KR101636575B1

KR101636575B1 - 유두종바이러스 백신

Info

Publication number: KR101636575B1
Application number: KR1020097016704A
Authority: KR
Inventors: 마르뗑 보뎅; 쟝-마르크 발룰; 나딸리 실베쓰뜨르
Original assignee: 트랜스진 에스.에이.
Priority date: 2007-01-30
Filing date: 2008-01-29
Publication date: 2016-07-05
Also published as: EP2118292B1; JP5474567B2; EP2118292A2; MX2009008118A; EP2390340A3; TW200840869A; CN101617052A; KR20090129399A; EP2390340A2; JP2010516287A; CA2675355A1; BRPI0806350A2; RU2482189C2; US8420103B2; AU2008209759B2; CA2675355C; AR065076A1; DK2118292T3; ATE518958T1; ZA200904932B

Abstract

본 발명은 적어도 하나의 유두종바이러스에 의해 초래되는 잠복기가 긴 유두종바이러스 감염을 앓고 있는 환자를 치료하기 위해 의도된 약물을 제조하기 위한 적어도 하나의 유두종바이러스 E2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, 또는 벡터, 감염성 바이러스 입자 또는 그 조성물의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 유두종바이러스 E1 폴리펩티드를 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열 및 유두종바이러스 E2 폴리펩티드를 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공하며, 이때 자연 상태에서 상기 제2 뉴클레오티드의 5' 영역과 100% 일치하는 상기 제1 뉴클레오티드의 3' 영역은 상기 영역과 최대 75%의 동질성 백분율을 나타내도록 변형된다.

Description

유두종바이러스 백신{PAPILLOMAVIRUS E2 POLYPEPTIDE USED FOR VACCINATION}

본 발명은 유두종바이러스(papillomavirus) 감염을 치료하기 위해 의도된 약물을 제조하기 위한 적어도 하나의 유두종바이러스 E2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자 또는 벡터 또는 감염성 바이러스 입자의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 면역치료 분야, 보다 구체적으로는 잠복기가 긴(persistent) 유두종바이러스 감염을 앓고 있는 환자를 치료하는데 매우 특별한 관심이 있다.

유두종바이러스는 다수의 고등 생물에서 단리되어 왔으며, 이들은 피부와 점막 상피 조직을 감염시킨다. 현재, 100개 이상의 인간 유두종바이러스(HPV) 유전자형(genotype)이 인간에서 동정되어 있으며(Stoler, 2000, Int. J. Gyunecol. Path 19, 16-28), 보통 양성 종양과 연관되는 "저위험" 유전자형(예를 들면, HPV-6 및 HPV-11)과, 전-악성 손상부위(lesion)(예를 들면, 경부 상피내 신생물, CIN)로 진행되어 최종적으로 악성 종양이 될 가능성을 갖는 손상부위와 연관되는 "고위험" 유전자형으로 분류될 수 있다. 예를 들면, 99% 이상의 경부암은 HPV DNA를 함유하며, 5개의 "고위험" HPV (HR-HPV) 유전자형이 주된 원인으로 인식되어 왔고, 이 중 HPV-16 및 HPV-18은 전세계적으로 진단된 침입성 경부암의 대략 70%에서 검출되고(Clifford et al., 2003, Br J Cancer 88, 63-73), HPV-31, HPV-33 및 HPV-45는 추가 10%에서 검출된다(Cohen et al., 2005, Science 308, 618-621).

유두종바이러스는 단백질 캡시드(capsid)에 의해 둘러싸인 작은 DNA 바이러스이다(예를 들면, Pfister, 1987, in The papovaviridae : The Papillomaviruses, Salzman and Howley edition, Plenum Press, New York, p1-38). 그 게놈은 3개의 기능성 부위인 얼리(early, E), 레이트(late, L) 및 긴 조절(long control, LCR) 부위로 이루어진 약 7,900 염기쌍의 이중사슬 원형 DNA이다. 상기 LCR은 인핸서(enhancer) 및 프로모터(promoter)와 같은 전사 조절 서열을 함유한다. 상기 레이트 부위는 각각 메이저 및 마이너 캡시드 단백질에 해당하는 L1 및 L2 구조 단백질을 코딩하는 반면, 얼리 부위는 바이러스 복제, 전사 및 세포 변형(transformation)을 조절하는 핵 내에서 우선적으로 발견되는 조절 단백질(E1-E7)을 코딩한다.

상기 E1 단백질은 유두종바이러스 게놈에 의해 코딩되는 가장 크고(HPV-16 E1은 649개 아미노산 길이), 가장 보존된(conserved) 단백질이다. E1은 바이러스 복제를 자극하기 위해 E2와의 이량체화 및 상호작용을 필요로 하는 ATP-의존적 헬리카제(helicase) 활성을 갖는 DNA 결합 인단백질이다(Desaintes and Demeret, 1996, Semin. Cancer Biol. 7, 339-347; Wilson et al, 2002, Virus Gene 24, 275-290). 상기 헬리카제 활성은 E1의 C-말단 도메인 및 중앙 도메인의 DNA 결합 도메인에 위치해 있다. 상기 E2 단백질(HPV-16 E2는 365개 아미노산 길이)은 바이러스 유전자의 전사를 조절하고 DNA 복제를 조절하는 다기능성 DNA 결합 인단백질이다(Bechtold et al., 2003, J. Virol. 77, 2021-2028). 바이러스 전사의 조절은 E2 이량체와 E2-결합 부위(보존적 ACCN6GGT 서열)에 이량체화 및 결합하는 것을 필요로 하며, 그 문맥(context)이 바이러스 전사가 트랜스-활성인지 또는 억제되는지를 결정한다(Ham et al., 1991, Trends Biochem. Sci. 16, 440-444; McBride et al., 1991, J. Biol. Chem. 266, 18411-18444). E2는 또한 E6 및 E7 암단백질의 발현을 조절하는 HPV-16 p97 프로모터를 억제한다. 마지막으로, E2는 딸세포에서 바이러스 게놈의 영역화에 관여한다. HPV-16 E2의 N-말단 도메인은 트랜스-활성, E1과의 상호작용 및 복제의 촉진에 관여하는 반면, C-말단 도메인은 DNA 결합 및 이량체화에 관여한다(McBride et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 510-514). 상기 E4-코딩된 단백질은 세포질 케라틴 네트워크에 결합하여 붕괴시키며, 바이러스를 성숙시키는 역할을 한다. E5 단백질의 기능은 여전히 논란이 있다. E6 및 E7 단백질은 각각 세포의 종양 억제 유전자 산물인 p53 및 레티노블라스토마(Rb)에 이들 바이러스 단백질이 결합함으로써(Howley, 1996, Papillomaviruses and their replication, p2045-2076. In B.N. Fields, D.M. Knipe and P.M. Howley(ed), Virology, 3^rd ed. Lippincott-Raven Press, New York, N.Y.에서 리뷰됨), HR-HPV에 감염된 세포의 암유전자 변형에 관여한다(Kanda et al., 1988, J. Virol. 62, 610-613; Vousden et al., 1988, Oncogene Res. 3, 1-9; Bedell et al., 1987, J. Virol. 61, 3635-3640).

HPV 감염은 가장 빈번하게 성적으로 전파되는 감염 중 하나이며, 성적으로 활성인 성인의 약 25%가 HPV에 감염되어 있다(Woodman et al., 2001, The Lancet 357, 1831-1836). 대략 80%의 대상은 6-12개월 내에 자연적으로 바이러스가 소멸된다(Ho et al., 1998, N Eng J Med 338, 423-428). 그러나, 나머지 20%에서, HPV 감염은 전-악성 CIN 손상부위로 진행되며, 진단되지 않는다면, 이는 침입성 암으로 발전할 수 있다(O'Shaughnessy et al., 2002, Clinical Cancer Research 2, 314-346). 종양형성(neoplasia)-유도 메카니즘은 HPV 게놈이 세포의 염색체 내로 삽입되는 것을 포함하는 것으로 보인다(Cullen et al., 1991, J. Virol. 65, 606-612). 대부분의 경우, 이는 E1/E2 부위 내의 HPV 게놈 DNA의 붕괴, E2 억제 효과로부터의 E6/E7 프로모터의 방출, 및 결과적으로 E6 및 E7 발현의 상향조절과 세포의 변형을 이끈다.

현재 HPV 감염 방지를 목적으로 하는 예방 백신이 거의 시장에 나올 예정이다. 이들은 바이러스가 숙주 세포 내로 침입하기 이전에 주로 중화 항체(neutralizing antibody)의 유도를 통해 바이러스를 차단하기 위하여 바이러스 표면에 발현되는 캡시드 단백질을 표적으로 한다. 일반적으로 이들은 자연스럽게 VLP(Virus like particle)로 재조립되는 재조합적으로 제조된 L1 단백질에 의존한다. 머크 및 글락소스미스클라인(GSK)에 의해 제조되는 2가지 HPV 백신이 임상 시험 3상을 성공적으로 완료하였으며, 타입-특이적 경부 감염을 거의 100% 효능으로 방지하는 것을 보여주었다. GSK의 백신은 HPV-16 및 HPV-18의 VLP 혼합물을 포함하는 반면, 머크의 백신은 또한 생식기의 혹(wart)을 초래하는 HPV-6 및 HPV-11 유 래의 VLP를 포함한다.

그러나, 이미 HPV로 감염된 대상은 예방 백신이 적절하지 않으며, 암유전자의 가능성을 갖는 손상부위로 발전할 위험성이 있는 감염된 환자를 치료하기 위한 치료 백신이 관심이 있다. 상기 암유전자 활성은 감염된 세포에서의 HPV E6 및 E7 유전자의 발현에 기인하기 때문에, 대부분의 노력은 그 발현을 차단하거나 이들 변형 유전자 산물에 대한 세포 면역 반응을 유도하는 것에 초점을 맞춰왔다. 예를 들면 안티센스 RNA(Steele et al., 1993, Cancer Res 53, 2330-2337; He et al., 1997, Cancer Res. 57, 3993-3999; Choo et al., 2000, Gynecol. Oncol. 78, 293-301), 리보자임(Chen et al., 1996, Cancer Gen Ther. 3, 18-23; Pan et al., 2004, Mol. Ther. 9, 596-606), siRNA(Butz et al., 2003, Oncogene 22, 5938-5945; Koivusalo et al., 2005, Mol. Pharmacol. 68, 372-382), 면역원성 펩티드(Feltkamp et al., 1993, Eur. J. Immunol. 23, 2242-2249), E6 및/또는 E7-코딩 플라스미드(Peng et al., 2004, J. Virol. 78, 8468-8476) 및 바이러스 벡터(WO90/10459; WO99/03885; Kaufmann et al., 2002, Clinical Cancer Res. 8, 3676-3685)의 사용에 의존하는 많은 시도들이 문헌에 개시되어 있다.

HPV 감염의 초기 단계에서 발현되기 때문에, 상기 E2 단백질은 치료 백신를 위한 두 번째 잠재적 표적을 나타낸다. 솜꼬리토끼 유두종바이러스(CRPV)로 감염된 토끼에서 수행된 전임상 연구는 E2 발현 후 수행된 유두종바이러스-연관 손상부위에 대한 보호를 보여주었다. 예를 들면, CRPV E2 단백질을 발현하는 재조합 아데노바이러스 벡터를 투여하면, 아마도 세포-매개성 면역을 통하여 CRPV-유도성 유 두종 및 감염이 깨끗하게 되는 결과를 가져왔다(Brandsma et al, 2004, J. Virol. 78, 116-123). 또한, CRPV E1 및 E2 단백질을 코딩하는 DNA를 투여하면, 비록 보호 면역이 투여 경로에 의존적인 것으로 나타났지만(Han et al., 2000, Vaccine 18, 2937-2944), CRPV-유도성 피부 유두종이 암종으로 발전하는 것을 방지하거나 적어도 지연시키는데 효과적이었다(Han et al., 2000, J. Virol. 74, 9712-9716). 유두종바이러스-연관 손상부위를 치료하기 위한 E2의 치료 가능성은 또한 HPV에 노출된 인간 대상에서 지지되었다. 항 E2 특이적 T-헬퍼 면역이 건강한 대상에서 빈번하게 검출되는 반면(De Jong et al., 2002, Cancer Res. 62, 472-479), HPV-16-연관 경부암을 갖는 여성에서는 E2 및 E6에 대한 약화된 CD4+ T-세포 면역이 관찰되었다(De Jong et al., Cancer Res. 64, 5449-5455).

임상 시험 2상은 소의 유두종바이러스(BPV) E2 단백질을 코딩하는 재조합 MVA(Modified Virus Ankara) 벡터를 이용한 HPV-연관된 높은 등급의 CIN 2 및 3을 갖는 환자에서 시행되고 있다. 상기 바이러스 입자는 CIN 손상부위 내로 직접 주입되며, E6 및 E7을 발현하는 세포에서 E2가 생성되면 아폽토시스(apoptosis)를 일으킬 것이라고 예측된다. 실제로 치료된 환자의 대부분에서 CIN 손상부위가 줄어드는 것이 관찰되었다. 그러나, 어떤 경우, 바이러스 DNA가 제거되지 않았으며, 1년 후에 손상부위의 재발이 관찰되었다(Garcia-Hernandez et al., 2006, Cancer Gene Ther. 13, 592-597).

감염 잠복기가 긴 특성, 높은 전파력(prevalence) 및 HPV-유도성 암의 현저한 사망률(morbidity)로 인하여, HPV가 오래동안 세계적으로 심각한 건강의 위협을 계속할 것이라고 예측하는 사람도 있다. 실제로 잠복기가 긴 HR-HPV 감염을 갖는 여성은 감염되지 않은 여성 또는 자연적으로 바이러스가 사라진 여성과 비교하여 CIN 손상부위가 발전할 위험성이 200배까지 현저하게 더 높은 것으로 나타났다(Bory et al., Int J Cancer 102, 519-525).

HPV 감염은 일반적으로 비정상(abnormal) 스크리닝(예를 들면, 팝 스미어 검사)에 따라 검출된다. 오늘날, HPV 감염을 진단하는 유일한 의학적 이점은 손상부위가 발생할 때 가능한 빨리 손상부위(예를 들면, 높은 등급의 CIN 2/3)를 검출하기 위하여 보다 빈번하게 추적조사(follwo-up)를 수행하는 것이며, 이후 상기 손상부위는 루프 전기외과적 절제술(LEEP) 및 콘 생검(conization)과 같은 제거 방법에 의해 제거될 수 있다. 이러한 방법은 전체적으로 90% 효과가 있지만, 산부인과적 합병증의 위험이 있다(예를 들면, 가임 연령의 여성에서 임신 가능성에 영향을 미칠 수 있음). 의학적인 관점에서 충분히 만족스럽지 않은 것에 더하여, 이러한 상황은 또한 환자를 불편(불안)하게 한다.

따라서, 특히 이러한 집단에서 전-악성 손상부위와 순차적으로는 암으로 진행할 위험성이 크다는 측면에서, 잠복기가 긴 HPV로 감염된 환자를 치료하기 위한 백신을 개발할 필요성이 있다.

따라서, 본 발명은 이러한 문맥이 현저하게 개선된 것을 나타낸다. 본 발명은 HR-HPV 유전자형에 의해 초래되는 감염에 대한 더 이른 보호를 제공하는 비침입적이고 안전한 방법을 제공한다. 유두종바이러스-연관 손상부위가 발생하기 전에 감염된 환자를 치료하고, 결과적으로 전-악성 및 악성 종양이 발생할 위험성을 감소시킨다는데 이점이 있다. 유익하게는, 본 발명은 종래의 제거 방법과 연관된 위험성(예를 들면, 산부인과적 합병증)을 감소시키면서 환자의 편안함(예를 들면, 손상부위의 표본조사(survey)와 연관된 불안의 감소)을 개선하도록 한다. 중요하게는, 본 발명은 또한 감염된 유두종바이러스 및 그 연관된 단리물(isolate)의 소멸을 통해 HPV-재감염으로 인한 향후의 재발 위험성을 감소시키도록 한다.

이러한 기술적 문제는 청구항에서 정의된 바와 같이 구현예를 제공함으로써 해결된다.

본 발명의 다른 및 추가 측면, 특성 및 이점은 하기 본 발명의 바람직한 구현예에 개시된 내용으로부터 명확해질 것이다. 이들 구현예는 개시를 목적으로 제공된다.

따라서, 한 측면에서, 본 발명은 적어도 하나의 유두종바이러스에 의해 초래되는 잠복기가 긴 유두종바이러스 감염을 앓고 있는 숙주 생물을 치료하기 위해 의도된 약물을 제조하기 위한 적어도 하나의 유두종바이러스 E2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, 또는 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터 또는 감염성 바이러스 입자의 용도를 제공한다. 본 발명은 또한 숙주 생물에서 잠복기가 긴 유두종바이러스 감염을 치료하기 위해 사용되는 상기 핵산 분자, 벡터 또는 감염성 바이러스 입자에 관한 것이다. 한 구현예에 따르면, 상기 핵산 분자, 벡터 또는 감염성 바이러스 입자는 숙주 생물이 적어도 하나의 유두종바이러스에 노출된 후 및 유두종바이러스-연관 손상부위가 검출/출현하기 전에 투여된다.

본 출원의 전체에 걸쳐 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "한(a)" 및 "하나(an)"라는 용어는, 그 문맥이 달리 나타내지 않는 한, 언급된 화합물 또는 단계의 "적어도 하나", "적어도 처음", "하나 이상" 또는 "복수"를 의미하는 것으로 사용된다. 예를 들면, "한 유두종바이러스 E2 폴리펩티드"란 용어는 유일한(unique) 타입의 유두종바이러스 E2 폴리펩티드, 그 혼합물을 포함하는 복수의 유두종바이러스 E2 폴리펩티드를 포괄한다.

본 명세서의 어디에서 사용되든, "및/또는"이란 용어는 "및", "또는" 및 "상기 용어에 의해 연결된 요소 모두 또는 임의의 다른 조합"의 의미를 포함한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "약" 또는 "대략"이란 용어는 주어진 값 또는 범위의 20% 이내, 바람직하게는 10% 이내, 보다 바람직하게는 5% 이내를 의미한다.

"아미노산" 및 "잔기"란 용어는 동의어이며, 천연 아미노산뿐만 아니라 아미노산 유사체(analog)(예를 들면, D 또는 L 광학 이성질체를 포함하는 비천연, 합성 및 변형 아미노산)를 포괄한다.

본 명세서에서 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"이란 용어는 교환가능하게 사용되며, 펩티드 결합을 통해 결합된 9개 이상의 아미노산을 포함하는 아미노산 잔기의 폴리머를 나타낸다. 상기 폴리머는 선형, 분지형 또는 고리형일 수 있고, 천연 발생형 및/또는 아미노산 유사체를 포함할 수 있으며, 비아미노산에 의해 방해(interrupt)될 수 있다. 일반적으로 나타내는 바와 같이, 아미노산 폴리머가 길면(예를 들면, 50개 아미노산 잔기 이상) 폴리펩티드 또는 단백질로 나타내는 것이 바람직하지만, 50개 아미노산 길이 이하이면 "펩티드"로 나타낸다.

본 발명의 문맥 내에서, "핵산", "핵산 분자", "폴리뉴클레오티드" 및 "뉴클레오티드 서열"이란 용어는 교환가능하게 사용되며, 폴리데옥시리보뉴클레오티드(DNA)(예를 들면, cDNA, 게놈 DNA, 플라스미드, 벡터, 바이러스 게놈, 단리된 DNA, 프로브, 프라이머 및 그의 임의의 혼합물) 또는 폴리리보뉴클레오티드(RNA) 분자(예를 들면, mRNA, 안티센스 RNA) 중 어느 하나 또는 혼합된 폴리리보-폴리데옥시리보뉴클레오티드의 임의의 길이의 폴리머를 정의한다. 이들은 단일 또는 이중 사슬, 선형 또는 고리형, 천연 또는 합성 폴리뉴클레오티드를 포괄한다. 또한, 폴리뉴클레오티드는 메틸화된 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체와 같은 비천연 발생형 뉴클레오티드를 포함할 수 있으며(변형의 예로는 US5,525,711, US4,711,955 또는 EPA 302 175 참조), 비-뉴클레오티드 성분으로 방해될 수 있다. 만일 존재한다면, 상기 뉴클레오티드에 대한 변형은 중합 이전 또는 이후에 수행될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 산물(product), 조성물 및 방법을 정의하기 위해 사용될 때, "포함"이란 용어는 상기 산물, 조성물 및 방법이 언급된 성분 및 단계를 포함하지만 다른 것들을 배제하지는 않는다는 것을 의미하기 위한 의도이다. "필수적으로 이루어진"이란 임의의 필수적으로 중요한 다른 성분 및 단계를 배제한다는 것을 의미할 것이다. 따라서, 언급된 성분으로 필수적으로 이루어진 조성물은 미량의 오염물 및 약학적으로 허용가능한 담체를 배제하지 않을 것이다. "이루어진"이란 다른 성분 또는 단계의 미량의 요소 이상을 배재한다는 것을 의미할 것이다. 예를 들면, 폴리펩티드가 언급된 아미노산 서열 이외의 어떠한 아미노산도 함유하지 않을 때, 폴리펩티드는 아미노산 서열로 "이루어진다." 아미노산 서열이 단지 몇 개의 추가 아미노산 잔기, 전형적으로는 약 1 내지 약 50개 정도의 추가 잔기와 함께 존재할 때, 폴리펩티드는 아미노산 서열로 "필수적으로 이루어진다." 아미노산 서열이 폴리펩티드의 최종 아미노산 서열의 적어도 일부일 때, 폴리펩티드는 아미노산 서열을 "포함한다." 이러한 폴리펩티드는 수 개에서 수백 개의 추가 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 이러한 추가 아미노산 잔기는, 다른 것들 중에서도, 폴리펩티드 트래피킹(trafficking)에서 역할을 하고, 폴리펩티드의 생산 또는 정제를 촉진시킬 수 있으며; 반감기를 연장시킬 수 있다. 동일한 사항이 뉴클레오티드 서열에도 적용될 수 있다.

"숙주 세포"란 용어는 단리된 세포, 세포의 군뿐만 아니라 세포의 특정한 유기조직, 예컨대 조직 또는 기관을 포괄하는 것으로 널리 이해될 것이다. 이러한 세포는 원형의(primary), 변형된 또는 배양된 세포일 수 있다. 이들은 원핵생물(예를 들면, Escherichia coli), 효모(예를 들면, Saccharomyces cerevisiae , Saccharomyces pombe 또는 Pichia pastoris), 진핵생물(예를 들면, 곤충, 식물 및 인간 세포를 포함하는 포유동물)일 수 있다. "숙주 세포"란 용어는 본 발명에서 사용되는 핵산 분자, 벡터 또는 감염성 바이러스 입자의 수용체(recipient)로 될 수 있거나 수용체로 사용된 세포 및 이러한 세포의 자손을 포함한다.

"숙주 생물"이란 용어는 척추동물, 특히 포유동물 종의 일원 및 특히 가축, 농장 동물, 스포츠 동물 및 인간을 포함하는 영장류를 나타낸다. 바람직하게는, 상기 숙주 생물은 적어도 하나의 유두종바이러스에 의해 초래되는 잠복기가 긴 유두종바이러스 감염을 앓고 있는 환자이다.

"유두종바이러스"는 파필로마비리내 아과(subfamily)에 속하는 바이러스를 나타낸다. 상기 정의는 소, 말, 토끼, 양, 개, 비인간 영장류 및 설치류를 포함하지만 이에 한정되지는 않는 비인간 종 기원의 동물 유두종바이러스뿐만 아니라 인간 유두종바이러스(HPV)를 포괄한다.

