KR101484025B1

KR101484025B1 - 염증성 질환의 치료를 위한 ｃｘｃｌ１３ 길항제 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101484025B1
Application number: KR20087028444A
Authority: KR
Inventors: 피터 부겔스키; 아누크 다스; 돈 이. 그리스월드; 바이린 량; 리 리; 로버트 티. 사리스키; 샤오저우 상
Original assignee: 얀센 바이오테크 인코포레이티드
Priority date: 2006-04-21
Filing date: 2007-04-20
Publication date: 2015-01-19
Also published as: WO2007124414A2; MX2008013597A; US8277809B2; US20080014201A1; CN101484180B; RU2449808C2; EP2021016A2; EP2021016B1; KR20080111152A; CA2646902C; RU2008145870A; WO2007124414A3; AU2007240355B2; EP2021016A4; AU2007240355A1; BRPI0710636A2; CA2646902A1; CN101484180A; JP2009534419A; JP5758073B2

Abstract

CXCL13 길항제 및 임의로 TNFα 길항제, 예컨대, 특정 부분 또는 변이체, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, siRNA, shRNA, 리보자임 및 DNAzyme을 비롯한 항체를 사용하는 CXCL13 활성과 관련된 질환의 치료 방법을 제공한다. CXCL13 활성과 관련된 질환은 염증 질환, 예컨대, 폐 질환, 예를 들어, 천식, 폐기종, 및 COPD 및 전신성 홍반성 루프스를 포함한다.

Description

염증성 질환의 치료를 위한 ＣＸＣＬ１３ 길항제 및 이의 용도{CXCL13 ANTAGONISTS AND THEIR USE FOR THE TREATMENT OF INFLAMMATORY DISEASES}

본 발명은 CXCL13 길항제 및 폐 질환 및 증후군, 및 증상 뿐만 아니라 관련 질병 및 증상을 치료하기 위한 CXCL13 길항제의 사용 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로 본 발명은 CXCL13 길항제 단독 또는 TNFα 길항제, 예컨대, 간섭 RNA, DNAzyme, 및 적어도 하나의 단백질 또는 이의 단편에 특이적인 특정 부분 또는 변이체를 포함하는 CXCL13에 대한 항체와 함께 CXCL13 활성을 억제하는데 유효한 양으로 사용하여 상기 질병을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 다른 염증성 질환, 예컨대, 전신성 홍반성 루프스를 지닌 동물을 치료하기 위하여 CXCL13 길항제 및 TNFα 길항제를 사용하는 방법에 관한 것이다.

천식은 복합적인 만성 질환이고, 유전적 및 환경적 구성 요소를 갖는다(1). 이는 가역적 기도 폐쇄, 기도 과민성, 기도 염증 및 개형(2)으로 특정지어 진다. 천식은 천오백만명의 미국인에게 영향을 미치는 것으로 추정되고 선진국에서 이와 관련된 이환률 및 사망이 증가하고 있다(3,4). 알러지성 천식의 기도에서의 염증 은 CD4⁺ T 세포의 T 헬퍼(helper)(Th)2 서브세트의 점막성 침윤 및 호산구와 관련 있다(5,6). 이들 세포간의 상호기능은 천식의 발병과 관련된 다양한 전-염증성 매개체의 생산을 유도한다(7,8). 천식의 다른 형태는 운동, 바이러스, 아스피린 및 직업에 의해 유도된 것들이다. 이들 천식 형태에 관여하는 기작은 Th2 림프구 및 사이토카인과 관련있지만 이는 상이하게 유발될 수 있다(9-12). 많은 사이토카인 및 케모카인이 천식의 발병과 관련 있다(13,14). 특히, Th2 유래 사이토카인(인터루킨 4, 5, 9 및 13)은 천식을 포함하는 알러지성 질환에서 중요한 역할을 한다.

만성 폐쇄성 폐 질환(COPD)은 호중구, 마크로파지, B 및 T 세포의 침윤으로 특정지어 지는 만성의 폐 염증이다. 이들 면역적격 세포는 유독성 가스 및 입자의 장기간 노출에 대한 반응으로 폐에서 방출된 다양한 사이토카인 및 케모카인으로 활성화된다(15). 비가역적 기류 폐쇄를 동반하는, 기관지염 및 폐기종은 질병의 임상적 발현이다. COPD로 특정지어지는 폐 기능의 가속화된 감퇴를 지연시키는 공지된 시약은 없다.

최근, COPD의 진행이 배 중심을 함유하는 이소성 림프성 여포를 형성시키는 본질적이고 적응성인 염증성 면역 세포에 의한 실질적 침윤과 밀접하게 관련있는 것으로 관찰되었다. 림프성 여포의 존재는 말단 소기도 벽을 두껍게하는 개형 진행과 연결되어 있다(16). 이 결과는 COPD에서 이소성 림프성 여포의 잠재적인 병리학적 역할을 강력하게 제안한다.

천식의 발병과 관련된 신규한 유전자를 확인하기 위한 노력에서, 연구자들은 천식의 동물 모델에서 상이하게 발현되는 프로필 유전자에 대하여 DNA 마이크로어레이 기술을 사용하였다(17,18). 마이크로어레이 기술은 수천개의 유전자의 발현을 동시에 분석하는 것이 가능하고 또한 고용량 포맷으로 자동화가 가능하기 때문에 강력한 도구이다. 다인성 질병, 예컨대, 천식에서 마이크로어레이 결과는 신규한 치료에 매우 유용한 것으로 판명될 수 있는 유전자 발현 프로필을 제공할 수 있다. 또한, 이는 신규한 유전자를 확인하고 기능이 알려지지 않은 유전자의 주석을 다는데 매우 강력한 판명을 할 수 있다(19).

CXCL13[a.k.a BLC(B 세포 회귀 케모카인) 또는 BCA-1(B 세포 유인 케모카인 1) 또는 앤지 2)]은 매우 선택적으로 강하에 B 세포를 유인하는 화학주성 인자이다. 이는 또한 수용체 CXCR5을 통하여 특정 T 세포 및 마크로파지의 이동을 증진시킨다(20). CXCL13은 파이어스 패치, 비장 및 림프절의 여포에서 발현되고, 여포 발달 및 항성성에 중요한 것으로 간주된다(21).

만성 염증 부위에서, 염증성 침윤물(T, B 및 기질 세포)의 배열은 림프성 조직을 갖는 많은 구조적 성질을 공유하고, 이는 이소성 림프성 여포라 불리는 것을 형성한다고 수년간에 걸쳐 발견됐다(21). 또한, CXCL13의 높은 이소성 생산은 만성 염증성 질환, 예컨대, 류마티스 관절염(21), 쇼그렌 증후군(22), 전신성 홍반성 루프스(23, 24)와 같은 다양한 형태의 루프스, 궤양성 대장염(25, 26), 다발성 경화증(27-29), 제 2형 당뇨병(30-32) 및 자가면역 갑상선 질환(33, 34)에서 림프구 축적 및 이소성 림프성 여포(ectopic lymphoid follicle) 형성과 관련 있다. 이소성 림프성 여포의 정확한 병원 역할은 확실하지 않지만, 국부의 염증 조직에서 림 프구를 축적시킴으로써 염증을 지속시켜 급성을 만성 형태로 전환시키는 증거에서 그의 중요성이 제안되었다(35). 그러므로, 이소성 림프성 여포를 파괴하거나 제거하는 것은 만성 염증성 질환을 조절하기 위한 신규한 치료적 접근을 제공할 수 있다. CXCL13은 이소성 림프성 여포에서 그의 높은 발현 수준 및 그들의 마이크로구조를 유지하고 B 세포를 유인하는 그의 중요한 역할 때문에 이상적인 치료의 표적이다.

전신성 홍반성 루프스(SLE 또는 루프스)는 면역계가 신체의 세포 및 조직을 공격하여, 염증 및 조직 손상을 일으킴으로써 쇠약의 우려가 있고 때때로 치명적인 만성 자가면역 질병이다. SLE는 신체의 임의의 부분에 영향을 미칠 수 있지만, 대부분 심장, 관절, 피부, 폐, 혈관, 간, 신장 및 신경계에 손상을 준다.

CXCL13 유전자(GenBank Accession No. NM_006419, 서열번호 1)는 인간 크로모좀 4q21에 위치한다. CXCL13은 CXC 케모카인 패밀리에 속한다. CXCL13은 리포이드 기관 형성/발달, B 세포 여포 형성 및 B 세포 보충에 있어서 중요한 역할을 한다. 이는 다발성 만성 염증성 질환의 염증 조직에서 이소적으로 높게 생산되고, 국부 B 및 T 세포 활성 및 염증을 유지하는데 중요한 역할을 한다고 간주된다.

유전자 발현은 siRNA, shRNA, 안티센스 분자 및 DNAzyme의 사용을 포함하는, 여러가지 다른 방법으로 조절될 수 있다. siRNA 및 shRNA는 모두 RNAi 경로를 통하여 기능하고 유전자의 발현을 억제하는데 성공적으로 사용된다. RNAi는 먼저 벌레에서 발견되었고 dsRNA와 관련된 유전자 침묵현상이 Fire 및 Mello에 의해 식물에서 처음으로 보고되었으며 식물 세포가 RNA 바이러스의 감염을 막기 위한 방법이 라고 생각되었다. 이 경로에서, 긴 dsRNA 바이러스 산물은 다이서-유사 효소에 의해 21-25 bp 길이의 더 작은 단편으로 프로세스된 다음 이중 가닥 분자가 풀리고 RISC(RNA induced silencing complex)로 적재된다. 유사한 경로가 인터페론 반응이라 불리는 유도를 막기 위하여 dsRNA 분자가 30 bp 길이보다 작아야하는 괄목할만한 차이를 갖는 포유류 세포에서 확인되었고, 이는 유전자 특이적이지 않으며 세포에서 단백질 합성의 전체적 차단을 유도한다.

합성 siRNA는 하나의 유전자를 특이적으로 표적하도록 설계될 수 있고 이들은 시험관 내 또는 생체 내에서 쉽게 세포로 전달될 수 있다. shRNA는 siRNA 분자의 DNA 등가물이고 세포의 게놈으로 통합된 다음 매 유사분열 주기 동안 복제되는 이점이 있다.

DNAzyme도 또한 유전자 발현을 조절하는데 사용되어 왔다. DNAzyme은 단일 가닥 RNA를 절단하는 촉매 DNA 분자이다. 이들은 표적 RNA 서열에 대하여 매우 선택적이고 이로써 전령 RNA를 표적으로 하여 특정 유전자를 하향 조절하는데 사용될 수 있다.

따라서, 폐 질환, 예컨대, 천식 및 관련 질병 및 증상에 있어서 CXCL13과 관련된 진단 및 치료에 대한 신규한 방법을 확인하고 특정화하는 것이 요망된다. 또한, 전신성 홍반성 루프스와 같은 질환을 치료하는 신규한 방법을 확인하고 특정화하는 것이 요망된다.

발명의 요약

본 발명은 CXCL13 또는 그의 수용체, CXCR5의 효능제 및/또는 길항제, 및/또는 그들의 활성의 하나 또는 둘 모두(이하 "CXCL13 길항제") 및 폐-관련 질환을 치료하기 위한 CXCL13에 대한 항체, 및 이의 특정 부분 또는 적어도 하나의 CXCL13 단백질에 대하여 특이적인 변이체 또는 단편을 포함하는, CXCL13 길항제를 사용하는 방법에 관한 것이다. 이들 CXCL13 길항제는 TNFα 길항제, 예컨대, TNFα 항체, 예를 들어, 인플릭시맵 등과 함께 투여될 수 있다. CXCL13 길항제, 예컨대, 단일클론 항체는 국부적인 B 및 T 세포 보충 및 염증성 질환이 매개된 만성적 면역을 조절하기 위한 신규한 전략을 제공하기 위한 후속 활성을 저해한다.

일 구체예에서, CXCL13 길항제는 CXCL13 또는 그의 수용체에 특이적으로 결합하는 항체이다. 이러한 항체의 특별한 이점은 그들이 CXCL13 또는 그의 수용체에 이들의 기능을 방해하는 방식으로 결합가능 하다는 것이다. 따라서 본 발명의 방법은 인간 또는 비인간 환자에서 다양한 폐-관련 질환과 관련 질병 상태의 치료적이고 예방적인 치료에 이상적으로 적합한 원하는 중화 성질을 갖는 항체를 사용하는 것이다. 따라서, 본 발명은 폐-관련 질병 또는 증상을 억제하기 위하여 CXCL13 항체를 중화시키는 양을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 치료를 요하는 환자에서 폐-관련 질병 또는 증상을 치료하는 방법에 관한 것이다.

다른 측면에서, 본 발명은 세포를, CXCL13 또는 그의 수용체의 활성 또는 발현을 조절(억제 또는 증진)시켜 세포에서 활성 또는 발현을 조절하는 시약(예: 길항제 또는 효능제)과 접촉시키는 것을 포함하는, CXCL13 또는 그의 수용체의 활성을 조절하는 방법을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 시약은 CXCL13 또는 그의 수 용체에 특이적으로 결합하는 항체이다. 다른 구체예에서, 조절제는 펩티드, 펩티드모방체 또는 다른 소분자이다.

