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KR101541520B1 - 항산화 및 항노화 활성을 갖는 황칠나무, 산수유 및 구기자 혼합 추출물의 제조방법 및 상기 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물 - Google Patents

항산화 및 항노화 활성을 갖는 황칠나무, 산수유 및 구기자 혼합 추출물의 제조방법 및 상기 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물 Download PDF

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KR101541520B1
KR101541520B1 KR1020130053336A KR20130053336A KR101541520B1 KR 101541520 B1 KR101541520 B1 KR 101541520B1 KR 1020130053336 A KR1020130053336 A KR 1020130053336A KR 20130053336 A KR20130053336 A KR 20130053336A KR 101541520 B1 KR101541520 B1 KR 101541520B1
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김종륜
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이지석
송시영
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김보애
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재단법인 전남생물산업진흥원
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Abstract

본 발명은 항산화 및 항노화 활성을 갖는 황칠나무, 산수유 및 구기자 혼합 추출물의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 초임계 이산화탄소 및 보조용매를 이용한 다단계 초임계 추출을 통해 황칠나무, 산수유 및 구기자로부터 항산화 및 항노화 활성을 갖는 혼합 추출물을 고효율로 추출하여 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 초임계 이산화탄소 및 보조용매를 이용한 다단계 추출을 통하여 황칠나무, 산수유 및 구기자 혼합 원료로부터 항산화 및 항노화 활성을 갖는 혼합 추출물을 고순도로 제조하는 방법을 제공할 수 있으며, 상기 추출물은 우수한 프리 라디칼 소거능을 갖고, 자외선에 의한 피부세포 손상을 억제하며(광노화 억제), 엘라스틴 분해 효소인 Elastase 및 콜라겐 분해 효소인 MMP-1의 발현을 억제하는 효과를 갖음으로써 피부 주름 및 노화 개선용 화장료 조성물로 사용될 수 있다.

Description

항산화 및 항노화 활성을 갖는 황칠나무, 산수유 및 구기자 혼합 추출물의 제조방법 및 상기 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물{A method for preparation of extract mixture having antioxidant and antiaging activity from dendropanax morbifera, cornus fruit and lycium chinense, and cosmetic composition containing the extract}
본 발명은 항산화 및 항노화 활성을 갖는 황칠나무, 산수유 및 구기자 혼합 추출물의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 초임계 이산화탄소 및 보조용매를 이용한 다단계 초임계 추출을 통해 황칠나무, 산수유 및 구기자로부터 항산화 및 항노화 활성을 갖는 혼합 추출물을 고효율로 추출하여 제조하는 방법에 관한 것이다.
사람의 피부는 노화 과정에서 다양한 물리화학적인 변화가 일어난다. 그 원인으로는 크게 내적인 노화(intrinsic aging)와 광노화(photo-aging)로 구분되며 이에 관한 연구가 활발히 이루어져 왔다. 자외선, 스트레스, 질병 상태, 환경 인자, 상처, 나이가 들어감에 따라 프리 라디칼(또는 활성 산소종)이 활성화될 수 있으며, 이런 상태가 심화될 경우 생체 내에 존재하는 항산화 방어망을 파괴하고, 세포 및 조직을 손상시켜 성인병 및 노화를 촉진하게 된다. 즉, 피부의 주요 구성 물질인 지질, 단백질, 다당류 및 핵산 등이 산화되어 피부 세포 및 조직이 파괴되고, 결국 피부 노화 현상이 생겨나는 것이다.
그러므로, 신체의 대사 과정 중 발생하는 프리 라디칼이나 자외선 조사, 염증 반응에 의해 매개되어 발생하는 프리 라디칼을 소거하여 세포막을 보호하고, 또 이미 손상 받은 세포는 활발한 신진 대사에 의해 재생시켜서 세포를 증식시켜야 피부는 빠르게 회복되고 건강한 피부를 유지할 수 있다.
상기 프리 라디칼, 특히 활성 산소종에 대한 구체적인 내용은 아래와 같다.
인간의 생체 내에서, 필요한 에너지 공급을 위해 끊임없이 일어나는 생화학 반응을 통해 발생하는 활성 산소종은 자기 방어 기구인 생체 내 소거 메카니즘에 의해 대부분 제거된다. 그러나 활성 산소종이 정상적으로 소거되지 않아 산화적 스트레스가 생체 내에 가해지면, 이들 활성 산소종은 세포 구성 성분들인 지질, 단백질, 탄수화물과 DNA의 산화적 손상 및 효소활성을 변화시켜 뇌졸중, 파킨슨씨 병과 같은 뇌 질환뿐만 아니라 심장질환, 허혈, 동맥경화 등과 같은 성인병 및 암 등의 각종 질병을 일으키는 원인이 된다. 또한 활성 산소종은 생체조직을 손상시킬 뿐만 아니라 앞서 언급한 바와 같이 노화를 촉진시키는 것으로 알려져 있다.
활성 산소종은 여러 신호전달 과정을 변경하여 유전자 발현, 세포흡착, 물질대사, 세포주기, 세포사멸에 영향을 주는 것으로 알려져 있으며, 활성 산소종이 유도하는 신호전달에는 mitogen-activated protein kinase (MAPK), nuclear factor-κB (NF-κB), phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K), p53, β-catenin/Wnt를 매개로 하는 신호전달이 알려져 있다. 최근, 활성 산소종에 의한 인체 내 손상을 보호하는 항산화, 항노화 물질에 대한 연구는 다양하게 이루어지고 있으며, 특히 식물에는 활성 산소종을 제거할 수 있는 항산화, 항노화 성분들이 다량 함유되어 있는 것으로 알려져 있으며, 과일, 야채, 차, 허브 등과 같은 식물로부터 얻어진 vitamin, 페놀화합물, 카로티노이드 등의 항산화, 항노화 물질에 대한 많은 연구가 보고되고 있다.
노화에는 상기와 같은 프리 라디칼 뿐만 아니라 콜라겐 분해효소인 기질 금속 단백질 분해 효소(Matrix Metalloproteinase; MMP)라는 효소도 관여한다. 즉, 생체 내에서 콜라겐과 같은 세포외기질의 합성과 분해는 적절하게 조절되나, 노화가 진행되면서 콜라겐 합성이 감소하고, 콜라겐을 분해하는 효소인 기질 금속 단백질 분해 효소(MMP)의 발현이 촉진되어 피부의 탄력이 저하되고 주름이 형성된다. 또한, 자외선 조사에 의해 이러한 분해 효소가 활성화되기도 한다.
그러므로, 세포 내에서 활성화가 유도되는 MMP 발현을 조절하거나 그 활성을 억제할 수 있는 물질의 개발이 요구되고 있다.