"HPV"는 보다 구체적으로는 인간 종 기원이거나 및/또는 인간을 감염시킬 수 있는 유두종바이러스를 나타낸다. 현재 100개 이상의 HPV 유전자형이 동정되어 있으며, 이들은 그 단리된 시간 순서에 따라 번호가 매겨져 있다. 관례상, HPV의 분류는 그 게놈의 연관성 정도에 기초한다. 계통수는 가용한 뉴클레오티드 서열을 배열함으로써 구축되었다(Van Ranst et al., 1992, J. Gen. Virol. 73, 2653; De Villiers et al., 2004, Virology 324, 17-27). HPV는 "고위험"(HR-HPV) 및 "저위험"(LR-HPV)으로 나누어질 수 있다. HR-HPV는 악성 손상부위로 진행될 가능성을 갖는 손상부위를 일으킬 수 있는 세포 변형과 강하게 연관되어 있는 HPV를 나타낸다. HR-HPV 타입은 HPV-16, HPV-18, HPV-30, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-45, HPV-51, HPV-52, HPV-56, HPV-58, HPV-59, HPV-66, HPV-68, HPV-70 및 HPV-85를 제한없이 포함한다. LR-HPV는 악성 손상부위로 진행할 가능성이 낮은 혹과 같은 양성 손상부위를 일으킬 수 있는 약한 세포 변형 가능성을 갖는 HPV를 나타낸다. LR-HPV 타입은 HPV-6 및 HPV-11을 제한없이 포함한다.

유두종바이러스는 임의의 천연 소스(source)로부터 단리, 클로닝 또는 유래될 수 있다. 이러한 소스로는 생물학적 샘플, 배양된 세포뿐만 아니라 재조합 물질을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "생물학적 샘플"은 유두종바이러스에 노출된 숙주 생물로부터 수집된 다양한 샘플을 포괄하며, 유두종바이러스의 소스로, 또는 진단 또는 모니터링 분석에 사용될 수 있다. 본 발명의 문맥에서, 생물학적 샘플은 수집된 후 시약 처리, 용해화, 또는 특정 성분(예를 들면, 폴리펩티드 또는 핵산 분자)의 농축(enrichment)과 같은 임의의 방식으로 취급될 수 있다. 상기 정의는 생물학적 유체(예를 들면, 혈액, 혈장, 혈청), 액체 샘플(예를 들면, 질, 경부 유체, 세포성 샘플), 고체 조직 샘플(예를 들면, 조직 절편, 생검 검체), 및 조직 배양물을 포괄한다. "배양된 세포"란 용어는 배양 중인 세포(예를 들면, ATCC에서 구입가능한 CaSki 세포), 세포 상등액(supernatant) 및 세포 용해물을 포괄한다. 재조합 물질은 유두종바이러스(예를 들면, 기탁 기관에서 구입가능함), 유두종바이러스 게놈, 게놈 또는 cDNA 라이브러리, 유두종바이러스 게놈의 절편(들)을 함유하는 플라스미드 또는 이러한 요소를 포함하는 것으로 알려져 있는 임의의 종래 기술 벡터를 제한없이 포함한다.

일반적인 정보로서, 다수의 유두종바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열 및 코딩된 폴리펩티드의 아미노산 서열이 문헌에 개시되어 있으며, 예컨대 HPV-16과 관련해서는 GenBank 기탁번호 NC_01526 및 K02718; HPV-18과 관련해서는 NC_001357 및 X05015; HPV-31과 관련해서는 J04353; HPV-33과 관련해서는 M12732; HPV-35와 관련해서는 NC_001529; HPV-39와 관련해서는 NC_001535; HPV-45와 관련해서는 X74479; HPV-51과 관련해서는 NC_001533; HPV-52와 관련해서는 NC_001592; HPV-56과 관련해서는 X74483; HPV-58과 관련해서는 D90400; HPV-59와 관련해서는 NC_001635; HPV-68과 관련해서는 X67160 및 M73258; HPV-70과 관련해서는 U21941 및 HPV-85와 관련해서는 AF131950과 같이 특수화된 데이터 뱅크에서 이용할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "유두종바이러스 E2 폴리펩티드"란 용어는 천연 E2 폴리펩티드(즉, 천연 유두종바이러스 소스의 E2 ORF로부터 발현된 것), 변형된 E2 폴리펩티드 및 그의 면역원성 펩티드를 포괄한다.

면역원성 E2 펩티드는 적어도 9개의 아미노산을 가지며, 상기 용어는 E2 에피토프(예를 들면, EP 523 395에 개시되어 있는 것과 같이, MHC 클래스 Ⅰ 및/또는 클래스 Ⅱ-매개성 경로를 통해 면역 반응을 유도 또는 활성화시킬 수 있는 특정 아미노산 모티프), 다중-에피토프 구조물(예를 들면, WO2005/089164에 개시되어 있는 것) 및 절단된 E2 폴리펩티드를 포함한다. 상기 절단은 연속적이거나 그렇지 않을 수 있으며, N-말단 및/또는 C 말단 및/또는 내부에 위치할 수 있는 1 내지 300개 아미노산 잔기로 다양할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 핵산 분자에 의해 코딩되는 E2 폴리펩티드는 임의의 유두종바이러스 유전자형으로부터 기원할 수 있으며, 전술한 것들, 보다 구체적으로는 HPV-16, HPV-18, HPV-33 또는 HPV-52 또는 그의 조합(예를 들면, HPV-16 및 HPV-18 양쪽 모두)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것과 같은 HR-HPV 유전자형이 특히 바람직하다. 예를 들면, HPV-18 E2는 Cole 등(1987, J. Mol. Biol. 193, 599-608); HPV-16 E2는 Seedorf 등(1985, Virology, 145, 181-185) 및 Kennedy 등(1991, J. Virol., 65, 2093-2097), HPV-31 E2는 Goldsborough 등(1989, Virology 171, 306-311), HPV-33 E2는 Cole 등(1986, J. Virol., 58, 991-995) 및 소 유두종바이러스 BPV-1 E2는 Chen 등(1982, Nature 299, 529-534) 및 Danos 등(1983, J. Virol. 46, 557-566)과 같이 다수의 천연 E2 폴리펩티드가 문헌에 개시되어 있다. 예시를 목적으로, HPV-16 E2 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열번호 1로 기재된다.

그러나, 본 발명은 이들 예시 서열에 한정되는 것은 아니다. 실제로, 상기 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 상이한 유두종바이러스 단리물 사이에서 변할 수 있으며, 이러한 천연적인 유전자 변화는 아래에 기재된 것과 같은 비천연 변형(들)과 마찬가지로 본 발명의 범위 내에 포함된다. "변형"이란 용어는 하나 이상의 뉴클레오티드 잔기(들) 또는 이러한 가능한 것들의 임의의 조합의 결실, 치환 또는 부가를 포함한다. 몇 개의 변형을 생각할 때, 이들은 연속적인 잔기 및/또는 비연속적인 잔기에 관한 것일 수 있다. 변형(들)은 위치-특이적 돌연변이(site-directed mutagenesis)(예를 들면, Amersham, Les Ullis, France의 Sculptor™ 시험관내 돌연변이 시스템을 이용함), PCR 돌연변이, DNA 셔플링(shuffling) 및 화학적 합성 기술(예를 들면, 합성 핵산 분자의 결과물)과 같은 기술분야의 당업자에게 알려져 있는 다수의 방법에 의해 본 발명에서 사용되는 핵산 분자에 생성될 수 있다.

본 발명에 의해 생각되는 상기 변형(들)은, 코딩되는 E2 유두종바이러스의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 사일런트(silent) 변형뿐만 아니라, 코딩되는 E2 폴리펩티드 내로 번역되어서, 그 결과 대응하는 천연 폴리펩티드와 비교하여 아미노산 서열이 변형되는 변형도 포괄한다.

코딩된 E2 폴리펩티드 레벨에서 사일런트한 변형은 전형적으로 E2-코딩 서열의 하나 이상의 코돈(들)을 동일한 아미노산을 코딩하는 하나 이상의 코돈(들)으로 교체함으로써 수행된다. Met 또는 Trp 잔기를 코딩하는 코돈은 유일하지만, 아르기닌, 루이신 또는 세린에 대해서는 6개의 상이한 코돈이, 알라닌, 글리신, 프롤린, 트레오닌 및 발린에 대해서는 4개의 상이한 코돈이 사용될 수 있음이 기술분야에서 잘 알려져 있다. 따라서, 아미노산 서열을 변경하지 않고도 E2를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 변형할 수 있다. 바람직하게는, 이러한 변형은 주어진 숙주 세포 또는 생물, 예를 들면 인간 숙주 세포를 포함하는 포유동물에서 유두종바이러스 E2 폴리펩티드의 발현을 개선하는 것이 목적이다. 이러한 변형의 대표적인 예로는 코돈-최적화에 의한 드물게 사용되는 코돈(들)의 억제, 발현 레벨에 부정적인 영향을 미치는 것으로 예측되는 음성 서열 요소의 억제 및/또는 본 발명에서 사용되는 핵산 분자 또는 벡터의 안정성에 부정적인 영향을 미치는 것으로 예측되는 상동 서열(homologous sequence)의 억제를 제한없이 포함한다.

전형적으로, 코돈 최적화는 관심있는 숙주 세포에서 드물게 사용되는 코돈에 해당하는 하나 이상의 "천연"(예를 들면, HPV) 코돈을, 보다 빈번하게 사용되는 동일한 아미노산을 코딩하는 하나 이상의 코돈으로 교체함으로써 수행된다. 발현의 증가는 일부만 교체하더라도 달성될 수 있으므로, 드물게 사용되는 코돈에 해당하는 모든 천연 코돈을 교체할 필요는 없다. 또한, 결과물인 핵산 분자 내로 제한 위치(들)를 도입하도록 하기 위하여, 최적화된 코돈 이용성을 엄격하게 고수하는 것에 대한 일부 변형이 수행될 수 있다. 이러한 코돈 최적화된 핵산 분자는, 예를 들면 WO01/14416, WO02/08435 및 WO03/018055와 같은 문헌에 개시되어 있다.

본 발명의 문맥에서 억제를 하기 위해 적합한 음성 서열 요소의 대표적인 예로는 매우 높거나(>80%) 매우 낮은(<30%) GC 함량을 갖는 부위; 매우 높은 AT 함량을 갖는 부위; 불안정한 직접 또는 역위(inverted) 반복 서열; RNA 2차 구조; 및/또는 내부 TATA-박스, 키(chi)-위치, 리보솜 진입(entry) 위치 및/또는 스플라이싱 제공(donor)/수용(acceptor) 위치와 같은 내부 잠재(cryptic) 조절 요소를 제한없이 포함한다.

본 발명에서 사용되는 핵산 분자 또는 벡터에서 상동 서열이 존재하면, 그 안정성, 특히 벡터의 제조 단계 동안에 부정적인 영향을 미칠 것으로 예측된다. 상동 서열 사이에 재조합이 일어나서, 상기 2개의 상동 서열 사이에 포함되는 영역이 결실될 가능성이 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "상동 서열"이란 용어는 적어도 40, 유익하게는 적어도 45, 바람직하게는 적어도 50, 보다 바람직하게는 적어도 55, 또는 훨씬 더 바람직하게는 적어도 59개의 연속적인 뉴클레오티드에 걸쳐 서로 높은 정도의 동질성(identity)을 갖는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 높은 정도의 동질성은 75% 또는 75% 이상, 유익하게는 80% 또는 80% 이상, 원하게는 85% 또는 85% 이상, 바람직하게는 90% 또는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 또는 95% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 97% 또는 97% 이상(예를 들면, 100%의 서열 동질성)이다. 2개의 뉴클레오티드 서열 사이의 동질성 백분율은 상기 서열들에 의해 공유된 동일한 부위 수의 함수이며, 최적의 배열을 위해 도입될 필요가 있는 빈공간(gap)의 수와 각각의 빈공간의 길이를 고려해야 한다. GCG 위스콘신 패키지와 같이, 뉴클레오티드 서열 사이의 동질성 백분율을 결정하기 위한 다양한 컴퓨터 프로그램과 수학적 알고리즘이 기술분야에서 이용가능하다.

2개의 상동 뉴클레오티드 서열 사이의 상동성은 바람직하게는 적어도 하나의 상동 서열에서의 코돈 이용성을 변질(degenerate)시켜서, 이전의 상동 서열 사이의 동질성 백분율이 75% 이하로 떨어지도록 함으로써 억제된다. 이것은 상동 부위 내에 존재하는 하나 이상의 "천연"(예를 들면, HPV) 코돈(들)을 동일한 아미노산을 코딩하는 하나 이상의 코돈(들)으로 교체함으로써 수행될 수 있다. 상동성은 일부만 교체하더라도 충분히 감소될 수 있기 때문에 모든 천연 코돈을 변질시킬 필요는 없다. 이러한 변형은 본 발명에서 사용되는 핵산 분자 또는 벡터가, 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이 상대적으로 보존되어 있거나(예를 들면, HPV-16 및 HPV-18 E2 폴리펩티드와 같이 2 이상의 E2 폴리펩티드를 코딩하는 서열), 공통 영역(예를 들면, 59개의 뉴클레오티드를 공통으로 공유하는 HPV-16 E1 및 E2-코딩 서열)을 함유하는 2개의 유두종바이러스 폴리펩티드를 코딩할 때 특히 유용하다. 이러한 구현예의 대표적인 예는 서열번호 6으로 기재되며, E1 및 E2를 코딩하는 서열 모두에 존재하는 59개 뉴클레오티드 영역에 대응하는 변질된 서열의 예를 제공한다.

코딩된 E2 폴리펩티드 레벨에서 번역하는 변형은 E2 폴리펩티드의 하나 이상의 아미노산 잔기(들)를 돌연변이시키게 된다. 유익하게는, 상기 변형된 E2 폴리펩티드는 아미노산 서열 전체 길이 또는 그의 절편(예를 들면, 적어도 9, 20, 50, 100, 200, 300개 아미노산 길이)에 걸쳐 대응하는 천연 폴리펩티드와 높은 정도의 아미노산 서열 동질성, 즉 75% 또는 75% 이상, 유익하게는 80% 이상, 원하게는 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 97% 이상(예를 들면, 100% 서열 동질성)의 아미노산 서열 동질성을 유지한다. 2개의 폴리펩티드 사이의 동질성 백분율은 상기 서열들에 의해 공유되는 동일한 부위 수의 함수이며, 최적의 배열을 위해 도입될 필요가 있는 빈공간의 수와 각각의 빈공간의 길이를 고려해야 한다. 예를 들면, W2H HUSAR 소프트웨어 및 NCBI에서 이용가능한 Blast 프로그램(예를 들면, Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402; Altschul et al., 2005, FEBS J. 272, 5101-5109)과 같이, 아미노산 서열 사이의 동질성 백분율을 결정하기 위한 다양한 컴퓨터 프로그램과 수학적 알고리즘이 기술분야에서 이용가능하다.

한 구현예에서, 본 발명에서 사용되는 핵산 분자는 천연 E2 폴리펩티드의 생물학적 활성 중 적어도 하나, 보다 구체적으로는 바이러스 복제 및/또는 전사 활성이 결핍된 E2 폴리펩티드를 코딩하도록 변형된다. 이러한 생물학적 활성에 결정적인 아미노산은 구조 및 기능 분석과 같은 일상적인 방법에 의해 동정될 수 있으며, 기술분야의 당업자는 주어진 생물학적 활성을 감소시키거나 없앨 수 있는 돌연변이(들)의 타입을 즉시 결정할 수 있다. E2의 전사 활성 및 복제 활성에 관연하는 잔기들이 N-말단 부위 내에 위치하는 반면, C-말단 부위는 바이러스 DNA 상의 E2 결합 위치에 대한 인식과 이량체화에 관여한다는 것이 기술분야에 잘 알려져 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, E2의 N-말단 부위는 개시 Met로부터 시작하여 처음 220개 아미노산 잔기를 포함한다. 예를 들면, E2 복제 기능(들)을 현저하게 감소시키거나 없애기 위하여, 바이러스 복제를 조절하는 E2 N-말단 부위 내의 하나 이상의 아미노산 잔기(들)를 결실 또는 치환시켜 유두종바이러스 게놈의 복제에 결함이 있는 E2 폴리펩티드를 생성하기 위하여 위치-특이적 돌연변이 또는 PCR 기술을 수행할 수 있다. 다른 한편으로 또는 조합하여, 유두종바이러스 프로모터로부터 전사를 활성화시키는 E2의 능력을 현저하게 감소시키거나 없애기 위하여, 전사 활성에 관여하는 E2 N-말단 부위 내의 하나 이상의 아미노산 잔기(들)를 결실 또는 치환시킬 수 있다. 적합한 결핍성 E2 폴리펩티드의 대표적인 예는 기술분야의 당업자에게 이용가능한 문헌, 예를 들면 Demeret 등(1995, Nucleic Acids Res. 23, 4777-4784), Sakai 등(1996, J. Virol. 70, 1602-1611), Brokaw 등(1996, J. Virology 70, 23-29) 및 Ferguson 등(1996, J. Virology 70, 4193-4199)에 개시되어 있다.

본 발명에서 사용되는 핵산에 의해 코딩되는 바람직한 복제-결핍성 E2 폴리펩티드는 HPV-16으로부터 기원하며, 적어도 39번 부위의 Glu 잔기(E39)가 변형, 예를 들면 Glu 이외의 임의의 아미노산 잔기로 치환된 것을 제외하고는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 포함한다. 전사 활성이 결핍된 다른 바람직한 E2 폴리펩티드는 HPV-16으로부터 기원하며, 적어도 73번 부위의 Ile 잔기(I73)가 변형, 예를 들면 Ile 이외의 임의의 아미노산 잔기로 치환된 것을 제외하고는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 포함한다. 복제 및 전사 활성 모두가 결핍된 훨씬 더 바람직한 E2 폴리펩티드는 HPV-16으로부터 기원하며, 적어도 39번 부위의 Glu 잔기(E39) 및 73번 부위의 Ile 잔기(I73)가 변형, 예를 들면 39번 및 73번 부위 각각에서 Glu 및 Ile 이외의 임의의 아미노산 잔기로 치환된 것을 제외하고는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 포함한다. 보다 바람직하게는, 39번 부위의 Glu 잔기 및/또는 73번 부위의 Ile 잔기가 Ala 잔기로 치환된다(E39A 및/또는 I73A). 본 발명의 문맥에서, 이러한 결핍성 E2 폴리펩티드는 임의의 유두종바이러스로부터 기원할 수 있으며, HPV-16 E2와 관련하여 개시된 상기 변형들을 다른 유두종바이러스 유전자형으로부터 기원하는 E2 폴리펩티드에 적용하는 것(예를 들면, HPV-16 E2의 39번 부위 및/또는 73번 부위에 상당하는 부위에 위치하는 아미노산 잔기(들)는 서열 비교에 의해 동정될 수 있고, 표준 기술에 의해 변형될 수 있다)은 당업자의 기술범위 이내이다. 예시를 위한 목적으로, 이러한 잔기들은 각각 HPV-18 E2에서는 43번 부위의 Glu 및 77번 부위의 Ile에 대응되고, HPV-33 및 HPV-52에서는 39번 부위의 Glu 및 73번 부위의 Ile에 대응된다.

다른 구현예에서, 본 발명에서 사용되는 핵산 분자는 E2의 N-말단, C-말단 중 어느 하나 또는 N- 및 C-말단 모두에서 유두종바이러스 E2 폴리펩티드가 하나 이상의 융합 파트너(들)와 융합된 것을 코딩하도록 변형된다. 상기 융합 파트너는 유두종바이러스로부터 기원하거나, 그렇지 않을 수 있다. 상기 융합은 유전공학적 수단, 즉 프레임(frame) 내에서 E2 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 융합 파트너(들)를 코딩하는 서열을 융합하여 융합된 코딩 서열이 하나의 폴리펩티드를 발현하도록 함으로써 수행될 수 있다. 상기 융합은 직접적이거나(즉, 그 사이에 어떠한 추가 아미노산 잔기도 없음), 또는 E2 폴리펩티드와 융합 파트너(들)를 연결하는 링커 펩티드를 통할 수 있다. 링커가 존재하면 융합 단백질의 올바른 형성, 접힘(folding) 및/또는 기능을 촉진할 수 있다. 본 발명에 따른 적합한 링커는 2 내지 30개 길이의 아미노산이며, 글리신, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 알라닌 및/또는 프롤린과 같은 아미노산 잔기로 이루어진다(예를 들면, Wiederrecht et al., 1988, Cell 54, 841; Aumailly et al., 1990 FEBS Lett. 262, 82; 및 Dekker et al., 1993, Nature 362, 852).

적합한 비-유두종바이러스 융합 파트너로는 칼레티큘린(Cheng et al., 2001, J. Clin. Invest. 108, 669-678), 마이코박테리움 투베르쿨로시스 열충격 단백질 70(HSP70)(Chen et al., 2000, Cancer Res. 60, 1035-1042), 유비퀴틴(Rodriquez et al., 1997, J. Virol. 71, 8497-8503) 및 슈도모나스 아에루기노사 외독소(exotoxin) A(ETA(dⅢ))의 이동 도메인과 같은 박테리아 독소(Hung et al., 2001 Cancer Res. 61, 3698-3703)를 제한없이 포함한다.

적합한 유두종바이러스 융합 파트너로는 임의의 레이트 또는 얼리 유두종바이러스 폴리펩티드 또는 이들의 임의의 절편일 수 있다. 바람직한 융합 파트너는 E1, E2, E4, E5, E6 및 E7 또는 그의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 얼리 HPV 폴리펩티드로부터 기원한다. 상기 E2 폴리펩티드 및 유두종바이러스 융합 파트너는 HPV-16 E1 및 E2 폴리펩티드의 융합과 같은 동일한 유두종바이러스 유전자형으로부터 기원할 수 있다. 다른 한편으로, 상기 E2 폴리펩티드 및 유두종바이러스 융합 파트너는 상이한 유두종바이러스 유전자형으로부터 기원할 수 있으며, 대표적인 예로는 HPV-16 E2 및 HPV-18 E2 폴리펩티드의 융합이 있다.

상기에서 정의된 변형(들)과 독립적으로 또는 조합하여, 본 발명에서 사용되는 핵산 분자는 코딩된 E2 폴리펩티드의 가공성, 안정성 및/또는 용해성에 유익한 다른 변형, 예를 들면 잠재적 절단 위치(들)의 억제, 잠재적 글리코실화 위치(들)의 억제 및/또는 코딩된 E2 폴리펩티드를 발현되는 숙주 세포의 표면에 제공하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, 잠재적 글리코실화 위치의 억제는, 진핵생물 숙주 세포 또는 생물에서 발현될 때 글리코실화될 수 없는 E2 폴리펩티드를 제공하기 위하여, 잠재적 N-글리코실화 위치(예를 들면, Asn-Val-Ser-Val 모티프를 포함)를 동정하고, 하나 이상의 아미노산 잔기(들)를 다른 잔기로 치환(예를 들면, Ser 잔기를 Gly 또는 Ala 잔기로 치환)함으로써 달성될 수 있다.

바람직한 구현예에서, 본 발명에서 사용되는 핵산 분자는 MHC 클래스 Ⅰ 및/또는 MHC 클래스 Ⅱ의 제공과, 그에 따른 숙주 세포 또는 생물에서의 잠재적 면역원성을 개선하기 위하여, 막-제공된(membrane-presented) E2 폴리펩티드를 코딩하도록 변형된다. 막 제공이 HPV-16 E6 및 E7 폴리펩티드의 치료 효능을 개선하도록 한다는 것은 이미 알려져 있다(예를 들면, WO99/03885 참조). 유두종바이러스 E2 폴리펩티드는, 비록 전형적인 핵 이동 신호는 동정되어 있지 않지만, 핵 단백질이다. 막-제공은 E2 폴리펩티드를 분비(secretory)(즉, 신호 펩티드) 및 막-고정(membrane-anchoring) 서열과 융합함으로써 달성될 수 있다. 이러한 서열은 기술분야에 알려져 있다. 간략하게, 분비 서열은 일반적으로 막-제공된 또는 분비된 폴리펩티드의 N-말단에 제공되며, 소포체(ER) 내로의 통과를 시작한다. 이들은 15 내지 35개의 필수적인 소수성 아미노산을 포함하며, ER에 위치하는 특정한 엔도펩티다제에의해 제거되어 성숙한 폴리펩티드를 제공한다. 막-고정 서열은 사실상 대개 매우 소수성이며, 상기 폴리펩티드를 세포막에 고정시키는 역할을 한다(예를 들면, Branden and Tooze, 1991, in Introduction to Protein Structure p.202-214, NY Garland 참조).