다른 구체예에서, 본 발명은 폐-관련 질병 또는 증상을 억제하기 위하여 CXCL13 항체 또는 하나 이상의 TNFα 길항제와 함께 다른 길항제를 중화시키는 양을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 치료를 요하는 환자에서 폐-관련 질병 또는 증상을 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 CXCL13의 양 또는 활성의 조절에 의해 개선될 수 있는 폐 또는 관련 질환을 갖는 대상을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 CXCL13의 활성의 조절제 또는 CXCL13 발현의 조절제인 시약을 대상에 투여함으로써, CXCL13 또는 그를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 비정상적인 활성으로 특정지어지는 질환을 갖는 대상을 치료하는 방법을 제공한다.

일 구체예에서, 조절제는 폴리펩티드 또는 소분자 화합물이다. 다른 구체예에서, 조절제는 폴리뉴클레오티드이다. 특정 구체예에서, CXCL13 길항제는 세포에 의한 CXCL13의 생산을 저지할 수 있는 siRNA 분자, shRNA 분자 또는 DNAzyme이다.

본 발명의 다른 측면은 동물에 CXCL-13의 길항제를 제공하고, 동물에 TNF-알파의 길항제를 제공하는 것을 포함하는 전신성 홍반성 루프스를 지닌 동물을 치료하는 방법이다: 여기에서 각 길항제는 동물에서 전신성 홍반성 루프스의 증후를 감소시키는데 유효한 양으로 제공된다. 이 방법의 일 구체예에서 CXCL-13의 길항제는 CXCL-13 결합 항체 또는 항체의 CXCL-13 결합 단편이고 TNFα의 길항제는 TNFα 결합 항체 또는 항체의 TNFα 결합 단편이다.

이 방법의 다른 구체예에서 동물은 포유류이다. 이 방법의 다른 구체예에서 포유류는 인간이다. 이 방법의 다른 구체예에서 각 항체 또는 항체의 결합 단편의 양은 동물의 kg 체중 당 약 25 mg 내지 동물의 kg 체중 당 약 40 mg으로 제공된다. 이 방법의 다른 구체예에서 전신성 홍반성 루프스의 증후는 신장 조직을 검사하여 확인된 동맥주위 림프구 침윤물 병소의 수이다. 이 방법의 다른 구체예에서 전신성 홍반성 루프스의 증후는 총 소변 단백질 대 총 소변 크레아틴의 비율이다. 이 방법의 다른 구체예에서 CXCL-13의 길항제는 CXCL-13 결합 항체 또는 CXCL-13 항체의 결합 단편이고 TNFα의 길항제는 TNFα 결합 항체 또는 TNFα 항체의 결합 단편이다. 이 방법의 다른 구체예에서 CXCL-13의 길항제는 CXCL-13 결합 항체 또는 CXCL-13 항체의 결합 단편이고 TNFα의 길항제는 TNFα 결합 항체 인플릭시맵이다.

본 발명은 본원에 기재된 임의의 발명을 제공한다.

도 1은 CXCL13 mRNA 전사 수준이 병든 폐 조직에서 상승됨을 나타낸다.

도 2는 TNF-α 및 CXCL13에 특이적인 단일클론 항체에 의한 공동 요법이 병든 폐 조직에서 이소성 여포 크기로 평가되는 폐 질병 증후군을 경감시킴을 나타낸다.

도 3은 TNF-α 및 CXCL13에 특이적인 단일클론 항체에 의한 공동 요법이 CD22.2를 발현하는 B-세포가 폐 조직으로 침습하는 것을 감소시킴을 나타낸다.

도 4는 TNF-α 및 CXCL13에 특이적인 단일클론 항체에 의한 공동 요법이 CD 19를 발현하는 B-세포가 폐 조직으로 침습하는 것을 감소시킴을 나타낸다.

도 5는 TNF-α 및 CXCL13에 특이적인 단일클론 항체에 의한 공동 요법이CD45R/B220을 발현하는 B-세포가 폐 조직으로 침습하는 것을 감소시킴을 나타낸다.

도 6는 TNF-α 및 CXCL13에 특이적인 단일클론 항체에 의한 공동 요법이 CD4를 발현하는 B-세포가 폐 조직으로 침습하는 것을 감소시킴을 나타낸다.

도 7은 CXCL-13 및 TNF-α에 특이적인 mAb의 공동 투여가, 전신성 홍반성 루프스(SLE) 증후군을 나타내는 NZB/W F1 마우스의 소변에서 사구체신염 관련 단백질 수준을 PBS 비히클을 단독으로 제공받은 비처리 대조군 NZB/W F1 마우스에 비하여 낮은 수준으로 감소시킴을 나타낸다.

도 8은 CXCL-13 및 TNF-α에 특이적인 mAb의 공동 투여가, SLE 증후군을 나타내는 NZB/W F1 마우스에서 전신성 홍반성 루프스(SLE) 관련 신장 질병의 심각성 등급 점수를 PBS 비히클을 단독으로 제공받은 비처리 대조군 NZB/W F1 마우스에 비하여 낮은 수준으로 감소시킴을 나타낸다.

정의

하기 정의는 본원에서 본 발명을 기술하기 위하여 사용된 다양한 용어의 의미 및 범위를 정의하고 설명하기 위하여 기재되었다.

폴리펩티드의 "활성," 생물학적 활성 및 기능적 활성은 표준적인 기술에 따라 생체 내, 인 시츄 또는 시험관 내에서 결정된 바, 다른 단백질 또는 분자와 그의 특이적인 상호기능에 대한 반응에서 CXCL13 또는 그의 수용체에 의해 발휘되는 활성을 의미한다. 이러한 활성은 직접적인 활성, 예컨대, 공동의 또는 제 2의 단백질 상에서 효소적 활성일 수 있거나, 간접적 활성, 예컨대, 단백질과 제 2의 단백질의 상호기능으로 매개되는 세포 과정 또는 세포내 신호 또는 응고 캐스캐이드에서의 일련의 상호기능일 수 있다.

"항체"는 면역글로블린 분자, 예컨대, 한정하는 것은 아니나, 적어도 하나의 중쇄 또는 경쇄의 상보성 결정 영역(CDR) 또는 그의 리간드 결합 부분, 중쇄 또는 경쇄 가변 영역, 중쇄 또는 경쇄 불변 영역, 프레임워크 영역, 또는 그의 임의의 부분, 단편 또는 변이체의 적어도 한 부분을 포함하는 분자를 함유하는 임의의 폴리펩티드 또는 펩티드를 포함한다. 용어 "항체"는 또한 단쇄 항체, 단일 도메인 항체 및 그의 단편을 비롯한 그의 특정 단편 또는 부분 또는 항체의 구조 및/또는 기능을 모방하는 항체의 부분 또는 항체 모방체를 비롯한 항체, 그의 분해 단편, 특정 부분 및 변이체를 포함하고자 한다. 예를 들어, 항체 단편은 한정하고자 하는 것은 아니나, Fab(예: 파파인 분해에 의한), Fab'(예: 펩신 분해 및 부분적 환원에 의한) 및 F(ab')2(예: 펩신 분해에 의한), facb(예: 플라스민 분해에 의한), pFc'(예: 펩신 또는 플라스민 분해), Fd(예: 펩신 분해, 부분적 환원 및 재응집에 의한), Fv 또는 scFv(예: 분자 생물 기술에 의한) 단편을 포함하고, 본 발명에 포함된다(예: Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); Colligan et al., Current Protocols in Polypeptide Science, John Wiley & Sons, NY (1997-2001) 참조).

"키메라" 또는 "융합" 분자는 예를 들어, 하나 이상의 CXCL13 길항제(또는 그들의 부분)와 추가의 핵산 서열(들)의 결합에 의해 생성되는 핵산 또는 폴리펩티드이다. 이러한 결합 서열은 적합한 벡터로 도입될 수 있고 키메라 또는 융합 폴리펩티드를 생성하기 위하여 발현될 수 있다.

본 발명의 핵산 서열에 대한 "상보성" 또는 "상보적인"은 제 1의 폴리뉴클레오티드에 대해 역 기원 및 상보적인 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 분자를 의미한다.

"단편"은 전반적으로 동일하지만 CXCL13 길항제의 임의의 아미노산 서열이 모두 동일하지 않은 아미노산 서열 또는 전반적으로 동일하지만 임의의 CXCL13 길항제 폴리뉴클레오티드의 임의의 핵산 서열은 모두 동일하지 않은 핵산 서열을 갖는 변이체 폴리뉴클레오티드의 아미노산 서열을 갖는 변이체 폴리펩티드이다. 단편은 예를 들어, 절단 폴리펩티드, 또는 이의 변이체, 예컨대, 이종의 아미노- 및/또는 카복시-말단 아미노산 서열을 포함하는 잔기의 연속적인 시리즈를 포함할 수 있다. 숙주 세포에 의해 또는 숙주 세포에서 생성되는 CXCL13 길항제의 분해 형태가 또한 포함된다. 다른 예시적인 단편은 구조적 또는 기능적 속성, 예컨대, 알파-헬릭스 또는 알파-헬릭스 형성 영역, 베타-시트 또는 베타-시트 형성 영역, 회전 또는 회전-형성 영역, 코일 또는 코일-형성 영역, 친수성 영역, 소수성 영역, 알파-양친매성 영역, 베타-양친매성 영역, 플렉서블 영역, 표면-형성 영역, 기질 결합 영역, 세포외 영역 및 고항원 인덱스 영역을 포함하는 단편에 의해 특정지어진다.

당업계에 공지된 바와 같이 "상동성(Identity)"은 서열을 비교하여 결정된 바, 두개 이상의 폴리펩티드 서열 또는 두개 이상의 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 관계이다. 이 분야에서, "상동성"은 또한 이러한 일련의 서열 간의 매치에 의해 결정된 바, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 서열 관련성의 정도를 의미한다. "상동성" 및 "유사성"은, 한정하는 것은 아니나, Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing:Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; and Carillo, H., and Lipman, D., Siam J. Applied Math., 48:1073 (1988)에 기재된 것을 포함하는, 공지된 방법으로 쉽게 계산될 수 있다. 또한 상동성 퍼센트의 값은 AlignX component of Vector NTI Suite 8.0(Informax, Frederick, MD)에 대한 디폴트 설정을 사용하여 산출된 아미노산 및 뉴클레오티드 서열 정렬로부터 수득될 수 있다.

상동성을 결정하는 바람직한 방법은 서열 검사 사이에서 가장 크게 매치되도록 설계하는 것이다. 상동성 및 유사성을 결정하는 방법은 공개적으로 사용가능한 컴퓨터 프로그램으로 체계화되어 있다. 두개의 서열 간의 상동성 및 유사성을 결정하기 위한 바람직한 컴퓨터 프로그램은, 한정하고자 하는 것은 아니나, GCG 프로그램 패키지(Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN 및 FASTA(Atschul, S. F. et al., J. Molec. Biol. 215:403-410 (1990))를 포함한다. BLAST X 프로그램은 NCBI 및 다른 공급원(BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBINLM NIH Bethesda, Md. 20894: Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)으로부터 공개적으로 사용가능하다. 잘 알려진 Smith Waterman 알고리즘 또한 상동성을 결정하는데 사용될 수 있다.

폴리펩티드 서열 비교를 위한 바람직한 파라미터는 다음을 포함한다:

(1) 알고리즘: Needleman and Wunsch, J. Mol Biol. 48:443-453 (1970)

비교 매트릭스: BLOSSUM62[Hentikoff and Hentikoff, Proc. Natl. Acad. Sci, USA. 89:10915-10919 (1992)]

갭 패널티: 12

갭 길이 패널티: 4

이러한 파라미터와 함께 유용한 프로그램은 Genetics Computer Group, Madison Wis의 "갭" 프로그램으로 공개적으로 사용가능하다. 상기 언급된 파라미터는 펩티드 서열 비교를 위한 디폴트 파라미터이다(마지막 갭에 패널티 없음).

폴리뉴클레오티드 비교를 위한 바람직한 파라미터는 다음을 포함한다:

(1) 알고리즘: Needleman and Wunsch, J. Mol Biol. 48:443-453 (1970)

비교 매트릭스: 일치 = +10, 불일치 = 0

갭 패널티: 50

갭 길이 패널티: 3

Genetics Computer Group, Madison Wis의 "갭" 프로그램으로 이용 가능. 여기에는 핵산 서열 비교를 위한 디폴트 파라미터가 있다.

