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KR101676622B1 - 재조합 항-표피 성장 인자 수용체 항체 조성물 - Google Patents

재조합 항-표피 성장 인자 수용체 항체 조성물 Download PDF

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KR101676622B1
KR101676622B1 KR1020097020519A KR20097020519A KR101676622B1 KR 101676622 B1 KR101676622 B1 KR 101676622B1 KR 1020097020519 A KR1020097020519 A KR 1020097020519A KR 20097020519 A KR20097020519 A KR 20097020519A KR 101676622 B1 KR101676622 B1 KR 101676622B1
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찰스 피케
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심포젠 에이/에스
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Abstract

본 발명은 인간 암 요법에 사용하기 위한 재조합 항체 분야에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 인간 EGFR에 결합할 수 있는 항체의 조성물 또는 혼합물을 제공한다. 3개 이상의 항체를 갖는 항체 조성물은 대표적 암 세포주의 증식 감소에 있어서 상승작용을 나타낸다. 또한, 동물 모델에서 신속하고 효과적인 수용체 내재화, 최종 분화의 유도 및 이후의 종양 근절에 기초한 신규한 작용 메커니즘을 나타내는 2개의 상이한 키메라 항-hEGFR 항체를 포함하는 조성물을 이용하여 이로운 결과가 수득되었다. 본 발명의 항체는 폴리클로날 항체로서 하나의 생물 반응 장치에서 제조될 수 있다.

Description

재조합 항-표피 성장 인자 수용체 항체 조성물{RECOMBINANT ANTI-EPIDERMAL GROWTH FACTOR RECEPTOR ANTIBODY COMPOSITIONS}
본 발명은 인간 암 요법에 사용하기 위한 재조합 항체 분야에 관한 것이다.
표피 성장 인자 수용체(EGFR)는 세포 증식 뿐만 아니라 종양 발달에 중요한 과정인 아폽토시스, 혈관신생 및 전이 확산(metastatic spread)에서 중요한 역할을 한다(Salomon et al, Crit. Rev. Oncology/Haematology, 19:183-232 (1995); Wu et al, J. Clin. Invest., 95:1897-1905 (1995); Karnes et al, Gastroenterology, 114:930-939 (1998); Woodburn et al, Pharmacol. Therap. 82: 241-250 (1999); Price et al, Eur. J. Cancer, 32A:1977-1982 (1996)). 이뿐 아니라, 여러 연구에서 EGFR-매개 세포 성장이 비소세포폐암, 전립선암, 유방암, 위암 및 두경부암의 종양을 포함하는 다양한 고형 종양에서 증가되는 것으로 밝혀졌다(Salomon DS et al, Critical Reviews in Oncology/Haematology, 19:183-232 (1995)). 또한, 암세포 표면에서의 EGFR의 과도한 활성화는 질병 진행, 암 환자에서의 전이성 표현형의 발달 및 불량한 예후와 관련되는 것으로 현재 공지되어 있다(Salomon DS et al., Critical Reviews in Oncology/Haematology 19:183-232 (1995)).
또한, EGFR 발현은 종종 EGFR-리간드, TGF-알파 및 EGF의 생성을 특히 수반 하고, EGFR-발현 종양 세포를 수반하며, 이는 상기 세포의 발달에 자가분비 고리(autocrine loop)가 관여하는 것을 암시한다(Baselga, et al.(1994) Pharmac. Therapeut. 64: 127-154; Modjtahedi, et al. (1994) Int. J. Oncology. 4: 277-296). 따라서, 상기 EGFR 리간드와 EGFR 사이의 상호작용을 차단(block)하는 것은 종양 성장 및 생존을 억제할 수 있다(Baselga, et al. (1994) Pharmac. Therapeut. 64: 127-154).
EGFR은 약 170 kDa의 분자량을 갖는 막 결합 당단백질이다. EGFR은 짧은 23개의 아미노산 막횡단 링커에 의해 연결된 당화된 외부 리간드-결합 도메인(621개의 잔기) 및 세포질 도메인(542개의 잔기)로 구성된다. EGFR의 세포외 부분은 25개의 이황화 결합 및 12개의 N-결합된 당화 부위를 함유하고, 이는 일반적으로 4개의 서브-도메인으로 구성되는 것으로 생각된다. EGFR의 X-선 결정 구조는 수용체가 EGF에 결합할 수 없는 자가억제된 구속(tethered) 형태(Ferguson et al, Mol Cell, 2003, vol 11: 507-517) 및 EGF 리간드 결합 및 수용체 이합체화를 매개할 수 있는 활성 형태(Garret et al, Cell 2002, vol 110:763-773; Ogiso et al, Cell, 2002, vol 110:775-787) 둘 모두를 채택함을 암시한다. 특히, 도메인 Ⅰ 및 도메인 Ⅲ는 고친화성 리간드 결합 부위 형성에 추가적인 기여를 제공하는 것으로 암시되었다. 도메인 Ⅱ 및 Ⅳ는 단백질 폴딩을 안정화시키고 가능한 EGFR 이합체화 계면을 함유하는 시스테인-부화(rich) 라미닌-유사 영역이다.
EGFR은 세포 표면 상에서 다수의 다양한 형태로 존재하는 것으로 공지되어 있으며, 여기서 구속된 형태 또는 폐쇄(locked) 형태가 가장 흔하다. 구속된 형태 는 이합체화 시킬 수 없으며, 이에 따라 비활성이다. 치료 항체 에르비툭스(Erbitux)는 구속되지 않은 상태에 도달하는 경우 도메인 Ⅲ에 결합하고 수용체를 입체적으로 방해함으로써 구속된 형태를 안정화시키는 것으로 공지되어 있다. 그러나, 몇몇 수용체는 여전히 구속되지 않은 형태를 채택하고, 리간드에 결합하고, 이합체화시킬 수 있다. 모노클로날 항체(mAb)는 통상적으로 형태 중 하나에 대한 결합에서만 효과적이고, 이에 따라 다른 형태를 나타내는 암 세포 또는 다양한 형태를 나타내는 암 세포를 효과적으로 표적으로 할 수 없을 것이다.
EGFR의 리간드-결합 도메인에 특이적인 모노클로날 항체(mAb)는 EGFR 리간드와의 상호작용을 차단할 수 있고, 부수적으로, 발생되는 세포내 신호전달 경로를 차단할 수 있다.
에르비툭스(Erbitux™)(세툭시맙(Cetuximab))는 인간의 세포외 도메인(EGFR)에 특이적으로 결합하는 재조합 인간/마우스 키메라 모노클로날 항체이다. 에르비툭스는 인간 IgG1 중쇄 및 카파 경쇄 불변 영역을 갖는 뮤린 항-EGFR 항체의 Fv 영역으로 구성되고, 이는 약 152 kDa의 분자량을 갖는다. 에르비툭스는 포유동물 세포 배양(뮤린 골수종)에서 생성된다. 에르비툭스는 전이성 직장결장암에 걸리고, 종양이 EGFR을 발현하는 환자의 치료에 대해 승인되어 있다. 또한, 에르비툭스는 수술에 의해 제거될 수 없는 두경부의 편평세포암에 걸린 환자를 치료하기 위한 방사선 요법과 조합하여 사용되거나, 표준 백금-기재 요법에 실패한 두경부의 편평세포암의 2차 치료로서 사용된다.
벡티빅스(Vectibix™)(파니투무맙(panitumumab))는 인간 EGFR에 특이적으로 결합하는 재조합 인간 IgG2 카파 모노클로날 항체이다. 벡티빅스는 약 147 kDa의 분자량을 갖는다. 파니투무맙은 유전공학처리된 포유동물 세포(차이니즈 햄스터 난소)에서 생성된다. 벡티빅스는 플루오로피리미딘-, 옥살리플라틴-, 및 이리노테칸-함유 화학요법 치료 시에 또는 이 이후에, 전이성 직장결장암에 걸리고, 질병이 진행됨에 따라 종양이 EGFR을 발현하는 환자의 치료에 대해 승인되어 있다.
인간 종양 세포에 대해 다수의 돌연변이 EGF 수용체가 확인되어 있다. 이들은 수용체 활성이 리간드 결합(EGFRvⅢ)과는 독립적이 되도록 하고, 이는 종양유발성(tumorigenicity)을 향상시킨다. 돌연변이 EGFR에 대한 모노클로날 항체가 생성될 수 있으나, 이러한 모노클로날 항체는 돌연변이되지 않은 EGFR에 대해 반드시 효과적이지는 않을 것이다.
EGFR에 특이적인 화학요법에 대한 반응에 영향을 주는 EGFR의 돌연변이가 인간 암 환자에서 확인되었다. WO 2006/110478호(Novartis)에는 EGFR 열린해독틀에서 43개의 돌연변이 뿐만 아니라 18개의 SNP가 기재되어 있다. 2개 이상의 유형의 종양 유형에서 몇몇 미스센스(missense) 돌연변이가 확인되어 있다. WO 2006/091899호(Amgen)에는 다양한 암세포에서 확인된 8개의 추가의 돌연변이가 기재되어 있다. 이러한 돌연변이 중 하나 이상은 에피토프에 위치될 수 있으며, 현재 승인된 모노클로날 항체 중 하나에 의해 결합되는 에피토프의 구조에 영향을 줄 수 있다. 이러한 돌연변이(들)을 갖는 환자는 모노클로날 항체에 의해 치료되지 않을 것이다.
또한, 하나 이상의 당화 부위의 당화에서의 이질성(heterogeneity)이 문헌에 보고되어 있다(Whitson et al., 2005 Biochemistry 44:14920-31; Zhen et al. 2003 Biochemistry 42; 5478-92). 이러한 이질성은 직간접적으로 종양 세포 사이에서 다양한 에피토프의 차별적 노출을 발생시킬 수 있다.
항체 의존 세포성 세포독성(ADCC)는 항체가 종양 세포의 사멸을 매개하는 대안적 메커니즘이다. ADCC의 수준은 IgG 서브타입(IgM>IgG1 >IgG2), 표적 세포에 대한 항체 밀도, 항체 당화 패턴 뿐만 아니라 표적 자체의 특성을 포함하는 여러 요인에 의존적이다.
문헌[Friedmann et al (PNAS 2005, 102:1915-20)]에는 별개의 EGFR 에피토프의 결합에 의한 EGFR에 대한 EGF의 결합을 억제하는 능력에 대해 선택된 2개의 뮤린 모노클로날 항체가 EGFR을 일시적으로 발현하는 KB 세포 및 CHO 세포에서 수용체 발현을 상승작용적으로 하향 조절할 수 있는 것이 밝혀져 있다. 교차 경쟁 EGF 억제 항체는 임의의 상승작용을 나타내지 않았다.
문헌[Modjtahedi et al (Cell Biophysics vol 22, 1993, 129-146)]에서는 여러 래트 항-EGFR 항체와 비-중첩 에피토프의 조합을 시험하였다. 항체는 상이한 동형(isotype)이었다. 모든 경우에서, 2개의 항체를 이용한 효과는 유사한 양의 2개의 모노클로날 항체 단독을 이용한 효과의 중간이었다. 이는 생체내 및 시험관내 둘 모두에서 입증되었다.
WO 2004/032960호(Merck Patent)에는 2개의 모노클로날 항체 Mab425 및 Mab225(Cetuximab)의 조합 용도가 유사한 양의 각각의 모노클로날 항체 단독에 비해, EGFR 발현 암 세포의 표면에 결합되는 항체의 양을 증가시키는 것이 기재되어 있다. 상기 간행물에는 또한 2개의 모노클로날 항체에 비해 항체의 조합물을 이용하는 경우의 EGFR의 증가된 하향 조절이 기재되어 있다.
문헌[Perera et al (Clin Cancer Res 2005; 11 (17):6390-99)]에는 2개의 뮤린 모노클로날 항체의 조합물을 이용한 U87MG.de2-7 이종이식편을 지니는 마우스 치료의 상승작용적 효과가 기재되어 있다. 항체 중 하나(mAb 528)는 세툭시맙(cetuximab)에 대해 유사한 특이성으로 모든 EGFR 서브타입에 결합하였다. 다른 하나(mAB 806)는 de2-7 EGFR에만 결합하였다. U87MG.de2-7 세포주는 de2-7EGFR 트랜스펙션된 세포주이다. U87MG.DK 세포주는 de2-7 EGFR의 키나아제 비활성 변이체를 발현한다. U87MG.DK 이종이식편을 지니는 마우스에 대해 2개의 항체가 사용되는 경우 상승작용이 관찰되지 않았다. 야생형 EGFR을 발현하는 A431 세포주를 갖는 이종이식 모델에서, 상기 문헌의 저자는 상승작용의 증거를 제시하지 않았다. de2-7 EGFR은 신경아교종, 다소의 유방암 및 폐암과 같은 제한된 수의 암 유형에만 존재한다.
이러한 연구들은 일부 경우에 2개의 뮤린 모노클로날 항체 사이에 상승작용이 존재할 수 있음을 나타내나, 이는 또한 다수의 경우에 상승작용이 관찰되지 않는 것을 나타낸다. 상기 연구들은 또한 광범위한 임상적으로 관련된 암 세포주에 대해 효과적인 항-EGFR 항체 조성물을 제공하지 않는다.
따라서, 낮은 투여량으로 투여되는 경우 EGFR의 과발현과 관련된 질병의 치료 및/또는 예방에 효과적인, EGFR에 대한 개선된 치료 항체가 필요하다. 또한, 당해 암 세포에 의해 발현되는 EGFR의 구조에 관한 자세한 지식을 소유하지 않고도 사용될 수 있는 광범위하게 적용가능한 암 치료 항체가 필요하다.
발명의 개요
한 양태에서, 본 발명은 3개 이상의 별개의 항-EGFR 항체 분자를 포함하는 재조합 항체 조성물에 관한 것으로, 상기 항체는 EGFR의 별개의 제 1, 제 2 및 제 3 에피토프에 결합한다.
한 추가 양태에서, 본 발명은 2개 이상의 별개의 EGFR 항체 분자를 포함하는 재조합 항체 조성물에 관한 것으로, 하나의 별개의 항-EGFR 항체 분자는 항체 992, 1024, 1030, 1042, 1208, 1229, 1254, 1257, 1260, 1261, 1277, 1284, 1308, 1320, 1344 및 1347, 또는 이러한 항체의 CDR을 갖는 항체로 구성된 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, 하나 이상의 별개의 항-EGFR 항체 분자는 항체 992, 1030, 1024, 1347, 1277, 1254, 1320, 1260, 1261 및 1284, 또는 이러한 항체의 CDR을 갖는 항체로 구성된 군으로부터 선택된다. 본 발명의 한 특히 바람직한 구체예에서, 항체 조성물은 항체 992 및 1024, 또는 이들의 CDR3 서열 또는 이들의 VL 및 VH 서열에 기초한 2개의 항체를 포함하거나, 본질적으로 동일한 결합 특이성을 갖는 2개의 항체를 포함한다.
본 발명의 대표적인 항체 조성물은 대표적인 암 세포주의 증식 억제에 효과적인 것으로 입증되었으며, 이는 암 치료에서의 생체내 용도를 나타낸다. 이러한 결과는 암세포가 종양을 형성하는 생체내의 상황에서 더욱 나타날 수 있는 암 세포 구상체(spheroid)를 이용한 검정에서 입증되었다. 또한, 본 발명의 항체 조성물은 암 구상체로부터의 세포 운동성(motility)을 감소시켜, 전이를 형성하는 경향을 감소시키는 것으로 보인다. 이종이식 모델에서의 생체내 효능이 또한 대표적인 항체 조성물을 이용하여 입증되었다. 이러한 결과는 항체 992 및 1024로 구성된 특히 바람직한 항체 조성물을 이용하여 입증되었다.
마우스에서의 인간 암의 이종이식 모델에서, 본 발명의 대표적인 항체 조성물은 시판되는 모노클로날 항체 벡티빅스(Vectibix) 및 에르비툭스(Erbitux)에 비해, 현저하게 높은 정도의 종양 세포의 최종 분화(terminal differentiation)를 발생시켰다. 본 발명의 바람직한 항체 조성물은 본 발명의 항체 조성물을 이용한 치료 종료 후에 종양 재성장이 관찰되지 않음에 따라 모노클로날 항체에 비해 다양한 작용 메커니즘을 통해 작동하는 것으로 보인다. 종양 재성장은 모노클로날 항체를 이용한 치료의 종료 후에 관찰된다.
결합 연구에서, 본 발명자들은 본 출원에 제공된 항체의 일부가 추가 항체의 결합을 촉진함으로써, 수용체에 결합하는 항체의 전체 양을 증가시키는 것을 입증하였다. 또한, 3개의 결합 도메인 Ⅲ 항체가 추가 항체의 이후의 결합을 촉진하는 것이 입증되었다. 이러한 관찰은 3개 이상의 별개의 항-EGFR 항체 분자를 갖는 조성물을 이용하는 개념을 명백하게 뒷받침하며, 여기서 상기 항체는 EGFR의 별개의 제 1, 제 2 및 제 3의 에피토프에 결합한다. 상기 효과는 또한 이러한 특정 효과를 제공하는 항체를 선택함으로써 본 발명의 2개의 항체의 특정 조합물을 이용하여 수득될 수 있다. 이러한 항체는 다른 항체와 혼합하기 위한 바람직한 후보자이다.
본 발명의 조성물은 여러 추가의 장점을 제공할 수 있다. 암세포는 다양한 EGFR을 발현한다. 형태, 당화 및 일차 구조에서 변이가 관찰된다(돌연변이 및 SNP). 단일한 모노클로날 항체는 상기 EGFR 변이체의 일부를 표적으로 할 수 있으나, 상기 모든 EGFR 변이체를 표적으로 하지는 않는다. EGFR 돌연변이는 모노클로날 항체에 대해 회피 돌연변이(escape mutation)가 될 수 있다. 본 발명의 2개의 항체 또는 별개의 EGFR 에피토프에 결합하는 3개 이상의 별개의 항체를 포함하는 항체는 돌연변이, SNP, 결실 돌연변이 및 당화의 변이에 덜 민감하다. 이는 다양한 EGFR 형태 및 변이체를 나타내는 인간 암 세포주의 패널(panel)에 대한 본 발명의 항체 혼합물의 광범위한 효능에 의해 입증된다.
하나의 모노클로날 항체의 투여는 또한 EGFR의 키나아제 활성을 완전히 차단할 수 없다. 신호전달의 보다 효과적인 억제는 항체의 조합물에 의해 달성될 수 있다.
따라서, 항체 혼합물에서 다양한 EGFR 형태(예를 들어, 구속되지 않은 형태 및 수용체 이합체)에 결합하는 항체를 포함시키는 것이 이로울 수 있다. 이러한 항체의 혼합물은 EGFR 활성의 억제에 있어서 형태 중 하나에만 결합하는 모노클로날 항체보다 더욱 효능이 있을 수 있다.
또한, 조성물에서 3개 이상의 항-EGFR 항체를 이용한 접근법을 이용함으로써, 종양 세포 표면 상에서 항체의 밀도를 상승시킴으로써, 모노클로날 항체에 비해 ADCC를 통한 사멸을 증가시키는 것이 가능할 수 있다.
한 추가 양태에서, 본 발명은,
(a) 진핵 세포의 제 1 집단을 제 1의 별개의 EGFR 에피토프에 결합할 수 있는 VH 및 VL 사슬의 제 1의 동족체 쌍(cognate pair)을 포함하는 제 1의 항체를 코딩하는 제 1의 발현 작제물로 트랜스펙션시키고;
(b) 진핵 세포의 제 2 집단을 제 2의 별개의 EGFR 에피토프에 결합할 수 있는 VH 및 VL 사슬의 제 2의 동족체 쌍을 포함하는 제 2의 항체를 코딩하는 제 2의 발현 작제물로 트랜스펙션시키고;
(c) 제 3 또는 추가의 집단, 발현 작제물, 동족체 쌍, 및 EGFR 에피토프에 대해 상기 단계 (b)를 임의로 반복하고;
(d) 트랜스펙션된 제 1, 제 2 및, 임의로 추가의 세포 집단을 선택하고;
(e) 상기 트랜스펙션된 집단을 하나의 용기(pot)에서 조합시켜 세포 뱅크(bank)를 수득하고;
(f) 상기 항체의 발현을 허용하는 조건하에서 상기 세포 뱅크로부터 세포를 배양하고;
(g) 상기 상층액으로부터 항체 조성물을 회수하고, 정제하는 것을 포함하는, 항체 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
용이한 제조, 하류 공정 및 특성규명을 위해 모든 항체는 동일한 중쇄 불변 영역을 포함한다.
한 추가 양태에서, 본 발명은 각각이 별개의 EGFR 에피토프에 결합할 수 있는 VH 및 VL 사슬의 동족체 쌍을 포함하는 항체를 코딩하는 하나의 발현 작제물로 트랜스펙션되거나 형질도입된 하위-집단인, 진핵 세포의 2개 이상의 하위-집단을 포함하는 세포 뱅크에 관한 것이다. 바람직하게는, 세포는 부위 특이적 통합을 이용하여 트랜스펙션된다.
또한, 본 발명은 EGFR 발현 세포의 조성물에 본 발명의 항체 조성물을 투여하여, EGFR 신호전달을 감소시키는 것을 포함하는, EGFR 신호전달을 감소시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 EGFR을 발현하는 세포의 조성물에 본 발명의 항체 조성물을 투여하여, EGFR 발현 세포를 사멸시키는 것을 포함하는, EGFR 발현 세포를 사멸시키는 방법에 관한 것이다.
EGFR 발현 세포의 조성물에 본 발명의 항체 조성물을 투여함으로써 아폽토시스를 유도하는 것을 포함하는, EGFR 발현 세포에서 아폽토시스를 유도하는 방법이 또한 제공된다.
한 추가 양태는 EGFR 발현 세포의 조성물에 본 발명의 항체 조성물을 투여함으로써 증식을 억제하는 것을 포함하는, EGFR 발현 세포의 증식을 억제하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 암에 걸린 개체에 본 발명의 항체 조성물을 투여함으로써, 종양 세포의 분화를 유도시키는 것을 포함하는, 생체내에서 종양 세포의 분화를 유도하는 방법에 관한 것이다. 이러한 양태는 본 발명의 항체 조성물에 노출되는 경우의 암 세포의 생체내 최종 분화에 대해 관찰된 효과를 기초로 한다.
한 추가 양태에서, 본 발명은 암 요법에서 동시, 별개 또는 연속 투여를 위한 조합물로서, 본 발명의 항체 조성물 및 암 세포의 분화를 유도할 수 있는 하나 이상의 화합물을 포함하는 약제 물품에 관한 것이다. 본 발명의 항체 조성물과 암 세포의 최종 분화를 유도하는 것으로 공지된 작용제를 조합함으로써, 효과가 추가로 개선될 수 있다.
한 추가 양태에서, 본 발명은 암 요법에서 동시, 별개 또는 연속 투여를 위한 조합물로서, 본 발명의 항체 조성물 및 하나 이상의 화학요법 또는 항신생물 화합물을 포함하는 약제 물품에 관한 것이다. 본 발명의 항체 조성물은 2차 치료, 즉, 통상적인 화학요법제 또는 항신생물제를 이용한 치료 후 또는 이와 동시에, 또는 방사선 요법 및/또는 수술 후 또는 이와 동시에 사용될 수 있다.
한 별개의 양태에서, 도 23에 도시된 핵산 서열(서열 목록 번호:100)을 갖는 핵산; 도 23에 도시된 아미노산 서열(서열 목록 번호:101)을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산; 도 34A에 도시된 핵산 서열(서열 목록 번호:102)을 갖는 핵산; 및 도 34B에 도시된 아미노산 서열(서열 목록 번호:103)을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산으로 구성된 군으로부터 선택된 폴리누클레오티드가 제공된다. 또한, 도 23에 도시된 아미노산 서열(서열 목록 번호:101)을 포함하는 폴리펩티드 및 도 34B에 도시된 아미노산 서열(서열 목록 번호:103)을 포함하는 폴리펩티드, 상기 핵산의 발현을 유도할 수 있는 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된 상기 정의된 상기 핵산을 포함하는 발현 벡터, 및 상기 발현 벡터로 트랜스펙션되거나 형질도입된 세포가 제공된다.
이러한 서열은 시노몰구스 EGFR, 즉 마카카 파스시큘라리스(Macaca fascicularis)로부터의 EGFR의 폴리누클레오티드 및 폴리펩티드 서열을 구성한다. 이러한 종의 원숭이는 독물학 연구에 널리 사용되는 동물이다. 인간 자가 항원(self-antigen)대한 항체를 수반하는 독물학 연구에서의 임의의 가치있는 동물 종에 대해, 항체가 또한 톡스-동물(tox-animal)에서 바람직하게는 대략 동일한 친화성으로 표적 단백질에 결합하는 것이 필수적이다. 시노몰구스 EGFR에 결합하는 항체를 시험하는 것은 이제 본 발명의 발명자들의 기여로 가능하게 되었다. 시노몰구스 및 인간 EGFR은 고도로 상동성인 단백질이나, 놀랍게도 인간 및 시노몰구스 EGFR에 대해 매우 다양한 친화성을 갖는 다수의 항체가 밝혀졌다. 이는 본 발명의 발명자들에 의해 제공된, 스크리닝을 위한 정확한 시노몰구스 EGFR 단백질의 사용의 중요성을 강조한다.
또한,
- 하나 이상의 시험 항체를 제공하는 단계;
- 시노몰구스 EGFR의 세포외 도메인(도 23, 서열 목록 번호:101) 또는 전장 시노몰구스 EGFR(도 34B, 서열 목록 번호:103); 또는 시노몰구스 EGFR의 세포외 도메인 또는 전장 시노몰구스 EGFR을 발현하는 세포의 표면에 결합하는 항체를 결정하기 위한 검정을 수행하는 단계; 및
- 시노몰구스 EGFR 세포외 도메인에 결합하는 하나 이상의 항체를 선택하는 단계를 포함하는,
시노몰구스 EGFR에 결합하는 항체를 스크리닝하는 방법이 제공된다.
상기 방법은 인간 EGFR 세포외 도메인 또는 인간 EGFR 발현 세포로의 결합을 스크리닝하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
한 추가 양태에서, 본 발명은,
(a). 제 1 검정에서, 고정된 양의 EGFR 항원과 관련하여 제 1 항체의 최대 결합 능력을 결정하는 단계;
(b). 제 2 검정에서, 고정된 양의 EGFR 항원을 제 2 항-EGFR 항체로 포화시키는 단계;
(c). EGFR-항체 복합체와 상기 제 1 항체를 접촉시키고, 최대 결합 능력을 결정하는 단계; 및
(d). 상기 단계 (c)의 최대 결합 능력이 상기 단계 (a)의 최대 결합 능력을 초과하는지 결정하기 위해 결합 능력을 비교하는 단계를 포함하는,
EGFR에 대한 또 다른 항-EGFR 항체의 동시 결합을 향상시킬 수 있는 항-EGFR 항체를 확인하는 방법에 관한 것이다.
이러한 검정은 항체 992 및 1024의 특성과 유사한 특성을 갖는 항체의 추가의 조합물을 확인하는데 사용될 수 있다.
정의
용어 "항체"는 혈청의 기능성 성분을 기재하며, 이는 종종 분자의 집합물(항체 또는 면역글로불린) 또는 하나의 분자(항체 분자 또는 면역글로불린 분자)를 언급한다. 항체 분자는 특정 항원 결정기(항원 또는 항원 에피토프)에 결합하거나 이와 반응할 수 있고, 차례로 면역학적 효과기 메커니즘을 유도할 수 있다. 개별적 항체 분자는 보통 단일특이성으로 간주되고, 항체 분자의 조성물은 모노클로날(즉, 동일한 항체 분자로 구성) 또는 폴리클로날(즉, 동일한 항원, 또는 별개의 상이한 항원 상의 동일하거나 상이한 에피토프와 반응하는 2개 이상의 상이한 항체 분자로 구성)일 수 있다. 각각의 항체 분자는 이의 해당 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 독특한 구조를 갖고, 모든 천연 항체 분자는 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄의 동일한 전체적인 기본 구조를 갖는다. 항체는 또한 집합적으로 면역글로불린으로 공지되어 있다. 본원에서 사용되는 용어 항체 또는 항체들은 키메라 및 단일 사슬 항체, 뿐만 아니라 항체의 결합 단편, 예를 들어, Fab, Fv 단편 또는 scFv 단편, 뿐만 아니라 다합체 형태, 예를 들어, 이합체 IgA 분자 또는 5가 IgM을 포함한다. 항체는 인간, 뮤린, 키메라, 인간화 또는 재형성된(reshaped) 항체일 수 있다.
용어 "동족체(cognate) VH 및 VL 코딩쌍"은 동일한 항체 생성 세포 내에 함유되거나 이로부터 유래된 VH 및 VL 코딩 서열의 본래의 쌍을 기재한다. 따라서, 동족체 VH 및 VL 쌍은 상기 세포가 유래되는 공여체에 본래 존재하는 VH 및 VL 쌍이다. 용어 "VH 및 VL 코딩쌍으로부터 발현된 항체"는 항체 또는 항체 단편이 벡터, 플라스미드 또는 VH 및 VL 코딩 서열을 함유하는 유사물로부터 생성된 것을 나타낸다. 완전한 항체 또는 이의 안정적인 단편으로 동족체 VH 및 VL 코딩쌍이 발현되는 경우, 이들은 이들이 유래되는 세포로부터 본래 발현된 항체의 결합 친화성 및 특이성을 보존한다. 동족체 쌍의 라이브러리는 또한 동족체 쌍의 레퍼토리 또는 집합물을 언급하는 것이며, 이는 개별적으로 유지되거나 풀링될 수 있다.
용어 "CDR" - 상보성 결정 영역은 문헌[Lefranc et al (2003) IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains. Dev. Comp Immunol 27, 55-77]에 정의되어 있다.
용어 "재조합 폴리클로날 단백질의 별개의 일원"은 다양하나 상동성인 단백질 분자를 포함하는 단백질 조성물 중 하나의 단백질 분자를 의미하고, 각각의 단백질 분자는 조성물의 다른 분자와 상동성이나, 폴리클로날 단백질의 개별적 일원 사이에서 아미노산 서열의 차이를 특징으로 하는 다양한 폴리펩티드 서열의 하나 이상의 스트레치(stretch)를 함유한다.
용어 "헤드-투-헤드(head-to-head) 프로모터"는 근접하게 위치되어 프로모터에 의해 구동되는 2개의 유전자 단편의 전사가 반대 방향으로 발생하는 프로모터 쌍을 의미한다. 헤드-투-헤드 프로모터는 또한 2개의 프로모터 사이에 관련이 없는 핵산으로 구성된 스터퍼(stuffer)와 함께 작제될 수 있다. 이러한 스터퍼 단편은 500개 이상의 누클레오티드를 용이하게 함유할 수 있다. 헤드-투-헤드 프로모터는 또한 양방향성 프로모터로 언급될 수 있다.
용어 "면역글로불린"은 일반적으로 혈액 또는 혈청에서 발견되는 항체의 혼합물의 집합적 명칭으로 사용되나, 이는 또한 다른 공급원으로부터 유래된 항체의 혼합물을 명명하는데 사용될 수 있다.
용어 "면역글로불린 분자"는, 예를 들어, 면역글로불린의 일부, 또는 임의의 폴리클로날 또는 모노클로날 항체 조성물의 일부로서 개별적 항체 분자를 나타낸다.
용어 "관심 변이체 핵산 분자 라이브러리"는 "관심 재조합 폴리클로날 단백질"을 집합적으로 엔코딩하는 핵산 분자의 집합물을 기재하는데 사용된다. 트랜스펙션에 사용되는 경우, 관심 변이체 핵산 분자의 라이브러리는 발현 벡터의 라이브러리에 포함된다. 이러한 라이브러리는 통상적으로 2, 3, 5, 10, 20, 50, 1000, 104, 105 또는 106개 이상의 별개의 일원을 갖는다.
용어 "대량 이동(mass transfer)"은 하나의 벡터 집단으로부터 또 다른 벡터 집단으로의 관심 핵산 서열의 이동을 기재하는데 사용되고, 이는 개별적 관심 DNA의 분리를 재분류하지 않고 각각의 DNA에 대해 동시에 수행한다. 이러한 벡터 집단은, 예를 들어, 관심 가변 영역, 프로모터, 리더 또는 인핸싱(enhancing) 성분을 함유하는 라이브러리일 수 있다. 이후, 이러한 서열은, 예를 들어, 파아지 벡터로부터 포유동물 발현 벡터로의 사전 분리 없이 이동될 수 있다. 특히, 항체 서열에 대해, 이러한 기술은, 예를 들어, 선택 벡터(예를 들어, 파아지 디스플레이 벡터)로부터 포유동물 발현 벡터로 라이브러리를 이동시키는 동안 VH 및 VL 다양성 사이의 연관성이 상실되지 않는 것을 보장한다. 이에 의해, VH 및 VL의 본래의 페어링(pairing)이 유지된다.
본원에서 사용되는 용어 "작동가능하게 연결된"은 다른 세그먼트와의 기능적 상관관계로 배치되는 경우 또 다른 세그먼트에 연결되는 세그먼트를 의미한다. 예를 들어, 신호 서열을 엔코딩하는 DNA는 소포체로의 폴리펩티드의 이동에 관여하는 리더로 발현되는 경우 폴리펩티드를 엔코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된다. 또한, 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사를 자극하는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다.
용어 "폴리클로날 항체"는 동일하거나 상이한 항원 상의 여러 다양한 특이적 항원 결정기에 결합하거나 이와 반응할 수 있는 다양한 항체 분자의 조성물을 기재한다. 보통, 폴리클로날 항체의 변이성은 폴리클로날 항체의 소위 가변 영역에 위치되는 것으로 생각된다. 그러나, 본 발명의 상황에서, 다클론성(polyclonality)은 또한, 예를 들어, 2개 이상의 항체 동형, 예를 들어, 인간 동형 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2, 또는 뮤린 동형 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 및 IgA를 함유하는 항체의 혼합물의 경우에서와 같이 소위 불변 영역에 존재하는 개별적 항체 분자 사이의 차이를 기재하는 것으로 이해될 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 이러한 폴리클로날 항체는 또한 "항체 조성물"로 언급될 수 있다.
용어 "에피토프"는 통상적으로 동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간에서 항원성 또는 면역원성 활성을 갖는 보다 큰 분자 또는 보다 큰 분자의 일부(예를 들어, 항원 또는 항원성 부위)의 부분을 기재하는데 사용된다. 면역원성 활성을 갖는 에피토프는 동물에서 항체 반응을 유발하는 보다 큰 분자의 일부이다. 항원성 활성을 갖는 에피토프는 당 분야에서 널리 공지된 임의의 방법, 예를 들어, 본원에 기재된 면역검정에 의해 결정시 항체가 면역특이적으로 결합하는 보다 큰 분자의 일부이다. 항원성 에피토프는 반드시 면역원성일 필요는 없다. 항원은 항체 또는 항체 단편이 면역특이적으로 결합하는 물질, 예를 들어, 독소, 바이러스, 박테리아, 단백질 또는 DNA이다. 항원 또는 항원성 부위는 종종 이들이 매우 작지 않는 한 1개 이상의 에피토프를 갖고, 이는 종종 면역 반응을 자극할 수 있다. 에피토프는 선형 또는 형태적일 수 있다. 선형 에피토프는 항체에 의해 인지되는 단백질 분자 상에 약 6 내지 10개의 인접한 아미노산으로 구성된다. 대조적으로, 형태적 에피토프는 연속적으로 배열되지 않은 아미노산으로 구성된다. 여기서, 항체는 3-차원 구조만을 인지한다. 단백질 분자가 3차원 구조로 폴딩되는 경우, 에피토프를 형성하는 아미노산은 항체가 서열을 인지하는 것을 가능하게 하도록 병렬된다. 변형된 단백질에서, 선형 에피토프만이 인지될 수 있다. 형태적 에피토프는 자명한 일로써 폴딩된 단백질의 외부에 존재해야 한다. 형태적 에피토프를 인지하는 항체는 약한 비-변성 절차하에서만 결합할 수 있다. 동일한 항원 상의 다양한 에피토프로의 항체 결합은 에피토프의 위치에 따라 이들이 결합하는 항원의 활성에 다양한 영향을 미칠 수 있다. 항원의 활성 부위에서의 에피토프로의 항체 결합은 항원의 기능을 완전히 차단할 수 있는 반면, 상이한 에피토프에서의 또 다른 항체 결합은 항원 단독의 활성에 영향을 미치지 않거나 적은 영향을 미칠 수 있다. 그러나, 이러한 항체는 여전히 보체를 활성화시킴으로써, 항원을 제거할 수 있고, 동일한 항원 상의 상이한 에피토프에서의 하나 이상의 항체 결합과 조합되는 경우 상승작용적 효과를 발생시킬 수 있다. 본 발명에서, 에피토프는 바람직하게는 EGFR의 세포외 도메인의 부분이다. 본 발명의 항원은 바람직하게는 항체 또는 항체 단편이 면역특이적으로 결합하는 EGFR 단백질, 폴리펩티드의 세포외 도메인 또는 이들의 단편이다. EGFR 관련 항원은 또한 항체 또는 항체 단편이 면역특이적으로 결합하는 EGFR 폴리펩티드의 세포외 도메인 또는 이의 단편의 유사체 또는 유도체일 수 있다.
동일한 항원으로의 결합에 대해 서로 경쟁할 수 있는 항체는 동일한 에피토프 또는 중첩 에피토프에 결합할 수 있거나, 서로 근접한 결합 부위를 가질 수 있어, 경쟁은 주로 입체구조적 방해에 의해 야기된다. 항체 사이의 경쟁을 결정하는 방법은 실시예에 기재되어 있다.
본원에서 사용되는 용어 "폴리클로날 항체" 또는 "다클론성"은 바람직하게는 면역글로불린 상과로부터 선택된, 다양하나 상동성인 단백질 분자를 포함하는 단백질 조성물을 의미한다. 따라서, 각각의 단백질 분자는 조성물의 다른 분자와 상동성이나, 또한 폴리클로날 단백질의 개별적 일원 사이의 아미노산 서열에서의 차이를 특징으로 하는 다양한 폴리펩티드 서열의 하나 이상의 스트레치를 함유한다. 이러한 폴리클로날 단백질의 공지된 예는 항체 또는 면역글로불린 분자, T 세포 수용체 및 B 세포 수용체를 포함한다. 폴리클로날 단백질은 공통적인 특징, 예를 들어, 요망되는 표적 항원에 대한 폴리클로날 항체의 경우와 같이 요망되는 표적에 대해 공유된 결합 활성에 의해 규정된, 단백질 분자의 규정된 서브셋으로 구성될 수 있다.
"단백질" 또는 "폴리펩티드"는 길이 또는 번역후 변형에 관계 없는 임의의 아미노산 사슬을 의미한다. 단백질은 단량체 또는 다합체로 존재할 수 있고, 이는 2개 이상의 어셈블리된 폴리펩티드 사슬, 단백질, 폴리펩티드, 올리고펩티드, 또는 펩티드의 단편을 포함한다.
용어 "RFLP"는 "제한 단편 길이 다형성"을 의미하고, 이러한 방법에 의해 핵산 분자 단편의 이동성 겔 패턴이 제한 효소를 이용한 분해 후에 검정된다.
용어 "스크램블링(scrambling)"은, 예를 들어, 면역글로불린 상과로부터의 2개의 상이한 폴리펩티드 사슬로 구성된 폴리클로날 단백질의 2개 이상의 별개의 일원이 개별적 세포로부터 발현되는 상황을 기재한다. 이러한 상황은 개별적 세포가 유전체로 유전자 세그먼트의 하나 이상의 쌍이 통합되는 경우에 발생할 수 있고, 여기서 유전자 세그먼트의 각각의 쌍은 폴리클로날 단백질의 개별적 일원을 엔코딩한다. 이러한 상황에서, 유전자 세그먼트로부터 발현된 폴리펩티드 사슬의 의도하지 않은 조합이 만들어질 수 있다. 이러한 폴리펩티드 사슬의 의도하지 않은 조합은 임의의 치료 효과를 갖지 않을 수 있다.
용어 "VH-VL 사슬 스크램블링"이 상기 정의된 스크램블링의 예이다. 이러한 예에서, VH 및 VL 엔코딩 유전자 세그먼트가 유전자 세그먼트의 쌍을 구성한다. 스크램블링은 VH 및 VL 폴리펩티드의 의도하지 않은 조합이 2개의 상이한 VH 및 VL 엔코딩 유전자 세그먼트 쌍이 통합되는 세포로부터 생성되는 경우에 발생한다. 이러한 스크램블링된 항체 분자는 본래의 특이성을 보유하지 않을 수 있고, 따라서 임의의 치료 효과를 갖지 않을 수 있다.
용어 "트랜스펙션"은 사용되는 외래 DNA를 세포로 도입시키는 광범위한 용어로 본원에서 사용된다. 상기 용어는 또한 외래 DNA를 세포로 도입시키기 위한 다른 기능적으로 동등한 방법, 예를 들어, 형질전환, 감염, 형질도입, 또는 공여체 세포 및 수용체 세포의 융합을 포함한다.
용어 "가변성 폴리펩티드 서열" 및 "가변성 영역"은 상호교환적으로 사용된다.
용어 "별개의 에피토프"는 2개의 상이한 항체가 별개의 에피토프에 결합하는 경우, 항원 결합에 대해 100% 미만의 경쟁, 바람직하게는 항원 결합에 대해 50% 미만의 경쟁, 더욱 바람직하게는 항원 결합에 대해 본질적으로 경쟁이 없는 것을 의미한다. 항체쌍의 "별개의 에피토프"에 대한 검정은 통상적으로 실시예에 기술된 바와 같이 EGFR 발현 세포 및 개별적으로 형광 표지된 항체에 대한 FACS 검정, 또는 플로우 셀(flow cell) 표면에 포획되거나 컨쥬게이션된 EGFR 항원을 이용하는 표면 플라즈몬 공명을 이용하여 포화 항체 조건하에서의 결합 실험에 의해 결정된다.
하나의 항체 분자에 적용되는 경우 "EGF 결합을 억제하는"일 수 있는 용어는 항체 분자가 EGFR로의 EGF의 결합과 관련하여 10 nM 미만, 바람직하게는 8 nM 미만, 더욱 바람직하게는 7 nM 미만, 더욱 바람직하게는 5 nM 미만, 더욱 바람직하게는 4 nM 미만, 더욱 바람직하게는 3 nM 미만, 더욱 바람직하게는 2 nM 미만, 더욱 바람직하게는 2 nM 미만, 더욱 바람직하게는 1 nM 미만의 IC50 값을 나타내는 것을 의미한다.
