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KR102265780B1 - 식물체의 개화기 조절 efg1 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

식물체의 개화기 조절 efg1 유전자 및 이의 용도 Download PDF

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Publication number
KR102265780B1
KR102265780B1 KR1020190159581A KR20190159581A KR102265780B1 KR 102265780 B1 KR102265780 B1 KR 102265780B1 KR 1020190159581 A KR1020190159581 A KR 1020190159581A KR 20190159581 A KR20190159581 A KR 20190159581A KR 102265780 B1 KR102265780 B1 KR 102265780B1
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South Korea
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gene
plant
efg1
rice
seq
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이강섭
송재은
이종렬
윤인선
김리경
민명기
임선형
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대한민국
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Abstract

본 발명은 식물체의 개화기를 조절하는 EFG1 유전자 및 상기 유전자를 식물체에 과발현하는 단계를 포함하는 식물체의 개화기를 조절하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 유전자를 이용하면 식물체의 개화기를 조절할 수 있으므로, 작물의 생산성 및 바이오매스 향상 등의 분야에서 활용될 수 있다.

Description

식물체의 개화기 조절 EFG1 유전자 및 이의 용도{EFG1 gene for regulating flowering date of plantbody and uses thereof}
본 발명은 식물체의 개화기를 조절하는 EFG1 유전자 및 상기 유전자를 식물체에 과발현시키는 단계를 포함하는 식물체의 개화기를 조절하는 방법에 관한 것이다.
벼는 크게 영양생장기와 생식생장기라는 두 개의 과정을 거쳐 자신의 일생을 마감한다. 영양생장기는 벼의 몸체를 만드는 시기이고, 생식생장기는 2세를 위한 볍씨를 만드는 시기이다. 영양생장기는 육묘기와 분얼기로 나뉘고, 그 중간에 모내기 후의 활착기가 있다. 육묘기에는 씨앗의 영양분이 고갈되는 이유기(離乳期)가 있는데, 세 번째 잎이 완전히 형성된 뒤 네 번째 잎이 만들어지는 시기를 말한다. 모가 논에서 활착한 다음에는 분얼이 왕성하게 일어나는데, 영양생장기의 재배 목표는 왕성한 분얼에 있다. 분얼이란 땅속에 있는 벼의 마디에서 새 가지가 나오는 것을 의미한다. 생식생장기는 유수 분화기부터 성숙기까지의 기간을 말하는데, 출수기(이삭이 팼을 때)를 기점으로 앞에는 신장기, 뒤에는 결실기가 된다. 전기가 신장(伸長)기인 것은 이때가 되면 이삭 줄기의 마디 사이가 급신장하기 때문이다. 그리고 이제 벼는 육체 성장이 둔화되고, 이삭의 성장은 가속화되기 때문에 이때부터 잎이 만들어지는 기간은 두 배로 느려진다. 이 신장기에는 어린 이삭(유수)이 분화하면서 동시에 이삭의 줄기가 급신장하며, 후반부에는 꽃가루가 만들어지는 감수분열기(생식세포분열기)를 맞이하고 이때부터 이삭이 패기 전까지를 수잉기(穗孕期)라 한다.
영양 생장과 생식 생장은 개화 신호에 의해 두 가지 생장 간의 전환이 이루어진다. 이러한 개화 신호에는 식물체 내의 유전적 요인과 광주기, 빛의 세기와 같은 환경적 요인 등 다양한 요소가 영향을 미친다. 이러한 생장 전환의 결과 다양한 형태적 변화가 일어나므로, 개화 관련 기작에 대한 연구가 계속되고 있다.
본 발명자들은 작물의 출수기 및 영양 생장 조절방법에 관해 연구를 하던 중, 벼 유래 EFG1 유전자가 식물체의 개화 시기에 관련이 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
한국등록특허 제10-1651940호(2016.08.23 등록)
본 발명의 목적은 식물체의 개화기를 조절하는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 EFG11 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 식물체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유전자를 식물체에 과발현하는 단계를 포함하는 식물체의 개화기를 조절하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유전자를 포함하는 식물체의 개화기를 조절하기 위한 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명은 식물체의 개화기를 조절하는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 EFG1(Early flowering gene 1) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
상기 EFG1 유전자는 벼(oryza sativa L.)에서 분리한 것일 수 있다.