산수유 나무(Cornus officianalis)는 층층나무과(Cornaceae)의 낙엽교목으로 주로 국내에서는 중부이남 지역에 분포한다. 산수유 나무의 열매인 산수유는 한의학에 있어서 맛이 시고 성질은 약간 따뜻하며 간경, 신경에 좋고, 이뇨작용, 혈압강하작용, 단백질의 소화를 돕는 작용, 항암 및 항균작용 등이 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 보고된 산수유의 성분으로는 gallic acid, malic acid, tartaric acid, ursolic acid와 morronoside, loganin, sweroside와 같은 iridoid 배당체 등이 있으며, tannin류의 분리도 보고되었다. 산수유에 대한 연구로는 항산화, 항노화 연구, 항암물질 분리, 항균활성 분리, 영양성분 분석 등 다양한 기능성 관련 연구가 보고되고 있다. 단일성분에 관한 연구의 예시로서 loganin은 실험동물에서 활성 산소종을 감소시켜 산화적 스트레스를 완화시켜주며, 지질 합성 관련 분자의 발현을 억제하여 지질대사에도 작용하는 것으로 보고되고 있다. 또한 인지력 향상 기능도 가지는 것으로 알려져 있다. 최근 산수유에 대한 관심 증가로 산수유로부터 유효성분의 추출 방법 개발은 산업적으로 매우 중요하며, 유효성분의 존재 여부를 분석하는 것은 산업적 상품의 진위와 품질을 판정하는데 중요한 수단이 된다.
황칠나무(Dendropanax morbifera)는 두릅나무과 황칠나무속으로 동아시아, 말레이반도, 중앙 및 남아메리카 등에 약 75종이 분포되어 있으며 우리나라에는 1종이 분포되어 있다. 우리나라 황칠나무의 분포도를 보면 제주도, 전남 완도, 보길도, 대흑산도, 거문도, 전북 어청도, 경남일대 바닷가 등에서 자생하는 상록 활엽 교목으로 겨울에도 낙엽이 지지 않는 수종으로 수피에 상처를 주면 황색의 수지액이 나오는데 이것을 황칠(黃漆)이라고 한다.
황칠은 삼국시대부터 황제의 갑옷, 투구, 기타 금속 장식구의 황금색을 발하는 진귀한 도료로 사용되었으며, 옛 문헌상에도 황칠의 채취시기, 사용용도 등이 기록되어 있음을 확인할 수 있다. 황칠의 성분으로는 도료 성분인 비휘발 성분 66.7%, 방향성분 10.8%, 수분 8.1%, 고형분 14.4%로 구성되어 있고, 특히 정유분획으로 세스퀴테르펜(sesquiterpene)류의 β-쿠베벤(cubebene), β-셀리넨(selinene), δ-카디넨(cadinene)으로 이루어져 있다. 현재까지 황칠나무에 대하여 연구된 바로는 자연의 금색을 나타내는 공예품에 사용하는 도료의 원료와 황칠나무 잎 추출물 분획에서 항암, 항산화, 항노화, 간세포 재생, 당뇨치료 효과, 경조직 세포 재생 등과 방향 성분의 신경계에 대한 진정작용과 강장작용이 있으며, 황칠로부터 얻은 추출물에서 멜라닌을 생성하는 티로시아나제의 활성 억제 기능으로 미백효과에 도움을 준다고 알려져 있다.
구기자는 구기자나무(Lycium chinense Miller) 또는 영하구기(寧夏枸杞)(Lycium barbarum Linne)의 열매로서 예로부터 민간 치료제로 사용해 왔으며, 성상은 열매로서 한쪽이 뾰족한 방추상이며, 길이 6~20mm, 지름 3~10mm으로 외부는 적색 또는 어두운 적색이고 맨 끝은 작은 돌기 모양의 암술대 자국이 있으며 기부는 희 색의 열매꼭지 자국이 있다. 열매 껍질은 부드럽고 질기며 쭈글쭈글한 형태로서 과육은 육질이 부드럽고 물렁하다. 또한 열매 안에는 씨가 있는데 이는 20~50알 정도로 신장형에 가까우며, 납작하고 길이는 약 2mm, 너비 1~2mm로 연한 황색 또는 황갈색으로 약간의 냄새와 단맛이 있는 특징을 가지고 있다.
구기자의 성분으로는 carotenoids, choline, meliscic acid, zeaxanthin, physalin(dipalmity-zeaxanthin), betaine, β-sitosterol, vitamin B1, rutin과 불포화 지방산 등으로 기능성 성분이 다량 함유되어 있다. 이뿐만 아니라 항산화, 항노화효과, 항균효과, 간 기능 개선, 혈압강하 및 항당뇨, 면역증진, 혈중 콜레스테롤 저하, 심혈관 관련 질환 예방 및 항암효과 등의 다양한 연구가 보고되고 있다. 대표적으로 한약재 구기자의 주성분 중 대한약전에서는 구기자의 정량기준을 베타인(betaine)의 함량으로 설정하고 있으며, 이는 원래 엿기름, 사탕무우 등에 들어있는 결정성 알칼로이드로 아미노산의 한 종류로 인체의 대사 작용을 맡고 있는 간장에 좋을 뿐 아니라 해독제, 무산증, 위산결핍증, 동맥경화와 고혈압 예방 등의 약으로 쓰이고 있다.
이와 같이 다양한 생리활성 및 효과 등을 고려할 때, 황칠나무, 산수유 및 구기자 혼합물은 그 이용가치가 충분한 것으로 판단된다.
그러나 상기와 같은 천연물을 이용하기 위하여, 종래에는 대부분 열수추출법이나 용매추출법을 통한 추출방법을 이용해왔다. 이와 같은 추출방법은, 추출 후 복잡한 정제과정을 거치며 이로 인한 유기용매의 잔존, 용매의 제거 및 오일성분의 낮은 분리효과 등의 문제점들이 있다.
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 초임계 이산화탄소 및 보조용매를 이용한 다단계 초임계 추출을 통해 황칠나무, 산수유 및 구기자로부터 항산화 및 항노화 활성을 갖는 혼합 추출물을 고효율로 추출할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 초임계 추출을 이용한 항산화 및 항노화 활성을 갖는 황칠나무, 산수유 및 구기자 혼합 추출물의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 황칠나무, 산수유 및 구기자 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 및 항노화 효과를 갖는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 항산화 및 항노화 활성을 갖는 황칠나무, 산수유 및 구기자 혼합 추출물의 제조방법을 제공한다.
황칠나무, 산수유 및 구기자 건조 분쇄물을 포함하는 원료를 35℃ 내지 60℃의 온도 및 100bar 내지 250bar의 압력 하에서 초임계 이산화탄소로 1차 초임계 추출하는 단계(단계 1);
상기 1차 초임계 추출 진행된 원료를 35℃ 내지 60℃의 온도 및 상기 단계 1의 추출 압력에서부터 300bar 내지 450bar의 압력까지 압력을 증가시키면서 초임계 이산화탄소 및 보조용매로 2차 초임계 추출하는 단계(단계 2); 및
상기 2차 초임계 추출 진행된 원료를 35℃ 내지 60℃의 온도 및 상기 단계 2의 최종 압력 하에서 초임계 이산화탄소 및 보조용매로 3차 초임계 추출하는 단계(단계 3).
바람직하기로, 본 발명의 황칠나무, 산수유 및 구기자 혼합 추출물의 제조방법은 상기 단계 3 이후에 초임계 추출된 추출물을 여과하여 상층액을 회수하는 단계(단계 4)를 추가로 포함할 수 있다.
