KR101557183B1

KR101557183B1 - 방광암 예후 진단 마커

Info

Publication number: KR101557183B1
Application number: KR1020120088882A
Authority: KR
Inventors: 김용준; 김원재; 윤형윤
Original assignee: 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2012-08-14
Filing date: 2012-08-14
Publication date: 2015-10-02
Also published as: KR20140022293A; WO2014027831A1

Abstract

본 발명은 방광암 예후 진단을 위한 신규 바이오 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 HOXA9, ISL1 및 ALDH1A3로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자의 메틸화 패턴에 따른 발현 특성을 이용하는 비근침윤성(표재성) 방광암 (Non-muscle Invasive Bladder Cancer; NMIBC) 진단 및 방광암 예후 진단 마커로서의 용도에 관한 것이다.

Description

방광암 예후 진단 마커{Prognostic Marker for Diagnosis of Bladder Cancer}

본 발명은 방광암 진단을 위한 신규 바이오 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 HOXA9, ISL1 및 ALDH1A3로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자의 메틸화 패턴에 따른 발현 특성을 이용하는 비근침윤성(표재성) 방광암 (Non-muscle Invasive Bladder Cancer; NMIBC) 예후 진단 마커로서의 용도에 관한 것이다.

방광암(bladder cancer)은 비뇨기계 영역에서 가장 빈번하게 발생하는 암으로서, 서양에서는 매년 인구 10만 명당 16.5명이 발병하는데 비하여 한국에서는 4.5명이 발생하는 것으로 보고되고 있다. 이처럼 서양에 비하여는 발생률이 낮으나, 해마다 발생률이 높아지고 있으며, 우리나라에서는 비뇨기계 암 중 가장 발생빈도가 높은 암으로 알려져 있다(Lee C, et al., 1992)

방광암은 침윤정도에 따라 크게 비침윤성(non-muscle invasive) 방광암과 침윤성(invasive) 방광암으로 구분된다. 비침윤성 방광암은 암이 근육층의 침범 없이 점막에 국한된 병변으로써 경요도 방광절제술(transurethral resection of bladder tumor) 또는 방광내 항암제 또는 BCG를 주입함으로써 비교적 간단하게 치료가 가능하나, 암의 재발과 침윤성 암으로의 진행이 문제가 된다. 한편, 침윤성 방광암은 암이 근육층 까지 침투한 상태를 말하는 것으로서, 이의 치료를 위하여는 근치적 방광적출술과 함께 복잡한 요로전환(urinary diversion)을 수행하여야 할 뿐 아니라, 환자에게 치명적인 결과를 초래할 수도 있다. 따라서, 일차 치료 후 재발과 진행에 대한 예측과 조기발견 및 예방이 매우 중요하다

최근에는 DNA 메틸화 측정을 통하여 암을 진단하는 방법들이 제시되고 있는데, DNA 메틸화는 주로 특정 유전자의 프로모터 부위의 CpG 섬(CpG island)의 시토신(cytosine)에서 일어나고, 그로 인하여 전사 인자의 결합이 방해를 받게 되어 특정 유전자의 발현이 차단되는 것으로서, 종양 억제 유전자의 프로모터 CpG 섬의 메틸화를 검색하는 것이 암 연구에 큰 도움이 되며, 이를 메틸화 특이 PCR(methylation specific PCR, 이하, "MSP"라고 함)이나 자동 염기 분석 등의 방법으로 검사하여 암의 진단과 스크리닝 등에 이용하려는 시도가 활발하게 이루어지고 있다.

종양 관련 유전자의 프로모터 메틸화가 암의 중요한 지표이며, 이를 암의 진단 및 조기 진단, 발암 위험의 예측, 암의 예후 예측, 치료 후 추적 조사, 항암 요법에 대한 반응 예측 등 다방면으로 이용할 수 있다. 실제 혈액이나 객담, 침, 대변, 소변 등에서 종양 관련 유전자의 프로모터 메틸화를 조사하여 각종 암 진료에 사용하려는 시도가 최근 활발하게 이루어지고 있다 (Esteller, M. et al., Cancer Res., 59:67, 1999;Sanchez-Cespedez, M. et al., Cancer Res., 60:892, 2000; Ahlquist, D.A. et al., Gastroenterol.,119:1219, 2000).

이에, 본 발명자들은 비근침윤성(표재성) 방광암 (Non-muscle Invasive Bladder Cancer; NMIBC) 조직으로부터 마이크로 어레이 분석을 통해 방광암 세포에서 특이적으로 메틸화되는 HOXA9, ISL1 및 ALDH1A3 유전자가 과메틸화되어 있으며, 유전자 발현은 하향 조절됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 특정 유전자 HOXA9, ISL1 및 ALDH1A3의 신규 용도에 관한 것으로,

본 발명의 목적은 상기 유전자들 중 1종 이상을 함유하는, 방광암 진단을 위한 마커용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 유전자들의 방광암 및 방광암 예후 진단에 필요한 다양한 용도를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자들을 이용하여 방광암의 치료기능을 가지는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 데 있다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 HOXA9, ISL1 및 ALDH1A3로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자의 바이오 마커 및 이들을 함유하는, 방광암 진단을 위한 마커용 조성물을 제공한다. 특히, 비근침윤성(표재성) 방광암 (Non-muscle Invasive Bladder Cancer; NMIBC) 예후 진단에 효과적이다.

상기 유전자들은 방광암에서 과메틸화되어 발현이 감소하는 것을 특징으로 하므로, 방광암 진단이 가능하다. 그리고, 가능하면, 상기 유전자는 2 이상의 조합으로 사용되는 것이 바람직한데, 조합하여 사용하는 유전자 수가 많을수록 더욱 바람직하다. 가장 바람직하게는 상기 3개 유전자 모두의 조합으로 사용되는 것이다.

또한, 본 발명에 따른 방광암 진단은 방광암 예후의 진단도 포함할 수 있는데 방광암 예후는 방광암의 진행(progression) 및 재발(Recurrence)을 포함할 수 있고, 특히, 유전자의 조합과 관련하여, 진행의 경우는 HOXA9 및 ISL1의 조합으로, 재발의 경우는 HOXA9, ISL1 및 ALDH1A3의 조합으로 사용하는 것이 가장 바람직하다.

상기 유전자의 기능에 기초하여, 본 발명은 일 구체예로서, HOXA9, ISL1 및 ALDH1A3로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 방광암 진단용 조성물을 제공한다.

상기 유전자의 발현 수준 측정은 메틸화, mRNA 또는 단백질의 수준을 측정하는 것을 포함하고, 가장 바람직하게는 상기 유전자들의 메틸화 수준을 측정한다.

또한, 본 발명에서 상기 유전자의 발현 수준은

이 때, 메틸화 수준의 측정은 공지의 PCR, 메틸화 특이 PCR(methylation specific PCR), 실시간 메틸화 특이 PCR(real time methylation specific PCR), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR , 정량 PCR, 파이로시퀀싱 및 바이설파이트 시퀀싱 등의 방법을 이용할 수 있다.

유전자 mRNA의 수준을 측정하는 제제는 HOXA9, ISL1 및 ALDH1A3로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머를 포함할 수 있고, 상기 단백질의 수준을 측정하는 제제는 HOXA9, ISL1 및 ALDH1A3로 구성된 군에서 선택되는 1 이상의 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 다른 구체예로서, 상기 진단용 조성물을 포함하는 방광암 예후 진단용 키트를 제공한다. 이 때, 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트 등일 수 있다.

