KR101626526B1

KR101626526B1 - ｈＲｈｅｂ를 유효성분으로 포함하는 허혈성 뇌질환의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101626526B1
Application number: KR1020140149201A
Authority: KR
Inventors: 김상룡; 김기석; 김진; 이향애; 박성걸
Original assignee: 경북대학교 산학협력단; 한국화학연구원
Priority date: 2014-10-30
Filing date: 2014-10-30
Publication date: 2016-06-02
Also published as: WO2016068619A1; KR20160053027A

Abstract

본 발명은 활성 형태의 hRheb(human Ras homolog enriched in brain)(S16H) 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산 분자를 유효성분으로 포함하는 허혈성 뇌질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 hRheb(S16H)는 야생형 hRheb 유전자에 점돌연변이(point mutation)를 도입하여 구성적 활성(constitutively active)을 유도한 것으로, 허혈성 뇌손상을 발생시킨 동물 모델에서 뇌 조직 보호 및 재생 효과가 우수하여, 이는 허혈성 뇌졸중을 비롯한 허혈성 뇌질환의 예방, 개선 및 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

ｈＲｈｅｂ를 유효성분으로 포함하는 허혈성 뇌질환의 예방 또는 치료용 조성물 {Composition comprising hRheb for preventing or treating Ischemic Brain disease}

본 발명은 활성 형태의 hRheb(human Ras homolog enriched in brain)(S16H) 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산 분자를 유효성분으로 포함하는 허혈성 뇌질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

뇌졸중(stroke)은 암이나 심혈관질환과 함께 전체 사망 원인 중에서 세번째를 차지하는 질병으로 신경계를 침범하는 질환 중에서는 빈도가 가장 높으며 점자 그 발생 수가 증가하는 추세이다.

뇌졸중은 일반적으로 뇌혈관에 혈액이 통하지 못하여 생기는 허혈성 뇌졸중과 뇌출혈로 인한 출혈성 뇌졸중의 두 가지 경우로 나뉜다. 그 중 허혈성 뇌졸중의 발생 빈도가 더 높은 편이며 특히, 급성 허혈성 뇌졸중의 경우는 수 시간 내에 사망할 수 있는 위험한 질환이다.

허혈성 뇌졸중은 주요 뇌동맥의 영역에 제한되는 뇌혈류의 일시적이거나 영구적인 감소에 의해 발생된다. 이 질환의 주요한 병리학적 메카니즘은 흥분성 매개인자, 과량의 Ca²⁺ 및 염증을 포함한다. 뇌혈관 폐색 후에 발생하는 허혈-재관류 손상에 산화적 스트레스가 연관되어 있으며, 이러한 재관류성 손상은 다량의 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)의 발생에 의해 유발된다. 자유라디칼은 염증성 매개인자 형성도 유도하는데, 이는 소교세포(microglia)를 활성화시켜, 내피 부착 분자의 상향조절을 통해 성상교세포증(astrogliosis) 및 백혈구 침윤(leukocyte infiltration)을 발생시킨다. 또한, NOS(nitric oxide synthase), COX(cyclooxygenase) 및 XO(xanthine oxidase)와 같은 많은 친염증성 효소가 뇌허혈에서 산화적 손상에 관여한다. iNOS(inducible NOS)는 성상교세포(astrocyte), 소교세포 및 대식세포에서 발견되는데, 이들 세포에 존재하는 iNOS로부터 ROS가 생성된다. 활성화된 iNOS는 다량의 NO(nitric oxide)를 생성하며, 이는 수퍼옥사이드 음이온과 결합하여 강력한 산화력을 갖는 과산화아질산염 음이온(peroxynitrite anion)을 생성시킨다고 알려져있다.