본 발명의 문맥에서 사용될 수 있는 막-고정 및/또는 분비 서열의 선택은 광범위하다. 이들은 공수병 당단백질, HPV 바이러스 외피(envelope) 당단백질 또는 홍역 바이러스 F 단백질과 같은 임의의 막-고정 및/또는 분비 폴리펩티드(예를 들면, 세포 및 바이러스 폴리펩티드)로부터 얻거나, 합성할 수 있다. 분비 서열의 바람직한 삽입 위치는 번역 시작을 위한 코돈의 N-말단 하류(downstream)이고, 막-고정 서열의 경우에는 C-말단, 예를 들면 중지 코돈의 바로 위 상류(upstream)이다. 아울러, 상기 분비 서열 및/또는 막 고정 서열을 E2 폴리펩티드에 연결하기 위하여 링커 펩티드가 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 핵산에 의해 코딩되는 막-표적화 E2 폴리펩티드는 첨부된 실시예 섹션에서 예시된 바와 같이 공수병 당단백질의 분비 및 막-고정 서열로 융합됨으로써 변형되는 것이 바람직하다.

본 발명에 따라 사용되는 바람직한 벡터는 다음을 포괄한다:

- HPV-16 E2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터;

- HPV-18 E2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터;

- HPV-33 E2 폴리페티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터;

- HPV-52 E2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터.

특히 바람직한 구현예에 따르면, E2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자는 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 포함하거나, 필수적으로 이루어지거나, 다른 한편으로는 이루어진다. 정보를 위하여, 서열번호 2의 폴리펩티드는 공수병 당단백질 분비 서열(2 내지 23번째 부위) 및 막-고정 서열(388 내지 453 부위)과 융합되어 복제 및 트랜스-활성화 활성이 결핍된(61번째 부위의 Glu 잔기와 95번째 부위의 Ile 잔기가 각각 천연 E2 폴리펩티드 내의 39 및 73번째 부위의 Glu 및 Ile 잔기에 대응하는 Ala 잔기로 변형) HPV-16 E2 폴리펩티드(24 내지 387번째 부위)를 포함한다.

본 발명은 또한 상이한 유두종바이러스 유전자형으로부터 기원하는 적어도 2개의 E2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터 또는 감염성 입자 및 이러한 벡터 또는 감염성 입자를 유두종바이러스 감염, 특히 잠복기가 긴 HR-HPV의 감염을 치료하기 위해 의도된 약물을 제조하기 위한 용도를 포괄한다. 유리한 구현예에서, "적어도 2"는 2, 3 또는 4이며, 각각의 코딩된 E2 폴리펩티드는 상이한 유전자형의 HR-HPV로부터 기원한다. 독립적으로 또는 조합하여, 상기 E2 폴리펩티드는 전술한 바와 같이 변형되는 것이 바람직하다(예를 들면, 복제 및/또는 전사 활성의 결핍 및/또는 막-제공). 적어도 2개의 E2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자는 독립적인 조절 서열 하에 놓여질 수 있거나, 서로 융합하여 하나의 폴리펩티드 사슬로 발현될 수 있다. 본 명세서에서 개시된 바와 같이, 대표적인 예로는 독립적인 조절 서열 하에 놓여 있으며, HPV-16 및 HPV-18 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터뿐만 아니라 HPV-16, HPV-18, HPV-33 및 HPV-52 E2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함한다. 본 발명의 또는 본 발명에서 사용되는 벡터가 E2 폴리펩티드를 코딩하는 2 이상의 핵산 분자를 포함할 때, 상기 E2-코딩 뉴클레오티드 서열이 변질되어 서로 75% 이하의 상동성 백분율을 나타내도록 하는 것이 권고된다. 바람직하게는, 상기 E2-코딩 핵산 분자는 75% 또는 75% 이상의 동질성 백분율을 나타내는 40개 이상(예를 들면, 50, 55, 59, 70개 또는 그 이상)의 연속하는 뉴클레오티드 영역을 포함하지 않는다.

본 발명의 특정 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 핵산 분자, 벡터 또는 감염성 입자는 또한 하나 이상의 추가 폴리펩티드(들) 또는 이러한 추가 폴리펩티드(들)를 코딩하는 하나 이상의 핵산, 벡터, 또는 감염성 입자와 조합하여 사용될 수 있다. 바람직하게는, 상기 추가 폴리펩티드(들)는 전술한 활성 제제에 의해 제공되는 치료 활성을 강화시킬 수 있다. 이러한 추가 폴리펩티드(들)를 코딩하는 핵산은 본 발명에서 사용되는 벡터, 또는 본 명세서에서 개시된 것들 중 하나와 같은 독립적인 벡터 내로 삽입될 수 있으며, 그 발현은 본 명세서에서 개시된 것과 같은 적절한 조절 서열의 조절 하에 놓여질 수 있다. 상기 추가 폴리펩티드(들)는 유두종바이러스 기원이거나, 또는 비-유두종바이러스 기원일 수 있다.

적합한 비-유두종바이러스 추가 폴리펩티드(들)로는 사이토카인(예를 들면, IL-2, IL-7, IL-15, IL-18, IL-21, IFNg) 및 자살 유전자 산물(예를 들면, Caruso 등, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7024-7028에 개시되어 있는 HSV-1의 티미딘 키나제; WO99/54481에 개시되어 있는 FCU -1)를 제한없이 포함한다.

적합한 유두종바이러스 추가 폴리펩티드(들)로는 E1, E2, E4, E5, E6 및 E7 또는 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 얼리 HPV 폴리펩티드(또는 절편)를 제한없이 포함한다.

본 발명의 한 측면에서, 상기 유두종바이러스 추가 폴리펩티드(들)는 전술한 핵산에 의해 코딩되는 E2 폴리펩티드와 동일한 유두종바이러스 유전자형으로부터 기원할 수 있다(예를 들면, HPV-16으로부터 기원하는 E1 및 E2 폴리펩티드).

다른 한편으로, 본 발명의 다른 측면에서, 상기 유두종바이러스 추가 폴리펩티드(들)는 전술한 핵산에 의해 코딩되는 E2 폴리펩티드와 상이한 유두종바이러스 유전자형으로부터 기원할 수 있다. 유익하게는, 상기 E2 폴리펩티드는 HPV-16으로부터 기원하고, 상기 추가 유두종바이러스 폴리펩티드(들)는 HPV-18로부터 기원한다.

상기 유두종바이러스 추가 폴리펩티드는 천연이거나, 또는 대응하는 천연 서열과 비교하여 변형될 수 있다. 예를 들면, 상기 추가 폴리펩티드(들)는 항원 활성을 유지하면서 그 각각의 생물학적 활성(예를 들면, 효소 활성)을 감소시키거나 없애도록 변형될 수 있다. 하기에서 예시한 예시적 변형은 HPV-16 유두종바이러스 폴리펩티드에 관하여 주어졌지만, 당업자는 이러한 예시적 돌연변이를 다른 유두종바이러스 유전자형의 대응하는 폴리펩티드에 투영할 수 있다. 또한, 상기 유두종바이러스 추가 폴리펩티드는 WO99/03885에서뿐만 아니라 E2와 관련하여 상기에 개시한 바와 같이 세포막 내에 제공되도록 추가로 변형될 수 있다.

유두종바이러스 추가 폴리펩티드의 적합한 예는 바이러스 복제를 자극하는데 결함이 있도록 하기 위하여 대응하는 천연 E1 폴리펩티드와 비교하여 하나 이상의 돌연변이(들)를 포함하는 변형된 E1 폴리펩티드이다. 바람직하게는, 상기 변형된 E1 폴리펩티드는 Yasugi 등(1997, J. Virol 71, 5942-5951)에 의해 개시된 HPV-16 E1의 변이체 W439R, Y412F, G482D 및 G496R과 같이 천연 E1 폴리펩티드의 412, 439, 482 및/또는 496번째 부위에서의 임의의 한 잔기가 돌연변이된 경우를 포함하며, 482번째 부위의 Gly 잔기를 Asp 잔기로 치환한 것을 제외하고는 천연 HPV-16 E1 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하는 G482D 변이체(예를 들면, 서열번호 3으로 기재되는 서열을 갖는 변형된 E1 폴리펩티드)가 특히 바람직하다. 다른 예시적으로 변형된 E1 폴리펩티드는 489번째 부위의 Gly 잔기가 Asp 잔기로 치환된 HPV-18 E1 폴리펩티드를 포함한다.

유두종바이러스 추가 폴리펩티드의 다른 적합한 예는 비-암유전자이고 세포의 종양 억제 유전자 산물인 p53에 결합하도록 변형된, 변형된 E6 폴리펩티드이다. 유두종바이러스 추가 폴리펩티드의 또 다른 적합한 예는 비-암유전자이고 세포의 종양 억제 유전자 산물인 Rb에 결합하도록 변형된, 변형된 E7 폴리펩티드이다. 이러한 비-암유전자 변이체는, 예를 들면 Pim 등(1994, Oncogene 9, 1869-1876), Munger 등(1989, EMBO J. 8, 4099-4105), Crook 등(1991, Cell 67, 547-556), Heck 등(1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4442-4446) 및 Phelps 등(1992, J. Virol. 66, 2148-2427)에 개시되어 있다. 바람직한 비-암유전자 E6 폴리펩티드는 HPV-16으로부터 기원하며, 118 내지 122번째 잔기(CPEEK)(+1은 첫 번째 Met 잔기로부터 출발하는 천연 HPV-16 E6 폴리펩티드의 첫 번째 아미노산을 나타냄)가 결실되어 있다. 바람직한 비-암유전자 E7 폴리펩티드는 HPV-16으로부터 기원하며, 21 내지 26번째 잔기(DLYCYE)(+1은 천연 HPV-16 E7 폴리펩티드의 첫 번째 아미노산을 나타냄)가 결실되어 있다.

바람직하게는, 본 발명에서 독립적으로 또는 조합하여 사용되기 위한 유두종바이러스 추가 폴리펩티드는 서열번호 3 내지 서열번호 5로 기재되는 임의의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 보다 구체적으로, 서열번호 3은 복제 활성이 결핍된 막-제공된 HPV-16 E1 폴리펩티드의 아미노산 서열(G482D)을 제공한다. 서열번호 4는 막-제공된 비-암유전자 HPV-16 E6 폴리펩티드의 아미노산 서열을, 서열번호 5는 막-제공된 비-암유전자 HPV-16 E7 폴리펩티드의 아미노산 서열을 제공한다.

천연 문맥(예를 들면, HPV-16 또는 HPV-18 게놈)에서, E1-코딩 핵산 분자의 3' 말단은 E2-코딩 핵산 분자의 5' 말단과 59개 뉴클레오티드에 걸쳐서 중첩한다. 바람직한 구현예에 따르면, E2-코딩 핵산 분자와 중첩하는 E1-코딩 핵산 분자 영역은 중첩하는 E2-서열과 75% 이하의 동질성 백분율을 나타내도록 변형된다. 바람직하게는, 상기 변형은 E1-코딩 핵산 분자에서 코돈 이용성을 변질시킴으로써 뉴클레오티드 레벨에서 수행되며, 아미노산 레벨에서는 사일런트, 즉 이러한 변형은 코딩된 유두종바이러스 E1 폴리펩티드로 번역되지는 않는다. HPV-16 E1-코딩 핵산 분자의 3' 말단에서 제공되고 천연 문맥에서 HPV-16 E2-코딩 핵산 분자의 5' 영역과 중첩하는 59 bp 영역 내에 도입될 수 있는 변형의 대표적인 예는 서열번호 6으로 기재된다.

본 발명은 또한 유두종바이러스 E1 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 한 핵산 분자 및 유두종바이러스 E2 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 한 핵산 분자를 포함하는 벡터 또는 감염성 바이러스 입자(예를 들면, 본 명세서에서 개시된 바와 같은 잠복기가 긴 유두종바이러스 감염을 치료하기 위해 사용됨)에 관한 것으로서, 천연 문맥에서 상기 E2-코딩 핵산 분자의 5' 영역과 100% 일치하는 상기 E1-코딩 핵산 분자의 3' 영역이 상기 E2-코딩 핵산 분자의 상기 영역과 75% 이하의 동질성 백분율을 나타내도록 변형된다. 다른 구현예에서, 본 발명은 또한 유두종바이러스 E1 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 한 핵산 분자 및 유두종바이러스 E2를 코딩하는 적어도 한 핵산 분자를 포함하는 벡터 또는 감염성 입자에 관한 것으로서, 상기 E1-코딩 핵산 분자와 E2-코딩 핵산 분자는 75% 또는 75% 이상의 동질성 백분율을 나타내는 40개 이상(예를 들면, 45, 50, 55, 59, 70개)의 연속적인 뉴클레오티드 영역을 포함하지 않는다.

본 구현예에 따른 바람직한 벡터는 하기 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 벡터를 포괄한다:

- (ⅰ) HPV-16 E2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 추가로 (ⅱ) HPV-18 E2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터;

- (ⅰ) HPV-16 E2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, (ⅱ) HPV-18 E2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자 및 (ⅲ) HPV-33 E2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터;

- (ⅰ) HPV-16 E2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, (ⅱ) HPV-18 E2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자 및 (ⅲ) HPV-52 E2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터;

- (ⅰ) HPV-16 E2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, (ⅱ) HPV-33 E2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자 및 (ⅲ) HPV-52 E2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터;

- (ⅰ) HPV-16 E2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, (ⅱ) HPV-18 E2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, (ⅲ) HPV-33 E2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자 및 (ⅳ) HPV-52 E2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터;

- (ⅰ) HPV-16 E2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자 및 (ⅱ) HPV-16 E1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터;

- (ⅰ) HPV-16 E2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, (ⅱ) HPV-16 E1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, (ⅲ) HPV-18 E2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자 및 (ⅳ) HPV-18 E1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터;

- (ⅰ) HPV-16 E2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자 및 (ⅱ) HPV-16 E6 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터;

- (ⅰ) HPV-16 E2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자 및 (ⅱ) HPV-16 E7 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터;

- (ⅰ) HPV-16 E2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, (ⅱ) HPV-16 E1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, (ⅲ) HPV-16 E6 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자 및 (ⅳ) HPV-16 E7 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터;

- (ⅰ) HPV-16 E1, E2, E6 및 E7 폴리펩티드 및 HPV-18 E1, E2, E6 및 E7 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터.

바람직하게는, 상기 코딩된 E2 폴리펩티드(들)는 막-제공되고, 복제 및 전사 활성화 활성에 대해 결함이 있다. 바람직하게는, 상기 HPV-16 E2 폴리펩티드는 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 포함하거나, 다른 한편으로는 필수적으로 이루어지거나, 다른 한편으로는 이루어지고; 및/또는 상기 HPV-18 E2 폴리펩티드는 서열번호 29로 기재되는 아미노산 서열을 포함하거나, 다른 한편으로는 필수적으로 이루어지거나, 다른 한편으로는 이루어지며; 및/또는 상기 HPV-33 E2 폴리펩티드는 서열번호 30으로 기재되는 아미노산 서열을 포함하거나, 다른 한편으로는 필수적으로 이루어지거나, 다른 한편으로는 이루어지고; 및/또는 상기 HPV-52 E2 폴리펩티드는 서열번호 31로 기재되는 아미노산 서열을 포함하거나, 다른 한편으로는 필수적으로 이루어지거나, 다른 한편으로는 이루어진다.

독립적으로 또는 조합하여, 상기 코딩된 E1 폴리펩티드(들)는 막-제공되고, 복제 활성에 대해 결함이 있다. 바람직하게는, 상기 HPV-16 E1 폴리펩티드는 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열을 포함하거나, 다른 한편으로는 필수적으로 이루어지거나, 다른 한편으로는 이루어지고; 및/또는 상기 HPV-18 E1 폴리펩티드는 서열번호 32로 기재되는 아미노산 서열을 포함하거나, 다른 한편으로는 필수적으로 이루어지거나, 다른 한편으로는 이루어진다. 상기 코딩된 E6 및/또는 E7 폴리펩티드(들)는 막-제공되고, 비-암유전자이다. 바람직하게는, 상기 HPV-16 E6 폴리펩티드는 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열을 포함하거나, 다른 한편으로는 필수적으로 이루어지거나, 다른 한편으로는 이루어지고; 및/또는 상기 HPV-16 E7 폴리펩티드는 서열번호 5로 기재되는 아미노산 서열을 포함하거나, 다른 한편으로는 필수적으로 이루어지거나, 다른 한편으로는 이루어진다.

보다 바람직하게는, HPV-16 E2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자는 서열번호 8로 기재되는 뉴클레이티드 서열을 포함하거나, 필수적으로 이루어지거나, 이루어지고; 및/또는 상기 HPV-18 E2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자는 서열번호 33으로 기재되는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 필수적으로 이루어지거나, 이루어지며; 및/또는 상기 HPV-33 E2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자는 서열번호 34 또는 서열번호 35로 기재되는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 필수적으로 이루어지거나, 이루어지고; 및/또는 상기 HPV-52 E2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자는 서열번호 36 또는 서열번호 37로 기재되는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 필수적으로 이루어지거나, 이루어지며; 및/또는 상기 HPV-16 E1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자는 서열번호 7로 기재되는 뉴클레오티드 서열(HPV-16 E2 중첩 영역과의 상동성을 감소시키기 위해 변질된 서열)을 포함하거나, 필수적으로 이루어지거나, 이루어지고; 및/또는 상기 HPV-18 E1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자는 서열번호 38로 기재되는 뉴클레오티드 서열(HPV-16 E1-코딩 서열과의 상동성을 감소시키기 위해 변질된 서열)을 포함하거나, 필수적으로 이루어지거나, 이루어진다.

E2 폴리펩티드를 코딩하는 2 이상의 핵산 분자를 포함하는 벡터와 연관된 구현예와 관련하여 본 명세서에 개시된 바와 같이, 상기 E2-코딩 뉴클레오티드 서열은 바람직하게는 그 전체 길이 서열에 걸쳐 서로 75% 이하의 상동성 백분율을 나타내도록 변질되는 것이 권고된다. 상기 E2-코딩 핵산 분자는 75% 또는 75% 이상의 동질성 백분율을 나타내는 40개 이상(예를 들면, 45, 50, 55, 59, 79개 또는 훨씬 더)의 연속적인 뉴클레오티드 영역을 포함하지 않는 것이 바람직하다. 전술한 뉴클레오티드 서열은 이러한 구현예를 충족시킨다.

본 발명의 벡터 또는 감염성 바이러스 입자에서 사용되거나 포함되는 핵산 분자(들)는 기술분야에서 접근가능한 서열 데이터 및 본 명세서에서 제공된 서열 정보를 이용하여 생성될 수 있다. 상기 핵산 분자는 HPV-함유 세포(예를 들면, 기탁번호 CRL-1550 하에 ATCC에서 이용가능한 CaSki 세포), 또는 상기에서 정의된 바와 같은 임의의 유두종바이러스 소스로부터 종래 분자생물학 또는 PCR 기술에 의해 직접 단리될 수 있으며, 필요시 (예를 들면, 결핍된 변이체 등을 생성하기 위해 특정 숙주 세포에서의 발현을 최적화하기 위하여) 일상적인 돌연변이 기술에 의해 본 명세서에서 정의된 바와 같이 추가로 변형될 수 있다. 다른 한편으로, 본 발명에서 사용되는 상기 핵산 분자(들)는 또한 자동화된 공정(예를 들면, Edge, 1981, Nature 292, 756; Nambair et al., 1984, Science 223, 1299; Jay et al., 1984, J. Biol. Chem. 259, 6311의 실시예에서 개시되어 있는 것과 같은 중첩하는 합성 올리고뉴클레오티드로부터 조립됨)으로 화학적 합성에 의해 생성될 수 있다.

다른 구현예에서, 본 발명에 따라 사용되거나 또는 본 발명의 벡터 또는 감염성 바이러스 입자에 포함되는 핵산 분자(들)는 숙주 세포 또는 생물에서 코딩되는 폴리펩티드(들)의 발현에 적합한 형태이며, 이는 상기 핵산 분자(들)가 그 발현에 필요한 하나 이상의 조절 서열의 조절 하에 놓여 있다는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "조절 서열"이란 용어는, 핵산 분자 또는 그 유도체 중 하나(즉, mRNA)의 숙주 세포 내로의 복제, 배가(duplication), 전사, 스플라이싱, 번역, 안정성 및/또는 이동을 포함하는, 주어진 숙주 세포에서 핵산 분자의 발현을 가능하게 하거나, 기여하거나 또는 조정하는 임의의 서열을 나타낸다. 이러한 조절 서열은 기술분야에 잘 알려져 있다(예를 들면, Goeddel, 1990, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego 참조). 상기 조절 서열의 선택은 벡터의 타입, 숙주 세포, 원하는 발현 레벨 등과 같은 인자들에 의존할 것임이 기술분야의 당업자에 의해 인식될 것이다.

본 발명의 문맥에서, 상기 조절 서열은 발현되는 핵산 분자에 실시가능하게(operably) 연결되어 있다. "실시가능하게 연결된"은 상기 핵산 분자가 숙주 세포 또는 생물에서 발현되도록 하는 방식으로 조절 서열에 연결되어 있음을 의미하는 의도이다.

상기 프로모터는 특히 중요하며, 본 발명은 많은 타입의 숙주 세포에서 핵산 분자를 직접적으로 발현시키는 지속적(constitutive) 프로모터와, 특정 숙주 세포 내에서 또는 특정 사건이나 외인성 인자(예를 들면, 온도, 영양 첨가제, 호르몬 또는 다른 리간드)에 대한 반응시에만 직접적으로 발현시키는 프로모터를 사용하는 것을 포괄한다. 적합한 프로모터는 문헌에 널리 개시되어 있으며, 보다 구체적으로는 RSV(Rous Sarcoma Virus), SV40(Simian Virus-40), CMV(Cytomegalo Virus) 및 MLP(Major Late Promoter) 프로모터와 같은 바이러스 프로모터를 인용할 수 있다. 폭스바이러스 벡터에서 사용하기 위한 바람직한 프로모터로는 백시니아 프로모터 7.5K, H5R, TK, p28, p11 및 K1L, 얼리 및 레이트 폭스바이러스 프로모터 사이의 키메라(chimera) 프로모터뿐만 아니라 Chakrabarti 등(1997, Biotechniques 23, 1094-1097), Hammond 등(1997, J. Virological Methods 66, 135-138) 및 Kumar 및 Boyle(1990, Virology 179, 151-158)에 개시되어 있는 것과 같은 합성 프로모터를 제한없이 포함한다.

기술분야의 당업자는 상기 핵산 분자의 발현을 조절하는 조절 서열이 숙주 세포 또는 생물 내로의 전사의 적합한 시작, 조절 및/또는 종결(예를 들면, 폴리 A 전사 종결 서열), mRNA 이동(예를 들면, 핵 이동 신호 서열), 가공(예를 들면, 스플라이싱 신호), 안정성(예를 들면, 인트론 및 비-코딩 5' 및 3' 서열) 및 번역(예를 들면, 3자간(tripartite) 리더 서열, 리보솜 결합 위치, 샤인-달가노 서열, 등)을 위한 다른 인자를 추가로 포함할 수 있음을 인식할 것이다.

본 발명의 문맥에서, 하나 이상 카피(copy)의 핵산 분자가 본 발명에 따라 사용되는 상기 벡터 또는 감염성 바이러스 입자 내에 포함될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "벡터"라는 용어는 바이러스뿐만 아니라 비-바이러스(예를 들면, 플라스미드 DNA) 벡터를 정의하며, 염색체외(예를 들면, 에피솜(episome)), 멀티카피 및 삽입(integrating) 벡터(즉, 숙주 염색체 내에 삽입되기 위한 것)를 포함한다. 본 발명의 문맥에서 특히 중요한 것은 유전자 치료(즉, 핵산 분자를 숙주 생물에 전달할 수 있음)에 사용되기 위한 벡터뿐만 아니라 다양한 발현 시스템에서 사용되기 위한 발현 벡터이다. 바이러스 벡터를 나타낼 때, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "벡터"라는 용어는 바이러스 기원의 적어도 한 요소를 포함하는 임의의 핵산 분자를 나타내며, 완전한 바이러스 게놈, 그의 일부 또는 후술하는 변형된 바이러스 게놈뿐만 아니라 그로부터 생성된 바이러스 입자(예를 들면, 감염성 바이러스 입자를 제조하기 위해 바이러스 캡시드 내로 패키지된 바이러스 벡터)를 포함한다.