또한, 본 발명은 또 다른 구체예로서, 다음을 포함하는 비근육침윤성 방광암 예후 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공한다:

환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 HOXA9, ISL1 및 ALDH1A3로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 단계; 및

상기 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 정상 대조구 시료의 해당 유전자의 메틸화 수준과 비교하는 단계.

이 때, 상기 유전자들은 2이상의 조합으로 사용하는 것이 바람직하며, 상기 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨로 이루어진 군중에서 선택될 수 있다.

또한, 본 발명은 바이오 마커의 유전자 기능을 활용하는 다른 구체예로서, 다음 단계를 포함하는 방광암, 특히 비근침윤성(표재성) 방광암 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

(a) 후보 물질의 존재하에, HOXA9, ISL1 및 ALDH1A3로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자를 메틸화시키는 단계; 및

(b) 후보물질이 없이 HOXA9, ISL1 및 ALDH1A3로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자를 메틸화시킨 경우에 비하여, 상기 유전자들의 메틸화가 억제되는 경우의 후보물질을 방광암 치료용 물질로 선택하는 단계.

이 때 역시, 상기 유전자들은 2이상의 조합으로 사용하는 것이 바람직하다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 방광암, 가장 바람직하게는 비근침윤성(표재성) 방광암 (Non-muscle Invasive Bladder Cancer; NMIBC) 예후 진단 인자로서의 HOXA9, ISL1 및 ALDH1A3 유전자의 신규 기능을 기반으로 하는 다양한 용도를 제공한다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 특정 유전자의 신규 기능에 관한 것으로, 방광암, 특히 비근침윤성(표재성) 방광암 (Non-muscle Invasive Bladder Cancer; NMIBC) 예후를 진단하는 조성물 및 방법을 제공하는 효과가 있다. 또한 본 발명은 HOXA9, ISL1 및 ALDH1A3 유전자의 과메틸화를 억제하는 물질을 스크리닝함으로써 방광암의 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공할 수도 있다.

따라서, 본 발명은 방광암에서의 HOXA9, ISL1 및 ALDH1A3의 유전자 기능에 관한 것으로, 방광암의 조기 진단 및 치료에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

도 1은 본 발형 실시예를 위한 실험 계획 및 전략을 간략히 도식화 하여 나타낸 것이다.
도 2 및 도 3은 NMIBC 및 NC에서 유전자 메틸화 및 발현 패턴을 마이크로어레이 및 PSQ 값으로 도출한 결과이다.
도 4 내지 도 10은 NMIBC 환자에서 메틸화 상태에 따른 재발 및 진행 가능성을 예측하는 Kaplan-Meier 곡선을 나타낸 그래프이다[재발에 대한 HOXA9 (도 4), ISL1 (도 5), ALDH1A3 (도 6), 및 M score (도 7) ; 및 진행에 대한 ISL1 (도 8), ALDH1A3 (도 9), ㅁ및 M score (도 10)]

본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.

"진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 방광암 예후를 예측 또는 확인하는 것이다. 그 중에서도 특히 비근침윤성(표재성) 방광암 (Non-muscle Invasive Bladder Cancer; NMIBC) 예후 진단에 유용하다.

"진단용 마커 또는 진단 마커(diagnosis marker)란 방광암 세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 세포에 비하여 방광암을 가진 세포에서 증가양상을 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질 , 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 다당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명의 목적상, 방광암 예후 진단 마커는 HOXA9, ISL1 및 ALDH1A3로 방광암 조직에서 과메틸화되어 그 발현이 감소하는 유전자들이다.

"예후(Prognosis)"란 질병의 경과와 결과의 예측을 의미하는 것으로, 본 발명에서는 방광암의 재발(Recurrence) 진행(progression)을 예측하는 것을 포함한다. 이에, 방광암의 재발 및 진행을 정확히 예측할 수 있는 지표가 매우 중요하며 조직의 분화도와 병기와 같은 임상적 지표를 보완하면서 치료의 반응을 예측할 수 있는 인자가 필요한데, 본 발명의 유전자들 HOXA9, ISL1 및 ALDH1A3이 이러한 지표 기능을 하므로 방광암 예후 인자로 이용할 수 있다. 즉, 이러한 유전자들의 발현 특성 측정은 방광암의 분화도 및 병기, 진행을 예측하는데 유용한 예후 지표(진단 마커)로 사용될 수 있다.

"암", "종양" 또는 "악성"은 일반적으로 비조절된 세포 성장의 특징을 갖는 포유동물의 생리학적 상태를 나타내거나 설명한다. 암의 예는 암종, 림프종, 백혈병, 모세포종 및 육종을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.

"대상" 또는 "환자"는 인간, 소, 개, 기니아 피그, 토끼, 닭, 곤충 등을 포함하여 치료가 요구되는 임의의 단일 개체를 의미한다. 또한, 임의의 질병 임상 소견을 보이지 않는 임상 연구 시험에 참여한 임의의 대상 또는 역학 연구에 참여한 대상 또는 대조군으로 사용된 대상이 대상에 포함된다.

"조직 또는 세포 샘플"은 대상 또는 환자의 조직으로부터 얻은 유사한 세포의 집합체를 의미한다. 조직 또는 세포 샘플의 공급원은 신선한, 동결된 및/또는 보존된 장기 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 고형 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 구성분; 대상의 임신 또는 발생의 임의의 시점의 세포일 수 있다. 조직 샘플은 또한 1차 또는 배양 세포 또는 세포주일 수 있다.

"핵산"은 임의의 DNA 또는 RNA, 예를 들어, 조직 샘플에 존재하는 염색체, 미토콘드리아, 바이러스 및/또는 세균 핵산을 포함하는 의미이다. 이중가닥 핵산 분자의 하나 또는 두개 모두의 가닥을 포함하고, 무손상 핵산 분자의 임의의 단편 또는 일부를 포함한다. 본 발명에서 사용하는 핵산은 CpG 섬과 같은 CpG-함유 핵산인 것이 바람직하다.

"유전자"는 단백질 코딩 또는 전사시에 또는 다른 유전자 발현의 조절시에 기능적 역할을 갖는 임의의 핵산 서열 또는 그의 일부를 의미한다. 유전자는 기능적 단백질을 코딩하는 모든 핵산 또는 단백질을 코딩 또는 발현하는 핵산의 일부만으로 이루어질 수 있다. 핵산 서열은 엑손, 인트론, 개시 또는 종료 영역, 프로모터 서열, 다른 조절 서열 또는 유전자에 인접한 특유한 서열 내에 유전자 이상을 포함할 수 있다.

"유전자 발현"이란 용어는 일반적으로 생물학적 활성이 있는 폴리펩티드가 DNA 서열로부터 생성되고 세포에서 생물학적 활성을 나타내는 세포 과정을 의미한다. 그런 의미로, 유전자 발현은 전사 및 해독 과정을 포함할 뿐만 아니라, 유전자 또는 유전자 산물의 생물학적 활성에 영향을 끼칠 수 있는 전사후 및 해독후 과정을 포함한다. 상기 과정들은 RNA 합성, 가공 및 수송뿐만 아니라, 폴립펩티드 합성, 수송 및 폴리펩티드의 해독후 변형을 포함하지만, 이들에 국한되는 것은 아니다. 본 발명에서는 유전자 발현의 태양으로 유전자 프로모터의 메틸화, mRNA 발현 및 단백질 발현의 경우를 모두 포함한다.