용어 "표피 성장 인자 수용체", "EGFR" 및 "EGFR 항원"은 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 인간 EGFR의 변이체, 동형 및 종 상동체를 포함한다. 한 바람직한 구체예에서, 본 발명의 항체의 EGFR-항원으로의 결합은 EGFR로의 EGFR 리간드의 결합을 억제하거나 차단함으로써 EGFR 발현 세포(예를 들어, 종양 세포)의 성장을 억제한다. 용어 "EGFR 리간드"는, 예를 들어, EGF, TGF-알파, 헤파린 결합 EGF(HB-EGF), 암피레귤린(amphiregulin)(AR), 헤레귤린(heregulin), 베타-셀룰린(beta-cellulin), 및 에피레귤린(epiregulin)(EPI)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 EGFR에 대한 모든(예를 들어, 생리학적) 리간드를 포함한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, EGFR-항원으로의 본 발명의 항체의 결합은 효과기 세포 포식작용 및/또는 EGFR 발현 세포의 사멸을 매개한다.
EGFR 도메인 구조: 성숙 EGFR(SwissProt acc.#P00533)의 세포외 부분은 621개의 아미노산 및 4개의 수용체 도메인으로 구성된다: 도메인 Ⅰ은 잔기 1-165를 포함하고, 도메인 Ⅱ는 잔기 166-312를 포함하고, 도메인 Ⅲ는 잔기 313-481을 포함하고, 도메인 Ⅳ는 잔기 482-621을 포함한다(Cochran et al. 2004 J immunol. Methods 287, 147-158). 도메인 Ⅰ 및 Ⅲ은 리간드에 대한 고 친화성 결합 부위의 형성에 기여하는 것으로 제안되었다. 도메인 Ⅱ 및 Ⅳ는 단백질 폴딩을 안정화시키고, 가능한 EGFR 이합체화 계면을 함유하는 시스테인 부화 라미닌 유사 영역이다.
본원에서 사용되는 용어 "성장을 억제하다"(예를 들어, 세포에 대해 언급됨)는 항-EGFR 항체와 접촉하지 않은 세포의 성장에 비한 항-EGFR 항체와 접촉된 동일한 세포의 증식(세포수 증가) 또는 대사의 임의의 측정가능한 감소, 예를 들어, 세포 배양 성장의 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99% 이상, 또는 100%의 억제를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "결합을 억제하다" 및 "결합을 차단하다"(예를 들어, EGFR로의 EGFR 리간드 결합의 억제/차단으로 언급됨)는 상호교환적으로 사용되고, 이는 부분적 및 완전한 억제/차단을 포함한다. EGFR로의 EGFR 리간드의 억제/차단은 바람직하게는 억제 또는 차단 없이 EGFR로 EGFR 리간드가 결합하는 경우에 발생하는 세포 신호전달의 정상 수준 또는 유형을 감소시키거나 변경시킨다. 억제 및 차단은 또한 항-EGFR 항체와 접촉되지 않은 리간드에 비해 항-EGFR 항체와 접촉되는 경우의 EGFR에 대한 EGFR 리간드의 결합 친화성의 임의의 측정가능한 감소, 예를 들어, 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99% 이상, 또는 100%의 EGFR로의 EGFR 리간드의 차단을 포함한다.
용어 "재조합 항체"는 천연적으로는 세포와 관련되지 않는 항체의 코딩 서열을 포함하는 발현 벡터로 트랜스펙션된 세포 또는 세포주로부터 발현되는 항체 분자 또는 여러 분자들을 기재하는데 사용된다.
도면의 설명
도 1 - 비장세포(splenocyte)의 분류(상세하게는 실시예 1 참조). 다음과 같은 게이트(gate)가 제조되었다(도시됨):
· 게이트 1 : 살아있는 세포(FSC/프로피디움 요오다이드 플롯)(좌측 하단 패널).
· 게이트 2 : 형질 세포가 CD43 pos/CD138 pos로 게이팅(gating)되었다(우측 하단 패널).
· 게이트 3 : 이중 판별(doublet discrimination)(우측 상단 패널).
도 2 - 뮤린 - mSymplex™ PCR. 단일한 세포로부터의 중쇄 및 경쇄 항체 유전자의 증폭 및 동족체 결합(cognate linkage)을 위한 다중 중첩 신장(Multiplex overlap extension) RT-PCR. 세부사항은 실시예 1을 참조.
도 3 - 뮤린 레파토리 클로닝. 단일한 형질 세포로부터의 VH/VL 유전자 쌍을 엔코딩하는 mSymplex™ PCR 생성물의 풀(pool)을 중첩 신장에 의한 스플라이싱에 의해 인간 카파 불변 경쇄를 엔코딩하는 유전자에 스플라이싱시켰다. 완전한 인간-마우스 키메라 항체를 엔코딩하는 유전자의 풀을 발현 벡터에 삽입한 후, 양방향성 프로모터 카세트(2xCMV)에 삽입하였다.
도 4 - 포유동물 전장 항체 발현 벡터 00-VP-002의 개략도. Amp 및 Amp pro, 앰피실린 내성 유전자 및 이의 프로모터; pUC 기점, 복제의 pUC 기점; CMV, 경쇄 및 중쇄의 발현을 구동하는 포유동물 프로모터; IGHV 리더, 유전체 인간 중쇄 리더; H 스터퍼(stuffer), 중쇄 가변 영역 엔코딩 서열로 교체되는 삽입물; IGHG1, 유전체 면역글로불린 동형 G1 중쇄 불변 영역을 코딩하는 서열(서열은 부록 2에 제시되어 있음); 래빗 B-글로빈 A, 래빗 베타-글로빈 polyA 서열; IGKV 리더, 뮤린 카파 리더; L 스터퍼, 경쇄 엔코딩 서열로 교체되는 삽입물; SV40 말단, 원숭이 바이러스 40 종료자 서열; FRT, Flp 인지 표적 부위; Neo, 네오마이신 내성 유전자; SV40 poly A, 원숭이 바이러스 40 poly A 신호 서열.
도 5 - 450-620 nm에서의 흡광도 차이의 클러스터(Cluster) 검정. 상층액을 클론 번호에 따른 수(1 내지 4)로 나타낸 바와 같이 반응성에 의해 클러스터링(clustering)시켰다. 어두운 회색은 대사적으로 활성인 세포의 수의 감소를 나타내는 반면, 밝은 회색은 대사적으로 활성인 세포의 수의 증가를 나타낸다. 흑색은 대사적으로 활성인 세포의 수에 대한 효과가 없는 상층액을 나타낸다.
도 6 - 경쟁 ELISA에 의해 결정된 특정 EGFR 도메인에 특이적인 나열된 참조 항체를 이용한 항-EGFR 항체의 억제 정도. A) 억제의 계산. B) 억제의 스코어링: 25-49%: 보통의 경쟁(+); 50-74%: 강한 경쟁(++); 75-100%: 매우 강한 경쟁(+++). 현저한 억제(50-100%)를 나타내는 박스는 회색으로 어둡게 하였다. 검정의 재현성을 나타내기 위해 에르비툭스 및 벡티빅스는 이중으로 나타내었다(4개의 독립적 실험). Ab2(225)는 에르비툭스가 발생되는 뮤린 전구체이다.
도 7은 비아코어(Biacore) 3000 SPR 기계에서 수행된 1개의 에피토프 맵핑(mapping) 주기의 예시를 도시하고, 여기서 mAb는 4개의 상이한 참조 항체와 EGFR의 세포외 도메인으로의 결합에 대해 경쟁한다.
도 8 - SPR 기술을 이용하는 경쟁 검정에 의해 결정된 특정 EGFR 도메인에 특이적인 나열된 참조 항체를 이용한 항-EGFR 항체의 억제 정도. A) 억제의 계산. B) 억제 스코어링: 25-49%: 보통의 경쟁(+); 50-74%: 강한 경쟁(++); 75-100%: 매우 강한 경쟁(+++). 현저한 억제(50-100%)를 나타내는 세포를 회식으로 어둡게 하였다. *로 표시된 클론 1229는 비아코어 검정에서 결합하지 않았다.
도 9 - 항-EGFR 항체쌍의 SPR 경쟁 검정에 의한 항-EGFR 항체 레퍼토리 내의 에피토프 클러스터의 결정. 항체를 추정된 EGFR 도메인 인지에 따라 그룹화하였다. 항체 조합물이 50%를 초과하는 억제로 중첩 에피토프에 결합하는 것으로 밝혀진 세포를 회색으로 어둡게 하였다. 결정이 수행되지 않은 세포를 흑색으로 채색하였다. A) 억제의 결정. B) 억제 스코어링: 25-49%: 보통의 경쟁(+); 50-74%: 강한 경쟁(++); 75-100%: 매우 강한 경쟁(+++).
도 10 - 비아코어 검정에 의해 결정된 EGFR의 세포외 도메인에 특이적인 항-EGFR 항체 및 참조 항체의 에피토프 맵. A) EGFR 세포외 도메인(ECD)의 도메인 Ⅰ 또는 도메인 Ⅰ/Ⅱ에 특이적인 항체의 에피토프 맵. B) EGFR ECD의 도메인 Ⅲ에 특이적인 항체의 에피토프 맵.
도 11 - EGFR 상의 비 중첩 에피토프에 특이적인 항체의 올리고클로날 혼합물의 동시 결합 연구. A) 도메인 Ⅲ, 도메인 Ⅰ 또는 공지되지 특이성에 대한 항체의 연속 첨가. 다양한 mAb 혼합물 또는 단일한 mAb에 대해 시험된 단일 샘플 mAb의 억제 값을 어두운 박스 내에 나타내었다. 억제를 계산하는데 사용된 Ru max 값을 또한 나타내었다. B) EGFR 상의 비-중첩 에피토프에 특이적인 6개의 별개의 샘플 mAb 및 6개의 시험된 항체를 함유하는 항체 혼합물의 경쟁 분석. 시험된 샘플 항체가 포함되지 않은 항체 혼합물을 양성 대조군으로 제공하였다. 다양한 mAb 혼합물에 대해 시험된 단일한 샘플 mAb의 억제 값을 어두운 박스에 나타내었다. 억제를 계산하는데 사용된 Ru max 값을 또한 나타내었다. C) 항체 봉쇄, 및 몇몇 경우에 항체 결합 향상을 나타내는 B의 검정으로부터 해당 센소그램(sensogram). D) 6개의 mAb 항체 혼합물에 대한 도메인 Ⅰ, Ⅰ/Ⅱ, 및 공지되지 않은 특이성의 도메인에 특이적인 추가 항체의 시험.
도 12 - 전장 EGFR에 대한 항체 적정에 의한 항체 매개 EGF 리간드 봉쇄의 결정 및 스트렙타비딘 HRP 시약을 이용한 비오티닐화된 EGF 리간드 결합의 검출. 에르비툭스, 벡티빅스 및 시나기스(Synagis) IgG(팔리비주맙(palivizumab))를 양성 대조군 및 음성 대조군으로 각각 사용하였다. 시험 항체를 이용한 인지된 항체 에피토프의 봉쇄 후, EGF 리간드 경쟁의 정도를 0.1 μg/ml의 비오티닐화된 EGF 리간드 및 검출을 위한 2차 스트렙타비딘-HRP 컨쥬게이트를 첨가하여 시각화시켰다.
도 13 - HN5 세포에서의 EGF(50 ng/ml)에 의해 유도된 EGFR 인산화에 대한 지정된 항체를 이용한 전처리의 효과. 그래프에 명명된 항체(10 μg/ml)를 EGF 첨가 30분 전에 7.5분 동안 세포와 함께 인큐베이션하였다. *로 표시된 데이터 세트는 대조군((-)ctrl) 데이터 세트와 현저하게 상이하였다(p<0.05). A. 1208은 EGFR 인산화에 대해 현저한 보호 효과를 가졌다. B. 1277 및 1320은 EGF 유도 인산화에 대해 현저한 보호 효과를 가졌다. 오차 막대는 3개의 독립적 실험의 편차를 나타낸다.
도 14 - HN5 세포에서의 인산화된 EGFR(pEGFR) 및 EGFR의 세포내 웨스턴(western) 검정. 혼합물은 최종 농도 10 μg/ml의 992, 1030 및 1042 항체의 등몰 혼합물을 나타내고, 다른 항체는 각각 10 μg/ml의 농도로 사용하였다. 50 μg/ml의 EGF를 EGFR 인산화를 자극하기 위해 고정 전에 7.5분 동안 첨가하였다. 오차 막대는 6개의 별개(ctlr-), 또는 3개의 별개의 데이터 포인트(992, 1030, 1042, 혼합물 또는 에르비툭스)의 표준 편차를 나타낸다. 992, 1030, 혼합물 및 에르비툭스는 인산화에 대해 현저한(* = p<0.05) 보호 효과를 가졌다.
도 15 - EGFR의 내재화에 대한 항체의 인큐베이션의 효과. 데이터는 최초 염색에 비례하는 세포 표면으로부터 제거된 수용체의 퍼센트로 나타내었다. 오차 막대는 SEM에 해당한다.
도 16 - 대사적으로 활성인 세포의 퍼센트에 의해 측정된 처리되지 않은 대조군에 비한 다양한 농도의 항체 992, 1030 및 1042 및 이들의 혼합물의 존재하에서의 A431-NS 세포의 성장 곡선. 1001은 음성 대조군으로 사용되는 유사한 동형을 갖는 비-기능성 항체이다.
도 17 - 450 nm에서의 흡광도에 의해 측정된, 10 μg/ml의 항체 992, 1030 및 1042 및 이들의 혼합물 및 다양한 농도의 EGFR 리간드 EGF의 존재하에서의 A431-NS 세포의 성장 곡선. 1001은 음성 대조군으로 사용되는 유사한 동형을 갖는 비-기능성 항체이다.
도 18 - 다양한 농도의 항체 992, 및 992와 도메인 Ⅰ, Ⅱ 또는 Ⅲ에 존재하는 비-중첩 에피토프를 갖는 항체의 혼합물의 존재하에서의 A431-NS 세포의 성장 곡선. 1001은 음성 대조군으로 사용되는 유사한 동형을 갖는 비-기능성 항체이다.
도 19 - A431NS 세포에서의 아폽토시스. EGFR-혼합물, 개별적 모노클로날 항체, 에르비툭스 및 벡티빅스를 10배 희석으로 시험하였다. 아폽토시스 세포로부터의 히스톤-DNA 복합체를 로슈(Roche) 사의 ELISA-키트를 이용하여 측정하였다.
도 20 - 10마리의 누드(nude) Balb/C Nu/Nu 마우스의 4개의 그룹에 1x106개의 A431NS 세포를 접종하였다. 종양이 대략 100 mm3가 된 경우, 처리를 개시하였다. 화살표로 나타낸 바와 같이 실험 동안 그룹에 1 mg/ml의 항체를 5회 주사하였다. 종양 직경을 디지털 캘리퍼스(callipers)로 측정하였다. 결과를 평균 종양 부피로 나타내었다(+/- SEM).
도 21 - 도 20에 나타낸 실험에서 개별적 마우스가 사망한 경우, 종양을 절제하고 칭량하였다. 평균값 +/- SEM를 나타내었다. 별표는 P<0.05에서의 유의성을 나타낸다.
도 22 - 10 μg/ml의 항체 1001, 에르비툭스, 벡티빅스, 및 비-중첩 에피토프 992+1030+1042를 갖는 3개 항체의 혼합물의 존재하에서의 A431-NS 구상체의 성장. 1001은 음성 대조군으로 사용되는 유사한 동형을 갖는 비-기능성 항체이다.
도 23 - 시노몰구스 원숭이 피부 표피로부터 유래된 cDNA로부터 클로닝된 시노몰구스 EGFR의 세포외 도메인의 DNA(서열 목록 번호:100) 및 단백질 서열(서열 목록 번호:101).
도 24 - 시노몰구스 EGFR ECD(서열 목록 번호:101)의 수득된 단백질 서열과 GENBANK 등록 번호 X00588로부터 수득된 인간 EGFR ECD(서열 목록 번호:108)의 정렬. 콘센서스(consensus) 서열(서열 목록 번호:109)을 또한 나타내었다.
도 25 - 인간 또는 시노몰구스 EGFR ECD 또는 둘 모두에 결합하는 종 특이적 항체와 교차 반응성 항체 사이의 ELISA 검정 판별의 예.
도 26 - 이종이식된 마우스의 4개의 실험 그룹의 각각으로부터의 대표적 종양 섹션의 현미경사진. 200x의 배율에서, 화살표는 생체내에서 A431 세포의 최종 분화의 집중점(foci)을 나타낸다. 종양에서 최종 분화의 현저하게 더 크고 더욱 많은 집중점은 3개의 항-EGFR 클론(992+1030+1042)의 혼합물로 처리된 것임을 주목하라, 상단 2개의 패널.
도 27 : A) 10 μg/ml의 대조군 항체(리툭시맙, 항 CD-20), 또는 992 및 1024의 항 EGFR 항체 혼합물 첨가 24시간 후에 HN5 구상체의 4Ox 배율에서 수득된 이미지. B) 소프트웨어 이미지 J(Image J)를 이용하여 세포에 의해 포함된 영역의 정량(* p<0.01).
도 28 - 처리되지 않은 대조군의 퍼센트로 나타낸 4개의 처리 그룹에서의 인볼루크린 수준을 나타내는 도표(에르비툭스, 벡티빅스 및 음성 대조군 각각에 비해 *#¤p<0.005).
도 29 - A) 2시간 동안 10 μg/ml의 알렉사(Alexa)-488 표지된 에르비툭스 또는 992+1024와 함께 인큐베이션된 HN5 및 A431NS 세포의 60 x 배율에서 수득된 이미지. B) 2시간 동안 10 μg/ml의 알렉사-488 표지된 에르비툭스 또는 992+1024와 함께 인큐베이션된 A431NS 세포의 작은 핀-홀(pin-hole)을 이용하여 60x배율에서 수득된 이미지.
도 30 - A) 지정된 기간 동안 10 μg/ml의 알렉사-488 표지된 에르비툭스 또는 992+1024와 함께 인큐베이션된 HN5 세포의 60 x 배율에서 수득된 이미지.
도 31 - ELISA에서의 A431-NS 세포 정제된 전장 EGFR에 대한 연속 항체 적정에 의한 Fab 992, 1024 & 1030의 항원 제시 특이성의 결정. 결합된 Fab 항체를 2차 염소 항-인간 Fab 특이적 HRP 컨쥬게이트로 시각화시켰다. A) A431 세포로부터의 정제된 전장 EGFR에 대해 시험된 Fab 항체. B) A431-NS 세포의 표면 상에서 발현된 EGFR에 대해 시험된 Fab 항체.
도 32 - ELISA에서 파라포름알데히드 고정된 A431-NS 세포에서의 연속 적정에 의한 항체 992, 1024, 1030, 에르비툭스 & 벡티빅스의 IgG 및 Fab 단편의 기능적 친화성의 결정. 결합된 Fab 및 IgG 항체를 2차 염소 항-인간 Fab 특이적 HRP 컨쥬게이트에 의해 시각화시켰다. 항-RSV 단백질 F 항체 시나기스(Synagis)를 음성 대조군 항체로 사용하였고, 이는 이용된 ELISA 검정에서 임의의 결합을 나타내지 않았다. A) A431-NS 세포로의 IgG 항체의 기능적 결합. B) A431-NS 세포로의 Fab 항체의 기능적 결합.
도 33 - 비중첩 에피토프에 결합하는 Fab 단편을 이용한 사전 수용체 포화에 대한 A431-NS 세포 상의 EGFR으로의 IgG 결합 향상의 결정. 지정된 Fab 단편이 30분 동안 A431-NS 세포 상의 인지된 EGFR 에피토프를 포화시키도록 한 후, 특정 IgG 항체를 연속적으로 적정시키고, 2차 마우스 항-인간 Fc HRP 컨쥬게이트에 의해 Fab가 첨가되거나 첨가되지 않은 결합된 IgG를 시각화시켰다. A) 지정된 Fab 단편을 이용한 사전 수용체 포화를 겪거나 이를 겪지 않은 A431-NS 세포에 대한 IgG 992의 결합 특성. B) 지정된 Fab 단편을 이용한 사전 수용체 포화를 겪거나 이를 겪지 않은 A431-NS 세포에 대한 IgG 1024의 결합 특성. C) 지정된 Fab 단편을 이용한 사전 수용체 포화를 겪거나 이를 겪지 않은 A431-NS 세포에 대한 IgG 1030의 결합 특성.
도 34 - 시노몰구스 전장 EGFR cDNA(도 34A; 서열 목록 번호:102) 및 엔코딩된 단백질(도 34B; 서열 목록 번호:103).
도 35 - 1 μg/ml의 지정된 항체/조합물을 이용하여 A431NS에서 수득된 아폽토시스. 히스톤-DNA 복합체를 로슈(Roche)사의 ELISA 키트에서 검출하였다. 아폽토시스의 수준은 양성 대조군과 관련이 있었다(최대 아폽토시스).
도 36 - Balb/C nu/nu 마우스에 1x106개의 A431NS 세포를 주사하였다. 종양이 대략 평균 100 mm3가 된 경우, 처리를 개시하였다. 마우스에 항체를 17회 주사하였다. 첫번째 처리는 8일에 시작하였고, 마지막 처리는 34일이었다. 항체/조성물을 0.5 mg/용량 또는 0.17 mg/용량으로 주사하였다. 종양의 평균 값 +/- SEM을 나타내었다.
도 37 - A431NS의 증식 억제. X축은 본 발명의 3개의 항체의 다양한 대표적 조합을 나타낸다. Y축은 처리되지 않은 대조군(대조군)의 퍼센트로 나타낸 대사 활성을 나타낸다. 오차 막대는 +/- SEM을 나타낸다. 추가의 세부사항은 실시예 6을 참조하라.
도 38 - A431NS 인간 종양 이종이식편에서의 에르비툭스에 비한 2개의 상이한 용량의 992+1024 혼합물의 성장 억제 효과. BALB/c nu/nu 마우스에 106개의 A431NS 세포를 접종하였다. 종양이 100 mm3의 평균 크기에 도달(8일)하는 경우, 마우스를 9개의 그룹으로 무작위화시키고, 처리를 시작하였다. 지정된 항체를 전체 9회의 주사로 1주일에 2회 0.5 mg/용량 또는 1 mg/용량으로 주사하였다. 그래프 상의 밝은 회색 영역은 처리 기간을 나타낸다. 점선 시작은 제공된 그룹 내의 첫번째 마우스가 과도한 종양 크기로 인해 안락사된 시점을 나타낸다. 2 mg/주의 992+1024 대 2 mg/주의 에르비툭스와 1 mg/주의 992+1024 대 2 mg/주의 에르비툭스 사이의 통계적으로 유의한 차이가 992+1024 2 mg/주 그룹을 제외하고는 모든 그룹이 종료된 60일에 계산되었다. 60일 전에 제외된 동물의 종양 크기가 달성되었고, 따라서; 그래프는 제공된 그룹의 모든 마우스의 축적된 종양 부피를 나타낸다. 평균값 +/- SEM이 제시되었다.
도 39 - 992+1024 항체 혼합물, 에르비툭스 또는 대조 항체로 처리된 마우스의 생존의 카플란-마이어(Kaplan-Meyer) 플롯(도 38에 제시된 것과 동일한 실험). 결과를 처리된 마우스의 생존 퍼센트로 나타내었다. 992+1024 및 에르비툭스를 비교하는 경우 고용량(2 mg/주, P = 0.0008) 및 저용량(1 mg/주, P = 0.0004) 그룹에서 마우스의 생존 퍼센트 사이에 현저한 차이가 관찰되었다. 또한, 고용량 에르비툭스와 비교하는 경우 저용량 992+1024가 현저하게 나았다(P = 0.0087). 로그-순위(Log-rank)(Mantel-Cox) 시험을 이용하여 통계적 차이를 계산하였다.
도 40 - FACS 검정에 의한 전장 인간 및 시노몰구스 EGFR이 트랜스펙션된 CHO 세포에 대한 IgG 992, 1024 & 1320의 교차 반응성의 검정. 결합 항체를 PE 표지된 염소 F(ab')2 항-인간 IgG FC로 검출하였다. EGFR을 발현하는 균일한 세포(SCC/FCS 특성)에 대해 게이팅(gating)을 수행하였다. 결합을 1 nM 농도에서의 최대 항체 결합 %로 나타내었다.
도 41 - 992(A) 및 1024(B)의 중쇄 및 경쇄 둘 모두의 뮤린의 가변 영역(chi) 및 인간화(hu) 후보 가변 영역의 아미노산 서열의 Clustalw2 정렬. IMGT에 의해 정의된 CDR 영역은 밑줄이 있고; 갭(gap)은 (-)로 표시하고, 동일한 아미노산은 (*)로 표시하고, 보존성 돌연변이는 (:)로 표시하고, 반-보존성은 (.)로 표시하였다. 굵은 글씨의 아미노산은 완전한 인간 프레임워크 변이체가 감소된 결합 친화성을 나타내는 경우에 본래의 확인된 뮤린 잔기에 대한 역돌연변이(back-mutation)가 수행될 아미노산 위치를 나타낸다. 서열 ID 번호는 다음과 같다: 인간화 992 VH(서열 목록 번호:104). 인간화 992 VL(서열 목록 번호:105). 인간화 1024 VH(서열 목록 번호:106). 인간화 1024 VL(서열 목록 번호:107). 키메라 992 VH(서열 목록 번호:40의 aa 3-124). 키메라 992 VL(서열 목록 번호:72의 aa 3-109). 키메라 1024 VH(서열 목록 번호:41의 aa 3-120). 키메라 1024 VL(서열 목록 번호:73의 aa 3-114 ).
도 42A - 992L1024에 대한 이중 가변 도메인을 엔코딩하는 유전자의 개략도; 992L1024 IGHV(751 bp)은 5' Asc Ⅰ 제한 부위로부터, 992 IGHV, ASTKGP 링커, 1024 IGHV가 후속되고, 3' Xho Ⅰ 제한 부위에서 종결되고, 992L1024 IGKV(1071 bp)는 5' NheⅠ 제한 부위로부터, 992 IGKV, TVAAP 링커, 1024 IGKV, IGKC가 후속되고, 3' NotⅠ 제한 부위에서 종결된다.
도 42B - 1024L992에 대한 이중 가변 도메인을 엔코딩하는 유전자의 개략도; 1024L992 IGHV(751 bp)는 5' Asc Ⅰ 제한 부위로부터, 1024 IGHV, ASTKGP 링커, 992 IGHV가 후속되고, 3' Xho Ⅰ 제한 부위에서 종결되고, 1024L992 IGKV(1071 bp)는 5' NheⅠ 제한 부위로부터, 1024 IGKV, TVAAP 링커, 992 IGKV, IGKC가 후속되고, 3' NotⅠ 제한 부위에서 종결된다.
본 발명의 상세한 설명
항체 혼합물
한 구체예에서, 본 발명은 3개 이상의 별개의 EGFR 에피토프, 바람직하게는 3개의 비-중첩 EGFR 에피토프에 결합할 수 있는 항체 분자를 포함하는 항체 조성물에 관한 것이다. 항체의 비-중첩 특성은 바람직하게는 EGFR 발현 세포를 이용하는 FACS 검정에서 다양하게 표지된 항체를 이용하거나, 플로우 셀 표면에 포획되거나 컨쥬게이션된 EGFR 항원을 이용하는 표면 플라즈몬 공명을 이용함으로써 결정된다. 실시예에 기재된 바와 같은 ELISA 기재 방법이 또한 사용될 수 있다. 3개의 비-중첩 EGFR 에피토프에 결합하는 조성물이 광범위한 EGFR 의존성 암 유형에 대해 사용될 수 있으며, 이는 1 또는 2개의 에피토프를 표적으로 하는 모노클로날 항체의 조성물에 비해 EGFR 형태의 차이에 대해 덜 취약하고, 돌연변이에 대해 덜 취약할 수 있기 때문이다. 또한, 비-중첩 EGFR 에피토프에 결합하는 항체 조성물은 보다 적은 에피토프를 표적으로 하는 조성물에 비해 우수한 효능을 제공할 수 있다. 특히, 항체 조성물은 생체내에서의 암세포의 최종 분화와 관련하여 우수한 효능을 제공할 수 있다. 도 37 - 개념의 일반적 적용가능성을 예시하는, 3개의 별개의 hEGFR 에피토프에 결합하는 효능 있는 항체 조성물의 다수의 예.
모노클로날 항-EGFR 항체 요법에 대해, 특정 비율의 환자는 항체 치료에 대해 효과적으로 반응하지 않을 것이다. 몇몇 환자에 대해, 이는 항체의 신속한 청소에 의한 것이거나, 항체가 상기 항체에 대해 환자에서 면역 반응을 발생시키기 때문일 수 있다. 몇몇 환자에 대해, 반응의 결핍은 특정 EGFR 의존성 암이 모노클로날 항체가 이의 에피토프에 결합할 수 없는 형태의 EGFR을 발현하기 때문일 수 있다. 이는 당화의 차이, 도메인 결실, 또는 돌연변이 및/또는 SNP(들) 때문일 수 있다.
또한, 몇몇 암에 대해, 암세포의 리간드 생성에 의해 야기된 자가분비 EGFR-자극이 중요한 반면, 다른 경우에는, 암세포에 의해 발현된 EGFR은 리간드 자극을 필요로 하지 않는다. 후자의 암 유형에 대해, 리간드 결합을 억제할 수 있는 항체는 효과적이지 않을 수 있다.
항체가 EGFR 상의 3개 이상의 별개의 에피토프에 결합할 수 있는 항체 조성물이 보다 광범위하게 적용될 것이며, 이는 항체에 의해 인지되는 에피토프(들)에 비해 모든 3개의 에피토프가 변경될 가능성이 감소되기 때문이다. 또한, 모든 항체가 환자에 의해 청소되는 가능성이 훨씬 적어진다. 최종적으로, 실시예는 기능 검정에서, 별개의 에피토프에 결합하는 3개의 항체를 포함하는 혼합물이 모노클로날 항체 및 2개의 항체를 포함하는 혼합물에 비해 우수한 것을 나타낸다. 우수함은 비-중첩 에피토프를 갖는 3개의 도메인 Ⅲ 항체를 이용하는 암세포의 최종 분화의 유도와 관련하여 가장 명백히 밝혀졌다. 이러한 암세포의 효과적인 항체 유도 최종 분화는 이전에 보고되지 않았으며, 이는 효과적인 항체-기재 암 요법의 고안에서 현저한 진전을 나타낸다. 이후의 결과는 2개의 항체의 특정 조합물로 유사하거나 심지어 우수한 결과가 수득될 수 있음을 나타내었다.
광범위한 EGFR 의존성 암 유형에 대한 개선된 임상 효능 및 광범위한 유용성을 위해, 조성물 내의 항체의 수가 증가될 수 있다. 따라서, 조성물은 4개의 비-중첩 에피토프에 결합할 수 있는 항체를 포함할 수 있다. 조성물은 5개의 비-중첩 에피토프에 결합할 수 있는 항체를 포함할 수 있다. 조성물은 6개의 비-중첩 에피토프에 결합할 수 있는 항체를 포함할 수 있다. 본 출원의 실시예는 6개 이상의 별개의 항체가 한번에 EGFR에 결합할 수 있음을 나타낸다(실시예 3). 이는 항체를 조심스럽게 선택함으로써 6개 이상, 예를 들어, 7 또는 8개의 비-중첩 에피토프에 결합할 수 있는 항체를 포함하는 조성물을 고안할 수 있거나, 이러한 것이 유리함을 배제하지 않는다.
또 다른 구체예에서, 조성물은 1개의 에피토프에 결합하는 1개의 항체 분자, 예를 들어, 다양하나 중첩하는 에피토프에 결합하는 2개의 항체를 포함한다. 에피토프가 결합할 가능성을 증가시키므로, 중첩 에피토프를 갖는 항체를 포함하는 것이 유리할 수 있다. 이의 배후의 하나의 이론적 근거는 일부 환자 및/또는 일부 암세포의 에피토프가 형태적 변화 또는 돌연변이 또는 SNP로 인해 변경될 수 있다는 점이다. 이는 1개의 항체의 결합에 영향을 줄 수 있으나, 중첩 에피토프에 결합하는 또 다른 항체의 결합에는 영향을 주지 않을 수 있다. 또한, 항체 중 하나가 항원으로 보여질 수 있으므로 환자에 의해 청소될 위험이 존재한다. 다양하나 중첩되는 에피토프에 결합하는 2개의 항체를 포함시킴으로써, 2개의 항체 중 하나의 청소의 결과 및 에피토프에서의 돌연변이의 결과가 감소된다.
따라서, 한 구체예에서, 조성물은 다양하나 중첩되는 에피토프에 결합하는 2개의 항체를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 조성물은 동일한 에피토프에 결합하는 2개의 별개의 항체 분자를 포함한다. 동일하거나 중첩하는 에피토프에 결합하는 항체는 동일하거나 상이한 동형일 수 있다.
따라서, 3개의 비-중첩 에피토프에 특이적인 항체를 포함하는 항체 조성물은 4, 5 또는 6개의 별개의 항체 분자를 포함할 수 있어, 2개의 항체는 2개의 중첩 에피토프 또는 동일한 제 1 에피토프에 결합하고, 다른 2개의 항체는 2개의 다른 중첩 에피토프 또는 동일한 제 2 에피토프에 결합하고, 2개의 항체는 2개의 추가의 다른 중첩 에피토프 또는 동일한 제 3 에피토프에 결합할 수 있다. 물론, 조성물은 중첩 에피토프에 결합하거나 동일한 에피토프에 결합할 수 있는 2개 이상, 예를 들어, 3 또는 4개의 항체 분자를 포함할 수 있다. 따라서, 조성물에 포함되는 항체의 전체 수는 각각의 에피토프에 대해 1개 이상의 항체를 가지거나 중첩 에피토프를 지닌 여러 항체를 가짐으로써 6개를 초과할 수 있다. 조성물 내에 포함된 각각의 추가 항체에 대해 항체의 전체 투여량을 일정하게 유지시킴으로써 각각의 항체의 농도가 감소한다. 따라서, 허용되는 효능을 유지시키면서 조성물 내에 포함될 수 있는 항체의 수에 제한이 있음이 예상된다. 표면 플라즈몬 공명 결합 연구 및 증식 검정으로부터의 관찰에 기초하고, 제품 실험(manufacture challenge)을 적절히 고려함으로써, 항체의 수를 6에서 7, 8, 9, 10개 이상으로 증가시킴으로써 제한된(존재시) 추가 장점이 수득되는 것이 예상된다. 물론, 이는 10개 이상, 예를 들어, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 항체 또는 이 이상, 예를 들어, 25개의 항체 또는 이 이상, 예를 들어, 30개의 항체 또는 이 이상, 예를 들어, 40개의 항체 또는 이 이상, 예를 들어, 50개의 항체 또는 이 이상을 포함하는 것을 배제하지 않는다.
3개 이상의 비-중첩 EGFR 에피토프에 결합할 수 있는 항체가 본 발명의 항체 조성물 내에 포함되는 것이 바람직하나, 2개의 비-중첩 EGFR 에피토프에 결합할 수 있는 항체의 특정 조합물로 우수한 결과가 또한 수득되었다. 이러한 바람직한 "2개 항체" 조성물은 본 발명의 항체 조성물을 고안하는 방법과 관련된 지침과 함께 하기에 보다 상세하게 기술된다. 항체 992, 1030 및 1042를 포함하는 3개 항체 조성물에 비해, 992 및 1024의 단지 2개의 항체를 갖는 조성물을 이용하는 경우에 유사하거나 심지어 개선된 효능이 수득될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 항체 1024 및 1042는 동일한 클러스터에 속하며, 따라서 효과에 있어서 동일한 결합 특이성을 갖고, 최종 분화에 대한 효과를 포함하는 3개의 항체 조성물에 대해 관찰된 결과가 조성물 내의 단지 2개의 결합 특이성(992 및 1024/1042)에 의한 것일 수 있다.
한 구체예에서, 조성물 내의 1개 이상의 항체는 도메인 Ⅲ 에피토프에 결합하고, 더욱 바람직하게는 조성물은 2개 이상의 항체 결합 도메인 Ⅲ 에피토프를 포함하고, 조성물은 또한 3개의 항체 결합 도메인 Ⅲ 에피토프를 포함할 수 있다.
바람직하게는, 조성물은 도메인 Ⅰ 에피토프에 결합하는 1개 이상의 항체를 포함하고, 이는 도메인 Ⅰ 에피토프에 결합하는 2개 이상의 항체를 포함할 수 있다.
바람직하게는, 조성물은 도메인 Ⅱ 에피토프에 결합하는 1개 이상의 항체를 포함하고, 이는 2개의 도메인 Ⅱ 에피토프에 결합하는 항체를 포함할 수 있다.
조성물은 또한 본원에 정의된 바와 같이 도메인 Ⅰ/Ⅱ 에피토프에 결합하는 항체를 포함할 수 있다.
조성물은 도메인 Ⅳ 에피토프에 결합할 수 있는 항체를 포함할 수 있다.
바람직하게는, 조성물은 EGF 결합을 억제할 수 있는 1개 이상의 항체 분자를 포함한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 조성물은 EGFR의 인산화를 방지할 수 있는 항체를 포함할 수 있다.
또한, 조성물은 EGFR의 내재화/분해를 향상시킬 수 있는 항체를 포함할 수 있다.
한 바람직한 구체예에서, 조성물은 1개 이상의 도메인 Ⅲ 항체 및 1개 이상의 도메인 Ⅰ/Ⅱ 항체를 포함한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 조성물은 2개 이상의 도메인 Ⅲ 항체 및 1개의 도메인 Ⅰ 항체를 포함한다.
한 추가의 바람직한 구체예에서, 조성물은 2개 이상의 도메인 Ⅲ 항체, 예를 들어, 3개 이상의 도메인 Ⅲ 항체를 포함한다.
조성물의 항체는 비-인간 가변 사슬 및 인간 불변 사슬을 갖는 키메라 항체일 수 있다. 비-인간 가변 사슬은 마우스, 래트, 양, 돼지, 닭, 비-인간 영장류 또는 다른 적절한 동물로부터 유래될 수 있다. 완전한 인간 항체를 수득하기 위해, 항체는 인간 항체 유전자를 이용하여 트랜스제닉 동물에서 생성될 수 있다. 상기 항체는 또한 비-인간 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열로 이식된 소위 인간화 항체일 수 있다.
바람직하게는, 인간 불변 사슬은 IgG1 또는 IgG2 동형이다. 더욱 바람직하게는, 조성물 내의 모든 항체는 제조의 용이성을 위해 동일한 동형을 갖는다. 그러나, 조성물 내에 상이한 동형의 항체를 포함하는 것이 이로울 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 항체 조성물은 인간 EGFR, 돌연변이된 인간 EGFR, 및 인간 EGFR의 결실 변이체로 구성된 군으로부터 선택된 EGFR에 결합할 수 있는 항체를 포함한다. 바람직하게는, 항체는 인간 및 비-인간 영장류 EGFR 둘 모두에 결합할 수 있어, 이들은 임상 실험 전에 관련 독성학 연구에서 시험될 수 있다. 바람직하게는, 비-인간 영장류는 시노몰구스 원숭이(마카카 파스시큘라리스(Macaca fascicularis))이다.
3개 이상의 별개의 에피토프에 결합하는 항체를 이용하여 EGFR 의존성 암을 치료하는 상기 확인된 개념을 뒷받침하기 위해, 본 발명자들은 EGFR에 특이적인 일련의 키메라 마우스/인간 항체를 확인하고, 제조하고, 특성규명하였다. 이러한 키메라 항체는 에르비툭스™ 및 벡티빅스™으로 예시되는 당 분야의 현재의 모노클로날 항체에 대해 개별적 및 혼합물로 비교되었다.
표 1은 개별적 키메라 항체 및 이와 관련된 특징의 요약을 나타낸다. 항체 번호는 본 출원을 통해 사용된 참조 번호이다. 특이성 도메인은 실시예 3에서 입증된 바와 같이 항체가 결합하는 EGFR 도메인이다. deltaEGFR은 실시예 1에 기술된 바와 같이 EGFR 돌연변이(EGFRvⅢ)에 결합하는 항체의 능력이다. 시노몰구스 EGFR은 시노몰구스 EGFR에 결합하는 항체의 능력이다(실시예 10). EGFR 억제는 EGF 결합을 억제하는 항체의 능력이다(실시예 4). 증식은 암 세포주 A431 및 HN-5의 증식을 억제하는 항체의 능력이다(실시예 6).
표 1. 본 발명의 항체
항체 번호 특이성 deltaEGFR 시노몰구스 EGFR EGF 억제 증식
992 도메인 Ⅲ 없음/약함 있음 있음/약함 있음
1030 도메인 Ⅲ 있음 있음 있음 있음
1024 도메인 Ⅲ 있음 있음 있음
1042 도메인 Ⅲ 약함 있음 (있음) 있음
1277 도메인 Ⅲ 있음 있음 있음 HN5
1254 도메인 Ⅲ 있음 있음 있음 HN5
1208 도메인 Ⅲ 있음 있음 있음 있음 HN5 +/- 992
1320 도메인 Ⅲ 약함 없음 있음 있음
1257 도메인Ⅰ/Ⅱ 없음 있음 없음 있음
1261 도메인Ⅰ 없음 있음 없음 있음
1229 없음 도메인Ⅰ/Ⅱ 있음 없음 없음 있음(A431)
1284 도메인Ⅰ 없음 있음 있음 있음
1344 도메인Ⅰ/Ⅱ 없음 있음 nd HN5 w/992
1260 도메인Ⅰ/Ⅱ 없음 있음 있음 A431
1308 도메인Ⅰ 없음 있음 nd HN5 w/992
1347 도메인Ⅰ 없음 있음 nd HN5 w/992
1428 도메인Ⅰ&Ⅱ 없음 있음 있음 HN5 w/992
증식, 결합, 수용체 분해/비활성화, 및 운동성 검정, 및 동물 모델에서 단독 및 조합되어 시험된 키메라 항체로 생성된 데이터로부터, 다수의 결론이 도출될 수 있었다.
2개의 암 세포주 HN-5 및 A431로 수득된 결과(실시예 6)를 다양한 암 세포주(MDA-MB-468 유방암 세포주; DU145 - 전립선암 세포주)를 이용하여 반복하였다. 이러한 실험으로부터 명백한 것은 본 발명자들에 의해 제공된 항체의 조합물이 매우 광범위한 암 세포주에 대해 효능을 나타낸다는 점이며, 이는 다양한 EGFR 형태에 대한 항체 조성물의 효능을 뒷받침한다.
생리학적 농도의 리간드(EGF)가 첨가되지 않는 경우 보다 상기 EGF가 성장 배지에 첨가되는 증식 검정에서 항체 혼합물의 우수성이 보다 높은 것으로 밝혀졌다(도 17). 문헌[Hayashi and Sakamoto 1998 J Pharmacobiodyn 11;146-51]에 따르면, 혈청은 약 1-1.8 ng/ml 또는 0.2-0.3 nM의 EGF를 함유하는 반면, 위액은 0.3 ng/ml(약 0.05 nM)을 함유하는 것으로 보고되어 있다(Pessonen et al. 1987 Life Sci. 40; 2489-94). 생체내 환경에서, EGF 및 다른 EGFR 리간드가 존재하는 것으로 보이며, 따라서 EGFR 리간드의 존재하에서 효과적인 항체 혼합물의 능력이 본 발명의 항체 혼합물의 중요한 특징이다.
