하여 아그로인필트레이션을 수행하였다. 6~15일령 오이류 묘목의 떡잎(cotyledon)에서 아그로인필트레이션을 수행하였다. TS-, TSAtPDS- 및 TSGmPDS-아그로필트레이션된 담배잎(6dpi)을 수확하여 대두 잎에 즙액 접종(sap inoculation)하였다.
4. GFP 발현의 웨스턴 블롯 분석
웨스턴 블롯 분석을 하기 위하여, 단백질 추출물은 접종 후 10일된(10dpi) 담배잎에서 준비하였다. 단백질 추출시료(20㎍ 단백질/샘플)를 10% SDS-PAGE 젤에서 분리하고 PVDF 막에 전이시켰다. 마우스 항-GFP 항혈청(Santa Cruz Biotechnology, 미국)로 1:800 희석하여 막을 프로빙하였다. 막을 염소 항-마우스 IgG-HRP 2차 항체로 1:5,000 희석하여 사용하였다. 최종 결과는 myECL Imager(Thermo Scientific, 미국)을 사용하여 분석하였다.
5. RT-PCR 및 semi-q RT-PCR(semi-quantitative RT-PCR) 분석
RT-PCR 및 semi-q RT-PCR을 위해서, 접종 식물 시료로부터 전체 RNA을 TRI 시료를 사용하여 추출하였다. RT-PCR는 오이류에서의 TRSV cDNA 클론의 감염성을 입증하기 위해 TRS-N30/C30 프라이머 세트를 이용하여 수행되었다(표 1). Semi-q RT-PCR 방법은 각각의 NbPDS-295F/556R, AtPDS-544F/981R, CuPDS-679F/906R 및 GmPDS-1627F/1857R 프라이머 세트를 이용하여 담배, 애기장대, 오이류, 대두에서의 PDS 유전자 발현 수준을 확인하기 위하여 수행되었다(표 1). 증폭된 담배 액틴 유전자(GenBank accession no.: EU165355), 애기장대 액틴 2(GenBank accession no.: NM_112764), 오이 액틴 유전자(GenBank accession no.: XM_004136807) 및 대두 투불린 유전자(GenBank accession no.: M64704)가 내재적 대조구(internal controls)로 사용되었다.
실시예
1. TRSV-기반 재조합 벡터의 GFP 발현 확인
GFP를 TRSV 기반으로 한 외래 유전자 발현 시스템에서 사용하기 위하여, RNA2 구성성분으로 MP와 CP 유전자 사이에 삽입되어 pT2C2AGFP 벡터로 제작되었다(도 1B). GFP는 MP-CP 절단 부위(cleavage site)와 FMDV 2A 촉매 펩타이드(catalytic peptide)의 가공 과정을 통하여 폴리단백질(polyprotein)으로부터 발현되었다.
TC2A(pTRSR1+pT2C2A) 또는 TC2AGFP(pTRSR1+pT2C2AGFP)을 담배의 4엽(4th)과 5엽(5th)에 아그로인필트레이션 결과 침윤 4일 또는 5일 후(4~5 dpi) 담배의 침윤엽(4엽, 5엽)과 9엽(9th)에 미세 원형 스팟이 관찰되었으며, 이는 바이러스 구축물이 감염되었음을 가시적으로 확인되었다. 반면에 완충액(Mock)을 침윤한 담배는 TRSV에 의해 유도되는 징조가 관찰되지 않았다. GFP 형광은 침윤 7일째(7 dpi)에 9엽(9th)에서 처음으로 확인되었다. 병징이 보이는 잎과 겹눈(axillary buds)에서 강한 GFP 형광이 관찰되었다. 침윤 15일(15dpi) 이후, GFP 형광이 새로 생장하는 잎에서 거의 보이지 않았으며, 병징 또한 거의 나타나지 않거나 없었다. 도 2A는 침윤 10일(10 dpi) 담배의 GFP 발현을 UV 상에서 촬영한 사진이다. 본 실험에서는 TC2AGFP-침윤 담배의 약 80%에서 GFP 형광을 확인하였다.