"코딩 영역" 또는 "코딩 서열"은, 통상적인 염기쌍과 코돈 용법 관계에 따라, 발현이 요구되는 특정 유전자 생성물 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산 서열, 이의 상보체, 또는 이들의 일부분을 지칭한다. 코딩 서열은 성숙 mRNA를 제공하기 위해 세포의 생화학 기구에 의해 함께 연결되는 게놈 DNA 또는 미성숙 1차 RNA 전사체에서의 엑손을 포함한다. 안티센스(antisense) 가닥은 상기 핵산의 상보체이고, 코딩 서열은 이들로부터 추정될 수 있다. 코딩 서열은, 적절한 길이의 전사체가 생성되고 적절한 리딩 프레임에서 번역되어 목적하는 기능 생성물이 생성되도록, 전사 조절 요소 및 번역 개시 및 종결 코돈과의 관계에 놓인다.

"프라이머"는 상보성 RNA 또는 DNA 표적 폴리뉴클레오티드에 혼성화하고 예를 들어 폴리머라제 연쇄 반응에서 발생하는 뉴클레오티딜트랜스퍼라제의 작용에 의해 모노뉴클레오티드로부터 폴리뉴클레오티드의 단계적 합성을 위한 출발점으로 기능하는 올리고뉴클레오티드 서열을 의미한다.

"단백질"은 또한 기준 단백질과 본질적으로 동일한 생물 활성 또는 기능을 보유하는, 단백질의 단편, 유사체 및 유도체를 포함하는 것이다

"표지" 또는 "라벨"는 직접 또는 간접적으로 시약, 예를 들어 핵산 프로브 또는 항체에 컨쥬게이팅 되거나 융합되고 컨쥬게이팅 되거나 융합된 시약의 검출을 용이하게 하는 화합물 또는 조성물을 의미한다. 표지는 그 자체가 검출될 수 있거나 (예를 들어, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지), 효소 표지의 경우에, 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변형을 촉매 할 수 있다.

"하향조절(down-regulation)"이라는 표현은, 정상조직세포에 비하여, 세포내 전사(gene transcription) 또는 번역(gene translation)에 의해서 특정 유전자의 mRNA로의 발현 또는 단백질로 발현량이 현저하게 감소된 것을 의미한다.

"항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로 무손상 모노클로날(단일클론) 항체, 폴리클로날 항체, 적어도 2개의 무손상 항체로부터 형성된 다중특이적 항체 (예를 들어 이중특이적 항체) 및 목적하는 생물학적 활성을 보이는 항체 단편을 포함한다.

"후생학(Epigenetics)"이란 DNA 염기서열의 변화 없이 유전자 발현의 양상이 변하여 자손에게 유전되는 것을 말한다. 주로 4가지 염기서열의 변화(소실, 치환, 증폭 등)에 의한 비정상적인 유전 정보가 종양형성 유전자나 종양억제 유전자에 축적되어 그 기능이 증폭 혹은 소실되어 암 발생에 영향을 미친다는 개념의 연구가 주를 이루어 왔으나 이것만으로 암의 발생이나 성장, 전이 과정을 설명하기는 부족하였다. 최근 들어 돌연변이 없이 유전자의 발현양상만을 조절하는 후생학이 암 관련 연구의 새로운 분야로 발전해 나가고 있다. 후생적 변화는 DNA 메틸화(methylation), 히스톤 변환(histone modification)과 게놈 임프린팅(genomic imprinting) 등의 과정을 통해 일어난다.

"치료"는 이롭거나 바람직한 임상적 결과를 수득하기 위한 접근을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해서, 이롭거나 바람직한 임상적 결과는 비제한적으로, 증상의 완화, 질병 범위의 감소, 질병 상태의 안정화 (즉, 악화되지 않음), 질병 진행의 지연 또는 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 일시적 완화 및 경감 (부분적이거나 전체적으로), 검출가능하거나 또는 검출되지 않거나의 여부를 포함한다. 또한, "치료"는 치료를 받지 않았을 때 예상되는 생존율과 비교하여 생존율을 늘이는 것을 의미할 수도 있다. 치료는 치료학적 치료 및 예방적 또는 예방조치 방법 모두를 가리킨다. 상기 치료들은 예방되는 장애뿐만 아니라 이미 발생한 장애에 있어서 요구되는 치료를 포함한다. 질병을 "완화(Palliating)"하는 것은 치료를 하지 않은 경우와 비교하여, 질병상태의 범위 및/또는 바람직하지 않은 임상적 징후가 감소되거나 및/또는 진행의 시간적 추이(time course)가 늦춰지거나 길어지는 것을 의미한다.

"약"이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.

본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "포함하다" 및 "포함하는"이란 말은 제시된 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.

이하, 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다.

본 발명에서 진단하고자 하는 질병은 방광암(Bladder Cancer), 특히 비근침윤성(표재성) 방광암 (Non-muscle Invasive Bladder Cancer; NMIBC)과 관련된 질병이다.

방광암은 현재 국내에서 발생빈도가 가장 높은 비뇨기계 종양으로 방광암의 발생기전 및 진행은 여러 가지 원인 및 단계를 거쳐 발생하는 것으로 알려져 있으며, 최근 염색체나 유전자이상에 대한 연구 및 방광암의 발생 및 재발, 진행을 예측할 수 있는 예후인자에 대한 연구들이 활발하게 진행되고 있다.

방광암은 최초 진단 시 표재성암과 침윤암으로 분류할 수 있고, 약 75%의 환자에서 표재성으로 나타난다. 표재성 종양은 재발이 흔하여 재발한 표재성 종양의 30% 정도에서는 이전보다 더 높은 악성도 또는 병기로의 진행을 보이며, 10% 정도에서는 근육층으로의 침범을 나타낸다.1 낮은 악성도의 Ta 병변의 경우 50-70%에서 재발하고, 5% 정도에서 침윤성 방광암으로 진행하며, 높은 악성도의 T1 병변은 80% 이상에서 재발하고 3년 내에 50%의 환자에서 침윤성 방광암으로 진행한다. 이러한 종양의 진행에 영향을 미칠 것으로 인식이 되는 인자로는 T1 병기와 G3 악성도로 (T1G3) 발견된 방광암, 다발성 상피내암, 높은 재발률, 방광내 BCG 요법후 종양의 잔류, p53 유전자의 발현 등이 보고되었다.

침윤성 방광암에서는 방광적출술이 표준적 치료법으로 알려져 있으며, 침윤성 방광암의 근치적 수술 후 예후는 T병기, N병기, 임파절 밀도, 악성도, 종양의 크기, 개수, 형태,임파선/혈관침범 여부 및 요로상피의 상태 등과 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 근침윤성 방광암의 80-90%는 이전 표재성방광암의 과거력이 없이 나타나는 일차성 근침윤성 방광암이나, 15% 정도는 이전에 표재성 방광암에서 침윤성 방광암으로 진행한 경우에 해당한다. 그리고 첫 진단시 침윤성 방광암으로으로 진단된 경우 (일차 침윤암)와 첫진단 시에는 표재성 방광암이었으나 재발하여 침윤성 방광암으로 진행된 경우 (진행성 침윤암)도 있다.

따라서, 이러한 잦은 재발과 병기의 진행은 방광암에서 자주 제기되는 문제점이며 방광암의 재발 및 침윤성으로 진행되는 것을 효과적으로 예측할 수 있는 지표의 발견이나 치료법의 개발이 필요한 실정이다

유전자이상에 대한 연구결과로 방광암에서 1q21-24, 3p24, 6p22, 8q21-22, 10q22-23, 12q15-21, 17q11-21,17q22 등의 유전자 증폭이 자주 발견된다는 보고도 있지만(Int J Oncol 2000;17:1025-9, Korean J Urol 2005;46:211-20, Cancer Genet Cytogenet 1999;110:87-93, Cancer Res 1998;58:3555-60), HOXA9, ISL1 및 ALDH1A3 유전자와 방광암 예후와의 관련성에 관한 내용은 전혀 알려진 바가 없다.