본 발명의 키메라 마우스/인간 항체는 단독으로 사용되는 경우 보다 조합되어 사용되는 경우에 보다 나은 결과를 제공한다. 이는 여러 실험(예를 들어, 실시예 6 참조)에서 예시되며, 여기서 단독으로 시험되는 항체는 암 세포주(A431-NS)에 대해 단지 보통의 항증식 효과를 나타내나, 조합되어 사용되는 경우 현저하게 우수한 결과를 나타낸다. 이러한 결과는 본 발명의 키메라 항체의 다수의 조합물을 이용하여 입증되었다. 특히 우수한 결과가 항체 992 및 1024를 포함하는 조성물로 수득되었다.
예를 들어, 여러 항체가 항체 992, 1208, 1254 및 1277과 함께 A431-NS 및 HN-5를 이용하는 항증식 검정에서 시험되었다.
수용체 결합 연구는 몇몇 항체가 추가 항체의 결합을 실제로 자극하여, 하나 또는 여러 항체를 이용한 수용체 포화 후에 특정 항체가 보다 많은 양으로 수용체에 결합할 수 있는 것을 나타내었다. 도메인 Ⅲ에 특이적인 항체 992의 결합은 비-중첩 에피토프에 결합하는 하나 이상의 항체를 이용한 사전의 수용체 포화에 의해 수득되는 상기 상승작용적 효과의 이점을 명백히 얻는다. 이러한 협동적인 효과의 또 다른 예는 공지되지 않은 에피토프에 특이적인 항체 1396이 비-중첩 에피토프에 결합하는 항체로 포화된 EGFR에 대해 시험되는 경우에 관찰된다.
수용체 결합 연구는 또한 6개 이상의 항체가 EGFR의 세포외 도메인에 동시에 결합할 수 있는 것을 밝혀내었다. 이러한 6개의 항체는 3개의 도메인 Ⅲ 항체, 1개의 도메인 Ⅰ 항체, 1개의 도메인 Ⅰ/Ⅱ 항체, 및 1개의 공지되지 않은 에피토프에 결합하는 항체이다. 흥미롭게도, 3개의 도메인 Ⅲ 항체의 결합은 추가 항체의 후속 결합을 촉진하는 것으로 보인다. 이는 별개의 에피토프에 결합하는 여러 항체를 갖는 항체 조성물을 제공하는 개념을 명백하게 뒷받침한다.
EGFR에 대한 항체 조성물의 조성물을 고안하는 경우, 바람직하게는 비-중첩 에피토프를 갖는 항체가 사용되는데, 이는 이들이 보다 높은 상승작용적 효과를 제공하기 때문이다.
혼합물의 항체 중 하나 이상(단독으로 시험하는 경우)이 EGFR에 대한 리간드의 결합을 억제, 예를 들어, EGF 결합을 억제하고/하거나, TGFalpha 결합을 억제하고/하거나, 앰피레귤린(amphiregulin) 결합을 억제할 수 있는 것이 또한 바람직하다. 바람직하게는, EGF 결합을 억제할 수 있는 항체는 항체 992, 1030, 1024, 1042, 1208, 1254, 1277, 1284, 1320 및 1428로 구성된 군, 더욱 바람직하게는 항체 1208, 1260, 1277 및 1320으로 구성된 군으로부터 선택된다.
항체 혼합물 내의 하나 이상의 항체 일원이 EGFR 인산화를 감소시킬 수 있는 것이 또한 바람직하다. 이러한 특성을 갖는 본 발명의 항체의 예는 992, 1030, 1042, 1208, 1277 및 1320을 포함한다.
EGFR의 도메인 Ⅲ는 수용체에 대한 리간드 결합에 중요하다. 또한, 도메인 Ⅲ에 대한 항체 결합은 구속된 단량체 형태에서 EGFR을 안정화시켜, 수용체 신호전달을 발생시키지 않을 수 있다. 이러한 이유에 대해, 항체 조성물이 도메인 Ⅲ에 대한 특이성을 갖는 1개 이상의 항체를 함유하는 것이 바람직하다. 바람직한 도메인 Ⅲ 항체는 항체 992, 1024, 1030, 1208, 1254, 1277 및 1320를 포함한다. 더욱 바람직하게는, 적어도 도메인 Ⅲ 항체는 항체 992, 1254, 1277, 1208 및 1320으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 항체 조성물은 바람직하게는 1개 이상의 도메인 Ⅲ 항체, 예를 들어, 3개 이상의 도메인 Ⅲ 항체, 예를 들어, 4개 이상의 도메인 Ⅲ 항체, 예를 들어, 5개 이상의 도메인 Ⅲ 항체, 예를 들어, 6개 이상의 도메인 Ⅲ 항체를 포함할 수 있다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 항체 조성물은 1개 이상의 도메인 Ⅰ 항체를 포함한다. 바람직하게는, 1개 이상의 도메인 Ⅰ 항체는 항체 1284, 1308, 1344 및 1347로 구성되는 군으로부터 선택된다. 더욱 바람직하게는, 1개 이상의 도메인 Ⅰ 항체는 항체 1284 및 1347로 구성되는 군으로부터 선택된다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 항체 조성물은 1개 이상의 도메인 Ⅰ/Ⅱ 항체를 포함한다. 바람직하게는, 1개 이상의 도메인 Ⅰ/Ⅱ 항체는 항체 1257, 1260, 1261, 1428 및 1434로 구성되는 군으로부터 선택된다. 더욱 바람직하게는, 1개 이상의 도메인 Ⅰ/Ⅱ 항체는 항체 1261 및 1260으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
본 발명으로부터의 2개의 항체의 효과적인 특정 조합물은 하기를 포함한다:
항체 1024, 1320, 1308, 1284, 1260 또는 1030, 바람직하게는 1320 또는 1284와 함께 항체 1280.
항체 1024, 1030, 1260, 1284, 1308 또는 1320, 바람직하게는 1320, 1284 또는 1260과 함께 항체 1254.
항체 1024, 1030, 1260, 1284, 1308 또는 1320, 바람직하게는 1320, 1284 또는 1260과 함께 항체 1277.
항체 1030, 1260, 1284, 1308, 1320 또는 1024, 바람직하게는 1320, 1024 또는 1284와 함께 항체 992.
2개의 항체의 우수하고 바람직한 혼합물의 예는 992+1024; 992+1320; 992+1042; 1277+1320; 1208+1320을 포함한다. 특히 바람직한 것은 992+1024이다.
3개의 항체를 갖는 바람직한 혼합물은 항체 992+1030+1042; 992+1320+1024; 992+1024+1030; 1320+1284+1261; 1320+1214+1320; 992+1284+1320; 992+1255+1024; 992+1030+1320; 992+1024+1214; 992+1261+1320; 992+1024+1284; 992+1024+1211; 992+1024+1030; 1260+1214+1254; 992+1255+1320; 992+1211+1320; 992+1030+1261; 992+1260+1030; 992+1260+1320; 992+1030+1214를 포함한다.
4개의 항체를 갖는 바람직한 혼합물은 항체 992+1320+1024+1030; 992+1024+1030+1284; 1277+1320+1260+1347; 1277+1320+1261+1347; 1277+1320+1261+1284; 1254+1320+1260+1347; 1254+1320+1261+1347; 1254+1320+1261+1284; 1254+1024+1260+1347; 1254+1024+1261+1347; 1254+1024+1261+1284; 1277+1024+1260+1347; 1277+1024+1261+1347; 1277+1024+1261+1284를 포함한다.
5개의 항체를 갖는 바람직한 혼합물은 992+1030+1024+1260+1347; 992+1030+1024+1261+1347; 992+1030+1024+1261+1284; 992+1030+1320+1260+1347; 992+1030+1320+1261+1347; 992+1030+1320+1261+1284를 포함한다.
8개의 항체를 갖는 한 바람직한 혼합물은 992+1030+1024+1277+1254+1320+1260+1261+1284+1347을 포함한다.
또한, 비-인간 영장류에서 독성학 연구를 수행할 수 있도록 하기 위해, 조성물 내의 모든 항체가 인간 뿐만 아니라 하나 이상의 추가의 영장류 EGFR, 예를 들어, 침팬지, 마카카 물라타(Macaca mulatta), 레수스(Rhesus) 원숭이 및 다른 원숭이, 또는 시노몰구스 원숭이로부터의 EGFR에 결합하는 것이 바람직하다. 시노몰구스 원숭이는 비교적 작은 동물이며, 독성학 연구에 매우 적합하다. 따라서, 추가의 영장류 EGFR은 바람직하게는 시노몰구스 EGFR이다. 바람직하게는, 상기 항체는 인간 및 비-인간 영장류 EGFR에 대략 동일한 친화성으로 결합한다.
본 발명은 하나의 조성물에 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8개의 항체를 조합시키는 경우 하나 이상의 기능성 검정에서 우수한 결과를 나타내었다. 이러한 데이터는 조성물 내의 항체의 수의 선택에 대한 지침을 제공하나, 이는 현재 제한적인 방식으로 이해된다. 실험 데이터는 단지 6개 항체의 동시 결합을 나타내지만, 조성물은 8개 이상의 항체를 포함할 수 있다. 항체 일원의 청소율에서의 차이와 같은 조성물 내에 6개 이상의 항체를 포함하는 다른 이유가 존재할 수 있다.
조성물의 항체의 추가의 바람직한 특징은 단백질 동질성이며, 이러한 항체는 용이하게 정제될 수 있다. 개별적 항체 일원에 대해, 하나의 명백한 피크를 갖는 이온 교환 크로마토그래피 프로파일이 특성규명의 용이성에 바람직하다. 명백한 이온 교환 크로마토그래피 프로파일이 또한 최종 항체 조성물의 특성규명의 용이함에 바람직하다. 항체가 이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 식별될 수 있어, 모든 항체를 갖는 조성물이 한 번의 수행으로 특성규명될 수 있는 것이 또한 바람직하다.
항체는 임의의 기원, 예를 들어, 인간, 뮤린, 래빗, 닭, 돼지, 라마 및 양 기원일 수 있다. 항체는 또한 실시예에 기술된 바와 같이 키메라일 수 있거나, 당 분야에 널리 공지된 방법을 이용하는 이의 인간화, 과인간화(superhumanised) 또는 재형성 형태일 수 있다.
바람직한 항체 조성물
첨부된 실시예에 나타난 바와 같이, 항체 992 및 1024에 기초한 항-EGFR 조성물은 독특하고 명백한 특성을 갖는다. 항체 992의 결합은 1024를 포함하는 다른 항체의 결합에 의해 향상된다. 시판되는 항체와는 대조적으로, 992 및 1024 둘 모두는 세포에 제시된 형태적 에피토프에 우선적으로 결합한다(실시예 14 및 15). 992 및 1024 둘 모두의 에피토프는 에르비툭스 및 벡티빅스 에피토프(들)과 중첩되나, 이와는 다르다. 개별적 항체가 비-중첩 에피토프에 결합하는 다수의 다른 2-항체 조성물과는 대조적으로, 항체 992 및 1024의 결합 특이성에 기초한 조성물은 수용체 내재화를 신속하고 효과적으로 촉발(trigger)시킨다. 증가된 인볼루크린 발현 및 각화 진주(keratin pearl)의 출현을 수반하는 최종 분화를 포함하는 신규한 작용 메커니즘이 항체 992 및 1024에 기초한 항체 조성물의 처리 후 동물 모델에서 관찰된다. 이러한 독특한 작용 메커니즘은 시험관내 및 생체내에서 더욱 효과적이고 지속된 성작 억제를 발생시킨다. 이는 종양이 처리 종료 후에도 지속적으로 감소하는 생체내 예에서 가장 명백하게 관찰된다. 에르비툭스를 투여하는 대조군에서, 종양은 처리 종료 후 곧 성장하기 시작한다. 이는 상이한 작용 메커니즘을 명백하게 나타낸다.
신규한 작용 메커니즘은 하나의 항체 조성물 내의 항체 992 및 1024에 의해 나타난 2개의 결합 특이성의 조합을 이용하여 달성되는 것으로 생각된다. 이러한 작용 메커니즘은 항체 992 및 1024와 경쟁하지 않는 제 3의 항체가 사용되는 경우, 예를 들어, 항체 992, 1024 및 1030의 삼중 조합물에서 또한 관찰된다.
이러한 관찰은 2개 이상의 별개의 항-인간 EGFR 항체 분자를 포함하는 항체 조성물을 고안하게 하였고, 여기서 제 1의 별개의 항-EGFR 항체 분자는 항체 992, 항체 992의 VL(서열 목록 번호:72의 아미노산 3-109) 및 VH(서열 목록 번호:40의 아미노산 3-124) 서열을 포함하는 항체, 항체 992의 CDR3(서열 목록 번호:116 및 111)를 갖는 항체, 항체 992와 동일한 에피토프에 결합하는 항체, 및 인간 EGFR에 대한 항체 992의 결합을 억제할 수 있는 항체로 구성되는 군으로부터 선택되고; 제 2의 별개의 항-EGFR 항체 분자는 항체 1024, 항체 1024의 VL(서열 목록 번호:73의 아미노산 3-114) 및 VH(서열 목록 번호:41의 아미노산 3-120) 서열을 포함하는 항체, 항체 1024의 CDR3(서열 목록 번호:120 및 114)를 갖는 항체, 항체 1024와 동일한 에피토프에 결합하는 항체, 및 인간 EGFR에 대한 항체 1024의 결합을 억제할 수 있는 항체로 구성된 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, 상기 제 1의 별개의 항-EGFR 항체 분자는 항체 992, 항체 992의 VL 및 VH 서열을 포함하는 항체, 항체 992의 CDR3를 갖는 항체, 및 항체 992와 동일한 에피토프에 결합하는 항체로 구성된 군으로부터 선택되고; 상기 제 2의 별개의 항-EGFR 항체 분자는 항체 1024, 항체 1024의 VL 및 VH 서열을 포함하는 항체, 항체 1024의 CDR3를 갖는 항체, 및 항체 1024와 동일한 에피토프에 결합하는 항체로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명은 동일한 결합 특이성을 갖는 항체를 제공하기 위해 항체 992 및 1024의 CDR3 서열 내에 돌연변이를 고려한다. 따라서, 한 구체예에서, 항체 992와 동일한 결합 특이성을 갖는 항체는 CTX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15W의 식을 갖는 CDRH3를 포함하고, 여기서 X1 내지 X15는 하기 나열된 아미노산의 그룹으로부터 개별적으로 선택되고:
X1 = R 또는 K;
X2 = N, D, E 또는 Q;
X3 = G, A, V 또는 S;
X4 = D, E, N 또는 Q;
X5 = Y, F, W 또는 H;
X6 = Y, F, W 또는 H;
X7 = V, I, L 또는 A;
X8 = S, T, G 또는 A;
X9 = S, T, G 또는 A;
X10 = G, A, V 또는 S;
X11 = D, E, N 또는 Q;
X12 = A, G, V 또는 S;
X13 = M, L, I 또는 V;
X14 = D 또는 E; 및
X15 = Y 또는 F;
항체 992와 동일한 결합 특이성을 갖는 항체는 CX1X2X3X4X5X6PPTF의 식으로 기재되는 CDRL3를 포함하고, 여기서 X1 내지 X6은 하기 나열된 아미노산의 그룹으로부터 개별적으로 선택된다:
X1 = Q 또는 H;
X2 = H, E 또는 Q;
X3 = Y, F, W 또는 H;
X4 = N, Q 또는 H;
X5 = T, S, G 또는 A; 및
X6 = V, I, L 또는 A.
한 구체예에서, 항체 1024와 동일한 결합 특이성을 갖는 항체는 CVX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11W의 식을 갖는 CDRH3를 포함하고, 여기서 X1 내지 X11은 하기 나열된 아미노산의 그룹으로부터 개별적으로 선택되고:
X1 = R 또는 K;
X2 = Y, F, W 또는 H;
X3 = Y, F, W 또는 H;
X4 = G, A, V 또는 S;
X5 = Y, F, W 또는 H;
X6 = D, E, N 또는 Q;
X7 = E 또는 D;
X8 = A, G, V 또는 S;
X9 = M, L, I 또는 V;
X10 = D, E, N 또는 Q; 및
X11 = Y 또는 F;
항체 1024와 동일한 결합 특이성을 갖는 항체는 CX1X2X3X4X5X6PX7TF의 식으로 기재되는 CDRL3를 포함하고, 여기서 X1 내지 X7은 하기 나열된 아미노산의 그룹으로부터 개별적으로 선택된다:
X1 = A, G 또는 V;
X2 = Q 또는 H;
X3 = N, Q 또는 H;
X4 = L, I, M 또는 V;
X5 = E, D, N 또는 Q;
X6 = L, I, M 또는 V; 및
X7 = Y, F, W 또는 H.
돌연변이된 CDR3를 갖는 항체는 표준 기술을 이용하여 제조될 수 있고, 본원에 기재된 방법을 이용하여 발현되고, 결합에 대해 시험될 수 있다.
본 발명의 이러한 양태에 따른 항체는 키메라, 인간, 인간화, 재형성 또는 과인간화 항체일 수 있다. 이는 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 항체 992 및 1024는 실시예 18에 기재된 방법을 이용하여 인간화될 수 있다. "과인간화" 방법은 US 6,881,557호에 기재되어 있다.
더욱 바람직하게는, 상기 제 1의 별개의 항-EGFR 항체 분자는 항체 992, 항체 992의 VL 및 VH 서열을 포함하는 항체, 및 항체 992의 CDR3를 갖는 항체로 구성되는 군으로부터 선택되고; 상기 제 2의 별개의 항-EGFR 항체 분자는 항체 1024, 항체 1024의 VL 및 VH 서열을 포함하는 항체, 및 항체 1024의 CDR3를 갖는 항체로 구성되는 군으로부터 선택된다.
더욱 바람직하게는, 상기 제 1의 별개의 항-EGFR 항체 분자는 항체 992, 및 항체 992의 VL 및 VH 서열을 포함하는 항체로 구성되는 군으로부터 선택되고; 상기 제 2의 별개의 항-EGFR 항체 분자는 항체 1024, 및 항체 1024의 VL 및 VH 서열을 포함하는 항체로 구성되는 군으로부터 선택된다.
가장 바람직하게는, 조성물은 항체 992 및 1024를 포함한다.
기재된 바와 같이, 제 1 및 제 2 항-EGFR 항체는 바람직하게는 서로 인간 EGFR에 대한 결합을 억제하지 않는다. 더욱 더 바람직하게는, 항체 중 하나 이상은 인간 EGFR과 관련하여 다른 항체의 최대 결합 능력을 증가시킬 수 있다. 이러한 효과는 항체 992 및 1024에 대해 관찰된다(실시예 16).
2개의 항체 사이의 비는 정확하게 1:1의 비일 필요는 없다. 결과적으로, 조성물 내에서 제 2 항체와 대비한 제 1 항체의 비율은 5 내지 95%, 예를 들어, 10 내지 90%, 바람직하게는 20 내지 80%, 더욱 바람직하게는 30 내지 70%, 더욱 바람직하게는 40 내지 60%, 예를 들어, 45 내지 55%, 예를 들어, 약 50%일 수 있다.
바람직하게는, 제 1 및 제 2 항체는 동형 IgG1, 또는 IgG2이다.
본 발명자들에 의해 확인된 항체 992와 동일한 항체에 결합하는 항체의 예는 클론 1209, 1204, 992, 996, 1033 및 1220를 포함하는 항체 클러스터로부터의 항체이다.
본 발명자들에 의해 확인된 항체 1024와 동일한 에피토프에 결합하는 항체의 예는 클론 1031, 1036, 1042, 984, 1024, 1210, 1217, 1221 및 1218을 포함하는 항체 클러스터로부터의 항체이다.
CDR3는 항체의 결합 특이성을 결정한다. 바람직한 구체예에서, 항체 992의 CDR3를 포함하는 항체는 추가로 항체 992의 VH 및 VL의 CDR1 및 CDR2를 포함한다. 마찬가지로, 항체 1024의 CDR3를 포함하는 항체는 바람직하게는 추가로 항체 1024의 VH 및 VL의 CDR1 및 CDR2를 포함한다. 항체의 CDR 서열은 표 12, 실시예 17에서 발견될 수 있다.
다른 구체예에서, 항체 992와 경쟁하는 항체는 항체 1208, 1254 및 1277로 구성되는 군으로부터 선택된다. 마찬가지로, 항체 1024와 경쟁하는 항체는 항체 1042 및 1320으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.
한 구체예에서, 조성물은 상기 제 1 및 제 2 항체 외에 추가의 항체를 함유하지 않고, 더욱 바람직하게는 추가의 항-EGFR 항체를 함유하지 않는다.
다른 구체예에서, 조성물은 제 3의 별개의 항-EGFR 항체를 추가로 포함하고, 여기서 상기 제 3의 별개의 항-EGFR 항체 분자는 항체 1030, 항체 1030의 VL(서열 목록 번호:74의 아미노산 3-113) 및 VH(서열 목록 번호:42의 아미노산 3-120) 서열을 포함하는 항체, 항체 1030의 CDR3(서열 목록 번호:112 및 119)를 갖는 항체, 항체 1030과 동일한 에피토프에 결합하는 항체, 및 인간 EGFR로의 항체 1030의 결합을 억제할 수 있는 항체로 구성되는 군으로부터 선택된다. 상기 제 3의 항체는 바람직하게는 상기 제 1 및/또는 제 2의 항체의 인간 EGFR에 대한 향상된 결합을 야기시킨다. 한 구체예에서, 조성물은 상기 제 1, 제 2, 및 제 3의 항체 외에 추가의 항체를 함유하지 않고, 더욱 바람직하게는 추가의 항-EGFR 항체를 함유하지 않는다.
항체 1030과 동일한 에피토프로에 결합하는 항체는 클론 1195, 1030, 1034, 1194, 980, 981, 1246 및 1223으로 구성된 항체 클러스터로부터 선택될 수 있다.
항체 1030의 CDR3를 포함하는 항체는 항체 1030의 VH 및 VL의 CDR1 및 CDR2를 추가로 포함할 수 있다.
항체는 투여를 위한 한 용기로 제형화될 수 있다. 그러나, 이들은 개별적으로 제조되고, 정제되고, 특성규명될 수 있고, 각각의 용기에 하나의 항체를 갖는 부품 키트(kit of parts)로서 2개 또는 3개의 별개의 용기로 제공될 수 있다. 이에 따라, 이들은 동시, 연속 또는 별개로 투여될 수 있다.
한 추가 양태에서, 항체 992 및 1024의 2개의 결합 특이성이 하나의 이중특이성 결합 분자로 조합될 수 있다. 바람직하게는, 이중특이성 결합 분자는 항체 992 및 1024의 CDR, 더욱 바람직하게는 항체 992 및 1024의 VH 및 VL 서열을 포함한다. 이중특이성 결합 분자는 실시예 19에 기재된 바와 같이 이중-가변-도메인 항체일 수 있다. 이중특이성 결합 분자는 또한 문헌에 기재된 바와 같이 이중특이성 Fab-단편, 이중특이성 scFV, 또는 디아바디(diabody)의 형태로 고안될 수 있다.
항체 992 및 1024의 결합 특이성에 기초한 항체 조성물은 바람직하게는 수용체 내재화, 생체내에서의 A431NS 종양의 퇴행, 생체내에서의 A431NS 세포에서의 최종 분화 유도, 및 생체내에서의 종양 인볼루크린 발현의 상향조절 중 하나 이상을 발생시킨다.
본 출원은 항체 992 및 1024의 조합물과 동일하거나 유사한 효과를 갖는 항체의 여러 예를 제공한다. 이러한 예는 동일한 면역화로부터 수득되고 동일한 클러스터에 속하는 항체, 및 2개의 항체 중 1개와 개별적으로 경쟁하는 항체를 포함한다. 동일하거나 유사한 효과를 갖는 항체 조성물은 항체 992 및 1024의 VL 및 VH 서열에 기초하고, 또한 상기 항체의 CDR, 특히 2개 항체의 CDR3에 기초하여 고안될 수 있다.
동일하거나 유사한 효과를 갖는 추가 항체 조성물은 본질적으로 실시예에 기재된 바와 같은 면역화 및 스크리닝을 수행함으로써 제조될 수 있다. 항체 992 및 1024와 동일한 결합 특이성을 갖는 항체는 본원에 기재된 바와 같은 2개의 별개의 경쟁 검정으로 확인될 수 있다. 최종적으로, 1개의 항체가 다른 항체의 결합을 향상시키는 항체 조성물은 본질적으로 실시예 16에 기재된 바와 같은 결합 실험을 수행함으로써 확인될 수 있다. 항체 조성물은 수용체 내재화에 대한 효과, 시험관내 및 생체내 효능, 결합 친화성 등에 대해 실시예에서 기재된 바와 같이 추가로 스크리닝될 수 있다.
본 발명의 항체 조성물의 용도
EGFR 발현(예를 들어, 과발현)과 관련된 질병의 생체내 치료 및 예방에 사용하기 위해, 본 발명의 항체는 임의의 적절한 투여 경로, 예를 들어, 주사 및 항체-기재 임상 제품에 대해 당 분야에 공지된 다른 투여 경로를 이용하여 치료적 유효량(예를 들어, 성장 억제, 포식작용, 운동성 감소, 최종 분화, 및/또는 EGFR을 발현하는 종양 세포의 사멸을 발생시키는 투여량)으로 환자(예를 들어, 인간 피검체)에 투여된다.
본 발명의 항체를 이용하여 치료되고/되거나, 개선되고/되거나, 예방될 수 있는 통상적인 EGFR-관련 질병은 자가면역 질병 및 암을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 치료되고/되거나, 개선되고/되거나, 예방될 수 있는 암은 방광, 유방, 자궁/경부, 결장, 신장, 난소, 전립선, 신세포, 췌장, 결장, 직장, 위, 편평 세포, 폐(비-소세포), 식도, 두경부, 및 피부의 암을 포함한다. 치료될 수 있는 자가면역 질병은, 예를 들어, 건선을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 교모세포종(glioblastoma), 예를 들어, 다형성 교모세포증(glioblastoma multiforme); 별아교세포종(astrocytoma), 예를 들어, 유년기 별아교세포종; 신경아교종(glioma); 신경모세포종(neuroblastoma); 위장관의 신경내분비종(neuroendocrine tumor); 기관지폐포 암종(bronchoalveolar carcinoma); 모낭수지상 세포 육종(follicular dendritic cell sarcoma); 타액선 암종(salivary gland carcinoma); 에나멜모세포종(ameloblastoma); 악성 말초 신경판 종양(malignant peripheral nerve sheet tumor); 내분비 췌장 종양; 또는 고환 생식세포 종양(testicular germ cell tumor), 예를 들어, 고환종(seminoma), 배아암종(embryonal carcinoma), 난황낭 암종(yolk sac tumor), 기형종(teratoma) 및 융모막암종(choriocarcinoma)을 치료하고/하거나, 개선시키고/시키거나, 예방하는 방법에 관한 것이다.
가변 중쇄 및 가변 경쇄 코딩 쌍의 분리 및 선택
항-EGFR 재조합 항체 조성물을 생성하는 방법은 적합한 공급원으로부터 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL)를 코딩하는 서열을 분리시켜, VH 및 VL 코딩 쌍의 레퍼토리를 생성하는 것을 포함한다. 일반적으로, VH 및 VL 코딩 서열을 수득하기에 적합한 공급원은 인간 EGFR 폴리펩티드 또는 펩티드, 또는 인간 EGFR을 발현하는 세포로부터 유래된 EGFR 단백질, 또는 인간 EGFR을 발현하는 세포 또는 이러한 세포의 분획으로 면역화/백신화된 비-인간 동물로부터의 혈액, 비장 또는 골수 샘플과 같은 림프구 함유 세포 분획이다. 바람직하게는, 분획을 함유하는 림프구가 비-인간 포유동물 또는 인간 면역글로불린 유전자를 지니는 트랜스제닉 동물로부터 수집된다. 수집된 림프구 함유 세포 분획은 특정 림프구 집단, 예를 들어, B 림프구 계통으로부터의 세포를 수득하기 위해 추가로 부화될 수 있다. 바람직하게는, 부화는 자기 비드 세포 분류(MACS) 및/또는 형광 활성화된 세포 분류(FACS)를 이용하여 수행되며, 이것은, 예를 들어, B 세포, 혈장 모세포 및/또는 혈장 세포의 경우에 계통-특이적인 세포 표면 마커 단백질의 이점을 지닌다. 바람직하게는, 림프구 함유 세포 분획은 B 세포, 혈장 모세포 및/또는 혈장 세포에 대해 부화되거나 분류된다. 더욱 바람직하게는, CD43 및 CD138의 높은 발현을 지니는 세포가 비장 또는 혈액으로부터 분리된다. 이러한 세포는 종종 순환 혈장 세포, 조기 혈장 세포 또는 혈장 모세포라고 불린다. 다른 용어가 상호교환적으로 사용될 수 있으나, 용이하게 하기 위해 본 발명에서는 이들을 단지 혈장 세포라고 부른다.
VH 및 VL 코딩 서열의 분리는 전통적인 방식으로 수행될 수 있고, 여기서 VH 및 VL 코딩 서열은 무작위로 벡터에 조합되어 VH 및 VL 코딩 서열 쌍의 조합 라이브러리를 생성한다. 그러나, 본 발명에서, EGFR 면역화 시에 체액성 면역 반응에서 생성되는 항체의 다양성, 친화성 및 특이성을 반영하는 것이 바람직하다. 이는 공여체에 원래 존재하는 VH 및 VL 페어링의 유지를 수반함으로써 각 쌍이 서열이 분리되는 공여체에 의해 생성된 항체에 원래 존재하는 VH 및 VL 쌍에 상응하는 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL)를 엔코딩하는 서열 쌍의 레퍼토리를 발생시킨다. 이는 VH 및 VL 엔코딩 서열의 동족체 쌍으로도 불리며 항체는 동족체 항체라고 불린다. 바람직하게는 조합이거나 동족체인 본 발명의 VH 및 VL 코딩 쌍은 뮤린 공여체로부터 수득되며, 따라서 서열은 뮤린 서열이다.
VH 및 VL 엔코딩 서열의 동족체 쌍을 생성하기 위한 여러 상이한 접근법이 있으며, 한 접근법은 림프구-함유 세포 분획으로부터 분류된 단일 세포로부터 VH 및 VL 엔코딩 서열을 증폭시키고 분리하는 것을 포함한다. 공여체에서의 VH 및 VL 서열 쌍의 다양성과 유사한 VH 및 VL 엔코딩 서열 쌍의 레퍼토리를 수득하기 위해, WO 2005/042774호(참조로서 본원에 포함됨)에 기재된 바와 같이 가능한 한 VH 및 VL 쌍의 스크램블링이 거의 없는(무작위 조합), 고속-처리(high-throughput) 방법이 바람직하다.
VH 및 VL 엔코딩 서열은 별개로 증폭되고 다음 단계에서 페어링될 수 있거나 증폭 동안 페어링될 수 있다(Coronella et al. 2000. Nucleic Acids Res. 28: E85; Babcook et al 1996. PNAS 93: 7843-7848 and WO 2005/042774). 두번째 접근법은 VH 및 VL 엔코딩 서열을 세포내(in-cell) 증폭하고 페어링하는 것을 포함한다(Embleton et al. 1992. Nucleic Acids Res. 20: 3831-3837; Chapal et al. 1997. BioTechniques 23: 518-524). 세 번째 접근법은 용혈성 플라크 검정을 VH 및 VL cDNA의 클로닝과 조합시키는 선택된 림프구 항체 방법(SLAM)이다(Babcook et al. 1996. PNAS 93 :7843-7848). 마우스를 이용하여 이용될 수 있는 또 다른 방법은 표준 하이브리도마 기술이고, 리드(lead) 후보자의 스크리닝 및 선택, 및 엔코딩된 항체의 이후의 클로닝이 후속된다.
본 발명의 한 바람직한 구체예에서, 일원 쌍이 EGFR 면역화로부터 초래된 체액성 면역 반응의 원인이 되는 유전자 쌍을 반영하는 VH 및 VL 코딩 쌍의 레퍼토리가 하기 단계를 포함하는 방법에 따라 생성된다: ⅰ) 인간 EGFR로 면역화된 동물 공여체로부터의 림프구-함유 세포 분획을 제공하는 단계; ⅱ) 상기 세포 분획으로부터 B 세포 또는 혈장 세포를 임의로 부화시키는 단계; ⅲ) 상기 세포 분획으로부터의 세포를 개별적으로 다수의 용기로 분배시키는 것을 포함하여, 분리된 단일 세포의 집단을 수득하는 단계; ⅳ) 다중 중첩 신장 RT-PCR 절차로 상기 분리된 단일 세포로부터 유래된 주형을 이용하여 VH 및 VL 코딩 쌍을 증폭하고 이의 결합을 실행시키는 단계; 및 ⅴ) 결합된 VH 및 VL 코딩 쌍의 네스티드 PCR을 임의로 수행하는 단계. 바람직하게는, 분리된 동족체 VH 및 VL 코딩 쌍을 하기 기재된 스크리닝 절차로 처리한다.
일단 VH 및 VL 서열 쌍이 생성되면, EGFR 관련 항원에 대한 결합 반응성을 갖는 VH 및 VL 쌍을 엔코딩하는 서열을 스크리닝하는 절차가 수행된다. 바람직하게는, EGFR 관련 항원은 도메인 Ⅲ, Ⅱ, Ⅰ 및/또는 Ⅳ, 도메인의 단편 또는 완전한 세포외 도메인과 같은 EGFR의 세포외 부분을 포함한다. 다른 항원은 EGFR의 결실 돌연변이, 또는 SNP, 또는 이들의 단편과 같은 돌연변이를 포함한다. VH 및 VL 서열 쌍이 조합인 경우, 스크리닝 이전에 EGFR에 결합되는 항체 단편을 코딩하는 VH 및 VL 쌍을 부화시키기 위해 파지 디스플레이 절차를 적용시킬 수 있다.
EGFR로 면역화시 체액성 면역 반응에서 생성된 항체의 다양성, 친화성 및 특이성을 반영하기 위해, 본 발명은 가능한 가장 넓은 다양성을 수득하기 위해 동족체 쌍에 대한 스크리닝 절차를 개발하였다. 스크리닝 목적으로, 동족체 VH 및 VL 코딩 쌍의 레퍼토리를 적합한 숙주 세포로 트랜스펙션되는 세균 또는 포유동물 스크리닝 벡터를 이용하여 항체 단편(예를 들어, scFv 또는 Fab) 또는 전장 항체로서 개별적으로 발현시킨다. Fab/항체의 레퍼토리는 EGFR에 대한 반응성, EGFR을 발현하는 암 세포주에 대한 항증식 활성, EGFR로 결합하는 리간드(예를 들어, EGF)를 억제하는 능력, 인산화의 억제, 아폽토시스의 유도, 및 EGFR 내재화에 대해 스크리닝될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
동시에, Fab/항체의 레퍼토리가 인간 및 임의로 시노몰구스 또는 침팬지 또는 레수스 원숭이 EGFR 펩티드와 같은 선택 항원에 대해 스크리닝된다. 항원성 펩티드는, 예를 들어, 인간 EGFR 세포외 도메인, 인간 돌연변이 EGFR 세포외 도메인, 및 시노몰구스 EGFR 세포외 도메인 또는 이들의 단편으로부터 선택될 수 있다. 펩티드는 스크리닝 동안 비드 또는 플레이트 상으로의 고정을 촉진하기 위해 비오티닐화될 수 있다. 대안적인 고정 수단이 또한 이용될 수 있다. 항원은 EGFR 생물학의 지식에 기초하여 선택되고 이러한 항원에 결합될 수 있는 항체의 예상되는 중화 및/또는 보호 효과가 잠재적으로 제공될 수 있다. 이러한 스크리닝 절차는 조합 파지 디스플레이 라이브러리에 마찬가지로 적용될 수 있다.
스크리닝에 이용되는 재조합 EGFR 단백질은 세균, 곤충 세포, 포유동물 세포 또는 다른 적합한 발현 시스템에서 발현될 수 있다. 정확한 처리(당화를 포함함)를 위해, 단백질은 포유동물 세포에서 발현된다. EGFR-ECD 단백질은 가용성 단백질로서 발현될 수 있거나(막횡단 또는 세포내 영역 없이), 안정성을 증가시키기 위해 제 3의 단백질에 융합될 수 있다. EGFR 단백질이 융합 태그(tag)와 함께 발현되는 경우, 융합 파트너는 스크리닝 전에 절단될 수 있다. 상기 기재된 일차 스크리닝에 더하여, 선택된 서열 중 어느 것도 위 양성(false positive)을 엔코딩하지 않음을 보장하기 위해, 이차 스크리닝이 수행될 수 있다.
일반적으로, 면역학적 검정이 본 발명에서 수행되는 스크리닝에 적합하다. 이러한 검정은 당 분야에 널리 공지되어 있고, 이는, 예를 들어, ELISPOTS, ELISA, FLISA, 막 검정(예를 들어, 웨스턴 블롯), 필터상에서의 어레이 및 FACS로 구성된다. 검정은 임의의 사전 부화 단계 없이 수행될 수 있고, VH 및 VL 쌍을 엔코딩하는 서열로부터 생성된 폴리펩티드를 이용한다. VH 및 VL 코딩 쌍의 레퍼토리가 동족체 쌍인 경우에, 스크리닝에 앞서, 예를 들어, 파지 디스플레이에 의한 어떠한 부화도 요구되지 않는다. 그러나, 조합 라이브러리의 스크리닝에서, 면역검정이 파지 디스플레이, 리보솜 디스플레이, 세균 표면 디스플레이, 효모 디스플레이, 진핵 바이러스 디스플레이, RNA 디스플레이 또는 공유 디스플레이와 같은 부화 방법과 함께 또는 그 이후에 수행되는 것이 바람직하다 (FitzGerald, K., 2000. Drug Discov. Today 5, 253-258에 개관되어 있음).
스크리닝에서 선택된 VH 및 VL 쌍을 엔코딩하는 서열은 일반적으로 서열분석되고, 가변 영역의 다양성에 대해 검정된다. 특히, CDR 영역의 다양성이 흥미로부나, VH 및 VL 과(family) 제시(representation)도 흥미롭다. 이러한 검정에 기초하여, 하나 이상의 동물 공여체로부터 분리된 EGFR 결합 항체의 전체적인 다양성을 나타내는 VH 및 VL 쌍을 엔코딩하는 서열이 선택된다. 바람직하게는, 모든 CDR 영역(CDRH1, CDRH2, CDRH3 및 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3)에서 차이를 지니는 서열이 선택된다. 상이한 VH 또는 VL 과에 속하는 하나 이상의 동일하거나 또는 매우 유사한 CDR 영역을 지니는 서열이 존재하는 경우, 이들도 선택된다. 바람직하게는, 가변 중쇄의 적어도 CDR3 영역(CDRH3)이 선택된 서열 쌍 사이에서 상이하다. 가능하게는, VH 및 VL 서열 쌍의 선택이 중대하게는 CDRH3 영역의 가변성을 근거로 할 수 있다. 서열의 프라이밍 및 증폭 동안, 가변 영역의 프레임워크 영역, 특히 첫번째 프레임워크 영역에서 돌연변이가 발생할 수 있다. 바람직하게는, 첫번째 프레임워크 영역에서 발생한 오차가 수정되어, 서열이 점라인(germline) 기원의 서열과 완전히 일치하거나 98% 이상 일치할 것이 보장되며, 예를 들어, VH 및 VL 서열이 완전한 뮤린 서열이 된다.
VH 및 VL 쌍을 엔코딩하는 선택된 서열의 집합물의 전체적인 다양성이 EGFR 면역화에 대한 체액성 반응에서의 유전자 수준에서 보여진 다양성을 고도로 나타내는 것이 확인될 때, 선택된 VH 및 VL 코딩 쌍의 집합물로부터 발현된 항체의 전체적인 특이성도 EGFR 면역화된 동물에서 생성된 항체의 특이성을 나타낼 것으로 예상된다. 선택된 VH 및 VL 코딩 쌍의 집합물로부터 발현된 항체의 특이성이 공여체에 의해 생성된 항체의 특이성을 나타내는지의 표시는, 공여체 혈액의 선택된 항원에 대한 항체 역가를 선택된 VH 및 VL 코딩 쌍의 집합물로부터 발현된 항체의 특이성과 비교함에 의해 수득될 수 있다. 추가로, 선택된 VH 및 VL 코딩 쌍의 집합물로부터 발현된 항체의 특이성을 추가로 검정될 수 있다. 특이성의 정도는 결합 반응성이 검출될 수 있는 상이한 항원의 수와 관련된다. 본 발명의 추가의 구체예에서, 선택된 VH 및 VL 코딩 쌍의 집합물로부터 발현된 개별적인 항체의 특이성은 에피토프 맵핑에 의해 검정된다.
에피토프 맵핑은 서로 반드시 배타적이지 않은 수많은 방법에 의해 수행될 수 있다. 항체 분자의 에피토프-특이성을 맵핑하는 한 가지 방법은 표적 항원의 일차 구조로부터 유래된 다양한 길이의 펩티드와의 결합을 평가하는 것이다. 이러한 펩티드는 선형 및 형태적일 수 있고, ELISA, FLISA 및 표면 플라스몬 공명(SPR, Biacore, FACS)을 포함하는 다수의 검정 포맷에 이용될 수 있다. 또한, 펩티드는 표적 항원의, 예를 들어, 세포외 영역 또는 보존 영역을 나타내는 이용가능한 서열 및 구조 데이터를 이용하여 이론적으로 선택될 수 있거나, 항원의 선택된 부분 또는 모든 항원을 나타내는 중첩 펩티드의 패널로서 고안될 수 있다 (Meloen RH, Puijk WC, Schaaper WMM. Epitope mapping by PEPSCAN. In: Immunology Methods Manual. Ed Iwan Lefkovits 1997, Academic Press, pp 982-988). 하나 이상의 상기 펩티드를 지니는 항체 클론의 특이적 반응성은 일반적으로 에피토프 특이성을 나타낼 것이다. 그러나, 펩티드는 많은 경우에 단백질성(proteinaceous) 항원에 대해 생성된 항체에 의해 인지되는 에피토프의 불충분한 모사체(mimic)인데, 그 이유는 천연 또는 특이적 형태의 결여 및 항체 및 펩티드에 비해 항체 및 단백질 항원간에 일반적으로 더 큰 묻혀 있는(buried) 상호작용 표면적 때문이다. 단백질 항원에 대한 특이성을 직접 정의할 수 있는 에피토프 맵핑을 위한 두번째 방법은 존재하는 잘 규정된 항체를 이용한 선택적인 에피토프 차폐(masking)에 의한 것이다. 차단 이후 항원에 대한 두번째 프로빙 항체의 감소된 결합은 일반적으로 공유되거나 중첩된 에피토프를 나타낸다. 선택적인 차폐에 의한 에피토프 맵핑은 당 분야에 널리 공지된 ELISA 및 비아코어(Biacore)를 포함하나 이로 제한되지 않는 다수의 면역검정에 의해 수행될 수 있다 (예를 들어, Ditzel et al. 1997. J. Mol. Biol. 267:684-695; Aldaz-Carroll et al. 2005. J. Virol. 79: 6260-6271). 항-EGFR 항체의 에피토프 특이성을 결정하는 또 다른 잠재적인 방법은 항체의 존재하에의 회피 돌연변이의 선택이다. 이는, 예를 들어, 알라닌-스캔을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 회피 돌연변이로부터의 관심있는 유전자(들)의 서열분석은 항원(들)에 있는 어떤 아미노산이 항체에 의한 인지에 중요한지를 일반적으로 나타내고, 이에 따라 에피토프(의 일부)를 구성할 것이다.