적합한 비-바이러스 벡터로는 pREP4, pCEP4(Invitrogene), pCI(Promega), pCDM8(Seed, 1987, Nature 329, 840), pVAX 및 pgWiz(Gene Therapy System Inc; Himoudi et al., 2002, J. Virol. 76, 12735-12746)과 같은 플라스미드를 포함한다.

바이러스 벡터는 다양한 상이한 바이러스, 특히 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노바이러스-연관 바이러스(AAV), 폭스바이러스, 헤르페스 바이러스, 홍역 바이러스 및 포미 바이러스(foamy virus)로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스로부터 기원할 수 있다. 바이러스 벡터는 복제-수용성(competent)일 수 있으며, 또는 복제-결핍성 또는 복제-손상성(impaired)이 되도록 유전적으로 무력화될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "복제-수용성"이란 용어는 특정 숙주 세포(예를 들면, 종양 세포)에서 더 잘 또는 선택적으로 복제하도록 가공된(engineered) 복제-선택적 및 조건적으로 복제하는 바이러스 벡터를 포괄한다.

한 측면에서, 본 발명에서 사용되는 벡터는 아데노바이러스 벡터이다(리뷰를 위하여, "Adenoviral vectors for gene therapy", 2002, Ed D. Curiel and J. Douglas, Academic Press 참조). 이는 다양한 인간 또는 동물 소스로부터 기원할 수 있으며, 임의의 혈청형(serotype)이 아데노바이러스 혈청형 1 내지 51로부터 도입될 수 있다. 특히 바람직한 것은 인간 아데노바이러스 2(Ad2), 5(Ad5), 6(Ad6), 11(Ad11), 24(Ad24) 및 35(Ad35)이다. 이러한 아데노바이러스는 ATCC(American Type Culture Collection, Rockville, Md.)로부터 이용가능하며, 그 서열, 조직화 및 제조 방법을 개시하고 있는 많은 공개문헌들의 주제가 되어 왔고, 당업자들이 이들을 적용하도록 한다(예를 들면, US6,133,028; US6,110,735; WO02/40665; WO00/50573; EP 1016711; Vogels et al., 2003, J. Virol. 77, 8263-8271 참조).

본 발명에서 사용되는 아데노바이러스 벡터는 복제-수용성일 수 있다. 복제-수용성 아데노 벡터의 많은 예들은 기술분야의 당업자에게 즉시 이용가능하다(Hernandez-Alcoceba et al., 2000, Human Gene Ther. 11, 2009-2024; Nemunaitis et al., 2001, Gene Ther. 8, 746-759; Alemany et al., 2000, Nature Biotechnology 18, 723-727). 예를 들면, 이들은 E1A CR2 도메인을 결실시키거나(예를 들면, WO00/24408) 및/또는 천연 E1 및/또는 E4 프로모터를 조직, 종양 또는 세포 상태-특이적 프로모터로 교체함으로써(예를 들면, US5,998,205, WO99/25860, US5,698,443, WO00/46355, WO00/15820 및 WO01/36650) 야생형 아데노바이러스 게놈으로부터 가공될 수 있다.

다른 한편으로, 본 발명에서 사용되는 아데노바이러스 벡터는 복제-결핍성이다(예를 들면, WO94/28152; Lusky et al., 1998, J. Virol 72, 2022-2032 참조). 바람직한 복제-결핍성 아데노바이러스 벡터는 대략 459 내지 3328 부위 또는 대략 459 내지 3510 부위까지 E1 결실이 연장된(기탁번호 M73260 하에 GenBank에 개시되어 인간 아데노바이러스 타입 5의 서열 및 Chroboczek et al., 1992, Virol. 186, 280-285 참조) E1-결핍성이다(예를 들면, US6,136,594 및 US6,013,638). 클로닝 효능은 아데노바이러스 게놈의 다른 영역(들)(예를 들면, 비-필수적 E3 부위 또는 다른 필수적 E2, E4 부위)을 결실시킴으로써 추가로 개선될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 핵산 분자의 삽입은 Chartier 등(1996, J. Virol. 70, 4805-4810)에 개시되어 있는 바와 같이 아데노바이러스 게놈의 임의의 위치에서의 상동성 재조합을 통해 수행될 수 있다. 바람직하게는, E1 부위를 교체하여 삽입된다. 문제 부위의 천연 전사 방향에 대해 센스 또는 안티센스 방향으로 위치될 수 있다.

다른 및 바람직한 측면에서, 본 발명에서 사용되는 벡터는 폭스바이러스 벡터이다(예를 들면, Cox et al., in "Viruses in Human Gene Therapy" Ed J. M. Hos. Carolina Academic Press 참조). 이는 폭스비리대의 임의의 일원, 특히 카나리폭스(예를 들면, WO95/27780에 개시되어 있는 바와 같은 ALVAC), 파울폭스(예를 들면, Paoletti et al., 1995, Dev. Biol. Stand. 84, 159-163에 개시되어 있는 바와 같은 TROVAC) 또는 백시니아 바이러스로부터 얻어질 수 있으며, 후자인 것이 바람직하다. 적합한 백시니아 바이러스로는 코펜하겐 균주(Goebel et al., 1990, Virol. 179, 247-266 및 517-563; Johnson et al., 1993, Virol. 196, 381-401), 와이어스(Wyeth) 균주, NYVAC(WO92/15672 및 Tartaglia et al., 1992, Virology 188, 217-232 참조) 및 매우 약독화된 변형된 앙카라(MVA) 균주(Mayr et al., 1975, Infection 3, 6-16)를 제한없이 포함한다.

폭스바이러스 게놈에서 발현되기 위해 요구되는 핵산 분자 및 연관된 조절 요소를 삽입하기 위한 기본적인 기술은 기술분야의 당업자가 접근가능한 많은 문헌에 개시되어 있다(Paul et al., 2002, Cancer Gene Ther. 9, 470-477; Piccini et al., 1987, Methods of Enzymology 153, 545-563; US4,769,330; US4,772,848; US4,603,112; US5,100,587 및 US5,179,993). 보통, 바이러스 게놈과 삽입될 핵산을 운반하는 플라스미드 양쪽 모두에 존재하는 중첩 서열(즉, 원하는 삽입 위치에 인접함) 사이의 상동성 재조합을 통해 진행된다. 본 발명에서 사용되는 핵산 분자는, 재조합 폭스바이러스가 살아있고 감염성을 유지하기 위하여, 폭스바이러스 게놈의 비필수 위치 내에 삽입되는 것이 바람직하다. 비필수 부위는 비-코딩 유전자간(intergenic) 부위이거나, 또는 불활성되거나 결실되더라도 바이러스의 성장, 복제 또는 감염에 현저한 손상을 주지 않는 임의의 유전자이다. 예를 들면, 폭스바이러스 게놈 내의 결실된 서열에 대응하는 보완 서열(complementing sequence)을 운반하는 헬퍼 세포주를 이용함으로써, 바이러스 입자가 제조되는 동안에 상기 결핍된 기능이 인트랜스(in trans)로 제공된다면, 필수 바이러스 위치 내로 삽입하는 것 또한 생각할 수 있다.

코펜하겐 백시니아 바이러스를 이용할 때, 핵산 분자는 티미딘 키나제 유전자(tk) 내로 삽입되는 것이 바람직하다(Hruby et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci USA 80, 3411-3415; Weir et al., 1983, J. Virol. 46, 530-537). 그러나, 다른 삽입 위치, 예를 들면 헴아글루티닌(hemagglutinin) 유전자 내(Guo et al., 1989, J. Virol. 63, 4189-4198), K1L 위치 내, u 유전자 내(Zhou et al., 1990, J. Gen. Virol. 71, 2185-2190), 또는 다양한 자연적 또는 가공된 결실이 문헌에 보고되어 있는 백시니아 바이러스 게놈의 왼쪽 말단(Altenburger et al., 1989, Archives Virol. 105, 15-27; Moss et al. 1981, J. Virol. 40, 387-395; Panicali et al., 1981, J. Virol. 37, 1000-1010; Perkus et al, 1989, J. Virol. 63, 3829-3836; Perkus et al, 1990, Virol. 179, 276-286; Perkus et al, 1991, Virol. 180, 406-410) 또한 적당하다.

MVA를 사용할 때, 핵산 분자는 MVA 게놈 내에 나타나는 동정된 결실부위 Ⅰ 내지 Ⅶ(Antoine et al., 1998, Virology 244, 365-396)뿐만 아니라 D4R 위치 중 어느 하나 내로 삽입될 수 있지만, 결실부위 Ⅱ 또는 Ⅲ 내에 삽입되는 것이 바람직하다(Meyer et al., 1991, J. Gen. Virol. 72, 1031-1038; Sutter et al,, 1994, Vaccine 12, 1032-1040).

파울폭스 바이러스를 사용할 때, 티미딘 키나제 유전자 내로 삽입하는 것이 고려될 수 있지만, 핵산 분자는 ORF 7 및 9 사이에 위치하는 유전자간 영역 내로 도입되는 것이 바람직하다(예를 들면, EP 314 569 및 US5,180,675 참조).

바람직하게는, 본 발명의 또는 본 발명에 따라 사용되는 벡터는 백시니아 바이러스 벡터이며, MVA 벡터인 것이 특히 바람직하다. 보다 바람직하게는, 핵산 분자(들)는 결실부위 Ⅲ 내에 삽입되고, 특히 상기 핵산 분자가 동일한 프로모터의 조절 하에 놓여질 때 결과적으로 반대 방향으로 삽입된다. 상기 E2- 및/또는 E7-코딩 핵산 분자(들)는 백시니아 H5R 프로모터 하에 놓여지고, 상기 E1- 및/또는 E6-코딩 핵산 분자(들)는 p7.5K 프로모터의 조절 하에 놓여지는 것이 바람직하다.

본 발명은 또한 지질 또는 폴리머와 복합체를 만들어 리포좀, 리포플레스 또는 나노입자와 같은 입자상 구조를 형성하는 벡터를 사용하는 것을 포괄한다. 이러한 기술은 기술분야에서 이용가능하다(예를 들면, Arangoa et al., 2003, Gene Ther. 10: 5-14; Eliaz et al., 2002, Gene Ther. 9, 1230-1237 및 Betageri et al., 1993, "Liposome drug delivery systems", Technomic Publishing Company, Inc 참조).

본 발명은 또한 전술한 핵산 분자를 포함하는 감염성 바이러스 입자 또는 벡터 및 본 명세서에서 정의된 바와 같은 그의 용도에 관한 것이다.

전형적으로, 이러한 바이러스 입자는 기술분야에 잘 알려진 기술을 이용하여 적합한 조건 하에 배양된 적절한 세포주에서 제조된다. 본 명세서에서는 감염성 바이러스 입자를 제조하기 위해 알려진 다양한 방법들을 상세히 기술하기 위한 어떠한 시도도 하지 않을 것이다.

상기 바이러스 벡터가 결핍성일 때, 상기 감염성 입자는 통상 보완 세포주 또는 비-기능성 바이러스 유전자를 인트랜스로 제공하는 헬퍼 바이러스를 사용함으로써 제조된다. 예를 들면, E1-결실된 아데노바이러스 벡터를 보완하기에 적합한 세포주는 293 세포(Graham et al., 1997, J. Gen. Virol. 36, 59-72)뿐만 아니라 PER-C6 세포(Fallaux et al., 1998, Huamn Gene Ther. 9, 1909-1917) 및 PER-C6 유도체를 포함한다. 폭스바이러스 벡터를 번식시키기에 적합한 세포는 조류 세포이며, 가장 바람직하게는 수정란으로부터 얻은 닭 배아로부터 제조된 원형의 닭 배아 섬유아세포(CEF)이다. 상기 제조 세포(producer cell)는 적절한 온도, pH 및 산소 함량 조건 하에 종래의 발효 생물반응기(bioreactor), 플라스크 및 페트리 플레이트에서 배양될 수 있다.

상기 감염성 바이러스 입자는 배양 상등액 또는 용혈(lysis) 후의 세포로부터 회수될 수 있다. 이들은 표준 기술(예를 들면, WO96/27677, WO98/00524, WO98/22588, WO98/26048, WO00/40702, EP1016700 및 WO00/50573에 개시된 바와 같은 크로마토그래피, 초원심분리)에 따라 추가로 정제될 수 있다.

본 발명은 또한 특정한 표적 세포로 우세하게(preferential) 표적화하도록 변형되어 있는 핵산 분자, 벡터 또는 바이러스 입자의 용도를 포괄한다(예를 들면, Wickam et al., 1997, J. Virol. 71, 8221-8229; Arnberg et al., 1997, Virol. 227, 239-244; Michael et al., 1995, Gene Therapy 2, 660-668; WO94/10323; WO02/96939 및 EP 1 146 125). 표적화된 벡터 및 바이러스 입자의 특징적인 특성은 그 표면에 세포-특이적 마커(예를 들면, HPV-감염된 세포), 조직-특이적 마커(예를 들면, 상피세포 특이적 마커)뿐만 아니라 바이러스(예를 들면, HPV) 항원과 같은 세포 및 표면-노출된 성분을 인식하고 결합할 수 있는 리간드가 존재한다는 것이다. 적합한 리간드의 예로는 HPV 항원성 도메인에 대한 항체 또는 그 절편을 포함한다. 세포의 표적화는 상기 리간드를 바이러스 표면 상에 존재하는 폴리펩티드(예를 들면, 아데노바이러스 섬유, 펜톤, pIX 또는 백시니아 p14 유전자 산물) 내로 유전공학적으로 삽입시킴으로써 수행될 수 있다.

본 발명은 또한 본 명세서에 개시된 바와 같이 사용되기 위한 전술한 핵산 분자, 벡터 또는 감염성 바이러스 입자를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.

본 발명에서 사용되는 핵산 분자, 벡터 및 감염성 바이러스 입자는 기술분야에서 알려진 임의의 방법에 의해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 이러한 방법은 미세주사(microinjection)(Capechi et al., 1980, Cell 22, 479-488), CaPO₄-매개성 트랜스펙션(transfection)(Chen and Okayama, 1987, Mol. Cell Biol. 7, 2745-2752), DEAE-덱스트란-매개성 트랜스펙션, 전기천공(electroporation)(Chu et al., 1987, Nucleic Acid Res. 15, 1311-1326), 리포펙션/리포좀 융합(Felgner et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7413-7417), 입자 충격(particle bombardment)(Yang et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 9568-9572), 유전자 총, 트랜스덕션(transduction), 바이러스 감염뿐만 아니라 다양한 수단을 통해 숙주 생물 내로 직접 도입하는 것을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 전술한 바와 같이, 이들은 숙주 세포 또는 생물 내로 이들의 도입을 촉진시키기 위하여 폴리양이온성 폴리머(예를 들면, 키토산, 폴리메타크릴레이트, PEI, 등) 및 양이온성 지질(예를 들면, 현재 Promega로부터 구입가능한 DC-Chol/DOPE, 트렌스펙탐 리포펙틴)과 같은 트랜스펙션 시약과 함께 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 측면에서, 전술한 핵산 분자, 벡터 또는 감염성 바이러스 입자(또한, 본 명세서에서 "활성 제제"로도 나타냄) 또는 그의 임의의 조합은 조성물 내에 포함된다. 이러한 조합은 상이한 유전자형의 E2 폴리펩티드를 코딩하는 벡터 또는 바이러스 입자를 포함할 수 있다.

유익하게는, 상기 조성물은 치료학적 유효량의 활성 제제(들), 약학적으로 허용가능한 비히클(vehicle)을 추가로 포함하는 약학적 조성물이다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "치료학적 유효량"은 보통 치료되기 원하는 질병 또는 질환과 연관되는 하나 이상의 증상을 완화시키기에 충분한 투여량(dose)이다. 예를 들면, 치료학적 유효량은 면역 반응을 유도하거나, 면역 시스템을 활성화시켜 항-HPV 반응을 나타나게 하기에 필요한 양일 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "약학적으로 허용가능한 비히클"은 약학적 투여시에 양립가능한(compatible) 임의의 및 모든 담체, 용매, 희석제, 부형제, 보조제(adjuvant), 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 및 흡수 지연제 등을 포함하는 의도이다.

바람직하게는, 본 발명에서 사용되는 조성물은 인간 또는 동물에 사용되기 위해 제형화된다. 등장(isotonic), 저장(hypotonic) 또는 약한 고장(hypertonic)의 희석제에 포함되고, 상대적으로 낮은 이온 세기를 갖는 것이 바람직하다. 적합한 희석제의 대표적인 예로는 멸균수, 생리식염수(예를 들면, 염화나트륨), 링거 용액, 글루코오스, 트레할로오스 또는 사카로오스 용액, 행크 용액, 및 다른 수용성 생리학적 균형 염 용액(예를 들면, 가장 최근 판의 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, A. Gennaro, Lippincott, Williams&Wilkins 참조)을 포함한다. 또한, 상기 조성물은 생리적 또는 약간 염기성인 pH(예를 들면, 약 pH 7 내지 약 pH 9 사이)에서 버퍼(buffer)될 수 있다. 적합한 버퍼로는 포스페이트 버퍼(예를 들면, PBS), 중탄산염 버퍼 및 Tris-HCl 버퍼를 제한없이 포함한다. 예시를 목적으로, 본 발명에 특별히 적합한 제형으로는 다음을 포함한다:

- 1 M 사카로오스, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl₂, 54 ㎎/ℓ 트윈 80, 10 mM Tris-HCl pH 8.5(특히, 상기 활성 제제가 아데노바이러스 벡터일 때);

- 10 ㎎/㎖ 만니톨, 1 ㎎/㎖ HSA, 20 mM Tris, pH 7.2, 및 150 mM NaCl; 및

- 생리식염수.

이러한 제형은 본 발명에서 사용되는 상기 조성물의 안정성을 냉동(예를 들면, -70℃, -20℃), 냉장(예를 들면, 4℃) 또는 주위 온도에서 보존하기에 특히 적합하다. 본 발명에서 사용되는 조성물은 또한 고형 형태로 제형화될 수 있다. 고형(예를 들면, 건조 분말 또는 동결건조) 조성물은 진공건조 및 동결건조를 포함하는 공정에 의해 얻어질 수 있다. 이들은 보통 사용하기 전에 적합한 비히클에서 재구성된다.

또한, 상기 조성물은, 예를 들면 pH의 변형 또는 유지, 삼투압, 점성, 투명성, 색조, 멸균성, 안정성, 제형의 용해 속도, 인간 또는 동물 생물 내로의 방출 또는 흡수를 변형 또는 유지, 점막 배리어(barrier)에 대한 이동 촉진 또는 특정한 기관 내의 침투를 포함하는 원하는 약학적 또는 약동학적(pharmacodynamic) 특성을 부여하기 위하여 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함할 수 있다. 예를 들면, 질로 투여하기에 적합한 조성물은 결과적으로 점막의 구멍 크기를 증가시키기에 적합한 하나 이상의 흡착 촉진제(enhancer)를 포함할 수 있다.

아울러, 본 발명에서 사용되는 조성물은 인간에서 전신 또는 점막성 적용에 적합한 하나 이상의 보조제(들)를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 보조제는 활성 제제, 특히 예를 들면 TLR-7, TLR-8 및 TLR-9와 같은 톨-유사 수용체(toll-like receptor, TLR)를 통한 T 세포-매개성 면역에 대한 면역을 자극할 수 있다. 유용한 보조제의 대표적인 예로는 알룸(alum), 프룬드(Freunds) 완전 및 불완전제(IFA)와 같은 미네랄 오일 유제(emulsion), 리포폴리사카라이드 또는 그의 유도체(Ribi et al., 1986, Immunology and Immunopharmacology of Bacterial Endotoxins, Plenum Publ. Corp., NY, p407-419), QS21과 같은 사포닌(Sumino et al., 1998, J. Virol. 72, 4931-4939; WO98/56415), 이미퀴모드와 같은 이미다조퀴놀린 화합물(Suader, 2000, J. Am Acad Dermatol. 43, S6-S11), 1H-이미다조(4, 5-c) 퀴놀론-4-아민 유도체(Aldara™) 및 연관된 화합물 S-27609(Smorlesi, 2005, Gene Ther. 12, 1324-1332), CpG와 같은 시토신 포스페이트 구아노신 올리고데옥시뉴클레오티드(Chu et al., 1997, J. Exp. Med. 186: 1623; Tritel et al., 2003, J. Immunol. 171: 2358-2547) 및 IC-31과 같은 양이온성 펩티드(Kritsch et al., 2005, J. Chromatogr Anal. Technol Biomed Life Sci 822, 263-270)를 제한없이 포함한다.

본 발명에서 사용되는 조성물은 전신, 국소 및 점막 투여를 포함하는 다양한 투여 형태로 투여될 수 있다. 전신 투여는 예를 들면 피하, 피부내, 근육내, 정맥내, 복강내, 혈관내, 동맥내 주사에 의한 임의의 수단에 의해 수행될 수 있다. 주사는 종래의 주사기 및 바늘, 또는 기술분야에서 이용가능한 임의의 다른 적절한 장치에 의해 수행될 수 있다. 점막 투여는 구강, 코, 기관지내, 폐내, 질내 또는 직장내 경로에 의해 수행될 수 있다. 국소 투여는 경피성 수단(예를 들면, 패치 등)을 이용하여 수행될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 조성물은 주사에 적합한 형태로 제형화되는 것이 바람직하며, 근육내 또는 피하 투여가 바람직하다.

적절한 투여량은 다양한 파라미터, 특히 투여 경로; 도입되는 활성 제제; 숙주 생물의 연령, 건강 및 체중; 병행 치료의 종류; 및/또는 치료 빈도의 함수로 조정될 수 있다. 치료를 위한 적절한 투여량을 결정하기 위해 필요한 계산의 추가적인 상세(refinement)는 해당 상황의 견지에서 숙련자에 의해 일상적으로 수행된다. 일반적인 지침을 위하여, 아데노바이러스 입자에 대한 적절한 투여량은 약 10⁵ 내지 약 10¹³ iu(infectious unit), 원하게는 약 10⁷ 내지 약 10¹² iu 및 바람직하게는 약 10⁸ 내지 약 10¹¹ iu로 다양하다. MVA 입자에 대한 적절한 투여량은 약 10⁴ 내지 약 10¹⁰ pfu(plaque-forming particle), 원하게는 약 10⁵ 내지 약 10⁹ pfu 및 바람직하게는 약 10⁶ 내지 약 10⁸ pfu로 다양하다. 벡터 플라스미드는 10 ㎍ 및 20 ㎎ 사이, 바람직하게는 100 ㎍ 내지 2 ㎎ 사이의 투여량으로 투여될 수 있다.

또한, 상기 투여는 표준 프로토콜, 투여량 및 처방계획(regimen)에 따라 수시간, 수일 및/또는 수주에 걸쳐 단일 투여량, 또는 다른 한편으로는 다중 투여량으로 수행될 수 있다. 아울러, 상기 투여는 환약(bolus) 주사 또는 연속 주입(infusion)에 의해 수행될 수 있다. 예를 들면, 상기 숙주 생물은 전술한 핵산 분자, 벡터, 감염성 입자 또는 조성물 중 적어도 2(예를 들면, 2 내지 10)의 투여로 처리될 수 있다. 바람직하게는, 제1 투여 시리즈를 수일 내지 4주의 다양한 기간 내에 순차적으로 수행한 후, 제2 투여 시리즈(예를 들면, 1회 또는 2회 투여)는 제1 시리즈의 마지막 투여 후 1 내지 6개월 내에 수행된다. 각각의 제2 투여 시리즈 사이의 기간은 수일 내지 4주일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 제1 투여 시리즈는 1주 간격의 순차적인 3회 투여를 포함하고, 제2 시리즈는 상기 제1 시리즈 후 4 내지 6개월 내의 1회 투여를 포함한다. 일반적인 지침으로, 본 발명에 따른 MVA 감염성 입자가 사용될 때, 10⁶ 내지 5×10⁸ pfu 사이를 포함하는 MVA 입자의 투여량으로 피하 경로에 의해 투여되는 것이 바람직하다.