한편, 뇌졸중이 발생한 후 6시간 내에 신경보호제를 투여하게 되면 뇌졸중에 의해 유도되는 저산소증에 의한 신경세포의 사멸을 감소시킬 수 있는 것으로 알려져 있으나, 현재까지 뇌졸중 발생 직후 3시간 내에 t-PA(tissue-type plasminogen activator)를 사용하여 혈류를 회복시키는 방법 이외에, 뇌허혈을 치료하는데 임상적으로 효율적인 신경보호제가 제공되어 있지 않는 상황이다.

이에 본 발명자들은 신규한 허혈성 뇌질환의 치료제를 개발하기 위해 연구를 거듭한 결과, 허혈성 뇌손상을 발생시킨 동물 모델에 hRheb(S16H) 유전자를 도입시킬 경우, 뇌 조직 보호 및 재생 효과가 우수함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 목적은 활성 형태의 hRheb(human Ras homolog enriched in brain)(S16H) 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산 분자를 유효성분으로 포함하는 허혈성 뇌질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 활성 형태의 hRheb(human Ras homolog enriched in brain)(S16H) 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산 분자를 유효성분으로 포함하는 허혈성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 활성 형태의 hRheb(human Ras homolog enriched in brain)(S16H) 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산 분자를 유효성분으로 포함하는 허혈성 뇌질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 hRheb(S16H)는 야생형 hRheb 유전자에 점돌연변이(point mutation)를 도입하여 구성적 활성(constitutively active)을 유도한 것으로, 허혈성 뇌손상을 발생시킨 동물 모델에서 뇌 조직 보호 및 재생 효과가 우수하여, 이는 허혈성 뇌졸중을 비롯한 허혈성 뇌질환의 예방, 개선 및 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 pBL- hRheb의 벡터맵을 나타낸 도이다.
도 2는 랫트에 AAV-GFP(green fluorescent protein)(대조군) 또는 AAV-hRheb(S16H)의 투여 3주 후, 뇌 조직을 분리하고 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole) 및 FLAG-tag를 이용한 염색을 통해 타켓 단백질의 발현을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 랫트에 AAV-hRheb(S16H)의 투여 3주 후 허혈성 뇌손상을 일으키고, 3, 7 및 14일 후 뇌 조직을 분리하여 H&E 염색을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 랫트에 AAV-hRheb(S16H)의 투여 3주 후 허혈성 뇌손상을 일으키고, 3, 7 및 14일 후 뇌 조직을 분리하여 TTC(2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride) 염색을 수행한 결과를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명은 활성 형태의 hRheb(human Ras homolog enriched in brain)(S16H) 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산 분자를 유효성분으로 포함하는 허혈성 뇌질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 약학적 조성물 및 식품 조성물을 포함한다.

본 발명의 hRheb(S16H) [human Ras homolog enriched in brain(S16H, serine to histidine at the 16 position)]는 야생형 hRheb 유전자에 점돌연변이(point mutation)를 도입하여 구성적 활성(constitutively active)을 유도한 것을 의미한다.

본 발명의 hRheb(S16H) 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질 또는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 암호화 되는 단백질, 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다.

상기 "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질 또는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 암호화 되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다.

또한, 본 발명의 hRheb(S16H) 단백질에는 이의 천연형 아미노산 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라 이의 아미노산 서열 변이체가 또한 본 발명의 범위에 포함된다. hRheb(S16H) 단백질의 변이체란 hRheb(S16H) 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 상기 hRheb(S16H) 단백질 또는 이의 변이체는 천연에서 추출하거나 합성 (Merrifleld, J. Amer. chem. Soc. 85:2149-2156, 1963) 또는 DNA 서열을 기본으로 하는 유전자 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다 (Sambrook et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, 2판, 1989).

