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KR101661356B1 - 유전자 요법을 사용한 신경퇴행성 질환의 치료 및 예방 - Google Patents

유전자 요법을 사용한 신경퇴행성 질환의 치료 및 예방 Download PDF

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KR101661356B1
KR101661356B1 KR1020097018535A KR20097018535A KR101661356B1 KR 101661356 B1 KR101661356 B1 KR 101661356B1 KR 1020097018535 A KR1020097018535 A KR 1020097018535A KR 20097018535 A KR20097018535 A KR 20097018535A KR 101661356 B1 KR101661356 B1 KR 101661356B1
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Abstract

본원에서는 알츠하이머병과 같은 신경퇴행성 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 특정 측면에서, 본원에서 투여되는 조성물은 세포성 면역 반응 요소를 코딩한다. 조성물은 조성물이 투여되는 대상체에서 세포성 면역 반응 요소 코딩 서열이 발현되도록 하는 방식으로 제조 및 투여될 수 있다. 조성물은 발현계, 전달계 및 특정 세포성 면역 반응 요소 유전자를 포함한다.
유전자 요법, 세포성 면역 반응 요소, 신경퇴행성 질환, 알츠하이머병

Description

유전자 요법을 사용한 신경퇴행성 질환의 치료 및 예방 {TREATMENT AND PREVENTION OF NEURODEGENERATIVE DISEASES USING GENE THERAPY}
<관련 출원의 상호 참조>
본 발명은 2007년 2월 6일에 출원된 특허출원 일련번호 제60/900,138호 (이의 전문이 본원에 참조로 포함됨)의 우선권을 주장한다.
본원에서는 알츠하이머병과 같은 신경퇴행성 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 특정 측면에서, 상기 조성물 및 방법은 입양 세포 요법 및 DNA 면역에 관한 것이다.
신경염증은 알츠하이머병 (AD) 병리학과 관련된다 (문헌 [Chen, K. et al., 281 Peptide J. Biol. Chem. 3651-59 (2006)] 및 [Frenkel, D. et al., 115 J. Clin. Inves. 2423-33 (2005)] 참조). 신경염증은 대부분 후모세관 정맥에 부착되는 다수의 활성화 소교세포 및 성상세포 뿐만 아니라 소수의 T 세포의 축적을 포함한다 (문헌 [Agadjanyan, M.G. et al., 174 J. Immunol. 1580-86 (2005)]; [Dickson, D. et al., 7 Glia 75-83 (1993)]; 및 [Fillit, H. et al., 129 Neurosci. Lett. 318-20 (1991)] 참조). 소교세포 및 성상세포 둘 다는 AD의 주요 병리학적 특징의 하나인 β-아밀로이드 단백질 (Aβ)을 생성한다고 밝혀졌다. Aβ 그자체는 다수의 염증 성분의 활성화를 야기하는 염증유발제(pro-inflammatory agent)로서 작용한다고 밝혀졌다. 수반되는 생화학적 변형에는 염증 및 자유 라디칼 공격의 특성을 갖는 다수의 분자의 출현 또는 상향조절이 포함된다. 상보체 단백질, 급성 단계 반응물 및 염증 시토킨이 특히 중요할 수 있다. 비스테로이드성 항염증 약물을 복용하는 환자는 그렇지 않은 환자보다 AD의 위험이 낮다. 이들 결과는 AD에 대한 항염증 요법 수행에의 관심을 증가시켰다 (Fillit, H. 1991).
<발명의 개요>
알츠하이머병과 같은 신경퇴행성 질환이 염증 또는 면역계에 의해 매개된다고 고전적으로 여겨지지 않지만, 일부 경우에서 면역계는 퇴행 과정에 중요한 역할을 한다. 체액성 면역 반응을 유도하도록 디자인된 면역치료법은 AD를 치료하기 위해 이전부터 개발되었다. 이러한 연구는 인간 시험을 유도하여 유익한 효과 및 해로운 효과 둘 다를 초래하였다. 동물 모델에서, 세포성 면역 반응을 유도하도록 디자인된 면역요법은, T 세포가 유도된 T 세포 반응의 유형에 따라 유익한 효과 또는 해로운 효과를 나타낼 수 있지만, 중추신경계 손상에 이로울 수 있다고 밝혀졌다. 이들 연구는 면역계에 기초한 신경퇴행성 질환 요법을 탐구하기 위한 새로운 경로를 제공한다.
적응 면역계는 광범위하게 두가지 유형의 반응, 세포성 및 체액성 (항체) 유형의 반응으로 분류될 수 있다. 세포성 반응 중에서, 세가지 주요 유형 또는 부류의 면역 반응, 예를 들어 Th1 반응 (예를 들어 IFN-γ과 관련됨) 및 이와 대조적으 로 Th2 또는 Th3 반응 (예를 들어 IL-4, IL-10, IL-13 및 TGF-β와 관련됨)이 염증 과정 조절의 메카니즘을 이해하는데 중요한 역할을 하는 것으로 확인되었다. 상이한 부류의 T 세포 반응은 알츠하이머병에 대한 백신처리 전략을 개발하는데 중요한 암시를 갖는다.
알츠하이머병과 같은 신경퇴행성 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 조성물 및 방법이 본원에 제공된다. 특정 측면에서, 상기 조성물 및 방법은 신경퇴행성 질환을 치료 또는 개선하기 위한 DNA 백신 및 입양 세포 유전자 요법에 관한 것이다. 다른 특정 측면에서, 상기 조성물 및 방법은 Th2 또는 Th3 시토킨과 같은 세포성 면역 반응 요소를 코딩하는 DNA 백신에 관한 것이다.
한 측면에서, 세포성 면역 반응을 유도하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 신경퇴행성 질환의 치료 또는 개선 방법이 제공된다. 또다른 측면에서, 세포성 면역 반응 요소 (바람직하게는 단백질, 펩티드, 핵산 또는 폴리뉴클레오티드임)를 포함하는 조성물을 투여하여 세포성 면역 반응을 유도하는 조성물을 투여함으로써 신경퇴행성 질환을 치료 또는 개선하는 방법이 제공된다. 관련 측면에서, 또한 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 또는 6개 이상의 세포성 면역 반응 요소를 투여하는 것을 포함하는, 신경퇴행성 질환의 치료 또는 개선 방법이 제공된다. 또다른 측면에서, 또한 세포성 면역 반응 요소 유전자 또는 이의 단편을 코딩하는 서열과 전사적으로 연결된 프로모터(promoter)/인핸서(enhancer)를 이용하여 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편을 제조하는 것을 포함할 수 있는, 신경퇴행성 질환의 치료 또는 예방용 조성물의 제조 방법이 제공된다. 관련 측면에서, 세포성 면역 반응 요소 유전자 또는 이의 단편을 코딩하는 서열과 전사적으로 연결된 프로모터/인핸서를 이용하여 폴리뉴클레오티드를 제조하는 단계 및 형질감염 촉진 물질과 폴리뉴클레오티드를 조합하는 단계를 포함하는, 대상체에서 세포성 면역 반응 요소 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편의 발현을 위한 조성물을 제조하는 방법이 제공된다. 또한, 포유동물, 바람직하게는 인간에게 투여하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 또다른 측면에서, 조성물은 제약상 허용되는 담체 및 세포성 면역 반응 요소 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함한 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 특정 측면에서, 대상체, 바람직하게는 인간에게 투여하기 위한 약제를 보관하기에 적합한 용기, 세포성 면역 반응 요소 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함한 폴리뉴클레오티드, 제약상 허용되는 담체, 및 용기에 부착된 라벨 또는 포장 삽입물을 포함할 수 있는 키트가 제공된다. 또다른 측면에서, 세포성 면역 반응 요소 폴리펩티드 또는 이의 단편에 상동성인 폴리펩티드를 투여하는 방법이 제공된다.
특정 실시양태에서, 세포성 면역 반응 요소를 유도하는 조성물이 제공된다. 방법 및 조성물은 단백질, 핵산 또는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있으며; 바람직하게는 폴리뉴클레오티드 및/또는 핵산이 DNA 또는 RNA이고; 바람직하게는 폴리뉴클레오티드가 원형 DNA이고; 바람직하게는 폴리뉴클레오티드가 플라스미드이고; 바람직하게는 폴리뉴클레오티드가 세포성 면역 반응 요소 유전자를 코딩하는 서열에 전사적으로 연결된 프로모터/인핸서를 포함하고; 바람직하게는 폴리뉴클레오티드가 복제시발점 (ORI)을 포함하고; 바람직하게는 폴리뉴클레오티드가 다중 클로닝 부위 (MCS)를 포함하고; 바람직하게는 프로모터가 진핵 세포에서의 발현에 적합하 고; 일부 바람직한 실시양태에서 폴리뉴클레오티드가 벡터, 바람직하게는 바이러스 벡터이고; 다른 바람직한 실시양태에서 폴리뉴클레오티드가 RNA이고; 바람직하게는 폴리뉴클레오티드가 이중 가닥 RNA이고; 바람직하게는 폴리뉴클레오티드가 짧은 간섭 RNA (siRNA)이거나; 또는 바람직하게는 염증을 감소시키는 1종 이상의 조성물이 동시에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서 단일 세포성 면역 반응 요소는 단일 폴리뉴클레오티드 또는 플라스미드 상에 존재하며, 다른 실시양태에서는 하나 초과의 세포성 면역 반응 요소가 단일 폴리뉴클레오티드 또는 플라스미드 상에 존재할 수 있다. 또다른 실시양태에서, 단일 폴리뉴클레오티드 또는 플라스미드는 1종 이상의 세포성 면역 반응 요소를 포함하고, 추가로 신경퇴행성 질환의 효과를 치료 또는 개선하는 것으로 알려져 있는 1종 이상의 폴리펩티드 또는 이의 단편을 포함한다 (즉, 뇌-유래 신경영양 인자 (BDNF), 신경 성장 인자 (NGF), β-아밀로이드, β-아밀로이드 펩티드 1-42 (β-아밀로이드1-42), 아포리포단백질 E (ApoE) 또는 ApoE-2).
다른 실시양태는 세포성 면역 반응 요소인 단백질, 펩티드 및/또는 폴리펩티드의 투여에 관한 것이다. 다른 실시양태에서, 세포성 면역 반응 요소 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 및/또는 폴리뉴클레오티드의 투여 방법이 제공된다. 조성물은, 조성물이 투여되는 대상체에서 세포성 면역 반응 요소 폴리펩티드가 발현되는 방식으로 제조 및 투여될 수 있다. 조성물은 발현계, 전달계, 및 면역조절 유전자, 예컨대 항염증 시토킨, 시토킨 효능제 또는 항-TNF 항체의 코딩 서열을 포함할 수 있 다. 바람직하게는, 방법 및 조성물의 세포성 면역 반응 요소가 염증을 감소시키는 유전자를 증가시키고; 바람직하게는 유전자 발현 증가가 상향조절 발현에 의한 것이고; 바람직하게는 염증을 감소시키는 유전자가 Th2 시토킨이고; 바람직하게는 Th2 시토킨이 IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, 또는 TGF-β이고; 다른 바람직한 실시양태에서, 세포성 면역 반응 요소를 포함하는 조성물이 염증을 증가시키는 유전자를 억제 또는 약화시키고; 바람직하게는 염증을 증가시키는 유전자가 Th1 시토킨이고; 바람직하게는 유전자 발현 약화가 하향조절 발현에 의한 것이고; 바람직하게는 Th1 시토킨이 IL-2, IL-12, 또는 TNFα이고; 일부 실시양태에서 조성물이 발현을 자극하거나 또는 염증을 감소시키는 유전자를 생성하여 조절을 수행하는 반면, 다른 실시양태에서는 조성물이 자극을 증가시키는 유전자, 예컨대 Th1 길항제의 발현을 억제하여 조절을 수행한다.
놀랍게도, 실시예 3 및 4에 기재된 바와 같이, IFN-γ를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 투여가 동물 모델에서 알츠하이머병의 효과를 치료 및 예방할 수 있다고 밝혀졌다. IFN-γ이 Th1 시토킨이더라도, 유전자 백신으로서 그의 투여는 신경퇴행성 질환의 효과를 최소화시킨다고 밝혀졌다. 따라서, IFN-γ 또는 IFN-γ에 상동성인 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물 및 방법은 대상체, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간에서 알츠하이머병과 같은 신경퇴행성 질환을 치료 및/또는 개선하는 방법으로서 본원에 제공된다.
특정 실시양태에서, 세포성 면역 반응 요소는 자가항원을 코딩하는 유전자 또는 단백질, 자가면역 염증 감소 시토킨, 자가면역 염증 증가 시토킨에 대한 길항 제, 또는 아네르기(anergy)를 유도하는 유전자 또는 이의 단편을 포함하며, 바람직하게는 세포성 면역 반응 요소는 인터류킨 (IL)-4, IL-5, IL-10, IL-13, 전환 성장 인자-베타 (TGF-β) 또는 인터페론-감마 (IFN-γ) 또는 이들의 단편이거나, 또는 이들에 상동성이다.
바람직한 실시양태에서, 세포성 면역 반응 요소는 신경퇴행성 질환의 효과를 더 치료 및/또는 개선하는 폴리펩티드 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산 또는 단백질로 더 투여되며, 바람직하게는 폴리펩티드를 코딩하는 추가적인 유전자 또는 단백질은 뇌-유래 신경영양 인자 (BDNF), 신경 성장 인자 (NGF), β-아밀로이드, β-아밀로이드 펩티드 1-42 (β-아밀로이드1-42), 아포리포단백질 E (ApoE) 또는 ApoE-2이거나, 또는 이들에 상동성이다.
다른 바람직한 실시양태에서, 세포성 면역 반응을 유도하는 조성물 및 방법은 입양 세포 유전자 요법에 의한 전달을 포함한다. 바람직하게는, 입양 세포 요법에 사용된 세포 유형은 자가(autologous) 또는 비자가(nonautologous) 세포이고; 바람직하게는 입양 세포 유전자 요법에 사용된 세포 유형은 T 세포, 항원 제공 세포, 섬유아세포 또는 줄기 세포이고; 바람직하게는 입양 세포 유전자 요법에 사용된 세포 유형은 수지상 세포, NIH3T3 세포, 비자가 줄기 세포, 예컨대 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection, ATCC)으로부터의 세포 또는 자가 줄기 세포이다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드는 제약상 허용되는 담 체와 함께 환자에게 투여된다. 특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 진핵생물 프로모터를 포함하며, 바람직하게는 진핵생물 프로모터는 인간에서의 발현을 제공한다. 특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 세포성 면역 반응 요소를 코딩하는 서열에 전사적으로 연결된 프로모터/인핸서와 복합체를 이루는 플라스미드이다. 특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 바이러스 벡터이다. 특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 리포펙션(lipofection) 시약과 함께 투여된다. 특정 실시양태에서, 방법은 정맥내, 비강내, 피하, 주사, 흡입 및 유전자 총으로 이루어진 군으로부터 선택된, 본원에 제공된 하나 이상의 조성물 투여 방법을 포함할 수 있다.
본원에 제공된 방법의 특정 바람직한 실시양태에서, 세포성 면역 반응 요소 폴리펩티드 또는 이의 단편을 코딩하는 서열을 포함한 폴리뉴클레오티드는 포유동물에게 투여되며; 보다 바람직하게는 포유동물이 인간이고; 바람직하게는 세포성 면역 반응 요소 유전자 또는 이의 단편을 코딩하는 서열을 포함한 폴리뉴클레오티드는 형질감염 촉진 물질과 함께 투여되며; 바람직하게는 형질감염 촉진 물질이 지질을 포함하고; 바람직하게는 폴리뉴클레오티드는 제약상 허용되는 담체 중에서 투여되고; 특정 바람직한 실시양태에서 폴리뉴클레오티드는 바이러스 형질도입에 의해 투여되고; 바람직하게는 폴리뉴클레오티드는 유전자 총에 의해 투여되고; 바람직하게는 폴리뉴클레오티드는 흡입에 의해 투여되거나; 또는 바람직하게는 폴리뉴클레오티드는 주사, 또는 바람직하게는 피하 주사, 또는 바람직하게는 근육내 주사에 의해 투여된다.