본 발명자들은 방광암(Bladder Cancer) 암조직에서 HOXA9, ISL1 및 ALDH1A3 유전자가 과메틸화됨을 발견하였다. 즉, 방광암과 상기 특정 유전자들의 발현 관련성에 대해 최초로 규명하였다.

따라서, 본 발명은 HOXA9, ISL1 및 ALDH1A3 중 선택되는 1종 이상의 유전자의 방광암 예후 진단 마커로서의 용도에 관한 것으로, 상기 유전자의 과메틸화 및 이에 따른 발현감소 여부의 확인을 통해 방광암 예후를 예측하여 진단할 수 있다. 특히, 비근침윤성(표재성) 방광암 (Non-muscle Invasive Bladder Cancer; NMIBC)의 경우의 예후 진단에 매우 유용하다.

상기 방광암의 예후는 재발(Recurrence) 및 진행(progression)을 포함한다.

본 명세서에서는, 더 낮은 또는 동등한 병리적 단계에서 1차 NMIBC의 재발로서 재발(Recurrence)을 정의하였고, 진행(progression)은 근육 침윤(TNM stage T2 또는 higher) 또는 전이성 질환으로 정의한다.

[방광암 예후 진단 마커용도]

따라서, 본 발명은 일 관점에서 HOXA9, ISL1 및 ALDH1A3 중 선택되는 1종 이상의 유전자의 방광암 및 방광암의 예후 진단 마커로서의 용도에 관한 것이다.

유의성 있는 진단 마커의 선택과 적용은 진단 결과의 신뢰도를 결정짓는다. 유의성 있는 진단 마커란, 진단하여 얻은 결과가 정확하여 타당도(validity)가 높고 반복 측정시에도 일관된 결과를 나타내도록 신뢰도(reliability)가 높은 마커를 의미한다. 본 발명의 방광암 예후 진단 마커는, 방광암의 발병과 함께 직접적 또는 간접적 요인으로 발현이 변화하는 유전자들로 반복된 실험에도 동일한 결과를 나타내며, 발현 수준의 차이가 대조군과 비교할 때 매우 커서 잘못된 결과를 내린 확률이 거의 없는 신뢰도가 높은 마커들이다. 그러므로 본 발명의 유의성 있는 진단 마커의 발현 정도를 측정하여 얻은 결과를 토대로 진단된 결과는 타당하게 신뢰할 수 있다.

본 발명의 특정 유전자들은 방광암 조직에서 과메틸화(hypermethylation)되어 하향조절되어 발현되는 것을 특징으로 한다.

따라서, HOXA9, ISL1 및 ALDH1A3 유전자의 메틸화 및/또는 하향조절 확인을 통해 방광암을 예측할 수 있다.

특히, 본 발명은 진단 또는 예측 마커로서 각 유전자를 개별적으로 사용하거나, 몇몇 마커 유전자를 조합하여 패널 디스플레이 형태로 하여 사용할 수 있고, 몇몇의 마커 유전자는 전체적인 발현 패턴 또는 메틸화된 유전자의 목록을 통하여 신뢰성 및 효율성을 향상시키는 것을 확인할 수 있다. 본 발명에서 확인된 유전자는 개별적으로, 또는 본 실시예에서 언급된 유전자가 조합된 유전자 세트로 사용될 수 있다. 또는, 유전자들은 함께 메틸화된 유전자의 수 및 그 중요도에 따라 순위를 매길 수 있고, 가중치를 둘 수 있으며, 암으로 발전할 가능성의 수준을 선정할 수 있다.

바람직하게는 상기 유전자들의 2이상의 조합, 가장 바람직하게는 3개의 유전자 모두의 조합으로 측정할 수 있다.

바람직한 일 구체예로서, 방광암의 예후 중 진행(progression)의 경우는 HOXA9 및 ISL1의 조합으로, 재발(Recurrence)의 경우는 HOXA9, ISL1 및 ALDH1A3의 조합으로 측정할 수 있다.

동일한 관점에서, 본 발명은 HOXA9, ISL1 및 ALDH1A3 중 선택되는 1종 이상의 유전자 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 방광암 예후 진단용 조성물에 관한 것이다.

이 때, 상기 '유전자 발현 수준 측정'이란, 메틸화, mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 것을 모두 포함한다. 가장 바람직하게는 메틸화 수준을 측정한다.

1. DNA 메틸화( Methylation ) 수준 측정

"DNA 메틸화(Methylation)"란 DNMT(DNA methyl transferase)에 의해 CpG의 5탄소 부위에 메틸기(CH3)가 결합된 것으로, 프로모터 CpG 섬에서 일어나는데, 이러한 DNA 메틸화는 세포 주기 또는 세포자살(apoptosis)을 조절하고, DNA를 복구하며, 세포 부착 및 세포간의 상호작용에 관여한다.

CpG 섬은 C+G 함유량이 50%이상이고, CpG 비율이 3.75% 이상인 0.2~3kb 길이의 부위를 말한다. 인간 게놈에는 약 45,000개의 CpG 섬이 있으며, 이들 대부분이 유전자의 발현을 조절하는 프로모터 부위에서 발견된다. 실제로, 상기 CpG 섬은 인간 유전자의 약 50%에 달하는 하우스키핑(housekeeping) 유전자의 프로모터에서 발견된다(Cross, S. and Bird, A., Curr. Opin. Gene Develop.,5:309, 1995). 상기 CpG는 포유동물 세포에서 대부분의 후생성 변화가 자주 일어나는 부위이다.

특히, 본 발명의 HOXA9, ISL1 및/또는 ALDH1A3 프로모터 CpG 섬이 메틸화되면, 이러한 메틸화는 코딩 서열의 돌연변이와 같은 방식으로 상기 유전자의 발현과 기능을 억제하게 되고, 이에 의하여 암의 발달, 재발, 진행이 촉진되게 된다.

그러므로, 구체적인 일례로서, 상기 유전자의 프로모터 메틸화 여부를 검출하는 방법은 다음 단계를 포함할 수 있다:

(a) 임상샘플로부터 샘플 DNA를 분리하는 단계;

(b) 상기 분리된 DNA를 HOXA9, ISL1 및 ALDH1A3로 구성된 군에서 선택되는 유전자 프로모터의 CpG 섬을 포함하는 단편을 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 증폭하는 단계; 및

(c) 상기 (b) 단계에서 증폭된 결과물의 생성 유무를 근거로 프로모터의 메틸화 여부를 결정하는 단계.

DNA 메틸화 수준의 측정은 공지의 다양한 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 상기 메틸화 측정방법은 PCR, 메틸화 특이 PCR(methylation specific PCR), 실시간 메틸화 특이 PCR(real time methylation specific PCR), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR , 정량 PCR, 파이로시퀀싱 및 바이설파이트 시퀀싱으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.