본 발명의 hRheb(S16H) 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 바람직하게는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어질 수 있으며, 상기 염기서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 핵산 분자는 서열번호 2의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명의 hRheb(S16H) 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 백터에 포함된 형태일 수 있다. 상기 hRheb(S16H) 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터는 인체 또는 동물세포에서 발현되는 선형 DNA, 플라스미드 벡터, 바이러스성 발현벡터를 포함하는 벡터 또는 재조합 레트로바이러스(retrovirus) 벡터, 재조합 아데노 바이러스(adenovirus) 벡터, 재조합 아데노 부속 바이러스(adeno-associated virus, AAV) 벡터, 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus) 벡터 또는 재조합 렌티바이러스(lentivirus) 벡터를 포함하는 재조합 바이러스 벡터인 것이 바람직하고, 재조합 아데노 부속 바이러스(adeno-associated virus, AAV) 벡터인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 따른 hRheb(S16H)는 야생형 hRheb 유전자에 점돌연변이(point mutation)를 도입하여 구성적 활성(constitutively active)을 유도한 것으로, 허혈성 뇌손상을 발생시킨 동물 모델에서 뇌 조직 보호 및 재생 효과가 우수하여, 이는 허혈성 뇌질환의 예방, 개선 및 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

상기 허헐성 뇌질환은 허혈 또는 허혈 후 재관류에 의해 발생되는 뇌질환을 의미하며, 예를 들어, 뇌졸중, 뇌경색, 뇌허혈, 혈전증(thrombosis), 색전증(em-bolism), 일과성 허혈 발작(transient ischemic attack), 소경색(lacune), 두부손상(head trauma), 뇌순환대사장애, 뇌 기능혼수, 외상성 뇌손상 또는 저산소성 뇌손상을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 것을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물을 제형화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글라이콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글라이콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에서 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.

본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물은 1일 0.001 내지 1000 mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 상기 투여량은 개체의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다. 그러나 경구 투여시, 단백질은 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화하는 것이 바람직하며, 예를 들어 주사제 형태로 투여될 수 있다.

본 발명의 활성 형태의 hRheb(S16H) 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산 분자는 허혈성 뇌질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물, 바람직하게는 건강기능식품에 포함될 수 있다.

본 발명에 있어서 건강기능식품이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체내조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미한다.

상기 건강기능식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 건강기능식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 더욱 쉽게 이해할 수 있도록 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. AAV-hRheb(S16H)의 제조

1-1. pBL-hRheb(S16H) 재조합 벡터 제조

pBL 플라스미드(3' WPRE 포함)에 서열번호 2의 hRheb(S16H) [human Ras homolog enriched in brain(S16H, serine to histidine at the 16 position)] 유전자를 도입하여, hRheb(S16H) 유전자가 도입된 pBL-hRheb(S16H) 재조합 벡터를 제조하였다. 그 벡터맵을 도 1에 나타내었다.

1-2. AAV-hRheb(S16H)의 제조

AAV(Adeno-associated virus)-hRheb(S16H)는 University of North Carolina Vector Core에 의뢰하여 제작하였으며, 유전적 역가는 2×10¹² viralgenomes/ml이었다.

한편, 동일한 바이러스 백본에 활성화된 GFP(green fluorescent protein)를 서브클로닝하여 이후 실험에서 대조군으로 이용하였다.

실시예 2. 허혈성 뇌질환 동물 모델을 이용한 분석 결과

2-1. 실험 동물

실험 동물로는 수컷 Male Sprague-Dawley 랫트(흰쥐)(200~250 g; Orientbio Experimental Animal Center, South Korea)를 이용하였으며, 이하 모든 동물 실험은 KIT(Korea Institute of Toxicology)의 IACUC에 의해 승인된 프로토콜 하에 수행되었다.

2-2. AAV-GFP 와 AAV-hRheb(S16H)의 주입

랫트에 케타민(100mg/kg; Yuhan, South Korea)을 i.p(intraperitoneal) 투여하여 마취시킨 후, 스테레오텍식 프레임(stereotaxic frame, David Kopf Instrument, Tujunga, CA, USA)에 위치시켰다. 종래 알려진 Paxinos 및 Watson (1998)의 방법에 따라 상기 실시예 1에서 제조한 AAV-GFP 또는 AAV-hRheb(S16H)를 실린지 펌프(KD Scientific, NewHope, PA)에 붙어있는 10 ㎕ Hamilton syringe(30S needle)를 이용하여 각 랫트의 좌측 피질(left Cortex)(AP: 0.0 mm; ML: -2.0 mm; DV: -2.0 mm, relative to the bregma)에 주사하였다. 각 바이러스 벡터 현탁액(2.0 ㎕)을 0.1 ㎕/min의 속도로 20분 간 주사하였으며, 주사 후, 바늘을 천천히 회수하기 전에 추가적으로 5분간 유지시켰다.