상기 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 유전자는 1083개의 뉴클레오티드로 이루어진다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 EFG1 유전자는 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 세트를 이용하여 PCR(Polymerase chain reaction) 증폭할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "출수기(出穗期)"란 화본과 식물에서 개화에 앞서 이삭목마디 사이가 신장하여 지엽의 잎집에서 이삭이 나오는 시기를 의미한다. 벼에서는 출수와 동시에 개화가 시작되기 때문에 이삭의 끝이 나온 때를 출수라고 정의한다. 따라서, 벼의 출수기는 벼의 개화시기와 동일한 의미를 가질 수 있다.
본 발명에 따른 상기 개화기의 조절은 조기 개화를 유도하여 식물체의 개화기를 단축시키는 것이다. 따라서, 상기 EFG1 유전자는 식물체의 개화기를 조절 또는 단축시키는 유전자일 수 있다.
상기 서열번호 1의 염기서열은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 EFG1 단백질을 암호화한다.
상기 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 EFG1 단백질은 361개의 아미노산으로 이루어진다.
상기 벡터는 EFG1 유전자를 과발현시키기 위한 재조합 벡터인 것이 바람직하다.
본 명세서에서 사용된 용어, "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
본 명세서에서 사용된 용어, "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "발현 벡터"는 흔히 "재조합 벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "재조합 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동 가능하게 연결된 코딩서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.
본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 재조합 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, pLλ 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다.
발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate), 글루포시네이트암모늄(glufosinate ammonium) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "항시발현(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포분화 하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 항시발현 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 항시발현 프로모터는 선택 가능성을 한정하지 않는다.
본 발명의 일 실시예에서는 pGA2897 벡터에 EFG1 유전자를 삽입하여 제조한 재조합 벡터 pGA2897EFG1을 예시하고 있으나, 본 발명은 이러한 특정 벡터에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 식물체를 제공한다.
상기 식물체는 단자엽 식물일 수 있고, 구체적으로 벼, 밀, 보리, 수수, 옥수수 및 기장으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있고, 벼인 것이 가장 바람직하나, 이에 제한되지 않는다. 식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및 (또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 식물 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, FA et al, 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I et al, June 1987, Plant Mol Biol 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito RD et al, 1985 Bio/Technol 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A et al, 1986, Mol Gen Genet 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein TM et al, 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.
본 발명의 벡터가 도입되는 식물 세포는 세포가 식물로 재생될 수 있는 한 특정한 형태로 특별히 제한되는 것은 아니다. 이들 세포는, 예를 들면, 배양된 세포 부유물, 원형질체(protoplast), 잎 절편(leaf section) 및 캘러스(callus)를 포함한다. 또한, 본 발명은 상기 방법에 따라 제조되고 조직 배양을 통해 재분화시킨 개화기가 단축된 식물체를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유전자를 식물체에 과발현시키는 단계를 포함하여 식물체의 개화기를 조절하는 방법을 제공한다.
상기 서열번호 1의 염기서열은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 EFG1 단백질을 암호화한다.
상기 유전자를 과발현하는 방법은 프로모터에 상기 유전자를 작동 가능하게 연결한 재조합 벡터로 식물체를 형질전환하는 단계를 포함하는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.
상기 방법에 의하면 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 유전자를 과발현시켜 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 EFG1 단백질의 세포 내 수준(level)을 높임으로써 식물체의 개화기를 조절할 수 있다.
상기 세포 내 수준이란 세포 내에 존재하는 양을 말하는 것으로, 이는 당업자에게 공지된 여러 방법으로 조절될 수 있다. 예를 들면, 세포 내 수준은 전사 단계에서의 조절 또는 전사 후 단계에서의 조절을 통해 이루어질 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 전사 단계에서의 조절은 당업자에게 공지된 유전자의 발현을 증진시키기 위한 방법, 예를 들면, 프로모터에 서열번호 1의 EFG1 유전자 또는 이들에 대한 상동 유전자를 연결한 재조합 발현벡터를 제조하여 상기 유전자의 발현을 증진시키는 방법 또는 서열번호 1의 EFG1 유전자 또는 이들에 대한 상동유전자의 주변에 상기 유전자의 발현이 증진되도록 하는 발현조절서열을 삽입하는 방법 등에 의해 수행될 수 있다. 전사 후 단계에서의 조절은 당업자에게 공지된 단백질 발현을 증진시키기 위한 방법, 예를 들면, 서열번호 1 또는 이의 기능적 동등물의 EFG1 유전자를 주형으로 전사된 mRNA의 안정성을 증진하는 방법, 단백질 또는 단백질의 안정성을 증진하는 방법 또는 단백질 또는 단백질의 활성을 증진하는 방법에 의해 수행될 수 있다.