예로써, 폴리뉴클레오티드 서열은 참조 서열과 비교한 바, 서열에 100% 동일하거나, 뉴클레오티드 변형의 특정 정수 수치 까지 포함할 수 있다. 이러한 변형은 적어도 하나의 뉴클레오티드 결실, 전이 및 전위를 함유하는 치환, 또는 삽입으로 구성된 그룹으로부터 선택되며, 여기에서, 변형은 참조 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치에서 발생하거나, 참조 서열 내의 하나 이상의 인접한 그룹 또는 참조 서열 내에서 뉴클레오티드들 사이에 산재된 말단 위치들 사이의 임의의 위치에서 발생할 수 있다. 뉴클레오티드 변형의 수는 서열에서 뉴클레오티드의 전체 수를 각각의 상동성 퍼센트(100에 의하여 나뉨)의 수치 퍼센트와 곱하고, 서열에서 뉴클레오티드의 전체 수로부터 곱을 뺌으로써, 또는 n.sub.n.ltorsim.x.sub.n-(x.sub.n.y)에 의하여 결정되며, 여기에서, n.sub.n은 뉴클레오티드 변형의 수이고, x.sub.n은 서열에서 뉴클레오티드의 전체 수이며, y는 예를 들어, 70%에 대해서는 0.70, 80%에 대해서는 0.80, 85%에 대해서는 0.85, 90%에 대해서는 0.90, 95%에 대해서는 0.95 등이고, 여기에서, x.sub.n의 임의의 비-정수 곱 및 y는 x.sub.n으로부터 빼기 전에 가장 가까운 정수로 잘라 버린다.

서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은 이 암호화 서열 내에서 넌센스, 미스센스 또는 프레임이동 돌연변이를 생성할 수 있고, 이로써, 이러한 변형이 수행된 폴리뉴클레오티드에 의하여 암호화되는 폴리펩티드를 또한 변형시킬 수 있다. 유사하게, 폴리펩티드 서열은 참조서열에 100% 상동성으로 동일하거나, 참조 서열과 비교한 바, 상동성 퍼센트가 100% 보다 작은 아미노산 변형의 특정 정수 수치까지 포함할 수 있다. 이러한 변형은 적어도 하나의 아미노산 결실, 보존적 및 비-보존적 치환을 포함한 치환, 또는 삽입으로 구성된 그룹으로부터 선택되며, 여기에서, 변형은 참조 폴리펩티드 서열의 아미노- 또는 카복시-말단 위치 또는 참조 서열에서 아미노산들 또는 참조 서열 내에서 하나 이상의 인접하는 그룹 사이에서, 산재된 말단 위치 사이의 임의의 위치에서 발생할 수 있다. 주어진 상동성%를 위한 아미노산 변형 수는 서열에서 아미노산 전체 수를 각각의 상동성 퍼센트(100에 의하여 나뉨)의 수치 퍼센트와 곱하고 서열에서 아미노산의 전체 수로부터 곱을 뺌으로써, 또는 n.sub.a.ltorsim.x.sub.a-(x.sub.a.y)에 의하여 결정되며, 여기에서, n.sub.a는 아미노산 변형의 수이고, x.sub.a는 서열에서 아미노산의 전체 수이며, y는 예를 들어, 70%에 대하여 0.70, 80%에 대하여 0.80, 85%에 대하여 0.85 등이고, 여기에서, x.sub.a의 임의의 비-정수 곱 및 y는 x.sub.a로부터 빼기 전에 가장 가까운 정수로 잘라 버린다.

"핵산"은 뉴클레오티드의 폴리머이고, 여기에서 뉴클레오티드는 적어도 2가 분자, 예컨대, 인산을 조정함으로써 서로 연결된 당에 연결된 염기를 포함한다. 천연 유래 핵산에서, 당은 2'-데옥시리보오스(DNA) 또는 리보오스(RNA)이다. 비자연적 폴리- 또는 올리고뉴클레오티드는 변형된 염기, 당, 또는 결합 분자를 의미하지만, 일반적으로 이들이 디자인된 후 천연 유래 핵산의 상보적인 성질을 모방하는 것으로 이해된다. 비자연적 올리고뉴클레오티드의 예시는 포스포로티오레이트 백본을 갖는 안티센스 분자 조성물이다. "올리고뉴클레오티드"는 일반적으로 30개 보다 작은 뉴클레오티드를 갖는 핵산 분자를 의미한다.

"폴리펩티드"는 펩티드 결합으로 결합된 아미노산 잔기의 폴리머이고, 펩티드는 일반적으로 12개 보다 작은 잔기의 아미노산 폴리머를 의미한다. 펩티드 결합은 핵산 주형에 의해 천연적으로 생산되거나 당업계에 공지된 방법으로 합성될 수 있다.

"단백질"은 하나 이상의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 마크로분자이다. 단백질은 또한 펩티드 결합의 형성과 관련 없는 아미노산의 측면 그룹에 부착된 치환체 그룹을 함유할 수 있다. 전형적으로, 진핵 세포 발현에 의해 형성된 단백질은 또한 탄수화물을 포함한다. 그들의 아미노산 서열 또는 백본 및 치환체의 용어에서 본원에서 정의된 단백질은 공지되어 있든, 그렇지 않든 간에 한정되지 않는다.

용어 "수용체"는 예를 들어, 세포에서 특정 리간드 또는 결합 파트너와의 상호기능의 결과로서 생물할적 활성에 영향을 미치는 능력을 갖는 분자를 의미한다. 세포 막 부착 수용체는 전형적으로 신호 변환과 관련있는 세포내 작동체 도메인, 세포외 리간드-결합 도메인 및 하나 이상의 막 횡단 또는 막전위 도메인에 의해 특정지어진다. 세포 막 수용체에 대한 리간드 결합은 세포 막을 가로질러, 하나 이상의 세포내 단백질과 직접 또는 간접적 상호기능이 전달되는 세포외 도메인에서의 변화를 유발하고, 세포의 성질, 예컨대, 효소 활성, 세포 모양 또는 유전자 발현 프로필을 변경시킨다. 수용체는 또한 세포 표면에 대한 사슬을 풀 수 있고 시토졸, 핵일 수 있거나, 완전히 세포로부터 방출될 수 있다. 수용체와 관련된 비-세포는 수용성 수용체이다.

본 명세서에서 언급된 모든 간행물 또는 특허는 특별하게 디자인되어 있던, 그렇지 않던, 전체가 참고 문헌으로서 본 명세서에 포함되고, 본 발명 당시의 기술 상태를 보여주고/주거나 본 발명의 기술 및 실현가능성을 제공한다. 간행물은 임의의 과학적 또는 특허 간행물, 또는 모든 기록된, 전자적 또는 프린트된 형태를 포함하는 임의의 매체 형태로 이용가능한 임의의 다른 정보를 언급한다. 다음 문헌은 전체가 참고 문헌으로서 본 명세서에 포함된다: Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1987-2001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow and Lane, antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY (1997-2001).

CXCL13의 생물학적 기능

림프성 기관 형성/발달, B 세포 여포 형성 및 B 세포 보충에서 CXCL13의 신규한 발현 및 신규한 기능 및 그의 생물학적 기능은 다양한 인간 질병 및 동물 모델에서 확인되었다. 처음에 이소성 발현은 폐 질병, 특별히 한정하는 것은 아니나, COPD와 관련된 림프성 여포 형성과 관련 있었다.

CXCL13 조성물은 하나 이상의 단백질 이소형, 이의 면역원성 부분 또는 이러한 부분을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 대안적으로, 치료적 조성물은 유전자, 또는 다른 형태의 효능제 및 길항제, 예컨대, 중화 단일클론 항체(mAb), 핵산-기반 요법, 또는 CXCL13 DNA, RNA 또는 단백질의 임의의 부분에 대한 소분자 화합물에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 발현하는 세포에 대하여 특이적인 T 세포 또는 CXCL13 단백질을 발현하는 세포를 포함할 수 있다. 이들 조성물은 예를 들어, 면역-매개 염증성 질환 범위를 예방 및 치료하는데 사용될 수 있다. 샘플에서 CXCL13 단백질 또는 이러한 단백질을 암호화하는 mRNA의 검출을 기반으로 한 진단 및 예후 방법이 개시된다.

CXCL13 및 그의 수용체 단백질, 폴리펩티드 및 이들을 암호화하는 핵산 분자는 특정 보존 구조 및 기능적 성질을 갖는 분자의 패밀리를 포함한다. 이들 분자의 각각은 CXCL13의 정의에 포함된다. 본원에서 사용되는 "패밀리"는 공통 또는 유사한 도메인 구조 및 본원에서 정의한 바와 같은 충분한 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열 상동성을 갖는 두개 이상의 단백질 또는 핵산 분자를 의미하고자 한다. 패밀리 원은 동일하거나 상이한 종일 수 있다. 예를 들어, 패밀리는 인간 기원의 두개 이상의 단백질을 함유할 수 있거나, 인간 기원의 하나 이상의 단백질 및 비-인간 기원의 하나 이상의 단백질을 함유할 수 있다.

CXCL13 단백질에 존재할 수 있는 도메인은 신호 서열이다. 본원에서 사용되는 "신호 서열"은 막-부착 단백질의 아미노 말단에서 발생하고 적어도 약 45% 소수성 아미노산 잔기, 예컨대, 알라닌, 루신, 이소루신, 페닐알라닌, 프롤린, 티로신, 트립토판 또는 발린을 함유하는 적어도 약 10개의 아미노산 잔기 길이의 펩티드를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 신호 서열은 적어도 약 10 내지 35개의 아미노산 잔기, 바람직하게 약 10 내지 20개의 아미노산 잔기를 함유하고, 적어도 약 35-60%, 더욱 바람직하게 40-50% 및 더욱 바람직하게 적어도 약 45% 소수성 잔기를 갖는다. 신호 서열은 지질 이중층에 대한 서열을 함유하는 단백질을 제공한다. 따라서, 일 구체예에서, CXCL13 단백질은 신호 서열을 함유할 수 있다. 신호 서열은 성숙 단백질의 프로세싱 동안 절단된다.

CXCL13 단백질은 세포외 도메인을 포함한다. 본원에서 사용되는 "세포외 도메인"은 단백질을 암호화하는 핵산이 세포에서 발현될 경우 세포의 지질 이중층의 비-세포질 측면에 위치한 단백질의 부분을 의미한다.

또한, CXCL13 단백질은 막전위 도메인을 포함한다. 본원에서 사용되는 "막전위 도메인"은 적어도 약 15개의 아미노산 잔기 길이이고 적어도 약 65-70% 소수성 아미노산 잔기, 예컨대, 알라닌, 루신, 페닐알라닌, 단백질, 티로신, 트립토판 또는 발린(Erik, et al. Proc. of Sixth Int. Conf. on Intelligent Systems for Molecular Biology, p 175-182)을 포함하는 아미노산 서열을 의미한다. 바람직한 구체예에서, 막전위 도메인은 약 15-30개의 아미노산 잔기, 바람직하게 약 20-25개의 아미노산 잔기를 포함하고, 적어도 약 60-80%, 더욱 바람직하게 65-75% 및 더욱 바람직하게 적어도 약 70% 소수성 잔기를 갖는다.

CXCL13 단백질은 세포질 도메인을 가지고, 특히 카복실-말단 세포질 도메인을 갖는 단백질을 포함한다. 본원에서 사용되는 "세포질 도메인"은 단백질을 암호화하는 핵산이 세포에서 발현될 경우 세포의 지질 이중층의 세포질 측면에 위치한 단백질의 부분을 의미한다. CXCL13 단백질은 전형적으로 다양한 잠재적인 번역 후 변형 부위(종종 세포외 도메인 내)를 포함한다.

CXCL13 길항제

본원에서 사용되는 용어 "CXCL13 길항제"는 CXCL13 또는 그의 수용체, CXCR5의 생물학적 활성을 억제 또는 중화시키는 물질을 의미한다. 이러한 길항제는 다양한 방법으로 이 효과를 달성한다. CXCL13 길항제의 하나의 클래스는 충분한 친화도로 CXCL13 단백질과 결합할 수 있고 CXCL13의 생물학적 효과를 중화시키는 특이적을 갖는다. 항체 및 항체 단편(예를 들어, F(ab) 또는 F(ab')₂ 분자)이 이 분자의 클래스에 포함된다. CXCL13 길항제의 다른 클래스는 CXCL13 단백질의 단편, 뮤테인 또는 소 유기 분자, 예를 들어, 펩티드모방체를 포함하고, CXCL13 또는 CXCL13 결합 파트너에 결합하여, CXCL13의 생물학적 활성을 억제한다. CXCL13 길항제는 CXCL13 생물학적 활성을 억제하는 물질일 경우 임의의 이들 클래스일 수 있다. CXCL13 길항제는 CXCL13 항체, CXCL13 수용체 항체, 변형된 CXCL13 및 CXCL13의 부분적 펩티드를 포함한다. CXCL13 길항제의 또다른 클래스는 본원에서 개시되고 당업계에 공지된 CXCL13 유전자 서열을 표적으로 하는 siRNA, shRNA, 안티센스 분자 및 DNAzyme을 포함한다.