2-3. 허혈성 뇌질환 동물모델의 제조

피질 경색(Cortical infarcts)은 로즈 벤갈(Rose Bengal)을 처리한 랫트의 감각운동피질(sensorimotor cortex)에 광원을 조사하여 유도하였다. 보다 구체적으로, 상기 실시예 2-2의 실험 종료 3주 후, 각 랫트에 케타민(100 mg/kg; Yuhan, South Korea)을 i.p(intraperitoneal) 투여하여 마취시킨 후, 스테레오텍식 프레임(stereotaxic frame, David Kopf Instrument, Tujunga, CA, USA)에 위치시켰다. 보온 패드(LMS, South Korea)를 이용하여 랫트의 체온을 37 ℃로 유지하였다. 두개골을 노출한 후, 종래 알려진 Paxinos 및 Watson (1998)의 방법에 따라. 직경 4 mm의 콜드 백색광(cold white light (Olympus, Denmark))을 브레그마(bregma) 뒤 쪽 2.5 mm 및 좌측 운동 피질(motor cortex) 위의 정중선 측방 3 mm 지점에 조사하였다. 광화학 염료인 로즈 벤갈(Sigma, St. Louis, MO, USA)을 광이 20분간 켜진 후, 2분 내에 주사를 통해 대퇴 정맥(femoral vein)에 주입하였다(20 mg/kg). 실험 종료 후 랫트의 수술 부위를 봉합한 후, 인큐베이터에서 회복시켰다.

2-4. 면역조직화학 분석

상기 실시예 2-2의 실험 종료 3주 후, 각 랫트에 바이러스 벡터가 성공적으로 주입되어 타겟 단백질이 정상적으로 발현되는지를 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

먼저, PBS로 관류(perfusion)를 수행한 후, 랫트의 뇌를 분리하고, 이를 10% NBF(Neutral Buffered Formalin) (BBC Biochemical, Korea)에서 12시간 동안 고정시켰다. 이후, OCT(Optimal Cutting Temperature)(Sakura, Japan) 화합물에 뇌 조직을 포매(embedding)하고, 20 ㎛ 두께로 Cryostat microtome(Leica, Germany)을 이용하여 뇌 조직 절편을 제작하였다. 상기 뇌 조직 절편을 PBS로 세척(5분 간격으로 3번)한 후, 상온에서 건조하였다. 충분히 건조한 후 DAPI 마운팅 솔루션(abcam, UK)으로 마운팅(mounting)하였다. 상기 과정을 통해 제조한 뇌 조직 절편 슬라이드를 DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) 및 FLAG-tag(Anti-Flag antibody(Sigma, USA))를 이용하여 면역 염색한 후, 형광현미경으로 관찰하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 아무것도 주입하지 않은 대조군에서는 DAPI(blue)만이 관찰되었으며, AAV-GFP를 주입한 군에서는 초록색의 GFP 발현이 관찰되었다. 또한, FLAG-tag 면역 염색 결과, AAV-hRheb(S16H)를 주입한 군에서 바이러스 백터에 포함된 Flag가 초록색으로 나타남을 확인하였다. 상기 결과를 통하여, 각 랫트의 뇌 조직 내 신경세포에 바이러스 벡터가 성공적으로 주입되어 타겟 단백질이 정상적으로 발현됨을 확인하였다.