선택된 V H 및 V L 코딩 쌍으로부터의 항- EGFR 항체 조성물의 생성
본 발명의 항체 조성물은 하나 또는 소수의 바이오반응기 또는 이의 등가물에서 폴리클로날 발현 세포주로부터 생성될 수 있다. 이러한 접근법 이후에, 항-EGFR 항체가 반응기로부터 공정 동안 항-EGFR 항체 조성물을 구성하는 개별적 일원을 분리시킬 필요 없이 단일 제조물로서 정제될 수 있다. 항체 조성물이 하나를 초과하는 바이오반응기에서 생성되는 경우, 정제된 항-EGFR 항체 조성물은 각각의 바이오반응기로부터의 개별적으로 정제된 상층액으로부터 수득된 항체를 풀링함에 의해 수득될 수 있다.
재조합 항체 조성물을 제조하는 한 방법이 WO 2004/061104호 및 WO 2006/007850호에 기재되어 있다(이들 참조문헌은 본원에 참조로서 포함된다). 본원에 기재된 방법은 항체 코딩 서열의 개별적 숙주 세포의 유전체로의 부위-특이적인 통합에 기초하며, VH 및 VL 단백질 사슬이 생성 동안 이들의 원래 페어링으로 유지되는 것을 보장한다. 또한, 부위-특이적인 통합은 위치 효과를 최소화하므로 폴리클로날 세포주에서 개별적 세포의 성장 및 발현 특성은 거의 유사할 것으로 예상된다. 일반적으로, 상기 방법은 하기를 포함한다: ⅰ) 하나 이상의 리콤비나아제(recombinase) 인지 부위를 갖는 숙주 세포; ⅱ) 숙주 세포와 양립하는 하나 이상의 리콤비나아제 인지 부위를 갖는 발현 벡터; ⅲ) 선택된 VH 및 VL 코딩 쌍을 스크리닝 벡터에서 발현 벡터로 이동시켜 발현 벡터의 집합물을 생성함으로써 전장 항체 또는 항체 단편이 벡터로부터 발현되도록 함(이러한 이동은 스크리닝 벡터가 발현 벡터와 동일한 경우에는 필요하지 않을 수 있다); ⅳ) 숙주 세포를 발현 벡터의 집합물, 및 숙주 세포의 유전체에 있는 리콤비나아제 인지 부위를 벡터에 있는 것과 조합시킬 수 있는 리콤비나아제를 코딩하는 벡터로 트랜스펙션; ⅴ) 트랜스펙션된 숙주 세포로부터 폴리클로날 세포주 수득/생성; 및 ⅵ) 폴리클로날 세포주로부터 항체 조성물의 발현 및 수집.
적은 수(2-3개 또는 이 이상)의 항체가 하나의 조성물에 사용되는 경우, 이들은, 예를 들어, WO 2004/085474호에 기재된 바와 같은 모노클로날 항체의 제조와 유사한 방식으로 개별적으로 발현되고 정제될 수 있다. 정제된 항체는 정제 후에 혼합되거나, 투여 전의 혼합을 위해 또는 별개의 투여를 위해 별개의 바이얼에 패키징될 수 있다.
바람직하게는, CHO 세포, COS 세포, BHK 세포, 골수종 세포(예를 들어, Sp2/0 또는 NS0 세포)와 같은 포유동물 세포, NIH 3T3와 같은 섬유모세포, 및 HeLa 세포, HEK 293 세포 또는 PER.C6과 같은 무한증식(immortalized) 인간 세포가 이용된다. 그러나, 비-포유동물 진핵 또는 원핵 세포, 예를 들어, 식물 세포, 곤충 세포, 효모 세포, 진균, 대장균(E. coli) 등도 적용될 수 있다. 적합한 숙주 세포는 이의 유전체에 하나 이상의 적합한 리콤비나아제 인지 부위를 포함한다. 숙주 세포는 인테그란트(integrant)(즉, 통합 부위에 항-EGFR Ab 발현 벡터 또는 발현 벡터 단편의 통합된 복사체를 갖는 세포)에 대한 선택이 가능하도록 통합 부위에 작동가능하게 연결된 선택 모드도 함유하여야 한다. 유전체의 미리 결정된 위치에 FRT 부위를 지니는 세포의 제조물이, 예를 들어, US 5,677,177호에 기재되어 있다. 바람직하게는, 숙주 세포는 인테그란트의 높은 발현을 가능하게 하는 부위에 있는 단일 통합 부위만을 지닌다(소위, 핫-스팟(hot-spot)).
적합한 발현 벡터는 숙주 세포의 리콤비나아제 인지 부위(들)와 매칭되는 재조합 인지 부위를 포함한다. 바람직하게는 리콤비나아제 인지 부위가 숙주 세포의 작제에 이용된 선택 유전자와 상이한 적합한 선택 유전자에 연결된다. 선택 유전자는 당 분야에 널리 공지되어 있고, 글루타민 합성효소 유전자(GS), 디히드로폴레이트 환원효소 유전자(DHFR), 및 네오마이신을 포함하고, 여기서 GS 및 DHFR은 삽입된 VH 및 VL 서열의 유전자 증폭에 이용될 수 있다. 벡터는 두 상이한 리콤비나아제 인지 부위도 함유할 수 있어서, 벡터의 완전한 통합 대신에 항체 코딩 서열의 리콤비나아제-매개된 카세트 교환(RMCE)를 가능하게 한다. RMCE는 문헌[Langer et al 2002; Schlake and Bode 1994]에 기재되어 있다. 적합한 리콤비나아제 인지 부위는 당 분야에 널리 공지되어 있고, 이는 FRT, lox 및 attP/attB 부위를 포함한다. 바람직하게는, 통합 벡터는 동형-엔코딩 벡터이고, 여기서 불변 영역(바람직하게는 인트론 포함)은 VH 및 VL 코딩 쌍이 스크리닝 벡터로부터 이동하기 전에 벡터에 존재한다(또는 스크리닝이 전장 항체 상에서 수행되는 경우 불변 영역이 이미 스크리닝 벡터에 존재한다). 벡터에 존재하는 불변 영역은 전체 중쇄 불변 영역(CH1 내지 CH3 또는 CH4)이거나 항체의 Fc 부분을 엔코딩하는 불변 영역(CH2 내지 CH3 또는 CH4)일 수 있다. 경쇄 카파 및 람다 불변 영역도 이동 전에 존재할 수 있다. 존재하는 경우, 존재하는 불변 영역의 수의 선택은 이용되는 스크리닝 및 이동 시스템에 의존적이다. 중쇄 불변 영역은 동형 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM, IgD 및 IgE로부터 선택될 수 있다. 바람직한 동형은 IgG1, IgG2 및/또는 IgG3이다. 또한, 항-EGFR 항체-엔코딩 핵산의 부위-특이적인 통합을 위한 발현 벡터는 VH 및 VL 사슬 각각의 높은 발현 수준을 유도하는 적합한 프로모터 또는 등가 서열을 함유한다. 도 4는 발현 벡터를 고안하는 가능한 한 가지 방법을 설명하나, 수많은 다른 고안이 가능하다.
스크리닝 벡터로부터 선택된 VH 및 VL 코딩 쌍의 이동은 통상적인 제한 효소 절단 및 라이게이션에 의해 수행될 수 있어서, 각 발현 벡터 분자는 하나의 VH 및 VL 코딩 쌍을 함유한다. 바람직하게는, VH 및 VL 코딩 쌍이 개별적으로 이동하나, 이들은 요망되는 경우 한 덩어리로(in-mass) 이동할 수 있다. 모든 선택된 VH 및 VL 코딩 쌍이 발현 벡터로 이동하면, 발현 벡터의 집합물 또는 라이브러리가 수득된다. 대안적인 이동 방법도 필요한 경우 이용될 수 있다. 스크리닝 벡터가 발현 벡터와 동일한 경우, 발현 벡터의 라이브러리는 스크리닝/발현 벡터에 놓여진, 스크리닝 동안 선택된 VH 및 VL 서열 쌍으로 구성된다.
핵산 서열을 숙주 세포로 트랜스펙션하는 방법은 당 분야에 공지되어 있다. 부위-특이적인 통합을 보장하기 위해, 적합한 리콤비나아제가 역시 숙주 세포에 제공되어야 한다. 이것은 바람직하게는 리콤비나아제를 엔코딩하는 플라스미드의 공동-트랜스펙션에 의해 확립된다. 적합한 리콤비나아제는, 예를 들어, 상응하는 리콤비나아제 인지 부위를 지니는 숙주 세포/벡터 시스템과 함께 이용되는, Flp, Cre 또는 파지 ΦC31 인테그라아제이다. 숙주 세포는 벌크(bulk)로 트랜스펙션될 수 있으며, 이것은 발현 벡터의 라이브러리가 하나의 단일 반응으로 세포주로 트랜스펙션됨으로써 폴리클로날 세포주를 수득함을 의미한다. 대안적으로, 발현 벡터의 집합물은 숙주 세포로 개별적으로 트랜스펙션될 수 있어서, 개별적 세포주의 집합물을 생성한다 (각 세포주가 특정 특이성을 지니는 항체를 생성한다). 트랜스펙션시에 생성된 세포주(개별적 또는 폴리클로날)를 이후에 부위 특이적 인테그란트에 대해 선택하고, 이들이 트랜스펙션 이전에 현탁액 및 무혈청 배지에서 성장하는 특성을 이미 지니고 있지 않았다면, 현탁액 및 무혈청 배지에서 성장하도록 적응시킨다. 트랜스펙션이 개별적으로 수행되는 경우, 개별적 세포주를 이들의 성장 특성 및 항체 생성에 대해 추가로 검정한다. 바람직하게는, 유사한 증식율 및 항체 발현 수준을 지니는 세포주를 폴리클로날 세포주의 생성을 위해 선택한다. 이후 개별적 세포주를 미리 결정된 비율로 혼합시킴에 의해 폴리클로날 세포주를 생성한다. 일반적으로, 폴리클로날 마스터 세포 뱅크(pMCB), 폴리클로날 리서치 세포 뱅크(pRCB) 및/또는 폴리클로날 워킹 세포 뱅크(pWCB)가 폴리클로날 세포주로부터 구축된다. 폴리클로날 세포주는 개별적 세포주를 미리 결정된 비율로 혼합시킴에 의해 생성된다. 폴리클로날 세포주를 앰풀로 분배시켜 폴리클로날 리서치 세포 뱅크(pRCB) 또는 마스터 세포 뱅크(pMCB)를 생성하고, 이로부터 폴리클로날 워킹 세포 뱅크(pWCB)가, 리서치 또는 마스터 세포 뱅크로부터의 세포를 확장시킴에 의해 생성될 수 있다. 리서치 세포 뱅크가 주로 개념 연구의 증거가 되는데, 여기서 폴리클로날 세포주는 마스터 세포 뱅크의 폴리클로날 세포주 만큼 많은 개별적 항체를 포함하지 않을 수 있다. 일반적으로, pMCB는 생성 목적을 위해 pWCB를 구축하기 위해 추가로 확장된다. 일단 pWCB가 고갈되면, pMCB로부터의 새로운 앰풀이 새로운 pWCB를 구축하기 위해 확장될 수 있다.
본 발명의 한 구체예는 본 발명의 재조합 항-EGFR 항체 조성물을 발현시킬 수 있는 폴리클로날 세포주이다.
본 발명의 추가의 구체예는 각 개별적 세포가 단일 VH 및 VL 코딩 쌍을 발현시킬 수 있는 폴리클로날 세포주이고, 상기 폴리클로날 세포주는 전체로서 VH 및 VL 엔코딩 쌍의 집합물을 발현시킬 수 있으며, 여기서 각각의 VH 및 VL 쌍은 항-EGFR 항체를 엔코딩한다. 바람직하게는 VH 및 VL 코딩 쌍의 집합물이 본 발명의 방법에 따라 생성된 동족체 쌍이다.
본 발명의 재조합 항체 제조물은, pWCB로부터의 하나의 앰풀을 적합한 배지에서 항체의 충분한 발현을 허용하는 기간 동안 배양시킴에 의해 제조될 수 있고, 여기서 폴리클로날 세포주는 안정하게 유지된다(윈도우(window)는 약 15일 내지 50일이다). 유가식(feed) 회분 또는 관류와 같은 배양 방법이 이용될 수 있다. 재조합 항체 조성물을 배양 배지로부터 수득하고 통상적인 정제 기술로 정제한다. 이온-교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 및 겔 여과와 같은 후속적인 정제 단계와 조합된 친화성 크로마토그래피가 종종 IgG의 정제를 위해 이용되었다. 정제 이후에, 폴리클로날 항체 조성물 중 모든 개별적 일원의 존재를, 예를 들어, 이온-교환 크로마토그래피에 의해 평가한다. 이러한 항체 조성물의 특성규명은 WO 2006/007853호(본원에 참조로서 포함됨)에 상세하게 기재되어 있다(본원에 참조로서 포함됨).
재조합 숙주에서 항체의 혼합물을 발현시키는 대안적인 방법이 WO 2004/009618호에 기재되어 있다. 이 방법은 단일 세포주로부터 동일한 경쇄와 연합된 상이한 중쇄를 지니는 항체를 생성한다. 이러한 접근법은 항-EGFR 항체 조성물이 조합 라이브러리로부터 생성되는 경우에 적용될 수 있다.
치료 조성물
본 발명의 또 다른 양태는 활성 성분으로서 본 발명의 항-EGFR 항체 조성물 또는 항-EGFR 재조합 Fab 또는 또 다른 항-EGFR 재조합 항체 단편 조성물, 또는 이중특이성 결합 분자를 포함하는 약제 조성물이다. 바람직하게는, 이러한 조성물의 활성 성분은 본 발명에 기재된 바와 같은 항-EGFR 재조합 항체 조성물이다. 이러한 조성물은 암의 개선 및/또는 예방 및/또는 치료를 위한 것이다. 바람직하게는, 약제 조성물은 인간, 가축 또는 애완동물에 투여된다.
약제 조성물은 약제학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함한다.
항-EGFR 항체 조성물 또는 이의 항체 단편이 약제학적으로 허용되는 희석제, 담체, 또는 부형제 내에서 단위 용량 형태로 투여될 수 있다. 암에 걸린 환자에게 투여되는 적합한 제형 또는 조성물을 제공하기 위해 통상적인 조제 실무가 이용될 수 있다. 한 바람직한 구체예에서, 투여는 치료용이며, 이것은 암 질환이 진단된 이후에 투여됨을 의미한다. 임의의 적합한 투여 경로가 이용될 수 있고, 예를 들어, 투여는 비경구, 정맥내, 동맥내, 피하, 근내, 복막내, 비내, 에어로솔, 좌제, 또는 경구 투여일 수 있다. 예를 들어, 약제학적 제형은 액체, 용액 또는 현탁액의 형태일 수 있다. 경구 투여를 위해, 위에서의 분해에 대해 보호될 필요가 있다. 비내 제형을 위해, 항체는 분말, 비내 점적액 또는 에어로졸의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명의 약제 조성물은 그 장체로(per se) 공지된 방식으로 제조되며, 예를 들어, 통상적인 용해, 동결건조, 혼합, 과립화 또는 당제(confectioning) 공정에 의해 제조된다. 약제 조성물은 통상적인 조제 실무에 따라 제형화될 수 있다 (예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20th ed.), ed. A.R. Gennaro, 2000, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA and Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick and J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, New York, NY] 참조).
바람직하게는 활성 성분의 용액 또는 현탁액, 및 특히 등장성 수용액 또는 현탁액이 본 발명의 약제 조성물을 제조하는데 사용된다. 활성성분만을 포함하거나 만니톨과 같은 담체와 함께 포함하는 동결건조된 조성물의 경우, 이러한 용액 또는 현탁액은 가능하다면 사용 전에 제조될 수 있다. 약제 조성물은 살균될 수 있고/거나 부형제, 예를 들어, 보존제, 안정화제, 습윤제 및/또는 에멀젼화제, 용해제, 삼투압을 조절하기 위한 염 및/또는 완충용액을 포함할 수 있고, 예를 들어, 통상적인 용해 또는 동결건조 공정에 의해 그 자체로 공지되어 있는 방식으로 제조된다. 상기 용액 또는 현탁액은 소듐 카르복시메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐피롤리돈 또는 젤라틴과 같은 점도-증가 물질을 포함할 수 있다.
살균 조건하에 통상적인 방식으로 주사 조성물을 제조하고: 조성물을 앰풀 또는 바이얼에 도입하고 컨테이너를 밀봉하기 위해서도 동일하게 적용된다.
약제 조성물은 약 1% 내지 약 95%, 바람직하게는 약 20% 내지 약 90%의 활성 성분을 포함한다. 본 발명에 따른 약제 조성물은, 예를 들어, 단위 용량 형태, 예를 들어, 앰풀, 바이얼, 좌제, 정제, 알약 또는 캡슐의 형태일 수 있다. 제형은 인간 개체에게 치료적 또는 예방적 유효량으로 투여되어 (예를 들어, 병리 상태를 예방, 제거 또는 감소시키는 양) 질병 또는 질환에 대한 치료를 제공한다. 투여되는 치료제의 바람직한 용량은 암의 중증도, 특정 환자의 전체적인 건강 상태, 화합물 부형제의 제형 및 이의 투여 경로와 같은 변수에 의존적일 것이다.
본 발명에 따른 조성물의 치료 용도
본 발명에 따른 약제 조성물은 포유동물에서 질병의 치료 또는 개선에 이용될 수 있다. 본 발명의 약제 조성물로 치료되거나 예방될 수 있는 질환은 바람직하게는 본 발명에 따른 약제 조성물을 이용한 치료적 치료에 적용될 수 있는 환자의 암의 예방 및 치료를 포함한다.
본 발명의 한 구체예는 유효량의 본 발명의 항-EGFR 재조합 항체 조성물을 포유동물에게 투여하는 것을 포함하여, 포유동물에서 암과 관련된 하나 이상의 증상을 예방, 치료 또는 개선시키는 방법이다.
본 발명의 추가의 구체예는 포유동물에서 암과 관련된 하나 이상의 증상을 치료, 개선 또는 예방하기 위한 조성물을 제조하기 위한 본 발명의 항-EGFR 재조합 항체 조성물의 용도이다.
바람직하게는, 상기 구체예에서 포유동물은 인간, 가축 또는 애완동물이다.
본 발명에 따른 항체는 특정 고형 종양의 치료를 나타낸다. EGFR 발현 수준을 포함하는 다수의 요인에 기초하여, 특히 다음과 같은 종양 유형이 바람직한 적응증으로 보인다: 유방암, 난소암, 결장암, 직장암, 전립선암, 방광암, 췌장암, 두경부암, 및 비소세포 폐암. 이러한 적응증 각각과 관련하여, 3개의 임상 경로가 임상적 성공을 위한 명백한 잠재성을 제공하는 것으로 보인다:
부가 요법: 부가 요법에서, 환자는 화학요법제 또는 항신생물제 및/또는 방사선 요법과 조합된 본 발명에 따른 항체로 치료될 수 있다. 상기 나열된 일차 표적은 표준 1차 및 2차 요법에 본 발명의 항체를 첨가하는 프로토콜 하에서 치료될 것이다. 프로토콜 디자인은 종양 부피의 감소 뿐만 아니라 표준 화학요법의 통상적인 양을 감소시키는 능력에 의해 평가되는 유효성을 다룰 것이다. 이러한 투여량 감소는 화학요법제의 용량-관련 독성을 감소시킴으로써 추가적이고/이거나 지속된 요법을 가능케 할 것이다. 당 분야의 항-EGFR 항체는 화학요법제 또는 항신생물제 아드리아마이신(에르비툭스: 진행된 전립선 암종), 시스플라틴(에르비툭스: 진행된 두경부 및 폐 암종), 탁솔(에르비툭스: 유방암), 및 독소루비신(에르비툭스)와 조합되어 여러 부가 임상 실험에서 사용되었거나, 사용된다.
본 발명은 암 요법에서 동시, 별개 또는 연속 투여를 위한 조합물로서 본 발명의 항체 조성물 및 암세포의 분화를 유도할 수 있는 하나 이상의 화합물을 포함하는 약제 품목을 제공한다. 본 발명의 항체 조합물과 암세포의 최종 분화를 유도하는 것으로 공지된 작용제를 조합시킴으로써, 효과가 추가로 개선될 수 있다.
1개 이상의 화합물이 레티노산, 트랜스-레티노산, 시스-레티노산, 페닐부티레이트, 신경 성장 인자, 디메틸 설폭시드, 활성 형태 비타민 D(3), 과산화소체 증식-활성화 수용체 감마, 12-O-테트라데카노일포르볼 13-아세테이트, 헥사메틸렌-비스-아세트아미드, 형질전환 성장 인자-베타, 부티르산, 시클릭 AMP, 및 베스나리논(vesnarinone)으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 화합물은 레티노산, 페닐부티레이트, 모든-트랜스-레티노산, 활성 형태 비타민 D로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 항체 조성물 및 하나 이상의 화학요법 또는 항신생물 화합물을 포함하는 약제 품목은 암 요법에서 동시, 별개 또는 연속 투여를 위한 조합물로 사용될 수 있다. 화학요법 화합물은 아드리아마이신, 시스플라틴, 탁솔, 독소루비신, 토포테칸, 플루오로피리미딘, 옥살리플라틴, 및 이리노테칸으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.
단일요법: 종양의 단일요법에서 본 발명에 따른 항체의 용도와 관련하여, 항체는 화학요법제 또는 항신생물제 없이 환자에 투여될 수 있다. 본원에 논의된, 본 발명에 따른 항체의 사용을 통해 생성된 전임상 결과는 표준-단독 요법으로서의 긍정적인 결과를 입증하였다.
영상화(imaging) 작용제: 본 발명에 따른 항체에 대한 방사성 핵종(예를 들어, 이트륨(90Y))의 결합을 통해, 본 발명에 따른 방사선 표지된 항체가 진단용, 영상화 작용제로 이용될 수 있음이 예상된다. 이러한 역할에서, 본 발명의 항체는 고형 종양 뿐만 아니라 EGFR를 발현하는 세포의 전이성 병변 둘 모두에 국소화될 것이다. 본 발명의 항체의 영상화 작용제로서의 용도와 관련하여, 항체는 수술전 스크린 뿐만 아니라, 수술 후에 종양이 유지되고/되거나 복귀되는지의 결정에 있어서, 고형 종양의 수술 치료를 돕는데 사용될 수 있다. (111In)-에르비툭스 항체는 절제불가능한 편평세포 폐암종을 갖는 환자에서 Ｉ기 인간 임상 실험에서 영상화 작용제로 사용되었다(Divgi et al. J. Natl. Cancer Inst. 83:97-104 (1991)). 환자는 표준 전방 및 후방 감마 카메라로 추적되었다. 예비 데이터는 모든 원발성 병변 및 큰 전이성 병변이 확인된 반면, 작은 전이성 병변의 단지 절반(1 cm 이하)이 확인된 것을 나타내었다.
티로신 키나아제 억제제(TKI)는 수용체의 세포내 티로신 키나아제 도메인과 상호작용하고, 세포내 Mg-ATP 결합 부위에 대해 경쟁함으로써 리간드 유도 수용체 인산화를 억제하는 주로 퀴나졸린 유도된 합성 저분자량 분자이다. 제피티니브(Gefitinib)(Iressa, ZD1839), 에를로브티니브(Erlobtinib)(Tarceva, OSI-774), 라파티니브(Lapatinib)(Tykerb, GW572016), 카너티니브(Canertinib)(CI-1033), EKB-569 및 PKI-166을 포함하는 임상 개발 중인 여러 TKI가 EGFR을 표적으로 한다. TKI와 항-EGFR의 조합 치료는 EGFR-의존성 암세포에 대해 생체내 및 시험관내 둘 모두에서 이로운 것으로 밝혀졌다. 본 발명의항체 조성물 및 하나 이상의 EGFR 표적 TKI를 포함하는 약제 품목이 암 요법에서 동시, 별개 또는 연속 투여를 위한 조성물로 사용될 수 있다. 추가의 소분자 억제제는 소라피니브(Sorafinib)(raf 및 다수의 RTK), 수니티니브(Sunitinib)(다수의 RTK), 템시롤리무스(Temsirolimus)(mTOR), RAD001(mTOR), 및 AZD217(VEGFR2)을 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 항체 조성물이 다른 항체 치료제와 조합되어 사용된다. 이의 예는, 예를 들어, HER2(Herceptin) 및 VEGF(avastin)에 대한 항체를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체 조성물은 면역계의 세포를 자극하는 것으로 공지된 작용제와 조합되어 사용되고, 이러한 조합 치료는 본 발명의 항체 조성물의 효능의 향상된 면역-매개 향상을 발생시킨다. 이러한 면역-자극 작용제의 예는 재조합 인터루킨(예를 들어, IL-21 및 IL-2)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
투여 용량 및 경로
본 발명에 따른 항체에 대한 특정 용량은 아직 결정되지 않았으나, 특정 용량 고려사항이 승인된 유사한 생성물(ImClone C225(Erbitux))과의 비교를 통해 결정될 수 있다. C225 항체는 통상적으로 5 내지 400 mg/m2의 범위의 용량으로 투여되고, 안정성 연구와 관련해서는 보다 적은 용량이 사용된다. 따라서, 본 발명자들은 본 발명에 따른 항체를 이용한 환자에서의 투여량이 상기 범위 또는 이 보다 적은 범위, 아마 50 내지 300 mg/m2의 범위일 수 있고, 여전히 효능이 보유될 것으로 예상한다. mg/kg의 용량의 통상적인 치수와는 대조적으로 mg/m2의 용량은 표면적에 기초한 치수이고, 유아로부터 성인까지의 모든 크기의 환자를 포함하도록 고안된 편리한 투여 치수이다.
에르비툭스(Cetuximab)에 대해 이용가능한 규정된 정보는 최초 120분의 400 mg/m2의 IV 주입 후, 매주 60분의 250 mg/m2의 주입을 포함한다. 이러한 투여량은 단독 뿐만 아니라 방사선 요법과의 조합에 대해 권고된다. 벡티빅스(파니투무맙(panitumumab))에 대해, 권고된 용량은 14일 마다 60분에 걸쳐 투여되는 6 mg/kg이다.
젠맙(Genmab)의 HuMaxEGFr 항체(주무투무맙(zumutumumab))의 예상 임상 투여량은 8 mg/kg의 HuMax-EGFr의 최초 투여량, 및 이후 질병이 진행할 때까지 매주의 유지 용량의 주입이다. 유지 용량은 환자가 용량 제한적 피부 발진이 발생할 때까지 16 mg/kg의 HuMax-EGFr의 최대량(젠맙의 제품 설명서로부터 이용가능한, 핵심 Ⅲ상 연구를 위한 투여량)까지 필요에 따라 조정될 것이다.
본 발명의 항체 조성물의 임상 용량은 현재 임상에서 사용되는 모노클로날 항-EGFR 항체(에르비툭스 및 벡티빅스)를 이용하여 관찰되는 피부 발진의 정도에 의해 제한될 수 있다. 시노몰구스 원숭이에서의 6주의 독성학 연구로부터의 데이터는 본 발명의 항체 조성물이 임상에서 사용되는 모노클로날 항체의 용량을 이용하는 치료에서 사용되는 것과 동등한 용량으로 투여되는 경우에 피부 발진의 증상을 나타내지 않았다(실시예 20). 따라서, 본 발명의 항체 조성물은 1.8 m2의 체표 및 60 kg의 체중을 갖는 인간에 대해 7.5 mg/kg로 표현되는 250 mg/m2의 매주의 용량을 이용하여 정맥내 투여될 수 있다. 또한, 400 mg/m2(1.8 m2의 체표 및 60 kg의 체중을 갖는 인간에 대해 12 mg/kg로 표현됨)의 최초 적하(loading) 용량이 이후의 매주의 용량 전에 제공될 수 있다.
3개의 별개의 전달 접근법이 본 발명에 따른 항체의 전달에 유용한 것으로 예상된다. 통상적인 정맥내 전달은 아마 대부분의 종양에 대한 표준 전달 기술일 것이다. 그러나, 복막강 내의 종양, 예를 들어, 난소, 담도, 다른 관 등의 종양과 관련하여, 복막내 투여가 종양에서 고 용량의 항체를 수득하고 항체 청소를 최소화하는데 바람직한 것으로 증명되었다. 한 유사한 방식에서, 특정 고형 종양은 국부 관류에 적합한 맥관 구조를 가진다. 국부 관류는 종양 부위에서 고용량의 항체의 획득을 가능케 하고, 항체의 단기 청소를 최소화할 것이다.
임의의 단백질 또는 항체 융합 기재 치료제를 이용함에 따른, 안정성 우려는 주로, (ⅰ) 사이토카인 방출 증후군, 즉 저혈압, 열, 진전, 오한, (ⅱ) 물질에 대한 면역원성 반응의 발달(즉, 항체 치료제에 대한 환자에 의한 인간 항체의 발생, 또는 HAHA 또는 HACA 반응), 및 (ⅲ) EGF 수용체를 발현하는 정상세포, 예를 들어, EGFR을 발현하는 간세포에 대한 독성과 관련된다. 상기 각각의 안정성 우려를 모니터하기 위해 표준 시험 및 후속 시험이 이용될 것이다. 특히, 존재시 간에 대한 손상을 평가하기 위해 임상 시험 동안 종종 간 기능이 모니터될 것이다.
진단 용도
본 발명의 또 다른 구체예는 진단 키트에 관한 것이다. 본 발명에 따른 키트는 본 발명에 따라 제조된 항-EGFR 항체 조성물을 포함하고, 여기서 단백질은 검출가능한 라벨을 이용하여 라벨링되거나, 비-라벨 검출을 위해 라벨링되지 않을 수 있다. 키트는 EGFR의 과발현과 관련된 암에 걸린 개체를 확인하는데 사용될 수 있다.
실시예 1 : 항- EGFR 항체의 클로닝
면역화
암컷 BALB/c, 균주 A, 또는 C57B16 마우스(8-10 주령)를 EGFR 과발현 세포 외에 다양한 정제된 단백질을 이용한 주사에 의한 면역화에 사용하였다.
일부 면역화를 위해 시판되는 EGFR 단백질(R&D systems cat#1095-ER or Sigma # E3641)을 사용하였다. 다른 면역화를 위해, EGFR 또는 EGFRvⅢ의 ECD 및 인간 성장 호르몬(hGH)으로 구성되고, 실시예 10b에 기재된 히스-태그(His-tag)에 더하여 담배 식각 바이러스(Tobacco Etch Virus)(TEV)-절단 부위를 포함하는 재조합 인간 EGFR 및 융합 단백질로 생성된 EGFRvⅢ를 사용하였다. 몇몇 경우에서, EGFR의 ECD를 TEV-프로테아제 절단 및 이후의 니켈 컬럼에서의 정제에 의해 분리하였다.
약 107개의 수용체/세포를 발현하는 인간 두경부암 세포주 HN5(Easty DM, Easty GC, Carter RL, Monaghan P, Butler LJ. Br J Cancer. 1981 Jun;43(6):772-85. Ten human carcinoma cell lines derived from squamous carcinomas of the head and neck.)를 세포 기재 면역화에 사용하였다. 세포를 10% FBS(우태아 혈청), 3mM 글리세롤, 5mM 피루브산 나트륨 및 1% 페니실린 스트렙토마이신이 보충된 DMEM 배지에서 배양하였다. 각각의 면역화 전, 세포를 PBS로 세척하고, TrypLE로 트립신화시키고, 성장 배지에 재현탁시켰다. 이후, 세포 현탁액을 5분 동안 250Xg에서의 원심분리에 의해 PBS로 2회 세척하고, 이동시키고, 15 ml 멸균 PBS에 재현탁시켰다.
세포 또는 항원을 PBS에 희석시킨 후, 프로인트 애쥬번트(Freund's Adjuvant)와 1:1로 혼합하였다. 면역 반응을 향상시키고 조절하기 위해 애쥬번트를 사용한다. 첫번째 면역화를 위해, 완전 프로인트 애쥬번트(CFA)를 사용한 반면, 이후의 면역화를 위해서는 불완전 프로인트 애쥬번트(IFA)를 사용하였다. IFA는 광유로 구성된 수중유 에멀젼이고, CFA는 가열 사멸되고, 건조된 미코박테리움 종이 첨가된 IFA이다. 둘 모두의 애쥬번트는 저장소 효과를 갖는다. CFA는 면역 반응의 장기간 지속성을 발생시키고, 면역 반응을 부스팅(boosting)하기 위한 첫번째 면역화에 사용되고, IFA는 이후의 면역화에 사용된다. 물을 가진 유리의 표면 상에 점적을 첨가함으로써 에멀젼을 시험하였다. 점적이 하나의 점적으로 유지되는 경우, 에멀젼은 안정적이고, 주사가 수행될 수 있다. 안정적인 에멀젼만을 마우스에 투여하였다.
스케줄(표 2 참조)에 따라, 각각의 주사를 위해 25-100 μg의 항원 또는 107개의 세포를 사용하였다. 전체적으로, 마우스에 4회 주사하였다. 모든 마우스에 300 μl 또는 200 μl의 에멀젼을 주사하였다. 스케줄에 따라, 피하(s.c.), 복막내(i.p.) 또는 정맥내(i.v.) 주사하였다.
종료시, 마우스를 경추 탈골로 희생시키고, 비장을 분리하여, 74 μm의 세포 스트레이너(strainer)(Corning#136350-3479)로 옮겼다. 세포를 필터를 통해 부수고, 10% FBS를 갖는 저온 RPMI 1640에 재현탁시키고, 5분 동안 300Xg에서 원심분리시켰다. 세포 펠렛을 1% FBS를 갖는 RPMI 1640에 재현탁시키고, 50 μm 주사기 필터(BD# 340603)를 통해 여과시키고, 원심분리에 의해 수거하였다. 10% DMSO를 갖는 FCS에 재현탁 후에 세포 펠렛을 동결건조시키고, 동결된 세포를 FACS 분류때까지 -80℃에 저장하였다.
뮤린 혈장 세포의 FACS 분류
동결된 비장세포를 갖는 바이얼을 37℃에서 해동시키고, 얼음이 여전히 존재하는 15 ml 튜브에 옮겼다. 10 ml의 얼음-저온 RPMI, 10% FBS(우태아 혈청)을 스월링(swirling)과 함께 튜브에 적가하였다. 10 ml의 FACS PBS에서 1회 세척 후, 5 ml의 FCS PBS를 50 μm의 필콘(Filcon)을 통해 세포를 여과시키기 전에 첨가하였다. 이후, 세포를 펠렛화시키고, 2% FBS(최종 부피)를 갖는 1 ml PBS에 재현탁시키고, 약 5 μg/ml의 최종 농도로 특정 희석에 따라 항-CD43-FITC 및 항-CD138-PE로 염색하였다. 세포를 어두운 곳에서 20분 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 이후, 세포를 2 ml의 FACS 완충용액으로 2회 세척하였다. 15 ml 이하의 FACS PBS를 첨가하였다. 프로피듐 요오다이드(PI)를 1:100(1부의 PI 대 100부의 FACS PBS 완충용액)으로 첨가하고, 이후 세포를 PCR 반응 완충용액(하기 참조)을 함유하는 96웰 PCR-플레이트로 분류하고, 2분 동안 400Xg로 스핀 다운하고, 플레이트를 -80℃에서 동결시켰다. 형질 세포를 도 1에 나타낸 바와 같이 CD43-양성/CD-138 양성으로 게이팅하였다.
동족체 V H 및 V L 쌍의 결합
형질 세포로서 게이팅된 단일 세포 상에서 VH 및 VL 코딩 서열의 결합을 수행하여 VH 및 VL 코딩 서열의 동족체 페어링을 촉진하였다. 절차는 일-단계 다중 중첩-신장 RT-PCT에 이은 네스티드 PCR에 기초한 2단계 PCR 절차를 이용하였다. 본 발명에서 이용된 프라이머 혼합물은 카파 경쇄만을 증폭시킨다. 그러나, 요망되는 경우 람다 경쇄를 증폭시킬 수 있는 프라이머가 다중 프라이머 혼합물 및 네스티드 PCR 프라이머 혼합물에 첨가될 수 있었다. 람다 프라이머가 첨가되면, 분류 절차가 람다 포지티브 세포를 제외시키지 않도록 조정되어야 한다. 동족체 VH 및 VL 서열의 결합 원리는 도 2에 도시되어 있다.
생성된 96-웰 PCT 플레이트를 해동시켰고 분류된 세포는 다중 중첩-신장 RT-PCR에 대한 주형으로 제공하였다. 단일-세포 분류가 반응 완충용액(OneStep RT-PCR 완충용액; Qiagen), RT-PCR에 대한 프라이머(표 3 참조) 및 RNase 억제제(RNasin, Promega)를 함유하기 전에, 분류 완충용액을 각 웰에 첨가하였다. 여기에 원스텝(OneStep) RT-PCR 효소 혼합물(25배 희석; Qiagen) 및 dNTP 혼합물(각 200 μM)를 보충하여 20 ㎕의 반응 부피에서 주어진 최종 농도를 수득하였다. 플레이트를 55℃에서 30분 동안 인큐베이션시켜 각 세포로부터 RNA의 역전사를 가능하게 하였다. RT 이후에, 플레이트를 하기 PCR 주기에 적용시켰다: 94℃에서 10분, 35x(94℃에서 40초, 60℃에서 40초, 72℃에서 5분), 72℃에서 10분.
PCR 반응을 필 실 바스킷(Peel Seal Basket)이 구비된 H20BIT 써멀 사이클러(Thermal cycler)에서 24 96-웰 플레이트(ABgene) 동안 수행하여 고-처리량을 촉진하였다. PCR 플레이트를 주기 후 -20℃에서 저장하였다.
네스티드 PCR 단계를 위하여, 96-웰 PCR 플레이트를 각 웰(20 ㎕ 반응물)에서 하기 혼합물을 이용하여 제공된 최종 농도를 수득하도록 제조하였다: 1x 패스트스타트(FastStart) 완충용액 (Roche), dNTP 혼합물(각각 200 μM), 네스티드 프라이머 혼합물(표 4 참조), 퓨전(Phusion) DNA 중합효소(0.08U; Finnzymes) 및 패스트스타트 하이 피델리티(FastStart High Fidelity) 효소 블렌드(0.8 U; Roche). 네스티드 PCR에 대한 주형으로서, 1 ㎕를 다중 중첩-신장 PCR 반응으로부터 옮겼다. 네스테스 PCR 플레이트를 하기 PCR 열 주기로 처리하였다: 35x(95℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 90초), 72℃에서 10분.
무작위로 선택된 반응물을 1% 아가로스 겔 상에서 분석하여 약 890 염기쌍(bp)의 중첩-신장 단편의 존재를 입증하였다.
PCR 단편의 추가 가공까지 플레이트를 -20℃에서 저장하였다.
네스티드(nested) PCR로부터의 결합된 VH 및 VL 코딩 쌍의 레퍼토리를 다양한 공여체로부터의 쌍을 혼합하지 않고 풀링하고, 분취용 1% 아가로오스 겔 전기영동에 의해 정제하였다. 인간 카파 불변 경쇄 엔코딩 서열을 결합된 VH 및 VL 코딩 쌍의 풀링된 PCR 생성물의 VL 코딩 영역으로의 중첩 신장에 의해 스플라이싱하였다(도 3). 인간 카파 불변 경쇄 엔코딩 서열을 50 μl의 전체 부피 중의 퓨 젼(Phusion) 효소(2U; Finnzymes), 1x 퓨전 완충용액, dNTP 혼합물(각각 200 μM), hKCforw-v2 프라이머 및 Kappa3' 프라이머(표 5), 및 플라스미드 주형 pLL138(10 ng/μl)을 함유하는 반응물에서 카파 경쇄를 갖는 인간 항체의 코딩 서열을 함유하는 플라스미드로부터 증폭시켰다. 반응물을 25x(95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 45초), 72℃에서 10분의 열주기에 적용시켰다. 생성된 PCR 단편을 분취용 1% 아가로오스 겔 전기영동에 의해 정제하였다.
인간 카파 불변 엔코딩 영역 단편(1.4 ng/μl), 정제된 풀링된 PCR 단편(1.4 ng/μl), 퓨젼(Phusion) DNA 중합효소(0.5U; Finnzymes) 및 패스트스타트 하이 피델리티 효소 블렌드(FastStart High Fidelity Enzyme Blend)(0.2U; Roche), 1x 패스트스타트(FastStart) 완충용액(Roche), dNTP 혼합물(각각 200 μM), mhKCrev 프라이머 및 mJH 세트 프라이머를 함유하는 중첩 신장 PCR(50 μl의 전체 부피)에 의한 스플라이싱에 의해 각각의 레퍼토리의 정제된 풀링된 PCR 단편을 인간 카파 불변 엔코딩 영역(부록 2)의 증폭되고 정제된 PCR 단편에 스플라이싱시켰다(표 5 참조). 반응을 95℃에서 2분, 25x(95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분), 72℃에서 10분의 열주기에 적용시켰다. 생성된 PCR 단편(약 1070 bp)을 분취용 1% 아가로오스 겔 전기영동에 의해 정제시켰다.
동족체 V H 및 V L 코딩 쌍의 스크리닝 벡터로의 삽입
EGFR에 대한 결합 특이성을 지니는 항체를 확인하기 위해, 수득된 VH 및 VL 코딩 서열을 전장 항체로서 발현시켰다. 이것은 VH 및 VL 코딩 쌍의 레퍼토리를 발 현 벡터로 삽입하고 숙주 세포로 트랜스펙션시키는 것을 포함한다.