전술한 바와 같이, 본 명세서에서 개시된 핵산 분자, 벡터, 감염성 바이러스 입자, 조성물 또는 그의 조합은 숙주 생물(환자)이 적어도 하나의 유두종바이러스에 노출된 후 및 유두종바이러스-연관 손상부위의 검출/출현 전에 투여되는 것이 바람직하다. 달리 말하면, HPV에 감염되었지만 아직 종양형성으로 진행되지 않은 숙주 생물이 종양형성 및 궁극적으로는 암으로 진행할 기회를 방지 또는 감소시키기 위해 본 발명에 따라 사용하기에 적합한 후보자이다.

"노출"은 감염할 수 있는 적어도 하나의 유두종바이러스와 숙주 생물이 마주치는 것을 나타낸다. 현재, 유두종바이러스 감염을 진단할 수 있는 다수의 진단 방법이 기술분야에서 이용가능하다. 예를 들면, 생물학적 샘플이 유두종바이러스 감염 위험이 있는 숙주 생물로부터 수집되어, 유두종바이러스, 바이러스 핵산(예를 들면, DNA 또는 mRNA) 및/또는 바이러스 항원의 존재에 대해 분석될 수 있다. 이러한 방법으로는 PCR, 인시투(in situ) 교잡, 면역형광, ELISA 및 현재 이용가능한 다수의 진단 테스트를 제한없이 포함한다. 적합한 테스트의 대표적인 예로는 LiPA 시스템(WO99/14377; Labo Biomedical products, Netherlands), Hybrid CaptureⅡ® 테스트(HCII; Digene Corp, USA, 13 HR-HPV에 대한 DNA를 검출함), Linear Array® 테스트(Roche, 37 HPV 유전자형에 대한 DNA 유전자형을 결정함), Thin Prep System(Cytyc Corporate; Marlborough, MA), PreTect-HPV Proofer®(NorChip AS, Norway, HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33 및 HPV-45에 대한 E6/E7 mRNA를 검출함), PCR/RT-PCR 시스템 및 Pretet 등(2004, J. Clin. Virol. 31, 140-147) 또는 Monnier-Benoit 등(2006, J. Clin. Virol. 31, 140-147)에서 개시된 바와 같은 실시간 PCR을 포함한다. 적합한 프라이머는 당업자에게 알려져 있거나, 검출된 유두종바이러스의 뉴클레오티드 서열에 기초하여 용이하게 합성될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "유두종바이러스-연관 손상부위"는 유두종바이러스의 감염에 의해 초래되는 임의의 질병 또는 질환을 나타낸다. 상기 용어는 전-악성뿐만 아니라 악성 손상부위를 포괄한다. 전-악성 손상부위의 대표적인 예로는 CIN, 음부 상피내 종양형성(VIN), 항문 상피내 종양형성(AIN), 음경 상피내 종양형성(PIN) 및 질 상피내 종량형성(VaIN)과 같은 다양한 조직에서 검출될 수 있는 낮은, 중간 또는 높은 등급의 상피내 종양형성을 제한없이 포함한다. 악성 손상부위의 대표적인 예로는 경부 암종, 항문 암종, 질암, 음경암 및 구강암을 제한없이 포함한다. 유두종바이러스-연관 전-악성 및 악성 손상부위는 직접 검사(예를 들면, 아세트산 도입 후의 질경검사(colposcopy))에 의해 시각화되거나, 또는 임상의사에 의해 통상 수행되는 방법(예를 들면, 팝 스미어 스크리닝, 세포성 샘플로부터의 비정상 세포의 검출)으로 진단될 수 있다. 예를 들면, 질경검사에 의해 시각화된 친산성 부위 또는 손상부위의 국소 생검을 수집하여 형태학적 이상(예를 들면, 상피 종양형성, 표식된 핵의 이상, 등)에 대해 조사할 수 있다. 본 발명의 문맥에서, 유두종바이러스-연관 손상부위는 ASCUS(atypical squamous cells of undetermined significance)와 같은 약한(mild) 비정상은 포괄하지 않는다.

바람직한 구현예에 따르면, 본 명세서에서 개시된 핵산 분자, 벡터, 감염성 바이러스 입자, 조성물 또는 그의 조합은 적어도 하나의 유두종바이러스, 특히 하나의 HR-HPV, 특히 바람직하게는 HPV-16, HPV-18, HPV-33 또는 HPV-52 또는 그의 임의의 조합(예를 들면, HPV-16 및 HPV-18 양쪽 모두)에 의해 초래되는 잠복기가 긴 감염을 치료하기 위해 사용된다. 본 발명의 문맥에서, 상기 E2 폴리펩티드는 감염 유두종바이러스 또는 상기 감염 유두종바이러스와 교차 반응(cross-react)하는 유두종바이러스로부터 기원할 수 있다.

다양한 HR-HPV의 E2 폴리펩티드 사이의 아미노산 서열의 보존으로 인하여, 교차 반응성은 특히 HPV-16과 HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-52 및 HPV-58 사이에서 예측될 수 있다. 한 측면에서, 본 발명은 HPV-16, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-52 및 HPV-58 중 적어도 하나에 의해 초래되는 감염을 앓고 있는 환자를 치료하기 위하여, HPV-16으로부터 기원하는 E2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, 벡터, 감염성 바이러스 입자 또는 조성물을 사용한다.

유사하게, 교차 반응성은 특히 HPV-18과 HPV-39, HPV-45, HPV-51, HPV-56, HPV-59, HPV-68, HPV-70 및 HPV-85 사이에서 예측될 수 있다. 다른 측면에서, 본 발명은 HPV-18, HPV-39, HPV-45, HPV-51, HPV-56, HPV-59, HPV-68, HPV-70 및 HPV-85 중 적어도 하나에 의해 초래되는 감염을 앓고 있는 환자를 치료하기 위하여, HPV-18로부터 기원하는 E2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, 벡터, 감염성 바이러스 입자 또는 조성물을 사용한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "잠복기가 긴 유두종바이러스 감염"은 유두종바이러스에 노출된 후 자연적으로 바이러스가 소멸되지 않은 숙주 생물에서의 유두종바이러스 감염 증상이 없는 시기(asymptomatic phase)에 해당한다. 잠복기가 긴 유두종바이러스 감염은, 숙주 세포에서 유두종바이러스 또는 적어도 하나의 그의 요소(예를 들면, 핵산, 항원, 등)가 수개월, 예를 들면 적어도 6개월, 유익하게는 적어도 8개월, 바람직하게는 적어도 10개월, 보다 바람직하게는 적어도 12개월 떨어진 2번의 연속적인 테스트에서 검출되지만, 어떠한 임상 증상(예를 들면, 전-악성 및/또는 악성 유두종바이러스-연관 손상부위)도 관찰되지 않을 때 확립된다. 상기 증상이 없는 시기는 보통의 세포검사(ASCUS와 같은 약한 비정상도 허용될 수 있음)에 의해 특정된다. 예를 들면, 잠복기가 긴 유두종바이러스 감염은 정상 팝 스미어를 나타내지만 대략 6개월 간격의 HCII 테스트에서 양성을 나타내는 환자에서 확립된다.

한 구현예에서, 전술한 핵산 분자, 벡터, 감염성 바이러스 입자, 또는 조성물은 이러한 활성 제제를 사용하지 않은 것과 비교하여 숙주 생물을 치료함에 있어서 면역 반응을 유도 또는 활성화시키기 위해 본 명세서에 개시된 양식에 따라 사용된다.

상기 유도 또는 활성화된 면역 반응은 특이적 및/또는 비특이적일 수 있으며, 체액성(humoral) 및/또는 세포-매개성일 수 있다. 체액성 반응은 적어도 하나의 유두종바이러스 폴리펩티드에 대한 항체의 생성을 포함하는 반면, 세포성 반응은 T-헬퍼 세포 및/또는 CTL 반응 및/또는 사이토카인 생성의 자극을 포함한다. 바람직하게는, 상기 유도 또는 활성화된 면역 반응은 적어도 하나의 감염 유두종바이러스에 대한 항바이러스 반응을 제공하기에 효과적이다.

치료되는 숙주 생물에서 전술한 핵산 분자, 벡터, 감염성 바이러스 입자 또는 조성물이 면역 반응을 유도 또는 활성화시키는 능력은 기술분야에서 표준인 다양한 분석에 의해 시험관내 또는 생체내 중 하나에서 평가될 수 있다(면역 반응의 개시 및 활성을 평가하기 위해 이용가능한 기술의 일반적인 개시의 경우에는, 예를 들면 Coligan et al., 1992 and 1994, Current Protocols in Immunology; ed J Wiley & Sons Inc, National Institute of Health 참조). 세포성 면역의 측정은 CD4+ 및 CD8+ T-세포로부터 유래되는 것들을 포함하는 활성화된 효과기 세포(effector cell)에 의해 분비되는 사이토카인 프로필의 측정(예를 들면, ELIspot에 의한 IL-10 또는 IFNg-생성 세포의 정량), 면역 효과기 세포의 활성 상태 결정(예를 들면, 고전적인 [³H] 티미딘 섭취에 의한 T 세포 증식 분석), 감작된(sensitized) 대상에서의 항원-특이적 T 임파구에 대한 분석(예를 들면, 세포독성 분석에서의 펩티드-특이적 용혈)에 의해 수행될 수 있다. 또한, 세포성 반응을 자극하는 능력은, 예를 들면 ELISPOT에 의해 신제닉(syngenic) 마우스(예를 들면, H₂D^b) 또는 트랜스제닉(transgenic) 마우스(예를 들면, HLA A2 및 HLA B7)에서 평가되거나, T 세포-매개성 면역을 분석하기 위한 테트라머-기반 분석 기술 또는 다른 표준 기술에 의해 평가될 수 있다. 체액성 반응은 항체 결합 및/또는 경쟁 분석에 의해 결정될 수 있다(예를 들면, Harlow, 1989, Antibodies, Cold Spring Harbor Press). 예를 들면, 면역학적 도구는 예컨대 치료되는 숙주 생물에서 항-E2 항체를 검출하기 위한 ELISA를 개발할 수 있다.

다른 구현예에서, 전술한 핵산 분자, 벡터, 감염성 바이러스 입자, 또는 조성물은 이러한 활성 제제를 사용하지 않은 것과 비교하여 감염 유두종바이러스 중 적어도 하나에 대한 항바이러스 반응을 제공하기 위해 본 명세서에 개시된 양식에 따라 사용된다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "항바이러스 반응"은 치료되는 생물에서 보통 유두종바이러스 감염과 연관되는 증상이 감소 또는 제거되는 것을 나타낸다. 예를 들면, 항바이러스 반응은 바이러스 감염을 조절하거나, 감염 유두종바이러스 중 적어도 하나를 감소 또는 없애거나, 및/또는 감염된 세포 또는 유두종바이러스 유전자 서열(특히, 잠재적으로 암유전자인 E6 및 E7 유전자)이 발현되는 것들을 감소 또는 없애기 위한 전술한 활성 제제(들)의 능력에 의해 규명될 수 있다. 이는 사용되기 전과 비교하여 치료되는 숙주 생물로부터 수집된 생물학적 샘플에서 유두종바이러스 감염을 나타내는 마커, 예를 들면 유두종바이러스, 바이러스 핵산 및/또는 바이러스 항원의 검출가능한 레벨이 현저하게 감소 또는 제거되는 것에 의해 평가될 수 있다. 감소 또는 제거는 본 발명에 따른 사용을 중단한 후의 시점에서 측정된 이러한 마커(들)의 레벨과, 치료되지 않은 감염을 나타내는 이러한 사용 이전에 측정된 동일한 마커(들)의 레벨을 비교함으로써 나타내어 진다. 바람직한 구현예에서, 상기 항바이러스 반응은 본 발명에 따른 사용을 중단한 후 수개월 동안, 검출가능한 유두종바이러스, 바이러스 핵산 및/또는 항원이 치료되는 숙주 생물로부터 수집된 생물학적 샘플에서 측정되지 않는 것이다.

항바이러스 반응은 또한 유두종바이러스에 감염된 생물에서 전형적으로 생성되는 손상부위의 발생, 크기 및/또는 정도(severity)를 현저하게 감소시키는 전술한 활성 제제(들)의 능력에 의해 규명될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "감소시킨다"는 것은 본 명세서에서 정의된 바와 같은 유두종바이러스-연관 손상부위의 발생, 크기 및/또는 정도가 생성되는 것을 방지, 지연, 방해, 늦춤, 지체 및/또는 연기하는 것을 의미한다. 전술한 활성 제제가 유두종바이러스-연관 손상부위의 발생, 크기 및/또는 정도를 감소시키는 능력은 치료되는 숙주 생물을 정기적으로 추적조사함으로써 평가될 수 있다. 바람직하게는, 상기 감소는 치료되는 숙주 생물이 본 발명에 따른 사용을 완료한 후 적어도 1년, 유익하게는 적어도 2년, 바람직하게는 적어도 3년 및 보다 바람직하게는 적어도 5년 동안 어떠한 유두종바이러스-연관 손상부위(예를 들면, 조직학적으로 CIN 손상부위에 의해 확인됨)도 생성되지 않는 것이다. 보다 바람직하게는, 본 발명에 따라 사용하면 치료되는 숙주 생물에서 제거 절차(예를 들면, 콘 생검)를 할 필요성이 지연 또는 제거되도록 한다.

일반적으로 나타낸 바와 같이, 숙주 생물에서 활성 제제를 마지막으로 투여한 것과 항바이러스 반응이 검출될 때 사이의 기간은 유두종바이러스 감염 이력, 사용하는 양식 및/또는 치료되는 숙주 생물에 따라 변할 수 있다. 바람직하게는, 대개 3개월 내지 수개월, 특히 바람직하게는 적어도 3개월, 유익하게는 적어도 4개월, 원하게는 적어도 5개월, 바람직하게는 적어도 6개월, 보다 바람직하게는 적어도 1년이다. 예를 들면, 항바이러스 반응은, 예컨대 Digen HCII에 의한 경부 샘플에서, HPV DNA에 대해 치료되기 전에는 양성으로 검출되었던 숙주 생물이 전술한 활성 제제를 마지막으로 투여한 후 적어도 6개월 동안 동일한 유두종바이러스에 대해 음성으로 검출될 때 규명된다.

본 발명은 또한 숙주 생물에게 치료학적 유효량의 전술한 핵산 분자, 벡터, 감염성 바이러스 입자 또는 조성물을 투여하여 면역 반응을 유도 또는 활성화 또는 강화하는 단계를 포함하는 숙주 생물에서 적어도 하나의 감염 유두종바이러스에 대한 면역반응을 유도 또는 활성화 또는 강화시키는 방법에 관한 것으로서, 상기 핵산 분자, 벡터, 감염성 바이러스 입자 또는 조성물은 상기 유두종바이러스 노출 후 및 유두종바이러스-연관 손상부위의 검출/출현 전에 투여된다. 바람직하게는, 상기 유도 또는 활성화된 면역 반응은 상기에서 정의된 바와 같이 감염 유두종바이러스 중 적어도 하나에 대한 항바이러스 반응을 제공한다.

한 구현예에서, 본 발명에 따른 방법 또는 용도는 하나 이상의 종래 치료 양식과 함께 수행될 수 있다. 다중 치료 접근법은 숙주 생물에게 보다 넓게 기초한 중재(intervention)를 제공한다. 이들 투여는 본 발명에서 사용되는 핵산 분자, 벡터, 감염성 바이러스 입자 또는 조성물을 투여하기 전에, 동시에, 또는 이후에 수행될 수 있다.

다른 구현예에서, 본 발명에 따른 방법 또는 용도는 하나 이상의 프라이머(들)와 하나 이상의 부스터(들)를 순차적으로 투여하는 것을 포함하는 프라임 부스트 치료 양식에 따라 수행될 수 있다. 전형적으로, 상기 프라이머 및 부스터는 적어도 면역원성 도메인을 공통으로 포함 또는 코딩하는 상이한 비히클을 사용한다. 상기 프라이머를 먼저 숙주 생물에 투여하고, 하루 내지 12개월의 다양한 기간 후에 부스터를 동일한 숙주 생물에 투여한다. 본 발명에 따른 방법 또는 용도는 프라이머를 1회 내지 10회 순차적으로 투여한 후 부스터를 1회 내지 10회 순차적으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머 및 부스터는, 예를 들면 MVA 벡터에 대해서는 피하 주사, DNA 플라스미드 및 아데노바이러스 벡터에 대해서는 근육내 주사와 같이, 동일한 투여 경로 또는 상이한 투여 경로에 의해 동일한 부위 또는 다른 부위에 투여될 수 있다.

본 발명의 문맥에서, 전술한 핵산 분자, 벡터, 감염성 바이러스 입자 또는 조성물은 항-유두종바이러스 면역 반응의 프라임 또는 부스트 중 어느 하나, 또는 프라임 및 부스트 양쪽 모두를 수행하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기에서 정의된 바와 같은 아데노바이러스 벡터 또는 입자는 프라이머로 사용될 수 있고, 상기에서 정의된 바와 같은 MVA 벡터 또는 입자는 부스터로 사용될 수 있으며, 그 반대도 마찬가지이다. 또한, 전술한 핵산 분자, 벡터, 감염성 바이러스 입자 또는 조성물을 본 발명의 조성물과 항원성 도메인을 공통으로 코딩 또는 포함하는 기술분야의 임의의 물질과 함께 사용할 수도 있다. 이러한 물질의 소스는 넓으며, 펩티드, 단백질(예를 들면, 재조합적으로 제조된 E2 폴리펩티드), 바이러스 벡터, 플라스미드 DNA, 바이러스-유사 입자와 같은 단백질성 입자, 조사된(irradiated) 세포와 같은 세포성 물질 등을 제한없이 포함한다.

본 발명은 예시적인 방식으로 기술되었으며, 사용되는 용어들은 한정보다는 서술을 위한 단어의 특성을 나타내기 위해 사용되었음이 이해되어야 한다. 본 발명의 많은 변형 및 변경이 전술한 내용의 견지에서 수행될 수 있음은 자명하다. 따라서, 첨부되는 청구항의 범위 내에서 본 발명은 본 명세서에서 구체적으로 개시된 것과 상이한 방식으로 수행될 수도 있음이 이해되어야 한다.

상기에서 인용된 모든 특허, 공개문헌 및 데이터베이스 기록들은, 이들 각각의 개별 특허, 공개문헌 또는 기록들이 인용에 의해 포함됨을 나타내는 것과 동일한 정도로, 인용에 의해 그 전체가 본 명세서에 구체적으로 포함된다.

도 1은 막-제공된 결핍성 HPV-16 E2 폴리펩티드를 코딩하는 플라스미드 pTG17408을 개략적으로 나타낸 것을 예시한다.

도 2는 막-제공된 복제-결핍성 HPV-16 E1 폴리펩티드를 코딩하는 플라스미드 pTG17409를 개략적으로 나타낸 것을 예시하며, 그 뉴클레오티드 서열은 HPV-16 E2-코딩 서열과 공통인 59개의 뉴클레오티드 영역이 변질되어 있다.

도 3은 MVATG17408(MVA-E2) 또는 음성 대조군인 MVA-N33으로 주사된 마우스에서 ELISPOT에 의해 검출된 E2-특이적 IFNg Th1 반응을 예시한다.

하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이다.

아래에 개시된 제조 방법들은 Maniatis 등(1989, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY)에 상세히 개시되어 있는 일반적인 유전공학 및 분자 클로닝 기술, 또는 시판되는 키트가 사용될 때는 제조사의 지침에 따라 수행된다. PCR 증폭 기술은 기술분야의 당업자에게 알려져 있다(예를 들면, PCR protocols - A guide to methods and applications, 1990, published by Innis, Gelfand, Sninsky and White, Academic Press 참조). 암피실린 저항성 유전자를 운반하는 재조합 플라스미드는 100 ㎍/㎖의 항생제가 첨가된 아가(agar) 또는 액체 배지에서 E. coli C600(Stratagene), BJ5183(Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166, 557-580) 및 NM522에서 복제된다. 상기 BJ5183 균주는 클로닝이 상동성 재조합에 의해 수행될 때 사용되는 것이 바람직하다(Bubek et al., 1993, Nucleic Acid Res. 21, 3601-3602).

재조합 백시니아 바이러스의 제조는 상기에서 인용된 문헌과 Mackett 등(1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 7415-7419) 및 Mackett 등(1984, J. Virol. 49, 857-864)에 개시되어 있는 기술분야의 통상적인 기술에 따라 수행된다. E. coli의 선별 유전자인 gpt(xanthine guanine phosphoribosyltransferase)는 상기 재조합 백시니아 바이러스 선별을 촉진하기 위해 사용된다.

실시예 1: HPV -16 E2 유전자를 발현하는 재조합 MVA 벡터의 제조

HPV-16 E2 유전자의 클로닝

CaSki 세포(ATCC CRL-1550)로부터 단리된 게놈 DNA로부터 HPV-16 E2를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 클로닝하였다. E2 유전자는 프라이머 OTG16809(서열번호 9) 및 OTG16810(서열번호 10)을 이용하여 증폭하였다. 결과물인 절편을 BamHI 및 EcoRI으로 소화시켰고, 동일한 효소로 제한된(restricted) pGEX2T(Amersham Biosciences) 내로 삽입시켜 pTG17239를 제조하였다. 클로닝된 E2 유전자를 시퀀싱한 결과, HPV-16 E2 원형(prototype) 서열(GenBank NC-01526에 개시됨)에 비해 5개의 돌연변이가 보였다. 2개의 돌연변이는 사일런트하였고, 3개의 비-사일런트 돌연변이(T210I, S219P, K310T)는 QuikChange Site Directed Mutagenesis 키트(Stratagene)를 이용해 수정하여 pTG17268을 제조하였다.

HPV -16 E2 폴리펩티드의 변형

E2*로 표시된 HPV-16 E2 변이체(E39A 및 I73A)를 생성하기 위하여, pTG17268 내에 포함된 E2 뉴클레오티드 서열을 위치 특이적 돌연변이에 의해 변형시켰다. 보다 구체적으로, 상기 E2의 복제 기능은 39번째 부위의 Glu 잔기를 Ala로 치환시킴으로써 없앴고, 트랜스활성(transactivation) 기능은 73번째 부위의 Ile 잔기를 Ala로 치환시킴으로써 없앴다. 결과물인 플라스미드 pTG17318은 HPV-16 E2*를 코딩하는 변형된 서열을 포함한다.

발현 숙주 세포 내의 HPV-16 E2*를 세포막 표면에 직접 제공하기 위하여, HPV-16 E2*는 그 N-말단에 공수병 바이러스 분리물의 당단백질(GenBank ay009097)로부터 유래된 펩티드 신호를 융합시키고, 그 C-말단에 막-고정 서열을 융합시킴으로써 추가로 변형시켰다. SS-E2*-TMR로 표시된 상기 막-제공된 E2 결핍성 변이체 를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(서열번호 8)을 다음의 프라이머를 이용한 3중 PCR에 의해 재조립하였다: OTG17500(서열번호 11), OTG17501(서열번호 12), OTG17502(서열번호 13), OTG17503(서열번호 14), OTG17504(서열번호 15) 및 OTG17505(서열번호 16). 재조립된 서열을 pBS-유래의 벡터(Stratagene) 내로 삽입하여 pTG17360을 제조한 후, pH5R 프로모터의 하류에 백시니아 전달 플라스미드 내로 클로닝하여(Rosel et al., 1986, J Virol. 60, 436-449) pTG17408을 제조하였다(도 1).

상기 전달 플라스미드(transfer plasmid)는 MVA 게놈의 결실부위 Ⅲ 내의 상동성 재조합에 의해 전달되는 뉴클레오티드 서열을 삽입할 수 있도록 디자인된다. 이는 플라스미드 pTG1E(Braun et al., 2000, Gene Ther. 7, 1447-1457)로부터 기원하며, 그 내로 MVA 결실부위 Ⅲ을 둘러싸는 인접 서열(BRG3 및 BRD3)을 클로닝하였고, 상기 서열은 MVATGN33.1 DNA로부터 PCR에 의해 얻었다(Sutter and Moss, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10847-10851). 상기 전달 플라스미드는 또한 얼리 레이트 백시니아 바이러스 합성 프로모터 p11K7.5(로잔 대학의 R. Wittek에 의해 호의적으로 제공됨)의 조절 하에 Aequorea victoria의 강화된 녹색 형광 단백질(eGFP 유전자, pEGP-C1으로부터 단리됨, Clontech) 및 Escherichia coli의 잔틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 유전자(gpt 유전자) 사이의 융합을 함유한다. 잔틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제의 합성은 GPT⁺ 재조합 MVA가 마이코페놀산, 잔틴 및 히폭산틴을 함유하는 선택 배지에서 플라크를 형성할 수 있게 하 며(Falkner et al., 1988, J. Virol. 62, 1849-1854), eGFP는 재조합 MVA 플라크를 시각화한다. 상기 선택 마커인 eGPP - GPT는 2개의 상동성 서열 사이에 동일한 방향으로 놓여 있다. 상기 클론의 선택이 달성되면, 상기 선택 마커는 선택 없이 수차례 계대하여 eGPP-GPT 재조합 MVA를 성장하도록 함으로써 쉽게 제거된다.