바람직하기로, 상기 단계 3 및 단계 4 사이에 초임계 추출된 추출물을 농축하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 상기 단계 1 및 단계 2를 통하여 황칠나무, 산수유 및 구기자 건조 분쇄물을 포함하는 원료에서 추출된 유지성분과 불순물을 회수하여 제거하고, 이어지는 단계 3의 초임계 이산화탄소 및 보조용매의 초임계 추출을 통해 항산화 및 항노화 활성을 갖는 혼합 추출물을 고순도로 수득할 수 있는 특징이 있다.
또한 황칠나무, 산수유 및 구기자 건조 분쇄물의 혼합 원료를 사용함으로써 개별 생물소재로부터 얻어진 추출물보다 다양한 유효성분을 포함하며, 높은 항산화 및 항노화 활성을 갖는 추출물을 수득할 수 있는 특징이 있다.
나아가 상기 황칠나무, 산수유 및 구기자 건조 분쇄물의 최적의 혼합 중량비를 제공함으로써 높은 항산화 및 항노화 활성을 갖는 혼합 추출물을 수득할 수 있는 특징이 있다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.
본 발명에 있어서, 상기 초임계 추출은 초임계 유체 추출법(supercritical fluid extraction, SFE)을 의미하는 것으로, 일반적으로 초임계 유체는 기체가 고온 고압 조건에서 임계점에 도달하였을 때 갖는 액체 및 기체의 성질을 지니고 있으며, 화학적으로 비극성 용매와 유사한 극성을 지니고 있으며 이러한 특성으로 인해 초임계 유체는 지용성 물질의 추출에 사용되고 있다.
이산화탄소는 초임계 유체기기의 작동으로 압력 및 온도가 임계점까지 이르는 과정을 거치면서 액체 및 기체의 성질을 동시에 지닌 초임계 유체가 되고 그 결과 지용성 용질에 대한 용해도가 증가한다. 초임계 이산화탄소가 일정량의 원료를 함유한 추출 용기를 통과하게 되면 시료에 함유된 지용성 물질인 유지성분과 그 외 다양한 물질들이 초임계 이산화탄소에 의해 추출되어 나온다. 특히 원료로부터 유지성분이 추출되어 제거되는 것을 탈지라 한다.
유지성분을 추출한 후 추출 용기에 남아있는 원료(탈지된 원료)에 다시 소량의 보조용매가 함유된 초임계 이산화탄소를 흘려 통과시키면 순수한 초임계 이산화탄소만으로는 추출되지 않았던 성분들이 추출되어 나오게 할 수 있다. 특히 본 발명은 상기와 같은 방법을 통해, 활성이 다소 떨어지는 유지성분과 기타 불순물을 먼저 분리하고, 탈지된 원료로부터 순수한 초임계 이산화탄소만으로는 추출되지 않는 활성물질을 고순도로 얻을 수 있다는 특징이 있다.
본 발명에 있어서, 상기 황칠나무는 황칠나무의 다양한 기관 또는 부분(예를 들어 잎, 꽃, 뿌리, 줄기, 가지, 껍질 및 종자 등)을 의미하고, 바람직하게는 잎, 줄기, 가지, 껍질 또는 뿌리를 의미하고, 가장 바람직하게는 줄기를 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 산수유는 활성성분들이 주로 열매 부위에 다량 함유되어 있기 때문에, 바람직하게는 산수유 나무의 열매를 의미하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 구기자는 활성성분들이 주로 열매 부위에 다량 함유되어 있기 때문에, 바람직하게는 구기자 나무의 열매를 의미하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용하는 용어 "건조 분쇄물"은 상기 황칠나무, 산수유 및 구기자 각각을 건조시키고 분쇄시킨 결과물을 의미한다.
구체적으로 본 발명의 일 구현예로서, 황칠나무, 산수유 및 구기자 각각을 열풍 건조하고 핀형 분쇄기를 사용하여 분쇄할 수 있다. 상기 열풍 건조는 열풍건조기를 이용하여 건조하는 방식을 의미하며, 50 내지 60℃의 온도 범위에서 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 열풍 건조는 수일 동안, 바람직하기로 1 내지 3일 동안 수행될 수 있으며, 이는 각각의 수분 함량에 따라 적절히 조절될 수 있다.
상기 분쇄는 핀형 분쇄기를 사용하여 0.5 내지 2㎜ 크기의 입자로 분쇄할 수 있다. 만일 상기 분쇄 시 입자 크기가 상기 범위 밖일 경우, 추출 효율이 떨어지는 단점이 있다. 특히, 0.5㎜ 미만의 입자 크기에서는 초임계유체 추출 시 압력 부하로 인하여 추출 효율이 떨어지게 되고 2㎜ 보다 큰 입자 크기에서는 입자 속에 포함되어 있는 유효물질이 초임계유체에 의해 외부로 추출되기 어려워 결과적으로 유효물질의 추출 효율이 떨어지는 단점이 있다.
바람직하기로, 상기 건조 분쇄물은 0.5㎜ 내지 1㎜의 입자 크기를 가질 수 있다.
본 발명에서는 상기 언급한 황칠나무 건조 분쇄물, 산수유 건조 분쇄물 및 구기자 건조 분쇄물을 혼합하여 초임계 추출을 위한 원료로 사용할 수 있다. 이들의 혼합은 각각의 건조 분쇄물을 제조한 뒤 이루어지거나, 혼합한 뒤 건조 분쇄하여 혼합 건조 분쇄물을 제조할 수 있으며, 특별히 순서에 제한이 되지 않는다.
구체적으로, 상기 원료는 황칠나무 건조 분쇄물 : 산수유 건조 분쇄물 : 구기자 건조 분쇄물이 1~2 : 1~3 : 1의 중량비를 갖도록 혼합할 수 있으며, 가장 바람직하기로 2 : 3 : 1의 중량비를 갖도록 혼합할 수 있으며, 이러한 비율을 가질 때, 각각의 개별 생물소재에 비하여 더욱 우수한 항산화 및 항노화 활성을 갖는 추출물을 제조할 수 있다.
상기 단계 1은, 황칠나무, 산수유 및 구기자 건조 분쇄물을 포함하는 원료를 35℃ 내지 60℃의 온도 및 100bar 내지 250bar의 압력 하에서 초임계 이산화탄소로 1차 초임계 추출하는 단계로서, 비교적 저압의 압력조건 하에서 황칠나무, 산수유 및 구기자 건조 분쇄물을 포함하는 원료에 함유된 유지성분 및 불순물을 주로 추출하여 제거하는 단계이다.
상기 유지성분은 대표적으로 지질 및 지방과 같은 지용성 물질을 의미한다. 이들은 본 발명이 목적하는 항산화 및 항노화 활성을 갖는 유효성분의 함량이 낮고, 항산화 및 항노화 활성을 저해하는 요인으로 작용할 수 있다. 따라서 본 발명은 이들을 탈지하는 단계로서 이산화탄소만으로 1차 초임계 추출을 수행함으로써, 유지성분을 효율적으로 추출하여 제거할 수 있다.
또한 상기 단계 1을 통하여 원료에 포함된 다양한 불순물 역시 함께 추출되어 제거할 수 있다. 상기 불순물은 항산화 및 항노화 활성을 갖는 유효성분을 제외한 각종 물질로서, 나아가 추출물의 항산화 및 항노화 활성을 저해시킬 수 있는 성분들을 의미한다.