결합된 VH 및 VL 코딩 쌍을 함유하는 발현 벡터의 레퍼토리를 생성하기 위해 2-단계 클로닝 절차를 이용하였다. 통계적으로, 발현 벡터의 레퍼토리가 스크리닝 레퍼토리의 생성을 위해 사용된 페어링된 동족체 VH 및 VL PCR 생성물의 수 보다 10배 많은 재조합 플라스미드를 함유하는 경우, 모든 독특한 유전자 쌍이 제시될 가능성이 99%이다. 따라서, 400개의 중첩-신장 V-유전자 단편이 수득되는 경우, 4000개 이상의 클론의 레퍼토리가 스크리닝을 위해 생성되었다.
간단히 말해, 인간 카파 불변 코딩 영역으로 스플라이싱된 결합된 VH 및 VL 코딩 쌍의 레퍼토리의 정제된 PCR 생성물을 PCR 생성물의 말단에 도입된 제한 부위에서 Xho Ｉ 및 Not Ｉ DNA 엔도누클레아제로 절단하였다. 절단되고 정제된 단편을 표준 라이게이션(ligation) 절차에 의해 XhoI/NotI 소화된 포유동물 IgG 발현 벡터, 00-VP-002(도 4)로 라이게이션하였다. 라이게이션 혼합물을 대장균(E. coli)으로 전기 천공시키고 적합한 항생제를 함유하는 2xYT 플레이트에 첨가하고 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 증폭된 벡터의 레퍼토리를 플레이트로부터 회수된 세포로부터 표준 DNA 정제 방법(Qiagen)을 이용하여 정제시켰다. 플라스미드를 AscI 및 NheI 엔도누클레아제를 이용한 절단에 의해 프로모터-리더(leader) 단편의 삽입을 위해 제조하였다. 상기 효소의 제한 부위는 VH 및 VL 코딩 유전자 쌍 사이에 위치한다. 벡터의 정제에 이어서, AscI-NheI 소화된 양방향 포유동물 프로모터-리더 단편을 표준 라이게이션 절차에 의해 AscI 및 NheI 제한 부위에 삽입하였다. 라이 게이션된 벡터를 대장균(E.coli)에서 증폭시키고 플라스미드를 표준 방법을 이용하여 정제하였다. 통상적인 절차에 의해 스크리닝 벡터의 생성된 레퍼토리로 대장균(E. coli)을 형질전환시켰다. 수득된 콜로니를 384-웰 마스터 플레이트에 통합시키고 저장하였다. 정렬된 콜로니의 수는 투입 PCR 생성물의 수를 3배 이상까지 초과하였으므로, 수득된 모든 독특한 V-유전자 쌍이 존재할 가능성은 95%이다.
EGFR 세포외 도메인으로의 결합에 대한 스크리닝
일반적으로, 스크리닝을 2 단계의 절차로 수행하였다. 세포-표면 발현된 EGFR에 결합하는 EGFR-항체의 검출을 위해 NR6wtEGFR 세포주를 이용하여 세포 기재 접근법으로서 ELISA에서 재조합 EGFR 단백질에 대한 반응성에 대해 항체-라이브러리를 스크리닝한 후, FMAT(FLISA)를 사용하였다. 101 및 108/109 라이브러리(표 2)에 대해, ELISA를 EGFR의 세포외 도메인을 나타내는 재조합 EGFR를 이용하여 수행하였다.
간단히, ELISA에 대해, 눈크 맥시소르브(Nunc maxisorb) 플레이트(cat no 464718)를 밤새 4℃에서 PBS 중에서 희석된 1 μg/ml의 단백질(사내 생성됨)로 코팅하였다. 50 μl 2%-밀크(Milk)-PBS-T에서 차단하기 전, 플레이트를 PBS + 0.05% Tween 20(PBS-T)로 1회 세척하였다. 플레이트를 PBS-T로 1회 세척하고, 20 μl의 2%-밀크-PBS-T 및 프리스타일 CHO-S 트랜스펙턴트(Freestyle CHO-S transfectants)(하기 참조)로부터의 5 μl의 상층액을 첨가하고, RT에서 1시간 30분 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 웰당 PBS-T 20 μl로 1회 세척하였다. 2% 밀크-PBS-T에 1:10000 희석된 이차 항체(HRP-염소-항-인간 IgG, Jackson, cat no 109-035-097)를 첨가하여 웰에 결합된 항체를 검출하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS-T에서 1회 세척하고, 25 μl의 기질(Kem-en-tec Diagnostics, cat no 4390)을 첨가하고, 5분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에 반응을 중지시키기 위해 25 μl의 1M 황산을 첨가하였다. 450 nm에서 ELISA 상에서 특정 신호를 검출하였다.
항-EGFR 항체의 세포 기재 FMAT 검출을 위해, SKBR-3(ATCC #HTB-30) 또는 NR6wtEGFR(Welsh et al, 1991, J Cell Biol, 114, 3, 533-543) 세포를 기재된 바와 같이 성장 배지에 유지시켰다. 세포를 계수하고, 1:40,000로 희석된 알렉사(Alexa)-647 컨쥬게이션된 염소-항-인간 IgG(H-L) 항체(Molecular probes No. A21445, lot no. 34686A)로 125,000 세포/ml로 희석시켰다. 전체 20 μl의 이러한 현탁액을 384 웰 투명 바닥 눈크 플레이트로 옮겼다. 이후, 10 μl의 트랜스펙션 상층액을 세포에 첨가하였다. 반응으로부터의 FMAT 신호를 6-10시간의 인큐베이션 후에 측정하였다.
스크리닝으로부터의 데이터는 전체 클론 중 221(4.8%)개가 ELISA에서 양성이었다. 이러한 클론 중 93개(2.0%)가 또한 FMAT에서 양성이었다. 전체 220개(4.8%)의 클론이 FMAT에서 양성이었고, 이중 127개(220-93)가 세포 표면 항원에 대해 독특하게 양성이었다. 111개의 라이브러리를 유사한 방식으로 스크리닝하였으나, 결실 돌연변이 EGFR 수용체 EGFRvⅢ에 대해 특이적인 항체를 생성시키기 위해 면역화 절차를 수행하였기 때문에, ELISA 스크리닝은 야생형 EGFR 및 EGFRvⅢ 둘 모두를 검출하기 위한 검정을 포함하였다. 7개의 클론이 ELISA에서 EGFRvⅢ에 대해 특이적인 것으로 확인되었고, 흥미롭게도 이러한 클론은 FMAT에서 wtEGFR 발현 세포의 염색에 대해 음성이었다. 13개의 클론이 FMAT 및 ELISA에서 wtEGFR에 대해 양성인 것으로 확인되었으나, EGFRvⅢ에 대해서는 그렇지 않았고, 이는 101 및 108/109 라이브러리에 비해 상기 라이브러리에 대해 독특하였다. 모든 ELISA 양성 클론을 추가 검정을 위해 선택하였다.
서열 분석 및 클론 선택
ELISA에서 EGFR-특이적인 것으로 확인된 클론을 본래의 마스터(master) 플레이트(384-웰 포맷)으로부터 회수하였고, 새로운 플레이트로 통합시켰다. 클론으로부터 DNA를 분리시키고, V-유전자의 DNA 서열분석을 위해 제공하였다. 서열을 정렬시키고, 모든 독특한 클론을 선택하였다. 수득된 서열의 다중정렬은 각각의 특정 클론의 독특함을 나타내었고, 독특한 항체의 확인을 가능케 하였다. 220개 클론의 서열 분석 후, 70개의 유전학적으로 별개의 항체 서열 클러스터를 확인하였다. 각각의 관련된 서열의 클러스터는 대개 공통의 전구체 클론의 체세포 과돌연변이(somatic hypermutation)를 통해 유래된 것이다. 종합적으로, 각각의 클러스터로부터의 1 내지 2개의 클론을 서열의 확인 및 특이성에 대해 선택하였다. 선택된 항체 가변 서열의 서열은 부록 1에 제시되어 있다. 누클레오티드 서열은 양 말단에 제한 부위를 포함한다. 결과적으로, 해당 번역된 아미노산 서열(DNA 서열의 제 3 판독 프레임을 이용함)은 N-말단에서 IMGT 정의에 따른 VH 및 VL 서열의 일부를 형성하지 않는 2개의 아미노산을 포함한다(Lefranc et al (2003) IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains. Dev. Comp Immunol 27, 55-77). 나타낸 모든 VL 서열은 동일한 인간 카파 불변 영역을 포함하고, 이는 아미노산 -TVAAP-로 시작하고 C-말단에서 -NRGEC로 종료된다. 본 발명의 목적을 위해, 특정 항체에 대해 언급되는 경우 용어 VL 서열은 카파 불변 영역 및 2개의 N-말단 아미노산(LA-)을 배제한다. 특정 항체에 대해 언급되는 경우 용어 VH 서열은 2개의 N-말단 아미노산(RA-)을 배제한다.
서열 및 특이성 확인
항체를 엔코딩하는 클론을 확인하기 위해, DNA 플라스미드를 제조하고, 2-ml 규모의 프리스타일(FreeStyle) CHO-S 세포(Invitrogen)의 트랜스펙현을 발현을 위해 수행하였다. 상층액을 트랜스펙션 96시간 후에 수거하였다. 표준 항-IgG ELISA를 이용하여 발현 수준을 측정하고, EGFR- 및 EGFRvⅢ-특이적 ELISA에 의해 특이성을 결정하였다. 클론의 85%가 정확한 특이성 및 서열을 갖는 것으로 밝혀졌다.
항-증식 효과에 대한 스크리닝
세포 손상은 부득이하게 대사성 세포 기능 및 성장을 위한 에너지를 유지하고 제공하는 세포의 능력을 상실시킨다. 대사 활성 검정은 이러한 전제를 기초로 한다. 보통, 이는 미토콘드리아 활성을 측정한다. 세포 증식 시약 WST-1(Roche Cat. No. 11 644 807 001)은 살아있는 세포의 대사 활성을 측정하는 미리 제조 된(ready-to-use) 기질이다. 이후, 대사 활성은 살아있는 세포의 수와 관련되는 것으로 추정된다. 이러한 실시예에서, 다양한 항-EGFR 항체를 함유하는 세포 배양 상층액으로 처리된 후에 대사적으로 활성인 세포의 수를 측정하는데 WST-1 검정을 이용하였다.
WST-1 검정을 수행하기 전, 다양한 부피의 2-ml 상층액(0, 10, 25, 50 및 150 μl)을 96 웰 플레이트 중의 적절한 웰로 옮겼다.
이후, HN5 세포를 1xPBS로 세척하고, 3 ml 트립신 용액을 이용한 트립신화에 의해 박리(detached)시켰다. 이후, 17 ml의 완전 배지를 첨가하고, 세포를 5분 동안 300xg(1200 rcf)에서 스핀 다운시켰다. 상층액을 제거하고, 세포를 DMEM + 0.5% FBS에 재현탁시켰다. 세포를 계수하고, 농도를 조정하고, 1500개의 세포를 상층액과 함께 각각의 웰이 전체적으로 200 μl의 배지를 함유하도록 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 가습화 인큐베이터에서 4일 동안 인큐베이션하였다. 이후, 20 μl의 WST-1 시약을 적절한 웰에 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이후, 플레이트를 오비탈 플레이트(orbital plate) 진탕기로 옮기고, 1시간 동안 두었다. ELISA 판독기에서 450 및 620 nm(기준 파장)에서 흡광도를 측정하였다. 대사적으로 활성인 세포(MAC)의 수준의 차이를 하기와 같이 대조 상층액의 퍼센트로 계산하였다:
Figure 112009060319675-pct00001
이후, 이러한 값을 무료 소프트웨어 클러스터(Cluster) 및 트리뷰(TreeView) 를 이용하여 수행된 지도 계층형 클러스터 검정(supervised hierarchical cluster analysis)(ELISA에서 반응성에 기초하여 클러스터링(clustering)됨)에 대한 기초로 사용하였다.
항체 선택 방법에서 초기 단계에서 기능성 항체를 스크리닝할 수 있는 것이 바람직하다. 83개의 2-ml 트랜스펙션으로부터의 배양 상층액을 0.5% FBS 중의 HN5 세포를 이용하여 수행된 증식 검정에서 성장 억제 기능을 스크리닝하기 위해 사용하였다. 단순 계층형 클러스터 분석에 의해 결과를 시각화시켰다. 클러스터 검정(도 5)에서 확인할 수 있는 바와 같이, 다수의 상층액이 농도 의존 방식으로 대사적으로 활성인 HN5 세포의 수를 감소(어두운 회색)시키는 것으로 밝혀졌다(클러스터 2). 유사하게, 일부 상층액은 농도 의존 방식으로 대사적으로 활성인 HN5 세포의 수를 증가(밝은 회색)시켰다(클러스터 1, 3 및 4). 흥미로운 관찰은 대사적으로 활성인 HN5 세포의 수를 감소시킨 상층액이 반응성 2(흑색 화살표)를 갖는 반면, 대사적으로 활성인 HN5 세포의 수를 증가시킨 상층액은 반응성 1(회색 활살표)를 갖는다는 점이다. 반응성 2를 갖는 상층액은 wtEGFR 및 EGFRvⅢ ELISA 둘 모두에서 양성인 반면, 반응성 1을 갖는 상층액은 wtEGFR에 대해서만 반응성을 가졌다. 따라서, 이러한 검정은 ELISA에서의 항체 반응성과 세포 검정에서의 기능성 사이의 상관 관계를 제공할 수 있다.
클론 수복( repair )
다중 PCR 접근법을 이용할 때, 프라이머 축퇴(degeneracy) 및 높은 상동성 정도로 인해 일정한 정도의 V-유전자 과(family) 내(intra) 및 과 간(inter) 교차- 프라이밍이 예상된다. 교차-프라이밍은 여러 잠재적인 영향력, 예를 들어, 구조적 변화 및 증가된 면역원성을 지니는 면역글로불린 프레임워크에서 자연적으로 발생하지 않는 아미노산을 도입시키며, 모두는 감소된 치료 활성을 초래한다.
이러한 단점을 제거하고 선택된 클론이 천연 체액성 면역 반응을 반영함을 보장 하기 위해, 이러한 교차-프라이밍 돌연변이를 소위 클론 수복이라 불리는 공정으로 바로잡았다.
클론 수복 절차의 첫번째 단계에서, VH 서열을 관심있는 클론이 유래된 VH-유전자에 상응하는 서열을 함유하는 프라이머 세트로 PCR 증폭시킴으로써, 교차-프라이밍에 의해 도입된 임의의 돌연변이를 바로잡았다. PCR 단편을 XhoI 및 AscI로 소화시키고 XhoI/AscI 소화된 포유동물 발현 벡터(도 4)로 통상적인 라이게이션 절차를 이용하여 다시 라이게이션하였다. 라이게이션된 벡터를 대장균(E.coli)에서 증폭시키고, 플라스미드를 표준 방법에 의해 정제하였다. VH 서열을, 교정을 입증하기 위해 서열분석하고, 벡터를 NheI/NotI로 소화시켜 경쇄의 삽입을 위해 제조하였다.
두번째 단계에서, 완전한 경쇄를 관심있는 클론이 유래된 VL-유전자에 상응하는 서열을 함유하는 프라이머 세트로 PCR 증폭시킴으로써, 교차-프라이밍에 의해 도입된 임의의 돌연변이를 바로잡았다. PCR 단편을 NheI/NotI로 소화시키고 상기 제조된 VH 함유 벡터로 라이게이션하였다. 라이게이션 생성물을 대장균(E.coli)에서 증폭시키고, 플라스미드를 표준 방법에 의해 정제하였다. 후속하여, 경쇄를 서 열분석하여 교정을 입증하였다.
선택된 클론의 카파 불변 영역이 유전자의 증폭 동안 도입된 돌연변이를 함유하는 경우, 이것은 둘연변이되지 않은 불변 영역으로 교체되었다. 이것은, 수복된 VL-유전자(불변 영역 없이 증폭됨)가 교정 서열(별개의 PCR에서 수득됨)로 불변 영역에 융합되는 중첩 PCR에서 수행된다. 전체 서열을 증폭시키고 상기 기재된 벡터를 함유하는 VH로 클로닝하였으며, 수복된 경쇄를 서열화하여 교정을 입증하였다.
표 2 : 항-EGFR 클로닝을 위한 시작 물질을 생성하기 위해 사용된 면역화 스케줄
Figure 112009060319675-pct00002
Figure 112009060319675-pct00003
표 3 : RT-PCR 다중 중첩-신장 프라이머 세트
Figure 112009060319675-pct00004
W=A/T, R=A/G, S=G/C, Y=C/T, K=G/T, M=A/C, H= ACT , B= GCT ; Cone . - 최종 농도.
표 4 : 네스티드 프라이머 세트
Figure 112009060319675-pct00005
K=G/T, M=A/C, D=AGT; Cone. - 최종 농도.
표 5 : 카파 불변 스플라이싱 프라이머 세트
Figure 112009060319675-pct00006
실시예 2 : 항-EGFR 항체의 포유동물 생성
항-EGFR 항체의 일시 발현을 위해 프리스타일 MAX CHO 발현 시스템(Invitrogen)을 이용하였다. 항체를 200-2000 ml 부피로 발현시켰다.
트랜스펙션 약 24시간 전에 CHO-S 세포를 계대배양하여 0.5 x 106 세포/ml의 세포 농도에 도달시켰다. 플라스미드(세포 배양 배지 ml 당 1.25 μg)를 옵티프로(OptiPro) 혈청 비함유 배지로 희석시키고, 공급자에 의해 권고되는 바와 같이 프리스타일 MAX 트랜스펙션 시약 용액과 혼합시켰다. 트랜스펙션 시약을 세포 배양물로 옮기고, 6일 후에 상층액을 수거하였다.
발현된 항체를 IgG1 분자의 정제를 위한 단백질 A-세파로오스 컬럼(MabSelect Sure, GE Health Care)을 이용하는 친화성 크로마토그래피 단계를 이용하여 배양 상층액으로부터 정제하였다. 항체를 0.1M 글리신, 2.7을 이용하여 컬럼으로부터 용리시켰다. 280 nm에서 흡광도 측정에 의해 결정된 항체를 함유하는 분획을 풀링시키고, 5 mM 아세트산 나트륨, 150 mM NaCl, pH 5에 대해 투석하였다. 정제된 항체 샘플을 LAL 검정에 의해 내독소의 존재에 대해 시험하였다.
실시예 3 : 에피토프 특이성의 결정
참조 항체를 이용한 경쟁 ELISA
문헌[J. R. Cochran et. al., JIM 2004: 287; 147-158]에 공개된 바와 같이 EGFR의 공지된 도메인으로의 참조 항체 결합을 이용함으로써, 항-EGFR 항체의 인간 Fc 영역에 대해 특이적이고, 마우스 또는 래트 IgG Fc에 대해 교차 반응성을 나타내지 않는 이차 시약과의 인큐베이션에 의해 항-EGFR 항체의 결합 에피토프 사이를 구별할 수 있는 경쟁 ELISA를 개발하였다. ELISA를 문헌[Ditzel et al, 1995, The Journal of Immunology, Vol 154, Issue 2 893-906]에 공개된 기재로부터 적합화시켰다.
에피토프 차단 ELISA를 전장 EGFR 수용체 항원을 PBS 중에 0.5 μg/ml로 희석시키고; 4℃에서 밤새 50 μl/ELISA 웰로 코팅함으로써 수행하였다. 다음날 아침, 웰을 PBS-T로 세척하고, 실온에서 PBS-T-1% BSA로 1시간 동안 차단시킨 후, PBS-T로 2회 세척하였다. 다음으로, 25 μl의 뮤린 또는 래트 참조 mAb를 이전 실험으로부터 공지된 희석액 중에 독립적 ELISA 웰에 첨가하여, 200배의 최대 항원 결합을 발생시켰다. 15분 후, 25 μl의 항-EGFR 항체를 참조 항체로 미리 인큐베이션된 웰 또는 25 μl의 PBS를 함유하는 웰에 2 μg/ml의 농도로 첨가하였다. 이는 1 μg/ml의 항-EGFR 항체의 최종 농도, 및 혼합 후에 참조 항체의 최대 항원 결합의 100배를 발생시켰다. 항체를 실온에서 45분 동안 인큐베이션한 후, 웰을 PBS-T로 4회 세척하였다. 이차 염소-항-인간 IgG HRP 컨쥬게이트를 1:3000 희석하 고, 50 μl를 각각의 웰에 첨가한 후, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 최종적으로, 웰을 PBS-T로 4회 세척하고, 50 μl/웰의 TMB를 첨가하여 플레이트를 발달시키고, 5-15-30분 마다 620 nm에서 판독하였다. 억제 정도를 억제 % = (1-(OD 경쟁/OD 비 경쟁(PBS))) x 100의 식으로부터 계산하였다.
ELISA 시약:
1) 코팅 완충용액: 1 x PBS; Gibco cat:20012-019
2) 항원: A431 세포로부터 정제된 야생형 전장 EGFR; Sigma E3641
3) ELISA 플레이트: NUNC 맥시소르브(Maxisorp); cat: 442404
4) 차단/희석 완충용액: PBS-T 중의 1% BSA(PBS-T-1% BSA)
5) 세척 완충용액: 1x PBS/0.05% Tween 20(PBS-T)
6) 양성 대조군: 에르비툭스(Merck KGaA, 64271 Darmstadt, Germany, Catalogue #: 018964; Cetuximab), 벡티빅스(Amgen Inc, One Amgen Center Drive, Thousand Oaks CA 91320-1799, USA, Cat # 3241400; 파니투무맙(Panitumumab))
7) 참조 항체:
· ICR10(래트), Abcam, Ab231
· 199.12(뮤린), Lab Vision Ab-11, MS-396-PABX
· EGFR.1(뮤린), Lab Vision Ab-3, MS-311-PABX
· H11(뮤린), Lab Vision Ab-5, MS-316-PABX
· B1D8(뮤린), Lab Vision Ab-16, MS-666-PABX
· 111.6(뮤린), Lab Vision Ab-10, MS-378-PABX
· 225(뮤린), Lab Vision Ab-2, MS-269-PABX
· 528(뮤린), Lab Vision Ab-1, MS-268-PABX
8) 염소-항-인간 IgG HRP 컨쥬게이트; Serotec, Star 106P
9) TMB 플러스(Plus); KemEnTec, cat # 4390L
10) 1M H2SO4
경쟁 ELISA의 결과는 도 6에 제시되어 있다. EGFR 세포외 도메인에 대해 발생된 사용된 참조 항체의 도메인 특이성에 따라 항-EGFR 항체 상층액을 등급화하기 위해 ELISA 경쟁 검정을 사용하였다. 50-100%의 억제 값을 중첩 에피토프 또는 항원 상의 근접한 에피토프에 결합하는 항체 쌍 사이의 유의한 경쟁의 표시로서 취하였고, 50% 미만의 억제 값은 항체 쌍에 의해 인지되는 에피토프가 근접하게 위치하지 않아 감소된 입체구조적 방해를 발생시키는 것을 나타내었다. 항-EGFR 항체는 도메인 Ⅰ,Ⅱ 및 Ⅲ을 포함하는 EGFR ECD 상의 다양한 에피토프에 결합하는 것으로 밝혀졌다. 몇몇 항체에 대해, 이러한 검정은 특이적 mAb가 도메인 Ⅰ 또는 도메인 Ⅱ에 대해 특이적인 지의 여부를 구별할 수 없었다. 이러한 특이성은 표지된 도메인 Ⅰ/Ⅱ이었다. 추가로, 몇몇 항체는 사용된 경쟁 ELISA에서 추가로 추론될 수 없는 독특한 에피토프에 결합하는 것으로 나타났다(예를 들어, 클론 1229 & 1320, 도 6). 이러한 항체의 일부는 본 발명자들이 임의의 항체 반응성에 대한 참조를 갖지 않는 도메인 Ⅳ에 대해 특이적인 것이 가능하다. 흥미롭게도, 도메인 Ⅲ 항체는 이러한 도메인에 대해 시험된 뮤린 참조 항체로 수득된 다양한 경쟁 패턴에 기초하여 4개의 하위그룹으로 추가로 나누어질 수 있었다. 그룹 Ⅰ은 참조 항체 Ab1 & Ab2와 결합에 대해 경쟁하는 것으로 밝혀진 mAb 992 만으로 구성되었다. 그룹 Ⅱ는 둘 모두가 동일한 Ig 재배열로부터 유래되고, 결과적으로 DNA 및 아미노산 수준에서 매우 근접한 서열 상동성을 나타내는 mAb 1024 & 1042로 구성되었다. 이러한 2개의 항체는 오직 Ab2와 결합에 대해 경쟁하는 것으로 밝혀졌다. 그룹 Ⅲ는 참조 항체 Ab1, Ab5 & Ab10과 결합에 대해 경쟁하는 mAb 1030, 1208 & 1277로 구성되었다. 최종적으로, 그룹 Ⅳ는 사용된 도메인 Ⅲ 참조 항체 Ab1, Ab2, Ab5 & Ab10 모두와 결합에 대해 경쟁하는 mAb 1254로 구성되었다.
표면 플라즈몬 공명 기술을 이용한 참조 또는 동일 종 항체를 이용한 별개의 에피토프에 대한 경쟁 검정
4개의 플로우 셀을 함유하는 비아코어 3000 기계 상에서 SPR 검정을 수행하였다. CM5 비아코어 칩을 제조업체의 설명서에 따라 플로우 셀 1-4에 10,000 공명 단위(Ru)의 폴리클로날 항-His 항체를 컨쥬게이션시켰다. 5 μl/분의 유동 속도를 이용하여, 20 μg/ml의 농도에서 15 μl 6xHis EGFR ECD를 주입하고, 항-His 폴리클로날 항체가 컨쥬게이션된 모든 4개의 플로우 셀 상에 포획시켰다. 항원 주입 직후, 경쟁이 없는 항-EGFR mAb의 최대 결합을 참조 수행 동안 각각의 플로우 셀에서 확립시켰다. 간단히, 40 μg/ml 농도의 5 μl 항체를 포획된 EGFR을 갖는 모든 플로우 셀 상에 주입한 후, 낮은 pH의 산 세척(10 mM 글리신-HCl, pH2로 10초간 접촉)을 이용하여 항체/항원 복합체를 스트립핑(stripping)시켰다. 각각의 플로우 셀에 대한 항-EGFR 항체 최대 결합의 결정 후, 동일한 비아코어 주기 동안 경쟁 실 험을 수행하였다. 플로우 셀을 EGFR ECD 항원으로 먼저 포화시킨 후, 상기 기재된 것과 동일한 항원 포화 조건을 이용하여 별개의 플로우 셀에 다양한 참조 항체 또는 항-EGFR 항체를 주입하였다. 이러한 단계 직후, EGFR 항원으로 포화된 플로우 셀 상에 항-EGFR 항체, 및 항원 또는 차단 항체의 해리를 최소화시키기 위한 경쟁 항체를 두번째로 주입하였다. 이후, 항체/항원 복합체를 낮은 pH의 산 세척(10 mM 글리신-HCl, pH 2와 10초 접촉)으로 스트립핑시키고, 참조 실험을 이용하여 시작하는 전체 주기를 신규한 항-EGFR 항체로 반복하였다. 시험된 항-EGFR 항체의 억제 정도를 각각의 샘플의 주입 전 및 후에 보고 시점이 기록된 2개의 제 2의 항체의 도입에 의한 경쟁 전 및 후에 개별적 항-EGFR 항체의 Ru max 값을 비교함으로써 결정하였다. 1개의 비아코어 주기의 예가 도 7에 도시되어 있다.
시약:
1. CM5 칩; Biacore, Cat. No. BR-1000-14
2. NHS; Biacore BR-1000-50
3. EDC; Biacore BR-1000-50
4. 10mM 아세테이트 완충용액 pH 4.5; Biacore, Cat. No. BR-1003-50
5. 테트라-His 항체(BSA 없음); Qiagen, Cat. No. 34670
6. 에탄올아민, 1.0M pH 8.5; Biacore BR-1000-50
7. 10 x HBS-EP 영동 완충용액: 0.01M HEPES pH 7.4, 0.15M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% v/v 계면활성제 P20
8. 항원: 6xHis를 갖는 사내 생성된 재조합 인간 EGFR 세포외 도메인.
9. 10 mM 글리신 HCl pH 2.0
10. 참조 항체:
· ICR10(래트), Abcam, Ab231
· 199.12(뮤린), Lab Vision Ab-11, MS-396-PABX
· EGFR.1(뮤린), Lab Vision Ab-3, MS-311-PABX
· H11(뮤린), Lab Vision Ab-5, MS-316-PABX
· B1D8(뮤린), Lab Vision Ab-16, MS-666-PABX
· 111.6(뮤린), Lab Vision Ab-10, MS-378-PABX
· 225(뮤린), Lab Vision Ab-2, MS-269-PABX
· 528(뮤린), Lab Vision Ab-1, MS-268-PABX
경쟁 ELISA에서 수득된 에피토프 검정을 확인하고, 동일 종 항-EGFR 항체 쌍 사이의 경쟁에 의해 추가 에피토프 검정을 수행하기 위해, 표면 플라즈몬 공명에 의해 실시간으로 측정된 항체 결합에 기초한 경쟁 검정을 확립시켰다. 참조 항체의 패널에 대해 시험된 항-EGFR 클론의 수득된 에피토프 맵이 하기 도 8에 제시되어 있다. 50-100%의 억제 값을 중첩 에피토프 또는 항원 상의 근접한 에피토프에 결합하는 항체 쌍 사이의 유의한 경쟁의 표시로서 취하였고, 50% 미만의 억제 값은 항체 쌍에 의해 인지되는 에피토프가 근접하게 위치하지 않아 감소된 입체구조적 방해를 발생시키는 것을 나타내었다. 25% 미만의 억제 값은 중첩 에피토프에 대한 검정에 포함시키지 않았는데, 이들은 유의하지 않은 억제를 나타내는 것으로 판단하였기 때문이다. 1320을 제외한 모든 시험된 항체는 사용된 참조 항체 중 하나 이상과 경쟁하는 것으로 밝혀졌고, 이는 1320이 본 발명자들이 임의의 항체 반응성에 대한 참조를 갖지 않는 공지되지 않은 에피토프에 대해 특이적인 것을 나타낸다. 완전한 인간 또는 인간화된 항체 벡티빅스 및 에르비툭스를 검정에 포함시켰고, 중첩 에피토프에 결합하는 것으로 밝혀졌다. 경쟁 ELISA 및 경쟁 SPR 검정 둘 모두로부터 수득된 데이터는 일반적으로 항-EGFR 항체의 확립된 도메인 특이성과 관련하여 상관 관계가 있다. 그러나, 개별적 참조 항체 사이의 경쟁 패턴에서의 약간의 차이가 때때로 2개의 검정에서 관찰되었고, 이는 아마 SPR 경쟁 검정이 재조합 세포외 도메인 EGFR을 사용한 반면 EGFR 경쟁 검정이 전장 EGFR 수용체 항원을 사용한다는 사실로 인한 것이다.
항-EGFR 항체의 에피토프 맵핑이 2개의 상이한 경쟁 검정에서 확증된 후, 어떠한 항체 쌍이 별개의 에피토프를 인지하고, 항체 쌍 인지 중첩 에피토프가 에피토프 클러스터로 추가로 나누어질 수 있는지를 결정하기 위해 항-EGFR 항체 쌍의 동일 종 조합물의 경쟁 검정으로 연구하였다. 이러한 검정의 결과는 도 9에 제시되어 있다. 다시, 이러한 검정에서, 50-100%의 억제 값을 중첩 에피토프에 결합하는 항체 쌍 사이의 유의한 경쟁을 나타내는 것으로 취하였다. 이러한 기준은 항체가 항체 스스로에 대해 시험되기 때문에 유효한 것으로 생각되며, 결과적으로 도 9에 나타난 바와 같이 인지 완전 중첩 에피토프는 70% 내지 100%의 억제 값을 발생시켰다. 추가로, 이러한 관찰은 분석 기간 내의 항원 또는 항체 쌍의 해리가 시험된 항체에 대한 실험의 결과에 영향을 미치지 않는 것을 나타내었다. 이전 섹션에서 결정된 추정된 EGFR ECD 도메인 특이성에 따른 항체를 그룹화시킴으로써, 도메 인 Ⅰ, 또는 도메인 Ⅰ 또는 Ⅱ(Ⅰ/Ⅱ)에만 결합하는 항체가 주로 동일한 특이성을 갖는 항체 일원과 클러스터링되고, 도메인 Ⅲ를 인지하는 항체 일원과는 클러스터링되지 않는 것으로 밝혀졌다. 마찬가지로, 도메인 Ⅲ 항체는 오직 도메인 Ⅲ를 인지하는 항체 일원과 결합에 대해 경쟁하고, EGFR 도메인 Ⅰ 또는 Ⅰ/Ⅱ를 인지하는 항체와는 결합에 대해 경쟁하지 않는 것으로 밝혀졌다. 동일한 Ig 재배열로부터 유래된 2개의 도메인 Ⅲ 항체 1024 & 1042가 중첩 에피토프를 인지하는 것으로 밝혀진 반면, 1024 또는 1042와 992 또는 1030과의 쌍을 이루는 조합은 중요하게는 유의한 경쟁의 결과를 발생시키지 않는 것으로 밝혀졌다. 결과적으로, 항체 992, 1030 & 1024/1042는 EGFR ECD의 도메인 Ⅲ 상의 3개의 비중첩 에피토프를 인지하는 것으로 결론내렸다. 최종적으로, mAb 1320는 도메인 Ⅲ에 대해 특이적이고, 시험된 다른 도메인 Ⅲ에는 특이적이지 않은(1320과 1042의 경쟁은 결정되지 않음) mAb 1024 및 1449와 결합에 대해 경쟁하는 것으로 밝혀졌다. 결과적으로, mAb 1320는 EGFR의 세포외 도메인 상의 도메인 Ⅲ 주변에 결합하는 것으로 추정되었다. 에피토프 특이성의 개관은 도 10에서 관찰될 수 있고, 여기서 EGFR ECD 도메인 Ⅰ, Ⅰ/Ⅱ 또는 Ⅲ에 대해 특이적인 항체의 에피토프 맵이 예시되어 있다.
992, 1030 & 1024/1042의 쌍을 이룬 조합이 SPR에 의해 결정시 유의한 항체 경쟁을 발생시키지 않는다는 발견 후, 얼마나 많은 항체가 수용체 항원에 동시에 결합할 수 있는지 시험하기 위해 신규한 비아코어 실험을 고안하였다. 먼저, 3개의 항체 992, 1024 및 1030를 이용한 도메인 Ⅲ의 포화가 도메인 Ⅲ가 아닌 다른 EGFR 특이성에 대한 항체의 결합에 대해 어떠한 영향을 주는지 연구하였다. 이러 한 검정으로부터의 결과는 도 11A에 제시되어 있다. 단일한 항체의 억제를 이들을 각각의 비아코어 주기 동안 1개의 여분의 항체의 연속 첨가에 의해 생성된 3개 이하의 항체의 항체 혼합물 또는 단일 항체와 조합하여 시험함으로써 확립하였다. 인지된 에피토프의 완전한 봉쇄를 보장하기 위해, 항체를 40 μg/ml의 개별적 농도로 시험하였다. 도 11A에 나타난 바와 같이, 3개의 도메인 Ⅲ 항체 992, 1024 & 1030은 임의의 결합 억제 없이 수용체에 동시에 결합하는 것으로 밝혀졌다. 첨가된 각각의 항체에 대해 증가하는 관찰된 음성 억제 값은 첨가되는 다음 항체에 대한 결합에서의 상승작용을 암시한다. 중요하게는, 도메인 Ⅲ가 3개의 항체와 인큐베이션된 후, 도메인 Ⅰ/Ⅱ(mAb 1261),도메인 Ⅰ(1347) 또는 공지되지 않은 특이성 도메인(1361) 상의 비-중첩 에피토프에 특이적인 다른 항체는 3개의 mAb 혼합물로부터 에피토프 봉쇄 없이 결합하는 것으로 보였다. 추가로, 이러한 시험된 항체는 이들이 3개의 mAb 혼합물을 이용한 수용체 포화 후에 보다 낫게 결합하는 것을 나타내는 작은 음성 억제 값을 가졌다. 결과적으로, 이러한 실험은 6개의 시험된 항체가 EGFR의 ECD에 동시에 결합할 수 있는 것을 암시한다. 이러한 관찰된 현상을 추가로 시험하기 위해, 모든 시험된 항체(1261, 1347, 992, 1024, 1030 & 1361)로 구성된 항체 혼합물을 제조하고, 혼합물 중의 각각의 개별적 샘플 항체의 억제에 대해 시험하였다. 양성 대조군으로 제공된 시험된 샘플 항체가 포함되지 않은 항체 혼합물을 또한 시험하였다. 도 11B/C에 제시된 바와 같이, 모든 6개의 시험된 항체는 항체의 완전한 혼합물과 인큐베이션된 EGF 수용체로의 결합에 대해 시험하는 경우 80-116%로 억제되는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 개별적 샘플 항체가 이러 한 혼합물로부터 제거되는 경우, 특정 샘플 항체의 유의한 억제가 인지되지 않았고, 이는 혼합물 중의 항체가 오직 이들 스스로에 의해 EGF 수용체에 대한 결합에 대해 차단되는 것을 나타낸다. 이러한 실험은 비-중첩 에피토프를 인지하는 6개 이상의 항체가 EGFR에 동시에 결합할 수 있는 것을 나타내었다. 최종 실험으로서, 6개의 항체 혼합물과 인큐베이션되는 경우 도메인 Ⅰ(1284), Ⅰ/Ⅱ(1257) 또는 공지되지 않은 특이성 클러스터(1183, 1255)에 특이적인 다른 항체가 EGFR에 결합할 수 있는지 연구하였다. 도 11D에 제시된 바와 같이, 6개의 항체 혼합물과 인큐베이션 전에 시험 항체 모두는 EGFR에 유의하게 결합할 수 없었다. 이는 상기 항체 집합물이 6개의 결합된 항체에 의해 점유되지 않는 남은 임의의 부위에 대한 항체를 포함하지 않는 것으로 인한 것일 수 있다. 대안적으로, 사실 시험된 도메인 상의 모든 부위가 항체로 차단되는 것이 가능하다.
표 6 : EGFR 세포외 도메인에 대해 문헌에 기재된 특이성을 갖는 시판 항체.
Figure 112009060319675-pct00007
실시예 4 : EGFR 활성화 억제
경쟁 ELISA에 의한 EGFR 수용체로의 EGF 리간드 결합의 항체 매개 봉쇄의 결 정
EGFR 수용체에 결합되고, 동시에 비오티닐화된 EGF 리간드의 결합을 차단하는 시험 항-EGFR 항체를 확인하기 위해, ELISA 웰을 4℃에서 밤새 PBS 중의 0.5 μg/ml의 농도로 80 μl/웰의 전장 EGFR로 코팅하였다. 다음날 아침에 웰을 PBS-T로 2회 세척하고, 실온에서 150 μl의 PBS-T-1% BSA로 1시간 동안 차단시킨 후, PBS-T로 2회 세척하였다. 다음으로, 80 μl의 연속 희석된 항-EGFR 항체 및 대조 항체를 웰에 첨가하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 항체 인큐베이션 후, 0.5 μg/ml 농도의 20 μL 비오티닐화된 EGF 리간드를 항-EGFR 항체 희석액을 함유하는 모든 웰 또는 PBS-T 1% BSA 만을 함유하는 웰에 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 이후, 웰을 PBS-T로 5회 세척한 후, 차단 완충용액 중에 1:1000으로 희석된 100μl/웰 스트렙타비딘-HRP 이차 시약 및 30분 동안 실온에서의 인큐베이션을 이용하여 인큐베이션시켰다. 최종적으로, 웰을 PBS-T로 5회 세척하고, 100 μL/웰 TMB 기질을 첨가하여 플레이트를 발달시키고, 60분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 1M H2SO4를 첨가하여 반응을 중지시키고, 100 μl/웰 및 플레이트를 OD 450 nm에서 판독하였다.
ELISA 시약:
1) 코팅 완충용액: 1 x PBS; Gibco cat:20012-019
2) 항원: A431 세포로부터 정제된 야생형 전장 EGFR; Sigma E2645
3) ELISA 플레이트: NUNC Maxisorp; cat: 442404
4) 차단/희석 완충용액: PBS-T 중의 1% BSA(PBS-T-1% BSA)
5) 세척 완충용액: 1x PBS/0.05% Tween 20(PBS-T)
6) 양성 대조군: 에르비툭스, 벡티빅스
7) 음성 대조군: 시나기스(Synagis)(Medimmune Inc, Palivizumab, cat. # NDC 60574-41 11-1)
8) 비오티닐화된 EGF 리간드; Invitrogen, cat E3477
9) 스트렙타비딘-HRP, ultra sensitive: Sigma S 2438
10) TMB 플러스(Plus); KemEnTec, cat # 4390L
11) 1M H2SO4
ELISA 웰에 코팅된 전장 EGFR 수용체에 대한 비오티닐화된 EGF 리간드의 결합을 억제하는 항-EGFR 항체의 능력을 등급화하기 위해 ELISA 경쟁 검정을 이용하였다. 도 12에 도시된 바와 같이, 에르비툭스 및 벡티빅스 둘 모두는 EGF 리간드 결합을 매우 잠재적으로 차단하는 것으로 보인 반면, EGFR에 특이적이지 않은 음성 대조군 항체 시나기스(Synagis)는 EGFR 리간드 결합을 억제하지 않았다. 도 12A에 도시된 바와 같이, 도메인 Ⅲ에 대해 특이적이고, 비 중첩 에피토프를 인지하는 3개의 항체 992, 1030 및 1042를 EGF 리간드 결합을 억제하는 능력에 대해 단독으로 또는 등몰 혼합물로 시험하였다. 3개의 시험된 항체 중, mAb 1030만이 에르비툭스 및 벡티빅스와 비교하는 경우 적당한 EGF 리간드 억제 활성을 나타내었다. mAb 992, 1030 및 1042의 등몰 혼합물은 단독으로 시험된 단일 항체 보다 EGF 리간드 결합을 억제하는데 더 효과적인 것으로 보였다. 1 μg/ml의 전체 IgG 농도에서, 등몰 혼합물은 mAb 1030 보다 대략 2배, 및 단독으로 시험된 mAb 992 & 1042 보다 4배 더 효과적으로 EGF 리간드 결합을 억제하는 것으로 밝혀졌고, 이는 비 중첩 에피토프를 인지하는 3개의 도메인 Ⅲ 항체 혼합의 상승작용적 효과를 나타낸다. 도 12B에 도시된 바와 같이, 항-EGFR 클론 1208, 1260, 1277 & 1320를 또한 상기 검정에서 시험하였다. 이러한 4개의 클론은 에르비툭스 대조군과 비교하는 경우 클론 992, 1030 및 1042에 대해 관찰된 것 보다 더욱 효과적인 용량 의존적 방식으로 EGF 리간드 결합을 억제할 수 있었다. 0.33 μg/ml를 초과하는 농도에서, 항-EGFR 클론 1208, 1260, 1277 & 1320은 동일한 농도로 시험된 에르비툭스에 비해 EGF 리간드 결합 차단에 효과적인 것으로 보였다.