특정 실시양태에서, 조성물은 세포성 면역 반응 요소 폴리펩티드 또는 이의 단편을 코딩하는 서열을 포함한 폴리뉴클레오티드를 포함하고; 바람직하게는 조성물은 제약상 허용되는 담체를 포함하고; 바람직하게는 조성물은 형질감염 촉진 물질을 포함하며, 바람직하게는 형질감염 촉진 물질이 지질을 포함하고; 바람직하게는 조성물은 보조제와 함께 투여되고; 바람직하게는 조성물은 포유동물에게 주사하기에 적합하며, 바람직하게는 포유동물이 인간이고; 바람직하게는 조성물은 제약상 허용되는 담체 중에 동봉되며, 바람직하게는 제약상 허용되는 담체가 그 내부의 내용물을 나타내는 라벨 및 폴리뉴클레오티드의 투여와 관련된 설명서를 갖고; 바람직하게는 조성물은 포장 삽입물을 포함하며, 바람직하게는 포장 삽입물이 조성물의 내용물과 관련된 설명서를 포함하며, 보다 바람직하게는 포장 삽입물이 투여 정보와 관련된 설명서를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "항원"은 개인이 면역 반응을 생성할 수 있는 임의의 조성물을 폭넓게 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "항원"은 면역 반응을 지시할 수 있는 1종 이상의 항원 결정자를 함유하는 분자를 폭넓게 지칭한다. 면역 반응은 세포 매개되거나 또는 체액성이거나 또는 이들 둘 다일 수 있다. 당업계에 널리 공지된 바와 같이, 항원은 천연 단백질, 천연 탄수화물, 천연 지질, 천연 핵산, 또는 이들 생물분자의 조합물일 수 있다. 예를 들어, 항원은 중합체 등과 같은 비천연 분자를 포함할 수 있다. 항원은 자기 항원 및 외부 항원, 예컨대 또다른 동물에 의해 생성된 항원이나 감염제로부터의 항원을 포함한다. 감염제 항원은 박테리아, 바이러스, 진균, 원생동물 등일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "자가"는 대상체로부터 세포를 제거하고, 가능하게는 세 포를 변경하거나 세포를 보존하여, 세포를 대상체에 다시 재주입하는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "코딩 영역" 또는 "코딩 서열"은, 통상적인 염기쌍과 코돈 용법 관계에 따라, 발현이 요구되는 특정 유전자 생성물 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산 서열, 이의 상보체, 또는 이들의 일부분을 지칭한다. 코딩 서열은 성숙 mRNA를 제공하기 위해 세포의 생화학 기구에 의해 함께 연결되는 게놈 DNA 또는 미성숙 1차 RNA 전사체에서의 엑손을 포함한다. 안티센스(antisense) 가닥은 상기 핵산의 상보체이고, 코딩 서열은 이들로부터 추정될 수 있다. 코딩 서열은, 적절한 길이의 전사체가 생성되고 적절한 리딩 프레임에서 번역되어 목적하는 기능 생성물이 생성되도록, 전사 조절 요소 및 번역 개시 및 종결 코돈과의 관계에 놓인다.
본원에 사용된 용어 "상보체", "상보적" 또는 "상보성"은 표준 왓슨(Watson)/크릭(Crick) 쌍 규칙에 따른 폴리뉴클레오티드 (즉, 올리고뉴클레오티드 또는 표적 핵산과 같은 뉴클레오티드의 서열)를 지칭한다. 한 서열의 5' 말단이 다른 서열의 3' 말단과 쌍을 이루는 핵산 서열의 상보체는 "역평행 결합"으로 존재한다. 예를 들어 서열 "5'-A-G-T-3'"는 서열 "3'-T-C-A-5'"에 대해 상보적이다. 천연 핵산에서 통상적으로 발견되지 않는 특정 뉴클레오티드가 본원에 기재된 핵산에 포함될 수 있으며; 이들에는 예를 들어 이노신, 7-데아자구아닌, 잠금 핵산 (LNA) 및 펩티드 핵산 (PNA)이 포함된다. 상보체 서열은 또한 DNA 서열에 상보적인 RNA 서열 또는 이의 상보체 서열일 수 있으며, 또한 cDNA일 수 있다. 상보성은 완벽할 필요는 없으며, 안정한 듀플렉스(duplex)는 잘못 짝지어진 염기쌍, 변성되거나 짝을 이루지 못한 염기를 함유할 수 있다. 핵산 기술 업계의 숙련자는 예를 들어 올리고뉴클레오티드의 길이, 올리고뉴클레오티드의 염기 조성 및 서열, 잘못 짝지어진 염기쌍의 이온 농도 및 빈도를 비롯한 다수의 변수를 경험적으로 고려하여 듀플렉스 안정성을 결정할 수 있다.
상보성은 2개의 핵산 가닥의 뉴클레오티드 염기의 단지 일부만이 염기쌍 규칙에 따라 짝지어진 "부분적" 상보성일 수 있다. 상보성은 2개의 핵산 가닥의 뉴클레오티드 염기의 모두가 염기쌍 규칙에 따라 짝지어진 "완전한" 또는 "전체적" 상보성일 수 있다. 상보성은 2개의 핵산 가닥의 뉴클레오티드 염기의 어느 것도 염기쌍 규칙에 따라 짝을 이루지 못한 경우 부재할 수 있다. 핵산 가닥 사이의 상보성 정도는 핵산 가닥 사이의 혼성화의 효율 및 강도에 유의한 영향을 미친다. 이는 증폭 반응 뿐만 아니라 핵산 사이의 결합에 좌우되는 검출 방법에서 특히 중요하다. 또한, 개별 뉴클레오티드에 대하여, 특히 폴리뉴클레오티드와 관련하여 상기 용어가 사용될 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 내의 특정 뉴클레오티드는 또다른 핵산 가닥 내의 뉴클레오티드에 대한 그의 상보성 또는 이의 결핍에 대해, 나머지 올리고뉴클레오티드와 핵산 가닥 사이의 상보성과 대조 또는 비교하여 주목될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "실질적으로 상보적인"은 엄격 혼성화 조건 하에서 혼성화되는 2개의 서열을 지칭한다. 당업자는 실질적으로 상보적인 서열이 그의 전체 길이를 따라 혼성화될 필요는 없다는 것을 이해할 것이다. 특히, 실질적으로 상보 적인 서열은, 표적 서열에 대한 엄격 혼성화 조건 하에서 혼성화되는 인접 염기 서열에 대해 3' 또는 5'에 위치하는, 표적 서열에 대해 혼성화되지 않는 인접 염기 서열을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "수지상 세포" (DC)는 조혈 줄기 세포로부터 유래될 수 있는 항원 제공 세포 (APC)를 지칭한다. DC는 다수의 림프 및 비림프 조직 뿐만 아니라 말초 혈액 및 골수로부터 얻을 수 있다. 인간에서의 CD34+ 세포와 같은 조혈 줄기 세포는 시험관내에서 DC로 인공 분화될 수 있다. 수지상 세포는 수지상 세포체로부터 여러 방향으로 연장되는 얇은 시트 (라멜리포듐(lamellipodium))의 특징적인 형태를 갖는다. 여러 표현형 기준이 또한 전형적이지만, 수지상 세포의 공급원에 따라 달라질 수 있다. 이들에는 다량의 MHC 분자 및 보조자극 분자 (예를 들어, B7-1 및 B7-2), 과립구, NK 세포, B 세포 및 T 세포에 특이적인 표지의 결핍이 포함된다. 마우스에서, 일부 (전부는 아님) 수지상 세포는 33D1 (피부 또는 흉선 수질이 아닌 비장 및 파이어스 패치(Peyer's patch)로부터의 DC), NLDC145 (피부 및 여러 림프 기관의 T-의존성 영역에서의 DC) 및 CD11C (Cd11c 또한 대식세포와 반응함)를 발현한다. 수지상 세포는 시험관내 및 생체내에서 1차 T 세포 반응을 개시할 수 있다. 이들 반응은 항원 특이적이다. 수지상 세포는 말초 혈액 백혈구, 비장세포, B 세포 및 단핵구에 비해 강한 혼합 백혈구 반응 (MLR)을 지시한다.
본원에 사용된 용어 "발현"은 코딩 서열에 의해 코딩되는 생성물의 생물학적 생성을 지칭한다. 대부분의 경우에서, 코딩 서열을 비롯한 DNA 서열은 전사되어 전령 RNA (mRNA)를 형성한다. 전령 RNA는 번역되어 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드를 형성한다. 그러나 일부 경우에서는, RNA 생성물이 관련 활성을 가질 수 있으므로 유전자 생성물로서 간주될 것이다. 발현은 전사 RNA 생성물의 추가 처리 단계, 예컨대 인트론 제거를 위한 스플라이싱(splicing) 및/또는 폴리펩티드 생성물의 번역후 처리를 포함할 수 있다.
본원에 사용된, 면역학적 내성과 관련된 용어는 자기 항원에 대한 비반응성의 습득을 지칭한다. 자기 항원 및 비자기 항원을 구별하는 능력은 숙주의 보존에 필수적이다. 면역학적 내성은 문헌 [Serology, C.M., et al., Gene Therapy, vol. 7, p. 9-13 (2000)]; [Costa, G.L., et al., J. Immunol., vol. 164, p. 3581-90 (2000)]; 및 [Weiner, H.L., et al., NY Acad. Sci., vol. 778, p. xiii-xviii (1996)]에 더 기재되어 있다.
본원에 사용된 용어 "세포성 면역 반응 요소"는 세포성 면역 반응을 유도하는 임의의 분자를 지칭한다. 바람직하게는, 세포성 면역 반응은 Th2 또는 Th3 반응이다. 바람직하게는, 분자는 단백질, 펩티드, 폴리펩티드, 핵산, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드이다. 일부 세포성 면역 반응 요소는 당업계에 널리 공지되어 있으며, 폴리펩티드 IL-4 (즉, 진뱅크 등록 번호(GenBank Accession No.) M13982; 서열 12) 및 IL-10 (즉, 진뱅크 등록 번호 M57627; 서열 14) 및 IL-4 및 IL-10을 코딩하는 핵산 (즉, 서열 1 및 3)을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 자가면역 염증을 감소시키는 폴리펩티드를 생성하거나 상향조절할 수 있는 분자를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 세포성 면역 반응 요소는 또한 폴리펩티드 TGF-β (즉, 진뱅크 등록 번호 M60316; 서열 16) 및 TGF-β를 코딩하는 핵산 (즉, 서열 5)을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 자가면역 염증을 증가시키는 폴리펩티드를 억제하거나 하향조절할 수 있다. 그러나, 다른 세포성 면역 반응 요소는 당업계에 공지되어 있는 것 및 아직 확인되지 않은 것을 포함한다고 이해된다. 바람직하게는, 세포성 면역 반응 요소 폴리펩티드 또는 이의 단편은 본원에 제공된 바와 같은 세포성 면역 반응 요소의 아미노산 서열, 즉 서열 12 내지 22와 상동성인 아미노산 서열을 갖는다. 특정 바람직한 실시양태에서, 세포성 면역 반응 요소의 단편은 본원에 제공된 바와 같은 세포성 면역 반응 요소, 즉 서열 12 내지 22와 상동성인 25개 이상의 아미노산, 보다 바람직하게는 50개 이상의 아미노산, 보다 바람직하게는 150개 이상의 아미노산, 보다 바람직하게는 200개 이상의 아미노산, 보다 바람직하게는 250개 이상의 아미노산, 보다 바람직하게는 300개 이상의 아미노산, 보다 바람직하게는 400개 이상의 아미노산, 보다 바람직하게는 500개 이상의 아미노산, 보다 바람직하게는 600개 이상의 아미노산, 보다 바람직하게는 700개 이상의 아미노산, 보다 바람직하게는 800개 이상의 아미노산을 갖는다. 본원에서 아미노산 서열을 지칭하는 경우 용어 "상동성"은 공지된 아미노산 서열 (예를 들어 서열 12 내지 22)과 적어도 70%, 보다 바람직하게는 75%, 보다 바람직하게는 80%, 보다 바람직하게는 85%, 보다 바람직하게는 90%, 보다 바람직하게는 95%, 보다 바람직하게는 98%, 또는 가장 바람직하게는 100% 동일함을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "리포펙션 시약"은 유전 물질을 리포좀에 의해 세포로 도입시키는데 사용된 물질을 지칭한다. 리포펙션 시약의 예에는 리포펙틴, 리포펙 타민, 양이온성 지질 및 중성 보조지질이 포함된다.
본원에 사용된 용어 "플라스미드"는 유전 물질 (즉, 핵산)로 구성된 구조체를 지칭한다. 이는 삽입된 코딩 서열이 진핵 세포에서 전사될 수 있도록 배열된 유전 성분을 포함한다. 플라스미드는 바이러스 핵산으로부터의 서열을 포함할 수 있지만, 이러한 바이러스 서열은 바이러스 입자 내로 플라스미드를 도입시키지 않으므로, 플라스미드는 비바이러스 벡터이다. 바람직하게는, 플라스미드는 폐쇄된 원형 핵산이다. 바람직하게는, 핵산은 DNA 또는 RNA이다. 바람직하게는, 플라스미드는 형질전환에 의해 세포에 도입될 수 있으며, 세포에서 자체적으로 복제될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "제약상 허용되는"은 인간에게 투여하기에 적합한 조성물을 지칭한다. 당업자는 인간에게 투여하기에 적합하기 위해서 조성물이 특정 기준을 충족하여야 한다는 것, 예를 들어, 조성물이 바람직하게는 우수 실험실 기준 (Good Laboratory Practice, GLP)을 따르고; 바람직하게는 조성물이 우수 제조 기준 (Good Manufacturing Practice, GMP)을 따르고; 보다 바람직하게는 조성물이 미국 식약청에 의해 설명된 바와 같은 정부 규정을 따르고; 바람직하게는 조성물이 21 U.S.C. § 301-392를 따른다는 것을 이해한다.
본원에 사용된 용어 "복제시발점"은 핵산 서열을 복제하기 위해 DNA 합성이 시작되는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 이는 일반적으로 ORI 부위로 칭한다. 원형 박테리아는 일반적으로 단일 ORI 부위를 갖는 반면, 각각의 진핵생물 염색체 상에는 다수의 ORI 부위가 존재할 수 있다. 이 용어는 본원에 사용된 바와 같이 DNA 복제 동안 자가 단위로서 거동하는 유전 요소를 지칭하는 레플리콘(replicon)을 포함한다. 박테리아에서, 염색체는 단일 레플리콘으로서 작용하는 반면, 진핵생물 염색체는 수백개의 일련의 레플리콘을 함유한다.
용어 "전사 단위" 또는 "발현 카세트(cassette)"는 전사의 개시 및 종결을 지시하는 서열 요소와 함께 1개 이상의 코딩 서열을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 그러나 전사 단위는 전사후 또는 번역후 과정에 관여하는 서열을 포함할 수 있는 추가적인 서열을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "전사 조절 서열"은 전사적으로 연결된 코딩 영역의 전사 속도를 조절하는 서열을 지칭한다. 이 용어는 프로모터, 오퍼레이터(operator) 및 인핸서와 같은 요소를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 전사 조절 서열은 1개 이상의 프로모터 서열을 포함할 것이다.
본원에 사용된 용어 "전사적으로 연결된"은, 조절 서열의 지시 하에 개시되며 조절 서열과 전사적으로 연결된 서열을 통해 진행될 전사에 적합한 계를 지칭한다. 바람직하게는, 생성된 전사체에서 돌연변이가 일어나지 않으므로 생성된 번역 생성물을 변형하지 않을 것이다. 예를 들어 "전사적으로 연결된"은 일반적으로, 연결될 DNA 서열이 인접하고 분비성 유도자의 경우 인접하며 판독 단계에 있는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접하여서는 안된다. 연결은 편리한 제한 부위에서 라이게이션(ligation)에 의해 수행된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상적인 관행에 따라 합성 올리고뉴클레오티드 적응인자 또는 연결인자가 사용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "5' 비번역 영역" 또는 "5' UTR"은 프로모터 영역에 대해 3' 및 하류 코딩 영역의 5'에 위치한 서열을 지칭한다. 따라서, 이러한 서열은 전사되는 동안 번역 개시 코돈의 상류 (즉 5')이므로 일반적으로 폴리펩티드 생성물의 부분으로 번역되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "3' 비번역 영역/폴리 (A) 신호" 또는 "3' UTR 폴리 (A) 신호"는 폴리펩티드 물질을 코딩하는 영역의 하류 (즉 3')에 위치한 서열이다. 5' UTR의 경우, 이 영역은 일반적으로 전사되지만 번역되지는 않는다. 진핵세포에서의 발현의 경우, 일반적으로 폴리-A 테일의 첨가를 신호하는 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 다른 합성 유전 요소의 경우, 합성 3' UTR/폴리 (A) 신호는 천연 발생 UTR 요소와 상이한 서열을 갖는다.
본원에 사용된 용어 "시토메갈로바이러스(cytomegalovirus) 프로모터/인핸서 서열"은 진핵 세포에서 전사 프로모터 및 상류 인핸서 서열로서 작용하는, 시토메갈로바이러스로부터의 서열을 지칭한다. 인핸서 서열은 관련 프로모터로부터 보다 높은 빈도로 전사가 일어나도록 한다.