따라서, 본원에서 사용되는 "CXCL13 항체", "항-CXCL13 항체", "항-CXCL13 항체 부분" 또는 "항-CXCL13 항체 단편" 및/또는 "항-CXCL13 항체 변이체" 등은 적어도 하나의 중쇄 또는 경쇄의 상보성 결정 영역(CDR), 또는 이의 리간드 결합 부분, 중쇄 또는 경쇄 가변 영역, 중쇄 또는 경쇄 불변 영역, 프레임워크 영역, 또는 이의 임의의 부분, 또는 CXCL13 단백질 또는 펩티드로부터 유도된 CXCL13 결합 단백질의 적어도 하나의 부분 또는 본 발명의 항체로 도입될 수 있는 결합 단백질과 같지만 이에 한정되지 않는 면역 글로블린 분자의 적어도 한 부분을 포함하는 분자를 함유하는 임의의 단백질 또는 폴리펩티드를 함유한다. 또한, 이러한 항체는 임의로 상기 항체가 시험관 내, 인시츄 및/또는 생체 내에서 CXCL13 활성을 조절, 감소, 증가, 길항, 기능, 완화, 경감, 차단, 방해, 폐기 및/또는 방해하는 것과 같지만, 이에 한정되지 않는 특정한 리간드에 영향을 미친다. 비제한적 실시예로써, 본 발명의 적합한 항-CXCL13 항체, 특정 부분 또는 변이체는 적어도 하나의 CXCL13 단백질 또는 펩티드 또는 이의 특정 부분, 변이체 또는 도메인에 결합할 수 있다. 적합한 항-CXCL13 항체, 특정 부분 또는 변이체는 RNA, DNA 또는 단백질 합성, CXCL13 방출, CXCL13 신호, CXCL13 결합, CXCL13 생산 및/또는 합성과 같으나, 이에 한정되지 않는 것과 같은 다양한 CXCL13 기능에 영향을 줄 수 있다.

항체는 하나 이상의 적어도 하나의 CDR, 적어도 하나의 가변 영역, 적어도 하나의 불변 영역, 적어도 하나의 중쇄(예: g1, g2, g3, g4, m, a1, a2, d, e), 적어도 하나의 경쇄(예: k 및 l) 또는 임의의 부분 또는 이의 단편을 포함할 수 있고, 추가로 사슬 간 및 사슬 내 이황화 결합, 힌지 영역, 힌지 영역에 의해 분리될 수 있는 당화 부위뿐만 아니라, 중쇄 및 경쇄를 포함할 수 있다. 경쇄는 전형적으로 약 25Kd의 분자량을 가지고 중쇄는 전형적으로 약 50K-77Kd의 범위의 분자량을 갖는다. 경쇄는 두개의 다른 형태 또는 아이소타입, 카파(k) 및 람다(l)로 존재할 수 있고, 이는 임의의 중쇄 타입과 결합할 수 있다. 모든 경쇄는 적어도 하나의 가변 영역 및 적어도 하나의 불변 영역을 갖는다. IgG 항체는 전형적인 항체 구조로 간주되고 경쇄에서 두개의 사슬내(가변 영역의 하나 및 불변 영역의 하나)에 이황화 결합을 가지고, 중쇄에서 4개를 가지며, 이러한 결합은 사슬 내에서 약 110개의 아미노산의 "도메인"을 포함하는 약 60-70개의 아미노산의 펩티드 루프를 포함한다. IgG 항체는 4개의 클래스, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 특정지어질 수 있다. 각각의 면역글로블린 클래스는 상이한 기능의 세트를 갖는다. 표 1은 면역글로블린 클래스 및 서브클래스의 각각의 물리화학적 성질을 요약한 것이다.

표 1

특성	IgG1	IgG2	IgG3	IgG4	IgM	IgA1	IgA2	SigA	IgD	IgE
중쇄	γ1	γ1	γ1	γ1	μ	a1	a2	a1 /a2	δ	e
평균 혈청 농도 (mg/ml)	9	3	1	0.5	1.5	3.0	0.5	0.05	0.03	0.00005
참강 상수	7s	7s	7s	7s	19s	7s	7s	11s	7s	8s
Mol. Wt. (X 10³)	146	146	170	146	970	160	160	385	184	188
반감기 (일수)	21	20	7	21	10	6	6	?	3	2
혈관내 분포 %	45	45	45	45	80	42	42	미량	75	50
탄수화물 (%)	2-3	2-3	2-3	2-3	12	7-11	7-11	7-11	9-14	12

표 2는 인간 항체 클래스 및 서브클래스에 대한 항체 작동체 기능의 비제한적인 예시를 요약한 것이다.

표 2

작동체 기능	IgG1	IgG2	IgG3	IgG4	IgM	IgA	IgD	IgE
보체 고정	+	+/-	++	-	++	-	-	-
태반 전이	+	+/-	+	+	-	-	-	-
황색포도상구균 A에 대한 결합	+++	+++	-	+++	-	-	-	-
연쇄상구균 G에 대한 결합	+++	+++	+++	+++	-	-	-	-

+++ = 매우 높음; ++ = 높음; + = 적당함; +/- = 최소; - = 없음; ? = 확실하지 않음

따라서, 항체 또는 이의 단편의 타입은 특정 치료 또는 진단 용도, 예컨대, 한정하는 것은 아니나, 혈청 반감기, 혈관내 분포, 보체 고정 등에 대한, 원하는 성질 및 기능을 기초로 하여 본 발명에 따른 용도를 위하여 선택될 수 있다.

분리된 CXCL13 폴리펩티드 또는 이의 단편은 다클론성 및 단일클론 항체 제제를 위하여 표준적인 기술을 사용하여 항체를 생산하는 면역원으로서 사용될 수 있다. 전장 폴리펩티드 또는 단백질이 사용될 수 있거나, 대안적으로 본 발명은 면역원으로서 사용을 위한 항원성 펩티드 단편을 제공한다. CXCL13 단백질의 항원성 펩티드는 적어도 8(바람직하게 10, 15, 20, 또는 30개 이상)개의 아미노산 잔기를 포함하고 펩티드가 단백질과 특정 면역 복합체를 형성하는 것에 대하여 상승된 항체가 되도록 하는 단백질의 에피토프를 함유한다.

전형적으로 면역원은 적합한 대상(즉, 면역적격), 예컨대, 토끼, 염소, 마우스 또는 다른 포유류 또는 척추동물을 면역화함으로써 항체를 제조하는데 사용된다. 적합한 면역원성 제제는 예를 들어, 재조합적으로 발현되거나 화학적으로 합성된 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 또한 제제는 애쥬번트, 예컨대, 프로인드 완전 또는 불완전 애쥬번트 또는 유사한 면역자극제를 포함할 수 있다.

항체 생성 세포는 대상 면역원으로 면역화된 인간 또는 기타 적합한 동물의 말초 혈액 또는, 바람직하게는 비장 또는 림프절로부터 얻어질 수 있다. 임의의 적합한 다른 숙주 세포는 또한 본 발명의 항체, 특정 단편 또는 이의 변이체를 암호화하는 이종 또는 내인성 핵산의 발현에 이용될 수 있다. 융합 세포(하이브리도마) 또는 재조합 세포는 선택적 배양 조건 또는 공지된 다른 적합한 방법을 이용하여 분리될 수 있고, 제한된 희석 또는 세포 선별 또는 다른 공지된 방법을 이용하여 분리될 수 있다. 원하는 특이적을 갖는 항체를 생성하는 세포는 적합한 분석 (예를 들면, ELISA)에 의해 선택될 수 있다.

한 연구에서, 하이브리도마가 적합한 무한증식세포주(예를 들면, Sp2/0, Sp2/0-AG14, NSO, NS1, NS2, AE-1, L.5, L243, P3X63Ag8.653, Sp2 SA3, Sp2 MAI, Sp2 SS1, Sp2 SA5, U937, MLA 144, ACT IV, MOLT4, DA-1, JURKAT, WEHI, K-562, COS, RAJI, NIH 3T3, HL-60, MLA 144, NAMALWA, NEURO 2A 등과 같으나, 이에 한정되지 않는 골수종 세포주) 또는 이형골수종, 그의 융합 생성물, 또는 이로부터 유래된 임의의 세포 또는 융합 세포, 또는 당업계에 공지된 바와 같은 적합한 다른 세포주(예를 들면, www.atcc. org, www.lifetech. com., 등 참조)를, 재조합 또는 내인성, 바이러스, 박테리아, 조류, 원핵, 양서류, 곤충, 파충류, 어류, 포유동물, 설치류, 말, 오바인(ovine), 염소, 양(sheep), 영장류, 진핵, 게놈 DNA, cDNA, rDNA, 미토콘드리아 DNA 또는 RNA, 엽록체 DNA 또는 RNA, hnRNA, mRNA, tRNA, 단일, 이중 또는 삼중 사슬, 혼성화 등 또는 이의 임의의 조합 형태로서 내인성 또는 이종의 핵산으로써, 분리된 또는 클론된 비장, 말초 혈액, 림프, 편도선, 또는 기타 면역 또는 B 세포 함유 세포, 또는 중쇄 또는 경쇄 가변 또는 불변 영역 또는 프레임워크 또는 CDR 서열을 발현하는 임의의 다른 세포와 같으나, 이에 제한되지 않는, 항체 생성 세포와 융합하여 생성된다. 예를 들어, 전체가 참고 문헌으로서 본 명세서에 포함된, Ausubel, supra, 및 Colligan, Immunology, supra, chapter 2를 참조할 수 있다.

요구되는 특이적을 갖는 항체를 생성 또는 분리하는 다른 적합한 방법이 이용될 수 있으며, 이는 당업계에서 개시되고/거나 당업계에 공지된 대로, 인간 항체의 레퍼토리를 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물의 면역화에 의존하거나(예를 들면, SCID mice, Nguyen et al., Microbiol. Immunol. 41: 901-907 (1997); Sandhu et al., Crit. Rev. Biotechnol. 16: 95-118 (1996); Eren et al., Immunol. 93: 154-161 (1998), 각각의 전체가 관련 특허 및 출원과 함께 참고 문헌으로서 포함됨), 펩티드 또는 폴리펩티드 라이브러리로부터 재조합 항체를 선택(예를 들면, 박테리오파지, 리보솜, 올리고뉴클레오티드, RNA, cDNA, 등 디스플레이 라이브러리; 예를 들면, Cambridge Antibody Technologies, Cambridaeshire. UK; MorphoSys, Martinsreid/Planegg, DE; Biovation, Aberdeen, Scotland, UK: BioInvent, Lund, Sweden; Dyax Corp., Enzon, Affymax/Biosite ;Xoma, Berkeley, CA; Ixsys. 참조, 예를 들면, EP 368,684, PCT/GB91/01134; PCT/GB92/01755; PCT/GB92/002240; PCT/GB92/00883; PCT/GB93/00605; US 08/350260 (5/12/94); PCT/GB94/01422; PCT/GB94/02662; PCT/GB97/01835; (CAT/MRC); W090/14443 ;W090/14424; WO90/14430; PCT/US94/1234; W092/18619; W096/07754; (Scripps); WO96/13583; WO97/08320 (MorphoSys); W095/16027 (BioInvent); W088/06630; W090/3809 (Dyax); US 4,704,692 (Enzon); PCT/US91/02989 (Affymax); W089/06283; EP 371 998; EP 550 400; (Xoma); EP 229046; PCT/US91/07149 (Ixsys); 또는 추측상 생성된 펩티드 또는 단백질-US 특허 5723323, 5763192, 5814476, 5817483, 5824514, 5976862, WO 86/05803, EP 590 689(Ixsys, now Applied Molecular Evolution (AME), 각각은 전체가 참고 문헌으로서 본 명세서에 포함됨)하는 방법을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이러한 기술은 리보솜 디스플레이(Hanes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 4937-4942 (May 1997); Hanes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 14130-14135 (Nov. 1998)); 단일 세포 항체 제조 기술(예를 들면, 선택된 림프구 항체 방법("SLAM") (미국 특허 번호 5,627,052, Wen et al., J. Immunol. 17: 887-892 (1987); Babcook et al., Proc. Natl.Acad. Sci. USA 93: 7843-7848 (1996)); 겔 마이크로드로플렛 및 유세포 분석(Powell et al.,Biotechnol. 8: 333-337 (1990); One 세포 System, Cambridge, MA; Gray et al., J. Imm. Meth.182: 155-163 (1995); Kenny et al., Bio/Technol. 13: 787-790 (1995)); B-세포 선택 (Steenbakkers et al., Molec. Biol. Reports 19: 125-134 (1994); Jonak et al., Progress Biotech,Vol. 5, In Vitro Immunization in Hybridoma Technology, Borrebaeck, ed., Elsevier Science Publishers B. V., Amsterdam, Netherlands (1988)) 방법을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

비-인간 또는 인간 항체를 설계 또는 인간화하는 방법이 또한 사용될 수 있고 당업계에 널리 공지되어 있다. 일반적으로, 인간화되거나 설계된 항체는 예를 들면, 마우스, 랫트, 토끼, 비-인간 영장류 또는 다른 포유동물이나 이에 한정되지 않는 인간이 아닌 공급원으로부터의 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 인간 아미노산 잔기는 종종 '이입' 잔기로 언급되는데, 이들은 공지된 인간 서열의 '중요한' 가변, 불변 또는 다른 도메인으로부터 전형적으로 취해진다. 공지된 인간 Ig 서열은, 예를 들면, 각각의 전체가 참고 문헌으로서 본 명세서에 포함되는 하기에 개시되어 있다:

이렇게 이입된 서열은 공지된 바와 같이 면역원성을 감소시키거나, 결합, 친화도, 온-속도, 오프-속도, 결합성, 특이적, 반감기 또는 임의의 다른 적합한 특성을 감소, 증가 또는 변형시키는데 사용될 수 있다. 일반적으로, 비-인간 또는 인간 CDR 서열의 일부 또는 전부는 유지되는 반면 가변 및 불변 영역의 비-인간 서열은 인간 또는 다른 아미노산으로 치환된다. 항체는 부가적으로 항원에 대해 높은 친화도의 보유력 및 다른 유리한 생물학적 특성으로 인간화될 수 있다. 이 목적을 이루기 위하여, 인간화된 항체는 부모 서열의 분석 방법 및 부모와 인간화된 서열의 3차원 모델을 이용한 다양하게 개념적으로 인간화된 생성물에 의해 임의로 제조될 수 있다. 3차원 면역글로불린 모델은 통상 이용가능하며 당업자들에게 익숙한 것이다. 선택된 후보 면역 글로불린 서열의 가능한 3차원 입체형태 구조를 디스플레이하고 나타내는 컴퓨터 프로그램이 유효하다. 이러한 디스플레이 검사는 후보 면역 글로불린 서열의 기능에서 잔기의 예상 역할 분석, 즉, 후보 면역 글로불린의 그의 항원과의 결합 능력에 영향을 주는 잔기의 분석을 허용한다. 이런 식으로, FR 잔기는 일치 및 이입된 서열로부터 선택 및 조합되어 증가된 표적 항원(들)에 대한 친화도와 같은 소기의 항체 특성이 얻어진다. 일반적으로, CDR 잔기는 직접적 및 가장 실질적으로 항원 결합에 영향을 미친다. 본 발명의 항체의 인간화 또는 설계는 한정하는 것은 아니나, 각각의 전체가 참고 문헌으로서 본 명세서에 포함되는, 하기에 기술된 바와 같은 임의의 공지 방법을 이용하여 수행될 수 있다: Winter (Jones et al., Nature 321:522 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988)), Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993); Clothia 및 Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987), Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151 :2623 (1993), U.S. 특허 번호: 5723323; 5976862; 5824514; 5817483; 5814476; 5763192; 5723323; 5766886; 5714352; 6204023; 6180370; 5693762; 5530101; 5585089; 5225539; 및 4816567; PCT/: US98/16280; US96/18978; US91/09630; US91/05939; US94/01234; GB89/01334; GB91/01134; GB92/01755; WO90/14443; WO90/14424; 및 WO90/14430; EP 229246.

CXCL13 항체는 본 명세서에 기술된 바, 및/또는 공지된 바와 같이 인간 항체의 특성을 생성할 수 있는 트랜스제닉 동물(예를 들면, 마우스, 랫트, 햄스터, 비인간 영장류 등)의 면역화에 의해서도 또한 임의로 발생될 수 있다. 인간 CXCL13 항체를 생성하는 세포는 이러한 동물로부터 분리될 수 있고 본 명세서에 기술된 방법과 같은 적합한 방법을 이용하여 무한증식될 수 있다.

인간 항원에 결합하는 인간 항체의 레퍼토리를 생성할 수 있는 트랜스제닉 마우스는 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다(비제한적으로, 예를 들면, 각각의 전체가 참고 문헌으로서 본 명세서에 포함되는, U.S. 특허 번호: 5,770,428, 5,569,825, 5,545,806, 5,625,126, 5,625,825, 5,633,425, 5,661,016 및 5,789,650 Lonberg et al.; Jakobovits et al. WO 98/50433, Jakobovits et al. WO 98/24893, Lonberg et al. WO 98/24884, Lonberg et al. WO 97/13852, Lonberg et al. WO 94/25585, Kucherlapate et al. WO 96/34096, Kucherlapate et al. EP 0463 151 B1, Kucherlapate et al. EP 0710 719 A1, Surani et al. US. 특허 번호 5,545,807, Bruggemann et al. WO 90/04036, Bruggemann et al. EP 0438 474 B1, Lonberg et al. EP 0814 259 A2, Lonberg et al. GB 2 272 440 A, Lonberg et al. Nature 368: 856-859 (1994), Taylor et al., Int. Immunol. 6(4)579-591 (1994), Green et al, Nature genetics 7:13-21 (1994), Mendez et al., Nature genetics 15:146-156 (1997), et al., nucleic acid Research 20(23):6287-6295(1992), Tuaillon et al., Proc Natl Acad Sci USA 90(8)3720-3724 (1993), Lonberg et al., Int Rev Immunol 13(1):65-93 (1995) 및 Fishwald et al., Nat Biotechnol 14 (7): 845-851 (1996) 참조). 일반적으로, 이들 마우스는 기능적으로 재배치되거나, 기능적 재배치를 거친 적어도 하나의 인간 면역글로불린 로커스에서의 DNA를 포함하는 적어도 하나의 트랜스유전자를 포함한다. 이러한 마우스에서 내인성 면역글로불린 로커스는 동물이 내인성 유전자에 의해 암호화된 항체를 생성하는 능력을 제거하도록 결실 또는 교란될 수 있다.

본 발명의 항체는 적어도 하나의 항-CXCL13 항체를 암호화하는 핵산을 염소, 소, 말, 양 등과 같은 트랜스제닉 동물 또는 포유동물에 투여하여 그들의 모유 내에 항체를 생성하도록 제조할 수 있다. 이러한 동물은 공지된 방법을 사용하여 제공될 수 있다. 예를 들면, 한정하는 것은 아니나, 각각의 전체가 참고 문헌으로서 본 명세서에 포함된, U.S. 특허 번호 5,827,690; 5,849,992; 4,873,316; 5,849,992; 5,994,616; 5,565,362; 5,304,489 등을 참조할 수 있다. 본 발명의 항체는 적어도 하나의 CXCL13 항체를 암호화하는 핵산을 이용하여 이러한 항체를 생산하는 트랜스제닉 식물 및 배양된 식물 세포(예를 들면, 비제한적으로 담배 및 옥수수), 식물 부분 또는 이들로부터 배양된 세포 내의 특정 부분 또는 변이체를 제공하도록 추가적으로 제조될 수 있다.

본 발명의 항체는 넓은 범위의 친화도(K_D)로 인간 CXCL13에 결합할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 적어도 하나의 인간 mAb는 높은 친화도로 인간 CXCL13에 임의로 결합할 수 있다. 예를 들어, 인간 mAb는 비제한적으로 0.1-9.9 (또는 본원에서 임의의 범위 또는 값) X 10^-7, 10^-8, 10^-9, 10^-10, 10^-11, 10^-12, 10^-13 또는 본원에서 임의의 범위 또는 값과 같이 약 10^-7M과 동등하거나 그 이하의 K_D로 인간 CXCL13에 결합할 수 있다.

항원에 대한 항체의 친화도 또는 결합도는 적합한 방법을 사용하여 실험적으로 결정될 수 있다(예를 들면, Berzofsky, et al., "antibody-antigen Interactions." In Furadamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, NY(1984); Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman 및 Company: New York, NY (1992); 및 본원에 기술된 방법 참조). 특정 항체-항원 상호기능의 친화도는 다른 조건(예를 들면, 염 농도, pH) 하에서 측정될 경우 변화할 수 있다. 그러므로 친화도 및 기타 항원-결합 파라미터(예를 들면, K_D, K_a, K_d)가 바람직하게는 항원 및 항체의 표준화된 용액과 본 명세서에 기술된 바와 같은 표준화된 완충액으로 제조된다.

CXCL13 길항제(예: 단일클론 항체)는 표준적인 기술, 예컨대, 친화도 크로마토그래피 또는 면역침전법으로 CXCL13 폴리펩티드를 분리하는데 사용될 수 있다. 또한 이러한 항체는 폴리펩티드 발현의 풍부성 및 패턴을 평가하기 위하여 단백질(예: 세포 용해물 또는 세포 상청액)을 검출하는데 사용될 수 있다. 항체는 또한 임상 검사 절차의 부분으로서 조직에서 단백질 수준을 모니터하는데, 예를 들어, 제공된 치료 처방의 효율을 결정하는데 진단적으로 사용될 수 있다. 검출은 검출가능한 물질에 대한 항체의 커플링으로 이용될 수 있다. 검출가능한 물질의 예시는 다양한 효소, 보결 그룹, 형광 물질, 발광 물질, 바이오발광 물질 및 방사능 물질을 포함한다. 적합한 효소의 예시는 양고추냉이 페록시디아제, 알칼라인 포스파타아제, β-갈락토시다아제 및 아세틸콜린에스테라아제를 포함한다; 적합한 보결 그룹 복합체의 예시는 스트랩트아비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴을 포함한다; 적합한 형광 물질의 예시는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린을 포함한다; 발광 물질의 예시는 루미놀을 포함한다; 바이오발광 물질의 예시는 루시퍼라아제, 루시페린 및 에쿼린을 포함하고 적합한 방사능 물질의 예시는 ¹²⁵I, ¹³¹I, ³⁵S 또는 ³H를 포함한다.

또한, 용어 "항체"는 항체, 그의 분해 단편, 특정 부분 및 변이체를 포함하고자 하며, 항체 모방체를 포함하거나, 단쇄 항체 및 그의 단편을 포함하는, 항체 또는 그의 특정 단편 또는 부분의 구조 및/또는 기능을 모방하는 항체의 부분을 포함한다. 기능성 단편은 포유 동물 CXCL13에 결합하는 항원-결합 단편을 포함한다. 예로서, CXCL13 또는 그의 부분에 결합할 수 있는 항체 단편은 제한하는 것은 아니지만, Fab(예로서, 파파인 분해에 의해), Fab'(예로서, 펩신 분해 및 부분적인 환원에 의해) 및 F(ab')₂ (예로서, 펩신 분해에 의해), facb(예: 플라스민 분해에 의해), pFc'(예로서, 펩신 또는 플라스민 분해에 의해), Fd(예로서, 펩신 분해, 부분적인 환원 및 재응집에 의해), Fv 또는 scFv(예: 분자생물학 기술에 의해) 단편을 포함하고 이는 본 발명에 포함된다(참조, 예: Colligan, Immunology, supra).

이러한 단편은 당업계에 공지되어 있고/있거나 본 명세서에 기술된 바와 같은 효소적 절단, 합성 또는 재조합 기술에 의해 제조될 수 있다. 항체는 또한 하나 이상의 정지 코돈이 자연적 정지 부위의 업스트림에 도입된 항체 유전자를 사용하여 다양한 절단 형태로 제조될 수 있다. 예를 들면, F (ab')₂ 중쇄 부분을 암호화하는 조합 유전자는 중쇄의 C_H1 도메인 및/또는 힌지 영역을 암호화하는 DNA 서열을 포함하도록 설계될 수 있다. 항체의 다양한 부분은 통상의 기술에 의해 화학적으로 서로 결합될 수 있거나, 유전공학 기술을 사용하여 인접 단백질로서 제조될 수 있다.

항-CXCL13 항체는 영장류, 설치류 또는 인간 항체 또는 키메라 또는 인간화된 항체일 수 있다. 본원에서 사용되는 "인간 항체"는 단백질(예를 들면, CDR, 프레임워크, CL, CH 도메인(예를 들면, C_H1, C_H2, C_H3), 힌지,(VL, VH))의 실질적인 모든 부분이 단지 적은 서열 변화 또는 변경만 있는, 인체 내에서 실질적으로 비-면역원성인 항체를 의미하고/하거나 공지된 인간 항체 성분으로 설계되거고, 유도되거나, 포함한다. 유사하게 영장류(원숭이, 비비, 침팬지, 등), 설치류(마우스, 랫트, 토끼, 기니아 픽, 햄스터 등) 및 다른 포유동물을 디자인하는 항체는 이러한 종, 하위속, 속, 하위 과, 과 특이적 항체를 디자인한다. 또한, 본 발명의 키메라 항체는 상기의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 이러한 변경 또는 변형은 부가적으로 바람직하게는 비-변형된 항체와 비교하여, 인간 또는 다른 종 내에서 면역원성을 억제 또는 감소시킨다. 그러므로, 인간 항체는 키메라 또는 인간화된 항체와 구분된다. 인간 항체가 기능적으로 재배치된 인간 면역 글로블린(예를 들면, 중쇄 및/또는 경쇄) 유전자를 발현할 수 있는 비-인간 동물 또는 진핵 또는 원핵 세포에 의해 제조될 수 있다. 또한, 인간 항체가 단쇄 항체일 때, 본래 인간 항체 내에서 발견되지 않는 링커 펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, Fv는 2 내지 약 8개의 글리신 또는 다른 아미노산 잔기와 같은 링커 펩티드를 포함할 수 있고, 이는 중쇄의 가변영역 및 경쇄의 가변 영역에 연결된다. 이러한 링커 펩티드는 인간 기원인 것으로 간주된다.