2-5. H&E 염색

hRheb(S16H)에 의한 뇌 조직 보호 및 회복 효과를 관찰하기 위하여, H&E(Hematoxylin and Eosin) 염색을 수행하였다. 보다 구체적으로, 상기 실시예 2-3과 같이 랫트에 허혈성 뇌손상을 유도하고 3일, 7일 및 14일 후 랫트를 희생시켰다. 랫트의 뇌를 분리하고, 20 ㎛ 두께로 Cryostat microtome(Leica, Germany)을 이용하여 뇌 조직 절편을 제작하였다. 상기 뇌 조직 절편을 PBS로 5분간 세척한 후, 종래 공지된 방법에 따라 H&E 염색을 수행하였다(시약으로 Xylene(Daejung, Korea), Alcohol(Samchun, South Korea), Hematoxylin(Sigma, St. Louis, MO, USA), Eosin Y(Sigma, St. Louis, MO, USA)를 이용함). 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, AAV-hRheb(S16H)를 주입하고 허혈성 뇌손상을 유도한 경우, 아무것도 주입하지 않은 대조군에 비해 손상 부위의 회복이 빠르게 일어남을 확인하였다.

2-6. TTC 염색

hRheb(S16H)에 의한 뇌 조직 보호 및 회복 효과를 관찰하기 위하여, TTC(2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride) 염색을 수행하였다. 보다 구체적으로, 상기 실시예 2-3과 같이 랫트에 허혈성 뇌손상을 유도하고 3일, 7일 및 14일 후 랫트를 희생시켰다. 랫트의 뇌를 분리하고, 차가운 식염수(1~2 ℃)에 담갔다. 전두극(frontal pole)으로부터 2 mm 간격으로 뇌를 관상절단한 후, 각 절편을 10 ml의 2.0% TTC 용액(Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA)에 담그고, 37 ℃, 암조건에서 30분간 유지하였다. 염색 후, 각 절편을 10% 포르말린(pH 7.4)에서 4시간 동안 고정시킨 후, 뇌 경색(염색이 되지 않은 부분) 정도를 관찰하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, AAV-hRheb(S16H)를 주입하고 허혈성 뇌손상을 유도한 경우, 아무것도 주입하지 않은 대조군 및 AAV-GFP를 주입한 군에 비해 손상 부위가 감소되어 있음을 확인하였으며, 상기 결과를 통하여, hRheb(S16H)에 의해 허혈성 뇌손상이 회복되는 우수한 효과가 있음을 확인하였다.

이상의 실험 결과를 통하여, 본 발명에 따른 hRheb(S16H)는 허혈성 뇌손상을 발생시킨 동물 모델에서 뇌 조직 보호 및 재생 효과가 우수하여, 허혈성 뇌졸중을 비롯한 허혈성 뇌질환의 예방, 개선 및 치료에 유용하게 이용될 수 있음을 확인하였다.

이하 본 발명의 약학적 조성물 및 식품 조성물의 제제예를 설명하나, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 약학적 조성물의 제조