상기 식물체는 단자엽 식물일 수 있고, 구체적으로 벼, 밀, 보리, 수수, 옥수수 및 기장으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있고, 벼인 것이 가장 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.
상기 방법은 식물체의 개화기를 촉진시키는 방법인 것이 바람직하다.
본 발명의 실시예에서, 본 발명자들은 EFG1 유전자가 포함된 재조합 벡터를 아그로박테리움에 도입시키고 상기 도입된 아그로박테리움을 이용하여 과발현 형질전환체 6계통을 확인하였다. 6계통의 EFG1 유전자 과발현 형질전환체를 수득해 개화기 모습을 확인한 결과, 대조구인 동진벼에 비하여 개화기가 평균 10일 이상 단축되었으며, 이들 중 3개 계통에 대하여 정밀 조사한 결과 모든 계통에서 10일 이상의 조기 개화를 확인하였다. 따라서, EFG1(Early flowering gene 1) 유전자의 과발현 형질전환체가 개화시기를 단축시키는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유전자를 포함하는 식물체의 출수기 및 생장을 조절하기 위한 조성물을 제공한다.
상기 서열번호 1의 염기서열은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 EFG1 단백질을 암호화한다.
상기 본 발명의 조성물은 유효 성분으로서 EFG1 유전자를 포함하며, 상기 유전자를 식물체에 형질전환시킴으로써 식물체의 개화기를 조절할 수 있다.
상기 식물체의 개화기 조절은 식물체의 개화 시기를 조절 또는 단축하는 방법인 것이다.
상기 식물체는 단자엽 식물일 수 있고, 구체적으로 벼, 밀, 보리, 수수, 옥수수 및 기장으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있고, 벼인 것이 가장 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 식물체의 개화기를 조절하는 유전자 및 이를 이용하여 식물체의 개화기를 조절하는 방법을 제공할 수 있다. 본 발명의 유전자를 이용하면 식물체의 개화기를 조절할 수 있으므로, 작물의 생산성 및 바이오매스 향상 등의 분야에서 활용될 수 있다.
도 1은 EFG1 유전자의 염기서열을 나타낸 것이다.
도 2는 EFG1 단백질 아미노산 서열 및 motif 분석을 나타낸 것이다.
도 3은 EFG1 단백질의 세포내 위치를 나타낸 것이다.
도 4는 대조구인 동진 벼와 EFG1 유전자 과발현 벼 형질전환체의 개화기 촉진 모습을 나타낸 것이다.
도 5는 대조구인 동진 벼(동진, Dongjin)와 EFG1 유전자 과발현 벼 형질전환체(형질전환체#5-8, #5-14, #5-15)의 초장, 간장 및 등숙율 등의 주요 농업형질을 비교한 것이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술한다. 다만, 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다.
<실시예 1>벼 유래 EFG1 유전자 분리
벼의 다양한 조직으로부터 cDNA를 분리하여 염기서열을 분석하였다. 이 중 아직까지 기능이 알려지지 않은 새로운 유전자를 발견하여 EFG1(Early flowering gene 1)로 명명하였으며, 이를 서열번호 1로 기재하고 이에 상응하는 아미노산 서열을 서열번호 2로 기재하였다(도 1).