TC2AGFP-침윤 담배의 8~10엽, 겹눈 또는 완충액-침윤, TC2A-침윤 담배의 10엽으로부터 단백질을 추출하여 웨스턴 블롯을 통하여 GFP 단백질 발현을 확인하였다. 그 결과 9엽, 10엽과 겹눈에서 각각 GFP-2A, MP-GFP-2A 및 GFP-2A-CP에 상응할 것으로 추정되는 ~30, 70 및 87 kDa의 단백질 밴드가 확인되었다(도 2B). 10엽과 겹눈에서는 더 큰 크기(~127 kDa)의 단백질 밴드가 존재하였으며 이는 단백질 절단이 충분히 이루어지지 않은 것(MP-GFP-2A-CP 융합 단백질)으로 보였다(도 2B). 겹눈에서는 GFP 단백질 크기에 상응하는 27kDa 단백질 밴드가 확인되었다. 완충액-침윤, TC2A-침윤 담배 잎에서는 단백질 밴드가 전혀 확인되지 않았다. 웨스턴 블롯 결과는 침윤 식물에서의 GFP 형광 발현을 조사한 결과와 일치하였다.
실시예
2. TRSV-기반 재조합 벡터의 담배 내
PDS
유전자 침묵 확인
담배 내 VIGS를 수행하기 위하여, 각각의 pTRSR2 및 pT2C2A 벡터 내 CP의 종결코돈의 하부에 SnaBI를 삽입한 pT2S 및 pT2C2AS를 제작하였다(도 1C, D). 삽입 부위의 크기와 방향이 VIGS 효율에 영향을 미치는지 확인하기 위해, 담배 NbPDS 유전자에서 2종의 cDNA 단편(215 및 345 bp)을 센스 및 안티센스 방향으로 pT2S 및 pT2C2AS의 SnaBI 사이트에 각각 삽입된 pT2SNbPDS 및 pT2C2ASNbPDS을 제작하여 담배에 침윤하였다. 완충액-침윤, TS-(pTRSR1+pT2S) 및 TC2AS-(pTRSR1+pT2C2AS)-침윤 담배는 대조구로 사용되었다.
침윤 5일(5 dpi)이 시작하연서 침윤엽에서 TRSV 감엽에 의한 병징(미세 원형 스팟)이 나타난 반면, 완충액-침윤엽에서는 관찰되지 않았다. 모든 VIGS 구축물에서 NbPDS의 침묵 효과인 백화 표현형(photo-bleaching phenotype)이 나타나기 시작했으나 균일성에 있어서 차이를 보였다(도 3A, B). TSNbPDS(pTRSR1+pT2SNbPDS)-접종 담배 및 TC2ASNbPDS(pTRSR1+pT2C2ASNbPDS)-접종 담배의 10엽과 겹눈에서는 각각 10 dpi와 13 dpi에서 처음으로 부분적인 백화 현상이 관찰되었다. TSNbPDS(pTRSR1+pT2SNbPDS)-접종 담배에서는 13일 이내에 백화된 잎, 줄기, 꽃 전체에서 강한 침묵으로 인하여 완전하게 백화되었으며 1달 가까이 백화현상이 지속되었다(도 3A, 7A, 패널 1). TC2ASNbPDS-접종 담배에서는 접종 70일 새로운 녹색엽이 발달하기 전까지 식물 전반적으로 불완전한 백화 현상이 나타났다(도 3B, 7A, 패널 2). semi-quantitative RT-PCR 분석 결과, 대조구와 비교하여 TSNbPDS-접종 식물(23 dpi) 또는 TC2ASNbPDS-접종 식물(30 dpi)의 백화-엽에서의 NbPDS mRNA 발현수준이 현저하게 감소하였다(도 3). TSNbPDS 및 TC2ASNbPDS 의 백화 현상 결과를 통하여 TSNbPDS에서의 VIGS 효율이 TC2ASNbPDS에서보다 더 높았으나, VIGS의 지속성 측면에서는 TC2ASNbPDS가 TSNbPDS에서보다 1달가량 더 지속되었다.
유전자 침묵 효율에서의 삽입된 단편의 크기와 방향의 효과를 조사한 결과, 2종의 NbPDS 215bp 단편과 345bp 단편에서는 크기와 방향에 상관없이 비슷한 백화현상을 확인하였다(도 3A, B). Semi-quantitative RT-PCR 분석 결과에서도 두 단편에 의해 감소되는 NbPDS 전사체량이 비슷함을 확인하였다(도 3A, B). 상기 결과는 담배 내 VIGS 효율이 ~200-350 bp 가량의 인서트 길이와 방향에 영향을 받지 않는다는 것을 확인하였다.