본원에 기재된 플라스미드는 프로모터, 5' 비번역 영역 (5' UTR), 3' UTR/폴리 (A) 신호 및 인트론 중 하나 이상을 포함할 수 있으며, 합성 서열일 수 있다. 이와 관련하여, 용어 "합성"은 상기 유형의 천연 발생 유전 요소의 서열에 의해 직접 제공되는 것이 아니라 인공적으로 생성된 (즉, 분자 생물학적 방법에 의해 개인에 의해 생성된) 서열을 지칭한다. 이러한 합성 서열 중 하나 이상의 부분이 천연 발생 서열의 부분과 동일할 수 있지만, 특정화된 유전 요소의 전체 서열은 그 유형 의 천연 발생 유전 요소와 상이하다. 이러한 합성 유전 요소를 사용하여 그 성분의 기능적 특징이 목적하는 기능을 위해 적절하게 디자인되도록 할 수 있다.
본원에 사용된, 세포성 면역 반응 요소 폴리펩티드 또는 이의 단편을 코딩하는 서열을 포함한 폴리뉴클레오티드는 본원에 정의된 바와 같은 세포성 면역 반응을 유도할 수 있는 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 통상적인 염기쌍과 코돈 용법 관계를 기준으로 단일 폴리펩티드 서열을 코딩할 수 있는 다수의 상이한 뉴클레오티드 서열이 존재한다고 이해된다. 따라서, 상기 용어는 세포성 면역 반응 요소 또는 이의 단편을 코딩할 임의의 핵산 서열을 지칭한다. 특정 바람직한 실시양태에서, 세포성 면역 반응 요소 폴리펩티드 또는 이의 단편을 코딩하는 서열을 포함한 폴리뉴클레오티드는 IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 또는 TGF-β에 상동성인 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 바람직하게는, 세포성 면역 반응 요소 폴리펩티드 또는 이의 단편을 코딩하는 서열을 포함한 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드 IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, TGF-β 또는 IFN-γ를 코딩하는 서열 (서열 1 내지 6에 나타낸 바와 같음)에 상동성인 50개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 100개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 300개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 600개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 1000개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 1500개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 2000개 이상의 뉴클레오티드의 인접 세그먼트(segment)를 포함한다. 본원에서 뉴클레오티드 서열을 지칭하는 경우 용어 "상동성"은 뉴클레오티드 서열이 공지된 뉴클레오티드 서열 (예를 들어 서열 1 내지 6에 제공된 바와 같은 IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, TGF-β 및 IFN-γ를 코딩하는 서열)과 적어도 70%, 보다 바람직하게는 75%, 보다 바람직하게는 80%, 보다 바람직하게는 85%, 보다 바람직하게는 90%, 보다 바람직하게는 95%, 보다 바람직하게는 98%, 또는 가장 바람직하게는 100% 동일하다는 것을 의미한다. 세포성 면역 반응 요소 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함한 폴리뉴클레오티드는 세포성 면역 반응 요소를 코딩하는 서열을 형성하는 뉴클레오티드 이외에 추가적인 뉴클레오티드를 함유할 수 있다고 이해된다.
본원에 사용된 용어 "샘플" 또는 "시험 샘플"은 관심 핵산을 포함하는 것으로 생각되는 임의의 액체 또는 고체 물질을 지칭한다. 시험 샘플은 임의의 생물학적 공급원 (즉, 생물학적 샘플), 예컨대 배양 중의 세포 또는 조직 샘플로부터 얻을 수 있거나 화학적 합성 주형을 비롯하여 합성 생성될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "세포성 면역 반응 유전자 또는 이의 단편을 코딩하는 서열"은 세포성 면역 반응 요소 유전자 또는 이의 단편을 코딩하는 임의의 핵산 서열을 지칭한다. 세포성 면역 반응 요소 유전자는 염증에 영향을 미칠 수 있는 폴리펩티드에 상응하는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 세포성 면역 반응 요소 유전자의 예에는 IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, TGF-β 및 IFN-γ가 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 본원에 기재된 세포성 면역 반응 요소 유전자는 통상적인 염기쌍과 번역 코돈 용법 관계를 기준으로 임의의 세포성 면역 반응 요소 폴리펩티드 또는 이의 단편의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 코딩한다. 바람직하게는, 코딩 서열은 천연 세포성 면역 반응 요소 유전자의 정확한 전체 아미노산 서열을 코딩한다.
본원에 사용된 용어 "형질도입된"은 선택된 핵산이 세포 내로 전위된 세포를 지칭한다. 세포는 선택된 핵산이 복제되어 자손 세포에 전해지는 경우 선택된 핵산으로 "안정하게 형질도입된다". 세포는 선택된 핵산이 세포의 게놈으로 통합되는 경우 선택된 핵산으로 "형질전환된다".
본원에 사용된 용어 "치료하는", "치료" 또는 "요법"은 치료 요법 및 예방(prophylactic/preventive) 요법을 지칭한다. "예방 요법"의 예는 표적 병리학적 상태 또는 장애의 예방 또는 약화이다. 치료가 필요한 대상체는 이미 장애를 가지고 있는 대상체 뿐만 아니라 장애에 걸리기 쉬운 대상체 또는 장애가 예방되어야 할 대상체를 포함한다. 투여는, 연장된 시간 동안 초기 치료 효과 (활성)를 유지하도록 급성 방식과 반대되는 연속 방식으로 작용제(들)를 투여하는 것을 지칭하는 "만성" 투여일 수 있다. 투여는 또한 중지 없이 연속적으로 수행되는 것이 아니라 오히려 사실상 순환되는 치료인 "간헐" 투여일 수 있다. 투여는 또한 동시 (병행) 투여 및 임의의 순서로의 연속 투여를 포함하는, 1종 이상의 추가 치료제와의 "조합" 투여일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "상향조절"은 유전자의 발현, 또는 RNA 또는 1종 이상의 단백질 서브유닛(subunit)을 코딩하는 동등한 RNA의 양, 또는 Th2 시토킨과 같은 1종 이상의 단백질 서브유닛의 활성이 본원에 개시된 조성물의 부재 하에 관찰된 경우보다 큰 것을 지칭한다. 예를 들어, IL-4와 같은 단백질의 발현은, 유전자 발현의 부재 또는 낮은 수준에 의해 야기 또는 악화된 병리학적 상태를 치료, 예방, 개 선 또는 조절하기 위해 증가할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "억제" 또는 "하향조절"은 유전자의 발현, 또는 RNA 또는 1종 이상의 단백질 서브유닛을 코딩하는 동등한 RNA의 양, 또는 Th1 시토킨과 같은 1종 이상의 단백질 서브유닛의 활성이 핵산 분자의 부재 하에 관찰된 경우 미만으로 감소하는 것을 지칭한다. 한 실시양태에서, 효소 핵산 분자에 의한 억제 또는 하향조절은 바람직하게는, 표적 RNA 상의 동일한 부위에 결합할 수 있지만 그 RNA를 절단할 수는 없는 효소 불활성 또는 약화 분자의 존재 하에 관찰된 수준 미만이다. 또다른 실시양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드를 이용한 억제 또는 하향조절은 바람직하게는, 예를 들어 스크램블링된(scrambled) 서열 또는 잘못 짝지어진 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드의 존재 하에 관찰된 수준 미만이다. 또다른 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물을 이용한 Th1 시토킨의 억제 또는 하향조절은 조성물이 부재하는 경우보다 존재하는 경우에 더 크다.
본원에서 사용된 용어 "약"은 정량적 용어로, 나타낸 값의 ±10%를 의미한다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 하기 바람직한 실시양태의 상세한 설명 및 특허청구범위로부터 명백할 것이다.
도 1a. 2회 주사 (6 및 8개월령에) 후 벡터 대조군 (비처리군) APP 트랜스제닉(transgenic) 알츠하이머병 마우스 모델에서 9개월령에 처리된 뇌 조직구조 단면. 조직구조 단면에서 화살표는 항 아밀로이드-β 항체로 염색 (면역조직화학 특 이적 염색) 후 아밀로이드 플라크 표지를 나타낸다.
도 1b. IL-10 유전자 백신을 이용한 2회 면역화 (6 및 8개월령에) 후 APP 트랜스제닉 알츠하이머병 마우스 모델에서 9개월령에 처리된 뇌 조직구조 단면. 조직구조는 항 아밀로이드-β 항체로 염색 (면역조직화학 특이적 염색) 후 임의의 아밀로이드 플라크 표지를 나타내지 않는다.
도 1c. IL-4 유전자 백신을 이용한 2회 면역화 (6 및 8개월령에) 후 APP 트랜스제닉 알츠하이머병 마우스 모델에서 9개월령에 처리된 뇌 조직구조 단면. 조직구조는 항 아밀로이드-β 항체로 염색 (면역조직화학 특이적 염색) 후 임의의 아밀로이드 플라크 표지를 나타내지 않는다.
도 1d. TGF-β 유전자 백신을 이용한 2회 면역화 (6 및 8개월령에) 후 APP 트랜스제닉 알츠하이머병 마우스 모델에서 9개월령에 처리된 뇌 조직구조 단면. 조직구조는 항 아밀로이드-β 항체로 염색 (면역조직화학 특이적 염색) 후 임의의 아밀로이드 플라크 표지를 나타내지 않는다.
도 1e. IFN-γ 유전자 백신을 이용한 2회 면역화 (6 및 8개월령에) 후 APP 트랜스제닉 알츠하이머병 마우스 모델에서 9개월령에 처리된 뇌 조직구조 단면. 조직구조 단면에서 화살표는 항 아밀로이드-β 항체로 염색 (면역조직화학 특이적 염색) 후 아밀로이드 플라크 표지를 나타낸다.
도 2a 및 2b. 벡터만 (도 2a) 또는 IL-4, IL-10, NGF 및 Apo-E2 유전자 백신의 혼합물 (도 2b)을 이용한 6회 면역화 (6, 8, 10, 12, 14 및 16개월령에) 후 APP 트랜스제닉 알츠하이머병 마우스 모델에서 18개월령에 처리된 해마의 뇌 조직 구조 단면. 혼합물 백신처리된 조직구조는 항 아밀로이드-β 항체로 염색 (면역조직화학 특이적 염색) 후, 통상적인 비처리 마우스에 부합하게 임의의 아밀로이드 플라크 표지를 나타내지 않은 반면, 벡터 투여는 표지된 아밀로이드 플라크를 가졌다.
알츠하이머병과 같은 신경퇴행성 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 조성물 및 방법이 본원에 제공된다. 특정 측면에서, 상기 조성물 및 방법은 대상체, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간에서 신경퇴행성 질환을 치료 또는 개선하기 위한 DNA 백신 및 입양 세포 유전자 요법에 관한 것이다. 특정 측면에서, 상기 조성물 및 방법은 Th2 또는 Th3 시토킨을 코딩하는 DNA 백신에 관한 것이다. 상기 조성물은 조성물이 투여되는 대상체에서 세포성 면역 반응 요소 코딩 서열이 발현되는 방식으로 제조 및 투여될 수 있다. 이들 조성물은 발현계, 전달게, 형질감염 촉진 물질 및 1종 이상의 세포성 면역 반응 요소를 포함할 수 있다.
알레르기 질환은 T-헬퍼 2형 (Th2) 프로파일 쪽으로 편향하며 T-헬퍼 1형 (Th1) 프로파일로부터 멀어지는 면역 반응을 갖는다. Th1 프로파일은 염증 반응을 지속시키는 분자, 예컨대 IFN-γ 및 IL-2의 양 증가를 특징으로 한다. Th2 프로파일은 특정 인터류킨 (IL), 예컨대 IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, CD4+ T 세포의 양 증가 및 항원 특이적 IgE의 생성을 특징으로 한다. IL-4는 IgE 합성 및 Th2 반응의 전개에 중요하고, IL-5는 호산구 생존에 중요하다. 면역요법은 Th1 시토킨, IFN-γ 및 IL-12의 증가로 이러한 불균형을 반전시키고, 또한 Th2 반응을 억제한다. 유전 백신처리 작업이 발전함과 동시에, 점유되는 경우 비만 세포 및 호염구에 대한 IgE-매개 반응을 억제하는 저친화성 IgG 수용체인 FCγRIIB에 대한 작업 또한 발전한다 (문헌 [Daeron, et al., J Clin. Invest. 95(2): 577-85 (1995)] 참조).
놀랍게도, 상기에 기재되고 실시예 3 및 4에 나타낸 바와 같이, IFN-γ를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 투여는 동물 모델에서 알츠하이머병의 효과를 치료 및 예방할 수 있다. IFN-γ가 Th1 시토킨이더라도, 유전자 백신으로서 그의 투여는 신경퇴행성 질환의 효과를 최소화시키는 것으로 밝혀졌다. 따라서, IFN-γ를 코딩하거나 IFN-γ에 상동성인 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물 및 방법은 대상체, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간에서 알츠하이머병과 같은 신경퇴행성 질환을 치료 및/또는 개선하는 방법으로서 본원에 제공된다.
특정 실시양태에서 염증을 감소시키는 조성물은 염증을 감소시키는 유전자를 생성하거나 그의 발현을 촉진할 수 있는 반면, 다른 실시양태에서 조성물, 예컨대 길항제는 염증을 증가시키는 유전자의 발현을 억제하여 조절에 영향을 미칠 수 있다. 이중 가닥 RNA, 특히 siRNA가 발현을 억제하는데 사용될 수 있다. RNA는 살아있는 세포에 도입되어 그 세포에서 표적 유전자 발현을 억제할 수 있다. 이 과정은 생체외 또는 생체내에서 수행될 수 있다. 이러한 RNA 조성물 및 사용 방법은 예를 들어 미국 특허 제6,506,559호에 더 기재되어 있다.
네이키드(naked) DNA, 리포좀과 복합체를 이루는 DNA 및 각종 바이러스 벡터를 비롯한 DNA를 숙주 세포에 도입하는데 다양한 방법이 사용될 수 있다. 네이키드 폴리뉴클레오티드 물질, 방법 및 전달계, 예컨대 미국 특허 제6,040,295호, 동 제5,763,270호 및 동 제5,580,859호에 기재된 것이 사용될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 세포 내로의 도입을 촉진하는 작용을 할 수 있는 임의의 전달 비히클 또는 형질감염을 촉진하는 임의의 물질, 예컨대 리포좀 제제, 리포펙틴과 같은 하전된 지질 또는 CaPO4와 같은 침전제가 없다는 점에서 네이키드이다.
핵산 전달용 벡터는 바이러스, 비바이러스 또는 물리적 벡터일 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Rosenberg et al., Science, 242:1575-1578 (1988)] 및 [Wolff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9011-9014 (1989)]을 참조한다. 유전자 요법에 사용하기 위한 방법 및 조성물의 논의가 문헌 [Eck et al., in Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ninth Edition, Hardman et al., eds., McGray-Hill, New York, (1996), Chapter 5, pp. 77-101]; [Wilson, Clin. Exp. Immunol. 107 (Suppl. 1):31-32 (1997)]; [Wivel et al., Hematology/Oncology Clinics of North America, Gene Therapy, S.L. Eck, ed., 12(3):483-501 (1998)]; [Romano et al., Stem Cells, 18:19-39 (2000)] 및 이들 내부에 인용된 참고문헌에 포함되어 있다. 또한, 미국 특허 제6,080,728호에서 각종 유전자 전달 방법 및 조성물의 논의가 제공된다. 전달 경로는 예를 들어 전신적 투여 및 동일계내 투여를 포함한다. 널리 공지된 바이러스 전달 기술은 아데노바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 포미(foamy) 바이러스, 단순 헤르페르 바이러스 및 아데노-관련 바이러스 벡터의 사용을 포함한다.
바이러스 벡터는 또한 포유동물 세포의 형질감염 및 게놈으로의 폴리뉴클레오티드 도입에 사용될 수 있다. 간적접인 방법으로, 유전 정보를 운반하는 바이러스 벡터를 사용하여 신체로부터 제거된 표적 세포를 감염시키고, 이어서 이들 세포를 재이식한다. 출생후 동물 내로의 직접적인 생체내 유전자 전달은 리포좀에 캡슐화된 DNA 제제 및 바이러스 피막 수용체 단백질을 함유하는 프로테오리포좀에 캡슐화된 DNA 제제에 대해 보고되었다 (문헌 [Nicolau et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 80:1068-1072 (1983)]; [Kaneda et al., Science 243:375-378 (1989)]; [Mannino et al., Biotechniques 6:682-690 (1988)] 참조). 바이러스 벡터는 시험관내에서 숙주 세포에 주사 또는 형질도입될 수 있으며, 이어서 채택적으로 전달되어 전달 비히클, 예컨대 T 세포 (문헌 [Nakajima, A., et al., J. Clin. Invest., vol. 17(21), p. 1293-1310 (2001)] 및 [Tuohy, V.K., et al., J. Neuroimmunol., vol. 17(2), p. 226-32 (2000)] 참조), 섬유아세포 (문헌 [Rabinovich, G.A., et al., J. Exp. Med., vol. 19, p. 385-98 (1999)] 참조), 수지상 세포 (DC) (문헌 [Kim, S.H., et al., J. Immunol., vol. 166(21), p. 3499-3550 (2001)] 및 [Morita, Y., et al., J. Clin. Invest., vol. 17(21), p. 1275-84 (2001)] 참조), 및 (ATCC 또는 자가) 줄기 세포로서의 역할을 한다.