EFG1 유전자를 분리하는 방법은 다음과 같다. 동진벼로부터 총 RNA를 trizol로 분리한 다음, 역전사 효소를 이용하여 총 RNA 5 ㎍로부터 30 ㎍의 cDNA를 합성하였다. 상기 합성한 cDNA로부터 EFG1-F(서열번호 3) 및 EFG1-R(서열번호 4)의 프라이머를 이용하여 EFG1 유전자의 coding 영역을 PCR로 증폭하였다. PCR 후 1% 아가로스젤(agarose gel)에 전기영동하여 PCR 산물을 확인하였고, Qiagen Gel extraction kit를 사용하여 DNA를 추출하여 pGEM-Teasy 벡터(Promega)에 클로닝하였다. 클로닝 후, forward 프라이머(서열번호 5)와 reverse 프라이머(서열번호 6), BigDye Terminator 31 (ABI)을 이용하여 목적 유전자인 EFG1의 염기서열을 분석하였다. 그 결과 EFG1 유전자는 NCBI GenBank Accession no AY333184.1의 유전자와 염기서열이 동일함을 확인하였다. 사용한 프라이머 정보는 하기 표 1에 나타내었다.
서열번호 프라이머 명칭 프라이머 방향 서열(5'→3')
3 EFG1 정방향 CACCATGGGAAATGACGAAG
4 EFG1 역방향 TTACCTTGCGGCTACAGCAT
5 M13F-pUC 정방향 GTTTTCCCAGTCACGAC
6 M13R-pUC 역방향 CAGGAAACAGCTATGAC
EFG1 유전자의 염기서열 및 아미노산 서열을 분석한 결과 1083 bp의 cDNA로 구성되며, 361개의 아미노산으로 구성된 단백질이다. 도메인 분석결과 bZIP 도메인을 갖고 있으며 G box binding 도메인을 갖고 있어 bZIP 전사인자의 일종으로 예상되며, EFG1 단백질의 세포내 위치를 결정한 결과 핵 내에 존재하는 것으로 관찰되어 전사인자로서 기능을 수행할 가능성이 높을 것으로 확인되었다(도 2, 도 3).
<실시예 2> EFG1 유전자 과발현 백터의 제작
식물체 형질전환을 위한 EFG1 과발현 벡터를 제작하였다.
구체적으로, EFG1-F 프라이머(서열번호 3)와 EFG1-R 프라이머(서열번호 4)를 이용하여 PCR(Polymerase chain reaction)을 수행해 1083 bp의 cDNA를 증폭하였다. PCR은 95 ℃ 30초, 55 ℃ 30초, 72 ℃ 1분을 30 사이클 수행하였다. 증폭된 cDNA는 pENTR-D-Topo에 클로닝한 후, gateway 방식으로 식물체 형질전환용 pEarleygate201 벡터에 클로닝하였다.
<실시예 3> EFG1 유전자 과발현 벼 형질전환체 제작 및 과발현 검정
상기 실시예 2에서 제작한 벡터를 Agrobacterium LBA4404 균주에 형질전환하고, 이를 이용해 벼의 형질전환을 하였다. 본 발명자들은 EFG1 유전자를 과발현하는 형질전환체를 제작하기 위하여 아그로박테리움 매개형질전환방법(Hiei et al 1994)을 이용하여 벼를 형질전환하였다.
구체적으로, 벼 형질전환에 사용하는 볍씨는 껍질을 벗긴 현미를 사용하였다. 볍씨를 70% 에탄올에서 1분간 침지시킨 후 50% 락스 용액 (락스 30 ml당 Tween 20 10 ㎕ 첨가)에서 40분 동안 소독하였다. 소독액을 모두 따라 버린 후 볍씨를 멸균수로 5회 세척하였다. 소독액이 잘 세척 된 후 여과지를 이용해 볍씨에서 물기를 제거한 뒤 2N6 배지에 볍씨를 치상하였다. 2N6 배지는 N6 배지(Chu et al., Scin Sin(1975) 18:659-668)에 다량원소, 미량원소와 비타민을 함유한 혼합물 4 g/L, 30 g/L sucrose, 0.5 g/L proline, 0.5 g/L glutamine, 0.3 g/L casamino acids, 0.01 g/L myo-inositol, 2 mg/L 2,4-D 및 4 g/L phytagel를 첨가한 고체 배지 (pH5.8)이다. 28 ℃로 처리하여 5일간 배양하였으며, 캘러스가 유도되면 배유를 제거하였다. 