메틸화 특이 PCR ( methylation specific PCR ) 방법

게놈DNA에 바이설파이트를 처리하면 5'-CpG'-3 부위의 시토신이 메틸화된 경우에는 그대로 시토신으로 남아있고, 비메틸화된 경우에는 우라실로 변하게 된다. 따라서, 바이설파이트 처리 후 변환된 염기서열을 대상으로 5'-CpG-3' 염기서열이 존재하는 부위에 해당하는 PCR 프라이머를 제작하였다. 이때 메틸화된 경우에 해당되는 PCR 프라이머와 비메틸화된 경우에 해당하는 두 종류의 프라이머를 제작하였다. 파이로 DNA를 바이설파이트로 변환시킨 다음, 상기 두 종류의 프라이머를 이용하여 PCR을 하면 메틸화된 경우에는 메틸화된 염기서열에 해당되는 프라이머를 사용한 것에서 PCR 산물이 만들어지게 되고, 반대로 비메틸화인 경우에는 비메틸화에 해당되는 프라이머를 이용한 것에서 PCR 산물이 만들어진다. 메틸화 여부는 아가로즈겔 전기영동방법으로 정성적으로 확인할 수 있다.

실시간 메틸화 특이 PCR ( real time methylation specific PCR )

실시간 메틸화 특이 PCR은 메틸화 특이 PCR 방법을 실시간 측정방법으로 전환한 것으로, 게놈 DNA에 바이설파이트를 처리한 후, 메틸화된 경우에 해당하는 PCR 프라이머를 디자인하고, 이들 프라이머를 이용하여 실시간 PCR을 수행하는 것이다. 이때, 증폭된 염기서열과 상보적인 TaqMan 프로브를 이용하여 검출하는 방법과 Sybergreen을 이용하여 검출하는 두 가지 방법이 있다. 따라서, 실시간 메틸화 특이 PCR은 메틸화된 DNA만을 선택적으로 정량 분석할 수 있다. 이때, in vitro methylated DNA 샘플을 이용하여 표준곡선을 작성하고, 표준화를 위하여 염기서열내에 5'-CpG-3' 서열이 없는 유전자를 음성대조군으로 함께 증폭하여 메틸화 정도를 정량 분석할 수 있다.

파이로시퀀싱

파이로시퀀싱 방법은 바이설파이트 시퀀싱 방법을 정량적인 실시간 시퀀싱으로 변환한 방법이다. 바이설파이트 시퀀싱과 마찬가지로 게놈 DNA를 바이설파이트를 처리하여 전환시킨 다음, 5'-CpG-3' 염기서열이 없는 부위에 해당하는 PCR 프라이머를 제작하였다. 게놈 DNA를 바이설파이트로 처리한 후, 상기 PCR 프라이머로 증폭한 다음, 시퀀싱 프라이머를 이용하여 실시간 염기서열 분석을 수행하였다. 5'-CpG-3' 부위에서 시토신과 티민의 양을 정량적으로 분석하여 메틸화 정도를 메틸화 지수로 나타낼 수 있다.

메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR 또는 정량 PCR 및 DNA 칩

메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR 또는 DNA 칩 방법은 메틸화 DNA에만 특이적으로 결합하는 단백질을 DNA와 섞어주게 되면, 메틸화 DNA에만 특이적으로 단백질이 결합하기 때문에 메틸화 DNA만을 선택적으로 분리할 수 있다. 게놈 DNA를 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질과 섞어준 후, 메틸화된 DNA만을 선택적으로 분리하였다. 이들 분리된 DNA를 프로모터 부위에 해당하는 PCR 프라이머를 이용하여 증폭한 후, 아가로즈 전기영동으로 메틸화 여부를 측정할 수 있다.

또한, 정량 PCR 방법으로도 메틸화 여부를 측정할 수 있으며, 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질로 분리한 메틸화 DNA는 형광 염료로 표지하여 상보적인 프로브가 집적된 DNA칩에 하이브리디제이션시킴으로써 메틸화 여부를 측정할 수 있다.

차별적 메틸화의 검출- 바이설파이트 시퀀싱 방법

메틸화 CpG를 함유한 핵산을 검출하는 다른 방법은 핵산을 함유한 시료를 비메틸화 시토신을 변형시키는 제제와 접촉시키는 단계 및 CpG-특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 시료의 CpG-함유 핵산을 증폭시키는 단계를 포함한다. 여기서, 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머는 변형된 메틸화 및 비메틸화 핵산을 구별하여 메틸화 핵산을 검출하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 증폭 단계는 선택적이고, 바람직하지만 필수적인 것은 아니다. 상기 방법은 변형된(예를 들면, 화학적으로 변형된) 메틸화 및 비메틸화 DNA를 구별하는 PCR 반응에 의존하는 것이다. 상기와 같은 방법은 미국특허 5,786,146에 개시되어 있으며, 상기 특허에는 메틸화 핵산의 검출을 위한 바이설파이트(bisulfite) 시퀀싱과 연관하여 기재되어 있다.

즉, 본 발명의 구체적인 일 양태에서는, 상기와 같은 방법 등을 이용하여 HOXA9, ISL1 및 ALDH1A3 유전자들의 DNA 메틸화 수준을 측정함으로써 과메틸화된 경우 방광암의 예후를 나타내는 것으로 진단하는 용도를 제공할 수 있다.

2. mRNA 발현수준 측정

"mRNA 발현수준 측정"이란 방광암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 상기 마커 유전자들의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정한다.

이를 위한 분석 방법으로는 역전사중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

이 때, 사용되는 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시할 수 있다. 본 발명의 프라이머는, 각 마커 유전자 특이적인 프라이머로 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산이다. 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 상기 프라이머는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있고, 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 핵산 서열은 또한 검출 가능한 시그날을 직접적으로 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 표지의 예로는 방사성 동위원소,형광성 분자, 바이오틴 등이 있다.

이에, 본 발명의 구체적인 일 양태에서는, HOXA9, ISL1 및 ALDH1A3 중 선택되는 1종 이상의 유전자에 특이적인 프라이머 서열을 포함하는 방광암 진단 마커 조성물을 제공할 수 있다. 이 때, 상기 유전자들의 mRNA 발현 수준을 측정함으로써 하향조절되는 경우 방광암의 예후를 나타내는 것으로 진단하는 용도를 제공할 수 있다.

3. 단백질 발현 수준 측정

또한, 단백질 발현수준 측정이란 방광암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 방광암 마커 유전자로부터 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 바람직하게는, 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있다.

항체란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다.

이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, 엘라이자(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

따라서, 또 다른 양태로서, 본 발명은 HOXA9, ISL1 및 ALDH1A3 중 선택되는 1종 이상의 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 방광암 진단 마커 조성물을 제공할 수 있다. 이 때, 상기 유전자들의 단백질 발현 수준을 측정함으로써 하향조절되는 경우 방광암의 예후를 나타내는 것으로 진단하는 용도를 제공할 수 있다.

[샘플]

샘플에서 특정 마커의 검출에 관련된 하기 프로토콜을 예시를 위해 제시한다.

샘플 제조를 위해, 포유동물 (일반적으로 인간 환자)로부터의 조직 또는 세포 샘플을 사용할 수 있다. 샘플은 수술에 의한 절제, 흡인 또는 생검을 포함하여 이로 제한되지 않는 당업계에 공지된 다양한 과정에 의해 얻을 수 있다. 조직은 신선하거나 냉동될 수 있다.

조직 샘플은 통상적인 방법에 의해 고정 (즉 보존)될 수 있다. 당업자는 샘플이 조직학적으로 염색되거나 달리 분석되는 목적에 따라 고정액을 선택할 수 있음을 이해할 것이다. 당업자는 또한 고정 길이가 조직 샘플의 크기 및 사용되는 고정액에 따라 결정됨을 이해할 것이다.

상기 방법은 추가로 조직 또는 세포 샘플에서 메틸화수준, mRNA 또는 단백질 발현을 조사하는 프로토콜을 포함한다. 앞서 설명한 것처럼, 세포 내의 메틸화, mRNA, 단백질의 평가 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다.