특정 실시양태에서, 바이러스 벡터는 바람직하게는 레트로바이러스 벡터이다. 레트로바이러스 벡터는 이종 핵산이 2개의 레트로바이러스 LTR 사이에 존재하는 유전자 전달 플라스미드이다. 레트로바이러스 벡터는 전형적으로, 레트로바이러스 벡터 또는 주형으로서 레트로바이러스 벡터를 사용하여 전사된 RNA가 적절한 패키징(packaging) 세포주에서 바이러스 비리온(virion)으로 패키징되도록 할 수 있는 적절한 패키징 신호를 함유한다 (예를 들어 미국 특허 제4,650,764호 참조).
본원에서 사용하기 위한 적합한 레트로바이러스 벡터는 예를 들어 미국 특허 제5,399,346호 및 동 제5,252,479호; 및 WIPO 공보 WO 92/07573호, WO 90/06997호, WO 89/05345호, WO 92/05266호 및 WO 92/14829호에 기재되어 있으며, 이들 문헌은 상기 레트로바이러스 벡터를 사용하여 인간 세포 내로 핵산을 효율적으로 도입하기 위한 방법에 대해 설명하고 있다. 다른 레트로바이러스 벡터에는 예를 들어 마우스 유방 종양 바이러스 벡터 (예를 들어 문헌 [Shackleford et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:9655-9659 (1998)] 참조), 렌티바이러스 등이 포함된다. 예시적인 바이러스 벡터는 pLentilox-IRES-GFP이다.
입양 세포 유전자 요법
세포 내로 핵산을 도입하는 기술은 핵산이 시험관내에서 배양된 세포로 전달되는지 또는 생체내에서 의도된 숙주 세포로 전달되는지에 따라 달라진다. 시험관내에서 포유동물 세포로 핵산을 전달하기에 적합한 기술은 리포좀, 전기천공법 (문헌 [Luxembourg A., et al., Expert Opinion Biol. Ther. 7(11):1647-1664 (2007)]; [Kesaraju P, et al., Mol. Ther. 14(3):416-422 (2006)]; [Luxembourg, et al., Vaccine (24(21):4490-4493 (2006)] 참조), 마이크로주사, 세포 융합, DEAE-덱스트란, 칼슘 포스페이트 침전 방법 등의 사용을 포함한다. 바람직한 생체내 유전자 전달 기술은 바이러스 (전형적으로는 레트로바이러스) 벡터를 이용한 형질감염 및 바이러스 코트 단백질-리포좀 매개된 형질감염을 포함한다 (문헌 [Dzau, et al., Trends in Biotechnology 11(5):205-10 (1993)] 참조). 적합한 벡터가 당업계에 널리 공지된 임의의 방법에 의해 제작될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Press (1989)] 및 [Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1987 and updates)]을 참조한다. DNA 백신용으로 디자인된 벡터, 예컨대 pVAX1 (인비트로겐 칼스배드(Invitrogen Carlsbad), 캘리포니아주 소재)는 또한 포유동물에 핵산을 전달하기에 적합하다. 양이온성 리포좀, 예컨대 CD-Chol/DOPE 리포좀의 용도는 DNA/양이온성 리포좀 복합체의 정맥내 주사를 통해 폭넓은 범위의 조직에 DNA를 전달하기 위한 적절한 비히클로서 널리 기록되었다. 문헌 [Caplen et al., Nature Med., 1:39-46 (1995)]; [Zhu et al., Science, 261:209-211 (1993)]을 참조한다. 리포좀은 혈장막과의 융합에 의해 표적 세포로 유전자를 전달한다. 리포좀 복합체의 성공적인 적용예에는 문헌 [Lesson-Wood et al., Human Gene Therapy, 6:395-405 (1995)] 및 [Xu et al., Molecular Genetics and Metabolism, 63:103-109 (1998)]에서의 예가 포함된다.
개인에서 핵산의 지시된 전달은 당업계에 공지된 임의의 각종 수단에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 핵산 공급원은 손상된 조직 내 세포를 표적화하는 작용제, 예컨대 세포 표면 막 단백질 또는 표적 세포에 특이적인 항체, 표적 세포 상의 수용체에 대한 리간드 등과 조합될 수 있다. 리포좀이 사용되는 경우, 세포내이입과 관련된 세포 표면 막 단백질에 결합하는 단백질은 예를 들어 특정 세포 유형에 대한 영양 캡시드 단백질 또는 이의 단편, 주기적으로 내부화를 수행하는 단백질에 대한 항체, 세포내 국지화를 표적으로 하고 세포내 반감기를 증가시키는 단백질을 표적화 및/또는 흡수 촉진하는데 사용될 수 있다. 수용체-매개된 세포내이입 기술은 예를 들어 문헌 [Wu, et al., J. Biol. Chem. 262(10):4429-32 (1987)]; 및 [Wagner, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87(9):3410-4 (1990)]에 기재되어 있다. 유전자 표지 및 유전자 요법 프로토콜의 개관을 위해, 문헌 [Anderson, Science 256(5058):808-13 (1992)]을 참조한다.
본원에 제공된 방법 및 조성물은 또한, 생체외 바이러스 형질도입 후 면역조절 생성물 및/또는 치료 유전자 생성물을 발현 및 전달하도록 기관-특이적 자가면역 질환에서 염증 부위를 이동시키는 능력을 갖는 유전자 조작된 면역 세포, 예컨대 1차 T 세포, 수지상 세포, 섬유아세포 및 줄기 세포를 사용하는 입양 세포 유전자 요법에 이용될 수 있다. 이들 세포의 생체외 형질도입은 트랜스진(transgene)-코딩 벡터에 숙주의 전신적 노출을 방지하므로 이러한 방법의 안전성에 도움이 된다. 항원-특이적 T 세포 하이브리도마(hybridoma)를 사용하여 항염증 시토킨, 예컨대 IL-4, 시토킨 길항제, 예컨대 IL-12 수용체 길항제 IL-12p40 또는 항-TNF 항체 단일쇄 가변 단편 (scFv)을 발현시켰다. 이러한 모든 분자는 질환 발달을 억제하고 질환 중증도를 감소시켰다. 입양 세포 유전자 요법의 CIA 모델이 항염증 유전자 요법을 매개하는데 편리한 유전자 셔틀(shuttle)의 예이다. 추가적인 연구는 형질도입하기에 보다 어려운 1차 T 세포가 IL-12p40을 발현하는 경우 동일하게 유효하다는 것을 밝혔으며, 이는 사용된 세포 유형과 상관없이 성공적인 입양 세포 유전자 요법이 적용될 수 있다는 것을 나타낸다. 따라서, 골수 유래된 수지상 세포 (DC)와 같은 세포는 염증 부위로 이동하는데 사용될 수 있다.
수지상 집단 세포는 분리된 두 위치에서 두가지 상이한 기능을 수행하는데 특히 적합하다. 말초 조직에서, 수지상 세포 (DC)는 "위험" 항원에 대한 감시자로서 작용한다. DC는 항원을 림프 기관에 이동 및 전달시켜 항원에 특이적인 T 림프구의 활성화를 개시한다. 이동 동안, DC는 항원-포획 모드에서 T-세포 감작 모드로 전환한다. DC는 또한 T 세포 분화의 특성, 즉 Th1/Th2 균형에 영향을 미친다. DC는 T 림프구의 최적 활성화에 필요한 항원 및 보조자극 신호를 제공한다. DC 및 사용 방법은 예를 들어 미국 특허 제6,734,014호에 더 기재되어 있다.
또한, 줄기 세포가 입양 세포 유전자 요법에 사용될 수 있다. 인간 배아 줄기 (ES) 세포가 본원에 제공된 조성물 및 방법에 사용될 수 있다. ES 세포는, 분화되지 않은 상태로 무한대로 성잘할 수 있으며 또한 성체의 모든 세포로 분화할 수 있는 배반포의 내세포괴로부터 유래된 배양된 세포주이다. 바람직하게는, 본원에 제공된 조성물 및 방법에서 사용하기에 적절한 줄기 세포는 대상체 자체로부터 유래되거나 또는 면역 반응을 회피하는 방식, 예컨대 배아 줄기 세포 DNA를 대상체의 DNA로 대체하는 것을 수반하는 핵이식 또는 체세포 핵이식으로 조작된다. 배아 줄기 세포는 인간 성체에서 발견된 대략 200개의 상이한 세포 유형으로 분화하는 능력으로 인해 가장 용도가 많은 줄기 세포이며, 일상적인 유전자 조작 프로토콜이 개발된 유일한 줄기 세포 유형이다. 생체외에서 줄기 세포를 생성하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 미국 특허 제6,326,198호, 동 제6,261,549호, 동 제6,093,531호, 동 제5,935,565호, 동 제5,670,351호, 동 제5,670,147호, 동 제5,646,043호, 동 제5,437,994호에 포함되어 있다.
cDNA를 이용한 백신처리는 비교적 적은 주사를 필요로 하며, 보다 신속한 조립 단계를 갖는다. 또한, 면역요법에 대한 유해 반응의 위험이 감소할 수 있다. 플라스미드 DNA 및 이의 유전자 발현은 장시간 지속되는 것으로 주목되었고 (문헌 [Wolff, et al., Hum. Mol. Genet. 1:363-69 (1992)] 참조), 영장류 및 설치류에서의 면역 반응은 DNA 백신처리 후 1년 이상 동안 지속되는 것으로 기록되었다 (문헌 [Donnelly, et al., J Immunol Meth. 176:145-152 (1994)]; 및 [Raz, et al., Pro. Natl. Acad. Sci. 91:9519-9523 (1994)] 참조). 플라스미드 DNA가 숙주 게놈에 도입되지만 에피좀(episome)으로서 남아있는 것처럼 보이지 않는다 (문헌 [Tang, et al., Nature. 356:152-4 (1992)] 참조). 네이키드 DNA 및 RNA가 흡수되어 생체내 근육 세포에 의해 일시적으로 발현된다는 발견은 유전자 전달용 비바이러스 비히클의 사용에 대한 관심을 증가시켰다. 문헌 [Wolff et al., Science, 247, 1465-1468 (1990); Acsadi, et al., Nature, 352, 815-818, (1991)]을 참조한다. 네이키드 DNA 및 RNA가 포유동물 세포에 흡수될 수 있지만, 형질감염의 효율은 DNA 또는 RNA가 리포좀과 복합체를 이루는 경우 대단히 증가할 수 있다 (문헌 [Chen, et al., Gene Therapy 7(19): 1698-705 (2000)] 참조).
세포성 면역 반응 요소 또는 이의 단편이 포유동물에서 발현되도록 폴리뉴클레오티드를 포유동물 생체내에 투여하는 것은 포유동물 유전자 발현 분야에 공지된 다수의 방법 중 임의의 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 포유동물에 발현계 및 전달계를 비롯한 발현가능한 폴리뉴클레오티드를 투여하는 상기 방법은 미국 특허 제6,875,748호, 동 제5,763,270호, 동 제5,580,859호, 동 제6,040,295호 및 동 제6,034,072호에서 찾을 수 있다.
본원에 기재된 폴리뉴클레오티드 구조체는 세포성 면역 반응 요소 또는 이의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드가 세포 내로 도입되어 예방 또는 치료 유효량의 목적하는 세포성 면역 반응 요소 또는 이의 단편을 검출가능한 양으로 발현하도록 투여된다. 본원에 제공된 바와 같이 사용하기에 적합한 예시적인 세포성 면역 반응 요소에는 IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, TGF-β 및 IFN-γ가 포함된다.
발현계
생체내 핵산의 비바이러스 투여는 각종 방법에 의해 수행되었다. 이들에는 리포펙틴/리포좀 융합 (문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. 84, pp. 7413-7417 (1993)] 참조); 아데노바이러스 증진의 존재 및 부재하의 폴리리신 축합 (문헌 [Human Gene Therapy 3, pp. 147-154 (1992)] 참조); 및 세포에 핵산의 트랜스페린:트랜스페린 수용체 전달 (문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. 87, pp. 3410-3414 (1990)] 참조)이 포함된다. 폴리아크릴산으로 이루어진 특정 조성물의 용도가 WO 94/24983호에 개시되어 있다. 네이키드 DNA는 WO 90/11092호에 개시된 바와 같이 투여되었다.
따라서, 한 측면에서, 플라스미드는 전사 단위로서 지칭될 수도 있는 발현 카세트를 포함하는 세포성 면역 반응 요소 또는 이의 단편의 발현에 제공된다. 플라스미드가 유전자 발현에 적합한 환경에 놓이는 경우, 전사 단위는 세포성 면역 반응 요소 또는 이의 단편을 코딩하는 서열을 포함한 폴리뉴클레오티드를 발현할 것이다. 전사 단위는 세포성 면역 반응 요소 코딩 서열과 전사적으로 연결된 전사 조절 서열을 포함한다. 전사 조절 서열은 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터/인핸서 서열과 같은 프로모터/인핸서 서열을 포함할 수 있다. 그러나, 당업자는, 진핵 세포에서의 발현에 적합한 각종 다른 프로모터 서열이 공지되어 있으며 본원에 개시된 구조체에 유사하게 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 유전자 생성물의 발현 수준은 관련된 프로모터 및 관련된 인핸서 요소의 존재 및 활성화에 좌우될 것이다. 특정 실시양태에서, 세포성 면역 반응 요소 유전자 또는 이의 단편을 코딩하는 서열은 전사, 번역, RNA 안정성 및 복제에 대한 조절 요소 (즉, 전사 조절 서열을 포함함)를 함유하는 발현 플라스미드 내로 클로닝될 수 있다. 이러한 발현 플라스미드는 당업계에 널리 공지되어 있으며, 당업자는 세포성 면역 반응 요소가 발현가능한 방식으로 세포성 면역 반응 요소 또는 이의 단편을 코딩하는 서열을 포함한 폴리뉴클레오티드를 갖는 적절한 발현 구조체를 디자인할 수 있을 것이다. 세포성 면역 반응 요소 유전자 또는 이의 단편을 코딩하는 서열을 포함한 폴리뉴클레오티드가 클로닝될 수 있는 적합한 발현 플라스미드의 여러 예, 예컨대 pCI-neo, pUMVC 또는 pcDNA3이 존재한다.
세포성 면역 반응 요소 또는 이의 단편의 발현용 플라스미드를 수반하는 다량의 박테리아 숙주를 발효시킬 수 있고, 플라스미드를 이후에 사용하기 위해 정제할 수 있다. 플라스미드를 사용하는 현재 인간 임상 시험이 이러한 방법을 이용한다 (문헌 [Recombinant DNA Advisory Committee Data Management Report, Human Gene Therapy 6: 535-548 (1994)] 참조).
플라스미드의 목적은 포유동물의 세포 또는 조직에 핵산 서열을 효율적으로 전달하고 그 세포 또는 조직에서 치료 유전자 (즉, 세포성 면역 반응 요소)를 발현시키기 위한 인간 유전자 요법에 일반적으로 사용하는 것이다. 특히, 플라스미드의 목적은 많은 복제 개수를 달성하고, 플라스미드 불안정성의 잠재적 원인을 방지하고, 플라스미드 선택을 위한 수단을 제공할 수 있는 것이다. 발현의 경우, 핵산 카세트는 카세트 내에 핵산의 발현에 필요한 요소를 함유한다. 발현은 플라스미드를 이용한 삽입 유전자, 핵산 서열 또는 핵산 카세트의 효율적인 전사를 포함한다. 발현 생성물은 단백질, 폴리펩티드 또는 RNA일 수 있다. 핵산 서열은 핵산 카세트 내에 함유될 수 있다. 핵산의 발현은 연속적이거나 조절될 수 있다.
궁극적으로 핵산에 의해 코딩된 생성물의 발현을 얻는 방법에서 최초 단계는 세포에 의해 핵산을 흡수하는 것이다. 세포에 의한 핵산의 흡수는 여러 인자에 좌우되며, 이러한 인자 중 하나는 핵산이 세포 표면에 근접하는 동안의 시간 길이이다. 예를 들어, 완충액 중 플라스미드 DNA의 근육내 (i.m.) 투여 후, 근육을 마사지하는 경우, 아마도 직접적인 또는 림프관을 통한 근육 밖으로의 DNA 유출로 인해 현저한 유전자 발현 감소가 관찰된다 (문헌 [Human Gene Therapy 4:151-159; 1993] 참조). 따라서, 핵산이 확산되는 속도 또는 핵산의 세포 흡수가 요구되는 부위로부터 운반되는 속도를 지체시키는 화합물과 함께 핵산을 제제화하는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 이들 화합물은 핵산의 세포 흡수를 증가시키는데 필요한 물성을 유지 또는 회복하면서 주사와 같은 수단에 의해 유기체에 투여하기에 적합할 수 있다.