배유는 캘러스가 훼손되지 않도록 핀셋을 이용하여 조심스럽게 제거하며, 자엽과 뿌리 부분은 그대로 두어 캘러스가 훼손되는 것을 방지하였다. 형질전환시켜 둔 아그로박테리움을 AB 고체 배지에 3일간 배양한 후 AAM 액체 배지에 모아서 현탁액을 만들었다. 흡광도기계를 이용하여 현탁액의 농도를 측정하며 먼저 OD595=0.1이 되도록 만든 후 AAM으로 10배 희석하여 OD595=0.01이 되도록 만들었다. 상기 아그로박테리움 현탁액에 배유를 제거한 캘러스를 2분 동안 침지하고 부드럽게 용액을 흔들어 아그로박테리움을 접종하였다. 접종이 끝나면 캘러스에서 현탁액만을 따라 버리며 여과지를 이용하여 여액을 제거하였다. 이 작업은 신속히 진행하며 캘러스가 지나치게 여과지 위에 오래 방치되어 마르지 않도록 주의하였다. 2N6 배지에 10 g/L 글루코오스 및 100 μM acetosyringone을 추가하여 pH를 5.2로 조정한 2N6-AS 배지 위에 미리 여과지를 한 장씩 깔아놓아서 충분히 배지 성분이 스며들게 한 다음, 상기 캘러스를 여과지 위에 올려놓아 25 ℃에서 7일간 암 조건에서 공동배양하였다. 여과지는 공동배양 기간 동안 아그로박테리움이 과도하게 성장하여 캘러스가 물러지는 현상을 방지하기 위한 것이다. 공동배양 후 선택적으로 아그로박테리움을 멸균증류수 1L에 항생제인 카르베니실린(carbenicillin)을 500 mg을 넣은 용액으로 세척하여 제거할 수 있으나, 아그로박테리움 LBA4404 균주를 사용하는 경우에는 공동배양 기간 동안 아그로박테리움의 과도한 성장이 이루어지지 않았기 때문에 세척 작업을 하지 않는 것이 더 바람직하다. 그 후 캘러스를 2N6 배지에 항생제인 세포탁심(cefotaxime) 200mg/L, 하이그로마이신(Hygromycin) 40mg/L가 첨가된 2N6-CH 배지로 옮겼다. 이때 핀셋을 이용하여 자엽과 뿌리 부분을 제거하며 캘러스는 2-3조각으로 나누어 배지와 닿는 면적이 최대가 되도록 옮겨 배양하였다. 배양온도는 28 ℃가 적당하며 암배양기에서 14일 동안 배양하여 형질전환된 캘러스를 유도하였다. 배양 14일 후, 항생제인 하이그로마이신이 첨가된 2N6-CH 배지에서 형질전환된 캘러스가 분열하면서 성장하면 슈트와 뿌리를 유도할 수 있는 재분화 배지인 MSR 배지로 계대배양하였다. 형질전환된 캘러스의 구분은 새롭게 분화된 캘러스 덩어리의 유무로 판단하며 갈변되어 죽은 캘러스는 버렸다. MSR 재분화 배지에서 성장한 유 식물체는 수도용 상토로 옮겨 온실에서 생육하였다. 형질전환체 유무는 온실에서 한 달간 키운 벼의 잎을 동결건조시켜 파쇄한 후 이로부터 DNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)를 이용하여 Genomic DNA를 분리하였다. 분리한 Genomic DNA 및 하기 표 2의 하이그로마이신 유전자 프라이머(서열번호 7과 8)를 이용하여 PCR를 수행하여 EFG1 유전자와 함께 삽입된 하이그로마이신 유전자의 삽입을 확인함으로써 EFG1 유전자의 삽입 여부를 확인하여 EFG1 과발현 형질전환체를 선발하였다. 그리고 형질전환체에서 EFG1 유전자의 과발현을 검정하였다. 그 결과, EFG1 유전자가 과발현된 벼 형질전환체를 확보하였다.
서열번호 프라이머 명칭 프라이머 방향 서열(5'→3')
7 Hygromycin F 정방향 CGACGTCTGTCGAGAAGTTT
8 Hygromycin R 역방향 CTATTCCTTTGCCCTCGGAC
<실시예 4> EFG1 유전자 과발현 형질전환체의 출수기 단축 효과 검정
상기 실시예 3에서 제작한 EFG1 유전자 과발현 벼 형질전환체의 출수기 단축 효과를 확인하기 위한 실험을 하였다.