유전자 침묵이 일어나는 정확한 위치를 결정하기 위하여, 이전에 Zhang 등(2010, Plant physiol. 153: 52-65)에 의해 기술된 마커 유전자-보조 침묵 방법(marker gene-assisted silencing)을 수행하였다. 이를 위해, 각각의 pT2C2ASNbPDS215와 pT2C2ASNbPDS215a에 GFP를 삽입하여 제조한 pT2C2ASGFPNbPDS215 및 pT2C2ASGFPNbPDS215a를 사용하였다. TC2ASGFPNbPDS(pTRSR1+pT2C2ASNbPDS)-접종 담배는 접종 후 7일부터 14일째에서 GFP 형광이 관찰되었으며 접종 후 17일 이후 약한 백화 현상이 나타났다(도 4). 상기 결과에 따르면 마커 유전자의 발현과 내재적 유전자의 침묵이 TRSV-기반 벡터에 의해서 동시에 일어나지 않으므로, 마커-유전자 보조 침묵이 본 시스템에서 실현 용이하지 않을 것으로 예상된다.
실시예 3. TRSV-기반 재조합 벡터의 애기장대 내
PDS
유전자 침묵 확인
TRSV는 애기장대 생태형에 따라 변이가 다양하게 나타났다. 예를 들어 애기장대 Col-0은 가시적인 병증이 나타나지 않는 반면, Estland는 치명적 전신성 괴사(lethal systemic necrosis, LSN)가 나타났다.
본 실험에서는 애기장대 Col-0 유래 PDS 유전자의 250 bp 단편을 센스 및 안티센스 방향으로 pT2S의 SnaBI 사이트에 삽입된 pT2SAtPDS를 제조하였다. TSAtPDS(pTRSR1+pT2AtPDS)-접종 후 5일 또는 6일된 담배 잎로부터의 즙액으로 애기장대 Col-0를 접종하였으며, 접종된 애기장대는 병징이 거의 나타나지 않았다.
접종 7일 또는 8일에 줄기와 새로 발달하는 잎에서 백화현상를 관찰하였다. 즙액 접종 2주 후 TSAtPDS(pTRSR1+pT2AtPDS)-접종 애기장대의 대부분의 줄기와 꽃받침에서 백화 현상이 관찰되었다(도 5A, B). 상기 PDS 침묵 표현형은 6주까지 지속되었으며, 백색 실리크가 형성됨을 확인하였다(도 5C, D). 그 후로 유전자 침묵 회복이 진행되면서 줄기의 상단부에 녹색의 실리크가 생성되었다. 센스 방향 및 안티센스 방향의 DNA 단편 모두 유전자 침묵 현상이 유사함을 확인하였다. 또한, TSAtPDS(pTRSR1+pT2AtPDS)-접종 애기장대의 AtPDS 유전자 발현 감소는 semi-q RT-PCR 방법으로 확인하였다(도 5E).
실시예
4. 오이류(cucurbits) 내 TRSV cDNA 감염성 클론의 아그로인필트레이션 확인
오이류 TRSV cDNA 클론의 생물학적 활성에 대해 이전에 보고된 바가 없어서 본 실험에서 확인하였다. 5종의 오이류(멜론, 참외, 오이, 수박, 호박)의 떡잎에 TRSV cDNA 클론(pTRSR1+pTRSR2)을 접종하였다. TRSV-접종 멜론과 참외의 경우 접종 후 7일부터 2본엽(2nd true leaf)에서 미세 원형 스팟이 나타났으며 그 후 14일째 4본엽에서 약한 병징이 나타났다. TRSV-접종 오이는 2본엽에서 접종 후 10일 이후에 미세한 모틀링(mottling)을 보이는 것을 제외하고 병징이 거의 나타나지 않았다.
멜론, 참외 및 오이에서의 TRSV의 전신성 감염(systemic infection)은 RT-PCR 방법으로 확인하였다. 반면 RT-PCR 방법으로 확인 결과, 수박과 호박에서 아그로인필트레이션 또는 잎-즙액 접종 방법은 성공하지 못하였다. 이는 아그로인필트레이션 방법을 통해서는 멜론, 참외 및 오이가 접종될 수 있음을 확인하였다.