1-1. 산제의 제조

hRheb(S16H) 단백질 2 g

유당 1 g

상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

1-2. 정제의 제조

hRheb(S16H) 단백질 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

1-3. 캡슐제의 제조

hRheb(S16H) 단백질 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

제제예 2. 식품 조성물의 제조

2-1. 건강식품의 제조

hRheb(S16H) 단백질 100 mg

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 g

비타민 E 1.0 mg

비타민 B1 0.13 mg

비타민 B2 0.15 mg

비타민 B6 0.5 mg

비타민 B12 0.2 g

비타민 C 10 mg

비오틴 10 g

니코틴산아미드 1.7 mg

엽산 50 g

판토텐산 칼슘 0.5 mg

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 mg

산화아연 0.82 mg

탄산마그네슘 25.3 mg

제1인산칼륨 15 mg

제2인산칼슘 55 mg

구연산칼륨 90 mg

탄산칼슘 100 mg

염화마그네슘 24.8 mg

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation KOREA RESEARCH INSTITUTE OF CHEMICAL TECHNOLOGY <120> Composition comprising hRheb for preventing or treating Ischemic Brain disease <130> 1-228P <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 185 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Pro Gln Ser Lys Ser Arg Lys Ile Ala Ile Leu Gly Tyr Arg His 1 5 10 15 Val Gly Lys Ser Ser Leu Thr Ile Gln Phe Val Glu Gly Gln Phe Val 20 25 30 Asp Ser Tyr Asp Pro Thr Ile Glu Asn Thr Phe Thr Lys Leu Ile Thr 35 40 45 Val Asn Gly Gln Glu Tyr His Leu Gln Leu Val Asp Thr Ala Gly Gln 50 55 60 Asp Glu Tyr Ser Ile Phe Pro Gln Thr Tyr Ser Ile Asp Ile Asn Gly 65 70 75 80 Tyr Ile Leu Val Tyr Ser Val Thr Ser Ile Lys Ser Phe Glu Val Ile 85 90 95 Lys Val Ile His Gly Lys Leu Leu Asp Met Val Gly Lys Val Gln Ile 100 105 110 Pro Ile Met Leu Val Gly Asn Lys Lys Asp Leu His Met Glu Arg Val 115 120 125 Ile Ser Tyr Glu Glu Gly Lys Ala Leu Ala Glu Ser Trp Asn Ala Ala 130 135 140 Phe Leu Glu Ser Ser Ala Lys Glu Asn Gln Thr Ala Val Asp Val Phe 145 150 155 160 Arg Arg Ile Ile Leu Glu Ala Glu Lys Met Asp Gly Ala Ala Ser Gln 165 170 175 Gly Lys Ser Ser Cys Ser Val Met *** 180 185 <210> 2 <211> 555 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atgccgcagt ccaagtcccg gaagatcgcg atcctgggct accggcatgt ggggaaatcc 60 tcattgacga ttcaatttgt tgaaggccaa tttgtggact cctacgatcc aaccatagaa 120 aacactttta caaagttgat cacagtaaat ggacaagaat atcatcttca acttgtagac 180 acagccgggc aagatgaata ttctatcttt cctcagacat actccataga tattaatggc 240 tatattcttg tgtattctgt tacatcaatc aaaagttttg aagtgattaa agttatccat 300 ggcaaattgt tggatatggt ggggaaagta caaataccta ttatgttggt tgggaataag 360 aaagacctgc atatggaaag ggtgatcagt tatgaagaag ggaaagcttt ggcagaatct 420 tggaatgcag cttttttgga atcttctgct aaagaaaatc agactgctgt ggatgttttt 480 cgaaggataa ttttggaggc agaaaaaatg gacggggcag cttcacaagg caagtcttca 540 tgctcggtga tgtga 555

Claims

서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 활성 형태의 hRheb(human Ras homolog enriched in brain)(S16H) 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산 분자를 유효성분으로 포함하는 허혈성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 hRheb(S16H) 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 허혈성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 hRheb(S16H) 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 벡터에 포함된 것을 특징으로 하는, 허혈성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제4항에 있어서, 상기 벡터는 선형 DNA, 플라스미드 DNA 및 재조합 바이러스성 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 허혈성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제5항에 있어서, 상기 재조합 바이러스성 벡터는 AAV(Adeno-associated virus)인 것을 특징으로 하는, 허혈성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항, 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 허헐성 뇌질환은 뇌졸중, 뇌경색, 뇌허혈, 혈전증(thrombosis), 색전증(em-bolism), 일과성 허혈 발작(transient ischemic attack), 소경색(lacune), 두부손상(head trauma), 뇌순환대사장애, 뇌 기능혼수, 외상성 뇌손상 및 저산소성 뇌손상으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 질환인 것을 특징으로 하는, 허혈성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 활성 형태의 hRheb(human Ras homolog enriched in brain)(S16H) 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산 분자를 유효성분으로 포함하는 허혈성 뇌질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.