단계 1에서 추출된 유지성분 및 불순물을 포함하는 추출물은 회수하여 제거하거나 필요에 따른 용도로 재활용할 수 있다.
바람직하기로, 상기 단계 1은 약 30분간 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 단계 2는, 상기 1차 초임계 추출 진행된 원료를 35℃ 내지 60℃의 온도 및 상기 단계 1의 추출 압력에서부터 300bar 내지 450bar의 압력까지 압력을 증가시키면서 초임계 이산화탄소 및 보조용매로 2차 초임계 추출하는 단계로서, 상기 단계 1과 마찬가지로 원료에 잔류하는 유지성분 및 불순물을 주로 추출하여 제거하는 단계이다. 나아가 상기 단계 2는, 유효 활성성분 추출을 위한 최종적 단계(단계 3)의 목적 압력과 온도에 다다르도록 설정하는 중간 단계의 의미를 갖는다.
구체적으로, 상기 단계 2는 상기 단계 1에 이어지면서 단계 1과 단계 3의 중간 단계로서의 역할을 하며, 단계 1의 추출 압력에서부터 비교적 고압의 압력조건인 300bar 내지 450bar의 압력까지 압력을 서서히 증가시키면서 진행될 수 있다. 또한 단계 2의 진행동안 공급되는 초임계 이산화탄소에 보조용매를 추가로 투입하여 공급시킬 수 있다. 이를 통하여 원료에 잔류하는 유지성분을 및 불순물을 상당히 제거할 수 있으며, 나아가 이어지는 단계 3에서 고순도의 항산화 및 항노화 성분을 고효율로 추출할 수 있게 할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 단계 2는 보조용매로서 에탄올(Ethanol)을 첨가하면서 수행될 수 있다. 이때 초임계 추출 장치에 있어서, 온도는 35 내지 60℃ 및 압력은 300 내지 450bar로 설정하여, 압력을 서서히 증가시키면서 보조용매인 에탄올을 초임계 이산화탄소와 함께 추출조로 흘려 보낸다. 이때 보조용매로 사용한 에탄올은 초임계 추출 장치의 관벽에 남아있는 잔류 오일(유지성분)까지 제거할 수 있는 효과가 있다.
상기 단계 1과 마찬가지로, 단계 2에서 추출된 유지성분 및 불순물을 포함하는 추출물을 회수하여 제거하거나 필요에 따른 용도로 재활용할 수 있다.
바람직하기로, 상기 단계 2는 약 30분에 걸쳐서 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 단계 3은, 상기 2차 초임계 추출 진행된 원료를 35℃ 내지 60℃의 온도 및 상기 단계 2의 최종 압력 하에서 초임계 이산화탄소 및 보조용매로 3차 초임계 추출하는 단계로서, 상기 단계 1 및 단계 2를 통하여 항산화 및 항노화 활성을 저해하는 유지성분과 불순물이 상당량 제거된 원료로부터 항산화 및 항노화 성분을 고순도 및 고효율로 추출하여, 그 추출물을 수득하는 단계이다.
특히 상기 단계 3은 활성 성분 추출을 위한 최적의 온도와 압력 하에서, 보조용매의 사용을 통해 순수한 초임계 이산화탄소만으로는 추출되지 않았던 활성 성분들이 추출되어 나오게 할 수 있는 특징이 있다.
바람직하기로, 상기 단계 3은 약 120분간 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하기로, 상기 단계 1 내지 단계 3의 초임계 이산화탄소는 5 ㎖/min 내지 60 ㎖/min의 체적유량으로 공급될 수 있고, 추출시간 대비 보다 많은 양의 추출물을 얻기 위하여 30 ㎖/min 내지 60 ㎖/min의 체적유량으로 공급됨이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 체적유량은 이산화탄소 봄베이에서 나온 액화 이산화탄소가 초임계 고압펌프 전단계까지의 압력과 온도 상태에서 이산화탄소가 갖는 체적을 기준으로, 단위시간당 추출조 내로 들어가는 체적을 의미한다.
본 발명에서 사용하는 용어 "보조용매"는 초임계 이산화탄소와 함께 사용되는 유기용매를 의미하며, 이들의 복합으로 유효성분인 항산화 및 항노화 활성 성분을 보다 효율적으로 추출할 수 있다.
상기 단계 2 및 단계 3의 보조용매는 전체 초임계 이산화탄소와의 혼합물 중 1 내지 30 부피%의 부피로 사용 가능하며, 바람직하기로는 10 부피%의 양으로 사용하는 것이 추출 효율면에서 바람직하다.
사용가능한 보조용매로는 에탄올, 메탄올, 클로로포름, 물, 에틸아세테이트, 헥산 및 디에틸에테르로 이루어진 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물을 사용할 수 있으며, 바람직하기로 에탄올을 사용할 수 있다.
상기 단계 4는 상기 단계 1 내지 3을 통하여 초임계 추출된 추출물을 여과하여 상층액을 회수하는 단계로서, 여과된 추출물 중 바닥의 침전물을 제외한 순도높은 상층액을 유효성분으로 회수하는 단계이다. 이는 최종 추출물 내에서도 상층액 부분이 항산화 및 항노화 활성이 보다 우수하기 때문이다.
구체적으로, 초임계 추출된 추출물의 여과는 각종 공지된 필터를 이용해 수행될 수 있으며, 종이 필터를 사용하는 것이 여과 효율과 경제적 측면에서 바람직하나, 이에 제한되는것은 아니다.
나아가, 상기 단계 3 및 단계 4 사이에 초임계 추출된 추출물을 농축하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 이는 추출된 황칠나무, 산수유 및 구기자 혼합 추출물 내 보조용매를 제거하기 위하여 추출물을 농축시키는 단계이다.
상기 농축은 당업계에 알려져 있는 통상의 농축기를 이용하여 수행 가능하다.
본 발명의 황칠나무, 산수유 및 구기자 혼합 추출물의 제조방법은 유지성분 등의 불순물을 제거하기 위한 단계 1 및 단계 2를 거침으로써, 단계 3에서 추출된 추출물이 단계 1 및 단계 2에서 추출된 추출물보다 항산화 및 항노화 활성이 더 우수함을 확인할 수 있었다.
또한 본 발명의 실험예를 통해, 본 발명의 제조방법에 따른 황칠나무, 산수유 및 구기자 혼합 추출물은 우수한 항산화(실험예 1 내지 3), 항노화(실험예 5) 활성을 갖으며, 나아가 엘라스틴 분해 효소인 Elastase 및 콜라겐 분해 효소인 MMP-1의 발현을 억제하는 효과를 갖음을 확인하였다.