제약 조성물
본원에 제공된 조성물은, 화합물을 당업계에 널리 공지되어 있는 제약상 허용되는 담체와 함께 제제화한 제약 조성물로서 투여될 수 있다. 제약 조성물의 제제화 및 투여 기술은 예를 들어 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences," (18th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990)]에서 찾을 수 있다. 따라서, 화합물은 의약의 제조에 사용될 수 있다. 화합물의 제약 조성물은 비경구 투여용 용액 또는 냉동건조 분말로서 제제화될 수 있다. 상기 분말은 사용 전에 적합한 희석제 또는 다른 제약상 허용되는 담체를 첨가하여 재구성할 수 있다. 상기 분말은 또한 건조 형태로 분무할 수 있다. 액체 제제는 완충 등장성 수용액일 수 있다. 적합한 담체의 예에는 통상적인 등장성 식염수, 물 중 표준 5% 덱스트로스 또는 완충 나트륨 또는 암모늄 아세테이트 용액이 있다. 상기 제제는 비경구 투여에 특히 적합하지만, 또한 경구 투여에 사용될 수 있거나 흡입을 위한 정량식 흡입기 또는 분무기에 함유될 수 있다. 부형제, 예컨대 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴, 히드록시 셀룰로스, 아카시아, 폴리에틸렌 글리콜, 만니톨, 염화나트륨 또는 시트르산나트륨을 첨가하는 것이 바람직할 수 있다.
별법으로, 세포성 면역 반응 요소 또는 이의 단편을 코딩하는 서열을 포함한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물은 경구 투여를 위해 캡슐화, 정제화될 수 있거나 에멀젼 또는 시럽으로 제조될 수 있다. 제약상 허용되는 고체 또는 액체 담체가 조성물을 증량 또는 안정시키기거나 또는 조성물의 제조를 촉진하도록 첨가될 수 있다. 고체 담체에는 전분, 락토스, 황산칼슘 이수화물, 테라 알바, 마그네슘 스테아레이트 또는 스테아르산, 탈크, 펙틴, 아카시아, 아가 또는 젤라틴이 포함된다. 액체 담체에는 시럽, 땅콩 오일, 올리브 오일, 식염수 및 물이 포함된다. 생체내에서 사용되는 수성 조성물의 경우, 멸균 발열원-무함유 물을 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 제제는 포유동물, 바람직하게는 인간에게 투여하기에 적합한 제약상 허용되는 조성물을 제조하기 위해 유효량의 폴리뉴클레오티드와 함께 적합량의 수용액을 함유할 것이다. 담체는 또한 지속 방출 물질, 예컨대 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트를 단독으로 또는 왁스와 함께 포함할 수 있다. 고체 담체의 양은 변하지만, 바람직하게는 투여 단위 당 약 20 mg 내지 약 1 g일 것이다. 제약 제제는, 정제 형태의 경우 필요하다면 분쇄, 혼합, 과립화 및 압축; 또는 경질 젤라틴 캡슐 형태의 경우 분쇄, 혼합 및 충전을 포함한 통상적인 조제 기술에 따라 제조된다. 액체 담체가 사용되는 경우, 제제는 시럽, 엘릭서제, 에멀젼 또는 수성 또는 비수성 현탁액의 형태일 수 있다. 직장 투여의 경우, 화합물은 코코아 버터, 글리세린, 젤라틴 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 부형제와 조합되어 좌약으로 성형될 수 있다.
본원에 기재된 폴리뉴클레오티드의 제약상 허용되는 염의 투여가 포함된다. 이러한 염은 유기 염기 및 무기 염기를 비롯한 제약상 허용되는 비독성 염기로부터 제조될 수 있다. 무기 염기로부터 유래된 염에는 나트륨, 칼륨, 리튬, 암모늄, 칼슘, 마그네슘 등이 포함된다. 제약상 허용되는 유기 비독성 염기로부터 유래된 염에는 1급, 2급 및 3급 아민의 염, 염기성 아미노산 등이 포함된다. 제약 염의 유용한 논의에 대해서는 문헌 [S. M. Berge et al., Journal of Pharmaceutical Sciences 66:1-19 (1977)]을 참조한다.
포유동물에게 세포성 면역 반응 요소 폴레펩티드를 공급하는데 사용하기 위한 제약 조성물이 또한 본원에 제공되며, 이는 제약상 유효량의 세포성 면역 반응 요소 또는 이의 단편을 코딩하는 서열을 포함한 폴리뉴클레오티드, 담체 및 폴리뉴클레오티드를 멸균 방식으로 동봉하는 용기, 및 용기로부터 조직의 간극 공간으로 폴리뉴클레오티드의 전달을 허용하여 조직의 세포가 폴리뉴클레오티드를 흡수하고 발현할 수 있는, 용기와 관련된 수단을 포함할 수 있다. 이러한 전달을 허용하는 수단은 예를 들어 바늘에 의해 침투될 수 있는 통상적인 격벽을 포함할 수 있다. 별법으로, 용기가 주사기인 경우, 상기 수단은 주사기의 플런저 또는 주사기에 부착된 바늘을 포함하는 것으로 생각될 수 있다. 용기는 1회 이상의 단위 투여를 제공하기 위해 적어도 1 μg, 바람직하게는 적어도 5 또는 10 μg, 보다 바람직하게는 적어도 50 또는 100 μg의 폴리뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 다수의 적용에서, 용기는 적어도 500 μg 또는 1 mg의 폴리뉴클레오티드를 함유할 것이며, 종종 적어도 50 또는 100 mg의 폴리뉴클레오티드를 함유할 것이다.
용기에 제약상 허용되는 투여가능한 형태로 세포성 면역 반응 요소 또는 이의 단편을 코딩하는 서열을 포함한 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 약제의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 규정된 형태의 용기와 관련되어 있으며 인간 또는 수의학적 투여용 폴리뉴클레오티드의 형태에 대해 상기 기관에 의한 승인이 반영된 통지서를 포함할 수 있는 제약 조성물이 본원에 제공된다. 상기 통지서는 예를 들어, 처방 약물 또는 승인된 제품 삽입물에 대한 미국 식약청에 의해 승인된 표지일 수 있다.
본원에 제공된 조성물은 당업계에 널리 공지되어 있는 제약상 허용되는 담체와 함께 제제화된 제약 조성물로서 투여될 수 있다. 제제화 및 투여 기술은 예를 들어 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences," (18th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990)]에서 찾을 수 있다. 따라서, 조성물은 의약의 제조에 사용될 수 있다. 제약상 허용되는 담체, 또는 제약 조성물, 또는 포유동물에게 투여하기에 적합한 임의의 물질은 각국 규제 표준에 따라 제조 및 저장된다고 이해된다. 예를 들어, 다수의 정부가 포유동물 및/또는 인간에게 투여하기 위한 조성물의 제조 및 취급의 각종 측면, 예컨대 위생, 공정 밸리데이션, 설비 및 문서의 추적가능성, 및 직원 자격을 규제하는 지침 또는 규칙을 가지고 있다. 바람직하게는, 제약 조성물 또는 제약상 허용되는 담체를 포함하는, 본원에 제공된 조성물은 인간에게 투여하기에 적합하며, 상기 목적을 위해 미국 식약청에서 설명한 바와 같은 각국 규제, 지침 및/또는 GMP (우수 제조 기준) 규정을 따른다.
바람직한 전달 경로인 주사용의, 세포성 면역 반응 요소 또는 이의 단편을 코딩하는 서열을 포함한 폴리뉴클레오티드는 앰플 내 단위 투여 형태로 또는 다중투여 용기로 제조될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 유성 또는 바람직하게는 수성 비히클 중 현탁액, 용액 또는 에멀젼과 같은 형태로 존재할 수 있다. 별법으로, 염 형태의 폴리뉴클레오티드는 멸균 발열원-무함유 물과 같은 적합한 비히클과 함께 전달 시점에서 재구성되는 냉동건조 형태로 존재할 수 있다. 액체 형태 및 재구성될 냉동건조 형태 모두 적합하게는 주사 용액의 pH를 조정하기에 필요한 양으로 작용제, 바람직하게는 완충제를 포함할 것이다. 임의의 비경구 사용에서, 특히 제제가 정맥내 투여되는 경우, 용질의 총 농도는 제제를 등장성, 저장성 또는 약고장성으로 제조하도록 조절되어야 한다. 당과 같은 비이온성 물질이 삼투성(tonicity)을 조정하는데 바람직하며, 수크로스가 특히 바람직하다. 이들 형태 중 임의의 형태는 적합한 제제화제, 예컨대 전분 또는 당, 글리세롤 또는 식염수를 더 포함할 수 있다. 단위 투여 당 조성물은 액체이든 고체이든지 간에 0.1% 내지 99%의 폴리뉴클레오티드 물질을 함유할 수 있다.
사용 전 폴리뉴클레오티드가 포장되어 있는 단위 투여 앰플 또는 다중투여 용기는 제약상 유효 투여 또는 수회의 유효 투여에 적합한 폴리뉴클레오티드를 함유하는 용액 또는 폴리뉴클레오티드 일정량을 동봉하는 밀봉된 용기를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 멸균 제제로서 포장되고, 밀봉된 용기는 사용시까지 제제의 멸균성을 보존하도록 디자인된다.
세포성 면역 반응 요소 또는 이의 단편을 코딩하는 서열을 포함한 폴리뉴클레오티드가 포함된 용기는 표지된 포장을 포함할 수 있으며, 상기 표지는 정부 기관, 예를 들어 식약청에 의해 규정된 형태의 통지서를 포함할 수 있으며, 상기 통지서는 인간 투여용 폴리뉴클레오티드 물질의 제조, 사용 또는 판매에 대한, 연방법하의 상기 기관의 승인을 반영하고 있다.
연방법은 인간 요법에서 제약 조성물의 사용이 연방 정부 기관에 의해 승인되어야 한다고 요구한다. 미국에서 시행은 식약청이 담당하며, 상기 승인을 보장하기 위한 적절한 규정 (21 U.S.C. § 301-392에 상세설명됨)을 공포한다. 동물 조직으로부터 제조된 생성물을 비롯한 생물학적 물질에 대한 규정은 42 U.S.C. § 262 하에 제공된다. 유사한 승인이 대부분의 외국 국가에서 요구된다. 규정은 국가마다 다르지만, 개개의 절차는 당업계에 널리 공지되어 있으며, 본원에 제공된 조성물 및 방법도 바람직하게는 이를 따른다.
투여될 투여량은 치료될 대상체의 상태 및 크기 뿐만 아니라 치료 빈도 및 투여 경로에 상당히 좌우된다. 투여량 및 빈도를 비롯한 연속 요법에 대한 계획은 초기 반응 및 임상 판단에 좌우될 수 있다. 에어로졸 제제의 흡입과 같은 다른 비경구 경로가 예를 들어 코, 목, 기관지 조직 또는 폐의 점막에 대한 특정 투여에 요구될 수 있지만, 조직의 간극 공간 내로의 비경구 주사 경로가 바람직하다.
따라서, 조직 세포가 세포성 면역 반응 요소 또는 이의 단편을 발현하도록 조직 내 간극 도입에 적합한, 제약상 허용되는 주사가능한 담체 중 용액형태의 세포성 면역 반응 요소 또는 이의 단편을 코딩하는 서열을 포함한 폴리뉴클레오티드, 상기 용액을 동봉하는 용기, 및 약제의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 규정된 형태의 용기와 관련되어 있으며 인간 투여용 폴리뉴클레오티드 용액의 제조, 사용 또는 판매에 대해 상기 기관에 의한 승인이 반영된 통지서를 포함할 수 있는 제약 제품이 본원에 제공된다.
투여
본원에 개시된 임의의 방법에서, 세포성 면역 반응 요소 또는 이의 단편을 코딩하는 서열을 포함한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물이 포유동물에 전달되는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게, 포유동물은 인간이다. 본원에 개시된 임의의 방법에 따른 조성물의 투여는 당업계에 공지된 각종 방법 중 임의의 방법에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,676,954호에는 양이온성 지질 담체와 복합체를 이루는 유전 물질을 마우스 내로 주사하는 것이 개시되어 있다. 또한, 미국 특허 제5,589,466호, 동 제5,693,622호, 동 제5,580,859호, 동 제5,703,055호, 및 PCT 국제특허출원 제PCT/US94/06069호 (WO 94/29469호)에는 네이키드 DNA 또는 DNA 양이온성 지질 복합체를 포함하는 조성물을 척추동물에 전달하는 방법이 제공되어 있다.
특정 실시양태에서, 세포성 면역 반응 요소 또는 이의 단편을 코딩하는 서열을 포함한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 화합물은 비경구, 예컨대 혈관내, 정맥내, 동맥내, 근육내, 피하 등으로 투여될 수 있다. 화합물은 근육, 피부, 뇌, 폐, 간 또는 비장 조직 내로 도입될 수 있다. 화합물은 또한 혈액 내로 도입될 수 있다. 투여는 또한 경구, 비강, 직장, 경피 또는 에어로졸을 통한 흡입으로 수행될 수 있다. 조성물은 또한 볼루스로서 투여될 수 있거나 또는 서서히 주입될 수 있다.
세포성 면역 반응 요소 또는 이의 단편을 코딩하는 서열을 포함한 폴리뉴클레오티드는 동물체의 조직, 예를 들어 근육, 피부, 뇌, 폐, 간, 비장, 골수, 흉선, 심장, 림프, 혈액, 뼈, 연골, 췌장, 신장, 담낭, 위, 장, 정소, 난소, 자궁, 직장, 신경계, 눈, 선 조직 및 연결 조직의 간극 공간에 전달될 수 있다. 조직의 간극 공간은 기관 조직의 망상 섬유, 관벽 또는 실벽에서의 탄성 섬유, 섬유 조직의 콜라겐 섬유 사이에 세포간 유체 점액다당류 매트릭스, 또는 근육 세포를 덮는 연결 조직 또는 뼈 구멍 내에 상기 동일한 매트릭스를 포함한다. 유사하게 상기 공간은 순환 혈장 및 림프 채널의 림프액에 의해 점유된다. 근육 조직의 간극 공간으로의 전달이 하기 논의된 이유로 바람직하다. 상기 세포를 포함하는 조직 내로의 주사에 의해 편리하게 전달될 수 있다. 전달 및 발현이 분화되지 않은 세포 또는 덜 완전히 분화된 세포, 예를 들어 혈액의 줄기 세포 또는 피부 섬유아세포에서 이루어질 수 있지만, 바람직하게는 분화된 지속적 비분할 세포에 전달되고 그 세포에서 발현된다.
생체내에서, 근육 세포는 폴리뉴클레오티드를 흡수 빛 발현하는 능력이 특히 우수하다. 이러한 능력은 다핵 세포, 근육세포질 세망 및 횡소관계를 포함하는 근육의 단일 조직 구조 때문일 수 있다. 본원에 제공된 폴리뉴클레오티드는, 세포외액을 함유하며 근육 세포 내로 심부 연장되는 횡소관계를 통해 근육으로 도입될 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드는 손상된 근육 세포로 도입되어 회복시킬 수 있다.
근육은 또한 다수의 치료 적용에서 폴리뉴클레오티드의 전달 및 발현을 위한 부위로서 유리하게 사용되는데, 이는 동물이 피부를 통한 직접적인 주사에 의해 편리하게 접근되는 비례적으로 많은 근육량을 갖기 때문이며, 이러한 이유로 비교적 많은 투여량의 폴리뉴클레오티드가 수회 주사 및 반복적 주사에 의해, 장기간에 걸친 요법이 용이하게 수행되며 특별한 기술이나 장치 없이도 안전하게 수행될 수 있는 정도로 근육에 침적될 수 있다.
근육 조직 이외의 조직이 또한 주사 부위로서 유리하게 사용되어 세포성 면역 반응 요소를 생성할 수 있다. 이러한 한가지 조건은, 유효하기 위해 특정 유형의 세포와 관련하여 존재해야 하는 폴리펩티드, 예를 들어 콜레스테롤 항상성과 관련된 간 세포의 세포 표면 수용체를 제공하는 폴리뉴클레오티드의 사용이다 (문헌 [Brown and Goldstein, Science 232:34-47 (1986)] 참조). 이 적용 및 다수의 다른 적용에서, 예컨대 효소 또는 호르몬이 유전자 생성물인 경우 가치있는 치료 결과를 나타내기 위해 높은 수준의 발현을 달성하는 것이 필요하지 않을 수 있다.
특정 실시양태에서, 세포성 면역 반응 요소 또는 이의 단편을 코딩하는 서열을 포함한 폴리뉴클레오티드는 주사가능한 담체를 단독으로 사용하여 조직 내로 도입된다. 담체는 바람직하게는 등장성, 저장성 또는 약고장성이며, 수크로스 용액에 의해 제공된 바와 같이 비교적 낮은 이온 농도는 갖는다. 제제는 더 유리하게는 폴리펩티드의 형태로 또는 폴리뉴클레오티드로서 리포좀에 도입되는 시토킨의 공급원을 포함할 수 있다.