구체적으로, EFG1 유전자 과발현 벼 형질전환체 6계통과 대조구인 동진벼를 출수날짜별로 비교 조사하였다.
그 결과, EFG1 과발현 벼의 출수기(개화기)까지 소요되는 기간이 대조구인 동진벼에 비하여 평균 10 일 정도 단축되는 것을 확인할 수 있었다(표 3).
동진벼와 과별현 형질전환 벼의 출수기 비교
날짜 동진(대조구)
(출수개체수/
전체계체수)		 형질전환체#8
(출수개체수/
전체계체수)		 형질전환체#14
(출수개체수/
전체계체수)		 형질전환체#15
(출수개체수/
전체계체수)
2016.08.01 -/58 -/25 5/25 15/32
2016.08.04 -/58 10/25 11/25 32/32
2016.08.08 -/58 10/25 24/25 32/32
2016.08.06 3/58 25/25 25/25 32/32
2016.08.18 32/58 25/25 25/25 32/32
2016.08.22 58/58 25/25 25/25 32/32
<실시예 5> EFG1 유전자 과발현 형질전환체의 농업형질 검정
상기 실시예 3에서 제작한 EFG1 유전자 과발현 형질전환체 벼의 주요 농업형질을 조사하였다.
구체적으로, 실시예 4에서 사용한 형질전환 식물체와 대조구인 동진벼의 수확 직전 초장, 간장 및 등숙율을 측정하여 비교하였다(도 5).
그 결과, EFG1 과발현 벼는 대조구인 동진벼와 초장, 간장 및 등숙율 등의 농업형질은 동진과 유사하나, 이삭 수 및 총 종자 무게가 최대 15% 정도 감소하였으며, 이삭 수가 감소하여 종자무게가 감소한 것을 확인할 수 있었다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> EFG1 gene for regulating flowering date of plantbody and uses thereof <130> DP20190264 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1083 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 1 atgggaaatg acgaagctgt agttactcag aagatgggga aagcaccatc gccccctaag 60 gatcatccag cccttagtcc ataccttgat tggtcaaata tgcaggcata ttacggccca 120 gggatcttgc caccaacatt ttttagccct ggaatagccg ctggtcatac ccctcctcca 180 tttatcttgg gtcctcagcc tctggtgcca tccgcttttg ggaagccata tgccgcaatt 240 tatcctcctg gtggagcttt ttcacatccg ttcatgcccc taatggtgag cccattgagc 300 atggagccag caaagtctgt caacagcaag gatagctgtt caaataagaa aatgaaggaa 360 attgatggtg cggctgtgtc aactggcagt ggcaacagtg aaaaaacaag tggagattgc 420 agcttagaag gatccagtga tggaaacaac cagaaggcaa gtggaactcc caagaaaagg 480 agcatagatg ataggcctaa atcaggcgtg gaaactggtg gagctttaac acctaatgat 540 agacctagcg aacaagcagc tttgccaaat ctatgcattc cggttacagc aatcaaacca 600 gacgtgagca ctgctagtga cttcagagtt attgccaccc cagtaactga agtgccaact 660 aaggatgata aggaatcgaa gcgcgagaga aggaagcaat caaacaggga gtctgctcgg 720 aggtcaaggt tgaggaagca ggccgagact gaggaactgg ctagaaaagt tgagctattg 780 actgcggaga acacatccct tagacgtgaa ataagcaggc taacggaaag ctccaagaaa 840 cttagattag agaattctgc tctaatggag aaactaacgg aaaccgggcc tgatgaagca 900 caagaagtgc ctccagtcaa aacaaaagca cagcaagctc gaggcgtcga aaatttcctg 960 tcaatgatag acaagactgg cacgccgaga agcagcgggc acatggatca tgccattgcc 1020 acgcccaagc ttcgtcaact cctgggctct ggtctggcga ctgatgctgt agccgcaagg 1080 taa 1083 <210> 2 <211> 360 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 2 Met Gly Asn Asp Glu Ala Val Val Thr Gln Lys Met Gly Lys Ala Pro 1 5 10 15 Ser Pro Pro Lys Asp His Pro Ala Leu Ser Pro Tyr Leu Asp Trp Ser 20 25 30 Asn Met Gln Ala Tyr Tyr Gly Pro Gly Ile Leu Pro Pro Thr Phe Phe 35 40 45 Ser Pro Gly Ile Ala Ala Gly His Thr Pro Pro Pro Phe Ile Leu Gly 50 55 60 Pro Gln Pro Leu Val Pro Ser Ala Phe Gly Lys Pro Tyr Ala Ala Ile 65 70 75 80 Tyr Pro Pro Gly Gly Ala Phe Ser His Pro Phe Met Pro Leu Met Val 85 90 95 Ser Pro Leu Ser Met Glu Pro Ala Lys Ser Val