HPV -16 SS - E2 *- TMR 유전자를 발현하는 재조합 MVA 의 제조

MVATG17408 바이러스의 제조는 MVATGN33.1로 감염되고(0.1 pfu/세포의 MOI에서), pTG17408로 전달감염된(표준 칼슘 포스페이트 DNA 침전에 따라) 원형 닭 배아 섬유아세포(CEF)에서 상동성 재조합에 의해 수행하였다. 바이러스의 선택은 마이코페놀산, 잔틴 및 히폭산틴을 함유하는 선택 배지의 존재 하에 3라운드의 플라크 정제에 의해 수행하였다. 전술한 바와 같이, 상기 선택 마커는 이후 비-선택 배지에서 계대함으로써 제거되었다. 양친 MVA에 의한 오염이 없음을 PCR에 의해 확인하였다.

E2 발현의 분석은 웨스턴 블롯에 의해 수행하였다. MVATG17408로 MOI 0.2에서 CEF를 감염시켰고, 24시간 후 세포를 수확하였다. 시판되는 단일클론 항-E2 항체 TVG271(Abcam)을 이용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. E2*-TMR의 이론적인 분자량은 48.9 kDa였지만, 55 kDa의 명백한(apparent) 분자량을 갖는 단백질의 발현이 검출되었다. 엔도글리코시다제 F로 세포 추출물을 처리한 후 상기 재조합 단백질의 크기 감소가 관찰되었는데, 이는 E2*-TMR이 N-글리코실화에 의해 변형되었음을 제시한다.

실시예 2: HPV -16 E1 유전자를 발현하는 재조합 MVA 의 제조

HPV-16 E1 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 CsSki 세포 DNA(ATCC CRL-1550)로부터 클로닝하였다. 보다 구체적으로, 상기 E1 유전자는 E1a(nt 1 내지 1,102) 및 E1b(nt 1001 내지 1,950)의 두 부분으로 증폭하였다. 프라이머 OTG16811(서열번호 17) 및 OTG16814(서열번호 18)를 사용하여 E1a 절편을 증폭하였으며, 상기 절편은 BamHI 및 EcoRI으로 소화시켰고, 동일한 효소에 의해 제한된 pGEX2T 내로 삽입하여 pTG17240을 제조하였다. E1b 절편은 OTG16813(서열번호 19) 및 OTG16812(서열번호 20)를 사용하여 생성하였으며, pGEX2T 내로 삽입하기 이전에 BamHI 및 EcoRI으로 소화시켰고, 그 결과 pTG17241을 제조하였다. 시퀀싱 결과 HPV-16 E1 원형 서열(GenBank NC-01526에 개시됨)과 비교하여 4개의 돌연변이가 보였다. 한 개의 돌연변이는 사일런트하였고, E1a에 존재하는 3개의 비-사일런트 돌연변이(K130Q, N185T 및 T220S)는 부위 특이적 돌연변이로 수정하였다. 이후, 수정된 E1a 절편을 BsrGI 및 EcoRI으로 소화된 pTG17241 내로 클로닝함으로써 완전한 E1 유전자를 재조립하였다. 결과물인 플라스미드는 pTG17289로 명명하였다.

상기 HPV-16 게놈에서, E1 유전자의 마지막 59개 뉴클레오티드는 E2 유전자의 처음 59개 뉴클레오티드와 동일하다. 상기 상동 서열의 존재는 상동성 재조합 사건과, 이에 따른 E1 및 E2-코딩 MVA 벡터 제조 단계 동안의 불안정성을 생성할 수 있다. 따라서, E1-코딩 서열의 상기 영역은 E2-코딩 서열과의 서열 상동성을 떨어뜨리기 위하여 코돈 이용성이 변질되도록 변형하였다. 상기 변질된 서열은 변질된 프라이머 OTG17408(서열번호 21) 및 OTG17409(서열번호 22)를 이용하여 E1 유 전자의 3' 말단을 증폭함으로써 얻었다. 상기 증폭된 절편은 NsiI 및 BglII로 소화시켰고, 동일한 효소로 제한된 pTG17289 내로 삽입시켜 pTG17340을 제조하였다.

상기 HPV-16 변질된 E1 서열은 또한 코딩된 E1 폴리펩티드의 복제 기능을 없애기 위하여, HPV-16 E1의 482번째 부위의 Gly 잔기를 Asp 잔기로 치환시킴으로써(G482D; 본 명세서에서 E1*로 나타냄), 위치 특이적 돌연변이에 의해 돌연변이시켜 pTG17373을 제조하였다.

상기 HPV-16 E1deg* 서열은 또한 공수병 바이러스 단리물(GenBank n° M38452)의 당단백질로부터 유래된 펩티드 신호 및 막-고정 서열로 융합시킴으로써 세포막 표면에 코딩된 폴리펩티드를 직접 발현하도록 변형시켰다. 상기 SS-E1deg*-TMR 서열은 하기 OTG17560(서열번호 23), OTG17561(서열번호 24), OTG17562(서열번호 25), OTG17563(서열번호 26), OTG17564(서열번호 27) 및 OTG17565(서열번호 28) 프라이머들을 이용한 3중 PCR에 의해 재구성하였다. 결과물인 서열(서열번호 7)을 pBS-유래의 벡터(Stratagene) 내로 삽입하여 pTG17404를 제조하였다. 이후, 상기 SS-E1deg*-TMR 서열을 p7.5K 프로모터(Cochran et al, 1985, J. Virol. 54: 30-37)의 하류에 실시예 1에 개시된 것과 같은 전달 플라스미드 내로 클로닝하여 pTG17409를 제조하였다(도 2).

MVATG17409 바이러스의 생성은 실시예 1에 개시된 것과 같은 상동성 재조합에 의해 CEF 내에서 수행하였다.

실시예 3: HPV -16 E1 및 E2 유전자를 발현하는 재조합 MVA 의 제조

p7.5K 프로모터에 의해 조절되는 상기 SS-E1deg*-TMR 서열을 pTG17409로부터 단리하고, pTG17408 내로 삽입하여 pTG17410을 제조하였다.

MVATG17410 바이러스의 생성은 실시예 1에 개시된 바와 같은 상동성 재조합에 의해 CEF 내에서 수행하였다.

실시예 4: HPV -16 E1 , E2 , E6 및 E7 유전자를 발현하는 재조합 MVA 의 제조

서열번호 5로 기재되는 비-암유전자 및 막-addressed E7 폴리펩티드를 코딩하도록 하기 위하여, WO99/03885에 개시되어 있는 바와 같이 상기 HPV-17 E7 유전자를 단리 및 변형시켰다. 비-암유전자 돌연변이는 아미노산 잔기 21-26(DLYCYE)을 결실시킴으로써 수행하였고, 막 addressing은 공수병 바이러스 당단백질의 펩티드 신호 및 막-고정 서열을 융합시킴으로써 수행하였다. 결과물인 서열을 얼리-레이트 pH5R 프로모터의 조절 하에 클로닝하였다. 이후, 발현 카세트를 pTG17410 내에 도입하여 pTG17482를 생성하였다.

서열번호 4로 기재되는 비-암유전자 및 막-addressed E6 폴리펩티드를 코딩하도록 하기 위하여, WO99/03885에 개시되어 있는 바와 같이 상기 HPV-17 E7 유전자를 단리 및 변형시켰다. 비-암유전자 돌연변이는 아미노산 잔기 118-122(CPEEK)를 결실시킴으로써 수행하였고, 막 addressing은 홍역 바이러스 F 단백질의 펩티드 신호 및 막-고정 서열을 융합시킴으로써 수행하였다. 결과물인 서열을 p7.5K 프로모터의 조절 하에 클로닝하였다. 이후, 발현 카세트를 pTG17482 내에 도입하여 pTG17483을 생성하였다.

MVATG17483의 생성은 실시예 1에 개시된 바와 같이 수행하였다.

실시예 5: 마우스 내에서 HPV -16 E2 -특이적 Th1 반응의 평가

HPV-16 E2 특이적 Th1 반응을 MVATG17408(MVA-E2)로 주사된 마우스에서 ELISPOT에 의해 평가하였다. E2에 대한 반응으로 IFNγ를 생성하는 세포를 분석하기 위하여, SYFPEITHI 및 BIMAS-예측된, 유전자형-특이적, H2^b-제한된 및 인간 HLA-A0201 제한된 MHC 클래스 Ⅰ 펩티드를 선택하였다. 상기 펩티드는 하기 표 1에 나타나 있다.

	부위	서열	이름	점수 SYFPEITHI	점수 BIMAS
E2-HPV16/ H2-D^b	129	MHYTNWTHI	M9I	24	67
	280	NCNSNTTPI	N9I	23	117
	51	FKHINHQVV	F9V	19	<10
	71	QAIELQL시	Q9L	19	30
	348	SQVKIPKTI	S9I	19	39
E2-HPV16/ HLA-A0201	138	YICEEASVTV	Y9V	26	<10
	69	ALQAIELQL	A9L	20	21
	7	RLNVCQDKIL	R10L	20	<10
	93	TLQDVSLEV	T9V	19	285
E2-HPV18/ H2-D^b	166	KEGYNTFYI	K9I	24	<10
	40	IRWENAIFF	I9F	22	<10
	281	LCSGNTTPI	L9I	22	84
	344	TKFLNTVAI	T9I	22	58
	196	NVIDCNDSM	N9M	15	61

C57Bl/6 암컷 마우스는 5.10⁷ pfu의 MVATGN33(음성 대조군) 또는 MVATG17408(MVA-E2)로 3회(0일, 7일 및 14일) 피하에 면역시켰다. 첫 번째 면역 후 21일에 비장을 취하고, 전술한 펩티드를 5 ㎍/㎖의 농도로 사용하여 γ-IFN ELISPOT을 수행하였다. Elispot은 Mabtech AB 마우스 IFNγ ELISPOT^PLUS 키트(Mabtech, France)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 수행하였다. 점들은 Elispot 리더인 Bioreader 4000 Pro-X(BIOSYS-Gmbh; Serlabo France)를 이용하여 계수하였다. 관련없는 펩티드 백그라운드를 삭감한 후 결과를 얻었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 4개의 펩티드는 MVA-N33으로 백신화된 동물에서 측정된 백그라운드 반응과 비교하여 현저한 수의 IFNγ-생성 비장세포를 나타내었다. 이들 펩티드 모두는 HPV-16 특이적이었다. F9V 및 N9I는 마우스 H2-Db 문맥에서 정의되었고, A9L 및 T9V는 인간 HLA-A201 문맥에서 정의되었다. 상기 A9L 펩티드는 특정 CTL 반응을 유도하는 것으로 개시되어 있음이 알려져 있다(Konya et al., 1997, J Gen Virol. 78 2615-20).

결과적으로, ELISPOT에서 나타낸 바와 같이, MVATG17408의 피하 주사는 백신화된 마우스에서 HPV-16에 대한 T 세포 반응을 유도한다.

실시예 6: HPV -18 E1 및 E2 유전자를 발현하는 재조합 MVA 벡터의 제조( MVATG17582 )

HPV-18 E1 및 E2 유전자는 합성 유전자로 재구성하였고, 천연 HPV-18 E1 서열의 3' 말단과 HPV-18 E2 서열의 5' 말단 모두에 존재하는 59개 뉴클레오티드 부위 사이의 상동성이 75% 이하가 되고, HPV-18 E1 및 E2 유전자 산물의 효소 활성을 없애는 돌연변이(E1: G489D, E2: E43A 및 I77A)가 도입되도록 올리고뉴클레오티드를 디자인하였다. 또한, 천연 HPV-16 및 HPV-18 서열에 의해 공유되는 상동성 영역 사이의 상동성 백분율이 75% 이하가 되도록 상기 합성 HPV-18 E1 서열을 디자인하였다. 상기 목적을 위하여, HPV-16 및 HPV-18 E1 및 E2 유전자의 뉴클레오티드 서열을 배열하였고, 6개 이하의 연속하는 뉴클레오티드로 상동성이 감소되도록 올리고뉴클레오티드를 디자인하였다.

HPV-18 degE1* 서열은 50개 올리고뉴클레오티드를 조립함으로써 재구성하였고, pBS 내로 클로닝하여 pTG17473을 제조하였다. 이후, 상기 E1 서열을 프라이머 OTG15315(서열번호 39), OTG17881(서열번호 40), OTG17882(서열번호 41), OTG17883(서열번호 42), OTG17884(서열번호 43) 및 OTG17885(서열번호 44)를 사용한 3중 PCR에 의해 홍역 바이러스 F 단백질로부터 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 융합시켰다(SS-18E1deg*-TMF). 상기 SS18deg E1*-TMF 폴리펩티드를 코딩하는 결과물인 절편(서열번호 38)을 pH5R 프로모터 하류에 MVA 전달 플라스미드 내로 삽입시켜 pTG17552를 제조하였다. 마지막으로, pTG17521로부터 p7.5K-SS-E1deg*-TMF 카세트를 단리하였고, pTG17552 내로 삽입시켜 pTG17582를 제조하였다.

재조합 MVATG17521, MVATG17552 및 MVATG17582의 생성은 전술한 바와 같이 수행하였다. 배양된 세포의 감염 후, 상기 MVA 제조물로부터의 HPV-18 E1 폴리펩티드의 발현은 면역화된 토끼로부터 얻은 혈청을 이용한 웨스턴 블롯에 의해 확인하였다.

실시예 7: HPV -16 및 HPV -18 E1 및 E2 유전자를 발현하는 다가의 ( multivalent ) 재조합 MVA 벡터의 제조( MVATG17583 )

상기 p7.5K-SS-18E1deg*-TMF 카세트 및 pH5R-SS-18E2*-TMR 카세트를 pTG17410(p7.5K-SS-16E1deg*-TMR 카세트 및 pH5R-SS-16E2*-TMR을 함유) 내로 도입하였고, 결과물인 전달 플라스미드를 pTG17583으로 명명하였다. MVATG17583의 생성은 전술한 바와 같이 수행하였다. 배양된 세포를 MVA TG17583으로 감염시킨 후, HPV-16 E1, HPV-16 E2 및 HPV-18 E1 폴리펩티드의 발현을 면역화된 토끼로부터 얻은 혈청을 이용한 웨스턴 블롯으로 확인하였다.

실시예 8: HPV -33 E2 유전자를 발현하는 재조합 MVA 벡터의 제조

Geneart(Regensburg, Germany)에 의해 HPV-33 E2 폴리펩티드를 코딩하는 합성 유전자를 합성하였다. 상기 합성 서열은 (ⅰ) HPV-16, HPV-18 및 HPV-52 유래 E2 유전자와의 상동성 백분율을 75% 이하로 감소시키고(가능하다면, 상동성 영역은 6개 이하의 연속적 뉴클레오티드로 감소된다), 및 (ⅱ) HPV-33 유전자 산물의 효소 기능을 없애는 돌연변이(E39A 및 I73A)를 도입하도록 디자인하였다.

이후, 상기 HPV-33 degE2* 서열을 공수병 바이러스(ERA 균주, GenBank n° M38452) 당단백질의 신호 및 막-고정 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 융합시켰다. 이는 프라이머 OTG18962(서열번호 51), OTG18963(서열번호 52), OTG18964(서열번호 53), OTG18965(서열번호 54), OTG18966(서열번호 55) 및 OTG18967(서열번호 56)을 이용한 3중 PCR로 수행하였다. 결과물인 상기 SS-33degE2*-TMR 폴리펩티드를 코딩하는 절편(서열번호 35)을 p7.5K 프로모터의 조절 하에 MVA 전달 벡터 내로 클로닝하였고, 전술한 바와 같이 바이러스 입자를 생성하였다.

실시예 9: HPV -52 E2 유전자를 발현하는 재조합 MVA 벡터의 제조

Geneart(Regensburg, Germany)에 의해 HPV-52 E2 폴리펩티드를 코딩하는 합성 유전자를 합성하였다. 상기 합성 서열은 (ⅰ) HPV-16, HPV-18 및 HPV-33 유래 E2 유전자와의 상동성 백분율을 75% 이하로 감소시키고(가능하다면, 상동성 영역은 6개 이하의 연속적 뉴클레오티드로 감소된다), 및 (ⅱ) HPV-52 유전자 산물의 효소 기능을 없애는 돌연변이(E39A 및 I73A)를 도입하도록 디자인하였다.

이후, 프라이머 OTG18968(서열번호 57), OTG18969(서열번호 58), OTG18970(서열번호 59), OTG18971(서열번호 60), OTG18972(서열번호 61) 및 OTG18973(서열번호 62)을 이용한 3중 PCR에 의해 합성 HPV-52 E2*deg 서열을 홍역 바이러스 F 단백질의 신호 및 막-고정 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 융합시켰다(SS-52E2*deg-TMF를 제공함).

결과물인 상기 SS-52E2*deg-TMR 폴리펩티드를 코딩하는 절편(서열번호 37)을 p7.5K 프로모터의 하류에 MVA 전달 플라스미드 내로 삽입시켰고, 전술한 바와 같이 바이러스 입자를 생성하였다.

실시예 10: HPV -16, HPV -18, HPV -33 및 HPV -52 E2 유전자를 발현하는 다가의 재조합 MVA 벡터의 제조

상기 막-제공되고 효소적으로 결핍된 HPV-18 E2 폴리펩티드를 코딩하는 pH5R-SS-18E2*-TMR 카세트(pTG17522로부터 단리됨), 상기 막-제공되고 효소적으로 결핍된 HPV-33 E2 폴리펩티드를 코딩하는 p7.5K-SS-33degE2*-TMR 카세트 및 상기 막-제공되고 효소적으로 결핍된 HPV-52 E2 폴리펩티드를 코딩하는 p7.5K-SS-52degE2*-TMF 카세트를 pTG17408(상기 pH5R-SS-16E2*-TMR 카세트를 함유함) 내로 도입하였고, 전술한 바와 같이 바이러스 입자를 생성하였다.

실시예 11: 재조합 MVA 제조물의 치료 효능을 평가하기 위한 동물 모델

CRPV 모델은 면역허용(immunocompetency)에도 불구하고 바이러스-유도성 유두종을 잔류시키고 선택적 숙주 압력 하에 침입성 및 전이성 편평상피세포 암종(squamous cell carcinomas)으로 발전시키는 유일한 실험 모델이다(Brandsma, 1994, Intervirology 37, 189190 및 Brandsma, 1996, Animal models for human papillomavirus vaccine development, p.69-78. In C. Lacey (ed.), Papillomavirus reviews: current research on papillomaviruses. Leeds University Press, Leeds, United Kingdom). E2를 발현하는 MVA는 잠복기가 긴 유두종바이러스에 대한 그 치료 효능을 평가하기 위하여 상기 모델에서 테스트될 수 있다. 그러나, HPV 및 CRPV 항원 사이의 교차-보호가 없기 때문에, 재조합 CRPV-특이적 MVA 제조물은 그 HPV-16 상대(counterpart)를 교체하는 CRPV 항원(기탁번호 NC_001541 하에 GenBank에 개시됨)과 함께 생성하였다. 보다 구체적으로, 하기 재조합 MVA를 제조하였다: pH5R 프로모터의 조절 하에 놓여진 홍역 바이러스 F 당단백질(SR-CRPVE2-TMF)의 신호 및 막-고정 펩티드와 융합된 CRPV E2 폴리펩티드(ref 서열)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 카세트가 결실부위 Ⅲ 내에 삽입된 것을 포함하는 MVATG17535; p7.5K 프로모터의 조절 하에 놓여진 공수병 바이러스 당단백질(SR-CRPVE1-TMR)의 신호 및 막-고정 펩티드와 융합된 CRPV E1 폴리펩티드(ref 서열)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 카세트가 결실부위 Ⅲ 내에 삽입된 것을 포함하는 MVATG17534; 및 상기 CRPV E2(pH5R-SR-CRPVE2-TMF) 및 CRPV E1(p7.5K-SR-CRPVE1-TMR) 발현 카세트가 결실부위 Ⅲ 내에 삽입된 것을 포함하는 MVATG17562.

뉴질랜드 화이트 암컷 토끼를 Helios 유전자총 시스템(Biorad)으로 입자-매개성 DNA 전달을 이용하여 1일에 CRPV DNA로 접종하였다. 1.6 ㎛ 금 입자를 제조사의 지침대로 바이러스 DNA에 코팅시키고, 상기 토끼 등의 3군데 위치에는 위치당 0.1 ㎍을, 다른 3군데 위치에는 0.5 ㎍을 운반하였다. 2일, 9일 및 16일에, 후보 CRPV 재조합 MVA를 토끼의 등에 피내(intradermal) 경로로 주사하였다. 8-12주 동안 매주 혹의 생성을 관찰하였다.

실험이 끝날 때, 토기를 히ㅡ생시키고, CRPV DNA로 주사되고 유두종이 제공되지 않은 상피 부위를 잘라내고 동결시켰다. DNA를 추출하고, PCR 분석에 의해 CRPV DNA의 존재를 분석하여, MVA 백신화가 바이러스의 제거를 유도하였는지 여부를 결정하였다.