HN5 세포에서 EGF 유도된 EGFR 인산화를 억제하는 능력
세포내 웨스턴 검정(in cell western analysis)에서 EGFR 인산화에 대한 반응성에 대해 항-EGFR 항체를 시험하였다. 세포내 웨스턴 절차는 동일 샘플로부터 EGFR 및 인산화된 EGFR(pEGFR)의 검출을 가능케 하고, 이는 차례로 각각의 항체 처리 및 데이터 세트에 대해 EGFR 대 pEGFR 발현의 비를 비교하는 것을 가능케 한다. 10% FCS 및 펜/스트렙(pen/strep)으로 보충된 DMEM에서 ATCC에 의해 제공된 설명서에 따라 HN5 세포를 배양하였다. 43,000개의 HN5 세포를 고갈(starvation) 24시간 전에 Nunc로부터의 96웰 플레이트(cat no 167008)에 시딩하였다. 세포를 항체 첨가 16시간 전에 DMEM에서 고갈시켰다. 항체를 200 μl DMEM 중의 10 μg/ml의 최종 농도로 첨가하고, 혼합물을 5회 이상 위아래로 피펫팅(pipetting)하여 혼합시켰 다. 항체 처리 30분 후, EGF를 적절한 웰에 50 μg/ml의 농도로 첨가하고, 7.5분 동안 두었다. 세포내 웨스턴을 본질적으로 세포내 웨스턴 키트(Odyssey, LI-COR biosciences)의 제조업체에 의해 제공된 설명서에 따라 수행하였다.
세포를 EGF 자극 후 20분 동안 3.7% 포름알데히드(Sigma F-8775, lot71 K500, ~1% 메탄올을 함유함)에서 고정시켰다. LI-COR 차단 완충용액(927-40000)에서 차단시키기 전에 세포막을 투과시키기 위해 5회의 5분 동안의 PBS-Triton X-100(0.1%) 세척을 이용하였다. 일차 항체를 제공된 설명서에 따라 해당 농도로 첨가하고, 2.5시간 동안 RT에서 가벼운 진탕과 함께 인큐베이션시켰다(전체 EGFR 마우스, 1:500 희석 biosource international, cat no AHR5062 및 Phospho-EGFR Tyr1173, 래빗 1:100 희석, biosource, Cat no 44-794G).
일차 항체와의 인큐베이션 후, 세포를 PBS-T(0.1% tween-20)로 5분 동안 5회 세척한 후, 이차 항체를 첨가하고(염소-항-래빗 IRDye 680, 1:200 희석, LI-COR cat no 926-32221 및 염소-항-마우스, IRDye 800CW 1:800 희석; LI-COR cat no 926-32210), 알루미늄 호일에 덮힌 플레이트의 가벼운 진탕과 함께 RT에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다.
테칸(Tecan) 형광 판독기에서의 측정 전, 플레이트를 PBS-T로 5분 동안 5회 세척하였다. 플레이트의 갑자기 중지된 던지는 동작으로 모든 세척을 종료시키고, 세척 용액을 없애기 위해 열린 측을 아래로 향하게 한 후, 플레이트를 파이퍼 타올에 두드렸다(ELISA 플레이트의 처리와 동일하게, 중요한 것은 세포가 상기 처리 동안 플레이트 상에 존재하고, 세척 용액이 세포 단층의 온전성을 방해하는 흡출에 의해서보다 상기 절차에 의해 제거될 수 있다는 개념이다.). 마지막 세척으로부터 남은 임의의 잔여 세척 용액을 다중채널 피펫을 이용하여 웰 측면에서의 가벼운 흡출에 의해 제거하였다. 형광 신호를 680nm 채널(여기 675nm 및 방출 705nm, 둘 모두 10nm 대역폭), 및 800nm 채널(여기 762nm 및 방출 798nm, 둘 모두 10nm 대역폭)에 대해 측정하였다.
세포내 웨스턴 검정을 이용함으로써, 3개의 항체가 HN5 세포의 pEGFR 상태에 현저하게(p<0.05) 영향을 주는 것이 명백해졌다; 1208, 1277 및 1320 항체(도 13).
항-EGFR 항체 및 개별적 항체의 항-EGFR 혼합물(992, 1030 및 1042)을 EGF 유도 EGFR 인산화의 억제의 세포내 웨스턴 검정에서의 효과에 대해 시험하였다. 도 14에서 관찰되는 바와 같이, 992 및 1030 및 항-EGFR 항체 혼합물은 EGF 유도 EGFR 인산화를 현저하게 억제하였다(p<0.05).
실시예 5 : A431NS 세포 내의 EGF 수용체의 내재화
A431NS 세포(ATCC# CRL-2592)를 TrypLE을 이용하여 80-90% 컨플루언스(confluence) T175 배양 플라스크로부터 트립신화시켰다. 박리된 세포를 PBS에서 세척하고, 혈청이 없는 DMEM에 현탁시켰다. 세포를 1-2 ml의 부분으로 나누고, 시험 항체와 함께 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 항체 농도는 10 μg/ml이었다. 세포를 DMEM (250g, 4분, 4℃)에서 3회 세척하고, 1.8 ml DMEM에 재현탁시켰다. 각각의 부분을 각각 300 μl 세포 현탁액을 함유하는 6개의 FACS 튜브로 나누었다. 각각의 부분의 3개의 튜브를 정확하게 40분 동안 37℃ 수조에 두고, 나머지 3개를 즉시 얼음 상에 두었다. 인큐베이션 후, 세포를 (250g, 4분, 4 ℃)에서 2회 세척하고, DMEM 중의 100 μl 래빗 항 인간 IgG Fcγ F(ab')2-FITC에 재용해시켰다. 세포를 4℃에서 30분 동안 인큐베이션시키고, 4℃ DMEM에서 3회 세척하고, FACSCalibur 상에서 검정하였다.
결과는 도 15에 도시되어 있다. 에르비툭스 및 벡티빅스와의 인큐베이션은 최초 표면 염색의 70%를 남긴 약 30%의 수용체의 내재화의 동등한 수준을 나타내었다. 992 단독과의 인큐베이션은 약 45%의 수용체 하향조절을 야기시켰다. 비-중첩 에피토프를 갖는 2개의 추가 항체를 함유하는 항체 혼합물과의 인큐베이션은 수용체 하향조절에서 증가를 야기시켰다: 992 + 1024, 74%; 992 + 1024 + 1030, 83%.
추가 항체의 첨가는 수용체 내재화를 추가로 증가시키지 않았다. 따라서, 3개 이상의 항체가 A431 세포에서의 내재화의 최대 수준을 달성하는데 요구되는 것으로 보인다.
실시예 6 - 증식 검정
세포 손상은 부득이하게 대사성 세포 기능 및 성장을 위한 에너지를 유지하고 제공하는 세포의 능력을 상실시킨다. 대사성 활성 검정은 이러한 전제를 기초로 한다. 보통, 이는 미토콘드리아 활성을 측정한다. 세포 증식 시약 WST-1(Roche Cat. No. 11 644 807 001)은 살아있는 세포의 대사 활성을 측정하는 미리 제조된(ready-to-use) 기질이다. 이후, 대사 활성은 살아있는 세포의 수와 관련되는 것으로 추정된다. 이러한 실시예에서, 다양한 농도의 다양한 항체를 이용한 처리 후에 대사적으로 활성인 세포의 수를 측정하는데 WST-1 검정을 이용하였다.
WST-1 검정을 수행하기 전, 적절한 항체 및 항체 혼합물을 0.5%의 FBS 및 1% P/S로 보충된 DMEM 중에 20 μg/ml의 최종 전체 항체 농도로 희석시켜, 가장 높은 항체 농도를 갖는 웰에서 10 μg/ml의 최종 항체 농도를 발생시켰다. 이후, 150 μl의 이러한 용액을 96-웰 플레이트의 컬럼 2의 웰에 첨가하고, 컬럼 9까지 3배 연속 희석 용액을 제조하여 각각의 웰이 100 μl의 항체 용액을 함유하도록 하였다. 100 μl의 배지를 컬럼 11에 첨가하였다. 실험 웰에서의 배지 증발의 효과를 감소시키기 위해 200 μl의 배지를 1 및 8열 뿐만 아니라 컬럼 1 및 12에 첨가하였다.
이후, A431-NS 세포를 1xPBS로 세척하고, 3 ml 트립신 용액을 이용한 트립신화에 의해 박리(detached)시켰다. 이후, 17 ml의 완전 배지를 첨가하고, 세포를 5분 동안 300xg(1200 rcf)에서 스핀 다운시켰다. 상층액을 제거하고, 세포를 DMEM + 0.5% FBS에 재현탁시켰다. 세포를 계수하고, 농도를 15,000 세포/ml로 조정하였다. 이후, 100 μl의 세포 현탁액(1500 세포/웰)을 컬럼 2-11의 실험 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 가습화 인큐베이터에서 4일 동안 인큐베이션하였다. 이후, 20 μl의 WST-1 시약을 적절한 웰에 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이후, 플레이트를 오비탈 플레이트(orbital plate) 진탕기로 옮기고, 1시간 동안 두었다. ELISA 판독기에서 450 및 620 nm(기준 파장)에서 흡광도를 측정하였다. 대사적으로 활성인 세포(MAC)의 양을 하기와 같이 미처리 대조군의 퍼센트로 계산하였다:
Figure 112009060319675-pct00008
EGF 적정 연구를 위해, 리간드를 DMEM+0.5% FBS 중에 20 nM/ml의 농도로 희석시켜, 가장 높은 EGF 농도를 갖는 웰에서 10 nM/ml의 최종 농도를 발생시켰다. 이후, 150 μl의 이러한 용액을 96-웰 플레이트의 컬럼 2의 웰에 첨가하고, 컬럼 9까지 3배 연속 희석 용액을 제조하여 각각의 웰이 100 μl의 EGF 용액을 함유하도록 하였다. 100 μl의 배지를 컬럼 11에 첨가하였다. 실험 웰에서의 배지 증발의 효과를 감소시키기 위해 200 μl의 배지를 1 및 8열 뿐만 아니라 컬럼 1 및 12에 첨가하였다. 적절한 항체 및 항체 혼합물을 0.5%의 FBS 및 1% P/S로 보충된 DMEM 중에 40 μg/ml의 최종 전체 항체 농도로 희석시켜, 웰에서 10 μg/ml의 최종 항체 농도를 발생시켰다. 이후, 50 μl의 이러한 용액을 96-웰 플레이트의 컬럼 2-9의 웰에 첨가하였다.
이후, A431-NS 세포를 1xPBS로 세척하고, 3 ml 트립신 용액을 이용한 트립신화에 의해 박리시켰다. 이후, 17 ml의 완전 배지를 첨가하고, 세포를 5분 동안 300xg(1200 rcf)에서 스핀 다운시켰다. 상층액을 제거하고, 세포를 DMEM + 0.5% FBS에 재현탁시켰다. 세포를 계수하고, 농도를 40,000 세포/ml로 조정하였다. 이후, 50 μl의 세포 현탁액(2000 세포/웰)을 컬럼 2-11의 실험 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 가습화 인큐베이터에서 4일 동안 인큐베이션하였다. 이후, 20 μl의 WST-1 시약을 적절한 웰에 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이후, 플레이트를 오비탈 플레이트(orbital plate) 진탕기로 옮 기고, 1시간 동안 두었다. ELISA 판독기에서 450 및 620 nm(기준 파장)에서 흡광도를 측정하였다. 대사적으로 활성인 세포의 양을 450 nm에서의 흡광도에서 620 nm의 참조 파장에서의 흡광도를 공제하여 나타내었다.
대사적으로 활성인 세포(MAC)의 양을 다음과 같이 미처리 대조군의 퍼센트로 계산한다:
Figure 112009060319675-pct00009
결과
도메인 Ⅲ 내에 비-중첩 에피토프를 갖는 3개의 항-EGFR 항체의 혼합물이 항체 단독에 비해 우수한 것을 나타내기 위해, A431-NS 성장의 억제를 연구하는 실험을 수행하였다. 도 16A에서 관찰될 수 있는 바와 같이, 항체 자체는 A431-NS 성장의 불량한 억제제이나, 조합되는 경우, 431-NS 성장에 대한 상승작용적 억제 효과가 수득된다. 1042 또는 1030을 갖는 992의 혼합물이 또한 매우 효능이 있으나, 모든 3개의 혼합물은 모든 항체 농도 범위에 걸쳐 상기에 비해 우수하다.
다양한 농도의 EGF로 자극된 A431-NS 세포의 성장에 대한 개별적 항체 및 항체 혼합물의 효과를 연구하였고, 결과는 도 17에 도시되어 있다. 도 17에서 관찰될 수 있는 바와 같이, 항체의 부재하에서 0.1 nM을 초과하는 EGF 농도가 세포에 대해 독성이다. 그러나, EGFR의 도메인 Ⅲ 내에 비-중첩 에피토프를 갖는 3개의 항체(992, 1030 및 1042)의 혼합물은 적어도 0.3 nM EGF까지 시험되는 경우 EGF의 존재하에서 A431-NS 세포의 성장을 상승작용적으로 억제하는 작용을 하고, 상기 혼 합물은 모든 모노클로날 항체에 비해 우수하다.
다음으로, 본 발명자들은 A431-NS 성장에 대한 상승작용적 억제 효과가 또한 EGFR의 도메인 Ⅲ 내의 비-중첩 에피토프를 갖는 2개의 항체를 EGFR의 도메인 Ⅰ 또는 Ⅱ 내의 에피토프를 갖는 항체와 조합시킴으로써 수득될 수 있다. 도 18에서 관찰될 수 있는 바와 같이, EGFR의 도메인 Ⅰ(1284) 또는 도메인 Ⅰ/Ⅱ(1434)과 반응성인 항체와 함께, EGFR의 도메인 Ⅲ인 항체 992 및 1024의 조합물이 EGFR의 도메인 Ⅲ 내의 비-중첩 에피토프와 반응하는 3개의 항체(992+1024+1030)만큼 효능이 있다. 또한, 이러한 항체 혼합물은 치료적 항 EGFR 항체 에르비툭스 및 벡티빅스 보다 A431-NS의 성장 억제에 더욱 효능이 있다.
2개의 다른 암 세포주 DU145(ATCC#HTB-81) 및 MDA-MB-468(ATCC#HTB-132)을 이용하여 유사한 검정을 수행하였다. 이러한 증식 검정으로부터의 결과는 도 16B 및 16C에 제시되어 있다. 둘 모두의 경우, 3개의 항체(992, 1030 및 1042)의 혼합물은 2개 항체의 혼합물 및 단일 항체에 비해 우수하였다. DU145 세포에서, 3개 항체의 혼합물은 모든 농도의 벡티빅스에 비해 우수하고, 높은 농도의 MDA-MB-468에서 우수하였다.
상기 기재된 것과 유사한 방법을 이용하여, 본 발명자들은 3개 항-EGFR 항체의 다양한 조합을 시험하였다.
결과
3개 항체의 다양한 조합물의 효과를 A431NS 세포주에서 연구하였다. 이의 가장 효능있는 20개의 성장 억제 활성이 도 37에 제시되어 있다. 모든 조합물은 비-처리 대조군에 비해 60% 이상 A431NS 세포주의 증식을 억제하였다. 또 다른 흥미로운 관찰은 조합물(992+1024+1254 및 992+1024+1320 및 992+1277+1320)은 제외된다는 점이며, 이러한 조합물은 비-중첩 에피토프를 갖는 항체를 함유한다. 이는 별개의 에피토프에 결합하는 3개 항체의 여러 조합물을 고안할 수 있는 것을 나타낸다.
실시예 7 - 아폽토시스.
아폽토시스는 세포를 사멸시키는 생물학적 메커니즘이다. 이러한 메커니즘은 항-EGFR 항체, 예를 들어, 에르비툭스의 사용에 의해 기존에 보고되었다(Baselga J. The EGFR as a target for anticancer therapy - focus on cetuximab. Eur J Cancer. 2001 Sep:37, Suppl 4:S16-22). 따라서, 개별적 항-EGFR 항체 992, 1042 및 1030 뿐만 아니라 혼합물(992+1042+1030)이 어느 정도까지 아폽토시스를 유도할 수 있는지 연구하였다.
1 x104개의 A431NS 세포를 0.01 μg/ml 내지 10 μg/ml 농도의 EGFR 혼합물(992, 1030, 1042의 동등한 부분), 992, 1030, 1042, 에르비툭스 또는 벡티빅스의 존재하에서 96 웰 배양 플레이트 중에서 삼중 결정으로 0.5%의 FBS 및 항생제가 보충된 DMEM에서 인큐베이션하였다. 세포 및 항체를 22시간 동안 인큐베이션하였다. 이후, 상층액을 수거하고, 히스톤-DNA 복합체의 존재하에서 Roche, Cat No:11774425001(Basel, Switzerland)의 ELISA-키트에서 측정하였다.
혼합물의 효과를 A431NS 세포를 이용하여 각각의 모노클로날 항체 단독 뿐만 아니라 참조 항체 벡티빅스 및 에르비툭스와 비교하였다(도 19의 결과). 항체를 10배 희석으로 시험하였다. 혼합물은 1 μg/ml 및 10 μg/ml의 농도로 시험하는 경우 개별적 모노클로날 항체 뿐만 아니라 벡티빅스에 비해 현저하게(P<0.05) 더욱 효과적이었다. 혼합물은 1 μg/ml에서 에르비툭스에 비해 통계적으로 유의(p<0.05)하게 아폽토시스를 증가시켰다.
실시예 7b
실시예 7에 더하여, 992+1024의 혼합물 뿐만 아니라 992+1024+1030의 혼합물을 실시예 7에 기재된 것과 동일한 방법에 따라 아폽토시스 활성에 대해 연구하였다(도 35). 아폽토시스의 사실적 수준은 최대 양성 대조군과 관련되었다. 둘 모두의 2개 혼합물을 A431NS 세포를 이용하여 1 μg/ml로 에르비툭스 및 개별적 모노클로날 항체 992, 1024 및 1030 뿐만 아니라 대조군 항체와 비교하였다. 992+1024의 혼합물은 에르비툭스 및 개별적 모노클로날 항체보다 현저하게 나았다(모두 P<O.05).
실시예 8 : 생체내 효능
항체 992, 1030 및 1042로 구성되는 항-EGFR-혼합물을 A431NS 세포를 이용하여 누드 마우스 이종이식 모델에서 생체내 효능에 대해 연구하였다. 이는 항-EGFR 항체를 포함하여 모노클로날 항-암 항체의 효능을 연구하는데 널리 사용되는 모델이다. 누드 마우스는 면역약화되어 있으며, T-세포가 결핍되어 있다. 이는 마우스에서 인간 세포의 성장을 가능케 한다.
2개 그룹의 6-8주령 누드 마우스에 1x106개의 A431NS 세포를 피하 주사하였다. 평균 종양 크기가 100 mm3에 도달하는 경우, 처리를 개시하였다. 마우스에 2-3일 간격으로 5회로 1 mg의 항체를 복막내 주사하였다. 종양 크기를 디지털 캘리퍼스를 이용하여 2개 직경으로 측정하고, 부피를 식: 종양 부피(mm3) = L x W2 x 0.5(여기서, L은 가장 긴 직경이고, W는 가장 짧은 직경임)(Teicher BA, Tumor Models in Cancer Research. Humana Press, NJ, USA 2002, p596)을 이용하여 계산하였다. 실험 말단에, 종양을 절제하고 칭량하였다.
시나기스(Synagis)를 대조 항체로 사용하였다. 실험에 또한 항-EGFR-혼합물(항체 992, 1030 및 1024)에 대한 것과 동일한 스케줄을 이용하여 동일량의 에르비툭스 및 벡티빅스를 이용한 처리를 포함시켰다.
도 20에서 관찰될 수 있는 바와 같이, 992, 1030 및 1042의 혼합물은 A431NS의 종양 성장을 현저하게 억제하였다(P<0.05). 평균 중량은 도 21에 도시되어 있다. 결과는 측정된 종양 크기와 관련된다. 처리군과 대조군 사이에 현저한 차이가 있었다.
실시예 8b : 생체내 효능
실시예 8의 생체내 실험에 기재된 것에 더하여, 상기 기재된 A431NS 이종이식 모델에서 992+1024 및 992+1024+1030의 혼합물을 연구하였다(도 36). 각각 9마리의 6-8주령의 누드 마우스의 4개 그룹에 1x106개의 A431NS 세포를 피하 주사하였 다. 평균 종양 크기가 100 mm3에 도달한 경우, 마우스에 첫번째 항체를 주사하였다. 3개 그룹에 992+1024의 혼합물, 992+1024+1030의 혼합물, 에르비툭스 또는 대조군 항체 시나기스를 투여하였다. 모두에서, 마우스에 1주일에 4회로 0.5 mg을 17회 주사하였다. 첫번째 주사를 8일에 제공하고, 마지막 주사를 34일에 제공하였다. 종양 크기를 56일에 측정하였다. 항체 처리 종료 후, 에르비툭스를 투여한 마우스의 종양은 크기가 증가하기 시작한 반면, 992+1024 또는 992+1024+1030의 혼합물을 투여한 2개 그룹의 마우스에 대해서는 종양 크기가 지속적으로 감소하였다. 91일(처리 종료 57일 후)에서 992+1024 그룹에 대해서는 종양 크기의 팽창이 관찰되지 않았다. 992+1024의 조합물에 대한 평균 종양 크기는 에르비툭스를 투여한 마우스에 대한 평균 종양 크기보다 56일에서 현저하게 적었다(P<0.01).
실험에서의 마우스의 생존을 또한 모니터하였다. 마우스를 종양이 최대 허용 크기에 도달하는 경우 사망으로 스코어링(scoring)하였다. 하기 표는 종양 세포의 접종 56일 후에 생존한 마우스의 수를 나타낸다. 에르비툭스에 비해 둘 모두의 조합물에 대해 개선된 생존이 관찰된다.
Figure 112009060319675-pct00010
추가 실험
실시예 8에 기재된 이종이식 실험으로부터의 종양 용해질에 대한 예비 데이 터는 992+1042+1030의 조합물이 A431NS에 의한 VEGF의 생성의 효능있는 하향 조절을 유도하는 것을 나타내며, 상기 VEGF는 혈관신생의 중요한 매개체이다. 혈관의 증가된 형성은 다수의 고형 종양에서 관찰되는 현상이고, 영양소 등의 지속된 공급에 관여함으로써 생존 조건에 영향을 미치는 메커니즘이다.
또한, 다른 예비 데이터는 992+1042+1030의 항체 조합물의 증가된 수준이 에르비툭스 및 벡티빅스와 비교하는 경우 실시예 8에 기재된 이종이식 실험으로부터의 종양 용해질에서 관찰될 수 있는 것을 나타낸다.
실시예 8c : 향상된 생체내 종양 세포 분화
세포의 최종 분화는 세포 유형 특이적 유전자 발현 프로그램을 활성화시켜, 증식 능력의 비가역적 상실로의 다단계 과정을 발생시키는 복잡한 과정이다. 악성 질병에서, 암세포는 종종 증가된 증식 속도를 특징으로 하는 역분화 상태로 존재하며, 이는 암세포의 최종 분화를 유도할 수 있는 약물이 악성 세포를 제거하고, 정상 세포 항상성 회복시킬 수 있는 것을 암시하였다(Pierce GB, Speers WC: Tumors as caricatures of the process of tissue renewal: prospects for therapy by directing differentiation. Cancer Res 48:1996-2004, 1988). 특정 실험 조건하에서, 항-EGFR 모노클로날 항체는 면역약화된 마우스에서의 이종이식 종양으로 성장된 인간 편평 암세포의 최종 분화 속도를 증가시킬 수 있는 것으로 기존에 보고되었다(Milas L, Mason K, Hunter N, Petersen S, Yamakawa M, Ang K, Mendelsohn J, Fan Z: In vivo enhancement of tumor radioresponse by C225 antiepidermal growth factor receptor antibody. Clin Cancer Res 6:701-8, 2000; Modjtahedi H, Eccles S, Sandle J, Box G, Titley J, Dean C: Differentiation or immune destruction: two pathways for therapy of squamous cell carcinomas with antibodies to the epidermal growth factor receptor. Cancer Res 54:1695-701, 1994).
본 발명자들은 마우스에서의 이종이식으로 성장된 항-EGFR 처리된 A431NS 세포에서의 최종 분화의 정도를 조직학적으로 시험하였다. 조직학 연구는 실시예 8에 기재된 실험으로부터의 4개의 실험 그룹 각각으로부터의 3개의 무작위적으로 선택된 마우스 이종이식 종양을 포함하였다.
조직을 절제하고, 급속 동결 후, 동결조직절편기(cryomicrotome)(Leitz, model 1720) 상에서 티슈-테크(Tissue-Tek)를 이용하여 마운팅(mounting)시키고, 5 μm 섹션으로 절제하고, 수퍼프로스트 플러스(superfrost plus) 슬라이트 상에 견본을 만든 후, 헤마톡실린/에오신 염색을 위해 처리하였다. 이후, 2명의 독립적 관찰자가 맹검 방식으로 모든 조직 섹션의 현미경 검사를 수행하고, 최종 분화 정도의 척도로서 각질화 영역("각질 진주(keratin pearls)")을 스코어링하였다(Modjtahedi et al., 1994). 표 7에는 수득된 결과가 나열되어 있다. 3개의 항-EGFR 항체의 혼합물(992+1024+1030, 그룹 1)로 처리된 마우스는 참조 항체 에르비툭스 및 벡티빅스(각각 그룹 2 및 3)로 처리된 마우스에 비해 최종 분화된 암세포의 현저하게 넓고 보다 많은 집중점(foci)을 가졌다. 항체 대신 PBS를 투여한 대조군(그룹 4)에서 최종 분화가 검출되지 않았다.
디지털 카메라가 장착된 현미경을 이용하여 대표적 현미경 이미지를 획득하 였다(도 26 참조).
결론적으로, 도메인 Ⅲ 내에 비-중첩 에피토프를 갖는 3개의 항-EGFR 항체(클론 992, 1030 및 1042)의 조합물은 에르비툭스 및 벡티빅스 모노클로날 항체에 비해 생체내에서 종양 세포에 대해 예기치 않은 향상된 분화 유도 효과를 나타내었다. 최종 분화에 대해 관찰된 효과로 본 발명의 항체 조성물이 다른 분화 유도제, 예를 들어, 레티노산, 4-페닐 부티레이트와의 조합 요법으로 사용될 수 있는 것으로 결론내렸다.
표 7
Figure 112009060319675-pct00011
실시예 8d : 본 발명의 항체 조성물의 지속된 성장 억제 효과
992+1024 항체 혼합물의 생체내 효능을 연구하기 위해 실시예 8 및 8b에 제시된 종양 이종이식 실험의 반복을 수행하였다. 간단히, BALB/c nu/nu 마우스에 106개의 A431NS 세포를 옆구리에 피하 주사하였다. 종양 이종이식편을 100 mm3의 평균 종양 크기로 성장(7일)하도록 두고, 이 시점에 마우스를 9마리의 5개 그룹으 로 무작위화시키고, 항체 처리를 개시하였다. 5개 그룹에 높거나(2 mg/주) 낮은(1 mg/주) 용량의 992+1024 혼합물 또는 참조 항체 에르비툭스, 또는 높은 용량(2 mg/주)의 대조 항체 시나기스를 투여하였다. 모든 마우스에 7일에서 시작하여 33일에 종료하도록 0.5 또는 1 mg의 항체를 매주 2회로 전체 9회 투여하였다.
고용량(2 mg/주)의 992+1024 혼합물은 에르비툭스에 비해 최초 종양 성장을 조절하고, 장기간의 종양 퇴행을 유도하는데 매우 효과적이었다(P = 0.0002, 도 38). 2 mg/주의 992+1024 혼합물을 투여한 동물은 모두 연구 기간(실험 시작 후 118일, 도 38 및 39)에 사망하지 않았고, 60일에 9마리의 동물 중 1마리만 남은 고용량의 에르비툭스 2 mg/주 그룹에 비해 현저하게 나은 결과를 발생시켰다(P = 0.0008, 도 39). 이는 장기간의 생존에 대한 992+1024 처리의 지속 효과를 나타낸다. 고용량에 비해 덜 효과적이나, 저용량 992+1024 혼합물(1 mg/주) 또한 종양 성장을 조절할 수 있었고, 종양 퇴행(P = 0.0135, 도 38) 및 생존(P = 0.0087, 도 39) 둘 모두를 관찰시 고용량 2 mg/주 에르비툭스에 비해 현저하게 나았다. 이러한 결과는 저용량의 에르비툭스에 비해 992+1024 조합물의 우수한 효능을 나타낸다. 결과는 또한 승인된 모노클로날 항체에 비해 992+1024 조합물에 의해 발생된 지속된 성장 억제를 입증한다.
실시예 9 : 구상체 성장
구상체 연구를 위해, 둥근 바닥 96-웰 플레이트에 35 μl의 120 mg/ml Poly-HEMA 용액을 첨가하고, 플로우-후드(flow-hood)에서 밤새 증발되도록 두었다. Poly-HEMA는 세포 부착을 방지한다. A431-NS 세포를 상기와 같이 처리하고, 계수 하고, 농도를 100,000 세포/ml로 조정하였다. 이후, 50 μl의 세포 현탁액(5,000 세포/웰)을 50 μl의 5% 마트리겔 용액과 함께 컬럼 2-11의 실험 웰에 첨가하였다. 실험 웰에서의 배지 증발의 효과를 감소시키기 위해 200 μl의 배지를 1 및 8열 뿐만 아니라 컬럼 1 및 12에 첨가하였다. 플레이트를 5분 동안 300xg에서 원심분리시키고, 37℃에서 가습화 인큐베이터에서 밤새 형성되도록 두었다. 다음날, 적절한 항체 및 항체 혼합물을 빈 96-웰 플레이트에서 20 μg/ml의 최종 전체 항체 농도로 희석시켰다. 이는 0.5%의 FBS 및 1% P/S로 보충된 DMEM에서 수행하여, 가장 높은 항체 농도를 갖는 웰에서 10 μg/ml의 최종 항체 농도를 발생시켰다. 이후, 150 μl의 이러한 용액을 96-웰 플레이트의 컬럼 2의 웰에 첨가하고, 컬럼 9까지 3배 연속 희석 용액을 제조하여 각각의 웰이 100 μl의 항체 용액을 함유하도록 하였다. 100 μl의 배지를 컬럼 11에 첨가하였다. 이후, 100 μl의 이러한 용액을 구상체를 함유하는 플레이트에 옮기고, 7일 동안 인큐베이션하였다. 이후, 20 μl의 WST-1 시약을 적절한 웰에 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이후, 플레이트를 오비탈 플레이트 진탕기로 옮기고, 1시간 동안 두었다. ELISA 판독기에서 450 및 620 nm(기준 파장)에서 흡광도를 측정하였다. 대사적으로 활성인 세포(MAC)의 양을 하기와 같이 미처리 대조군의 퍼센트로 계산하였다:
Figure 112009060319675-pct00012
도메인 Ⅲ 내에 비-중첩 에피토프를 갖는 3개 항체의 혼합물(992+1030+1042) 은 A431-NS 구상체의 성장을 효과적으로 억제하고, 이는 모노클로날 치료 항 EGFR 항체 에르비툭스 및 벡티빅스보다 더욱 효능이 있다(도 22).
실시예 10 : 시노몰구스 EGFR ECD에 대한 결합
시노몰구스 EGFR 세포외 도메인의 클로닝.
신호 펩티드를 제외하는 시노몰구스 EGFR의 세포외 도메인을 네스티드 PCR 및 전장 인간 EGFR의 공개된 서열(GENBANK X00588, Ullrich A et. al. Nature 309(5967),418-425 (1984))로부터 유래된 서열 특이적 프라이머를 이용함으로써 표피로부터 분리된 시노몰구스 cDNA로부터 클로닝시켰다.
PCR 시약:
정상 피부 표피로부터 분리된 시노몰구스 원숭이 cDNA:
CytoMol Unimed, Cat. No: ccy34218, Lot No: A711054.
퓨전(Phusion) 반응 완충용액(5X): Finnzymes, Cat. no: F-518, Lot. No: 11.
퓨전(Phusion) 효소: Finnzymes, F-530S (2 U/μL).
dNTP 25 mM: Bioline, Cat. No: BIO-39029, Lot. No: DM-103F.
부분 신호 서열 및 막횡단 도메인을 포함하는 시노몰구스 EGFR ECD의 증폭을 위한 프라이머:
5' ATG 프라이머: 5'-TCTTCGGGAAGCAGCTATGC-3'(서열 목록 번호:135)
3' Tm 2 프라이머: 5'-TTCTCCACTGGGCGTAAGAG-3'(서열 목록 번호:136)
XbaⅠ, MluⅠ 제한 부위 및 막횡단 도메인 앞의 정지 코돈이 통합된, 시노몰 구스 EGFR ECD Bp 1-1863을 증폭시키는 네스티드 PCR을 위한 프라이머:
5' EGFR XbaⅠ: 5'-ATCTGCATTCTAGACTGGAGGAAAAGAAAGTTTGCCAAGGC-3'(서열 목록 번호:137)
3' EGFR MluⅠ: 5'-TACTCGATGACGCGTTTAGGATGGGATCTTAGGCCCGTTCC-S'(서열 목록 번호:138)
PCR 조건:
30 주기: 98℃/30초 용융, 55℃/30초 어닐링(annealing), 72℃/60초 신장. 30주기 후, PCR 생성물을 추가 5분 동안 신장되도록 하였다.
PCR 반응을 0.2 mM dNTP, 0.5 μM 프라이머를 함유하는 50 μL 반응 완충용액의 전체 부피 중의 1 μl 주형 및 2 유닛의 퓨전(Phusion) 효소를 이용하여 수행하였다.
약 1800-1900 Bp의 명백한 길이를 갖는 최종 PCR 밴드를 수득하고, 발현 벡터에 클로닝하였다. 시노몰구스 EGFR의 클로닝된 세포외 도메인의 DNA 및 단백질 서열은 도 23에 도시되어 있고, 인간 EGFR ECD에 대해 정렬된 시노몰구스 EGFR ECD의 단백질 서열은 도 24에 도시되어 있다. 인간 EGFR ECD 및 시노몰구스 EGFR ECD DNA 서열의 정렬은 97.6%의 서열 동일성을 나타낸 반면, 상응하는 단백질 서열의 정렬은 98.6%의 서열 동일성을 나타내었다.
ELISA에서의 인간 및 시노몰구스 EGFR의 세포외 도메인 사이의 항체 교차 반응성의 입증.
시험된 항-EGFR 항체가 인간 및 시노몰구스 EGFR ECD 둘 모두에 대해 동등하 게 잘 결합하는 것을 확인하고, 따라서 시노몰구스 원숭이에서의 독성학 연구를 보장하기 위해, 1 μg/ml로부터 시작하는 항체의 연속 4배 희석액을 재조합 인간 및 시노몰구스 EGFR ECD 단백질로의 결합에 대해 ELISA에 의해 시험하였다. 이러한 검정에서 동일한 결합 프로파일을 나타내는 항체를 우수한 종 EGFR 교차 반응성의 표시로 취하였다. ELISA 웰을 4℃에서 밤새 PBS 중에서 1 μg/ml의 농도로 50 μl/웰의 전장 EGFR로 코팅하였다. 다음날 아침, 웰을 PBS-T로 2회 세척하고, 실온에서 100 μl의 PBS-T-1% BSA로 1시간 동안 차단시킨 후, PBS-T로 2회 세척하였다. 다음으로, 50 μl의 연속 희석된 항-EGFR 항체 및 대조 항체를 웰에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 항체 인큐베이션 후, 웰을 PBS-T로 5회 세척한 후, 차단 완충용액 중에 1:3000 희석된 50 μl/웰의 스트렙타비딘-HRP 이차 시약과 함께 인큐베이션시키고, 30분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 최종적으로, 웰을 PBS-T로 5회 세척하고, 50 μL/웰 TMB 기질을 첨가함으로써 플레이트를 발달시키고, 실온에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 1M H2SO4를 첨가하여 반응을 중지시키고, 100 μl/웰 및 플레이트를 OD 450nm에서 판독하였다.
ELISA 시약:
1. ELISA 플레이트; NUNC Maxisorp; cat: 442404
2. 항원: 인간 rEGFR ECD; 시노몰구스 rEGFR ECD
3. 코팅 완충용액: 1 x PBS; Gibco cat:20012-019
4. 세척 완충용액: 1xPBS/0.05% Tween 20(PBS-T)
5. 차단/희석 완충용액: PBS-T 중의 1% BSA
6. 염소-항-인간 IgG HRP 컨쥬게이트: Serotec, Star 106P
7. TMB 플러스(Plus)(KemEnTec cat # 4390L)
8. (1M H2SO4)
도 25에 도시된 바와 같이, 기재된 ELISA 검정은 교차 반응성 인간 및 시노몰구스 항-EGFR ECD 항체(도 25A)와 마우스 면역화에 사용된 인간 EGFR ECD 만을 인지하는 종 특이적 항체(도 25B) 사이를 구별할 수 있다.
실시예 11 : 운동성의 억제
대부분의 암 사멸은 먼 위치에서 종양 세포의 전이 및 이후의 성장으로부터 유래된다. 인접한 정상 조직의 국소 침범은 항상성 기능을 손상시키고, 종양의 외과적 또는 방사선학적 절제를 방해한다. 최근의 연구는 이러한 확산을 촉진하는 역할을 하는 운동성을 유도하는 중추적 역할을 강조하였다. EGFR은 세포 운동성을 촉진하고, 따라서 EGFR 표적화 약물의 중요한 메커니즘인 EGFR 매개 운동성의 억제를 촉진하는 것으로 공지되어 있다.
두경부 암종 세포주의 운동성에 대한 항체 992 및 1024의 혼합물의 효과를 연구하였다. 10,000개의 세포로 구성되는 구상체를 실시예 9에 기재된 바와 같이 밤새 제조하였다. 이후, 구상체를 NUNC T25 세포 배양 플라스크로 옮기고, 밤새 부착시켰다. 이후, 10 μg/ml의 항체 혼합물 992+1024 또는 음성 대조군 항체를 첨가하고, 구상체를 24시간 동안 인큐베이션하였다. 4Ox 배율로 이미지를 수득하 고, 세포에 의해 포함되는 영역을 소프트웨어 이미지 제이(Image J)를 이용하여 측정하였다.
결과: 도 27A에서 관찰될 수 있는 바와 같이, EGFR 특이적 항체 992 및 1024의 첨가는 종양 세포에 의해 포함되는 영역을 현저하게 감소시켰다. 운동성은 도 27B에 정량되어 있으며, 이는 음성 대조군 항체에 비해 약 60% 감소되는 것을 나타낸다. 이러한 운동성의 감소는 매우 현저하다(p<0.01).
따라서, 항체 992 및 1024의 조합물은 EGFR 매개 종양 세포 운동성을 유력하게 억제하고, 이는 항 EGFR 항체의 조합물이 전이된 질병의 치료에 사용될 수 있는 것을 나타낸다.
실시예 12. Sym004 항체 조성물에 의한 인볼루크린의 상향조절
인볼루크린은 각질세포막의 형성에 수반되는 초기 편평 세포 분화의 마커 및 단백질이다. 따라서, 인볼루크린 수준은 분화된 종양 세포의 수의 척도로 사용될 수 있다. 인볼루크린의 수준을 시판되는 인볼루크린 ELISA 키트(Biomedical Technologies)를 이용하여 에르비툭스, 벡티빅스 또는 항체 992+1030+1042의 혼합물로 처리되거나 미처리된 A431NS 이종이식 종양으로부터의 단백질 용해질에서 측정하였다. 키아젠(Qiagen)사의 티슈라이저(TissueLyzer)를 이용하여 1 ml의 RIPA 완충용액 중에 30-40 mg의 종양 조직을 균질화시킴으로써 종양 용해질을 제조하였다. 각각의 투명한 용해질 내의 단백질 농도를 피어스(Pierce)사로부터의 BCA 단백질 검정 키트를 이용하여 결정하고, 인볼루크린 수준을 각각의 샘플로부터의 0.4 μg의 단백질 중에서 ELISA 검정을 이용하여 평가하였다.
결과: 도 27에서 관찰될 수 있는 바와 같이, 음성 대조군 및 에르비툭스 또는 벡티빅스 처리 그룹에 비해 992+1030+1042 처리 그룹에서 현저하게 높은 수준으로 인볼루크린이 발견된다. 따라서, 항체 992, 1030 및 1042의 조합물은 A431NS 이종이식 종양에서 인볼루크린의 수준을 증가시키고, 따라서 아마 보다 높은 정도의 A431NS 분화를 유도할 것이다. 각질 진주의 높은 수와 확실히 관련된 결과가 특정 처리 그룹에서 발견되었다(실시예 8 참조).
실시예 13 : Sym004 항체 조성물에 의한 EGFR의 내재화
몇몇 항체는 표면 표적의 내재화를 유도함으로써 작용한다. EGFR은 EGF와 같은 리간드에 의해 활성화되는 경우 내재화를 경험하는 것으로 공지되어 있다.
EGFR 내재화를 유도하는 2개 항체 992 및 1024의 혼합물의 능력을 공초첨 현미경(confocal microscopy)을 이용하여 연구하였다. A431NS 및 HN5 세포를 랩텍(LabTek)으로부터의 8-웰 챔버 슬라이드에 시딩하고, 0.5% FBS를 함유하는 DMEM에서 밤새 인큐베이션하였다. 이후, 세포에 10 μg/ml의 알렉사(Alexa)-488 표지된 992+1024의 항체 혼합물 또는 대조군 항체 에르비툭스를 첨가한 후, 다양한 기간 동안 인큐베이션하였다. 이후, 큰 핀-홀(pin-hole) 또는 작은 핀-홀을 갖는 바이오래드(Biorad) 공초점 현미경을 이용하여 6Ox 배율로 이미지를 획득하였다.
결과: 도 29A에 도시된 바와 같이, 2시간 동안의 알렉사-488 표지된 EGFR 특이적 항체 992 및 1024의 첨가는 A431NS 및 HN5 세포주 둘 모두에서 세포내 소포 내에 항체의 축적을 야기시킨다. 대조적으로, 에르비툭스는 세포 표면에서 주로 발견된다. 도 29B는 보다 작은 핀-홀을 이용하여 A431NS 세포의 이미지를 나타내 고, 이는 세포의 보다 얇은 섹션의 이미지를 발생시킨다. 항체 992+1024가 세포 내에 위치되어 있는 반면 에르비툭스는 주로 세포 표면에서 발견되는 것이 상기 이미지로부터 명백하다. 도 30은 992+1024 매개 내재화의 기간을 나타내고, 이들은 항체 첨가 후 30분 만큼 초기에 세포내 소포에서 발견될 수 있다. 4시간 후, 항체 992+1024의 거의 대부분은 낮거나 매우 약한 표면 염색을 이용하여 세포 내에서 발견된다. 대조적으로, 에르비툭스는 세포 표면에 유지된다. 992+1024에 의해 유도된 내재화가 세포에서 EGFR의 지속된 분해 및 제거를 발생시키는 것을 나타내는 증거가 또한 수득되었다.