실시예 5. TRSV-기반 재조합 벡터의 오이류(cucurbits) 내
PDS
유전자 침묵 확인
오이류에서 VIGS를 확인하기 위하여, pT2S 벡터에 CuPDS 유전자를 센스 또는 안티센스 방향으로 삽입하여 pT2SCuPDS벡터를 제조하였다. 유전자 침묵 현상을 확인하기 위하여, 본 실시예 4 결과에서 확인된 바와 같이 멜론, 참외 및 오이를 대상으로 하여 TSCuPDS(pTRSR1+pT2SCuPDS)를 접종하였다. 멜론과 참외의 경우에는 떡잎에 접종 후 10일에 3본엽(3rd true leaf)에서 부분적인 백화 현상이 나타났으며, 오이의 경우에는 20일에 4본엽 또는 5본엽에서 유사 현상이 나타났다. 이어 상기 침묵된 식물체는 완전히 백화된 신엽, 엽병, 꽃잎, 꽃받침, 덩굴손(tendrils)까지 형성하였다(도 6A, 7B). 멜론과 참외는 CuPDS 유전자 침묵의 표현형을 1달 가량 지속하였으나, 열매 발달 전에 유전자 침묵으로부터 회복되었다. 오이의 경우에는 TRSV-매개 VIGS가 식물에 계속 지속되었다. TS- 및 TSCuPDS-접종 오이 식물체에서는 TRSV 감염으로 인하여 하위 마디의 열매가 자라지 못하였다. TSCuPDS-접종 오이는 TS-접종 식물보다 빨리 죽었으며, 상위 마디에서 열매가 하나 또는 전혀 발달하지 않았다. 상기 발달된 열매의 경우에는 부분적으로 백화 현상이 나타나며 형태가 비틀어져 있었다(도 7C). Semi-q RT-PCR 분석 결과에서는 TSCuPDS-접종 식물의 침묵된 잎에서 CuPDS mRNA가 현저하게 감소됨을 확인하였다(도 6B).
실시예
6. TRSV-기반 재조합 벡터의 콩류(legume species) 내
PDS
유전자 침묵 확인
이전 연구에서는 애기장대와 대두를 직접 TRSV cDNA 감염성 클론으로 아그로인필트레이션하는 방법이 성공하지 못하고, 감염성 클론-접종 담배의 즙액을 기계적으로 접종하는 방법이 수행되었다.
콩류에서 VIGS를 확인하기 위하여, pT2S벡터 SnaBI 사이트에 GmPDS 유전자의 209-bp 단편를 센스 또는 안티센스 방향으로 삽입하여 pT2SGmPDS 벡터를 제조하였다. 상기 제조된 벡터를 담배에 접종하여 6일째에 즙액을 준비하여 대두 품종인 '윌리암스 82'('Williams 82')와 야생형의 단소엽(unifoliolate leaves)에 기계적 접종을 하였다. TSGmPDS(pTRSR1+pT2SGmPDS)-접종 대두 식물에서는 접종 후 14일에 접종엽 상위의 2삼출엽(2nd trifoliolate leaf) 또는 3삼출엽(3th trifoliolate leaf)에서 점차적으로 백화 표현형이 나타났다. 이후 백화 표현형이 완전해지며, 신엽과 겹눈까지도 확장되었다(도 8). TSGmPDS-접종 야생형은 꼬투리를 관찰할 수 없었다. Semi-q RT-PCR 분석 결과에서는 TSGmPDS-접종 24일째의 야생형과 45일째의 '윌리암스 82' 식물체의 침묵된 잎에서 GmPDS mRNA가 현저하게 감소됨을 확인하였다(도 8B).