또한, 상기 방법은 마이크로어레이 기술에 의해 조직 또는 세포 샘플에서 메틸화 및 mRNA를 조사 또는 검출하는 프로토콜을 포함할 수 있다.

마이크로어레이(Microarray) 방법은 종양 내의 수천 또는 심지어 수만 개의 유전자의 RNA 발현을 동시에 연구할 수 있어, 인간 질병의 분자적 기초에 대한 포괄적 통찰력을 보다 효과적으로 얻을 수 있게 해준다. 또한, 이를 이용하여 종양 분류에서의 유전자 발현 패턴, 임상학적 결과 및 화학적 치료요법에 대한 반응의 평가가 가능하다.

이와 같이, 샘플을 이용한 상기 프로토콜 등에 의해 HOXA9, ISL1 및 ALDH1A3 중 선택되는 1종 이상의 유전자 발현을 측정하여 방광암의 예후 진단이 가능하다. 앞서 언급한 바와 같이, 상기 유전자는 다수의 다양한 조합으로 측정하는 것이 바람직하다.

중요한 프로브는 검출할 수 있도록 표지될 수 있으며, 예를 들면 방사선 동위원소, 형광 화합물, 바이오 발광 화합물, 화학 발광 화합물, 금속 킬레이트 또는 효소로 표지될 수 있다. 상기와 같은 프로브를 적당하게 표지하는 것은 당해 분야에서 널리 알려진 기술이며, 통상적인 방법을 통하여 수행할 수 있다.

유사한 관점에서 본 발명은 인간의 방광암 예후 진단용 키트에 관한 것이다.

상기 키트는 HOXA9, ISL1 및 ALDH1A3 중 선택되는 1종 이상의 유전자의 발현을 분석하여 방광암, 바람직하게는 비근침윤성(표재성) 방광암 (Non-muscle Invasive Bladder Cancer; NMIBC) 예후를 판단하는데 쓰이는데, 이는 크게 두 가지 방법으로 실시할 수 있다: 유전적 분석(genetic analysis) 및 면역분석(immunoassay).

이를 위해, 상기 키트는 예를 들어, HOXA9, ISL1 및 ALDH1A3 중 선택되는 1종 이상의 유전자 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 혹은 프로브; 또는 HOXA9, ISL1 및 ALDH1A3 중 선택되는 1종 이상단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함할 수 있다.

즉, 본 발명의 인간 방광암 진단용 키트가 만일 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 그리고, 본 발명의 인간 방광암 진단용 키트가 면역 분석에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, 이차항체 및 표지의 기질을 포함할 수 있다.

본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

이처럼, 본 발명의 또 다른 양태에서는, 본 발명에 따른 상기 방광암 진단용 조성물을 포함하는 방광암 진단 키트를 제공한다. 바람직하게, 상기 진단 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다.

일 구체예로서, 본 발명의 키트는 샘플을 담는 구획된 캐리어 수단, 비메틸화 시토신을 민감하게 절단하는 제제를 함유하는 첫번째 용기, CpG 함유 핵산을 증폭하기 위한 프라이머를 함유하는 두번째 용기 및 절단된 또는 절단되지 않은 핵산의 존재를 검출하는 수단이 함유된 세번째 용기를 포함하는 하나 이상의 용기를 포함할 수 있다.

[방광암 진단방법]

본 발명은 다른 관점에서, 이러한 발견에 기초하여 HOXA9, ISL1 및 ALDH1A3 중 선택되는 1종 이상의 유전자의 발현수준을 측정하는 것을 포함하는 방광암 진단 방법 또는 방광암 진단을 위한 정보 제공방법을 제공한다.

상기 '유전자 발현 수준 측정'이란, 메틸화, mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 것을 모두 포함하기 때문에, HOXA9, ISL1 및 ALDH1A3 유전자의 메틸화 및/또는 하향조절 확인을 통해 방광암의 예후에 관한 정보를 예측할 수 있다.

바람직하게는, HOXA9 및 ISL1의 조합으로 방광암의 예후 중 진행(progression)의 경우를, HOXA9, ISL1 및 ALDH1A3의 조합으로 재발(Recurrence)의 경우에 대한 정보를 수득할 수 있다.

일 구체예로서, 본 발명의 방법은

환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 HOXA9, ISL1 및 ALDH1A3 중 선택되는 1종 이상의 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및

상기 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 정상 대조구 시료의 해당 유전자의 발현과 비교하는 단계를 포함한다. 특히, 상기 유전자들의 메틸화 수준을 측정하는 것을 특징으로 한다. 기타 사항은 앞서 설명한 바와 같다.

즉, 상기 HOXA9, ISL1 및 ALDH1A3 유전자의 발현은 방광암에 대한 지표임을 특징으로 한다.

다시 말해, 상기 방광암 예후 진단방법은, 특히 비근침윤성(표재성) 방광암 (Non-muscle Invasive Bladder Cancer; NMIBC)에 따른 특정 마커의 발현을 조사하는 것에 관한 것이고, 본 명세서에 개시된 방법은 방광암 환자 치료를 위해 적절하거나 효과적인 요법을 평가할 때 유용한 데이터 및 정보를 얻기 위한 편리하고, 효율적이며, 비용 효과적인 수단을 제공할 수 있을 것이다.

[스크리닝 방법]

한편, 다른 관점에서 본 발명은 앞서 설명한 사실을 기반으로 하여, HOXA9, ISL1 및 ALDH1A3의 메틸화를 억제시키는 방광암 치료용 물질을 스크리닝 하는 방법에 관한 것이다.

상기 방법은 일 구체예로,

(a) 후보 물질의 존재하에, HOXA9, ISL1 및 ALDH1A3 중에서 선택되는 1 개 이상의 유전자를 발현시키는 단계; 및

(b) 후보물질이 없이 HOXA9, ISL1 및 ALDH1A3 중에서 선택되는 1 개 이상의 유전자를 발현시킨 경우에 비하여, 상기 유전자들의 메틸화가 억제되는 경우의 후보물질을 방광암 치료용 물질로 선택하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명은 HOXA9, ISL1 및 ALDH1A3의 메틸화와 관련하는 유전자의 발현의 상향 조절 또는 하향 조절에 대한 유전적 접근까지 확장한다.

이처럼, 본 발명에서는 방광암, 바람직하게는 비근침윤성(표재성) 방광암 (Non-muscle Invasive Bladder Cancer; NMIBC) 환자에게서 HOXA9, ISL1 및 ALDH1A3 중 선택되는 1종 이상의 유전자의 메틸화 증가 및 발현 감소 프로파일 특성을 보여 주었고, 이러한 결과는 방광암 예후 진단 마커로서의 상기 유전자들의 용도를 활용하여, 방광암 진단 및 치료제를 개발 또는 스크리닝하기 위한 표적유전자로서, 본 발명에 의해 특성이 규명된 상기 유전자를 이용할 수 있음을 시사한다.

실시예

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

통계적 분석을 SPSS 12.0 software (SPSS Inc., Chicago, IL)을 이용하여 수행하였다. P < 0.05는 통계적으로 유의미한 것으로 간주하였다.

샘플 수집

전체 187개 인간 방광 샘플들을 메틸화 어레이 또는 파이로시퀀싱(pyrosequencing, PSQ) 분석을 위해 사용하였다: 6개의 정상 대조군(normal controls, NC) 및 181 NMIBC. 조직학적으로-진단된 이행세포 암종(histologically-diagnosed transitional cell carcinomas)에 대해 1995년~2010년 사이 경요도적절제술(transurethral resection, TUR)을 행한 181 개 1차 NMIBC 환자로부터 NMIBC 샘플들을 수득하였다.