따라서, 항체 992 및 1024의 조합물은 EGFR 내재화를 신속하고 효능 있게 유도하는 반면, 에르비툭스는 그렇지 않다.
실시예 14 : 표면 플라즈몬 공명을 이용한 항체 친화성의 측정.
재조합 가용성 EGFR ECD에 대한 Sym004 IgG 항체의 1가 친화성의 측정.
본 발명의 전장 IgG 항체의 동역학 검정을 가용성 항원에 대한 전체 IgG 분자의 1가 친화성의 측정을 가능케 하는 문헌[Canziani, Klakamp, et al. 2004, Anal. Biochem, 325:301-307]에 기재된 바와 같은 검정을 이용하여 BIAcore 2000 상에서 수행하였다. 간단히, 약 10,000 Ru의 폴리클로날 항-인간 IgG Fc 항체를 제조업체의 설명서에 따라 CM5 칩 표면에 컨쥬게이션시킨 후, 항-Fc 칩 표면 상에 25 μg의 본 발명의 개별적 항-EGFR 항체 또는 시나기스 음성 대조군을 포획시켰다. 포획된 IgG의 밀도를 각각의 클론에 대해 최적화시켰고, 본 검정에서 사용된 가장 높은 항원 농도의 결합은 25 Ru를 초과하지 않았다. 다음으로, 겔 배제 크로 마토그래피에 의해 1가 단백질만 함유하는 것으로 이전에 밝혀진 250 μL의 가용성 인간 EGFR ECD를 HBS-EP 완충용액 중의 연속 2배 희석액 중에 25 μL/분의 유속으로 주입하여 반응 곡선을 발생시켰다. 칩 표면을 100 mM의 H3PO4의 10초 주입을 이용하여 포획된 항체/항원 복합체를 스트립핑(stripping)시킴으로써 주기 사이에서 재생시켰다. 먼저 음성 대조군 항체 시나기스를 함유하는 플로우 셀의 반응을 공제한 후, HBS-EP 완충용액만을 주입하여 생성된 반응을 공제함으로써 동역학 검정을 수행하였다("이중 참조(double referencing)"). 결합 속도 상수(ka) 및 해리 상수(kd)를 제조업체에 의해 제공된 BIA 평가 소프트웨어 4.1을 이용하여 발생된 센서그램(sensogram)으로부터 전체적으로 평가하였다.
시약:
1. CM5 칩: Biacore, Cat. No. BR-1000-14
2. NHS: Biacore BR-1000-50
3. EDC: Biacore BR-1000-50
4. 10M 아세테이트 완충용액 pH 4.5: Biacore, Cat. No. BR-1003-50
5. 염소 항-인간 IgG Fc: Caltag, Cat. No. H10500
6. 에탄올아민, 1.0M pH 8.5: Biacore BR-1000-50
7. 10 x HBS-EP 영동 완충용액: 0.01M HEPES pH 7.4, 0.15M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% v/v 계면활성제 P20
8. 항원: 6xHis를 갖는 인간 EGFR 세포외 도메인
9. 100 mM H3PO4
가용성 인간 EGFR ECD에 대한 본 발명의 전장 IgG의 계산된 1가 친화성이 하기 표 8에 제시되어 있다.
Figure 112009060319675-pct00013
표 8. 가용성 수용체에 대한 항-EGFR IgG 항체의 측정된 친화성. 항체 측정을 제조업체에 의해 제공된 평가 소프트웨어를 이용하여 BIAcore 2000 상에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 수행하였다. * 스캐차드(Scatchard) 검정에 의해 992의 친화성을 결정하였다. NA . 적용가능하지 않음.
대부분의 시험된 Sym004 항체는 각각 4.2 nM, 0.4 nM 및 4.6 nM의 높은 친화성을 갖는 1260, 1277 및 1284는 제외하고는, 10 - 20 nM 범위의 친화성으로 가용성 인간 EGFR ECD를 인지하였다. 최종적으로, 992는 다른 시험 항체 보다 훨씬 낮은 친화성으로 가용성 EGFR ECD에 결합하는 것으로 밝혀졌다. 결과적으로, 이러한 항체의 동역학 검정은 스캐차드 검정에 의해 결정되었고, 이는 가용성 인간 EGFR ECD에 대해 170 nM의 친화성을 나타내었다.
고정된 재조합 EGFR ECD에 대한 Sym004 Fab 항체의 친화성의 측정.
가용성 및 고정 형태로 제시된 EGFR ECD 사이의 항원 제시의 가능한 차이점을 연구하기 위해, 인간 IgG Fc에 융합된 인간 EGFR ECD로 구성되는, EGFR-Fc(R&D Systems, 344-ER)로 언급되는 고정된 키메라 EGFR 수용체 항원 상에서의 신규한 친화성 측정을 수행하였다. 이를 위해, IgG 항체 992, 1024 및 1030의 Fab 단편을 1가 친화성의 측정을 가능케 하도록 생성하였다.
Fab 생성:
992, 1024 및 1030의 Fab 단편을 피어스(Pierce)사의 Fab 제조 키트를 이용하고, 제조업체의 설명서에 따라 파파인 분해에 의해 생성시켰다. 간단하게, 2 mg의 각각의 IgG 항체를 제조업체의 설명서에 따라 NAP-5 컬럼(Amersham Biosciences) 상에서 20 mM 시스테인-HCl, pH 7.0을 함유하는 새로이 제조된 분해 완충용액으로 완충용액 교환하였다. 이후, 350 μl의 파파인 비드의 슬러리를 동일한 분해 완충용액으로 2회 세척하고, 비드를 스핀 다운하고, 상층액을 폐기하였다. 비드에 1 ml의 완충용액 교환된 IgG 항체를 첨가하고, 1000 rpm에서의 진탕과 함께 37℃에서 밤새 인큐베이션하여 항체를 분해하였다. 다음날 아침, HiTrap 단백질 A 컬럼(Ge Healthcare) 상에서의 전장 IgG의 고갈에 의해 미정제 Fab로부터 분해되지 않은 IgG를 분리시켰다. 생성된 Fab를 밤새 PBS에 대해 최종적으로 투석시키고, 환원 및 비환원 조건하에서 SDS-PAGE로 분석하였다. 비환원 조건하에서의 약 50 kDa의 단백질 밴드를 성공적인 Fab 생성의 표시로 취하였다.
시약:
1. 이뮤노퓨어(ImmunoPure) Fab 제조 키트; Pierce; cat. No. 44885
2. NAP5 탈염 컬럼; Amersham, Cat. No. 17-0853-02
3. PBS pH 7.2; Gibco; #20012-019
4. 하이트랩(HiTrap) 단백질 A HP, 1 ml 컬럼; GE Healthcare; #17-0402-01
5. NuPAGE 4-12% Novex Bis-Tris 겔; Invitrogen; #NP0322BOX
6. 분자 마커; Seeblue Plus 2,; Invitrogen; # LC5925
7. 항-EGFR 항체 - 각각 2.0 mg.
본 발명의 Fab 항체의 동역학 검정을 대량 이동의 제한을 회피하기 위해 매우 낮은 밀도로 센서 표면에 고정된 재조합 항원을 이용하여 비아코어 2000 상에서 수행하였다. 간단하게, 전체 285 Ru의 재조합 EGFR ECD-Fc 키메라(R&D Systems, Cat. No. 344-ER)를 제조업체의 설명서에 따라 CM5 칩 표면에 컨쥬게이션시켰다. 이후, 본 발명의 항체로부터 유래된 Fab 단편을, 고정된 EGFR을 갖는 칩상에서 시험되는 경우 25를 초과하는 Ru max 값을 발생시키지 않는 최적화된 농도에서 시작하여, 연속 2배 희석으로 시험하였다. 먼저 HBS-EP 완충용액 단독의 주사에 의해 생성된 반응을 공제함으로써 동역학 검정을 수행하였다. 결합 속도 상수(ka) 및 해리 상수(kd)를 제조업체에 의해 제공된 BIA 평가 소프트웨어 4.1을 이용하여 생성된 센서그램으로부터 전체적으로 평가하였다.
고정된 인간 EGFR ECD에 대한 본 발명의 시험 Fab 단편의 계산된 친화성은 하기 표 9에 제시되어 있다.
Figure 112009060319675-pct00014
표 9: 고정된 수용체에 대한 항- EGFR Fab 항체의 측정된 친화성. 항체 측정을 제조업체에 의해 제공된 평가 소프트웨어를 이용하여 BIAcore 2000 상에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 수행하였다. * 스캐차드(Scatchard) 검정에 의해 992의 친화성을 결정하였다. NA. 적용가능하지 않음.
상기 표 9에 제시된 바와 같이, 992 및 1024의 Fab 단편은 이전의 실시예에 제시된 친화성과 일치하게 각각 150 nM 및 26 nM의 친화성을 갖는 것으로 밝혀졌고, 이는 상기 2개 항체에 대한 가용성 및 고정 EGFR에 대한 항체 인지의 작은 차이를 나타낸다. 그러나, 항체 1030은 가용성 수용체에 비해 고정 항원에 대해 2.3 nM의 10배 더 높은 친화성을 나타내었고, 결과적으로 고정된 항원 상에서 노출된 에피토프를 우선적으로 인지하였다.
실시예 15: A431-NS 세포 상에서의 EGFR 항원 제시 및 기능적 친화성의 순위 연구.
A431-NS 세포에서의 항원 제시와 정제된 전장 EGFR 수용체 사이의 비교.
동역학 검정은 항체 992가 150 내지 170 nM의 친화성으로 재조합 EGFR ECD를 인지한 것을 나타내었으므로, 이러한 약한 친화성이 mAb 992가 A431 세포로부터 정제된 재조합 EGFR ECD 또는 전장 EGFR 상에 존재하는 형태와는 대조적으로 A431-NS 세포에서 발현되는 EGFR의 천연 형태에 우선적으로 결합한다는 사실로 인한 것인지 연구하였다. EGF 수용체 항원 제시에서의 차이를 연구하기 위해, 본 발명의 항체의 부차집단의 동시 ELISA 결합 연구를 시험 A431-NS 세포 상에서의 결합력 효과를 회피하기 위한 Fab 단편 및 동일 세포로부터의 정제된 전장 EGFR을 이용하여 수행하였다.
Fab 생성: Fab 단편의 생성을 실시예 14에 기재된 바와 같이 수행하였다.
간접 ELISA: 간접 ELISA를 위해, 전장 EGFR(Sigma E2645)을 4℃에서 밤새 카르보네이트 완충용액(50 μl/웰) 중의 1 μg/ml로 코팅하였다. 다음날 아침, 웰을 PBS-T로 2회 세척하고, 실온에서 1% BSA를 함유하는 PBS-T로 1시간 동안 차단시킨 후, PBS-T로 2회 세척하였다. 다음으로, 1% BSA를 함유하는 DMEM 중에 50 μl의 Fab 항체의 연속 희석액을 독립적인 ELISA 웰에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 이후 웰을 PBS-T로 4회 세척하였다. 다음으로, 1% BSA를 함유하는 DMEM에 1:5000으로 희석된 50 μl의 이차 염소-항-인간(Fab 특이적) HRP 컨쥬게이트를 첨가하고, 30분 동안 얼음 상에서 인큐베이션하였다. 최종적으로, 웰을 PBS-T로 4회 세척하고, 50 μl/웰의 TMB 기질을 첨가하여 플레이트를 발달시키고, 1-15-30분 마다 620 nm에서 판독하였다. 기질과의 인큐베이션 후, 1M H2SO4를 첨가하여 반응을 중지시키고, 450 nm에서 흡광도를 판독하였다.
시약, 간접 ELISA:
1) 코팅 완충용액: 50 mM 카르보네이트 완충용액, pH 9.8
2) 항원: A431 세포로부터 정제된 야생형 전장 EGFR; Sigma E2645
3) ELISA 플레이트: NUNC Maxisorp; Cat. No: 442404
4) 세척 완충용액: 1x PBS/0.05% Tween 20(PBS-T)
5) 차단/희석 완충용액: PBS-T 중의 1% BSA(PBS-T-1% BSA)
6) 항체 희석 완충용액: 1% BSA를 함유하는 DMEM
7) 염소-항-인간(Fab 특이적) HRP 컨쥬게이트: Jackson, Cat. No. 109-035-097
8) TMB 플러스(Plus) 기질: KemEnTec, Cat. No. 4390L
9) 1M H2SO4
세포 ELISA: 최대 중간 OD(half maximal OD)(ED50)를 발생시키는 몰 농도로 정의된 상대 결합 친화성을 A431-NS 세포 상에서의 항체 적정에 의해 결정하였다. 간단하게, 10,000개의 A431-NS 세포를 밤새 37℃, 5% CO2에서 0.5% FCS 및 1% P/S가 첨가된 DMEM을 함유하는 96 웰 ELISA 플레이트에서 성장시켰다. 다음날 아침, 컨플루언스 세포(약 20,000/웰)를 PBS로 2회 세척하고, 실온에서 15분 동안 1% 파라포름알데히드 용액과 함께 인큐베이션하여 고정시킨 후, PBS로 4회 세척하였다. 다음으로, 시험 EGFR 항체 및 음성 대조군 항체 시나기스를 1% BSA를 함유하는 DMEM에 연속 희석시키고, 50 μl의 각각의 희석액을 웰에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 웰을 PBS로 4회 세척하였다. 이후, 1% BSA를 함유하는 DMEM에 1:5000 희석된 50 μl의 이차 염소-항-인간(Fab 특이적) HRP 컨쥬게이트를 첨가하고, 30분 동안 얼음 상에서 인큐베이션하였다. 최종적으로, 웰을 PBS로 4회 세척하고, 50 μl/웰 TMB 플러스(Plus) 기질을 첨가하여 플레이트를 발달시키고, 5-15-30분 마다 620 nm에서 판독하였다. 기질과의 인큐베이션 후, 1M H2SO4를 첨가하여 반응을 중지시키고, 450 nm에서 흡광도를 판독하였다. 이차 시약 단독을 이용한 평균 백그라운드 결합의 공제 후, 각각의 시험 항체에 비한 최대 결합%를 작도함으로써 결합 곡선의 규격화에 의해 ED50 값으로 나타낸 기능적 친화성을 계산하였다.
시약, 세포 ELISA:
1) DMEM 배지: Gibco, Cat. No 41966-029
2) FCS: Gibco, Cat. No. 10099-141
3) 펜 스트렙(Pen strep)(P/S): Gibco,,Cat. No. 15140-122
4) ELISA 플레이트: Costar, Cat. No. 3595
5) 세척 완충용액(PBS): Gibco cat. 20012-019
6) 항체 희석 완충용액: 1% BSA를 함유하는 DMEM
7) 세포 고정 용액: BD Biosciences, Cat. No. 340181
8) 염소-항-인간(Fab 특이적) HRP 컨쥬게이트: Jackson, Cat. No. 109-035-097
9) TMB 플러스(Plus) 기질: KemEnTec, Cat. No. 4390L
10) 1M H2SO4
A431-NS 세포에서 발현된 EGF 수용체 및 동일 세포로부터의 정제된 수용체 상에서의 항원 제시에서의 차이를 동일한 이차 항체 시약 및 인큐베이션 시간을 이용하는 동반 ELISA 결합 연구로 결정하였다. 결과는 도 31에 도시되어 있다. 실험은 Fab 항체 992 및 1024가 동일 농도의 Fab 1030의 결합과 비교하는 경우 ELISA 웰에 코팅된 정제된 전장 EGFR에 약하게 결합하는 것을 명백히 나타내었다. 그러나, 992 및 1024의 이러한 약한 결합 활성은 항체가 모든 3개의 Fab가 강한 결합 활성을 나타낸 A431-NS 세포에서 시험되는 경우에 회복되었다. 2개의 상이한 ELISA의 비교는 ELISA 웰의 정제된 항원 상에 제시된 형태와 대조적으로 세포 표면 상에서 발현되는 천연 EGFR 형태로의 결합에 대해 Fabs 992 및 1024의 우선적 결합을 명백히 나타내었다. 결과는 또한 재조합 가용성 및 고정 EGFR ECD에 대한 표면 플라즈몬 공명으로 측정된 992의 명백히 약한 친화성이 시험 시스템에서 992 항체 에피토프의 바람직하지 않은 제시로 인한 것임을 암시하였다.
A431-NS 세포에 대한 기능적 친화성의 순위.
상기 기재된 바와 같이 수행된 세포 ELISA를 ED50 값으로 표현된 최대 중간 OD 값의 계산에 의해 992, 1024, 1030, 벡티빅스 및 에르비툭스의 IgG 및 Fab 단편의 기능적 친화성을 등급화시키기 위해 사용하였다. 이러한 검정의 결과는 도 32에 도시되어 있고, 계산된 ED50 값은 하기 표 10에 제시되어 있다.
Figure 112009060319675-pct00015
표 10: IgG의 결합력 효과 또는 Fab의 1가 친화성에 기초하여 ED50 값으로 표현된 기능적 친화성의 순위. A431-NS 세포에서의 연속 항체 적정에 의해 ED50 값을 결정하였다. SD: 곡선 접합(curve fitting)의 표준 편차.
실험은 결합력 효과가 IgG 992 및 1024가 에르비툭스 및 벡티빅스 둘 모두에 비해 높은 결합력으로 A431-NS 세포에 결합하는 반면, IgG 1030은 시험된 IgG 항체의 가장 낮은 친화성을 갖는 것을 명백하게 나타내었다. 그러나, 세포에서의 1가 친화성이 Fab 단편을 이용하여 결정되는 경우, 992는 약 10 nM의 가장 낮은 친화성을 가졌다. 그럼에도 불구하고, 이러한 1가 기능적 친화성은 BIAcore로 시험되는 것보다 여전히 15배 이상 낮았다.
실시예 16 : 항체에 의해 유도된 결합 향상의 연구.
본 발명의 항체 쌍에서 수행된 BIAcore 경쟁 실험은 992 및 1024의 결합이, 이러한 항체가 양 방향으로 서로에 대해 시험되는 경우 각각 약 55% 및 58% 향상(도 9A)된 것을 나타내었다. 이러한 현상을 추가로 연구하기 위해, 비 중첩 에피토프에 결합하는 항체의 Fab 단편을 이용한 수용체 포화 전에 1개의 항체 클론의 IgG 결합의 효과를 연구하기 위해 고정되지 않은 세포를 이용한 세포 ELISA를 고안하였다
세포 ELISA: ELISA를 변형과 함께 본질적으로 실시예 15에 기재된 바와 같이 수행하였다. 세포를 고정되지 않은 채로 두어, 항체 첨가 후에 형태적 EGFR 유연성(flexibility)을 가능케 하였다. 간단하게, 10,000개의 A431-NS 세포를 밤새 37 ℃, 5% CO2에서 0.5% FCS 및 1% P/S가 첨가된 DMEM을 함유하는 96 웰 ELISA 플레이트에서 성장시켰다. 다음날 아침, 컨플루언스 세포(약 20,000/웰)를 PBS로 2회 세척하고, 항체에 의해 유도된 결합 향상의 연구를 위한 웰을 992, 1024 또는 1030의 40 nM 단일 Fab 단편 25 μl, 또는 포화 결합을 발생시키는 것으로 기존에 밝혀진 이중 조합의 80 nM의 각각의 단일 Fab 12.5 μl와 함께 예비인큐베이션하였다. 1% BSA를 함유하는 25 μl DMEM을 Fab 단편의 첨가 없이 IgG 항체의 시험에 사용되는 웰에 첨가하였다. Fab 및 배지 첨가 후, ELISA 웰을 실온에서 30분 동안 인큐베이션시킨 후, 360 nM의 농도에서 시작하는 25 μl의 본 발명의 IgG의 연속 3배 희석액 또는 시나기스 음성 대조군을 웰에 첨가하고, 1시간 동안 얼음 상에서 인큐베이션하였다. 다음으로, 웰을 PBS로 4회 세척하고, 1% BSA를 함유하는 DMEM에 1:5000 희석된 50 μl의 이차 모노클로날 마우스-항-인간(Fc 특이적) HRP 컨쥬게이트를 첨가하고, 30분 동안 얼음 상에서 인큐베이션하였다. 최종적으로, 웰을 PBS로 4회 세척하고, 50 μl/웰의 TMB 기질을 첨가하여 플레이트를 발달시키고, 5-15-30분 마다 620 nm에서 판독하였다. 기질과의 인큐베이션 후, 1M H2SO4를 첨가하여 반응을 중지시키고, 450 nm에서 흡광도를 판독하였다. 이차 항체 단독을 이용한 평균 백그라운드 결합을 공제한 후, 각각의 시험 항체에 비한 최대 결합%를 작도함으로써 결합 곡선의 규격화에 의해 ED50 값으로 나타낸 기능적 친화성을 계산하였다.
시약, 세포 ELISA:
1) DMEM 배지: Gibco, Cat. No 41966-029
2) FCS: Gibco, Cat. No. 10099-141
3) 펜 스트렙(Pen strep)(P/S): Gibco, , Cat. No. 15140-122
4) ELISA 플레이트: Costar, Cat. No. 3595
5) 세척 완충용액(PBS): Gibco cat. 20012-019
6) 항체 희석 완충용액: 1% BSA를 함유하는 DMEM
7) 마우스-항-인간(Fc 특이적) HRP 컨쥬게이트: Ab-direct, Cat. No. MCA647P
8) TMB 플러스(Plus) 기질: KemEnTec, Cat. No. 4390L
9) 1M H2SO4
항체에 의해 유도된 결합 향상의 연구를 동일한 이차 항체 시약 및 인큐베이션 시간을 이용하는 동반 ELISA 결합 연구에 의해 결정하였다. 연구 결과는 도 33에 도시되어 있고, 계산된 ED50 값은 하기 표 11에 제시되어 있다.
Figure 112009060319675-pct00016
표 11: 나열된 Fab 단편을 이용한 사전 수용체 포화 또는 이의 부재에서의 IgG의 결합력 효과에 기초한 ED50 값으로 나타낸 기능적 친화성의 순위. A431-NS 세포에서의 연속 항체 IgG 적정에 의해 ED50 값을 결정하였다. SD: 곡선 접합(curve fitting)의 표준 편차.
도 33 및 상기 표 11에 제시되어 있는 바와 같이, IgG 992는 1030과 함께 1024 또는 1030 또는 1024의 Fab 단편을 이용한 사전 수용체 포화시의 결합의 명백한 향상을 나타내었다. Fab 단편과의 인큐베이션은 IgG 992가 단독으로 시험되는 경우의 0.6 nM에 비해 각각 0.5, 0.4 & 0.5 nM의 감소된 ED50 값을 발생시켰다. 마찬가지로, IgG 1024 및 1030은 또한 세포가 Fab 992로 포화되는 경우에 증가된 결합을 나타내었고, Fab 992 및 1030 둘 모두가 IgG 전에 세포에 첨가되는 경우에 1024에서만 증가된 결합을 나타내었다. 이러한 결과는 동일한 표적 수용체 상의 비중첩 에피토프에 대한 1개 이상의 항체를 갖는 것의 이점을 명백히 나타낸다.
실시예 2에 비해 약간 낮은 기능적 친화성이 본 실시예에서 결정되었다. 이러한 결과는 아마 다양한 이차 시약이 본 실시예에서 사용되고, 시험 IgG가 내재화를 회피하기 위해 얼음 상에서 고정되지 않은 세포와 함께 인큐베이션되었다는 사실로 인한 것일 것이다.
실시예 16B : 전장 시노몰구스 EGFR 의 클로닝 .
신호 펩티드를 포함하는 전장 시노몰구스 EGFR을 네스티드 PCR 및 전장 인간 EGFR의 공개된 서열(GENBANK X00588, Ullrich, A et. al. Nature 309(5967),418-425 (1984))로부터 유래된 서열 특이적 프라이머를 이용하여 표피로부터 분리된 시노몰구스 cDNA로부터 클로닝시켰다.
PCR 시약:
정상 피부 표피로부터 분리된 시노몰구스 원숭이 cDNA: CytoMol Unimed, Cat. No: ccy34218, Lot No: A711054.
패스트스타트(FastStart) 반응 완충용액(10X): Roche, Cat. no: 03 553 361 001
패스트스타트 효소: Roche, Roche, Cat. no: 03 553 361 001
퓨전(Phusion) 효소: Finnzymes, F-530S (2U/μL).
dNTP 25 mM: Bioline, Cat. No: BIO-39029
신호 서열을 포함하는 전장 시노몰구스 EGFR의 증폭을 위한 프라이머:
5' ATG 프라이머: 5'-TCTTCGGGAAGCAGCTATGC-3'(서열 목록 번호:135)
3' STOP 프라이머: 5'-TCATGCTCCAATAAATTCACTG-3'(서열 목록 번호:139)
PCR 조건:
95℃/2분, 40 주기: 95℃/30초, 55℃/30초, 72℃/3분 30초, 5분 동안 72℃에서 최종 인큐베이션.
Not 및 Xho 제한 부위를 포함하는, 전장 시노몰구스 EGFR을 증폭시키는 네스티드 PCR을 위한 프라이머:
E579 Cyn Not5' 5'-GGAGTCGGCGGCCGCACCATGCGACCCTCCGGGACGG-3(서열 목록 번호:140)
E580 Cyn Xho5' 5'-GCATGTGACTCGAGTCATGCTCCAATAAATTCACTGC-3(서열 목록 번호:141)
PCR 조건:
95℃/2분, 이후 30주기: 95℃/30초 용융, 55℃/30초 어닐링, 72℃/3분 신장. 30주기 후, PCR 생성물을 추가 10분 동안 신장시켰다.
PCR 반응을 1x 패스트스타트(FastStart) 완충용액, 0.2 mM dNTP 및 0.2 μM의 각각의 프라이머의 최종 농도를 갖는 50 μL의 전체 부피의 반응 완충용액 중의 0.5 μl 주형 및 0.1 μl 퓨전(Phusion) 효소, 0.4 μl 패스트스타트 효소를 이용하여 수행하였다.
약 4000 bp의 명백한 길이를 갖는 PCR 단편을 수득하고, TOPO TA 클로닝 키트(Invitrogen, Part No. 4506-41)를 이용하여 클로닝시키고, 서열분석하였다. 클로닝된 시노몰구스 EGFR의 DNA 및 단백질 서열은 도 34에 도시되어 있다. 인간 EGFR 및 시노몰구스 EGFR 단백질 서열의 정렬은 99.2%의 서열 동일성을 나타내었다.
FACS 검정에 의한 전장 인간 및 시노몰구스 EGFR 사이의 항체 교차 반응성의 입증.
전장 인간 및 시노몰구스 EGFR을 안정적인 트랜스펙션에 의해 CHO 세포의 표면에서 발현시키고, 세포를 FACS 검정에 의해 연속 희석된 EGFR 항체의 패널로의 결합에 대해 시험하였다. 결정을 모든 항체 희석 시리즈에서 고정된 수의 세포의 세포 표면에서 발현된 EGFR 항원 분자의 수 보다 5배 이상 더 높은 항체의 몰 과량을 유지시킴으로써 KD 의존성 조건하에서 수행하였다. 이러한 구성은 모든 시험 항 체 농도에 대한 완전한 수용체 포화에서 항체 결합의 FACS 검정을 가능케 하였다.
간단하게, 인간 또는 시노몰구스 전장 EGFR로 트랜스펙션된 CHO 세포의 표면 상에서 발현된 EGFR 분자의 수를 결정하기 위해 BD FACS 어레이 바이오어낼라이저(Bioanalyzer) 시스템에서 정량적 FACS 검정을 수행하였다. 세포 상에서 PE 표지된 에르비툭스 IgG를 적정함으로써 검정을 수행하고, 공지된 PE 밀도를 갖는 레인보우(Rainbow) 교정 입자로부터 제조된 표준 곡선과 비교함으로써 등가 PE의 분자의 수를 결정하였다. 정량적 검정은 EGFR 트랜스펙션된 CHO 세포가 각각의 세포의 표면 상에 약 350,000개의 분자를 전시한 것을 나타내었다. 다음으로, 각각의 결정에서 표면 상에 전시된 EGFR 항원에 비해 5배 이상의 몰 과량의 항체를 허용하는, 5 nM에서 시작하는 본 발명의 항체의 연속 5배 희석액을 증가하는 부피의 10,000개의 EGFR 트랜스펙션된 CHO 세포와 함께 인큐베이션시킴으로써 비교하였다. 항체를, 수용체 내재화를 방지하기 위해 FACS 완충용액을 0.02% NaN3에 첨가하고, 온도를 4℃로 유지시키면서, 모든 시험 항체 농도에서 완전한 항원 포화를 촉진하기 위해 진탕기에서 14시간 동안 세포와 함께 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 세포를 4℃에서 5분 동안 1200 RPM에서 펠렛화시키고, 200 ul FACS 완충용액에 재현탁시켰다. 다음으로, 세포를 1:500 희석된 이차 염소 F(ab')2 항-인간 IgG Fc감마 PE로 염색시키고, 진탕기에서 4℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 최종적으로, 세포를 FACS 완충용액으로 2회 세척하고, 동일한 전면/측면 산란 특성을 나타내는 EGFR 발현 CHO 세포에 대해 게이팅된 BD FACS 어레이 바이오어낼라이저 시스 템에서 분석하였다.
FACS 시약:
레인보우(Rainbow) 교정 입자: BD, cat. no: 559123
FACS 완충용액: 1xPBS + 2% FCS + 0.02% NaN3
염소 F(ab')2 항-인간 IgG Fc감마 PE: Jackson ImmunoResearch, cat. no. 109-116-170
EGFR 항체 IgG 992 및 1024의 교차 반응성의 결정을 위해 기재된 FACS 결합 검정을 사용하였고, 시노몰구스 EGFR과 교차 반응하지 않는 대조 항체 IgG 1320과 비교하였다. 하기 도 40에 도시된 바와 같이, 기재된 FACS 검정은 인간 및 시노몰구스 전장 EGFR 사이에서 우수한 교차 반응성을 나타내는 항체(도 4OA, IgG 992 및 도 4OB, IgG 1024), 및 전장 인간 EGFR 만을 인지하는 종 특이적 항체(도 4OC, IgG 1320)의 구별에 매우 우수하였다. 이러한 검정으로부터, IgG 992 및 1024 둘 모두가 안정적인 트랜스펙션된 CHO 세포의 표면 상에서 발현된 인간 및 시노몰구스 전장 EGFR 둘 모두에 대해 우수한 교차반응성을 나타내는 것으로 결론내렸다. 시노몰구스 및 인간 EGFR 사이의 결합에서의 차이는 높은 정도의 서열 유사성의 관점에서 놀랍고, 전임상 독성학 연구에 대해 사용되는 동물에서 정확한 표적 서열로의 결합을 위한 시험 항체의 중요성을 뒷받침한다.
실시예 17. 992, 1024 및 1030에 상동성인 클론
면역측정 검정(ELISA 및 세포 기재 검정)에 기초한 EGFR-결합 항체-클론의 스크리닝으로 이전 실시예에 기재된 바와 같이 클론 992, 1024 및 1030를 확인하였다. 992, 1024, 1030에 상동성인 EGFR 특이적 클론을 또한 확인하였다(표 12).
동일한 클러스터에 속하는 클론은 동일한 결합 특이성을 가지나, 다양한 친화성으로 결합할 수 있는 것으로 예상된다. 따라서, 클러스터 내의 클론은 본 발명의 항체 조성물 내의 또 다른 클론으로 대체될 수 있으나, 단, 상기 클론의 결합 친화성은 너무 많이 상이하지 않아야 한다.
Figure 112009060319675-pct00017
Figure 112009060319675-pct00018
실시예 18: 항체 922 및 1024의 인간화
모든 항체는 인간 항-항체 반응을 유발하는 잠재성을 함유한다. 상기 반응 은 적용된 치료 항체의 "인간성(humanness)"의 정도와 다소 관련된다. 면역원성을 예측함으로써 인간 항-항체를 예측하는 것은 불가능하나, 임상 사용을 위한 높은 정도의 인간성을 갖는 항체를 선택하려는 경향이 존재한다. 본 발명에 기재된 항체의 인간성은 인간화 방법에 의해 증가될 수 있다[Reichert JM. Monoclonal antibodies in the clinic. Nature Biotechnol, 2001;19:819-822; Reichert JM, Rosensweig CJ, Faden LB and Dewitz MC. Monoclonal antibody successes in the clinic. Nature Biotechnol, 2005;23:1073-1078].
뮤린 mAb의 인간화는 주로 상보성 결정 영역(CDR)을 통상적으로 CDR 이식으로 언급되는 절차에 의해 밀접하게 관련된 서열을 갖는 IGHV 및 IGKV 도메인의 인간 프레임워크 영역(FR)으로 이식함으로써 달성된다(Jones PT, Dear PH, Foote J, Neuberger MS and Winter G. Replacing the complementarity-determining regions in a human antibody with those from a mouse. Nature, 1986;321:522-525). 그러나, 과변이 영역만의 단순한 CDR 이식은 일부 프레임워크 아미노산 또는 영역이 항원에 대한 중요한 접촉을 이루거나, 항원 결합 CDR 루프의 형태를 지지하므로 친화성을 감소시킨다[Queen C, Schneider WP, Selick HE, Payne PW, Landolfi NF, Duncan JF, Avdalovic NM, Levitt M, Junghans RP and Waldmann TA. A humanized antibody that binds to the interleukin 2 receptor. Proc Natl Acad Sci U S A, 1989;86:10029-10033; Al-Lazikani B, Lesk AM and Chothia C. Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins. J Mol Biol, 1997;273:927-948]. 결과적으로, 항체 인간화는 항원 결합 활성에 대한 문헌에 기 재된 영향력을 갖는 중요한 뮤린 프레임워크 잔기를 보유하면서, 뮤린 유래 가변 영역으로부터의 CDR 루프의 매우 상동성인 인간 프레임워크로의 이식을 수반하여야 한다(Winter, G. and W. J. Harris. "Humanized antibodies." Immunol. Today 14.6 (1993): 243-46). 여러 방법이 개발되었고, 항체 친화성 및 기능을 유지하면서 인간화를 달성시키는데 성공적으로 적용되었다(reviewed in Almagro, J. C. and J. Fransson. "Humanization of antibodies." Front Biosci. 13 (2008): 1619-33.). 인간화는 온당한 방법, 예를 들어, CDR 이식, 리서피싱(resurfacing), 과인간화(superhumanization), 인간 스트링 함량 최적화(string content optimization)에 의해 달성될 수 있고, 상기 방법 모두는 소수의 인간화된 항체 후보의 구성에 의지한다. 후보의 아미노산 서열은 항체 구조, 및 항원 상호작용 영역의 전체 구조의 직접 및 간접적인 안정화를 통한 항원 결합을 위한 개별적 아미노산의 기여에서의 통찰 및 예측을 기초로 한다. 보통, 후보는 세밀화되고, 일부 아미노산은 각각의 항체가 일부 생각치 않은 개별적 구속을 가지므로 본래의 뮤린 잔기로 역돌연변이된다. 친화성 및 기능을 유지하는데 여러 연속적인 라운드의 고안, 시험 및 재고안(redesign)이 필요할 수 있음이 상기 방법에서 통상적이다. 대안은 많은 조합의 라이브러리가 생성되고, 요망되는 특징을 갖는 항체가 효소 또는 파아지 디스플레이 또는 대안적 스크리닝 방법과 같은 방법에 의한 선택에 의해 변이체 풀로부터 부화되는 보다 경험적인 방법이다.
본 발명에 기재된 항-EGFR 항체는 인간 V 영역으로의 CDR 이식에 의해 인간화될 수 있다. 바람직한 계획안에서, 인간 V 영역은 본래의 뮤린 V 영역에 대한 상동성에 기초하여 선택된다. 낮은 면역원성과 같은 다른 요망되는 특징을 갖는 인간 V 유전자 영역이 또한 사용될 수 있다. 본 실시예는 992 및 1024 항-EGFR 키메라 항체의 인간화에 사용되는 방법을 기재한다. 도 41A에 제공된 인간화 서열은 992 IGHV로부터의 IMGT 규정된 CDR 영역을 IGHV1-46/IGHJ4에 이식하고, 992 IGKV를 IGKV1-27/IGKJ1-01에 이식함으로써 생성되었다. 도 41B에 제공된 아미노산 서열은 1024 IGHV로부터의 IMGT 규정된 CDR 영역을 IGHV1-2*02/IGHJ6*02로 이식하고, 1024 IGKV를 IGKV2-28*01/IGKJ2*01로 이식함으로써 인 실리코(silico) 생성되었다. 특정화된 인간화 항체를 엔코딩하는 인공 유전자가 합성되고, 포유동물 발현 벡터에 삽입된다. 항체가 실시예 3에 기재된 바와 같이 발현되고, 정제되고, 활성에 대해 시험된다. 최초 시험 후, 인간화 항체의 결합 동역학은 실시예 14에 기재된 바와 같이 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정될 수 있다. 유사하게, 세포의 표면에 발현된 hEGFR에 대한 결합은 실시예 15에 기재된 바와 같이 결정될 수 있다.
인간화된 아미노산의 결합 활성이 본래의 항체에 대해 관찰된 것보다 현저하게 낮은 경우, 친화성의 재생을 위해 버니어(Vernier) 구역에 위치된 인간화 프레임워크 잔기, 또는 CDR 영역의 경우 구조를 지지하는 것으로 제안된 잔기로 시작하는 연속 역돌연변이 계획이 이용될 것이다(Foote, J. and G. Winter. "Antibody framework residues affecting the conformation of the hypervariable loops." J Mol. Biol. 224.2 (1992): 487-99; Padlan, E. A. "Anatomy of the antibody molecule." Mol. Immunol 31.3 (1994): 169-217.). 이러한 잔기는 IMGT 넘버링에 서 992 IGHV 아미노산 번호 13, 45 및 80; 992 IGKV 아미노산 25; 1024 IGHV 아미노산 13, 45, 80 및 82; 1024 IGKL 아미노산 78에 존재한다. 이러한 돌연변이는 표준 분자 생물학 방법을 이용하는 PCR 매개 부위 특이적 돌연변이유발을 이용함으로써 작제될 수 있다. 작제된 돌연변이는 상기 기재된 바와 같이 시험될 것이다. 이러한 세트의 후보가 항원 결합 특성을 보유하는 인간화 항체를 발생시킬 것이다. 그러나, 부위 특이적 돌연변이유발에 의한 CDR 영역 내에 아미노산 치환의 도입에 의한 추가 역돌연변이 또는 친화성 성숙이 배제될 수 없다.
실시예 19 : 이중 가변 도메인 항체
6개의 아미노산 링커(ASTKGP)에 의한 탠덤(tandem)의 992 및 1024의 IGHV 도메인과 5개의 아미노산 링커(TVAAP)에 의한 992 및 1024의 IGKV 도메인을 융합시킴으로써 이중 가변 도메인(DVD) 항체 단백질이 공학처리된다[Wu C, Ying H, Grinnell C, Bryant S, Miller R, Clabbers A, Bose S, McCarthy D, Zhu RR, Santora L, vis-Taber R, Kunes Y, Fung E, Schwartz A, Sakorafas P, Gu J, Tarcsa E, Murtaza A and Ghayur T. Simultaneous targeting of multiple disease mediators by a dual-variable-domain immunoglobulin. Nature Biotechnol, 2007;25:1290-1297]. 이중 IGHV 및 IGKV 도메인 융합체에 이어 IGHC 및 IGKC 도메인이 각각 후속된다. 한 전장 DVD 항체(992L1024)에서, 992 IGHV 및 IGKV는 N-말단에 존재하고, 이에 이어 링커 및 1024 IGHV 및 IGKV가 각각 후속된다. 두번째 전장 DVD 항체(1024L992)에서, 1024 IGHV 및 IGKV는 N-말단에 존재하고, 이에 이어 링커 및 992 IGHV 및 IGKV가 각각 후속된다. 992 및 1024 항체를 엔코딩하는 플라 스미드 DNA가 DVD 엔코딩 유전자의 2단계 PCR 매개 작제를 위한 주형으로 사용된다. IGHV 및 IGKV의 2개의 가변 도메인을 엔코딩하는 영역이 먼저 개별적으로 증폭되고, 이들은 링커 엔코딩 영역의 위치에서 중첩 신장 영역을 함유한다(주형 및 프라이머 조합물에 대해서는 표 13 및 표 14 참조). C-말단 근위 가변 도메인을 엔코딩하는 IGKV 유전자가 증폭되어, 인간 경쇄 불변 도메인 엔코딩 유전자(IGKC)가 코딩 서열에 포함된다. 이중 가변 도메인 항체의 서브유닛의 코딩 서열 및 아미노산 서열은 부록 3에 제시되어 있다.
제공된 최종 농도를 수득하기 위해 각각의 튜브(50-μl 반응)에서 다음과 같은 혼합물을 이용하여 첫번째 PCR을 준비하였다: 1 x 패스트스타트(FastStart) 완충용액(Roche), dNTP 혼합물(각각 200 μM), 프라이머(각각 10 pmol)(표 14 참조), 패스트스타트 하이 피델리티 효소 블렌드(FastStart High Fidelity Enzyme Blend)(2.2U; Roche) 및 100 ng의 플라스미드 주형(표 14 참조). PCR을 다음과 같은 열주기에 적용시켰다: 95℃에서 2분, 20 x (95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분), 72℃에서 10분. 첫번째 PCR 반응으로부터의 정확한 크기를 갖는 생성된 PCR 생성물(표 14 참조)을 분취용 아가로오스 겔 전기영동에 의해 정제하고, 2개의 가변 도메인이 중첩 신장 PCR에 의해 스플라이싱되는 두번째 단계에 사용하였다. 중첩 신장 PCR에 의한 DNA 단편의 스플라이싱인 두번째 PCR을 제공된 최종 농도를 수득하기 위해 각각의 튜브(50-μl 반응)에서 다음과 같은 혼합물을 이용하여 준비하였다: 1x 패스트스타트 완충용액(Roche), dNTP 혼합물(각각 200 μM), 프라이머(각각 10 pmol, 표 15 참조), 패스트스타트 하이 피델리티 효소 블렌 드(FastStart High Fidelity Enzyme Blend)(2.2U; Roche) 및 주형(100 ng PCR 단편, 표 15 참조). PCR을 상기 정의된 바와 같은 열 주기에 적용시켰다. 두번째 PCR 단계로부터 생성된 생성물을 분취용 아가로오스 겔 전기영동에 의해 정제하고, 이중 IGHV에 대해 AscⅠ 및 XhoⅠ, 및 이중 IGKV(IGKC 포함)에 대해 NheⅠ 및 NotⅠ의 제한 효소로 처리하였다. 단편을 표준 제한 효소 분해 및 라이게이션 방법에 의해 포유동물 IgG 발현 벡터 00-VP-002(도 4)에 연속적으로 라이게이션시켰다. 생성된 발현 플라스미드 벡터를 대장균(E. coli)에서 증폭시키고, 플라스미드 제조물을 표준 방법에 의해 정제하였다. DVD 항체를 발현시키고, 실시예 2와 같이 정제하고, 실시예 3-13에서와 같이 활성에 대해 특성규명하였다.