적어도 두 개의 상이한 항원에 대해 결합 특이적을 갖는, 단일, 바람직하게는 인간 또는 인간화된 항체인 양특이적, 이형특이적, 이형컨쥬게이트 또는 유사 항체가 또한 사용될 수 있다. 이러한 경우, 결합 특이적 중 하나는 적어도 하나는 CXCL13 단백질에 대한 것이고, 다른 하나는 임의의 다른 항원, 예를 들어, CXCL13 수용체 또는 TNFα에 대한 것이다. 양특이적 항체의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다. 전형적으로, 양특이적 항체의 재조합 생성은 두 중쇄가 상이한 특이적을 갖는 두 개의 면역 글로블린 중쇄-경쇄 쌍의 공동-발현에 기초한다(Milstein 및 Cuello, Nature 305: 537 (1983)). 면역글로블린 중쇄 및 경쇄의 무작위 배열로 인해, 이들 하이브리도마(쿼드로마)는 10개의 상이한 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생성하고, 그 중 단지 하나만이 올바른 양특이적 구조를 갖는다. 올바른 분자의 정제는 일반적으로 친화성 크로마토그래피 단계에 의해 수행되는데 다소 번거롭고, 생성 수득율이 낮다. 유사한 절차가 예를 들면, WO 93/08829, US 특허 번호 6210668, 6193967, 6132992, 6106833, 6060285, 6037453, 6010902, 5989530, 5959084, 5959083, 5932448, 5833985, 5821333, 5807706, 5643759, 5601819, 5582996, 5496549, 4676980, WO 91/00360, WO 92/00373, EP 03089, Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991), Suresh et al., Methods in Enzymology 121: 210 (1986)에 개시되어 있고, 이들은 모두 참고 문헌으로서 본 명세서에 포함되어 있다.

본 발명의 방법 및 조성물에서 유용한 항-CXCL13 항체는 CXCL13에 대한 높은 친화도 결합에 의하여 부가적으로 특성화될 수 있고 바람직하게는 부가적으로 저독성이다. 특히, 가변 영역, 불변 영역 및 프레임워크와 같은 각 성분이 각각 및/또는 함께, 임의로 및 바람직하게 낮은 면역원성을 갖는 본 발명의 항체, 특정 단편 또는 변이체는 본 발명에서 유용하다. 본 발명에서 사용될 수 있는 항체는 징후의 상당한 감소 및 적고/적거나 허용가능한 독성으로 연장된 기간 동안 환자를 치료하는 능력에 의해 부가적으로 특성화된다. 적거나 허용가능한 면역원성 및/또는 높은 친화도뿐만 아니라 다른 적합한 특성은 달성하고자 하는 치료적 결과에 기여할 수 있다. "낮은 면역원성"은 HAHA, HACA 또는 HAMA 반응을 치료할 환자의 약 75% 미만, 또는 바람직하게는 약 50% 미만으로 유의하게 증가시키고/거나 낮은 역가를 증가시키는 것으로 정의된다(이중 항원 효소 면역분석으로 측정하여 약 300 미만, 바람직하게는 약 100 미만임)(예를 들면, 전체가 참고 문헌으로서 본 명세서에 포함된, Elliott er al., Lancet 344 : 1125-1127 (1994) 참조).

적합한 항체는 CXCL13 활성을 차단하는 단일클론 항체를 갖는, 인간 CXCL13에 결합하기 위하여 경쟁하는 것들을 포함한다.

siRNA, shRNA, 안티센스, 리보자임 및 DNAzyme 형태의 CXCL13 길항제

CXCL13의 유도 인자를 표적으로 하는 치료는 더 나은 성공 기회를 제공할 수 있다. 유전자 발현은 siRNA, shRNA, 안티센스 분자, 리보자임 및 DNAzyme의 사용을 포함하는 다양한 방법으로 조절될 수 있다. 합성 siRNA, shRNA, 리보자임 및 DNAzyme은 하나 이상의 유전자를 특이적으로 표적으로 하도록 설계될 수 있고 이들은 시험관 내 또는 생체 내 세포로 쉽게 전달될 수 있다.

본 발명은 안티센스 핵산 분자, 즉, CXCL13 폴리펩티드를 암호화하는 센스 핵산에 상보적인 분자, 예를 들어, 이중 가닥 cDNA 분자의 가닥을 암호하거나 mRNA 서열에 상보적인 분자를 포함한다. 따라서, 안티센스 핵산은 센스 핵산에 수소 결합할 수 있다. 안티센스 핵산은 총 암호화 가닥, 또는 이의 부분, 예를 들어, 단백질 암호화 영역의 모두 또는 일부(또는 개방 리딩 프레임)에 상보성일 수 있다. 안티센스 핵산 분자는 CXCL13 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 암호화 가닥의 비암호화 영역의 모두 또는 일부에 대하여 안티센스일 수 있다. 비암호화 영역("5' 및 3' 비번역 영역")은 암호화 영역을 플랭크하고 아미노산으로 번역되지 않는 5' 및 3' 서열이다.

안티센스 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어, 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50개 이상의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 본 발명의 안티센스 핵산은 당업계에 공지된 절차를 사용하여 화학적 합성 및 효소적 라이게이션 기능을 사용하여 작제될 수 있다. 예를 들어, 안티센스 핵산(예: 안티센스 올리고뉴클레오티드)은 천연 유래 뉴클레오티드, 또는 분자의 생물학적 안정성을 증가시키거나 안티센스와 센스 핵산 사이에서 듀플렉스 형태의 물리적 안정성을 증가시키기 위하여 설계된 다양한 변형된 뉴클레오티드, 예를 들어, 포스포로티오에이트 유도체, 펩티드 핵산(PNA) 및 아크리딘 치환 뉴클레오티드를 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 안티센스 핵산을 생성하는데 사용될 수 있는 변형된 뉴클레오티드의 예시는 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-요오도우라실, 히포키산틴, 크산틴, 4-아세틸시토신, 5-(카복시하이드록실메틸) 우라실, 5-카복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카복시메틸아미노메틸우라실, 디하이드로우라실, 베타-D-갈락토실큐에오신, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실큐에오신, 5'-메톡시카복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산(V), 와이부톡소신, 슈도우라실, 큐에오신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산(V), 5-메틸-2-티오우라실, 3-(3-아미노-3-N-2-카복시프로필) 우라실, (acp3)w 및 2,6-디아미노퓨린을 포함한다. 대안적으로, 안티센스 핵산은 안티센스 기원에서 서브클론된 핵산(예를 들어, 삽입된 핵산으로부터 전사된 RNA는 원하는 핵산을 표적으로 하는 안티센스 기원일 것이고, 하기 부분에 좀더 설명된다)으로 발현 벡터를 사용하여 생물학적으로 생산될 수 있다.

본 발명의 안티센스 핵산 분자는 전형적으로 대상에 투여되거나 그들이 세포 mRNA 및/또는 예를 들어, 전사 및/또는 번역을 억제함으로써 발현을 억제하기 위하여 선택된 CXCL13 폴리펩티드를 암호화하는 게놈 DNA에 결합 또는 하이브리드하도록 인 시츄에서 생성된다. 하이브리드는 안정한 듀플렉스를 형성하기 위하여 상보성인 통상의 뉴클레오티드로 이루어질 수 있거나, 예를 들어, DNA 듀플렉스에 결합하는 안티센스 핵산 분자의 경우에, 이중 헬릭스의 주요 그루브에서 특이적인 상호기능을 통하여 이루어질 수 있다. 본 발명의 안티센스 핵산 분자의 투여 경로의 예시는 조직 부위에 직접적인 주사를 포함한다. 대안적으로, 안티센스 핵산 분자는 선택된 세포를 표적으로 하기 위하여 변형된 다음 전신적으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 전신 투여를 위하여, 안티센스 분자는 예를 들어, 안티센스 핵산 분자를 세포 표면 수용체 또는 항원에 결합하는 펩티드 또는 항체에 연결시킴으로써 선택된 세포 표면 상에서 발현하는 수용체 또는 항원에 특이적으로 결합하도록 변형될 수 있다. 안티센스 핵산 분자는 또한 본원에 기재한 벡터를 사용하여 세포로 전달될 수 있다. 안티센스 분자의 충분한 세포내 농도를 달성하기 위하여, 안티센스 핵산 분자가 강력한 pol II 또는 pol III 프로모터 조절 하에 있는 벡터 작제물이 바람직하다.

본 발명의 안티센스 핵산 분자는 α-아노머 핵산 분자일 수 있다. α-아노머 핵산 분자는 보통 α-유닛과 반대이고, 가닥이 각각 평행한 RNA와 상보적인 특이적 이중 가닥 하이브리드를 형성한다(Gaultier et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15:6625-6641). 안티센스 핵산 분자는 또한 2'-o-메틸리보뉴클레오티드(Inoue et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15:6131-6148) 또는 키메라 RNA-DNA 유사체(Inoue et al. (1987) FEBS Lett. 215:327- 330)를 포함한다.

본 발명은 또한 리보자임을 포함한다. 리보자임은 단일 가닥 핵산, 예컨대, mRNA를 상보적인 영역에서 절단할 수 있는 리보뉴클레아제 활성을 갖는 촉매 RNA 분자이다. 따라서, 리보자임(예: Haselhoff 및 Gerlach (1988) Nature 334:585-591에 기재된 해머헤드 모양의 리보자임)은 mRNA 전사물을 촉매적으로 절단하여 mRNA에 의해 암호화되는 단백질의 번역을 억제하는데 사용될 수 있다. CXCL13 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자에 대하여 특이적을 갖는 리보자임은 본원에 개시된 cDNA의 뉴클레오티드 서열을 기초로 하여 설계될 수 있다. 예를 들어, 테트라히메나 L-19 IVS RNA의 유도체는 활성 부위의 뉴클레오티드 서열이 Cech 등의 U.S. 특허 번호 4,987,071; 및 Cech 등의 U.S. 특허 번호 5,116,742에서 절단된 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적으로 작제될 수 있다. 대안적으로, CXCL13 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA는 RNA 분자 풀로부터 특이적 리보뉴클레아제 활성을 갖는 촉매 RNA를 선택하기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들어, Haselhoff 및 Gerlach supra; Bartel 및 Szostak (1993) Science 261 :1411-1418을 참조할 수 있다.

본 발명은 또한 상보성이고, 안티센스, 이중 가닥 유사체, siRNA, 또는 짧은 헤어핀 구조, shRNA(집합적으로, 간섭 RNA)를 형성하는 서열 특이적 단일 가닥 RNA인 리보핵산 분자를 포함하고, 이는 특이적 유전자 발현, 이 경우 CXCL13을 하향조절하는데 사용될 수 있으며, 이로써 단백질 발현을 억제시키고 그들 각각의 생물학적 기능을 밝힌다(Fire, A., et al. (1998) Nature 391:806-811 ; Paddison, P.J. et al. (2002) Gene Develop 16:948-958).

본 발명은 또한 RNA(Breaker 및 Joyce, 1994; Santoro 및 Joyce, 1997) 또는 DNA(Carmi et al., 1996) 분자를 절단할 수 있는 DNAzyme을 포함한다. 이러한 핵산 효소의 촉매 절단 비율은 이가 금속 이온, 예컨대, Ba²⁺, Sr²⁺, Mg²⁺, Ca²⁺, Ni²⁺, Co²⁺, Mn²⁺, Zn²⁺ 및 Pb²⁺의 존재 및 농도에 달려있다(Santoro 및 Joyce, 1998; Brown et al., 2003).

촉매 DNAzyme, 예컨대, 10:23 및 8:17 DNAzyme은 다중 도메인을 갖는다. 이들은 두개의 비보존 기질 결합 도메인(하이브리드 팔)에 의해 플랭크되는 보존 촉매 도메인(촉매 코어)을 가지고, 이는 기질에 특이적으로 결합하는 서열의 영역이다. 10:23 및 8:17 DNAzyme은 특이적 RNA 포스포디에스테르 결합에서 핵산 기질을 절단할 수 있다(Santoro 및 Joyce, 1997). 10:23 DNAzyme은 기질-인식 팔에 의해 플랭크되는 15개의 데옥시뉴클레오티드의 촉매 도메인을 갖는다.

촉매 핵산은 핵산 기질을 요구를 최소한으로 만족시키는 표적 서열로 절단할 수 있다. 기질 서열은 촉매 핵산의 하이브리드 팔에 대하여 실질적으로 상보적이어야 하고, 기질은 절단 부위에서 특이적 서열을 포함하여야 한다. 절단 부위에서 요구되는 특정 서열은 예를 들어, 10:23 DNAzyme에 의한 절단에 대한 퓨린:피리미딘 리보뉴클레오티드 서열을 포함한다(Santoro 및 Joyce, 1997).

다양한 구체예에서, 본 발명의 핵산 분자는, 예를 들어, 안정성, 하이브리드화 또는 분자의 가용성을 개선하기 위하여 염기 부위, 당 부위 또는 포스페이트 백본에서 변형될 수 있다. 예를 들어, 상술한 바와 같은 뉴클레오티드 유사체는 천연 유래 뉴클레오티드에 대하여 치환될 수 있다.