세포성 면역 반응 요소 또는 이의 단편을 코딩하는 서열을 포함한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 화합물은 다른 의학적으로 유용한 약물 또는 생물학제를 포함하도록 제제화된다. 화합물은 또한 본원에 기재된 화합물이 적용되는 질환 또는 상태에 유용한 다른 약물 또는 생물학제의 투여와 함께 투여될 수 있다 (예를 들어 골다공증에 유용한 활성 성분에 대해 미국 특허 제6,413,955호 참조).
세포성 면역 반응 요소 또는 이의 단편을 코딩하는 서열을 포함한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 화합물은 또한 "유전자 총"에 의해 조직 또는 세포 내로 도입될 수 있다. DNA는 금 마이크로입자 상에 코팅되어, 입자 충격 장치 또는 문헌 (예를 들어 [Tang et al. (1992), Nature 356:152-154] 참조)에 기재된 바와 같은 "유전자 총"에 의해 피부내로 전달될 수 있으며, 여기서 금 마이크로프로젝틸(microprojectile)이 치료 DNA로 코팅된 후 피부 세포 내로 발포된다.
세포성 면역 반응 요소 또는 이의 단편을 코딩하는 서열을 포함한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 화합물은 또한 비강 및 경구 투여에 의해 도입될 수 있따. 적은 투여량은 활성 억제에 바람직한 반면, 보다 높은 투여량은 클론 아네르기/삭제에 바람직하다. 경구 및/또는 비강 항원은 T 헬퍼 2 (Th2) T 세포, 예컨대 IL-4 및 IL-10, 및 T 헬퍼 3 (Th3) T 세포, 예컨대 TGF-β, 이외에 CD4+CD25+ 조절 세포 및 잠복-관련 펩티드 T 세포를 유도한다. 따라서, 경구 내성의 유도는 IL-4, IL-10, 항-IL-12, TGF-β, 콜레라 톡신 B 서브유닛, Flt-3 리간드 및 항-CD40 리간드를 투여하여 증진될 수 있다.
경구 및 비강 항원 투여 (예를 들어 점막 내성)는 실험 자가면역 뇌염, 포도막염, 갑상선염, 근무력증, 관절염, 및 비-비만 당뇨병 (NOD) 마우스에서의 당뇨병을 비롯한 자가면역 질환, 및 천식, 죽상동맥경화증, 이식거부, 알레르기 (예컨대 디니트로클로로벤젠 (DNCB)에 대한 접촉 민감성 및 니켈 알레르기), 대장염, 뇌졸중, 및 알츠하이머병과 같은 비-자가면역 질환의 동물 모델을 억제한다 (문헌 [McGeer P. et al., 42 Neurology 447-449 (1992)]; [Okuray Y., 103(25) PNAS USA 9619-24 (Epub June 12, 2006)]; [Qu B. et al., 244(1-2) J. Neurol. Sci. 151-158 (2006)] 참조). 점막 내성은 투여 용이성, 독성 부재 및 항원-특이적 작용 메카니즘으로 인해 알츠하이머병과 같은 신경퇴행성 질환의 치료에 유리할 수 있다.
점막 내성은 독성 부재, 시간에 걸친 투여 용이성 및 항원-특이적 작용 메카니즘 때문에 신경퇴행성 질환의 치료에 대한 매력적인 접근법이다. 인간 질환의 치료를 위한 경구 내성의 성공적인 적용은 투여량, 면역 효과를 평가하기 위한 발달하는 면역 표지, 경로 (비강 대 경구), 제제, 점막 보조제, 조합 요법 및 조기 요법에 좌우될 것이다.
본원에 사용된 어구 "유효량"은 수용자에게 유익한 효과를 부여하기에 충분히 높은 농도를 제공하는데 충분한 투여량을 지칭한다. 임의의 특정 대상체에 대한 특정 치료 유효 투여량은 치료될 장애, 장애의 중증도, 특정 화합물의 활성, 투여 경로, 화합물의 제거율, 치료 기간, 화합물과 조합 또는 부합되는 약물, 대상체의 연령, 체중, 성별, 식이 및 일반 건강을 비롯한 각종 인자 및 의학계에 널리 공지된 유사 인자에 좌우될 것이다. "치료 유효량"을 결정하는데 고려되는 각종 일반적인 고려사항이 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [Gilman et al., eds., Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th ed., Pergamon Press, 1990]; 및 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990]에 기재되어 있다.
보조제
포유동물계에 세포성 면역 반응 요소 또는 이의 단편을 코딩하는 서열을 포함한 폴리뉴클레오티드를 전달하기 위해, 통상적으로 전달계를 이용하는 것이 바람직하다. 이러한 전달계는 여러 이익을 제공할 수 있으며, 특히 DNA의 본래형태를 보호하는 안정화를 제공할 뿐만 아니라 세포 흡수를 돕는다.
또한, 본원에 기재된 예시적인 전달계 (즉, 형질감염 시약)에 의해 예시된 바와 같이, 제제의 비-DNA 성분은 면역계 증진 또는 활성화에 기여할 수 있다. 그 결과, 전달계의 성분은 면역자극 효과를 증진 또는 최소화하기 위해 특정 유전자 생성물과 함께 선택될 수 있다.
면역자극 효과는 또한 특정 뉴클레오티드 서열에 대해 기재되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Sato et al., Science 273: 352-354 (1996)]은 특정 CpG 함유 서열을 갖는 이중 가닥 DNA를 이용한 백신처리가 인터페론-γ, 인터페론-β 및 인터류킨-12의 생성에 대해 미치는 효과를 기재하고 있다.
형질감염 시약
본원에 제공된 세포성 면역 반응 요소 또는 이의 단편을 코딩하는 서열을 포함한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물은 또한 세포 내부 및/또는 세포내 목적하는 위치로 폴리뉴클레오티드의 전달을 촉진하는 1종 이상의 형질감염 촉진 물질을 포함할 수 있다. 이러한 다수의 형질감염 촉진 물질은 예를 들어 리포펙틴(Lipofectin), 리포펙타민(Lipofectamine), 리포펙타민 2000, 옵티펙트(Optifect), 수퍼펙트(SuperFect)로 시판된다. 형질감염 촉진 물질의 예에는 지질, 바람직하게는 양이온성 지질; 무기 물질, 예컨대 인산칼슘, 및 금속 (예를 들어, 금 또는 텅스텐) 입자 (예를 들어, "분말"형 전달 용액); 펩티드, 예를 들어 양이온성 펩티드, 특정 세포 또는 핵이나 인과 같은 세포내 소기관으로의 선택적 전달을 위한 표적 펩티드, 및 양쪽성 펩티드, 즉 헬릭스 형성 또는 기공 형성 펩티드; 염기성 단백질, 예컨대 히스톤; 아시알로단백질; 바이러스 단백질 (예를 들어, 센다이(Sendai) 바이러스 코트 단백질; 기공 형성 단백질; 및 중합체, 예를 들어 덴드리머, 별형 중합체, "동종" 폴리아미노산 (예를 들어, 폴리리신, 폴리아르기닌), "이종" 폴리아미노산 (예를 들어, 리신과 글리신의 혼합물), 공중합체, 폴리비닐피롤리돈 (PVP) 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 또한, 생체내 척추동물 세포 내로 폴리뉴클레오티드의 도입을 촉진 및 증진시키는 보조제도 "형질감염 촉진 물질"로서 고려될 수 있다.
리포펙틴 촉진된 형질감염은 예를 들어 미국 특허 제6,034,072호, 동 제6,040,295호 및 동 제6,710,035호에 기재된 바와 같이 당업계에 널리 공지되어 있다. 본원에 제공된 특정 실시양태의 조성물은 형질감염 촉진 물질로서 양이온성 지질 (예를 들어, DOTMA, DMRIE, DOSPA, DC-Chol, GAP-DLRIE), 염기성 지질 (예를 들어, 스테릴 아민), 중성 지질 (예를 들어, 콜레스테롤), 음이온성 지질 (예를 들어, 포스파티딜 세린), 및 쯔비터이온성 지질 (예를 들어, DOPE, DOPC)을 비롯한 지질을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 양이온성 지질이 1종 이상의 보조지질과 혼합된다. 정의상, 용어 "보조지질"은 양이온성 지질 성분과 조합될 수 있으며 포스포리피드와 같은 양쪽성 지질 및 콜레스테롤과 같은 중성 지질을 포함하는 임의의 소수성 물질을 지칭한다. 양이온성 지질 및 보조지질은 예를 들어 리포좀, 다층막 소포, 단일막 소포, 미셀 및 간단한 막을 비롯한 각종 비공유결합으로 결합된 육안으로 보이는 구조체를 생성하기 위해 다수의 방식으로 혼합 또는 조합될 수 있다.
전달은 또한 DNA 전달체를 사용할 수 있다. DNA 전달체는 DNA 벡터에 결합하며 표피 세포에 흡수될 수 있는 분자를 지칭한다. DNA 전달체는 DNA에 비공규결합으로 결합할 수 있으며 세포막을 통해 DNA를 효율적으로 전달할 수 있는 분자 복합체를 함유한다. DNA 전달체계는 DAN에 독립적으로 및 비공유결합으로 결합되는 여러 요소를 함유한 입자로 이루어질 수 있다. 각각의 요소는 특정 수용체 또는 다른 관능기를 인식하는 리간드, 예컨대 DNA에 결합하는 양이온성 기와 복합체를 이루는 단백질로 이루어진다. 사용될 수 있는 양이온의 예에는 스퍼민, 스퍼민 유도체, 히스톤, 양이온성 펩티드 및/또는 폴리리신이 있다. 제1 요소는 DNA 벡터 및 표적 세포 상의 세포 표면 수용체 둘 다에 결합할 수 있다. 이러한 요소의 예예에는 아시알로글리코단백질 수용체, 폴레이트 수용체, 만노스-6-포스페이트 수용체 또는 카르니틴 수용체와 상호작용하는 유기 화합물이 있다. 제2 요소는 DNA 벡터 및 핵막 상의 수용체 둘 다에 결합할 수 있다. 핵 리간드는 핵막을 통해 전달체계를 인식 및 전달할 수 있다. 이러한 리간드의 예에는 SV40 거대 T 항원 또는 히스톤으로부터의 핵 표적 서열이 있다. 제3 요소는 DNA 벡터 및 에피좀 용균을 유도하는 요소 둘 다에 결합할 수 있다. 예에는 불활성화 바이러스 입자, 예컨대 아데노바이러스, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌과 관련된 펩티드, 또는 GALA 펩티드가 포함된다.
실시예 1
DNA 백신 동물 모델 연구
K670N/M671L APP 이중 돌연변이를 함유하는 트랜스제닉 마우스 (Tg-2576)를 DNA 백신처리 및 알츠하이머병의 효과를 연구하는데 사용하였다. 마우스를 각 연 구에 대한 제도 지침에 따라 테네시주 주립대학(University of Tennessee)의 동물 우리 시설에 유지하였다. 이들 연구는 실험용 동물의 인간 관리 및 이용에 대한 공중보건(Public Health Service) 정책에 따라 테네시주 주립대학의 동물 관리 및 이용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee of the University of Tennessee)의 승인을 받았다. 동물 모델 실험으로부터의 결과는 다른 유기체, 특히 인간에서 입양 세포 유전자 요법 원리의 증거를 제공한다.
4, 5개월 사에에, Tg-2576 마우스에서 뇌 병변이 나타난다. 9 내지 10개월 후, 병변이 완전히 발달한다. 4개월 쯤에 시작한 백신처리는 알츠하이머병에 대한 치료의 예방 효과를 나타내는 반면, 5개월 후에 시작 (즉, 6개월에 시작)한 백신처리는 이미 알츠하이머병이 발달한 마우스의 치료를 나타낸다.
4개월령 마우스를 IL-4, IL-10, TGF-β, IFN-γ를 코딩하는 DNA 백신으로 처리하거나, 또는 대조군 벡터로 투여하였다. 백신 100 μg을 각각의 마우스에 제공하였다. 마우스를 2개월 간격으로 2배 증가시켰다. 수컷 및 암컷 Tg-2576 마우스 둘 다를 사용하고, 60주령까지 유지하였다. 이어서, 마우스를 희생시키고, 뇌를 제거하고, 액체 질소 중에 급속 냉동시키고, -80℃에서 저장하였다.
실시예 2
기억 평가
공간 학습 및 기억을 모리스(Morris) 물 미로 항해 작업 (물 미로)을 사용하여 평가하였다. 마우스를 불투명한 물의 원형 풀에서 물 밖으로 탈출하기 위해 플랫폼의 위치를 학습하도록 훈련시켰다. 풀은 임의의 상이한 거리 공간 단서를 갖 는 용기의 중앙에 위치시켰다. 오버헤드 카메라를 이용하여 모든 시험을 비디오녹화하였다. 물 탱크 (80 cm 폭, 80 cm 깊이)를 23℃의 물로 채웠다. 숨겨진 원형 플랫폼 (15 cm 폭)을 수면 1 cm 아래에 놓았으며, 이는 동물을 위한 탈출 플랫폼으로서의 역할을 하였다. 각 시험에 대한 최대 수영 시간은 90초이었고, 이어서 플랫폼 상에서 20초 휴식하였다. 각각의 마우스를 하루에 4회의 시험으로 5일 동안 훈련시켰다. 훈련 매일 4개의 출발점을 무작위로 선정하였다. 마지막 시험 30분 후 플랫폼의 부재 하에서 보유 시험 (프로브 시험)을 수행하였다. 각각의 동물을 표적 사분면의 반대 위치로부터 방출시키고 60초 동안 수영하도록 하였다. 7일에 재훈련 후, 탈출 플랫폼을 반대 사분면으로 이동시키고, 실험 8-10일에 역 훈련 과정을 수행하였다. 역 훈련에 대한 보유 시험 또한 마지막 습득 시험 30분 후에 수행하였다. 각각의 시험 동안, 잠복기 (마우스가 플랫폼에 도달하는데 걸리는 시간 길이)를 등록하였다.
실시예 3
알츠하이머병의 예방을 위한 물 미로 결과
4개월령에 시작하여 백신처리한 8개월령 마우스의 물 미로 결과
마우스
동정 수
잠복기
통상적인 비처리 마우스 1 6초
대조군 벡터를 갖는 Tg-2576 마우스 1 2분
IL-10 벡터를 갖는 Tg-2576 마우스 1 15초
TGF-β 벡터를 갖는 Tg-2576 마우스 1 23초
4개월령에 시작하여 백신처리한 9개월령 마우스의 물 미로 결과
마우스
동정 수
잠복기
통상적인 비처리 마우스 1 6초
대조군 벡터를 갖는 Tg-2576 마우스 1 2분 40초
2 52초
IL-10 벡터를 갖는 Tg-2576 마우스
1 8초
2 7초
3 15초
TGF-β 벡터를 갖는 Tg-2576 마우스
1 1분 20초
2 1분 10초
IL-4 벡터를 갖는 Tg-2576 마우스 1 10초
INF-γ 벡터를 갖는 Tg-2576 마우스 1 25초
이들 결과는 알츠하이머병의 효과가 DNA 백신을 사용한 조기 치료에 의해 예방되고/거나 대단히 감소할 수 있음을 나타낸다.