특히 본 발명의 제조방법에 따른 황칠나무, 산수유 및 구기자 혼합 추출물은 기존의 용매추출 및 열수추출에 비해 현저히 높은 항산화 및 항노화 활성을 갖으며, 나아가 원료 내의 황칠나무 : 산수유 : 구기자 = 2 : 3 : 1의 혼합 중량비를 갖을때 가장 우수한 효과를 보임을 확인하였다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 황칠나무, 산수유 및 구기자 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 및 항노화 효과를 갖는 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 황칠나무, 산수유 및 구기자 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 및 노화 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
전술한 제조방법을 통하여 추출 및 수득된 황칠나무, 산수유 및 구기자 혼합 추출물을 포함하는 화장료 조성물은 높은 항산화 및 항노화 활성을 가지므로 피부 주름 및 노화 개선에 효과적인 특징이 있다.
구체적으로, 상기 추출물은 우수한 프리 라디칼 소거능을 갖고, 자외선에 의한 피부세포 손상을 억제하며(광노화 억제), 엘라스틴 분해 효소인 Elastase 및 콜라겐 분해 효소인 MMP-1의 발현을 억제하는 효과를 갖음으로써 피부 주름 및 노화 개선용 화장료 조성물로 사용될 수 있다.
예를 들면, 상기 추출물은 화장수, 스킨, 로션, 크림, 겔, 연고, 페이스트, 분말 파운데이션, 세럼, 유탁액 파운데이션, 에센스, 페이스트, 분말, 스프레이, 수증유(O/W)형 또는 유증수(W/O)형과 같은 제형으로 제형화 될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 상기 화장품 제형에 있어서 수용가능한 담체를 포함할 수 있다. 여기서, "화장품 제형에 있어서 수용가능한 담체"란 화장품 제형에 포함될 수 있는 이미 공지되어 사용되고 있는 화합물 또는 조성물이거나 앞으로 개발될 화합물 또는 조성물로서 피부와의 접촉시 인체가 적응 가능한 이상의 독성, 불안정성 또는 자극성이 없는 것을 말한다.
상기 담체는 본 발명의 화장용 조성물 전체 중량에 대하여 약 1 중량 ％ 내지 약 99.99 중량 ％, 바람직하게는 조성물의 중량의 약 90 중량％ 내지 약 99.99 중량 ％로 포함될 수 있다. 그러나 상기 비율은 본 발명의 화장용 조성물이 제조되는, 전술한 제형에 따라 또 그것의 구체적인 적용 부위(얼굴, 목 등)나 그것의 바람직한 적용량 등에 따라 달라지는 것이기 때문에, 상기 비율은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.
한편, 상기 담체로서는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선 차단제, 발색제, 향료 등이 예시될 수 있다. 상기 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선 차단제, 발색제, 향료로 사용될 수 있는 화합물/조성물 등은 이미 당업계에 공지되어 있기 때문에 당업자라면 적절한 해당 물질/조성물을 선택하여 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구현예로서, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 상기 가지 추출물 이외에 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글키롤, 폴리옥시에틸렌 경화피마자유, 에탄올, 트리에탄올아민 등을 포함할 수 있으며, 방부제, 항료, 색소, 정제수 등을 필요에 따라 미량 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 화장료 조성물은 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 그리고, 상기의 성분들은 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.
전술한 제조방법을 통하여 추출된 추출물의 화장료 조성물로의 응용은 예시적이며, 당업자라면, 본 발명의 범위 내에서, 상기 추출물의 항산화 및 항노화 활성에 따른 피부 주름 및 노화 개선 효과에 기초하여, 피부, 두피 및 음용될 수 있는 제약이나 샴푸 및 비누와 같은 세제, 식품 및 음료 등으로 제품화될 수 있으며, 이 또한 본 발명에 포함됨을 이해하여야 한다.
본 발명은 초임계 이산화탄소 및 보조용매를 이용한 다단계 추출을 통하여 황칠나무, 산수유 및 구기자 혼합 원료로부터 항산화 및 항노화 활성을 갖는 혼합 추출물을 고순도로 제조하는 방법을 제공할 수 있으며, 상기 추출물은 우수한 프리 라디칼 소거능을 갖고, 자외선에 의한 피부세포 손상을 억제하며(광노화 억제), 엘라스틴 분해 효소인 Elastase 및 콜라겐 분해 효소인 MMP-1의 발현을 억제하는 효과를 갖음으로써 피부 주름 및 노화 개선용 화장료 조성물로 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예 및 비교예에 따른, 원료 혼합 비율별, 추출 단계별로 추출된 추출물을 보여주는 사진도이다. 도 1 (A) 내지 (C)는 비교예 1 내지 3에서 얻어진 추출물의 모습이고, 도 1 (D) 내지 (F)는 비교예 4 내지 6에서 얻어진 추출물의 모습이고, 도 1 (G) 내지 (H)는 비교예 7, 8 및 실시예 1에서 얻어진 추출물의 모습이다.
도 2는 본 발명의 실시예 및 비교예에 따른 추출물에 대한 DPPH 라디칼 소거능에 대한 모니터링 실험의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 실시예 1-1 및 실시예 1-2에서 얻어진 추출물에 대한 DPPH 라디칼 소거능에 대한 모니터링 실험의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 실시예 1-1 및 실시예 1-2에서 얻어진 추출물에 대한 유사항산화(SOD-like)저해능 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 실시예 1-1 및 실시예 1-2에서 얻어진 추출물에 대한 농도별 세포독성(MTT assay) 평가 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 실시예 1-1에서 얻어진 추출물의 자외선으로 유도된 HS68 세포의 산화적 손상에 대한 항노화 효능 분석 결과이다.
도 7은 본 발명의 실시예 1-1에서 얻어진 추출물에 대한 MMP-1 저해활성 측정 분석 결과이다.
도 8은 본 발명의 실시예 및 비교예에 따른 추출물에 대한 지표성분(로가닌)을 HPLC로 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 구체적으로, 도 8a는 지표성분(로가닌), 실시예 1, 비교예 1 및 비교예 2에 대한 HPLC결과이며, 도 8b는 비교예 3 내지 비교예 8에 대한 HPLC결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
비교예 1 내지 7 및 실시예 1: 황칠나무, 산수유 및 구기자 건조 분쇄물의 다단계 초임계 추출
황칠나무, 산수유 및 구기자 건조 분쇄물을 1:1:1, 1:2:1 및 2:3:1 중량비로 혼합한 원료로부터 항산화 및 항노화 활성이 높은 성분을 효율적으로 얻기 위하여 다단계를 통한 초임계유체 추출 방법을 이용하였으며, 상기 단계에는 활성이 낮은 오일(유지) 성분을 제거하는 탈지 단계가 포함되었다. 이때 각각의 추출 단계에서 얻어지는 추출물을 모두 샘플로서 수득하였다.
전처리로, 황칠나무, 산수유 및 구기자 혼합물을 60℃에서 1일 동안 열풍 건조한 후 핀형분쇄기를 이용하여 0.5㎜m의 입자 크기로 분쇄함으로써 혼합 추출 원료를 준비하였다. 상기 원료는 황칠나무, 산수유 및 구기자 건조 분쇄물이 각각 1:1:1의 중량비, 1:2:1의 중량비 및 2:3:1의 중량비를 갖는 세가지 원료 샘플로서 준비되었다.