불완전한 절제술 또는 분석에 지나친 영향을 미칠 수 있는 혼란 변수의 가능성을 배제하기 위해 환자들을 6개월 이하 동안 팔로우-업 시키고 또는 6개월 내 질병 재발을 겪은 환자들을 연구에서 제외시켰다. 정상 방광 요로상피의 샘플들을, 전립선 비대증, 방광 손상이 있는 개인들로부터 수득하고, 방광 결석을 대조군으로 사용하였다. 89 표본들(NC = 6, NMIBC = 83) 에 대한 마이크로어레이 유전자 발현 데이터는 본 발명자들의 이전 연구 Mol Cancer. 2010;9:3 및 J Clin Oncol. 2010;28:2660-7로부터 이용하였다.

실험 계획

본 실험 계획 및 전략을 도 1에 개략적으로 나타내었다.

모든 종양들을 외과 절제술 15분 내에 매크로-절개하였다. 각 NMIBC 샘플들을, 조직 샘플 부분의 병리학적 분석에 의해 확인하였다(즉, TUR 표본으로부터의 절편들을 액체질소에서 스냅-동결(snap-frozen)하고-80℃에서 보관하였음). 실험에 사용된 샘플들을 충북 국립대학병원으로부터 제공받았다. 모든 샘플들의 수집 및 분석은 충북대학교병원 임상시험심사위원회의 승인을 받았고 각 환자로부터 동의도 받았다.

종양들은 2002 TNM 분류 및 1973 WHO 평가 시스템(grading system)에 따라 단계를 나누었다. 방광암 샘플이 적절한 근육을 포함하고 있지 않거나 높은 수준의 종양이 검출되면, 2번째 TUR을 최초 절제술 후 2-4 주때 수행하였다. 중간의- 또는 고위험의 NMIBC 환자들을 요로 방광 내 요법(intravesical therapy)의 1 사이클을 받게하였다. 표준 권고에 따라 각 환자들을 팔로우업하고 매니징하였다.

보다 낮은 또는 동등한 병리적 단계에서 1차 NMIBC의 재발로서 재발(Recurrence)을 정의하였고, 진행(progression)은 근육 침윤(TNM stage T2 or higher) 또는 전이성 질환으로 정의하였다.

DNA 메틸화 프로파일

마이크로어레이 유전자 발현 데이터를 위한 89 방광 샘플이 유효하였고, DNA 샘플(NC = 6, NMIBC = 18)과 매칭된 24개를 DNA 메틸화 프로파일링을 위해 사용하였다. 14,495 유전자를 커버하고 있는 27,578 CpG 디뉴클레오티드들의 interrogation이 가능한 genome-wide Infinium array (Illumina Inc., San Diego, CA)을 이용하여 메틸화 패턴을 분석하였다.

β 값은 특이적 CpG 아일랜드의 DNA 메틸화 수준의 정량적 측정값을 0(완전한 비메틸화)에서부터 1까지(완전한 메틸화) 나타냈다.

PSQ 분석

NMIBC-특이적 과메틸화된 CpG 사이트의 DNA 메틸화 위치를 PyroMark Q96 ID (Qiagen, Valencia, CA)를 이용하여 PSQ에 의해 분석하였다.

PSQ 프라이머는 Illumina Infinium array 상에서 분석된 CpG 사이트를 포함하도록 고안되었다. 상기 프라이머 서열 및 증폭 조건은 아래에 기재하였다.

프라이머들은 NCBI Reference Sequences build version 36.1을 이용하여 디자인하였다. PCR 반응은 0.01 μM 프라이머, Bioneer Taq (Bioneer, Daejeon, Korea), 및 20 ng 바이설파이트-처리된 DNA을 포함하였다. 열적순환 파라미터들은 다음과 같다: 94℃에서 5분동안 변성; 94℃에서 30 초, 52℃에서 30초 동안 어닐링, 및 72℃에서 30초 동안의 45 사이클; 그리고 최종 신장 72℃에서 5분 동안 최종 신장.

bp, base pairs; TSS, transcription start sit

통계학적 분석

R 언어환경 (2.10.0 버전, http://www.r-project.org/에서 이용)에서 변위치 표준화를 사용하여 DNA 메틸화 및 유전자 발현 프로파일 데이터를 표준화하였다. 구체적인 분석 방법은 Mol Cancer. 2010;9:3; J Clin Oncol. 2010;28:2660-7; 및 Clin Cancer Res. 2011;17:4523-30 등을 참조할 수 있다.

24 매칭된 DNA 메틸화 및 발현 프로파일을 이용하여, NMIBC 및 NC 사이에 메틸화 수준이 현저히 다른 메틸화-사일런싱 유전자를 검출하는데 3개의 기준을 사용하였다. 상기 기준은 다음과 같다: (1) NMIBC 및 NC사이에 DNA 메틸화 수준의 차이 (△β value) > 0.4; (2) NC < 0.15 대한 평균 β값 ; 및 (3) NMIBC 및 NC사이에 유전자 발현 수준에서의 > 3-배 차이.

본 실험에서 확인된 유전자를 평가하기 위하여, 26 방광암 조직으로부터 마이크로어레이 메틸화 데이터(Ta = 17, T1 = 5, T2 = 4) 및 웨스턴 군집으로부터 6개 NC 조직을 이용하였다. 그룹 간 연속 변량들의 차이는 2 샘플 t-test 또는 다항 대조를 이용한 ANOVA 트렌드 분석(trend analyses)를 이용하여 분석하였다. 피어슨 상관계수는 연속변량으로 그룹간 관계를 평가하기 위해 사용되었다. ROC(Receiver operating characteristic) 곡선을 이용하여, 예측(재발 또는 진행)을 위한, 가장 높이 결합된 민감성 및 특이성을 나타내는 최적의 cut-off 포인트를 결정하였다. 그리고, 환자들을 서브그룹(저메틸화 또는 과메틸화)으로 나누었다.

메틸화의 전체 양을 포함하기 위해, 각 유전자의 예측가능한 값을 평가하기 위해 사용된 Cox 회귀 분석 유래 회귀 계수에 의해 증가된 선택된 유전자의 메틸화 수준 합으로 각 환자들의 메틸화 점수(M 스코어)를 계산하였다. 다변수의 Cox 비례 위험 회귀분석 모델(proportional hazards regression models)에 대해, 메틸화 위치의 예후 값(prognostic value)을 개별적으로 평가하고, 잘 알려진 임상병리학적(성, 연령, 종양크기, 종양수, 요로 방광내 치료, 정도 및 단계) 요소에 대해 적용시켰다.

실시예 1: NC 및 NMIBC 환자들의 특성

NC 및 NMIBC 환자들의 기준치 특성(Baseline characteristics)들을 이하 표 1에 기재하였다.

이처럼, NMIBC 환자 중에서 평균적으로 재발 없는 생존 및 진행 없는 생존 기간은 각각 47.2 ± 40.4 달 (median 35.8, range 6.1 to 183.3) 및 61.1 ± 41.7 달 (median 50.9, range 6.6 to 183.3)이었다.

실시예 2 : NMIBC 및 NC 에서 상이하게 메틸화되고 발현된 유전자의 확인

18 NMIBC 환자로부터의 게놈-와이드 메틸화 및 발현 프로파일을 6개 NC의 경우와 비교하였다. 인간 방광 조직 유래 마이크로어레이 데이터의 완전한 세트를, 데이터 시리즈 어세션 넘버 GSE37817 하에서 온라인(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) 상에서 이용하였다.