실시예 4
알츠하이머병의 치료를 위한 물 미로 결과
6, 8, 10 및 12개월령에 백신처리한 7.5, 9.5 및 11개월령 마우스의 물 미로 결과
실험 1: 7.5개월령 마우스의 결과
마우스
동정 수
잠복기
통상적인 비처리 마우스 1 6초
대조군 벡터를 갖는 Tg-2576 마우스 1 2분
TGF-β 벡터를 갖는 Tg-2576 마우스 1 23초
IL-10 벡터를 갖는 Tg-2576 마우스 1 15초
실험 2: 9.5개월령 마우스의 결과
마우스
동정 수
잠복기
대조군 벡터를 갖는 Tg-2576 마우스
1 2분 24초
2 52초
TGF-β 벡터를 갖는 Tg-2576 마우스
1 1분 12초
2 1분 6초
INF-γ 벡터를 갖는 Tg-2576 마우스 1 25초
IL-4 벡터를 갖는 Tg-2576 마우스 1 10초
IL-10 벡터를 갖는 Tg-2576 마우스
1 8초
2 7초
실험 3: 11개월령 마우스의 결과
마우스
동정 수
잠복기
대조군 벡터를 갖는 Tg-2576 마우스 1 2분 24초
혼합 유전자*를 이용한 Tg-2576 마우스 1 13초
TGF-β 벡터를 갖는 Tg-2576 마우스
1 1분 18초
2 6초
IFN-γ 벡터를 갖는 Tg-2576 마우스 1 4초
IL-4 벡터를 갖는 Tg-2576 마우스 1 10초
IL-10 벡터를 갖는 Tg-2576 마우스
1 2초
2 7초
*혼합 유전자는 BDNF, IL-10, IL-4, ApoE를 포함함
뇌 병변이 4 내지 5개월령 쯤에 형성되기 때문에, 이들 마우스는 이미 알츠하이머병이 발달하였으며, 이들 결과는 알츠하이머병이 치료될 수 있다는 것 및 그 효과가 세포성 면역 반응 요소를 코딩하는 DNA 백신에 의해 감소 또는 반전될 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 5
뇌 조직구조
마우스를 아버틴으로 마취시킨 후, 귀를 통해 가온 0.1 M 포스페이트 완충 용액 (PBS), 이어서 가온 완충된 1.5% 파라포름알데히드 용액으로 2분 동안 관류하였다. 이어서, 한냉 4% 파라포름알데히드를 함유하는 제2 고정액으로 25분 동안 관류하였다. 동물을 죽이고, 뇌 및 뼈를 노출시키고, 전체 머리를 10% 중성 포름알데히드 용액에 함침시키고, 밤새 저장하였다. PBS로 헹군 후, 뇌를 에탄올로 탈수시키고, 파라핀에 삽입하였다. 전두엽에서 시작하여 소뇌로 향하는 6 μm 두께의 관상 단면의 군을 수집하고, 마이크로톰을 사용하여 일련의 순서로 탑재하였다. 모든 단면을 탑재하고, 표준 헤마톡실린 및 에오신(Hematoxylin and Eosin, H&E) 및 베타 아밀로이드 면역조직화학 염색(Beta Amyloid Immunohistochemical Staining)으로 염색하여 병변 또는 신경퇴행의 증거를 조사하였다. 모든 단면을 광학 현미경 (최종 확대 x 400의 칼 자이스 악시오스코프(Carl Zeiss Axioskop) 2 플러스 HAL 100)을 이용하여 조사하였다. 컴퓨터에 연결된 카메라 (라이카(Leicar))를 사용하여 단면의 디지탈 영상을 얻었다.
헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색 프로토콜
슬라이드 홀더 (유리 또는 금속)에 파라핀 단면을 함유하는 슬라이드를 놓는다.
하기를 사용하여 단면을 파라핀 제거하고 재수화시킨다:
3 x 3' 크실렌 (에탄올을 사용하기 전에 초과량의 크실렌을 블로팅한다(blot)) (스타트랩(StatLab) #8400, 실험용 등급, 아나파트 브랜드(Anapath brand), 텍사스주 루이스빌 소재)
3 x 3' 100% 에탄올
1 x 3' 95% 에탄올
1 x 3' 80% 에탄올
1 x 5' 탈이온수
단면이 물 중에 있는 동안, 표면의 헤마톡실린을 킴와이프(Kimwipe)로 걷어내어 산화된 입자를 제거한다. 헤마톡실린으로 가기 전에 슬라이드 홀더로부터 초과량의 물을 블로팅한다.
헤마톡실린 염색은 하기를 포함한다:
1 x 3' 헤마톡실린 (폴리 사이언티픽(Poly Scientific) #s212A, 빙초 산을 함유하는 해리스(Harris) 헤마톡실린, 뉴욕주 베이쇼어 소재)
탈이온수로의 헹굼
1 x 5' 수돗물 (염색을 진행시킴)
산 에탄올 중에 8 내지 12회 (신속히) 침지시킴 (탈염색)
2 x 1' 수돗물 헹굼
1 x 2' 탈이온수 헹굼 (밤새 이 단계에 남겨질 수 있음)
에오신으로 가기 전에 슬라이드 홀더로부터 초과량의 물을 블로팅한다.
에오신 염색 및 탈수:
1 x 30초 에오신 (보다 오래된 에오신 배치로 45초 이하) (폴리 사이언티픽 #s176, 에오신 플록신(Eosin Phloxine) 염색, 뉴욕주 베이쇼어 소재)
3 x 5' 95% 에탄올
3 x 5' 100% 에탄올 (크실렌으로 가기 전에 초과량의 에탄올을 블로팅함)
2 x 15' 크실렌
슬라이드를 크실렌 중에 밤새 남겨 임의의 물을 잘 제거할 수 있다.
기포가 남지 않도록 주의하면서, 퍼마운트(Permount) (크실렌 기재) (피셔 사이언티픽(Fisher Scientific) #SP15-100, 조직학 탑재 매질)를 슬라이드 상에 유리 막대를 사용하여 적가한다.
커버슬립을 비스듬히하고, 슬라이드 상에 서서히 떨어뜨린다. 퍼마운트가 모든 조직을 덮으면서, 커버슬립 아래로 전개되도록 한다.
후드에서 밤새 건조시킨다.
베타 아밀로이드 면역조직화학 염색 프로토콜
베타 아밀로이드는 뇌에서 발견된 세포외 섬유상 단백질 침적물이다. 이는 아밀로이드 코어 및 신경염 플라크의 주요 단백질 성분이며, 또한 신경원섬유에서 침적물로서 발견된다. 인간에서, 알츠하이머병은 노인성 치매의 가장 통상적인 원인이며, 뇌에 비정상적인 섬유상 단백질의 침적물을 특징으로 한다. 베타 아밀로이드 침적물은 또한 루이 소체 치매, 다운 증후군, 아밀로이드증 (더치형) 및 괌 파킨슨-치매 복합병에서 검출된다. 알츠하이머병을 갖는 뇌 조직에 더하여 이들 질환을 갖는 뇌 조직을 양성 대조군으로서 사용하였다.
고정 단계: 포르말린-고정된, 파라핀 삽입된 단면.
양성 대조군: 알츠하이머병, 루이 소체 치매, 다운 증후군, 아밀로이드증 (더치형) 및 괌 파킨슨-치매 복합병을 갖는 뇌 조직.
용액 및 시약:
1차 항체:
마우스 항-베타-아밀로이드 (클론: 6F/3D) (노보카스트라(Novocastra), Cat# NCL-B-아밀로이드). 최적 희석 1:100. 종 반응성: 인간, 마우스 (보다 많은 정보에 대해서는 항체 데이타시트 참조).
2차 항체:
말 항-마우스 IgG (H+L), 비오티닐화 (벡터 래보러토리즈(Vector Laboratories), Cat# BA-2000). 최적 희석 1:500.
검출 시약:
HRP-스트렙타비딘 (벡터 래보러토리즈, Cat# SA-5004). 최적 희석 1:500
과정:
1. 증류수에 단면을 파라핀처리함.
2. 에피토프 복구: 포름산 에피토프 복구 방법을 사용함.
3. 단면을 세정 완충액 2회 변경하며 각각에 대해 2분간 헹굼.
4. 혈청 차단: 단면을 통상적인 말 혈청 차단 용액으로 30분 동안 인큐베이션하여 이뮤노글로불린의 비특이적 결합을 차단함.
5. 1차 항체: 단면을 1차 항체 희석 완충액으로 1:100 희석된 마우스 항-베타-아밀로이드 (노보카스트라, Cat# NCL-B-아밀로이드)를 이용하여 실온에서 1시간 동안 인큐베이션함.
6. 2 x 2분 동안 세정 완충액으로 헹굼.
7. 퍼옥시다제 차단: 단면을 퍼옥시다제 차단 용액 중에서 10분 동안 인큐베이션하여 내인성 퍼옥시다제 활성을 차단함.
8. 3 x 2분 동안 세정 완충액으로 헹굼.
9. 2차 항체: 단면을 2차 항체 희석 완충액으로 희석된 비오티닐화 말 항-마우스 IgG를 이용하여 실온에서 30분 동안 인큐베이션함.
10. 3 x 2분 동안 세정 완충액으로 헹굼.
11. 검출: 단면을 HRP-스트렙타비딘 희석 완충액으로 희석된 HRP-스트렙타비딘을 이용하여 실온에서 30분 동안 인큐베이션함.
12. 3 x 2분 동안 세정 완충액으로 헹굼.
13. 크로모젠/기질: 단면을 DAB 퍼옥시다제 기질 용액 중에서 5 내지 10분 동안 인큐베이션함.
14. 증류수로 간단히 헹굼.
15. 필요한 경우 길(Gill) 헤마톡실린 용액 또는 마이어(Mayer) 헤마톡실린 용액으로 대비염색함.
16. 흐르는 수돗물로 5분 동안 헹굼.
17. 95% 에탄올을 통해 2분 동안, 100% 에탄올을 통해 2 x 3분 동안 탈수시킴.
18. 크실렌으로 2 x 3분 동안 맑게함.
19. 영구 탑재 매질로 커버슬립함.
결과:
염색 패턴: 양성 염색을 노 플라크 코어, 플라크 주변 및 확산 플라크에서 관찰할 수 있었다. 알츠하이머병의 경우 염색은 관벽 및 세포외 신경원섬유에서 관찰할 수 있었다.
주석:
1. 관련 프로토콜: Tau (Tau-2) (노보카스트라)
2. 아비딘/비오틴 차단은 내인성 비오틴을 함유할 수 있는 신장, 간, 전립선, 결장 및 내장과 같은 특정 조직에 대해 내인성 비오틴 활성을 차단하는데 필요할 수 있다. 냉동 단면의 경우, 이소펜탄 중의 급속 냉동 신선 조직을 액체 질 소 중에서 예비-냉각시키고, 냉동주형 내 OCT 화합물에 삽입한다. 4 내지 8 μm 크라이오새트(cryosat) 단면을 절단하고, 수퍼프로스트 플러스 슬라이드(superfrost plus slide) 상에 탑재한다. 슬라이드를 필요할 때까지 -80℃에서 저장한다. 염색 전에, 슬라이드를 실온에서 30분 동안 공기 건조시키고, 빙냉 아세톤 중에서 5분 동안 고정시킨다. 추가 30분 동안 공기 건조시킨다. 이어서, 일상적인 면역염색을 위해 단계 3부터 시작한다.
실시예 6
알츠하이머병의 예방을 위한 물 미로 결과
6, 8, 10, 12 및 14개월령에 백신처리한 16개월령 마우스의 물 미로 결과
마우스
동정 수
잠복기
통상적인 비처리 마우스 1 6초
대조군 벡터를 갖는 Tg-2576 마우스 1 1분 2초
IL-10 벡터를 갖는 Tg-2576 마우스
1 3초
2 4초
TGF-β 벡터를 갖는 Tg-2576 마우스 1 14초
IL-4 벡터를 갖는 Tg-2576 마우스 1 4초
IL-10 및 IL-4 벡터를 갖는 Tg-2576 마우스 1 3초
INF-γ 벡터를 갖는 Tg-2576 마우스 1 24초
6, 8, 10 및 12개월령에 백신처리한 13개월령 마우스의 물 미로 결과
마우스
동정 수
잠복기
통상적인 비처리 마우스 1 6초
대조군 벡터를 갖는 Tg-2576 마우스
1 3분 40초
2 1분 40초
IL-10 벡터를 갖는 Tg-2576 마우스

1 1초
2 1초
3 8초
TGF-β 벡터를 갖는 Tg-2576 마우스
1 1분 20초
2 30초
IL-4 벡터를 갖는 Tg-2576 마우스 1 10초
IL-10 및 IL-4 벡터를 갖는 Tg-2576 마우스
1 1초
2 2초
IL-10 및 TGF-β 벡터를 갖는 Tg-2576 마우스
1 45초
2 44초
β-아밀로이드 벡터를 갖는 Tg-2576 마우스
1 48초
2 2분 35초
β-아밀로이드 및 APO-E 벡터를 갖는 Tg-2576 마우스 1 36초
β-아밀로이드 및 NGF 벡터를 갖는 Tg-2576 마우스
1 19초
2 36초
INF-γ 벡터를 갖는 Tg-2576 마우스

1 2분 8초
2 36초
실시예 7
혼합 유전자 백신처리의 뇌 조직구조
단지 DNA 백신 벡터만으로 (도 2a) 또는 IL-4, IL-10, 뇌-유래 신경 성장 인자 (NGF) 및 Apo-E2 유전자를 함유한 DNA 백신의 혼합물로 (도 2b) 처리된 18개월령 아밀로이드 전구체 단백질 (APP) 트랜스제닉 마우스로부터 해마 영역의 마우스 뇌 조직을 상기한 바와 같이 처리하였다. 마우스를 6, 8, 10, 12, 14 및 16개월령에 근육내로 백신처리하였다. 각각의 혼합 DNA 백신처리의 투여량은 각각 4개의 유전자에 대해 주사 당 대략 100 μg (총 대략 400 μg)이었다. 냉동된 뇌 조직을 형광 표지된 항-아밀로이드 단백질 항체로 염색하였다. 비처리 마우스 뇌에는 다 량의 아밀로이드 조직이 존재하였고 (도 2a), 혼합 DNA 백신처리 마우스 뇌에는 현저히 감소된 아밀로이드 단백질이 존재하였다 (도 2b).
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 업계의 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본원에 예시적으로 기재된 발명은 적합하게는 본원에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 제한 또는 제한들의 부재 하에 실시될 수 있다. 따라서, 예를 들어 용어 "포함하는", "비롯한", "함유하는" 등은 제한 없이 광범위하게 해석될 것이다. 추가로, 본원에 사용된 용어 및 표현은 제한 없이 설명된 용어로서 사용되었으며, 상기 용어 및 표현의 사용이 도시 및 기재된 특징 또는 그의 부분의 임의의 동등물을 배제하는 것을 의도하지는 않지만, 청구된 본 발명의 범위 내에서 각종 변형이 가능하다고 인식된다.
따라서, 본 발명은 바람직한 실시양태에 의해 구체적으로 개시되었고, 본원에 포함된 본 발명의 임의적 특징, 변형, 개선 및 변경은 당업자에 의해 재분류될 수 있으며, 이러한 변형, 개선 및 변경은 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주된다. 본원에 제공된 물질, 방법 및 예는 바람직한 실시양태를 나타내고, 예시적이며, 본 발명의 범위에 대한 제한으로서 의도되지 않는다.
본 발명은 본원에 광범위하게 및 일반적으로 기재되었다. 일반적 개시 내에 속하는 보다 좁은 종 및 하위종 군 각각이 또한 본 발명의 일부를 형성한다. 이는 삭제된 물질이 본원에 구체적으로 인용되었는지 여부에 관계없이 종으로부터 임의의 대상을 제거하는 부정적 제한 또는 단서와 함께 본 발명의 일반적 기재를 포함 한다.
또한, 본 발명의 특징 또는 측면이 마쿠쉬(Markush)군의 견지에서 기재되는 경우, 당업자는 또한 마쿠쉬군의 임의의 개별 구성원 또는 구성원의 하위군의 견지에서 그에 따라 기재된다는 것을 인식할 것이다.
본원에 언급된 모든 공개문헌, 특허출원, 특허 및 참고문헌은, 각각이 개별적으로 참조로 포함되는 것과 동일한 정도로 그 전문이 참조로 분명히 포함된다. 충돌하는 경우, 정의를 비롯한 본원의 명세서가 우선할 것이다.
다른 실시양태는 하기 특허청구범위 내에서 설명된다.