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology
<120> TRSV recombinant vector and uses thereof
<130> PN15397
<160> 32
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRSV RNA2 cassette
<400> 1
ttgaaaattc tctcacaggg ttccggttac gttgttcttt tactctcttt ttattttaat 60
tgttcaaaat tgcgattctg aagcttccta ctttctggtg cccgcatttt ctctctgctc 120
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agtcagggtc tctccctcct gcttctccgg ccgcggctct cacccgcgtc caacgcgccc 240
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ttcctgctcc agctcctcca ggctggggta ttccaaaacc cccccctctt cctccacctt 540
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 26
ccaagctgct acctttccac 20
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 27
ccgtacgtaa taactggaaa gg 22
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 28
ccgtacgtaa accaactcta ac 22
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 29
aacctcctcc tcatcgtact 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 30
gacagcatca gccatgttca 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 31
gcttgccaaa ctctttcctg 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 32
gcacaaagct tcccagaaag 20
Claims (15)
- TRSV(tobacco ringspot virus) RNA2의 P2A(protein 2A) 코딩 유전자; MP(movement protein) 코딩 유전자; MP(movement protein) 코딩 유전자 및 CP(coat protein) 코딩 유전자 사이의 절단부위(cleavage site); 상기 절단부위의 하부에 위치하는 발현시키고자 하는 외래 유전자를 삽입할 수 있는 MCS1(multiple cloning site1); 상기 MCS1의 하부에 위치하는 자가 절단성 펩티드를 코딩하는 서열; CP(coat protein) 코딩 유전자; CP의 하부에 위치하는 침묵시키고자 하는 목적 유전자를 삽입할 수 있는 MCS2(multiple cloning site2);을 포함하는 카세트를 포함하는 TRSV RNA2 재조합 벡터.
- 제1항에 있어서, 상기 카세트는 서열번호 1의 염기 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
- 제1항에 있어서, 상기 발현시키고자 하는 외래 유전자는 유용 단백질을 코딩하는 핵산 서열인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
- 제1항에 있어서, 상기 침묵시키고자 하는 목적 유전자는 센스 또는 안티센스 방향으로 삽입되는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
- (1) TRSV(tobacco ringspot virus) RNA1의 폴리프로테인(polyprotein) 코딩 유전자를 포함하는 TRSV RNA1 재조합 벡터를 제조하는 단계;
(2) 제1항의 TRSV RNA2 재조합 벡터에 발현시키고자 하는 외래 유전자를 MCS1(multiple cloning site1)에 삽입하여 TRSV RNA2 재조합 벡터를 제조하는 단계;
(3) 상기 (1) 및 (2) 단계에서 제조된 각각의 재조합 벡터로 아그로박테리움을 형질전환하여 각각의 형질전환체를 얻는 단계; 및
(4) 상기 각각의 아그로박테리움 형질전환체의 혼합액을 식물체에 인필트레이션(infiltration) 또는 즙액 접종(sap inoculation)하는 단계;를 포함하는 식물체 내에서의 외래 유전자를 과발현시키는 방법. - 제5항에 있어서, 상기 TRSV(tobacco ringspot virus) RNA1의 폴리프로테인(polyprotein) 코딩 유전자는 서열번호 2의 염기 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 식물체는 담배, 애기장대, 박과식물 및 콩과 식물로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- (1) TRSV(tobacco ringspot virus) RNA1의 폴리프로테인(polyprotein) 코딩 유전자를 포함하는 TRSV RNA1 재조합 벡터를 제조하는 단계;
(2) 제1항의 TRSV RNA2 재조합 벡터에 침묵시키고자 하는 목적 유전자를 MCS2(multiple cloning site2)에 삽입하여 TRSV RNA2 재조합 벡터를 제조하는 단계;
(3) 상기 (1) 및 (2) 단계에서 제조된 각각의 재조합 벡터로 아그로박테리움을 형질전환하여 각각의 형질전환체를 얻는 단계; 및
(4) 상기 각각의 아그로박테리움 형질전환체의 혼합액을 식물체에 인필트레이션(infiltration) 또는 즙액 접종(sap inoculation)하는 단계;를 포함하는 식물체 내에서의 목적 유전자를 침묵시키는 방법. - (1) TRSV(tobacco ringspot virus) RNA1의 폴리프로테인(polyprotein) 코딩 유전자를 포함하는 TRSV RNA1 재조합 벡터를 제조하는 단계;
(2) 제1항의 TRSV RNA2 재조합 벡터에 발현시키고자 하는 외래 유전자를 MCS1(multiple cloning site1)에 삽입하고, 침묵시키고자 하는 목적 유전자를 MCS2(multiple cloning site2)에 삽입하여 TRSV RNA2 재조합 벡터를 제조하는 단계;
(3) 상기 (1) 및 (2) 단계에서 제조된 각각의 재조합 벡터로 아그로박테리움을 형질전환하여 각각의 형질전환체를 얻는 단계; 및
(4) 상기 각각의 아그로박테리움 형질전환체의 혼합액을 식물체에 인필트레이션(infiltration) 또는 즙액 접종(sap inoculation)하는 단계;를 포함하는 식물체 내에서의 외래 유전자를 과발현시키고 목적 유전자를 침묵시키는 방법. - (1) TRSV(tobacco ringspot virus) RNA1의 폴리프로테인(polyprotein) 코딩 유전자를 포함하는 TRSV RNA1 재조합 벡터를 제조하는 단계;
(2) 제1항의 TRSV RNA2 재조합 벡터에 발현시키고자 하는 외래 유전자를 MCS1(multiple cloning site1)에 삽입하여 TRSV RNA2 재조합 벡터를 제조하는 단계;
(3) 상기 (1) 및 (2) 단계에서 제조된 각각의 재조합 벡터로 아그로박테리움(Agrobacterium)를 형질전환하여 각각의 형질전환체를 얻는 단계; 및
(4) 상기 각각의 아그로박테리움(Agrobacterium) 형질전환체의 혼합액을 식물체에 인필트레이션(infiltration) 또는 즙액 접종(sap inoculation)하는 단계;를 포함하는 외래 유전자가 과발현된 식물체의 제조방법. - 제10항의 방법에 의해 제조된 외래 유전자가 과발현된 식물체.