다른 예시에서, 핵산의 데옥시리보오스 포스페이트 백본은 펩티드 핵산을 생성하기 위하여 변형될 수 있다(Hyrup et al. (1996) Bioorganic & Medicinal Chemistry 4(1): 5-23 참조). 본원에서 사용되는 "펩티드 핵산" 또는 "PNA"는 핵산 모방체, 예를 들어, DNA 모방체를 의미하고, 여기에서 데옥시리보오스 포스페이트 백본은 슈도펩티드 백본으로 치환되고 단지 원래 4개의 뉴클레오염기가 유지된다. PNA의 중성의 백본은 낮은 이온성 강도의 조건 하에 DNA 및 RNA에 특이적인 하이브리드를 제공하는 것으로 알려졌다. PNA 올리고머의 합성은 Hyrup et al. (1996), supra; Perry-O'Keefe et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 14670-675에 기재된 바와 같이 표준의 고체상 펩티드 합성 프로토콜을 사용하여 수행될 수 있다.

PNA는 치료 및 진단 적용에 사용될 수 있다. 예를 들어, PNA는 예를 들어, 전사 또는 번역 억제를 유도하거나 복제를 억제하여 유전자 발현의 서열-특이적 조절에 대한 안티센스 또는 항원 제제로서 사용될 수 있다. PNA는 또한 예를 들어, PNA 직접적 PCR 클램핑; 다른 효소, 예를 들어, S1 뉴클레아제(Hyrup (1996), supra)와 조합하여 사용될 경우 인공 제한 효소로서; 또는 DNA 서열 및 하이브리드에 대한 프로브 또는 프라이머로서(Hyrup (1996), supra; Perry-O'Keefe et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 14670-675) 유전자에서 단일 염기 쌍 돌연변이의 분석에 사용될 수 있다.

다른 구체예에서, PNA는 예를 들어, 지방 친화성 또는 PNA에 대한 다른 보조 그룹에 부착, PNA-DNA 키메라의 형성 또는 리포좀 또는 당업계에 공지된 시약 전달의 다른 기술을 사용함으로써, 그들의 안정성 또는 세포 흡수를 증진시키기 위하여 변형될 수 있다. 예를 들어, PNA-DNA 키메라는 PNA 및 DNA의 이로운 특성을 조합하도록 생성될 수 있다. 이러한 키메라는 DNA 인식 효소, 예를 들어, RNASE H 및 DNA 폴리머라제를 DNA 부분과 상호기능하도록 하고, PNA 부분은 높은 결합 친화도 및 특이적을 제공하도록 한다. PNA-DNA 키메라는 염기 스택킹, 뉴클레오염기 사이에서 결합의 수 및 기원에서 선택된 적합한 길이의 링커를 사용하여 연결될 수 있다(Hyrup (1996), supra). PNA-DNA 키메라의 합성은 Hyrup (1996), supra 및 Finn et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24(17): 3357-63에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 예를 들어, DNA 사슬은 표준 포스포라미다이트 커플링 화학 및 변형된 뉴클레오시드 유사체를 사용하여 고체 지지 상에서 합성될 수 있다. 화합물, 예컨대, 5'-(4-메톡시트리틸)아미노-5'-데옥시-티미딘 포스포라미다이트가 PNA 및 DNA의 5' 말단 사이의 링커로 사용될 수 있다(Mag et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:5973-88). 이어서 PNA 모노머는 순차적 방식으로 커플링되어 5' PNA 구획 및 3' DNA 구획을 갖는 키메라 분자를 생한한다(Finn et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24(17):3357-63). 대안적으로, 키메라 분자는 5' DNA 구획 및 3' PNA 구획으로 합성될 수 있다(Peterser et al. (1975) Bioorganic Med. Chem. Lett. 5:1119-11124).

다른 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 다른 부가 그룹, 예컨대, 펩티드(예: 생체 내 숙주 세포 수용체를 표적하기 위하여), 또는 세포 막(예를 들어, Letsinger et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6553-6556; Lemaitre et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:648-652; PCT 출원 번호 WO 88/09810 참조) 또는 뇌혈관장벽(예를 들어, PCT 출원 번호 WO 89/10134 참조)을 가로지르는 전달을 용이하게 하는 제제를 포함할 수 있다. 또한 올리고뉴클레오티드는 하이브리드-트리거 절단제(예를 들어, Krol et al. (1988) Bio/Techniques 6:958-976 참조) 또는 삽입제(예를 들어, Zon (1988) Pharm. Res. 5:539-549 참조)로 변형될 수 있다. 이 때문에, 올리고뉴클레오티드는 다른 분자, 예를 들어, 펩티드, 교차 결합제로 트리거된 하이브리드, 전달제, 하이브리드-트리거 절단제와 결합될 수 있다.

단백질

본 발명은 또한 키메라 또는 융합 단백질을 제공한다. 본원에서 사용되는 "키메라 단백질" 또는 "융합 단백질"은 이종의 폴리펩티드(즉 동일한 CXCL13 폴리펩티드와는 다른 폴리펩티드)에 작동가능하게 연결되는 CXCL13 폴리펩티드의 전체 또는 부분(바람직하게 생물학적으로 활성)을 포함한다. 융합 단백질 내에, "작동가능하게 연결된"은 CXCL13 폴리펩티드 및 이종의 폴리펩티드가 서로 프레임 내에서 융합되는 것을 의미하고자 한다. 이종의 폴리펩티드는 CXCL13 폴리펩티드의 아미노-말단 또는 카복실-말단에 융합될 수 있다. 다른 구체예에서, CXCL13 폴리펩티드 또는 도메인 또는 이의 활성 단편은 키메라 단백질을 형성하기 위하여 이종의 단백질 서열 또는 이의 단편과 융합될 수 있고, 여기에서 폴리펩티드, 도메인 또는 단편은 말단에서 말단으로 융합되지 않지만 이종의 단백질 프레임워크 내에 삽입된다.

하나의 유용한 융합 단백질은 CXCL13 폴리펩티드가 GST 서열의 카복실 말단에 융합되는 GST 융합 단백질이다. 이러한 융합 단백질은 재조합 CXCL13 폴리펩티드의 정제에 유용할 수 있다.

다른 구체예에서, 융합 단백질은 그의 아미노 말단에서 이종의 신호 서열을 포함한다. 예를 들어, CXCL13 폴리펩티드의 본래 신호 서열은 제거될 수 있고 다른 단백질의 신호 서열로 대체될 수 있다. 예를 들어, 바큘로바이러스 외피 단백질의 gp67 분비 서열은 이종의 신호 서열로서 사용될 수 있다(Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, 1992). 진핵의 이종 신호 서열의 다른 예시는 멜리틴의 분비 서열 및 인간 태반 알칼라인 포스파타아제(Stratagene; La JoIIa, Calif.)를 포함한다. 또다른 예시에서, 유용한 원핵 이종의 신호 서열은 phoA 분비 신호(Sambrook et al., supra) 및 단백질 A 분비 신호(Pharmacia Biotech; Piscataway, N. J.)를 포함한다.

또다른 구체예에서, 융합 단백질은 CXCL13 폴리펩티드의 전체 또는 부분이 면역글로블린 단백질 패밀리의 멤버로부터 유래된 서열에 융합되는 면역글로블린 융합 단백질이다. 본 발명의 면역글로블린 융합 단백질은 약제학적 조성물에 통합될 수 있고 세포(수용체)의 표면 상의 리간드(수용성 또는 막-부착)와 단백질 사이의 상호기능을 억제하기 위하여 대상에 투여될 수 있고, 이로써 생체 내 신호 변환을 억제하게 된다. 면역글로블린 융합 단백질은 CXCL13 폴리펩티드의 동종의 리간드의 생체이용율에 영향을 주기 위하여 사용될 수 있다. 리간드/수용체 상호기능의 억제는 증식과 분화 질환의 치료 및 세포 생존의 조절(예: 증진 또는 억제) 모두에 치료적으로 사용될 수 있다. 면역글로블린 키메라 단백질의 바람직한 구체예는 C_H1 도메인-삭제 면역글로블린 또는 동시 계류중인 출원 PCT WO/04002417에서 지시하는 바와 같이 변형된 프레임워크 영역 내에 통합된 활성의 폴리펩티드 단편을 갖는 "모방체"이다. 또한, 본 발명의 면역글로블린 융합 단백질은 대상에서 CXCL13 폴리펩티드에 대한 항체를 생산하기 위한 면역원으로서 사용될 수 있고, 수용체와 리간드의 상호기능을 억제하는 분자를 확인하는 스크리닝 어세이에서 리간드를 정제하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 키메라 및 융합 단백질은 표준의 재조합 DNA 기술로 생산될 수 있다. 다른 구체예에서, 융합 유전자는 DNA 자동 합성장치를 포함하는 통상의 기술로 합성될 수 있다. 대안적으로, 유전자 단편의 PCR 증폭은 연속적으로 어닐링되고 재증폭되어 키메라 유전자 서열을 생성할 수 있는 두개의 연속적인 유전자 단편 사이에 상보적인 오버행을 발생시키는 앵커 프라이머를 사용하여 수행될 수 있다(예를 들어, Ausubel et al., supra 참조). 또한, 융합 부위(예: GST 폴리펩티드)를 미리 암호화하는 많은 발현 벡터가 상업적으로 이용가능하다. CXCL13 폴리펩티드를 암호화하는 핵산은 융합 부위가 CXCL13 폴리펩티드에 대하여 프레임 내에서 연결될 수 있도록 이러한 발현 벡터로 클론될 수 있다.

CXCL13 폴리펩티드의 신호 서열은 분비된 단백질 또는 원하는 다른 단백질의 분비 및 분리에 사용될 수 있다. 신호 서열은 전형적으로 하나 이상의 절단 이벤트에서의 분비 동안 성숙 단백질로부터 일반적으로 절단되는 소수성 아미노산의 코어에 의해 특정지어진다. 이러한 신호 펩티드는 그들이 분비 경로를 통하여 이동하는 것과 같이 성숙 단백질로부터 신호 서열을 절단하도록 하는 프로세싱 부위를 포함한다. 따라서, 본 발명은 신호 서열을 갖는 기재된 폴리펩티드뿐만 아니라 신호 서열 그 자체 및 신호 서열의 부재 중의 폴리펩티드(즉, 절단 생성물)에 관한 것이다. 일 구체예에서, 본 발명의 신호 서열을 암호화하는 핵산 서열은 발현 벡터에서 대상 단백질, 예컨대, 정상적으로 분비되지 않거나 분리하기 어려운 단백질에 작동가능하게 연결될 수 있다. 신호 서열은 예컨대, 발현 벡터가 형질전환된 진핵 숙주의 단백질로부터 직접 분비되고, 신호 서열은 연속적 또는 동시에 절단된다. 이어서 단백질은 당업계에 인지된 방법으로 세포외 매질로부터 쉽게 정제될 수 있다. 대안적으로, 신호 서열은 정제가 용이한, 예컨대, GST 도메인을 갖는 서열을 사용하여 대상 단백질에 연결될 수 있다.

다른 구체예에서, 본 발명의 신호 서열은 조절 서열, 예를 들어, 프로모터, 인핸서 및/또는 억제 물질을 확인하는데 사용될 수 있다. 신호 서열은 대부분 펩티드의 아미노-말단 서열이므로, 그의 아미노-말단 측면 상의 신호 서열을 플랭킹하는 핵산은 전사에 영향을 미치는 조절 서열일 수 있다. 따라서, 신호 서열의 전체 또는 부분을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 신호 서열 및 그들의 플랭크 영역의 확인 및 분리하는데 프로브로서 사용될 수 있고, 이들 플랭크 영역은 본원에서 조절 요소를 확인하기 위하여 연구될 수 있다.

본 발명은 또한 CXCL13 폴리펩티드의 변이체에 관한 것이고 본원에서 한정한 바, 자연적 돌연변이 또는 인간 조작으로부터의 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 첨가를 포함할 수 있다. 이러한 돌연변이 또는 치환은 뮤테인을 포함할 수 있고, 이의 돌연변이는 펩티드의 생물학적 활성의 변경 없이 인간 CXCL13가 그의 리간드에 결합 하는 것을 억제하기 위하여 펩티드의 성질을 변경하는데 충분할 수 있다. 물론, 당업자는 아미노산 치환의 수를, 상술한 것들을 포함하는, 많은 인자에 따라 만들 수 있다. 본 발명의 특정 구체예에서, 임의로 제공된 CXCL13 폴리펩티드, 단편 또는 변이체에 대한 아미노산 치환, 삽입 또는 결실은 본원에서 한정한 바, 1-5 이상일 수 없거나, 임의의 범위 또는 값 이상일 수 없다.

CXCL13 폴리펩티드는 또한 그들의 아미노산 서열에 변형되고, 비자연 유래의 일반적이지 않은 아미노산의 치환 또는 첨가를 포함한다. 변형되고, 비자연 유래의 일반적이지 않은 아미노산의 예시 목록을 하기에 제공한다.