첫 번째 단계로, 상기 전처리된 원료 각각을 150 g의 양으로 주입하고 초임계 추출 장치(ISA-SCFE-0050-0100-080-re, 일신오토클레이브, 한국)를 이용하여 50℃에서, 압력을 150bar로 조절하여 1차 초임계 추출을 실시하였다. 초임계 이산화탄소의 유량은 60 ㎖/min으로 30분 동안 추출하였으며(SFE 추출법), 여기서 추출된 추출물을 회수하여 샘플로서 수득하였다(비교예 1, 비교예 4, 비교예 7).
두 번째 단계로, 첫 번째 단계에 이어서 초임계 추출 장치의 압력을 조절하여 150bar에서부터 400bar까지 천천히 압력을 상승시킴과 동시에, 초임계 이산화탄소뿐만 아니라 보조용매로 에탄올(주정)을 추가로 공급하여 상기 1차 추출을 거친 원료의 2차 추출을 실시하였다. 이때 초임계 이산화탄소의 유량은 첫 번째 단계와 동일하게 유지시킨 상태로, 보조용매인 에탄올의 유량은 3 ㎖/min으로 30분 동안 추출하였으며, 여기서 추출된 추출물을 회수하여 샘플로서 수득하였다(비교예 2, 비교예 5, 비교예 8).
세 번째 단계로, 50℃에서 압력은 400bar인 상태로 초임계 이산화탄소 및 보조용매인 에탄올을 공급하여 상기 2차 추출을 거친 원료의 3차 추출을 실시하였다(SFE with co-solvent). 세 번째 단계의 각각의 유체에 대한 유량은 전술한 두 번째 단계와 동일하며, 120분 동안 추출하였으며, 여기서 추출된 추출물을 회수하여 샘플로서 수득하였다(비교예 3, 비교예 6, 실시예 1).
상기 각각의 단계에 대하여, 초임계 추출이 완료되면 초임계 추출 장치의 추출조 압력을 낮춰 초임계유체 상태를 해제하여 추출물을 샘플로서 회수하였다. 상기 회수된 각각의 단계에 대한 샘플들을 농축기를 이용하여 농축하였다.
이들 각각에 대하여 하기 표 1에 나타내었다.
번호 황칠나무, 산수유, 구기자 건조 분쇄물 중량 혼합비 추출 온도
(℃)		 추출 압력
(bar)		 추출 시간
(min)		 보조용매
(에탄올)
비교예 1
(1차 추출)		 1 : 1 : 1 50 150 30 1차+2차+3차:
총 180분		 -
비교예 2
(2차 추출)		 50 150 부터
400 까지		 30 3 ㎖/min
비교예 3
(3차 추출)		 50 400 120 3 ㎖/min
비교예 4
(1차 추출)		 1 : 2 : 1 50 150 30 1차+2차+3차:
총 180분		 -
비교예 5
(2차 추출)		 50 150 부터
400 까지		 30 3 ㎖/min
비교예 6
(3차 추출)		 50 400 120 3 ㎖/min
비교예 7
(1차 추출)		 2 : 3 : 1 50 150 30 1차+2차+3차:
총 180분		 -
비교예 8
(2차 추출)		 50 150 부터
400 까지		 30 3 ㎖/min
실시예 1
(3차 추출)		 50 400 120 3 ㎖/min
실시예 1-1 및 실시예 1-2: 상층액과 하층액의 분리회수
상기 3차 추출의 결과물인 실시예 1의 농축 샘플을 종이 필터(Whatman filter papers No. 1)를 이용하여 여과하였다. 그 후, 샘플의 상층액(실시예 1-1)을 회수하고, 침전물이 다소 포함된 하층액(실시예 1-2)을 각각 회수하였다.
실험예 1: 초임계 유체 추출 조건에 따른 추출물의 DPPH 라디칼 소거능 실험 분석
상기 비교예 1 내지 8 및 실시예 1에서 얻어진 추출물 샘플에 대하여 DPPH 라디칼 소거 실험을 실시하였다. DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)는 그 자체가 매우 안정한 프리 라디칼(Free radical)로써, 517㎚에서 특정적인 광흡수를 나타내는 진한 보라색의 화합물을 측정하며, 라디칼 소거활성이 있는 항산화제에 의해 정량적으로 탈색됨으로 인해 항산화 활성을 쉽게 측정할 수 있다. 이러한 라디칼에 의한 소거활성은 지질과산화 억제활성을 비롯한 항산화 활성과의 상관관계를 보이므로 항산화제 검색에 널리 이용되고 있다.
상기 비교예 1 내지 8 및 실시예 1의 추출물 샘플의 항산화 활성 측정 (Electron donating abilities, EDA)은 Blois의 방법을 변형하여 측정하였다. 각 시료용액 2.0 ㎖에 0.2 mM의 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 0.5 ㎖를 넣고 교반한 후 30분간 방치한 다음 517㎚에서 흡광도를 측정하였다. 전자공여 효과는 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다. 결과적인 프리 라디칼 소거능을 하기의 수학식 1에 의하여 계산하였다.
[수학식 1]
프리 라디칼 소거활성(%)= {1-(B/A)}×100
A: 비교예 1 내지 8 및 실시예 1의 추출물 샘플을 처리하지 않은 대조군 웰의 흡광도
B: 비교예 1 내지 8 및 실시예 1의 추출물 샘플을 처리한 실험군 웰의 흡광도
그 결과를 하기 표 2 및 도 2에 나타내었다.
비교예 1 비교예 2 비교예 3 비교예 4 비교예 5 비교예 6 비교예 7 비교예 8 실시예 1
프리 라디칼 소거활성
(%)		 14.9 80.86 25.24 33.25 45.04 87.31 45.6 54.94 88.90
상기 결과를 통하여 실시예 1이 가장 우수한 DPPH 라디칼 소거능을 나타냄을 확인할 수 있었다.
실험예 2: 실시예 1-1 및 실시예 1-2 추출물의 DPPH 라디칼 소거능 실험 분석
상기 실험예 1에서 확인하였듯이, 실시예 1의 추출물이 가장 우수한 프리 라디칼 소거능을 나타냄에 따라, 실시예 1의 추출물의 상층액(실시예 1-1)과 하층액(실시예 1-2)의 추가적인 DPPH 라디칼 소거능 실험을 수행하였다.
실시예 1-1 및 실시예 1-2 추출물 샘플 각각에 대하여, 1 ㎎/㎖, 0.5 ㎎/㎖, 0.25 ㎎/㎖, 0.125 ㎎/㎖ 및 0.0625 ㎎/㎖로 희석된 농도별로 상기 실험예 1과 동일하게 실험을 수행하였다.
그 결과를 하기 표 3 및 도 3에 나타내었다.
프리 라디칼 소거활성(%)
실시예 1-1 실시예 1-2
1.000 ㎎/㎖ 86.564 74.450
0.500 ㎎/㎖ 73.450 43.676
0.250 ㎎/㎖ 38.550 20.756
0.125 ㎎/㎖ 27.570 14.072
0.0625 ㎎/㎖ 30.649 2.060
상기 실험결과를 통하여, 실시예1-1의 추출물 샘플이 실시예 1-2의 추출물 샘플보다 더 우수한 프리 라디칼 소거활성을 갖으며, 실시예1-1의 추출물 샘플은 농도 의존적으로 프리 라디칼 소거활성이 증가함을 확인하였다.