- (1) TRSV(tobacco ringspot virus) RNA1의 폴리프로테인(polyprotein) 코딩 유전자를 포함하는 TRSV RNA1 재조합 벡터를 제조하는 단계;
(2) 제1항의 TRSV RNA2 재조합 벡터에 침묵시키고자 하는 목적 유전자를 MCS2(multiple cloning site2)에 삽입하여 TRSV RNA2 재조합 벡터를 제조하는 단계;
(3) 상기 (1) 및 (2) 단계에서 제조된 각각의 재조합 벡터로 아그로박테리움(Agrobacterium)를 형질전환하여 각각의 형질전환체를 얻는 단계; 및
(4) 상기 각각의 아그로박테리움(Agrobacterium) 형질전환체의 혼합액을 식물체에 인필트레이션(infiltration) 또는 즙액 접종(sap inoculation)하는 단계;를 포함하는 목적 유전자가 침묵된 식물체의 제조방법. - 제12항의 방법에 의해 제조된 목적 유전자가 침묵된 식물체.
- (1) TRSV(tobacco ringspot virus) RNA1의 폴리프로테인(polyprotein) 코딩 유전자를 포함하는 TRSV RNA1 재조합 벡터를 제조하는 단계;
(2) 제1항의 TRSV RNA2 재조합 벡터에 발현시키고자 하는 외래 유전자를 MCS1(multiple cloning site1)에 삽입하고, 침묵시키고자 하는 목적 유전자를 MCS2(multiple cloning site2)에 삽입하여 TRSV RNA2 재조합 벡터를 제조하는 단계;
(3) 상기 (1) 및 (2) 단계에서 제조된 각각의 재조합 벡터로 아그로박테리움을 형질전환하여 각각의 형질전환체를 얻는 단계; 및
(4) 상기 각각의 아그로박테리움 형질전환체의 혼합액을 식물체에 인필트레이션(infiltration) 또는 즙액 접종(sap inoculation)하는 단계;를 포함하는 외래 유전자가 과발현되고, 목적 유전자가 침묵된 식물체의 제조방법. - 제14항의 방법에 의해 제조된 외래 유전자가 과발현되고, 목적 유전자가 침묵된 식물체.
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Applications Claiming Priority (1)
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| KR101724370B1 true KR101724370B1 (ko) | 2017-04-07 |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20200011845A (ko) * | 2018-07-25 | 2020-02-04 | 서울대학교산학협력단 | 잠두위조바이러스2를 이용한 고추 유전자 침묵 기술 |
-
2016
- 2016-07-08 KR KR1020160086897A patent/KR101724370B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ji Lian Li 등. mBio. vol. 5, no. 1, 페이지1-11 (2014.01.21) * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20200011845A (ko) * | 2018-07-25 | 2020-02-04 | 서울대학교산학협력단 | 잠두위조바이러스2를 이용한 고추 유전자 침묵 기술 |
| KR102076338B1 (ko) * | 2018-07-25 | 2020-02-11 | 서울대학교산학협력단 | 잠두위조바이러스2를 이용한 고추 유전자 침묵 기술 |
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