서열목록
Figure 112009054560519-pct00001
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SEQUENCE LISTING <110> YOO, Tai June. <120> TREATMENT AND PREVENTION OF NEURODEGENERATIVE DISEASES USING GENE THERAPY <130> 069662-0502 <140> PCT/US08/052953 <141> 2008-02-04 <150> 60/900,138 <151> 2007-02-06 <160> 22 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 614 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gatcgttagc ttctcctgat aaactaattg cctcacattg tcactgcaaa tcgacaccta 60 ttaatgggtc tcacctccca actgcttccc cctctgttct tcctgctagc atgtgccggc 120 aactttgtcc acggacacaa gtgcgatatc accttacagg agatcatcaa aactttgaac 180 agcctcacag agcagaagac tctgtgcacc gagttgaccg taacagacat ctttgctgcc 240 tccaagaaca caactgagaa ggaaaccttc tgcagggctg cgactgtgct ccggcagttc 300 tacagccacc atgagaagga cactcgctgc ctgggtgcga ctgcacagca gttccacagg 360 cacaagcagc tgatccgatt cctgaaacgg ctcgacagga acctctgggg cctggcgggc 420 ttgaattcct gtcctgtgaa ggaagccaac cagagtacgt tggaaaactt cttggaaagg 480 ctaaagacga tcatgagaga gaaatattca aagtgttcga gctgaatatt ttaatttatg 540 agtttttgat agctttattt tttaagtatt tatatattta taactcatca taaaataaag 600 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tgcagtaccg cggcgaggtg 420 caggccatgc tcggccagag caccgaggag ctgcgggtgc gcctcgcctc ccacctgcgc 480 aagctgtgta agcggctcct ccgcgatgcc gatgacctgc agaagtgcct ggcagtgtac 540 caggccgggg cccgcgaggg cgccgagcgc ggcctcagcg ccatccgcga gcgcctgggg 600 cccctggtgg aacagggccg cgtgcgggcc gccactgtgg gctccctggc cggccagccg 660 ctacaggagc gggcccaggc ctggggcgag cggctgcgcg cgcggatgga ggagatgggc 720 agccggaccc gcgaccgcct ggacgaggtg aaggagcagg tggcggaggt gcgcgccaag 780 ctggaggagc aggcccagca gatacgcctg caggccgagg ccttccaggc ccgcctcaag 840 agctggttcg agcccctggt ggaagacatg cagcgccagt gggccgggct ggtggagaag 900 gtgcaggctg ccgtgggcac cagcgccgcc cctgtgccca gcgacaatca ctga 954 <210> 12 <211> 153 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Met Gly Leu Thr Ser Gln Leu Leu Pro Pro Leu Phe Phe Leu Leu Ala 1 5 10 15 Cys Ala Gly Asn Phe Val His Gly His Lys Cys Asp Ile Thr Leu Gln 20 25 30 Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn Ser Leu Thr Glu Gln Lys Thr Leu Cys 35 40 45 Thr Glu Leu Thr Val Thr Asp Ile Phe Ala Ala Ser Lys Asn Thr Thr 50 55 60 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Gln Phe Leu Asp Tyr Leu Gln Glu Phe Leu Gly Val Met Asn Thr 115 120 125 Glu Trp Ile Ile Glu Ser 130 <210> 14 <211> 178 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Val Leu Leu Thr Gly Val 1 5 10 15 Arg Ala Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His 20 25 30 Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe 35 40 45 Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu 50 55 60 Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys 65 70 75 80 Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro 85 90 95 Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu 100 105 110 Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg 115 120 125 Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn 130 135 140 Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu 145 150 155 160 Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile 165 170 175 Arg Asn <210> 15 <211> 132 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Met Ala Leu Leu Leu Thr Thr Val Ile Ala Leu Thr Cys Leu Gly Gly 1 5 10 15 Phe Ala Ser Pro Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Glu Leu 20 25 30 Ile Glu Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys 35 40 45 Asn Gly Ser Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys 50 55 60 Ala Ala Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu 65 70 75 80 Lys Thr Gln Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala 85 90 95 Gly Gln Phe Ser Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala 100 105 110 Gln Phe Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu 115 120 125 Gly Arg Phe Asn 130 <210> 16 <211> 431 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Met His Val Arg Ser Leu Arg Ala Ala Ala Pro His Ser Phe Val Ala 1 5 10 15 Leu Trp Ala Pro Leu Phe Leu Leu Arg Ser Ala Leu Ala Asp Phe Ser 20 25 30 Leu Asp Asn Glu Val His Ser Ser Phe Ile His Arg Arg Leu Arg Ser 35 40 45 Gln Glu Arg Arg Glu Met Gln Arg Glu Ile Leu Ser Ile Leu Gly Leu 50 55 60 Pro His Arg Pro Arg Pro His Leu Gln Gly Lys His Asn Ser Ala Pro 65 70 75 80 Met Phe Met Leu Asp Leu Tyr Asn Ala Met Ala Val Glu Glu Gly Gly 85 90 95 Gly Pro Gly Gly Gln Gly Phe Ser Tyr Pro Tyr Lys Ala Val Phe Ser 100 105 110 Thr Gln Gly Pro Pro Leu Ala Ser Leu Gln Asp Ser His Phe Leu Thr 115 120 125 Asp Ala Asp Met Val Met Ser Phe Val Asn Leu Val Glu His Asp Lys 130 135 140 Glu Phe Phe His Pro Arg Tyr His His Arg Glu Phe Arg Phe Asp Leu 145 150 155 160 Ser Lys Ile Pro Glu Gly Glu Ala Val Thr Ala Ala Glu Phe Arg Ile 165 170 175 Tyr Lys Asp Tyr Ile Arg Glu Arg Phe Asp Asn Glu Thr Phe Arg Ile 180 185 190 Ser Val Tyr Gln Val Leu Gln Glu His Leu Gly Arg Glu Ser Asp Leu 195 200 205 Phe Leu Leu Asp Ser Arg Thr Leu Trp Ala Ser Glu Glu Gly Trp Leu 210 215 220 Val Phe Asp Ile Thr Ala Thr Ser Asn His Trp Val Val Asn Pro Arg 225 230 235 240 His Asn Leu Gly Leu Gln Leu Ser Val Glu Thr Leu Asp Gly Gln Ser 245 250 255 Ile Asn Pro Lys Leu Ala Gly Leu Ile Gly Arg His Gly Pro Gln Asn 260 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Asn Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn 35 40 45 Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp 50 55 60 Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe 65 70 75 80 Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile 85 90 95 Lys Glu Asp Met Asn Val Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg 100 105 110 Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val 115 120 125 Gln Arg Lys Ala Ile His Glu Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser 130 135 140 Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg 145 150 155 160 Gly Arg Arg Ala Ser Gln 165 <210> 18 <211> 247 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Met Thr Ile Leu Phe Leu Thr Met Val Ile Ser Tyr Phe Gly Cys Met 1 5 10 15 Lys Ala Ala Pro Met Lys Glu Ala Asn Ile Arg Gly Gln Gly Gly Leu 20 25 30 Ala Tyr Pro Gly Val Arg Thr His Gly Thr Leu Glu Ser Val Asn Gly 35 40 45 Pro Lys Ala Gly Ser Arg Gly Leu Thr Ser Leu Ala Asp Thr Phe Glu 50 55 60 His Val Ile Glu Glu Leu Leu Asp Glu Asp Gln Lys Val Arg Pro Asn 65 70 75 80 Glu Glu Asn Asn Lys Asp Ala Asp Leu Tyr Thr Ser Arg Val Met Leu 85 90 95 Ser Ser Gln Val Pro Leu Glu Pro Pro Leu Leu Phe Leu Leu Glu Glu 100 105 110 Tyr Lys Asn Tyr Leu Asp Ala Ala Asn Met Ser Met Arg Val Arg Arg 115 120 125 His Ser Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser Val Cys Asp Ser Ile 130 135 140 Ser Glu Trp Val Thr Ala Ala Asp Lys Lys Thr Ala Val Asp Met Ser 145 150 155 160 Gly Gly Thr Val Thr Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys Gly Gln 165 170 175 Leu Lys Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr Thr 180 185 190 Lys Glu Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys Arg His Trp Asn Ser Gln Cys 195 200 205 Arg Thr Thr Gln Ser Tyr Val Arg Ala Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys 210 215 220 Arg Ile Gly Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr 225 230 235 240 Leu Thr Ile Lys Arg Gly Arg 245 <210> 19 <211> 241 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Met Ser Met Leu Phe Tyr Thr Leu Ile Thr Ala Phe Leu Ile Gly Ile 1 5 10 15 Gln Ala Glu Pro His Ser Glu Ser Asn Val Pro Ala Gly His Thr Ile 20 25 30 Pro Gln Ala His Trp Thr Lys Leu Gln His Ser Leu Asp Thr Ala Leu 35 40 45 Arg Arg Ala Arg Ser Ala Pro Ala Ala Ala Ile Ala Ala Arg Val Ala 50 55 60 Gly Gln Thr Arg Asn Ile Thr Val Asp Pro Arg Leu Phe Lys Lys Arg 65 70 75 80 Arg Leu Arg Ser Pro Arg Val Leu Phe Ser Thr Gln Pro Pro Arg Glu 85 90 95 Ala Ala Asp Thr Gln Asp Leu Asp Phe Glu Val Gly Gly Ala Ala Pro 100 105 110 Phe Asn Arg Thr His Arg Ser Lys Arg Ser Ser Ser His Pro Ile Phe 115 120 125 His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp Ser Val Ser Val Trp Val Gly 130 135 140 Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys Gly Lys Glu Val Met Val Leu 145 150 155 160 Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu 165 170 175 Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile 180 185 190 Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys Thr Thr Thr His Thr Phe Val 195 200 205 Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg 210 215 220 Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu Ser Arg Lys Ala Val Arg Arg 225 230 235 240 Ala <210> 20 <211> 305 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Trp Thr Ala Arg 1 5 10 15 Ala Leu Glu Val Pro Thr Asp Gly Asn Ala Gly Leu Leu Ala Glu Pro 20 25 30 Gln Ile Ala Met Phe Cys Gly Arg Leu Asn Met His Met Asn Val Gln 35 40 45 Asn Gly Lys Trp Asp Ser Asp Pro Ser Gly Thr Lys Thr Cys Ile Asp 50 55 60 Thr Lys Glu Gly Ile Leu Gln Tyr Cys Gln Glu Val Tyr Pro Glu Leu 65 70 75 80 Gln Ile Thr Asn Val Val Glu Ala Asn Gln Pro Val Thr Ile Gln Asn 85 90 95 Trp Cys Lys Arg Gly Arg Lys Gln Cys Lys Thr His Pro His Phe Val 100 105 110 Ile Pro Tyr Arg Cys Leu Val Gly Glu Phe Val Ser Asp Ala Leu Leu 115 120 125 Val Pro Asp Lys Cys Lys Phe Leu His Gln Glu Arg Met Asp Val Cys 130 135 140 Glu Thr His Leu His Trp His Thr Val Ala Lys Glu Thr Cys Ser Glu 145 150 155 160 Lys Ser Thr Asn Leu His Asp Tyr Gly Met Leu Leu Pro Cys Gly Ile 165 170 175 Asp Lys Phe Arg Gly Val Glu Phe Val Cys Cys Pro Leu Ala Glu Glu 180 185 190 Ser Asp Asn Val Asp Ser Ala Asp Ala Glu Glu Asp Asp Ser Asp Val 195 200 205 Trp Trp Gly Gly Ala Asp Thr Asp Tyr Ala Asp Gly Ser Glu Asp Lys 210 215 220 Val Val Glu Val Ala Glu Glu Glu Glu Val Ala Glu Val Glu Glu Glu 225 230 235 240 Glu Ala Asp Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Gly Asp Glu Val Glu Glu 245 250 255 Glu Ala Glu Glu Pro Tyr Glu Glu Ala Thr Glu Arg Thr Thr Ser Ile 260 265 270 Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Glu Ser Val Glu Glu Val Val Arg 275 280 285 Glu Lys Trp Tyr Lys Glu Val His Ser Gly Gln Ala Arg Trp Leu Met 290 295 300 Leu 305 <210> 21 <211> 317 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Met Lys Val Leu Trp Ala Ala Leu Leu Val Thr Phe Leu Ala Gly Cys 1 5 10 15 Gln Ala Lys Val Glu Gln Ala Val Glu Thr Glu Pro Glu Pro Glu Leu 20 25 30 Arg Gln Gln Thr Glu Trp Gln Ser Gly Gln Arg Trp Glu Leu Ala Leu 35 40 45 Gly Arg Phe Trp Asp Tyr Leu Arg Trp Val Gln Thr Leu Ser Glu Gln 50 55 60 Val Gln Glu Glu Leu Leu Ser Ser Gln Val Thr Gln Glu Leu Arg Ala 65 70 75 80 Leu Met Asp Glu Thr Met Lys Glu Leu Lys Ala Tyr Lys Ser Glu Leu 85 90 95 Glu Glu Gln Leu Thr Pro Val Ala Glu Glu Thr Arg Ala Arg Leu Ser 100 105 110 Lys Glu Leu Gln Ala Ala Gln Ala Arg Leu Gly Ala Asp Met Glu Asp 115 120 125 Val Cys Gly Arg Leu Val Gln Tyr Arg Gly Glu Val Gln Ala Met Leu 130 135 140 Gly Gln Ser Thr Glu Glu Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg 145 150 155 160 Lys Leu Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala Asp Asp Leu Gln Lys Arg 165 170 175 Leu Ala Val Tyr Gln Ala Gly Ala Arg Glu Gly Ala Glu Arg Gly Leu 180 185 190 Ser Ala Ile Arg Glu Arg Leu Gly Pro Leu Val Glu Gln Gly Arg Val 195 200 205 Arg Ala Ala Thr Val Gly Ser Leu Ala Gly Gln Pro Leu Gln Glu Arg 210 215 220 Ala Gln Ala Trp Gly Glu Arg Leu Arg Ala Arg Met Glu Glu Met Gly 225 230 235 240 Ser Arg Thr Arg Asp Arg Leu Asp Glu Val Lys Glu Gln Val Ala Glu 245 250 255 Val Arg Ala Lys Leu Glu Glu Gln Ala Gln Gln Ile Arg Leu Gln Ala 260 265 270 Glu Ala Phe Gln Ala Arg Leu Lys Ser Trp Phe Glu Pro Leu Val Glu 275 280 285 Asp Met Gln Arg Gln Trp Ala Gly Leu Val Glu Lys Val Gln Ala Ala 290 295 300 Val Gly Thr Ser Ala Ala Pro Val Pro Ser Asp Asn His 305 310 315 <210> 22 <211> 317 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Met Lys Val Leu Trp Ala Ala Leu Leu Val Thr Phe Leu Ala Gly Cys 1 5 10 15 Gln Ala Lys Val Glu Gln Ala Val Glu Thr Glu Pro Glu Pro Glu Leu 20 25 30 Arg Gln Gln Thr Glu Trp Gln Ser Gly Gln Arg Trp Glu Leu Ala Leu 35 40 45 Gly Arg Phe Trp Asp Tyr Leu Arg Trp Val Gln Thr Leu Ser Glu Gln 50 55 60 Val Gln Glu Glu Leu Leu Ser Ser Gln Val Thr Gln Glu Leu Arg Ala 65 70 75 80 Leu Met Asp Glu Thr Met Lys Glu Leu Lys Ala Tyr Lys Ser Glu Leu 85 90 95 Glu Glu Gln Leu Thr Pro Val Ala Glu Glu Thr Arg Ala Arg Leu Ser 100 105 110 Lys Glu Leu Gln Ala Ala Gln Ala Arg Leu Gly Ala Asp Met Glu Asp 115 120 125 Val Cys Gly Arg Leu Val Gln Tyr Arg Gly Glu Val Gln Ala Met Leu 130 135 140 Gly Gln Ser Thr Glu Glu Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg 145 150 155 160 Lys Leu Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala Asp Asp Leu Gln Lys Arg 165 170 175 Leu Ala Val Tyr Gln Ala Gly Ala Arg Glu Gly Ala Glu Arg Gly Leu 180 185 190 Ser Ala Ile Arg Glu Arg Leu Gly Pro Leu Val Glu Gln Gly Arg Val 195 200 205 Arg Ala Ala Thr Val Gly Ser Leu Ala Gly Gln Pro Leu Gln Glu Arg 210 215 220 Ala Gln Ala Trp Gly Glu Arg Leu Arg Ala Arg Met Glu Glu Met Gly 225 230 235 240 Ser Arg Thr Arg Asp Arg Leu Asp Glu Val Lys Glu Gln Val Ala Glu 245 250 255 Val Arg Ala Lys Leu Glu Glu Gln Ala Gln Gln Ile Arg Leu Gln Ala 260 265 270 Glu Ala Phe Gln Ala Arg Leu Lys Ser Trp Phe Glu Pro Leu Val Glu 275 280 285 Asp Met Gln Arg Gln Trp Ala Gly Leu Val Glu Lys Val Gln Ala Ala 290 295 300 Val Gly Thr Ser Ala Ala Pro Val Pro Ser Asp Asn His 305 310 315

Claims (225)

  1. IL-4, IL-10 및 ApoE-2를 코딩하는 핵산을 포함하나, β-아밀로이드 또는 β-아밀로이드1-42는 포함하지 않으며, 근육내 주사에 의해 투여되는, 알츠하이머 질환을 치료 또는 개선하기 위한 제약 조성물.
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  3. 제1항에 있어서, 포유동물에서 알츠하이머 질환을 치료 또는 개선하기 위한 제약 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 포유동물이 인간인 제약 조성물.
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  7. 제1항에 있어서, 상기 핵산이 복제시발점 (ORI), 프로모터 및 다중 클로닝 부위 (MCS)를 포함한 원형 DNA를 포함하는 것인 제약 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 핵산이 세포성 면역 반응 요소 유전자를 코딩하는 서열에 전사적으로 연결된 프로모터/인핸서를 포함하는 플라스미드인 제약 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 프로모터가 진핵 세포에서의 발현에 적합한 것인 제약 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 형질감염 촉진 물질과 함께 투여되는 제약 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 입양 세포 유전자 요법에 의해 전달되는 제약 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 입양 세포 유전자 요법이 핵산을 염증 부위로 표적 전달할 수 있는 세포의 투여를 포함하는 것인 제약 조성물.
  13. 제1항에 있어서, 상기 핵산이 벡터인 제약 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 벡터가 pVAX1, pUMCV, pGCy 및 pLentilox-IRES-GFP로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 벡터를 포함하는 것인 제약 조성물.
  15. 제1항에 있어서, 염증을 증가시키는 유전자의 발현을 억제 또는 약화시키는 제약 조성물.
  16. 제1항에 있어서, 포유동물의 뇌에서 아밀로이드 플라크 축적을 감소시키는 제약 조성물.
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