Asn Ser Lys Asp Ser 100 105 110 Cys Ser Asn Lys Lys Met Lys Glu Ile Asp Gly Ala Ala Val Ser Thr 115 120 125 Gly Ser Gly Asn Ser Glu Lys Thr Ser Gly Asp Cys Ser Leu Glu Gly 130 135 140 Ser Ser Asp Gly Asn Asn Gln Lys Ala Ser Gly Thr Pro Lys Lys Arg 145 150 155 160 Ser Ile Asp Asp Arg Pro Lys Ser Gly Val Glu Thr Gly Gly Ala Leu 165 170 175 Thr Pro Asn Asp Arg Pro Ser Glu Gln Ala Ala Leu Pro Asn Leu Cys 180 185 190 Ile Pro Val Thr Ala Ile Lys Pro Asp Val Ser Thr Ala Ser Asp Phe 195 200 205 Arg Val Ile Ala Thr Pro Val Thr Glu Val Pro Thr Lys Asp Asp Lys 210 215 220 Glu Ser Lys Arg Glu Arg Arg Lys Gln Ser Asn Arg Glu Ser Ala Arg 225 230 235 240 Arg Ser Arg Leu Arg Lys Gln Ala Glu Thr Glu Glu Leu Ala Arg Lys 245 250 255 Val Glu Leu Leu Thr Ala Glu Asn Thr Ser Leu Arg Arg Glu Ile Ser 260 265 270 Arg Leu Thr Glu Ser Ser Lys Lys Leu Arg Leu Glu Asn Ser Ala Leu 275 280 285 Met Glu Lys Leu Thr Glu Thr Gly Pro Asp Glu Ala Gln Glu Val Pro 290 295 300 Pro Val Lys Thr Lys Ala Gln Gln Ala Arg Gly Val Glu Asn Phe Leu 305 310 315 320 Ser Met Ile Asp Lys Thr Gly Thr Pro Arg Ser Ser Gly His Met Asp 325 330 335 His Ala Ile Ala Thr Pro Lys Leu Arg Gln Leu Leu Gly Ser Gly Leu 340 345 350 Ala Thr Asp Ala Val Ala Ala Arg 355 360 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EFG1-forward <400> 3 caccatggga aatgacgaag 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EFG1-reverse <400> 4 ttaccttgcg gctacagcat 20 <210> 5 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M13F-pUC-forward <400> 5 gttttcccag tcacgac 17 <210> 6 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M13F-pUC-reverse <400> 6 caggaaacag ctatgac 17 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hygromycin_forward <400> 7 cgacgtctgt cgagaagttt 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hygromycin-reverse <400> 8 ctattccttt gccctcggac 20

Claims (10)

  1. 식물체의 개화기를 단축시키는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 EFG1(Early flowering gene 1) 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 EFG1 유전자는 벼에서 분리한 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  3. 삭제
  4. 제1항의 재조합 벡터로 형질전환된 식물체.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 식물체는 벼, 밀, 보리, 수수, 옥수수 및 기장으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 식물체.
  6. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유전자를 식물체에 과발현하는 단계를 포함하는, 식물체의 개화기를 단축시키는 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 유전자를 과발현시키는 방법은 프로모터에 상기 유전자를 작동 가능하게 연결한 재조합 벡터로 식물체를 형질전환하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 식물체의 개화기를 단축시키는 방법.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 식물체는 벼, 밀, 보리, 수수, 옥수수 및 기장으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 식물체의 개화기를 단축시키는 방법.
  9. 삭제
  10. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유전자를 포함하는 식물체의 개화기를 단축시키기 위한 조성물.
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