실험예 3: 실시예 1-1 및 실시예 1-2 추출물의 유사항산화(SOD-like)저해능 측정 실험
상기 실시예 1-1 및 실시예 1-2에서 얻어진 추출물 샘플에 대하여 SOD 효소 활성을 측정하였다. SOD assay Kit-WST를 이용하여 지시(메뉴얼)대로 측정하였으며, 96-well plate에 상기 추출물 샘플을 넣고 WST-1 (2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium, mono-sodium salt)과
잔틴산화효소(xanthine oxidase) working solution을 첨가한 후 37℃에서 20분간 인큐베이션한 다음 마이크로플레이트 리더(microplate reader)에서 450㎚ 파장을 측정하였다
유사항산화 활성(SOD-like activity)은 하기의 수학식 2에 따라 계산하였다.
[수학식 2]
유사항산화(SOD-like)저해능(%) = [[(A1-A3)-(AS-A2)]/(A1-A3)]×100
여기서 A1, A2, A3, AS는 각각 uninhibited test, blank sample, blank reagent, 그리고 sample의 측정값을 넣어 계산하였다.
그 결과를 하기 표 4 및 도 4에 나타내었다.
유사항산화(SOD-like)저해능(%)
실시예 1-1 실시예 1-2
1.000 ㎎/㎖ 32.97 25.71
0.500 ㎎/㎖ 25.15 20.18
0.250 ㎎/㎖ 17.76 10.59
0.125 ㎎/㎖ 9.24 4.39
0.0625 ㎎/㎖ 2.07 1.38
상기 실험예 2의 DPPH 라디칼 소거활성 결과와 마찬가지로, 유사항산화 저해능 실험결과, 실시예1-1의 추출물 샘플이 실시예 1-2의 추출물 샘플보다 더 우수한 유사항산화 저해능을 갖으며, 실시예1-1의 추출물 샘플은 농도 의존적으로 항산화 효능이 증가함을 알 수 있었다.
실험예 4: 실시예 1-1 및 실시예 1-2 추출물의 농도별 세포독성( MTT assay ) 평가 측정 실험
상기 실시예 1-1 및 실시예 1-2에서 얻어진 추출물 샘플에 대하여 샘플의 농도별 세포독성(MTT assay) 평가 측정 실험을 수행하였다.
HS68 세포를 48-well plate에 4×104 cells/well로 분주한 다음 24시간 후에 FBS를 포함하지 않는 배지로 교환하여 24시간 동안 배양한 후, 상기 실시예 1-1 및 실시예 1-2에서 얻어진 추출물 샘플을 처리한 다음 24시간 후에 배지를 제거하고 PBS로 워싱(washing) 하였다. 그 후 PBS 200 ㎕를 well에 분주 후 자외선 B를 120 mJ/cm2로 조사하였으며, 자외선 B 조사 후에 PBS를 제거하고 배지로 교환한 후 추출물을 처리한 다음 24시간 후에 배지를 제거하고 MTT 용액 (MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide])을 넣고 24시간 동안 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 배양 후 MTT 용액을 제거하고 생성된 formazan crystal을 DMSO에 녹여 Titertek Multiskan Automatic ELISA microplate reader로 570㎚에서 흡광도를 측정하였다. 이는 노란색의 tetrazolium이 살아있는 세포의 미토콘리아 효소에 의해 보라색의 formazan으로 변환되는 것을 측정하는 분석 방법이다.
그 결과를 하기 표 5 및 도 5에 나타내었다.
세포생존률(%)
실시예 1-1 실시예 1-2
0 ppm 98.75 99.50
10 ppm 103.50 96.75
100 ppm 98.00 101.50
200 ppm 84.75 98.50
300 ppm 84.50 103.25
그 결과, 실시예 1-1의 추출물은 100ppm 까지는 세포가 98%까지 생존하므로, 100ppm의 농도까지는 세포독성을 나타내지 않음을 확인하였다. 그러나 농도가 200 내지 300 ppm으로 진해졌을때는 세포생존률이 약 84%정도로 감소하여, 세포독성이 다소 나타남을 확인하였다.
실험예 5: 실시예 1-1 추출물의 RNA 추출 ? RT - PCR 에 따른 HS68 세포의 산화적 손상에 대한 항노화 효능 분석
상기 실시예 1-1에서 얻어진 추출물 샘플에 대하여 자외선으로 유도된 HS68 세포의 산화적 손상에 대한 항노화 효능 분석을 위한 RNA추출 ? RT-PCR 실험을 수행하였다.
Total RNA의 추출은 TRIzol Reagent(Invitrogen 사)를 사용하여 제시된 방법에 따라 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA로 부터 cDNA 합성은 M-MLV Reverse Transcriptase를 사용하여 합성하였으며, 효소들의 유전자 발현을 비교 측정하기 위하여 PCR을 진행하였다. PCR 조건은 95℃에서 5분간 진행한 후 95℃ 30초, 53-61℃ 1분, 72℃ 1분을 40 cycle 수행 후 72℃ 5분간 더 반응시켰고 각 PCR 산물들은 edithium bromide를 포함하고 있는 1.5% 아가로오스 겔(agrose gel)에서 50 V로 전기영동 한 후 Image analysis 장비를 사용하여 type 1 collagen과 type 1 procollagen 노화관련 유전자 발현을 측정하였으며, Quantity One Software를 이용하여 분석하였다. 실험에 사용된 노화관련 단백질의 특정 프라이머(primer) 서열은 하기의 표와 같다.
그 결과를 하기 도 6에 도시하였다.
Figure 112013041599938-pat00001
본 실험에서 HS68 세포에 자외선 B를 노출시킨 경우 type Ⅰ collagen 및 type Ⅰ procollagen의 mRNA 합성이 현저히 감소되었으나, 실시예 1-1에서 얻어진 추출물을 처리하였을 때 type Ⅰ collagen 및 type Ⅰ procollagen의 mRNA 합성이 증가한 것을 관찰할 수 있었다.
결과적으로, 광노화에 의한 collagen의 감소는 깊은 주름과 같은 피부노화와 직접적으로 연관이 있고 할 수 있는데, 상기 실시예 1-1의 추출물은 이러한 광노화에 따른 피부 주름 및 노화 개선효과가 있음을 확인할 수 있었다.
실험예 6: 실시예 1-1 추출물의 MMP -1 저해활성 측정 분석
상기 실시예 1-1에서 얻어진 추출물 샘플에 대하여 MMP-1 저해활성을 측정하였다.
피부세포의 결합 조직을 구성하는 성분 중 콜라겐(collagen)은 피부 건조 중량의 90% 정도를 차지하는 주요 구성 단백질이다. 따라서 콜라겐의 분해는 결합 조직의 탄력 저하와 주름 생성 등에 직접적인 영향을 미치게 된다. 체내에서 생성되는 수종의 MMPs 가운데 MMP-1은 콜라겐에 특이적으로 작용하는 단백질 분해 효소(protease)로써, MMP-1의 활성을 억제하여 콜라겐의 분해를 감소시키면, 피부 조직의 탄력을 유지하고 주름 생성을 예방할 수 있다.