매우 엄격한 선택 기준((△β value > 0.4 and mean β value in NC < 0.15)을 이용하여, NC 와 비교하여 NMIBC 에서 과메틸화된 39 유전자에서 42개의 독특한 CpG 아일랜드 좌위를 확인하였다. NMIBC 에서 메틸화-사일런싱 유전자를 선별하기 위해, 24 인간 방광 샘플의 상응하는 유전자 발현 수준을 비교하였다.

그 결과, 6개 유전자에서 42개의 독특한 과메틸화된 좌위, 7좌위가 NC 와 비교하여 NMIBC에서 유전자 발현이 적어도 3 배의 감소를 보였다.

NMIBC에 대한 메틸화 마커로서의 유전자를 웨스턴 군집 유래 Infinium microarray methylation data의 독립적 세트 (Clin Cancer Res. 2011;17:5582-92)를 이용하여 평가하였다. △β 값은 다른 실험에서의 경우와 거의 일치하였다. 이를 이하 표 2에 기재하였다.

실시예 3 : PSQ 분석

다른 방법을 이용하여 후보 유전자들의 DNA 메틸화 수준을 평가하기 위해, 187 인간 방광 샘플(NC = 6, NMIBC = 181)로부터 수득한 바이설파이트-변경된 게놈 DNA를 이용하여 PSQ 분석을 수행하였다.

6개의 후보 유전자 중 4개의[HOXA9 (Homeobox A9), ISL1(ISL LIM homeobox 1), ALDH1A3(Aldehyde dehydrogenase 1 family, member A3), EOMES(Eomesodermin)] PSQ 분석이 기술적으로 가능하였고, PSQ에 의해 분석하였다. 바이설파이트 PSQ 테크닉의 신뢰성을 테스트하기 위해, Infinium 어레이 및 PSQ로부터 수득한 24 방광 샘플을 비교하였다.

그 결과, 표 3에 기재한 바와 같이, 피어슨 상관계수가 허용가능한 0.715 ~ 0.940 범위를 나타냈다.

P-값은 피어슨 상관계수를 이용하여 계산함.

실시예 4 : NMIBC 및 NC 에서 메틸화 및 유전자 발현 패턴

DNA 메틸화-유도 유전자 사일런싱을 확인하기 위해, DNA 메틸화 및 유전자 발현 수준 사이의 상관성을 마이크로어레이 발현 데이터를 이용하여 계산하고, 89 대상으로부터 PSQ 값을 매치하였다.

그 결과, 도 2 및 도 3에 도시한 바와 같이, EOMES를 제외하고, HOXA9 (r = -0.453, P < 0.001), ISL1 (r = -0.501, P < 0.001), 및 ALDH1A3 (r = -0.150, P < 0.049)의 메틸화 및 발현 수준이 현저한 역 상관관계를 보였다. 또한, NMIBC 환자들은 NC 보다 현저히 높은 메틸화 및 낮은 발현 수준을 보였다(P < 0.001)

.

실시예 5 :메틸화 수준 및 임상병리학적 변수 사이의 연관성

메틸화 패턴 및 임상병리학적 요소 사이의 상관성을 평가하기 위해, 공지의 예후 인자, 예를 들어 종양수, 종양크기 및 종양 정도 및 단계의 관점에서 메틸화 수준을 관찰하였다.

그 결과, 이하 표 4에 기재한 바와 같이, 일반적으로, HOXA9, ISL1, ALDH1A3, 및 EOMES 에 대한 증가된 메틸화 값은 종양 수, 크기, 정도 및 단계의 증가와 깊이 관계하고 있었다.

^aP-값은 Students t-test를 이용해 계산

^bP-값은 ANOVA trend analyses test를 이용해 계산.

실시예 6 : 예후 예측인자로서 메틸화 상태

선별된 메틸화 마커가 예후(재발 또는 진행)와 관계가 있는지 여부를 알아보기 위해, ROC 커브 분석을 기초로 최적 cut-off 포인트로 각 유전자의 메틸화 값을 둘로 나누었다.

그 결과를 이하 표 5에 기재하였다.

또한, 일변량 및 다변량 Cox 회귀 분석으로 재발(HOXA9, ISL1 and, ALDH1A3) 및 진행(ISL1 and ALDH1A3)과 본 발명의 메틸화 마커가 매우 밀접한 관련성을 가지고 있음을 확인하였다.

예후 타당성을 가지는 메틸화 마터들의 메틸화 위치를 통합시키기 위해, 재발(HOXA9, ISL1 and, ALDH1A3) 및 진행(ISL1 and ALDH1A3)에 대한 M 스코어를 각각 계산하였다. 그리고, 환자들을 그에 따라서 2 그룹으로 분류하였다. 다변량 Cox 회귀 분석에 따라, M 스코어 분류자는 재발(Hazard ratio [HR], 1.93; P = 0.033) 및 진행(HR, 10.86; P = 0.004, 표 6)의 독립적인 예측인자였다.

^aHR(hazard ratios)는 메틸화 상태(저메틸화 vs. 고메틸화)에 따른 질병 결과를 예측함.

^bHR 는 임상병리학적 요소[성별, 나이, 종양크기(< 3 cm vs. ≥ 3 cm), 다양성(single vs. multiple), 요로방광내 요법(intravesical therapy)(no vs. yes), 종양 정도(G1 vs. G2 vs. G3), 및 T 단계 (Ta vs. T1)]를 적용시킴. 다변량 분석 상에서, HR는 각 유전자 메틸화 상태 및 임상병리학적 요소에 따라 결정됨.

그리고, 도 4 내지 도 10에 도시하고 있는 바와 같이, 유사하게, Kaplan-Meier 평가는 메틸화 상태에 따른 시간 대 재발 또는 진행에서의 현저한 차이를 확인시켜주었다(log-rank test, P < 0.05).

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본

질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시 예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

ISL1 및 ALDH1A3로 이루어진 유전자를 함유하는, 방광암 진단 마커용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 유전자들은 방광암에서 과메틸화되어 저발현하는 것을 특징으로 하는 마커용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 방광암은 비근침윤성(표재성) 방광암(Non-muscle Invasive Bladder Cancer; NMIBC)인 것을 특징으로 하는 마커용 조성물.
제1항에 있어서,
방광암 진단은 방광암의 진행(progression) 및 재발(Recurrence)을 포함하는 것을 특징으로 하는 마커용 조성물.
삭제
ISL1 및 ALDH1A3로 이루어진 유전자의 발현 수준을 측정하는 프로브, 항체 또는 프라이머를 포함하는, 방광암 진단용 조성물.
삭제
제6항에 있어서,
상기 유전자의 발현 수준 측정은 메틸화, mRNA 또는 단백질의 수준을 측정하는 것을 특징으로 하는 방광암 진단용 조성물.
제6항에 있어서,
상기 방광암은 비근침윤성(표재성) 방광암 (Non-muscle Invasive Bladder Cancer; NMIBC)인 것을 특징으로 하는 방광암 진단용 조성물.
삭제
제6항에 따른 조성물을 포함하는 방광암 진단용 키트.
환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 ISL1 및 ALDH1A3로 구성된 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 단계; 및
상기 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 정상 대조구 시료의 해당 유전자의 메틸화 수준과 비교하는 단계를 포함하는 방광암 진단을 위한 정보의 제공 방법.
제12항에 있어서,
상기 방광암은 비근침윤성(표재성) 방광암 (Non-muscle Invasive Bladder Cancer; NMIBC)인 것을 특징으로 하는 것을 특징으로 하는 방법.
제12항에 있어서,
상기 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨로 이루어진 군중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.