<110> TRANSGENE S.A. <120> Papillomavirus E2 polypeptide used for vaccination <130> TG182 EXT <150> EP07360004.1 <151> 2007-01-30 <150> EP07360018.1 <151> 2007-05-15 <160> 62 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 365 <212> PRT <213> Human papillomavirus type 16 <400> 1 Met Glu Thr Leu Cys Gln Arg Leu Asn Val Cys Gln Asp Lys Ile Leu 1 5 10 15 Thr His Tyr Glu Asn Asp Ser Thr Asp Leu Arg Asp His Ile Asp Tyr 20 25 30 Trp Lys His Met Arg Leu Glu Cys Ala Ile Tyr Tyr Lys Ala Arg Glu 35 40 45 Met Gly Phe Lys His Ile Asn His Gln Val Val Pro Thr Leu Ala Val 50 55 60 Ser Lys Asn Lys Ala Leu Gln Ala Ile Glu Leu Gln Leu Thr Leu Glu 65 70 75 80 Thr Ile Tyr Asn Ser Gln Tyr Ser Asn Glu Lys Trp Thr Leu Gln Asp 85 90 95 Val Ser Leu Glu Val Tyr Leu Thr Ala Pro Thr Gly Cys Ile Lys Lys 100 105 110 His Gly Tyr Thr Val Glu Val Gln Phe Asp Gly Asp Ile Cys Asn Thr 115 120 125 Met His Tyr Thr Asn Trp Thr His Ile Tyr Ile Cys Glu Glu Ala Ser 130 135 140 Val Thr Val Val Glu Gly Gln Val Asp Tyr Tyr Gly Leu Tyr Tyr Val 145 150 155 160 His Glu Gly Ile Arg Thr Tyr Phe Val Gln Phe Lys Asp Asp Ala Glu 165 170 175 Lys Tyr Ser Lys Asn Lys Val Trp Glu Val His Ala Gly Gly Gln Val 180 185 190 Ile Leu Cys Pro Thr Ser Val Phe Ser Ser Asn Glu Val Ser Ser Pro 195 200 205 Glu Ile Ile Arg Gln His Leu Ala Asn His Pro Ala Ala Thr His Thr 210 215 220 Lys Ala Val Ala Leu Gly Thr Glu Glu Thr Gln Thr Thr Ile Gln Arg 225 230 235 240 Pro Arg Ser Glu Pro Asp Thr Gly Asn Pro Cys His Thr Thr Lys Leu 245 250 255 Leu His Arg Asp Ser Val Asp Ser Ala Pro Ile Leu Thr Ala Phe Asn 260 265 270 Ser Ser His Lys Gly Arg Ile Asn Cys Asn Ser Asn Thr Thr Pro Ile 275 280 285 Val His Leu Lys Gly Asp Ala Asn Thr Leu Lys Cys Leu Arg Tyr Arg 290 295 300 Phe Lys Lys His Cys Thr Leu Tyr Thr Ala Val Ser Ser Thr Trp His 305 310 315 320 Trp Thr Gly His Asn Val Lys His Lys Ser Ala Ile Val Thr Leu Thr 325 330 335 Tyr Asp Ser Glu Trp Gln Arg Asp Gln Phe Leu Ser Gln Val Lys Ile 340 345 350 Pro Lys Thr Ile Thr Val Ser Thr Gly Phe Met Ser Ile 355 360 365 <210> 2 <211> 453 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> membrane presented and defective HPV-16 E2 variant <400> 2 Met Val Pro Gln Ala Leu Leu Leu Val Pro Leu Leu Gly Phe Ser Leu 1 5 10 15 Cys Phe Gly Lys Phe Pro Ile Glu Thr Leu Cys Gln Arg Leu Asn Val 20 25 30 Cys Gln Asp Lys Ile Leu Thr His Tyr Glu Asn Asp Ser Thr Asp Leu 35 40 45 Arg Asp His Ile Asp Tyr Trp Lys His Met Arg Leu Ala Cys Ala Ile 50 55 60 Tyr Tyr Lys Ala Arg Glu Met Gly Phe Lys His Ile Asn His Gln Val 65 70 75 80 Val Pro Thr Leu Ala Val Ser Lys Asn Lys Ala Leu Gln Ala Ala Glu 85 90 95 Leu Gln Leu Thr Leu Glu Thr Ile Tyr Asn Ser Gln Tyr Ser Asn Glu 100 105 110 Lys Trp Thr Leu Gln Asp Val Ser Leu Glu Val Tyr Leu Thr Ala Pro 115 120 125 Thr Gly Cys Ile Lys Lys His Gly Tyr Thr Val Glu Val Gln Phe Asp 130 135 140 Gly Asp Ile Cys Asn Thr Met His Tyr Thr Asn Trp Thr His Ile Tyr 145 150 155 160 Ile Cys Glu Glu Ala Ser Val Thr Val Val Glu Gly Gln Val Asp Tyr 165 170 175 Tyr Gly Leu Tyr Tyr Val His Glu Gly Ile Arg Thr Tyr Phe Val Gln 180 185 190 Phe Lys Asp Asp Ala Glu Lys Tyr Ser Lys Asn Lys Val Trp Glu Val 195 200 205 His Ala Gly Gly Gln Val Ile Leu Cys Pro Thr Ser Val Phe Ser Ser 210 215 220 Asn Glu Val Ser Ser Pro Glu Ile Ile Arg Gln His Leu Ala Asn His 225 230 235 240 Pro Ala Ala Thr His Thr Lys Ala Val Ala Leu Gly Thr Glu Glu Thr 245 250 255 Gln Thr Thr Ile Gln Arg Pro Arg Ser Glu Pro Asp Thr Gly Asn Pro 260 265 270 Cys His Thr Thr Lys Leu Leu His Arg Asp Ser Val Asp Ser Ala Pro 275 280 285 Ile Leu Thr Ala Phe Asn Ser Ser His Lys Gly Arg Ile Asn Cys Asn 290 295 300 Ser Asn Thr Thr Pro Ile Val His Leu Lys Gly Asp Ala Asn Thr Leu 305 310 315 320 Lys Cys Leu Arg Tyr Arg Phe Lys Lys His Cys Thr Leu Tyr Thr Ala 325 330 335 Val Ser Ser Thr Trp His Trp Thr Gly His Asn Val Lys His Lys Ser 340 345 350 Ala Ile Val Thr Leu Thr Tyr Asp Ser Glu Trp Gln Arg Asp Gln Phe 355 360 365 Leu Ser Gln Val Lys Ile Pro Lys Thr Ile Thr Val Ser Thr Gly Phe 370 375 380 Met Ser Ile Tyr Val Leu Leu Ser Ala Gly Thr Leu Ile Ala Leu Met 385 390 395 400 Leu Ile Ile Phe Leu Ile Thr Cys Cys Lys Arg Val Asp Arg Pro Glu 405 410 415 Ser Thr Gln Arg Ser Leu Arg Gly Thr Gly Arg Asn Val Ser Val Thr 420 425 430 Ser Gln Ser Gly Lys Phe Ile Ser Ser Trp Glu Ser His Lys Ser Gly 435 440 445 Gly Glu Thr Arg Leu 450 <210> 3 <211> 737 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> membrane-presented and replication-defective HPV-16 E1 variant <400> 3 Met Val Pro Gln Ala Leu Leu Phe Val Pro Leu Leu Val Phe Pro Leu 1 5 10 15 Cys Phe Gly Lys Phe Pro Ile Ala Asp Pro Ala Gly Thr Asn Gly Glu 20 25 30 Glu Gly Thr Gly Cys Asn Gly Trp Phe Tyr Val Glu Ala Val Val Glu 35 40 45 Lys Lys Thr Gly Asp Ala Ile Ser Asp Asp Glu Asn Glu Asn Asp Ser 50 55 60 Asp Thr Gly Glu Asp Leu Val Asp Phe Ile Val Asn Asp Asn Asp Tyr 65 70 75 80 Leu Thr Gln Ala Glu Thr Glu Thr Ala His Ala Leu Phe Thr Ala Gln 85 90 95 Glu Ala Lys Gln His Arg Asp Ala Val Gln Val Leu Lys Arg Lys Tyr 100 105 110 Leu Gly Ser Pro Leu Ser Asp Ile Ser Gly Cys Val Asp Asn Asn Ile 115 120 125 Ser Pro Arg Leu Lys Ala Ile Cys Ile Glu Lys Gln Ser Arg Ala Ala 130 135 140 Lys Arg Arg Leu Phe Glu Ser Glu Asp Ser Gly Tyr Gly Asn Thr Glu 145 150 155 160 Val Glu Thr Gln Gln Met Leu Gln Val Glu Gly Arg His Glu Thr Glu 165 170 175 Thr Pro Cys Ser Gln Tyr Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Cys Ser Gln 180 185 190 Tyr Ser Ser Gly Ser Gly Gly Glu Gly Val Ser Glu Arg His Thr Ile 195 200 205 Cys Gln Thr Pro Leu Thr Asn Ile Leu Asn Val Leu Lys Thr Ser Asn 210 215 220 Ala Lys Ala Ala Met Leu Ala Lys Phe Lys Glu Leu Tyr Gly Val Ser 225 230 235 240 Phe Ser Glu Leu Val Arg Pro Phe Lys Ser Asn Lys Ser Thr Cys Cys 245 250 255 Asp Trp Cys Ile Ala Ala Phe Gly Leu Thr Pro Ser Ile Ala Asp Ser 260 265 270 Ile Lys Thr Leu Leu Gln Gln Tyr Cys Leu Tyr Leu His Ile Gln Ser 275 280 285 Leu Ala Cys Ser Trp Gly Met Val Val Leu Leu Leu Val Arg Tyr Lys 290 295 300 Cys Gly Lys Asn Arg Glu Thr Ile Glu Lys Leu Leu Ser Lys Leu Leu 305 310 315 320 Cys Val Ser Pro Met Cys Met Met Ile Glu Pro Pro Lys Leu 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Asp 530 535 540 Asp Ala Thr Val Pro Cys Trp Asn Tyr Ile Asp Asp Asn Leu Arg Asn 545 550 555 560 Ala Leu Asp Gly Asn Leu Val Ser Met Asp Val Lys His Arg Pro Leu 565 570 575 Val Gln Leu Lys Cys Pro Pro Leu Leu Ile Thr Ser Asn Ile Asn Ala 580 585 590 Gly Thr Asp Ser Arg Trp Pro Tyr Leu His Asn Arg Leu Val Val Phe 595 600 605 Thr Phe Pro Asn Glu Phe Pro Phe Asp Glu Asn Gly Asn Pro Val Tyr 610 615 620 Glu Leu Asn Asp Lys Asn Trp Lys Ser Phe Phe Ser Arg Thr Trp Ser 625 630 635 640 Arg Leu Ser Leu His Glu Asp Glu Asp Lys Glu Asn Asp Gly Asp Ser 645 650 655 Leu Pro Thr Phe Lys Cys Val Ser Gly Gln Asn Thr Asn Thr Leu Tyr 660 665 670 Val Leu Leu Ser Ala Gly Thr Leu Ile Ala Leu Met Leu Ile Ile Phe 675 680 685 Leu Ile Thr Cys Cys Lys Arg Val Asp Arg Pro Glu Ser Thr Gln Arg 690 695 700 Ser Leu Arg Gly Thr Gly Arg Asn Val Ser Val Thr Ser Gln Ser Gly 705 710 715 720 Lys Phe Ile Ser Ser Trp Glu Ser His Lys Ser Gly Gly Glu Thr Arg 725 730 735 Leu <210> 4 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> membrane-presented and non oncogenic HPV-16 E6 variant <400> 4 Met Gly Leu Lys Val Asn Val Ser Ala Ile Phe Met Ala Val Leu Leu 1 5 10 15 Thr Leu Gln Thr Pro Thr Gly Gln Ile His Trp Gly Met His Gln Lys 20 25 30 Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro Arg Lys Leu Pro 35 40 45 Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu 50 55 60 Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe 65 70 75 80 Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala 85 90 95 Val Cys Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg 100 105 110 His Tyr Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn 115 120 125 Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro 130 135 140 Leu Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly 145 150 155 160 Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg 165 170 175 Arg Glu Thr Gln Leu Gly Leu Ser Ser Thr Ser Ile Val Tyr Ile Leu 180 185 190 Ile Ala Val Cys Leu Gly Gly Leu Ile Gly Ile Pro Ala Leu Ile Cys 195 200 205 Cys Cys Arg Gly Arg Cys Asn Lys Lys Gly Glu Gln Val Gly Met Ser 210 215 220 Arg Pro Gly Leu Lys Pro Asp Leu Thr Gly Thr Ser Lys Ser Tyr Val 225 230 235 240 Arg Ser Leu <210> 5 <211> 185 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> membrane-presented and non oncogenic HPV-16 E7 variant <400> 5 Met Val Pro Gln Ala Leu Leu Phe Val Pro Leu Leu Val Phe Pro Leu 1 5 10 15 Cys Phe Gly Lys Phe Pro Ile Gly Ser Met His Gly Asp Thr Pro Thr 20 25 30 Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr Gln Leu Asn 35 40 45 Asp Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala 50 55 60 Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys 65 70 75 80 Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg 85 90 95 Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile 100 105 110 Cys Ser Gln Lys Pro Arg Ser Tyr Val Leu Leu Ser Ala Gly Ala Leu 115 120 125 Thr Ala Leu Met Leu Ile Ile Phe Leu Met Thr Cys Cys Arg Arg Val 130 135 140 Asn Arg Ser Glu Pro Thr Gln His Asn Leu Arg Gly Thr Gly Arg Glu 145 150 155 160 Val Ser Val Thr Pro Gln Ser Gly Lys Ile Ile Ser Ser Trp Glu Ser 165 170 175 His Lys Ser Gly Gly Glu Thr Arg Leu 180 185 <210> 6 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> portion of 59 nt of HPV-16 E1-encoding sequence degenerated to decrease homology with the overlapping HPV-16 E2-encoding sequence <400> 6 atggtgattc attacctaca ttcaagtgcg tatctggtca gaacacaaat actttgtga 59 <210> 7 <211> 2214 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence encoding a membrane-addressed and defective HPV-16 E1 polypeptide which includes the 59nt degenerated sequence <400> 7 atggtaccgc aagccctgct attcgtacct ttattggtct ttcccctctg tttcggtaag 60 tttcctatag ctgatcctgc aggtaccaat ggggaagagg gtacgggatg taatggatgg 120 ttttatgtag aggctgtagt ggaaaaaaaa acaggggatg ctatatcaga tgacgagaac 180 gaaaatgaca gtgatacagg tgaagatttg gtagatttta tagtaaatga taatgattat 240 ttaacacagg cagaaacaga gacagcacat gcgttgttta ctgcacagga agcaaaacaa 300 catagagatg cagtacaggt tctaaaacga aagtatttgg gtagtccact tagtgatatt 360 agtggatgtg tagacaataa tattagtcct agattaaaag ctatatgtat agaaaaacaa 420 agtagagctg caaaaaggag attatttgaa agcgaagaca gcgggtatgg caatactgaa 480 gtggaaactc agcagatgtt acaggtagaa gggcgccatg agactgaaac accatgtagt 540 cagtatagtg gtggaagtgg gggtggttgc agtcagtaca gtagtggaag tgggggagag 600 ggtgttagtg aaagacacac tatatgccaa acaccactta caaatatttt aaatgtacta 660 aaaactagta atgcaaaggc agcaatgtta gcaaaattta aagagttata cggggtgagt 720 ttttcagaat tagtaagacc atttaaaagt aataaatcaa cgtgttgcga ttggtgtatt 780 gctgcatttg gacttacacc cagtatagct gacagtataa aaacactatt acaacaatat 840 tgtttatatt tacacattca aagtttagca tgttcatggg gaatggttgt gttactatta 900 gtaagatata aatgtggaaa aaatagagaa acaattgaaa aattgctgtc taaactatta 960 tgtgtgtctc caatgtgtat gatgatagag cctccaaaat tgcgtagtac agcagcagca 1020 ttatattggt ataaaacagg tatatcaaat attagtgaag tgtatggaga cacgccagaa 1080 tggatacaaa gacaaacagt attacaacat agttttaatg attgtacatt tgaattatca 1140 cagatggtac aatgggccta cgataatgac atagtagacg atagtgaaat tgcatataaa 1200 tatgcacaat tggcagacac taatagtaat gcaagtgcct ttctaaaaag taattcacag 1260 gcaaaaattg taaaggattg tgcaacaatg tgtagacatt ataaacgagc agaaaaaaaa 1320 caaatgagta tgagtcaatg gataaaatat agatgtgata gggtagatga tggaggtgat 1380 tggaagcaaa ttgttatgtt tttaaggtat caaggtgtag agtttatgtc atttttaact 1440 gcattaaaaa gatttttgca aggcatacct aaaaaaaatt gcatattact atatggtgca 1500 gctaacacag ataaatcatt atttggtatg agtttaatga aatttctgca agggtctgta 1560 atatgttttg taaattctaa aagccatttt tggttacaac cattagcaga tgccaaaata 1620 ggtatgttag atgatgctac agtgccctgt tggaactata tagatgacaa tttaagaaat 1680 gcattggatg gaaatttagt ttctatggat gtaaagcata gaccattggt acaactaaaa 1740 tgccctccat tattaattac atctaacatt aatgctggta cagattctag gtggccttat 1800 ttacataata gattggtggt gtttacattt cctaatgagt ttccatttga cgaaaacgga 1860 aatccagtgt atgagcttaa tgataagaac tggaaatcct ttttctcaag gacgtggtcc 1920 agattaagtt tgcacgagga cgaggacaag gaaaacgatg gtgattcatt acctacattc 1980 aagtgcgtat ctggtcagaa cacaaatact ttgtacgtac tgctatcggc aggcacgttg 2040 atcgcactaa tgcttatcat cttcctaata acctgctgca agcgggttga taggcccgaa 2100 agtacccaaa ggtccttgag aggtaccgga cgcaacgtat cggtaacgtc gcaaagcggc 2160 aagttcatta gcagttggga gtcgcacaaa tcaggtggag agacccgcct gtga 2214 <210> 8 <211> 1362 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nt sequence encoding the membrane-addressed and defective HPV-16 E2 polypeptide <400> 8 atggtaccac aagcgctgtt acttgtccca ctgcttggtt tctctttatg ttttggaaaa 60 ttcccaatag agactctttg ccaacgttta aatgtgtgtc aggacaaaat actaacacat 120 tatgaaaatg atagtacaga cctacgtgac catatagact attggaaaca catgcgccta 180 gcatgtgcta tttattacaa ggccagagaa atgggattta aacatattaa ccaccaggtg 240 gtgccaacgc tggctgtatc aaagaataaa gcattacaag cagctgaact gcaactaacg 300 ttagaaacaa tatataactc acaatatagt aatgaaaagt ggacattaca agacgttagc 360 cttgaagtgt atttaactgc accaacagga tgtataaaaa aacatggata tacagtggaa 420 gtgcagtttg atggagacat atgcaataca atgcattata caaactggac acatatatat 480 atttgtgaag aagcatcagt aactgtggta gagggtcaag ttgactatta tggtttatat 540 tatgttcatg aaggaatacg aacatatttt gtgcagttta aagatgatgc agaaaaatat 600 agtaaaaata aagtatggga agttcatgcg ggtggtcagg taatattatg tcctacatct 660 gtgtttagca gcaacgaagt atcctctcct gaaattatta ggcagcactt ggccaaccac 720 cccgccgcga cccataccaa agccgtcgcc ttgggcaccg aagaaacaca gacgactatc 780 cagcgaccaa gatcagagcc agacaccgga aacccctgcc acaccactaa gttgttgcac 840 agagactcag tggacagtgc tccaatcctc actgcattta acagctcaca caaaggacgg 900 attaactgta atagtaacac tacacccata gtacatttaa aaggtgatgc taatacttta 960 aaatgtttaa gatatagatt taaaaagcat tgtacattgt atactgcagt gtcgtctaca 1020 tggcattgga caggacataa tgtaaaacat aaaagtgcaa ttgttacact tacatatgat 1080 agtgaatggc aacgtgacca atttttgtct caagttaaaa taccaaaaac tattacagtg 1140 tctactggat ttatgtctat atatgttctt ctctctgctg gaactttaat agctttaatg 1200 ttaataatat tcttaataac gtgctgtaaa agggtagacc gtccagagtc aactcagcgc 1260 agccttaggg gtactgggag aaatgtttcc gtgacatcac agagtggaaa atttatctcg 1320 tcttgggaat ctcataagag tggaggcgaa acacgtcttt ga 1362 <210> 9 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sens primer <400> 9 aaacccggat ccatggagac tctttgccaa cgtt 34 <210> 10 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer <400> 10 aaacccgaat tcaagcttag atcttcatat agacataaat ccagtagac 49 <210> 11 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sens primer <400> 11 aaacccggat ccatggtacc acaagcgctg tta 33 <210> 12 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sens primer <400> 12 tctctttatg ttttggaaaa ttcccaatag agactctttg ccaacgttta aat 53 <210> 13 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer <400> 13 atttaaacgt tggcaaagag tctctattgg gaattttcca aaacataaag aga 53 <210> 14 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sens primer <400> 14 cagtgtctac tggatttatg tctatatatg ttcttctctc tgctggaac 49 <210> 15 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer <400> 15 gttccagcag agagaagaac atatatagac ataaatccag tagacactg 49 <210> 16 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sens primer <400> 16 aaacccagat cttcaaagac gtgtttcgcc tccactctta tgag 44 <210> 17 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sens primer <400> 17 aaacccggat ccatggctga tcctgcaggt acca 34 <210> 18 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer <400> 18 aaacccgaat tccattatcg taggcccatt gtac 34 <210> 19 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sens primer <400> 19 aaacccggat ccgagacacg ccagaatgga ta 32 <210> 20 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer <400> 20 aaacccgaat tcaagcttag atcttcataa tgtgttagta ttttgtcctg 50 <210> 21 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer <400> 21 aaacccagat cttcacaaag tatttgtgtt ctgaccagat acgcacttga atgtaggtaa 60 tgaatcacca tcgttttcct tgtcctcg 88 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sens primer <400> 22 gatgctacag tgccctgttg g 21 <210> 23 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sens primer <400> 23 aaacccaagg atccatggta ccgcaagccc tgcta 35 <210> 24 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sens primer <400> 24 ttcccctctg tttcggtaag tttcctatag ctgatcctgc aggtaccaat gg 52 <210> 25 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisens primer <400> 25 ccattggtac ctgcaggatc agctatagga aacttaccga aacagagggg aa 52 <210> 26 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sens primer <400> 26 tatctggtca gaacacaaat actttgtacg tactgctatc ggcaggcacg 50 <210> 27 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer <400> 27 cgtgcctgcc gatagcagta cgtacaaagt atttgtgttc tgaccagata 50 <210> 28 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisens primer <400> 28 aaacccaaag atcttcacag gcgggtctct ccacctgatt tg 42 <210> 29 <211> 453 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-18 membrane-presented and replication-defective E2 polypeptide (SS-18 E2*-TMR) <400> 29 Met Val Pro Gln Ala Leu Leu Phe Val Pro Leu Leu Val Phe Pro Leu 1 5 10 15 Cys Phe Gly Lys Phe Pro Ile Gln Thr Pro Lys Glu Thr Leu Ser Glu 20 25 30 Arg Leu Ser Cys Val Gln Asp Lys Ile Ile Asp His Tyr Glu Asn Asp 35 40 45 Ser Lys Asp Ile Asp Ser Gln Ile Gln Tyr Trp Gln Leu Ile Arg Trp 50 55 60 Ala Asn Ala Ile Phe Phe Ala Ala Arg Glu His Gly Ile Gln Thr Leu 65 70 75 80 Asn His Gln Val Val Pro Ala Tyr Asn Ile Ser Lys Ser Lys Ala His 85 90 95 Lys Ala Ala Glu Leu Gln Met Ala Leu Gln Gly Leu Ala Gln Ser Arg 100 105 110 Tyr Lys Thr Glu Asp Trp Thr Leu Gln Asp Thr Cys Glu Glu Leu Trp 115 120 125 Asn Thr Glu Pro Thr His Cys Phe Lys Lys Gly Gly Gln Thr Val Gln 130 135 140 Val Tyr Phe Asp Gly Asn Lys Asp Asn Cys Met Thr Tyr Val Ala Trp 145 150 155 160 Asp Ser Val Tyr Tyr Met Thr Asp Ala Gly Thr Trp Asp Lys Thr Ala 165 170 175 Thr Cys Val Ser His Arg Gly Leu Tyr Tyr Val Lys Glu Gly Tyr Asn 180 185 190 Thr Phe Tyr 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aaaacaggaa tactgactgt aacctaccat 1080 agcgaaacac aaagaacaaa attcttaaat actgttgcaa ttccagatag tgtacaaata 1140 ttggtgggat acatgacaat gtatgtatta ctgagtgcag gggccctgac tgccttgatg 1200 ttgataattt tcctgatgac atgttgtaga agagtcaatc gatcagaacc tacgcaacac 1260 aatctcagag ggacagggag ggaggtgtca gtcactcccc aaagcgggaa gatcatatct 1320 tcatgggaat cacacaagag tgggggtgag accagactgt ga 1362 <210> 34 <211> 1062 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence encoding a replication-defective HPV-33 E2 polypeptide (degenerated sequence) <400> 34 atggaggaaa tatcagcacg cttgaatgca gtccaagaga aaattctaga tctttacgaa 60 gcagataaaa ctgatttacc atctcaaatt gaacactgga aattgatacg catggcctgc 120 gctttattgt atacagccaa acagatgggc ttttcacatt tatgtcacca agtggtacct 180 tctttgttag catccaaaac caaagcgttt caagtagcgg aactacagat ggcattagag 240 acattaagta aatcacagta tagcacaagc caatggacgt tgcaacagac aagcttagag 300 gtttggcttt gtgaaccacc aaaatgtttt aaaaagcaag gagaaacagt aactgtgcaa 360 tatgacaatg acaaaaaaaa taccatggac tatactaact ggggtgaaat atacattata 420 gaggaagata catgtactat ggttacaggg aaagtagatt atataggtat gtattacata 480 cataactgtg aaaaggtata ctttaaatat tttaaggagg atgctgccaa atactctaaa 540 acacaaatgt gggaagtcca tgtaggtggc caggttattg tttgccctac gtctatatct 600 agcaatcaaa tatccactac tgagactgct gacatacaga cagacaacga taaccgacca 660 ccacaagcag cggccaaacg acgacgacct gcagacacta ctgacaccgc ccagcccctt 720 acaaagctgt tctgtgcaga ccccgccttg gataatagaa cagcacgtac agcaactaac 780 tgcacaaata agcagcggac tgtgtgtagt tctaacgttg caccaatagt gcatttgaaa 840 ggcgaatcaa atagcttaaa gtgtttgaga tacagattaa aaccttataa agagttgtac 900 agttctatgt cttcaacttg gcactggact agtgacaaca aaaatagtaa aaatggcata 960 gtaaccgtga catttgtaac tgaacagcaa caacaaatgt tcttgggtac cgtaaagata 1020 cctcctactg tgcagataag taccggattc atgaccttat aa 1062 <210> 35 <211> 1326 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence encoding a membrane-presented and replication-defective HPV-33 E2 polypeptide (SS-33E2*-TMR) (degenerated sequence) <400> 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aacaggagtc tgggaggtgc acgtgggcgg tcaagtaatc 660 gtgtgtccag catcggtatc aagtaacgag gtttctacta cagaaacagc tgtccaccta 720 tgcaccgaaa cctccaagac ctccgcagtg tccgtgggtg ccaaagacac acacctacaa 780 ccaccacaga agcgacgtcg accagatgtc acagattcca gaaacaccaa gtaccccaac 840 aaccttttgc ggggacaaca atccgttgac agcactacac ggggactcgt aactgccact 900 gagtgcacta ataaaggtcg ggttgcacat acaacttgta ctgctcctat tattcaccta 960 aagggtgacc ccaacagctt gaaatgccta aggtataggg taaaaacaca taaaagttta 1020 tatgttcaaa tttcatctac gtggcattgg acgagtaatg aatgtacaaa taataaacta 1080 ggtattgtaa caataacgta cagtgatgag acacagcgtc aacagttttt aaaaactgtc 1140 aaaatcccaa ataccgtcca agttatacaa ggtgtcatgt cattgggttt atcgagcact 1200 agcatagtct acatcctgat tgcagtgtgt cttggagggt tgatagggat ccccgcttta 1260 atatgttgct gcagggggcg ttgtaacaaa aagggagaac aagttggtat gtcaagacca 1320 ggcctaaagc ctgatcttac gggaacatca aaatcctatg taaggtcgct ctga 1374 <210> 38 <211> 2241 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence encoding a membrane-presented and replication-defective HPV-18 E1 (SS-18E1*-TMF) (degenerated to decrease homology with E1-encoding HPV-16 nucleotide sequence) <400> 38 atgggtctca aggtgaacgt ctctgccata ttcatggcag tactgttaac tctccaaaca 60 cccaccggtc aaatccattg gggcgcagac ccagaaggca cagacggaga aggcacgggt 120 tgcaacggct ggttctacgt acaagctatt gtagacaaga agaccggaga tgtaatttct 180 gacgatgagg acgagaatgc aacagacaca gggtcggata tggttgactt cattgataca 240 caaggaacat tttgtgaaca agccgagcta gaaactgctc aggcattgtt ccatgcgcag 300 gaggtccaca atgatgcaca agtgttgcat gttttaaagc ggaagtttgc aggaggcagc 360 acagaaaaca gtccattagg ggagcggctg gaggtggata cagagttaag cccacggtta 420 caagaaatat ctttaaatag tgggcagaaa aaggctaaga ggcggctgtt tacaatatca 480 gatagtggct acggctgttc tgaggtggaa gcaacacaga ttcaggtaac tacaaatggc 540 gaacatggcg gcaatgtatg cagtggcggc agtacggagg ctatagacaa cggaggcaca 600 gagggcaaca acagcagtgt agacggtaca agcgacaata gcaatataga aaatgtaaat 660 ccacaatgta ccatagcaca attaaaagac ttgttaaaag taaacaataa acaaggagct 720 atgcttgcag tattcaagga cacatatggg ctatcattta cagatttagt tagaaatttc 780 aagagtgaca aaaccacatg tacagactgg gttacagcta tattcggagt aaacccaaca 840 atcgcagaag gatttaagac tctaatacag ccatttatat tgtatgccca tatacaatgt 900 ctagactgta agtggggtgt attaatatta gccctgttgc gttacaagtg cggtaagagt 960 agactaacag ttgctaaagg tttaagtacg ttgttacacg tacctgaaac ttgcatgtta 1020 attcaaccac ctaagttacg aagtagtgtt gctgcactat actggtacag aactggaatt 1080 tctaacataa gcgaggtaat gggtgacaca cctgagtgga ttcagagact tactattata 1140 cagcatggaa tagacgatag caatttcgat ttgtcagaaa tggttcagtg ggcatttgac 1200 aacgagctga cagatgaaag cgatatggca tttgaatacg ccttattagc tgacagcaac 1260 agcaacgcag ctgcattttt aaagagcaat tgccaagcta aatatttaaa agactgtgcc 1320 actatgtgca aacactatag gcgtgcccag aaacgacaga tgaatatgtc acagtggatt 1380 cgatttaggt gttcaaaaat agacgaaggg ggagactgga gaccaatagt gcaattcctg 1440 cgataccaac aaatagaatt cataacattc ttaggagcct tgaaatcatt cttaaaagga 1500 acccccaaga agaactgttt agtattttgt ggaccagcaa atactgacaa gtcatatttc 1560 ggaatgagct ttatacactt tatacaagga gcagttatat cattcgtgaa ctccactagt 1620 cacttctggc tggaaccgtt aacagacact aaggtggcca tgctagacga cgcaacgacc 1680 acgtgctgga catactttga tacctatatg aggaacgcgt tagacggcaa tccaataagt 1740 attgatagaa aacacaaacc tttaatacag cttaagtgtc cgccaatact actaaccaca 1800 aatatacatc cagcaaagga taatagatgg ccatacttag aaagtagaat aacagtattt 1860 gaattcccaa atgcattccc gttcgataaa aatggcaacc ctgtatacga aataaacgac 1920 aaaaattgga agtgtttctt tgaaagaaca tggtcaaggt tagatttaca tgaagaagaa 1980 gaagatgctg atacagaggg taatccattt ggtactttca aattacgagc tggacagaat 2040 cacaggcctc ttggtttatc gagcactagc atagtctaca tcctgattgc agtgtgtctt 2100 ggagggttga tagggatccc cgctttaata tgttgctgca gggggcgttg taacaaaaag 2160 ggagaacaag ttggtatgtc aagaccaggc ctaaagcctg atcttacggg aacatcaaaa 2220 tcctatgtaa ggtcgctctg a 2241 <210> 39 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer oTG15315 for reconstituting sequence encoding HPV-18 SS-6E1*deg-TMF <400> 39 ggggagatct atgggtctca aggtgaacgt ctc 33 <210> 40 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer oTG17881 for reconstituting sequence encoding HPV-18 SS-E1*deg-TMF <400> 40 gtgccttctg ggtctgcgcc ccaatggatt tgaccggtg 39 <210> 41 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer oTG17882 for reconstituting sequence encoding HPV-18 SS-E1*deg-TMF <400> 41 ggtcaaatcc attggggcgc agacccagaa ggcacag 37 <210> 42 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer oTG17883 for reconstituting sequence encoding HPV-18 SS-E1*deg-TMF <400> 42 cagaatcaca ggcctcttgg tttatcgagc actagcatag tc 42 <210> 43 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer oTG17884 for reconstituting sequence encoding HPV-18 SS-E1*deg-TMF <400> 43 gctagtgctc gataaaccaa gaggcctgtg attctgtcc 39 <210> 44 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer oTG17885 for reconstituting sequence encoding HPV-18 SS-E1*deg-TMF <400> 44 gggggcggcc gctcagagcg accttacata gg 32 <210> 45 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer oTG17875 for reconstituting sequence encoding HPV-18 SS-E2*deg-TMR <400> 45 ggggagatct atggttcctc aggctctcct g 31 <210> 46 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer oTG17876 for reconstituting sequence encoding HPV-18 SS-E2*deg-TMR <400> 46 gttttgggaa attccctatt cagacaccga aggaaaccc 39 <210> 47 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer oTG17877 for reconstituting sequence encoding HPV-18 SS-E2*deg-TMR <400> 47 gtttccttcg gtgtctgaat agggaatttc ccaaaacaca atg 43 <210> 48 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer oTG17878 for reconstituting sequence encoding HPV-18 SS-E2*deg-TMR <400> 48 gtgggataca tgacaatgta tgtattactg agtgcaggg 39 <210> 49 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer oTG17879 for reconstituting sequence encoding HPV-18 SS-E2*deg-TMR <400> 49 ctgcactcag taatacatac attgtcatgt atcccacc 38 <210> 50 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer oTG17880 for reconstituting sequence encoding HPV-18 SS-E2*deg-TMR <400> 50 gggggcggcc gctcacagtc tggtctcac 29 <210> 51 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer oTG18962 for reconstituting sequence encoding SS-33E2*-TMR <400> 51 cccaaaggat ccaccatggt accgcaagcc ctgcta 36 <210> 52 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer oTG18963 for reconstituting sequence encoding SS-33E2*-TMR <400> 52 ttcccctctg tttcggtaag tttcctatag aggaaatatc agcacgcttg aa 52 <210> 53 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer oTG18964 for reconstituting sequence encoding SS-33E2*-TMR <400> 53 ttcaagcgtg ctgatatttc ctctatagga aacttaccga aacagagggg aa 52 <210> 54 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer oTG18965 for reconstituting sequence encoding SS-33E2*-TMR <400> 54 gataagtacc ggattcatga ccttatacgt actgctatcg gcaggcacg 49 <210> 55 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer oTG18966 for reconstituting sequence encoding SS-33E2*-TMR <400> 55 cgtgcctgcc gatagcagta cgtataaggt catgaatccg gtacttatc 49 <210> 56 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer oTG18967 for reconstituting sequence encoding SS-33E2*-TMR <400> 56 aaaaccccgc atgcgcggcc gcaagctatc acaggcgggt ctctccacct gatttg 56 <210> 57 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer oTG18968 for reconstituting sequence encoding SS-52E2*-TMF <400> 57 aaacccgaga tctaccatgg gtctcaaggt gaacgtc 37 <210> 58 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer oTG18969 for reconstituting sequence encoding SS-52E2*-TMF <400> 58 cccaccggtc aaatccattg gggcgaatcg ataccggcac ggttaa 46 <210> 59 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer oTG18970 for reconstituting sequence encoding SS-52E2*-TMF <400> 59 ttaaccgtgc cggtatcgat tcgccccaat ggatttgacc ggtggg 46 <210> 60 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer oTG18971 for reconstituting sequence encoding SS-52E2*-TMF <400> 60 gttatacaag gtgtcatgtc attgggttta tcgagcacta gca 43 <210> 61 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer oTG18972 for reconstituting sequence encoding SS-52E2*-TMF <400> 61 tgctagtgct cgataaaccc aatgacatga caccttgtat aac 43 <210> 62 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer oTG18973 for reconstituting sequence encoding SS-52E2*-TMF <400> 62 aagcttgcta gccaccggtg gggccgcggc cgctcagagc gaccttacat agg 53