다른 링커가 생성된 항체가 표적 hEGFr에 대해 감소된 결합을 나타내거나 결합을 나타내지 않는지 시험될 수 있다.
표 13 : 992 및 1024로부터의 DVD 항체를 작제하기 위한 프라이머
Figure 112009060319675-pct00019
Figure 112009060319675-pct00020
표 14 : 992 및 1024로부터 DVD 엔코딩 유전자를 작제하기 위한 첫번째 PCR 단계를 위한 프라이머 및 주형 조합물
Figure 112009060319675-pct00021
* 증폭된 코딩 서열은 IGKC-유전자를 포함한다.
표 15 : 992 및 1024로부터 DVD 엔코딩 유전자를 작제하기 위한, 중첩 신장에 의한 스플라이싱인 두번째 PCR 단계를 위한 프라이머 및 주형
Figure 112009060319675-pct00022
실시예 20 : 시노몰구스 원숭이에서의 에르비툭스와 조합된 6주의 정맥내 투여 독성 연구
연구 목적: 연구의 목적은 6주 동안의 시노몰구스 원숭이로의 1주 1회의 정맥내 투여 후의, 시험 품목 992-1024의 독성을 결정하는 것이다.
독성은 에르비툭스 및 벡티빅스와 같은 EGFR 억제제를 이용한 임상 실시에서 용량 제한적 요인이므로, 임상적으로 적절한 용량의 992-1024의 용인성(tolerability)을 평가하기 위한 초기 단계에서 중요한 것으로 생각되었다. 이는 992-1024가 다른 EGFR 표적 생성물에 비해 다양한 메커니즘에 의해 작용되는 것으로 보인다는 사실에 의해 강조된다. 이는 잠재적으로 새로운 유해 효과 또는 다른 EGFR 억제제를 이용하여 관찰된 효과의 약화를 발생시킬 수 있다.
3마리의 암컷 시노몰구스 원숭이의 그룹에 6주 동안 4/2.7 및 12/8 mg/kg의 992+1024, 및 12/8 mg/kg의 에르비툭스를 매주 IV 투여하여 처리하였다. 부하 량(loading dose)인 4 및 12 mg/kg, 및 유지량인 2.7 및 8mg/kg의 첫번째 용량을 5회 투여하였다. 12/8 mg/kg의 용량은 임상 실시에서 투여되는 에르비툭스의 인간 임상 용량과 동등하다.
연구 디자인
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# 첫번째 용량 수준은 부하량에 대한 것이고, 두번째 용량 수준은 8일 이후부터의 투여에 대한 것이다.
연구 동안 다음과 같은 파라미터를 추적하였다: 사망률, 임상적 증상, 체중, 음식 섭취, 혈액학, 임상 화학, 기관 중량, 육안 조사.
결과
사망률: 연구 과정 동안 예정에 없던 사망이 없었다.
임상적 증상: 처리와 관련된 유해한 임상적 관찰이 없었다.
체중: 체중에 대해 992+1024 또는 에르비툭스를 이용한 처리의 효과가 없었 다.
음식 섭취: 음식 섭취에 대해 명백한 효과가 없었다.
혈액학: 992+1024 또는 에르비툭스를 이용한 처리의 효과를 암시하는 혈액학적 파라미터에 대해 효과가 없었다.
임상 화학: 시험 품목을 이용한 처리의 효과를 암시하는 임상 화학 파라미터에서 변화가 없었다.
4주에서, 4.2/2.7 mg/kg의 992+1024/일이 투여된 1마리의 동물은 처리전 값에 비해 증가된 아스파테이트 아미노전이효소 및 알라닌 아미노전이효소 수준을 가졌다. 이러한 수준은 6주까지 정상 범위로 복귀되었다. 다른 처리 동물에서의 유사한 효과의 부재에서, 간의 효소에서의 상기 증가의 독성학적 유의성은 공지되지 않았다.
기관 중량: 처리 동물과 대조군 동물 사이의 기관 중량에서 독성학적 유의성의 차이가 없었다.
육안 조사: 992+1024 또는 에르비툭스의 효과를 암시하는 부검에서 인지되는 일치하는 발견이 없었다.
예비 결론: 예비 데이터는 992+1024가 시험 용량에서 잘 용인되고, 처리와 관련된 유해 효과가 관찰되지 않는 것을 나타낸다.
실시예 21. 폐세포 암 세포주의 성장 억제.
폐암 세포주는 티로신 키나아제 도메인에 돌연변이를 갖는 EGFR을 발현하는 것으로 공지되어 있다(Steiner et al. Clin Cancer Res 13.5 (2007): 1540-51). 실시예 6에서 사용된 것과 유사한 방법에 의해, 다양한 EGFR 돌연변이를 갖는 폐암 세포주 HCC827 및 H1975의 성장을 억제하는 2개 항체 992 및 1024의 조합물의 능력을 연구하였다.
결과
표 16 및 표 17에서 관찰될 수 있는 바와 같이, 992 및 1024의 조합물은 둘 모두의 세포주의 성장을 억제할 수 있다. 조합물은 모노클로날 항체 992 및 1024, 및 벡티빅스에 비해 우수하다.
표 16 : HCC827 세포주에 대한 지정된 항체의 IC50 값 및 최대 성장 억제
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표 17 : H1975 세포주에 대한 지정된 항체의 IC50 값 및 최대 성장 억제
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부록 1. 항체 가변 영역 서열
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부록 2: 항체 불변 영역 서열
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부록 3: 이중 가변 도메인 항체 서열
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Figure 112009060319675-pct00037
SEQUENCE LISTING <110> Symphogen A/S Pedersen, Mikkel W Steinaa, Lucilla Jensen, Allan Koefoed, Klaus Meijer, Per-Johan Carlson, Robert Pyke, Charles Nielsen, Lars S <120> Recombinant Anti-epidermal Growth Factor Receptor Antibody Compositions <130> P109PC00 <160> 141 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> PCR primer <400> 1 gacsgatggg cccttggtgg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> PCR primer <400> 2 gctgtaggtg ctgtctttgc 20 <210> 3 <211> 39 <212> DNA <213> artificial <220> <223> PCR primer <400> 3 tattcccatg gcgcgccsag gtccarctgc arcagyctg 39 <210> 4 <211> 37 <212> DNA <213> artificial <220> <223> PCR primer <400> 4 tattcccatg gcgcgccgar gtgmagctkg tkgagtc 37 <210> 5 <211> 37 <212> DNA <213> artificial <220> <223> PCR primer <400> 5 tattcccatg gcgcgccsag gtgcagctkm aggagtc 37 <210> 6 <211> 37 <212> DNA <213> artificial <220> <223> PCR primer <400> 6 tattcccatg gcgcgcccag gttactctga aagagtc 37 <210> 7 <211> 39 <212> DNA 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tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcg 360 <210> 26 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 26 cgcgccgaag tgcagctggt ggagtctggg ggaggcttag tgaagcctgg agggtccctg 60 aaactctcct gtgcagcctc tggattcact ttcagtagtt atgccctgtc ttgggttcgc 120 cagactccag agaggaggct ggagtgggtc gcatccatta gtggtgttgg tagcacctac 180 tttccagaca gtgtgaaggg ccgtttcacc atgtccagag ataatgccag gaacatcctg 240 tacctccaaa tgagcagtct gaggtctgag gacacggcca tgtattactg tgcaagaggt 300 tctgatggtt acttctatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcg 360 <210> 27 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 27 cgcgcccagg tgcagcttca gcagcctggg gctgaactgg tgaagcctgg ggcttcagtg 60 aagctgtcct gtaaggcttc tggctacacc ttcaccagcc actggatgca ctgggtgcag 120 cagaggcctg gacaaggcct tgagtggatt ggagagattc atcctagcaa cggtcgtact 180 aactacaatg agaagttcaa gaacaaggcc acactgactg tagacaaatc tcccagcaca 240 gcctacatgc aactcagcag tttgacatct gaggactctg cggtctatta ctgtgcaaga 300 tactatggtt acgacgatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcg 360 <210> 28 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tgggttttca ttaaccatct atggtgtaca ctgggttcgc 120 cagcctccag gaaagggtct ggagtggctg ggagtaatat gggctggtgg aaacacaaat 180 tataattcgg ctctcatgtc cagactgagc atcagcaaag acaactccaa gagtcaagtt 240 ttcttaaaaa tgaacagtct gcaaactgat gacacagcca tgtacttctg tgccagaggc 300 tatggctaca atttagacta ttggggccaa ggcaccactc tcacagtctc g 351 <210> 39 <211> 357 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 39 cgcgcccagg tgcagctgaa ggagtcagga cctggcctgg tggcgccctc acagagcctg 60 tccatcacat gcaccgtctc aggattctca ttaaccggcc atggtgtaaa ctgggttcgc 120 cagcctccag gaaagggtct ggagtggctg ggaatgatat ggggtgatgg aagcacggac 180 tataattcaa ctctcaaatc cagactgagt atcagcaagg acaactccaa gagccaagtt 240 ttcttaaaaa tgaacagtct gcagactgat gacaccgcca ggtactactg tgccagaggc 300 tacggctacc tttactactt tgactactgg ggccaaggca ccactctcac agtctcg 357 <210> 40 <211> 124 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Arg Ala Glu Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Glu Leu Val Arg Pro 1 5 10 15 Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30 Ser 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gcaaggacag cacctacagc 540 ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 600 gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 660 <210> 59 <211> 657 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 59 gatattgtga tgactcaggc tgcattctcc aatccagtca ctcttggaac atcagcttcc 60 atctcctgca ggtctagtaa gagtctccta catagtaatg gcatcactta tttgtattgg 120 tatctgcaga agccaggcca gtctcctcag ctcctgattt atcagatgtc caaccttgcc 180 tcaggagtcc cagacaggtt cagtagcagt gggtcaagaa ctgatttcac actgagaatc 240 agcagagtgg aggctgagga tgtgggtgtt tattactgtg ctcaaaatct agaacttccg 300 tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaacgaa ctgtggctgc accatctgtc 360 ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420 ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480 tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540 agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600 gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgt 657 <210> 60 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ggagtttatt tctgctctca aaatacacat 300 gtgtacacgt tcggaggggg gacaaagttg gaaataaaac gaactgtggc tgcaccatct 360 gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc 420 ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 480 caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 540 ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 600 gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 660 <210> 63 <211> 645 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 63 ctagcccaaa ttgtgctcac acagtctcca gcaatcatgt ctgcatctcc aggggagaag 60 gtcaccatga cctgcagtgc cagctcaagt gtaagttaca tttactggta ccagcagaag 120 ccaggatcct cccccagact cctgatttat gacgcatcca acctggcttc tggagtccct 180 gttcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaatcag ccgaatggag 240 gctgaagatg ctgccactta ttactgccag cagtggagca gttacccaat cacgttcggc 300 tcggggacaa agttggaaat aaaacgaact gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360 ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 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gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc 540 ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat 600 cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgt 648 <210> 70 <211> 648 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 70 ctagccgaca ttcagatgac acagactact tcctccctgt ctgcctctct gggagacaga 60 gtcaccatta gttgcagtgc aagtcagggc attagtaatt atttaaactg gtatcagcag 120 aaaccagatg gaactgttaa actcctgatc tattacacat caagtttaca ctcaggagtc 180 ccatcaaggt tcagtggcag tgggtctggg acagattatt ctctcaccat cagcaacctg 240 gaacctgaag atattgccac ttactattgt cagcagtata gtaagcttcc gtacacgttc 300 ggagggggga ccaagctgga aatcaaacga actgtggctg caccatctgt cttcatcttc 360 ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac 420 ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac 480 tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc 540 ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat 600 cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgt 648 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acc atc tcc aaa gcc aaa g gtgggacccg 1192 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 215 220 tggggtgcga gggccacatg gacagaggcc ggctcggccc accctctgcc ctgagagtga 1252 ccgctgtacc aacctctgtc cctacag gg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac 1305 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 230 acc ctg ccc cca tcc cgg gag gag atg acc aag aac cag gtc agc ctg 1353 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 235 240 245 acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg 1401 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 250 255 260 265 gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg 1449 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 270 275 280 ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tat agc aag ctc acc gtg gac 1497 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 285 290 295 aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat 1545 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 300 305 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Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Ser Arg Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Asn Gly Asp Tyr Tyr Val Ser Ser Gly Asp Ala Met Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 120 <210> 105 <211> 107 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Synthetic construct <400> 105 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Asn Thr Val Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 106 <211> 118 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Synthetic construct <400> 106 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser His 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Ser Ser Gly Arg Asn Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Tyr Gly Tyr Asp Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Ser Val Thr Val Ser 115 <210> 107 <211> 112 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Synthetic construct <400> 107 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Ser 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565 570 575 Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val 580 585 590 Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly 595 600 605 Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser 610 615 620 <210> 109 <211> 616 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Consensus sequence <400> 109 Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln 1 5 10 15 Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn 20 25 30 Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn Leu Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg 35 40 45 Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys Thr Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr 50 55 60 Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr Val Glu Arg Ile Pro Leu Glu Asn Leu 65 70 75 80 Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met Tyr Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala 85 90 95 Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro 100 105 110 Met Arg Asn Leu Gln Glu Ile Leu His Gly Ala Val Arg Phe Ser Asn 115 120 125 Asn Pro Ala Leu Cys Asn Val Glu Ser Ile Gln Trp Arg Asp Ile Val 130 135 140 Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn Met Ser Met Asp Phe Gln Asn His Leu 145 150 155 160 Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp Pro Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp 165 170 175 Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gln Lys Leu Thr Lys Ile Ile Cys Ala 180 185 190 Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys Arg Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys 195 200 205 His Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys 210 215 220 Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys 225 230 235 240 Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn 245 250 255 Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro 260 265 270 Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly 275 280 285 Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys 290 295 300 Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu 305 310 315 320 Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys 325 330 335 Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe 340 345 350 Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu 355 360 365 Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln 370 375 380 Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu 385 390 395 400 Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val 405 410 415 Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile 420 425 430 Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala 435 440 445 Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gln Lys Thr Lys 450 455 460 Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val 465 470 475 480 Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Lys 485 490 495 Asp Cys Val Ser Cys Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys 500 505 510 Cys Asn Ile Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu 515 520 525 Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Met Asn Ile Thr Cys 530 535 540 Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp 545 550 555 560 Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn 565 570 575 Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu 580 585 590 Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly 595 600 605 Cys Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser 610 615 <210> 110 <211> 18 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 110 Cys Thr Arg Asn Gly Asp Tyr Tyr Ile Ser Ser Gly Asp Ala Met Asp 1 5 10 15 Tyr Trp <210> 111 <211> 18 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 111 Cys Thr Arg Asn Gly Asp Tyr Tyr Val Ser Ser Gly Asp Ala Met Asp 1 5 10 15 Tyr Trp <210> 112 <211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 112 Cys Ala Arg Gly Ser Asp Gly Tyr Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp 1 5 10 15 <210> 113 <211> 14 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 113 Cys Ala Arg Tyr Tyr Gly Tyr Asp Asp Ala Met Asp Tyr Trp 1 5 10 <210> 114 <211> 14 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 114 Cys Val Arg Tyr Tyr Gly Tyr Asp Glu Ala Met Asp Tyr Trp 1 5 10 <210> 115 <211> 14 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 115 Cys Val Arg Tyr Tyr Gly Tyr Asp Glu Val Met Asp Tyr Trp 1 5 10 <210> 116 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 116 Cys Gln His Tyr Asn Thr Val Pro Pro Thr Phe 1 5 10 <210> 117 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 117 Cys Gln Gln Phe Thr Thr Ser Pro Phe Thr Phe 1 5 10 <210> 118 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 118 Cys Gln His Tyr Asn Thr Val Pro Pro Thr Phe 1 5 10 <210> 119 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 119 Cys Gln His Ser Arg Glu Phe Pro Leu Thr Phe 1 5 10 <210> 120 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 120 Cys Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe 1 5 10 <210> 121 <211> 35 <212> DNA <213> artificial <220> <223> PCR primer <400> 121 ggaggcgctc gagacggtga ctgaggttcc ttgac 35 <210> 122 <211> 52 <212> DNA <213> artificial <220> <223> PCR primer <400> 122 ccagccgggg cgcgccgagg tccaactgca gcaacctggg tctgagctgg tg 52 <210> 123 <211> 49 <212> DNA <213> artificial <220> <223> PCR primer <400> 123 ccagccgggg cgcgcccagg tccaactgca gcagcctggg gctgaactg 49 <210> 124 <211> 50 <212> DNA <213> artificial <220> <223> PCR primer <400> 124 catgggaata gctagccgac attcagatga ctcagactac atcctccctg 50 <210> 125 <211> 51 <212> DNA <213> artificial <220> <223> PCR primer <400> 125 catgggaata gctagccgac atcgtgatga cacaagctgc attctccaat c 51 <210> 126 <211> 43 <212> DNA <213> artificial <220> <223> PCR primer <400> 126 accgcctcca ccggcggccg cttattaaca ctctcccctg ttg 43 <210> 127 <211> 44 <212> DNA <213> artificial <220> <223> PCR primer <400> 127 ctgggggccc ttggtgctgg ctgacgagac ggtgactgag gttc 44 <210> 128 <211> 37 <212> DNA <213> artificial <220> <223> PCR primer <400> 128 gccagcacca agggccccca ggtccaactg cagcagc 37 <210> 129 <211> 38 <212> DNA <213> artificial <220> <223> PCR primer <400> 129 cggggccctt ggtgctggct gacgagacgg tgactgag 38 <210> 130 <211> 37 <212> DNA <213> PCR primer <400> 130 gccagcacca agggccccga ggtccaactg cagcaac 37 <210> 131 <211> 40 <212> DNA <213> artificial <220> <223> PCR primer <400> 131 gtctggtgca gccacagttc gtttgatttc cagcttggtg 40 <210> 132 <211> 38 <212> DNA <213> artificial <220> <223> PCR primer <400> 132 cgaactgtgg ctgcaccaga catcgtgatg acacaagc 38 <210> 133 <211> 41 <212> DNA <213> artificial <220> <223> PCR primer <400> 133 gtctggtgca gccacagttc gttttatttc cagcttggtc c 41 <210> 134 <211> 41 <212> DNA <213> artificial <220> <223> PCR primer <400> 134 cgaactgtgg ctgcaccaga cattcagatg actcagacta c 41 <210> 135 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 135 tcttcgggaa gcagctatgc 20 <210> 136 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> PCR primer <400> 136 ttctccactg ggcgtaagag 20 <210> 137 <211> 41 <212> DNA <213> artificial <220> <223> PCR primer <400> 137 atctgcattc tagactggag gaaaagaaag tttgccaagg c 41 <210> 138 <211> 41 <212> DNA <213> artificial <220> <223> PCR primer <400> 138 tactcgatga cgcgtttagg atgggatctt aggcccgttc c 41 <210> 139 <211> 22 <212> DNA <213> artificial <220> <223> PCR primer <400> 139 tcatgctcca ataaattcac tg 22 <210> 140 <211> 37 <212> DNA <213> artificial <220> <223> PCR primer <400> 140 ggagtcggcg gccgcaccat gcgaccctcc gggacgg 37 <210> 141 <211> 37 <212> DNA <213> artificial <220> <223> PCR primer <400> 141 gcatgtgact cgagtcatgc tccaataaat tcactgc 37

Claims (86)

  1. 제1의 항-인간 EGFR 항체 분자 및 제2의, 별개의 항-인간 EGFR 항체 분자를 포함하는 EGFR-의존성 암을 치료하기 위한 항체 조성물로서,
    a) 제1의 항-EGFR 항체 분자는 서열번호 40의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열과 서열번호 72의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열을 포함하고;
    b) 제2의 항-EGFR 항체 분자는 서열번호 41의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열과 서열번호 73의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열을 포함하는, EGFR-의존성 암을 치료하기 위한 항체 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    a) 제1의 항-EGFR 항체 분자는 서열번호 72의 아미노산 3-109를 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL)과 서열번호 40의 아미노산 3-124를 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하고;
    b) 제2의 항-EGFR 항체 분자는 서열번호 73의 아미노산 3-114를 포함하는 VL과 서열번호 41의 아미노산 3-120을 포함하는 VH를 포함하는, 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    a) 제1의 항-EGFR 항체 분자는 서열번호 40의 아미노산 3-124 및 서열번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 불변 영역을 포함하는 VH와 서열번호 72의 아미노산 3-216을 포함하는 경쇄를 포함하고;
    b) 제2의 항-EGFR 항체 분자는 서열번호 41의 아미노산 3-120 및 서열번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 불변 영역을 포함하는 VH와 서열번호 73의 아미노산 3-221을 포함하는 경쇄를 포함하는, 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제1의 항-EGFR 항체 분자 및 제2의 항-EGFR 항체 분자는 인간 EGFR에 대한 서로의 결합을 억제하지 않는, 조성물.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 항체 분자가 인간 EGFR에 대한 나머지 항체 분자의 최대 결합 능력을 증가시킬 수 있는, 조성물.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물 내 제2의 항체 분자와 대비한 제1의 항체 분자의 비율이 40 내지 60%인, 조성물.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제1의 항체 분자 및 제2의 항체 분자가 동형(isotope) 서브타입 IgG1 또는 IgG2인, 조성물.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1의 항체 분자 및 제2의 항체 분자 이외에 추가의 항-EGFR 항체 분자를 함유하지 않는, 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 제3의, 별개의 항-EGFR 항체 분자를 추가로 포함하고, 상기 제3의 항-EGFR 항체 분자가 서열번호 42의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열번호 74의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열을 포함하는, 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 제3의 항-EGFR 항체 분자가 서열번호 74의 아미노산 3-114를 포함하는 VL과 서열번호 42의 아미노산 3-120을 포함하는 VH를 포함하는, 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 제3의 항-EGFR 항체 분자가 서열번호 42의 아미노산 3-120을 포함하는 VH 및 서열번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 불변 영역을 포함하는 중쇄와, 서열번호 74의 아미노산 3-220을 포함하는 경쇄를 포함하는, 조성물.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제3의 항체 분자가 제1의 항체 분자, 제2의 항체 분자, 또는 둘 다의 인간 EGFR에 대한 결합을 향상시키는, 조성물.
  13. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1의 항체 분자, 제2의 항체 분자 및 제3의 항체 분자 이외에 추가의 항-EGFR 항체 분자를 함유하지 않는, 조성물.
  14. 제1항 내지 제3항 및 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 EGFR 수용체 내재화를 발생시킬 수 있는, 조성물.
  15. 제1항 내지 제3항 및 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 생체 내에서(in vivo) A431NS 종양의 퇴행을 발생시킬 수 있는, 조성물.
  16. 제1항 내지 제3항 및 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 생체 내에서 A431NS 세포에서 최종 분화(terminal differentiation)를 유도할 수 있는, 조성물.
  17. 제1항 내지 제3항 및 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 생체 내에서 종양 인볼루크린(involucrin) 발현을 상향-조절할 수 있는, 조성물.
  18. 서열번호 72의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열과 서열번호 40의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열을 포함하는 제1의 항원-결합 도메인; 및 서열번호 73의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열과 서열번호 41의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열을 포함하는 제2의 항원-결합 도메인을 포함하는 이중 특이성 결합 분자.
  19. 제18항에 있어서, 상기 이중 특이성 결합 분자가 이중-가변-도메인 항체, 이중 특이성 Fab 단편, 또는 이중 특이성 scFV인, 이중 특이성 결합 분자.
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  25. 제1항 내지 제3항 및 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항의 항체 조성물, 또는 제18항 또는 제19항의 이중 특이성 결합 분자를 포함하는, 생체 내에서 종양 세포의 분화를 유도하기 위한, 약제 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 상기 분화가 최종인, 약제 조성물.
  27. 제25항에 있어서, 상기 분화가 인볼루크린 발현의 증가를 수반하는, 약제 조성물.
  28. 제25항에 있어서, 상기 종양 세포가 비소세포폐암 세포, 두경부암 세포, 결장암 세포, 또는 직장암 세포인, 약제 조성물.
  29. 제1항 내지 제3항 및 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항의 항체 조성물, 또는 제18항 또는 제19항의 이중 특이성 결합 분자와 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는, 암 치료용 약제 조성물.
  30. 제29항에 있어서, 암 세포의 분화를 유도할 수 있는 하나 이상의 화합물을 추가로 포함하는, 약제 조성물.
  31. 제30항에 있어서, 상기 화합물이 레티노산, 페닐부티레이트, 올-트랜스-레티노산(all-trans-retinoic acid) 및 활성 형태 비타민 D로 구성된 군에서 선택되는, 약제 조성물.
  32. 제29항에 있어서, 하나 이상의 화학요법 화합물 또는 항신생물 화합물을 추가로 포함하는, 약제 조성물.
  33. 제32항에 있어서, 상기 화학요법 화합물이 아드리아마이신, 시스플라틴, 탁솔, 독소루비신, 토포테칸, 플루오로피리미딘, 옥살리플라틴 및 이리노테칸으로 구성된 군에서 선택되는, 약제 조성물.
  34. 제29항에 있어서, 상기 암이 비소세포폐암, 두경부암, 결장암, 또는 직장암인, 약제 조성물.
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Families Citing this family (64)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
SI2121920T1 (sl) * 2007-03-01 2011-12-30 Symphogen As Postopek za kloniranje sorodnih protiteles
MX2009008909A (es) * 2007-03-01 2009-08-28 Symphogen As Composiciones de anticuerpo recombinante anti-receptor de factor de crecimiento epidermico.
JP2008289483A (ja) * 2007-05-25 2008-12-04 Symphogen As 真核生物系において発現可能な形質転換体のスクリーニング
US20110256142A1 (en) * 2007-09-06 2011-10-20 Genmab A/S Novel methods and antibodies for treating cancer
US20090203038A1 (en) * 2007-12-27 2009-08-13 Abbott Laboratories Negative Mimic Antibody For Use as a Blocking Reagent In BNP Immunoassays
RU2011111725A (ru) * 2008-08-29 2012-10-10 Симфоген А/С (Dk) Способ клонирования антител птиц
WO2010022736A2 (en) * 2008-08-29 2010-03-04 Symphogen A/S Recombinant anti-epidermal growth factor receptor antibody compositions
WO2010040356A1 (en) * 2008-10-06 2010-04-15 Symphogen A/S Method for identifying and selecting drug candidates for combinatorial drug products
FR2942928B1 (fr) 2009-03-03 2011-04-01 Alcatel Lucent Procede et systeme de gestion multicriteres de notifications de presence
FR2945538B1 (fr) * 2009-05-12 2014-12-26 Sanofi Aventis Anticorps humanises specifiques de la forme protofibrillaire du peptide beta-amyloide.
US8821879B2 (en) 2009-09-04 2014-09-02 Xoma Technology Ltd. Anti-botulism antibody coformulations
MX2012003538A (es) 2009-10-09 2012-08-03 Symphogen As Cuantificacion multiple de proteinas recombinantes individuales en una mezcla mediante peptidos distintivos y espectrometria de masas.
WO2011106707A2 (en) * 2010-02-26 2011-09-01 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that specifically bind to dr3
US8609095B2 (en) 2010-03-04 2013-12-17 Symphogen A/S Anti-HER2 antibodies and compositions
EP2563393B1 (en) 2010-04-26 2016-06-08 Abraxis BioScience, LLC Sparc binding antibodies and uses thereof
WO2011140151A1 (en) * 2010-05-04 2011-11-10 Dyax Corp. Antibodies against epidermal growth factor receptor (egfr)
US9044460B2 (en) * 2010-05-04 2015-06-02 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Antibodies against epidermal growth factor receptor (EGFR) and uses thereof
WO2012018260A1 (en) * 2010-08-05 2012-02-09 Universiteit Utrecht Holding B.V. Epidermal growth factor receptor targeted immune therapy
CN103298489A (zh) * 2010-10-29 2013-09-11 伊缪诺金公司 新型egfr结合分子及其免疫偶联物
WO2012058592A2 (en) 2010-10-29 2012-05-03 Immunogen, Inc. Non-antagonistic egfr-binding molecules and immunoconjugates thereof
EP3156421B1 (en) 2010-11-01 2018-06-06 Symphogen A/S Pan-her antibody composition
US9155802B2 (en) 2010-11-01 2015-10-13 Symphogen A/S Pan-HER antibody composition
CA2981662C (en) 2011-01-14 2019-02-05 The Regents Of The University Of California Therapeutic antibodies against ror-1 protein and methods for use of same
RU2013138177A (ru) 2011-01-24 2015-03-10 Йм Биосайнсис Инк. Антитела, действующие селективно на клетки с повышенной плотностью мишени рецептор эпидермального фактора роста (egfr)
EP2683736B1 (en) 2011-03-09 2018-01-17 Cell Signaling Technology, Inc. Methods and reagents for creating monoclonal antibodies
EP2683741A2 (en) 2011-03-11 2014-01-15 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Use of inhibitors of egfr-family receptors in the treatment of hormone refractory breast cancers
MX2013010444A (es) 2011-03-15 2014-03-21 Merrimack Pharmaceuticals Inc Superar la resistencia a inhibidores de la via erbb.
US20120258502A1 (en) * 2011-04-08 2012-10-11 Vinod Pandiripally Method of producing recombinant plasmid dna using substantially solid growth medium
US8691231B2 (en) * 2011-06-03 2014-04-08 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Methods of treatment of tumors expressing predominantly high affinity EGFR ligands or tumors expressing predominantly low affinity EGFR ligands with monoclonal and oligoclonal anti-EGFR antibodies
EP2794010A4 (en) 2011-11-21 2015-10-21 Immunogen Inc METHOD OF TREATING TUMORS RESISTANT TO EGFR THERAPIES BY A CYTOTOXIC EGFR-AGENT ANTIBODY CONJUGATE
JP2015509091A (ja) * 2012-01-09 2015-03-26 ザ スクリプス リサーチ インスティテュート ヒト化抗体
KR101933990B1 (ko) 2012-05-02 2018-12-31 심포젠 에이/에스 인간화 ｐａｎ­ｈｅｒ 항체 조성물
EP2894472A4 (en) * 2012-09-05 2016-03-30 Jsr Corp METHOD OF SCREENING MATERIAL FOR EPITHELIAL CONSERVATION OF CELLS
WO2014063206A1 (en) * 2012-10-26 2014-05-01 The University Of Queensland Methods for classifying tumors and uses therefor
CN102993305B (zh) * 2012-11-16 2015-05-13 上海赛伦生物技术有限公司 人源抗人表皮生长因子受体抗体及其编码基因与应用
US9856319B2 (en) * 2012-12-28 2018-01-02 Abbvie Inc. Monovalent binding proteins
CN104059148B (zh) * 2013-03-18 2016-09-07 回而生医药科技（北京）有限公司 人源化抗人表皮生长因子受体抗体及其应用
AU2014318545A1 (en) * 2013-09-12 2016-03-24 Halozyme, Inc. Modified anti-epidermal growth factor receptor antibodies and methods of use thereof
US20160340439A1 (en) * 2014-01-22 2016-11-24 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and Compositions for Antibody and Antibody-loaded Dendritic Cell Mediated Therapy
GB201402591D0 (en) * 2014-02-14 2014-04-02 Memo Therapeutics Ag Method for recovering two or more genes, or gene products, encoding an immunoreceptor
EP3483593B1 (en) * 2014-03-26 2021-04-28 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Luminescent oxygen channeling immunoassay utilizing three antibodies and methods of production and use thereof
MA39599A (fr) 2014-05-14 2016-10-05 Merrimack Pharmaceuticals Inc Dosage et administration d'agents thérapeutiques anti-egfr
WO2016065456A1 (en) * 2014-10-31 2016-05-06 Formation Biologics Inc. Egfr antibody-based combination therapy
CN113713091A (zh) * 2015-02-06 2021-11-30 新加坡国立大学 工程免疫细胞及其用途和生产方法
WO2016172584A1 (en) 2015-04-24 2016-10-27 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating patients having mutations in the extracellular domain of epidermal growth factor receptor (egfr) with a combination of three fully human monoclonal anti-egfr antibodies
EP3429623A1 (en) 2016-03-15 2019-01-23 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating er+, her2-, hrg+ breast cancer using combination therapies comprising an anti-erbb3 antibody
CA3025162A1 (en) 2016-05-26 2017-11-30 Qilu Puget Sound Biotherapeutics Corporation Mixtures of antibodies
CN115317603A (zh) 2016-07-07 2022-11-11 小利兰·斯坦福大学托管委员会 抗体佐剂缀合物
KR20240099512A (ko) 2016-11-22 2024-06-28 싱가포르국립대학교 T 세포 악성종양의 면역요법을 위한 키메라 항원 수용체 및 cd7 발현의 차단
MX2019007356A (es) * 2016-12-23 2019-09-05 Visterra Inc Polipeptidos de union y metodos para fabricarlos.
US11124575B2 (en) * 2017-02-22 2021-09-21 University Of Saskatchewan EGFR-binding agents and uses thereof
WO2018166119A1 (zh) * 2017-03-14 2018-09-20 北京伟峰益民科技有限公司 一种多肽或其衍生物及其在制备治疗肿瘤的药物中的应用
US20190038733A1 (en) 2017-08-10 2019-02-07 National University Of Singapore T cell receptor-deficient chimeric antigen receptor t-cells and methods of use thereof
WO2019043059A1 (en) 2017-08-30 2019-03-07 Symphogen A/S COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE TREATMENT OF CANCER BY ANTI-EGFR ANTIBODIES
CN109912716B (zh) * 2017-12-13 2022-08-23 凯惠科技发展(上海)有限公司 一种egfr抗体及其制备方法和应用
KR20210008408A (ko) 2018-05-23 2021-01-21 싱가포르국립대학교 T-세포 악성 종양의 면역요법을 위한 cd2 표면 발현 및 키메라 항원 수용체의 발현에 대한 차단
US20210002128A1 (en) 2018-12-03 2021-01-07 X-Celeprint Limited Enclosed cavity structures
US11274035B2 (en) 2019-04-24 2022-03-15 X-Celeprint Limited Overhanging device structures and related methods of manufacture
US10456776B1 (en) 2019-02-21 2019-10-29 King Saud University Method of fabricating a photocatalyst for water splitting
CN113993549A (zh) 2019-03-15 2022-01-28 博尔特生物治疗药物有限公司 靶向her2的免疫缀合物
CN111018990A (zh) * 2020-02-10 2020-04-17 张喜田 一种新型的重组抗表皮生长因子受体单克隆抗体及其应用
EP4413050A1 (en) 2021-10-04 2024-08-14 Les Laboratoires Servier Cancer therapy targeting nkg2a
AR127893A1 (es) 2021-12-10 2024-03-06 Servier Lab Terapia del cáncer dirigida a egfr

Family Cites Families (51)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CU22545A1 (es) * 1994-11-18 1999-03-31 Centro Inmunologia Molecular Obtención de un anticuerpo quimérico y humanizado contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico para uso diagnóstico y terapéutico
US4943533A (en) * 1984-03-01 1990-07-24 The Regents Of The University Of California Hybrid cell lines that produce monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
AU4128089A (en) * 1988-09-15 1990-03-22 Rorer International (Overseas) Inc. Monoclonal antibodies specific to human epidermal growth factor receptor and therapeutic methods employing same
US5459061A (en) * 1990-01-26 1995-10-17 W. Alton Jones Cell Science Center, Inc. Hybridomas producing monoclonal antibodies which specifically bind to continuous epitope on the human EGF receptor and compete with EGF for binding to the EGF receptor
EP0531472B1 (en) 1991-03-06 2003-08-13 MERCK PATENT GmbH Humanized monoclonal antibodies
WO1994000136A1 (en) 1992-06-30 1994-01-06 Oncologix, Inc. A COMBINATION OF ANTI-erbB-2 MONOCLONAL ANTIBODIES AND METHOD OF USING
GB9401182D0 (en) 1994-01-21 1994-03-16 Inst Of Cancer The Research Antibodies to EGF receptor and their antitumour effect
US7060808B1 (en) * 1995-06-07 2006-06-13 Imclone Systems Incorporated Humanized anti-EGF receptor monoclonal antibody
CA2222231A1 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Imclone Systems Incorporated Antibody and antibody fragments for inhibiting the growth of tumors
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
WO2004009618A2 (en) 2002-07-18 2004-01-29 Crucell Holland B.V. Recombinant production of mixtures of antibodies
US7201905B2 (en) 2000-03-23 2007-04-10 Greenville Hospital System Bi-functional cancer treatment agents
BR0110927A (pt) * 2000-05-19 2003-03-11 Scancell Ltd Anticorpo, ácido nucléico, vetor, célula, método de fabricar um anticorpo, composição farmacêutica, uso de um anticorpo ou de um ácido nucleico, e, método para o tratamento ou profilaxia do câncer
US6849259B2 (en) * 2000-06-16 2005-02-01 Symphogen A/S Polyclonal antibody composition for treating allergy
JP2004519233A (ja) 2001-02-19 2004-07-02 メルク　パテント　ゲゼルシャフト　ミット　ベシュレンクテル　ハフトング 免疫原性の低減された修飾された抗ｅｇｆｒ抗体
DK2163256T3 (en) 2001-05-11 2015-12-07 Ludwig Inst For Cancer Res Ltd Specific binding proteins and use thereof
RU2335507C2 (ru) 2001-06-13 2008-10-10 Генмаб А/С Человеческие моноклональные антитела к рецептору эпидермального фактора роста (egfr), способ их получения и их использование, гибридома, трансфектома, трансгенное животное, экспрессионный вектор
US7595378B2 (en) 2001-06-13 2009-09-29 Genmab A/S Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor (EGFR)
US7662374B2 (en) * 2001-08-03 2010-02-16 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Monoclonal antibodies to activated erbB family members and methods of use thereof
WO2003074705A1 (fr) 2002-03-01 2003-09-12 Japan Envirochemicals, Ltd. Proteines capables de se fixer sur des hormones environnementales et procede permettant de les produire
AU2003236649A1 (en) 2002-05-15 2003-12-02 Falko Fend Egf receptor antagonists in the treatment of gastric cancer
CA2485691A1 (en) 2002-05-20 2003-12-04 Abgenix, Inc. Treatment of renal carcinoma using antibodies against the egfr
ES2392525T3 (es) 2002-07-15 2012-12-11 F. Hoffmann-La Roche Ag Tratamiento del cáncer con el anticuerpo dirigido contra ErbB2 rhuMAb 2C4
EP1549345A1 (en) * 2002-10-10 2005-07-06 MERCK PATENT GmbH Bispecific anti-erb-b antibodies and their use in tumor therapy
US20060275766A1 (en) * 2003-01-07 2006-12-07 Haurum John S Method for manufacturing recombinant polyclonal proteins
DK1583830T3 (da) 2003-01-07 2007-01-15 Symphogen As Fremgangsmåde til fremstilling af rekombinante polyklonale proteiner
CA2450289A1 (en) 2003-03-20 2005-05-19 Imclone Systems Incorporated Method of producing an antibody to epidermal growth factor receptor
AT500651B9 (de) 2003-05-27 2010-04-15 Altropus Gmbh Aktiv immunisierender antikörper
TWI333977B (en) 2003-09-18 2010-12-01 Symphogen As Method for linking sequences of interest
US7655751B2 (en) * 2004-01-23 2010-02-02 Green Peptide Co., Ltd. Epidermal growth factor receptor-derived peptides
WO2006009694A2 (en) 2004-06-14 2006-01-26 Imclone Sysetms Incorporated Crystal of egfr extracellular domain and cetuximab fab fragment and uses thereof
WO2006007853A2 (en) 2004-07-20 2006-01-26 Symphogen A/S A procedure for structural characterization of a recombinant polyclonal protein or a polyclonal cell line
WO2006007850A1 (en) 2004-07-20 2006-01-26 Symphogen A/S Anti-rhesus d recombinant polyclonal antibody and methods of manufacture
WO2006078307A1 (en) 2005-01-21 2006-07-27 Genentech, Inc. Fixed dosing of her antibodies
US20070009972A1 (en) * 2005-02-16 2007-01-11 Ginger Chao Epidermal growth factor receptor polypeptides and antibodies
BRPI0606542A8 (pt) 2005-02-23 2018-03-20 Genentech Inc métodos para aumentar o tempo de progressão de uma doença (ttp)
BRPI0607235A2 (pt) 2005-02-24 2009-08-25 Amgen Inc mutações do receptor do fator de crescimento epidérmico
US20060216288A1 (en) 2005-03-22 2006-09-28 Amgen Inc Combinations for the treatment of cancer
WO2006110478A2 (en) 2005-04-11 2006-10-19 Novartis Ag Mutations and polymorphisms of epidermal growth factor receptor
CN101155932A (zh) 2005-04-14 2008-04-02 默克专利有限公司 基于在肿瘤组织中增加的egfr基因拷贝数的抗egfr抗体治疗
CN101277716A (zh) 2005-04-27 2008-10-01 回而生医药科技有限公司 治疗癌症的抗体
PT1907424E (pt) * 2005-07-01 2015-10-09 Squibb & Sons Llc Anticorpos monoclonais humanos para o ligando 1 de morte programada (pd-l1)
MX2008000030A (es) * 2005-07-11 2008-04-02 Macrogenics Inc Metodos para el tratamiento de enfermedad autoinmune utilizando anticuerpos anti-cd16a humanizados.
US7850965B2 (en) * 2005-12-05 2010-12-14 Symphogen A/S Anti-orthopoxvirus recombinant polyclonal antibody
US7498142B2 (en) 2006-01-31 2009-03-03 Yeda Research And Development Co., Ltd. Methods of identifying combinations of antibodies with an improved anti-tumor activity and compositions and methods using the antibodies
CN101395182A (zh) 2006-03-06 2009-03-25 西福根有限公司 用于治疗呼吸道合胞病毒感染的重组多克隆抗体
MX2009008909A (es) 2007-03-01 2009-08-28 Symphogen As Composiciones de anticuerpo recombinante anti-receptor de factor de crecimiento epidermico.
SI2121920T1 (sl) * 2007-03-01 2011-12-30 Symphogen As Postopek za kloniranje sorodnih protiteles
JP2008289483A (ja) 2007-05-25 2008-12-04 Symphogen As 真核生物系において発現可能な形質転換体のスクリーニング
WO2010022736A2 (en) 2008-08-29 2010-03-04 Symphogen A/S Recombinant anti-epidermal growth factor receptor antibody compositions
US9155802B2 (en) 2010-11-01 2015-10-13 Symphogen A/S Pan-HER antibody composition

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BBRC. 2006, Vol. 349, pp.816-824.*
Clinical Cancer Research. 2002, Vol. 8, No. 6, pp1720-1730
PNAS. 2005, Vol. 102, pp.1915-1920.

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Publication number Publication date
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