피부섬유아세포를 2×106개/2㎖의 세포를 6-well plate에 접종하였다. 그 후 각 well에 실시예 1-1의 추출물 샘플을 세포 독성이 미치지 않았던 100ppm으로 세포에 전처리하였으며, 비교군으로서 Vitamin C도 세포독성을 나타내지 않는 0.1ppm으로 전처리하였다. 그다음 CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하였으며, 이때 MMP-1의 활성을 높이기 위하여 TNF-α를 10 ng/㎖의 농도로 첨가하여 추가 처리하였다. 세포의 배양액을 수거하여 실험에 사용하였으며, Gross B. E.의 방법에 따라 Matrix Metalloproteinase-1 Biotrack activity Assay Kit (Amersham Bioscience)을 이용하여 플레이트 리더(plate reader)로 450㎚에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과를 하기 표 7 및 도 7에 나타내었다.
MMP-1 수준 (ng/㎖)
Con(-) TNF-α 실시예 1-1 Vit. C
ppm 14.6 37.5 35.7 21.4
실험 결과, MMP-1활성도를 높이기 위해 처리되었던 TNF-α를 단독으로 처리한 군은 MMP-1 수준이 증가한 것을 관찰할 수 있었으며, 반면 추출물을 처리한 군에서는 MMP-1 수준이 TNF-α 단독 처리군 보다 약 2.2% 감소되게 나타났으며, 이는 실시예 1-1의 추출물이 콜라겐 분해에 영향을 미치는 MMP-1의 활성을 억제함으로써 피부노화를 억제할 수 있다는 것을 확인하였다.
실험예 7: 실시예 1-1 추출물의 Elastase 저해활성 측정 분석
상기 실시예 1-1에서 얻어진 추출물 샘플에 대하여 Elastase 저해활성을 측정하였다.
Elastase는 진피 내 피부탄력을 유지하는 기질 단백질인 엘라스틴(elastin)의 분해에 관련되며, 콜라겐을 분해할 수 있는 비특이적 가수분해 효소이며, 또한 조직파괴의 직접적인 원인이 되고, 피부의 주름 및 탄력성 소실 등을 유발한다. 따라서, elastase 저해제는 피부의 주름을 개선하는 효과를 갖는다고 볼 수 있다.
상기 추출물 샘플의 elastase 저해활성은 James의 방법에 따라 측정하였다. 즉, 0.05 M Tris-HCl buffer (pH 8.2)에 기질인 0.5 mM N-succinyl-Ala-Ala-Ala-pnitroniline (Sigma)를 용해시킨 후, 추출물 샘플과 효소인 elastase (1 unit/㎖, Sigma) 용액을 첨가하였고, 이 혼합액을 25℃에서 10분간 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 415㎚에서 흡광도를 측정하였다.
Elastase 억제율에 대한 결과를 하기 표 8에 나타내었다.
실시예 1-1
(100 ppm/ ㎖)		 Vit. C
(0.1 ppm/ ㎖)
Elastase 억제율 (%) 21.9±4.2 75.5±2.4
실험예 8: 비교예 1 내지 7 및 실시예 1의 추출물의 지표성분 HPLC 분석
상기 비교예 1 내지 7 및 실시예 1에서 얻어진 추출물 샘플에 대하여, 추출물의 지표성분으로 산수유의 지표성분인 로가닌(Loganin)을 선정하였으며, 상기 추출물 각각을 HPLC를 이용하여 로가닌의 함량을 분석하였다.
상기 비교예 1 내지 7 및 실시예 1에서 얻어진 추출물 샘플을 10,000ppm으로 제조 한 후, 0.45㎛ membrane filter로 여과한 다음 HPLC(waters, USA)로 분석하였다. 분석조건 컬럼(columm)은 COSMOSIL 5C-18-MS-Ⅱ(4.6㎜×250㎜, 5㎛, USA)을 사용하였고, 이동상은 0.05M NaH2PO4(A)와 아세토나이트릴(Acetonitrile)(B)를 6 대 1비율로 혼합하여 사용하였으며, 혼합용매를 선형 그라디언트(linear gradient)로 20분 동안 분석하였다. 유속은 1 ㎖/min, 주입량은 10㎕, 컬럼의 온도는 30℃, 검출기는 photo diode array detector 및 파장은 240㎚에서 분석하였다.
그 결과를 하기 표 9 및 도 8에 나타내었다.
비교예 1 비교예 2 비교예 3 비교예 4 비교예 5 비교예 6 비교예 7 비교예 8 실시예 1
10,000 ppm 0 6.9 108.3 0 11.2 308.2 0 9.7 167
상기 표 9의 결과를 통하여, 비교예 6의 추출물이, 지표성분 로가닌의 함량이 가장 높게 측정되었으며, 실시예 1의 추출물의 경우, 비교예 6 다음으로 지표성분이 높게 측정되었다. 이는 산수유의 함량이 많을수록 지표성분이 높게 측정된 것이다. 상기의 결과를 이용하여, 적정 범위의 추출물을 화장료 조성물을 제조하기 위한 지표로 활용할 수 있다.

Claims (7)

  1. 하기의 단계를 포함하는, 항산화 및 항노화 활성을 갖는 황칠나무, 산수유 및 구기자 혼합 추출물의 제조방법:
    황칠나무, 산수유 및 구기자 건조 분쇄물을 포함하는 원료를 35℃ 내지 60℃의 온도 및 100bar 내지 250bar의 압력 하에서 초임계 이산화탄소로 1차 초임계 추출하는 단계(단계 1);
    상기 1차 초임계 추출 진행된 원료를 35℃ 내지 60℃의 온도 및 상기 단계 1의 추출 압력에서부터 300bar 내지 450bar의 압력까지 압력을 증가시키면서 초임계 이산화탄소; 및 에탄올, 메탄올, 클로로포름, 물, 에틸아세테이트, 헥산 및 디에틸에테르로 이루어진 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물인 보조용매로 2차 초임계 추출하는 단계(단계 2); 및
    상기 2차 초임계 추출 진행된 원료를 35℃ 내지 60℃의 온도 및 상기 단계 2의 최종 압력 하에서 초임계 이산화탄소; 및 에탄올, 메탄올, 클로로포름, 물, 에틸아세테이트, 헥산 및 디에틸에테르로 이루어진 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물인 보조용매로 3차 초임계 추출하는 단계(단계 3).
  2. 제1항에 있어서, 상기 단계 3 이후에 초임계 추출된 추출물을 여과하여 상층액을 회수하는 단계(단계 4)를 추가로 포함하는 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 단계 1은 황칠나무 건조 분쇄물 : 산수유 건조 분쇄물 : 구기자 건조 분쇄물이 1~2 : 1~3 : 1의 중량비를 갖는 것인 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 보조용매는 에탄올인 것인 제조방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 단계 2 내지 단계 3은 보조용매가 초임계 이산화탄소 및 보조용매의 혼합물의 1 내지 30 부피%로 포함되는 것인 제조방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 제조방법으로 제조된 황칠나무, 산수유 및 구기자 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 및 항노화 효과를 갖는 화장료 조성물.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 제조방법으로 제조된 황칠나무, 산수유 및 구기자 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 및 노화 개선용 화장료 조성물.
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