Claims

유두종바이러스 E1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자 및 유두종바이러스 E2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터로서, 상기 E1-코딩 핵산 분자와 E2-코딩 핵산 분자는 40개 이상의 연속하는 뉴클레오티드 영역에 걸쳐 서로 75% 미만의 동질성 백분율을 보이고, 상기 E1-코딩 핵산 분자는 서열번호 6 또는 서열번호 38로 기재되는 뉴클레오티드 서열로 이루어지고, 상기 E2-코딩 핵산 분자는 서열번호 8 또는 서열번호 33로 기재되는 뉴클레오티드 서열로 이루어진, 벡터.
적어도 2개의 유두종바이러스 E2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터로서, 상기 E2-코딩 핵산 분자들은 40개 이상의 연속하는 뉴클레오티드 영역에 걸쳐 서로 75% 미만의 동질성 백분율을 보이고, 서열번호 8, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 36 및 서열번호 37로 기재되는 뉴클레오티드 서열 중 적어도 두개로 이루어진, 벡터.
청구항 1에 있어서,

상기 E1-코딩 핵산 분자는 서열번호 7로 기재되는 뉴클레오티드 서열로 이루어진, 벡터.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,

상기 E2-코딩 핵산 분자(들)는 HPV-16, HPV-18, HPV-30, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-45, HPV-51, HPV-52, HPV-56, HPV-58, HPV-59, HPV-66, HPV-68, HPV-70 및 HPV-85로 이루어진 군으로부터 선택되는 HR-HPV (High Risk-Human pavillomavirus)로부터 기원하는 E2 폴리펩티드를 코딩하는, 벡터.
청구항 4에 있어서,

상기 E2-코딩 핵산 분자(들)는 HPV-16, HPV-18, HPV-33 또는 HPV-52 또는 그의 임의의 조합으로부터 기원하는 E2 폴리펩티드를 코딩하는, 벡터.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,

상기 핵산 분자는 적어도 복제, 전사 활성화 활성, 또는 복제 및 전사 활성화 활성 모두가 결핍된 E2 폴리펩티드를 코딩하도록 변형되는, 벡터.
청구항 6에 있어서,

상기 E2 폴리펩티드는 HPV-16으로부터 기원하며, 적어도 39번 부위의 Glu 잔기(E39), 73번 부위의 Ile 잔기(I73), 또는 39번 부위의 Glu 잔기(E39) 및 73번 부위의 Ile 잔기(I73) 모두가 해당 39번 및 73번 부위의 Glu 및 Ile 이외의 임의의 아미노산 잔기로 치환되는, 벡터.
청구항 7에 있어서,

상기 39번 부위의 Glu 잔기, 73번 부위의 Ile 잔기, 또는 39번 부위의 Glu 잔기 및 73번 부위의 Ile 잔기 모두가 Ala 잔기로 치환되는, 벡터.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,

상기 핵산 분자는 막-제공된 (membrane-presented) E2 폴리펩티드를 코딩하도록 변형되는, 벡터.
청구항 9에 있어서,

상기 막-제공된 E2 폴리펩티드는 상기 유두종바이러스 E2 폴리펩티드와 분비 및 막-고정 (membrane-anchoring) 서열과의 융합에 의해 변형되는, 벡터.
청구항 10에 있어서,

상기 분비 서열, 막-고정 서열, 또는 분비 서열 및 막-고정 서열 모두는 공수병 당단백질, HIV 바이러스 외피 당단백질 또는 홍역 바이러스 F 단백질로부터 기원하거나, 또는 합성되는, 벡터.
청구항 11에 있어서,

상기 핵산 분자는 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 E2 폴리펩티드를 코딩하는, 벡터.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,

상기 벡터는,

- (ⅰ) HPV-16 E2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 추가로 (ⅱ) HPV-18 E2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터;

- (ⅰ) HPV-16 E2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, (ⅱ) HPV-18 E2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자 및 (ⅲ) HPV-33 E2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터;

- (ⅰ) HPV-16 E2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, (ⅱ) HPV-18 E2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자 및 (ⅲ) HPV-52 E2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터;

- (ⅰ) HPV-16 E2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, (ⅱ) HPV-33 E2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자 및 (ⅲ) HPV-52 E2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터;

- (ⅰ) HPV-16 E2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, (ⅱ) HPV-18 E2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, (ⅲ) HPV-33 E2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자 및 (ⅳ) HPV-52 E2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터;

- (ⅰ) HPV-16 E2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자 및 (ⅱ) HPV-16 E1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터;

- (ⅰ) HPV-16 E2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, (ⅱ) HPV-16 E1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, (ⅲ) HPV-18 E2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자 및 (ⅳ) HPV-18 E1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터;

- (ⅰ) HPV-16 E2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자 및 (ⅱ) HPV-16 E6 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터;

- (ⅰ) HPV-16 E2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자 및 (ⅱ) HPV-16 E7 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터;

- (ⅰ) HPV-16 E2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, (ⅱ) HPV-16 E1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, (ⅲ) HPV-16 E6 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자 및 (ⅳ) HPV-16 E7 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터; 및

- (ⅰ) HPV-16 E1, E2, E6 및 E7 폴리펩티드 및 HPV-18 E1, E2, E6 및 E7 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터

로 이루어진 군으로부터 선택되는 벡터.
청구항 13에 있어서, 상기 벡터는,

a) 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 HPV-16 E2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산;

b) 서열번호 29로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 HPV-18 E2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산;

c) 서열번호 30으로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 HPV-33 E2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산;

d) 서열번호 31로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 HPV-52 E2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 또는

e) 핵산 a) 내지 d)의 임의의 조합을, 포함하는 벡터.
청구항 13에 있어서, 상기 벡터는,

a) 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 HPV-16 E1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산;

b) 서열번호 32로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 HPV-18 E1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산;

c) 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 HPV-16 E6 폴리펩티드를 코딩하는 핵산;

d) 서열번호 5로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 HPV-16 E7 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 또는

e) 핵산 a) 내지 d)의 임의의 조합을, 포함하는 벡터.
청구항 13에 있어서,

a) 서열번호 8로 기재되는 뉴클레오티드 서열로 구성되는 HPV-16 E2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산;

b) 서열번호 33으로 기재되는 뉴클레오티드 서열로 구성되는 HPV-18 E2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산;

c) 서열번호 34 또는 서열번호 35로 기재되는 뉴클레오티드 서열로 구성되는 HPV-33 E2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산;

d) 서열번호 36 또는 서열번호 37로 기재되는 뉴클레오티드 서열로 구성되는 HPV-52 E2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산,

e) 서열번호 7로 기재되는 뉴클레오티드 서열로 구성되는 HPV-16 E1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산;

f) 서열번호 38로 기재되는 뉴클레오티드 서열로 구성되는 HPV-18 E1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산; 또는

g) 핵산 a) 내지 f)의 임의의 조합을, 포함하는 벡터.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 적어도 하나의 유두종바이러스에 의해 초래되는 잠복기가 지속적인 (persistent) 유두종바이러스 감염을 앓고 있는 숙주 생물을 치료하기 위한 벡터.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,

상기 벡터는 카나리폭스, 파울폭스 또는 백시니아 바이러스로부터 생성되는 폭스바이러스 벡터인, 벡터.
청구항 18에 있어서,

상기 백시니아 바이러스는 코펜하겐 균주, 와이어스 균주, NYVAC 또는 변형된 앙카라(MVA) 균주인, 벡터.
청구항 19에 있어서,

상기 바이러스 벡터는 코펜하겐 백시니아 바이러스로부터 유래되고, 상기 핵산 분자는 티미딘 키나제 유전자 내로 삽입되는, 벡터.
청구항 19에 있어서,

상기 바이러스 벡터는 MVA 백시니아 바이러스로부터 유래되고, 상기 핵산 분자는 결실부위 Ⅲ 내로 삽입되는, 벡터.
청구항 19에 있어서,

상기 E2-코딩 핵산 분자는 백시니아 H5R 프로모터의 조절 하에 놓여있고, 상기 E1-코딩 핵산 분자는 p7.5K 프로모터의 조절 하에 놓여있는, 벡터.
청구항 1 또는 청구항 2에 의한 벡터 또는 상기 벡터를 포함하는 감염성 바이러스 입자로 구성되는 조성물.
청구항 23에 있어서,

상기 조성물은 적어도 하나의 HR-HPV (High Risk-HPV)에 의해 초래되는 잠복기가 지속적인 감염을 치료하기 위한 용도로 주사 형태로 제형화되는, 조성물.
청구항 24에 있어서,

상기 주사는 적어도 하나의 HR-HPV (High Risk-HPV)에 의해 초래되는 잠복기가 지속적인 감염을 치료하기 위한 용도로 근육내 또는 피하 투여에 의한 것인, 조성물.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,

적어도 하나의 HR-HPV (High Risk-HPV)에 의해 초래되는 잠복기가 지속적인 감염을 치료하기 위한, 벡터.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,

HPV-16, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-52 및 HPV-58 중 적어도 하나에 의해 초래되는 감염을 앓고 있는 숙주 생물을 치료하기 위한 것으로서, 상기 핵산 분자는 HPV-16으로부터 기원하는 E2 폴리펩티드를 코딩하는, 벡터.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,

HPV-18, HPV-39, HPV-45, HPV-51, HPV-56, HPV-59, HPV-68, HPV-70 및 HPV-85 중 적어도 하나에 의해 초래되는 감염을 앓고 있는 숙주 생물을 치료하기 위한 것으로서, 상기 핵산 분자는 HPV-18로부터 기원하는 E2 폴리펩티드를 코딩하는, 벡터.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,

적어도 하나의 HR-HPV (High Risk-HPV)에 의해 초래되는 잠복기가 지속적인 감염을 치료하기 위하여 수일 내지 4주 기간 내에 순차적으로 수행되는 제1 투여 시리즈와, 제1 시리즈의 마지막 투여 후 1 내지 6개월 내에 수행되는 제2 투여 시리즈를 포함하여 사용되는, 벡터.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,

적어도 하나의 HR-HPV (High Risk-HPV)에 의해 초래되는 잠복기가 지속적인 감염을 치료하기 위하여 제1 투여 시리즈는 1주 간격의 순차적인 3회 투여를 포함하고, 제2 시리즈는 상기 제1 시리즈 후 4 내지 6개월 내의 1회 투여를 포함하여 사용되는, 벡터.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,

적어도 하나의 HR-HPV (High Risk-HPV)에 의해 초래되는 잠복기가 지속적인 감염을 치료하기 위하여 적어도 하나의 감염 유두종바이러스에 대한 항바이러스 반응을 제공하기 위해 사용되는, 벡터.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,

적어도 하나의 HR-HPV (High Risk-HPV)에 의해 초래되는 잠복기가 지속적인 감염을 치료하기 위하여 동물 또는 인간 생물에서 면역 반응을 유도 또는 활성화시키기 위해 사용되는, 벡터.
청구항 23에 있어서,

적어도 하나의 HR-HPV (High Risk-HPV)에 의해 초래되는 잠복기가 지속적인 감염을 치료하기 위한, 조성물.
청구항 23에 있어서,

HPV-16, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-52 및 HPV-58 중 적어도 하나에 의해 초래되는 감염을 앓고 있는 숙주 생물을 치료하기 위한 것으로서, 상기 핵산 분자는 HPV-16으로부터 기원하는 E2 폴리펩티드를 코딩하는, 조성물.
청구항 23에 있어서,

HPV-18, HPV-39, HPV-45, HPV-51, HPV-56, HPV-59, HPV-68, HPV-70 및 HPV-85 중 적어도 하나에 의해 초래되는 감염을 앓고 있는 숙주 생물을 치료하기 위한 것으로서, 상기 핵산 분자는 HPV-18로부터 기원하는 E2 폴리펩티드를 코딩하는, 조성물.
청구항 23에 있어서,

적어도 하나의 HR-HPV (High Risk-HPV)에 의해 초래되는 잠복기가 지속적인 감염을 치료하기 위하여 수일 내지 4주의 변하는 기간 내에 순차적으로 수행되는 제1 투여 시리즈와, 제1 시리즈의 마지막 투여 후 1 내지 6개월 내에 수행되는 제2 투여 시리즈를 포함하여 사용되는, 조성물.
청구항 23에 있어서,

적어도 하나의 HR-HPV (High Risk-HPV)에 의해 초래되는 잠복기가 지속적인 감염을 치료하기 위하여 제1 투여 시리즈는 1주 간격의 순차적인 3회 투여를 포함하고, 제2 시리즈는 상기 제1 시리즈 후 4 내지 6개월 내의 1회 투여를 포함하여 사용되는, 조성물.
청구항 23에 있어서,

적어도 하나의 HR-HPV (High Risk-HPV)에 의해 초래되는 잠복기가 지속적인 감염을 치료하기 위하여 적어도 하나의 감염 유두종바이러스에 대한 항바이러스 반응을 제공하기 위해 사용되는, 조성물.
청구항 23에 있어서,

적어도 하나의 HR-HPV (High Risk-HPV)에 의해 초래되는 잠복기가 지속적인 감염을 치료하기 위하여 동물 또는 인간 생물에서 면역 반응을 유도 또는 활성화시키기 위해 사용되는, 조성물.
적어도 하나의 유두종바이러스에 의해 초래되는 잠복기가 지속적인 유두종바이러스 감염을 앓고 있는 숙주 생물을 치료하기 위한, 청구항 1 또는 청구항 2에 의한 벡터를 포함하는 감염성 바이러스 입자.
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