변형된(일반적이지 않은) 아미노산 기호

2-아미노아디프산 Aad

3-아미노아디프산 Baad

베타-알라닌, 베타-아미노프로피온산 bAla

2-아미노부티르산 Abu

4-아미노부티르산, 피페리딘산 4Abu

6-아미노카프로산 Acp

2-아미노헵타노산 Ahe

2-아미노이소부티르산 Aib

3-아미노이소부티르산 Baib

2-아미노피멜릭산 Apm

2,4-디아미노부티르산 Dbu

데스모신 Des

2,2'-디아미노피멜릭산 Dpm

2,3-디아미노프로피온산 Dpr

변형된(일반적이지 않은) 아미노산 기호

N-에틸글리신 EtGly

N-에틸아스파라긴 EtAsn

하이드록시리신 Hyl

알로-하이드록시리신 Ahyl

3-하이드록시프롤린 3Hyp

4-하이드록시프롤린 4Hyp

이소데스모신 lde

알로-이소루신 Aile

N-메틸글리신, 사르코신 MeGly

N-메틸이소루신 Melle

6-N-메틸리신 MeLys

N-메틸발린 MeVal

노르발린 Nva

노르루신 Nle

오르니틴 Orn

기능에 필수적인 CXCL13 폴리펩티드의 아미노산은 당업계에 공지된 방법, 예컨대, 부위-직접 돌연변이유발 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이유발로 확인될 수 있다(예: Ausubel, supra, Chapters 8, 15; Cunningham 및 Wells, Science 244:1081- 1085 (1989)). 후자의 절차는 분자의 모든 잔기에서 단일 알라닌 돌연변이를 도입한다. 결과의 변이 분자는 이어서 생물학적 활성, 예컨대, 한정하는 것은 아니나, 적어도 하나의 CXCL13 중화 활성에 대하여 검사된다.

이러한 변이체는 변경된 아미노산 서열을 가지고 효능제(모방체) 또는 길항제로서 기능할 수 있다. 변이체는 돌연변이 형성, 예를 들어, 분리된 점 돌연변이 또는 절단에 의해 생성될 수 있다. 효능제는 단백질의 천연 유래 형태의 생물학적 활성과 실질적으로 동일하거나 서브세트로 유지될 수 있다. 단백질의 길항제는 하나 이상의 단백질의 천연 유래 형태의 활성을, 예를 들어, 대상 단백질을 포함하는 세포 신호 캐스캐이드의 다운스트림 또는 업스트림 일원에 길항적으로 결합하여 억제할 수 있다. 따라서, 특이적 생물학적 효과는 제한된 기능의 변이체의 치료에 의해 유도될 수 있다. 단백질의 천연 유래 형태의 생물학적 활성을 갖는 변이체로 대상을 치료하는 것은 단백질의 천연 유래 형태로 치료하는 것에 비하여 대상에서 부기능이 거의 없을 수 있다.

효능제(모방체) 또는 길항제로서 기능하는 CXCL13 폴리펩티드의 변이체는, 예를 들어, 효능제 또는 길항제 활성에 대한 본 발명의 단백질의 절단 돌연변이의 조합 라이브러리를 스크리닝함으로써 확인될 수 있다. 일 구체예에서, 변이체의 다양한 라이브러리는 핵산 레벨에서 조합 돌연변이 형성에 의해 생성되고 다양한 유전자 라이브러리에 의해 암호화된다. 변이체의 다양한 라이브러리는 예를 들어, 효능 있는 단백질 서열의 축중 세트가 개별의 폴리펩티드 또는 대안적으로, 더 큰 융합 단백질(예를 들어, 파지 디스플레이)로서 발현가능하도록 합성 올리고뉴클레오티드의 혼합물을 유전자 서열로 효소적으로 라이게이션시켜 생성될 수 있다. 축중 올리고뉴클레오티드 서열로부터 CXCL13 폴리펩티드의 효능 있는 변이체의 라이브러리를 생산하는데 사용될 수 있는 다양한 방법이 있다. 축중 올리고뉴클레오티드를 합성하는 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, Narang (1983) Tetrahedron 39:3; ltakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; ltakura et al. (1984) Science 198:1056; lke et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11:477 참조).

또한, CXCL13 폴리펩티드의 암호화 서열 단편의 라이브러리는 변이체의 스크리닝 및 다음의 선택에 있어서 폴리펩티드의 다양한 집단을 생성하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 암호화 서열 단편의 라이브러리는 조건 하에 뉴클레아제로 대상의 암호화 서열의 이중 가닥 PCR 단편을 처리함으로써 생성될 수 있고, 여기에서 절단은 분자 당 단지 약 하나에서 발생하고, 이중 가닥 DNA를 변성하며, 상이한 절단된 산물로부터 센스/안티센스 쌍을 포함할 수 있는 이중 가닥 DNA를 형성하기 위하여 DNA를 재생하고, S1 뉴클레아제의 처리에 의해 변형된 듀플렉스로부터 단일 가닥 부분을 제거하며, 결과의 단편 라이브러리를 발현 벡터로 라이게이션한다. 이 방법으로, 아미노 말단 및 대상 단백질의 다양한 크기의 내부 단편을 암호화하는 발현 라이브러리를 유도할 수 있다.

점 돌연변이 또는 절단에 의해 제조되는 조합 라이브러리의 유전자 산물의 스크리닝 및 선택된 특성을 갖는 유전자 산물의 cDNA 라이브러리의 스크리닝에 대한 몇몇의 기술이 당업계에 공지되어 있다. 큰 유전자 라이브러리를 스크리닝하기 위하여 고 용량 분석이 가능한, 가장 널리 사용되는 기술은 전형적으로 유전자라이브러리를 복제가능한 발현 벡터로의 클로닝, 벡터의 결과 라이브러리를 갖는 적합한 세포의 형질전환 및 조건 하의 조합 유전자의 발현을 포함하고, 여기에서 원하는 활성의 검출은 검출된 유전자의 산물을 암호화하는 벡터의 분리를 용이하게 한다. 라이브러리에서 기능적 돌연변이의 횟수를 증진시키는 기술, REM(Recursive Ensemble Mutagenesis)이 CXCL13 길항제 폴리펩티드의 변이체를 확인하기 위한 스크리닝 어세이와의 조합에 사용될 수 있다(Arkin and Yourvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811-7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3):327-331).

조성물 및 그들의 용도

본 발명에 따라, CXCL13 길항제, 예컨대, 단일클론 항체를 중화시키는 것은 본원에 기재한 바와 같이 CXCL13 활성을 억제하는데 사용될 수 있다. 부가적으로, 이러한 길항제는 한정하고자 하는 것은 아니나, 폐-관련 질환을 포함하는 치료가 가능한 CXCL13-관련 염증성 질환을 억제하는데 사용될 수 있다. 치료될 개체는 임의의 포유류일 수 있고 바람직하게 영장류, 포유류인 동반 동물일 수 있고, 가장 바람직하게, 인간 환자일 수 있다. 투여되는 길항제의 양은 투여의 방법 및 투여를 위하여 사용되는 목적에 따라 변할 것이다.

항-CXCL13 길항제는 CXCL13 활성이 방해되거나 정지되길 원하는 조직에서 효과적인 많은 방법에 의해 투여될 수 있다. 또한, CXCL13 길항제는 CXCL13 활성 상에 대한 영향을 국부적으로 가질 필요는 없다. 그러므로, 이들은 CXCL13을 포함하는 체액 또는 신체 구획 어디에든 접근할 수 있도록 투여될 수 있다. 염증, 악성 또는 면역반응이 제대로 되지 않는 조직의 경우에, 이들 방법은 길항제를 포함하는 제제의 직접적인 적용을 포함할 수 있다. 이러한 방법은 액체 조성물의 정맥내 투여, 액체 또는 고체 제제의 경피 투여, 경구, 국소 투여, 또는 세포 사이 또는 수술중 투여를 포함한다. 투여는 그의 1차적 기능이 시약 전달 비히클이 아닐 수 있는 장치의 이식에 의해 영향을 받을 수 있다.

투여는 또한 종양 또는 비일반적 조직으로 경구 또는 국부 주사될 수 있고, 단일클론 항체는 정맥내로 투여된다. 일반적으로, 용량 범위는 약 0.05 mg/kg 내지 약 12.0 mg/kg이다. 이것은 마이크로프로세서 조절 및 프로그램 펌프 장치에 의해 조절될 수 있는 볼루스 또는 슬로우(slow) 또는 연속 주사일 수 있다.

대안적으로, 바람직하게 단일클론 항체를 암호화하는 DNA는 하이브리도마 세포로부터 분리될 수 있고 포유류에 투여될 수 있다. DNA는 네이키드(naked) 형태로 투여될 수 있거나, 재조합 벡터, 예를 들어 백시니아 바이러스에 삽입되어 투여될 수 있으며, 이런 방식은 환자의 세포에서 DNA를 발현시켜 항체를 전달하게 된다.

본 발명의 방법에 사용되는 단일클론 항체는 약제학적 조성물을 제제화하는 확립된 임의의 방법, 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, 1985에 기재된 방법에 의해서 제제화될 수 있다. 용이한 투여를 위해, 단일클론 항체는 전형적으로 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합될 것이다. 이러한 담체는 물, 생리 식염수 또는 오일을 포함한다.

비경구 투여에 적합한 제제는 수성 및 비-수성 무균 주사용액이고 항산화제, 완충액, 정균제 및 의도된 수령자의 혈액과 등장성인 제제를 부여하는 용질을 포함할 수 있고; 수성 및 비-수성 무균 현탁액은 현탁화제 및 농후제를 포함할 수 있다. 임의의 통상적인 매질이 활성성분 및 그의 의도된 용도와 호환되지 않는 경우를 제외하고는, 임의의 조성물에서의 이의 사용도 고려된다.

제제는 단위-용량 또는 다-용량 용기, 예를 들어, 실링된 앰플 및 바이알로 제공될 수 있고, 사용하기 바로 전에 무균 용액 담체, 예를 들어 주사용액의 첨가만이 필요한 동결 건조 상태로 보관될 수 있다.

CXCL13 길항제 핵산 분자, 폴리펩티드 및 항체는 투여를 위하여 약제학적 조성물에 적절하게 통합될 수 있다. 이러한 조성물은 전형적으로 핵산 분자, 단백질, 또는 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본원에서 사용되는 "약제학적으로 허용되는 담체"는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등의, 약제학적 투여에 융화할 수 있는 것을 포함하고자 한다. 약제학적으로 활성 물질에 대한 이러한 매질 및 제제의 사용은 당업계에 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질이 활성성분 또는 시약이 활성 화합물과 호환되지 않는 경우를 제외하고는, 임의의 조성물에서의 이의 사용도 고려된다.

다른 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같이 부위의 공유결합에 의해 변형된 CXCL13 길항제에 관한 것이다. 상기 변형으로 개선된 약동학적 특성(예: 생체 내 혈청 반감기 증가)을 갖는 CXCL13 길항제를 생산할 수 있다. 유기 부위는 선형 또는 분지형 친수성 폴리머 군, 지방산 군 또는 지방산 에스테르 군일 수 있다. 특정 구체예에서, 친수성 폴리머 군은 약 800 내지 약 120,000 달톤의 분자량을 가질 수 있고 폴리 알칸 글리콜(예: 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜(PPG)), 탄수화물 폴리머, 아미노산 폴리머 또는 폴리비닐 피롤리돈일 수 있고, 지방산 또는 지방산 에스테르 군은 약 8 내지 약 40개의 탄소 원자를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 "지방산"은 모노-카복실산 및 디-카복실산을 포함한다. 본 발명의 항체를 변형하는데 적합한 지방산과 지방산 에스테르는 포화될 수 있거나 하나 이상의 불포화 단위를 함유할 수 있다. 본 발명의 항체를 변형하는데 적합한 지방산은 예를 들어 n-도데카노에이트(C₁₂, 라우레이트), n-테트라데카노에이트(C₁₄, 미리스테이트), n-옥타데카노에이트(C₁₈, 스테아레이트), n-아이코사노에이트(C₂₀, 아라키데이트), n-도코사노에이트(C₂₂, 베헤네이트), n-트리아콘타노에이트(C₃₀), n-테트라콘타노에이트(C₄₀), 시스-델타 9-옥타데카노에이트(C₁₈, 올레에이트), 모든 시스-델타 5,8,11,14-아이코사테트라에노에이트(C₂₀, 아라키도네이트), 옥탄디오익 산, 테트라데칸디오익 산, 옥타데칸디오익 산, 도코산디오익 산 등을 포함한다. 적합한 지방산 에스테르는 선형 또는 분지된 저급 알킬 군을 포함하는 디카복실산의 모노-에스테르를 포함한다. 저급 알킬 군은 1 내지 약 12개, 바람직하게는 1 내지 약 6개의 탄소 원자를 포함할 수 있다.

변형된 인간 폴리펩티드 및 항체는 적합한 방법, 이를테면 하나 이상의 변형제와의 반응에 의해 제조될 수 있다. 본 발명에서 사용된 용어 "변형제"는 활성화 군을 포함하는 적합한 유기 군(예, 친수성 폴리머, 지방산, 지방산 에스테르)을 언급한다. "활성화 군"은 적당한 조건하에, 제 2 화학 군과 반응하여 변형제와 제 2 화학 군 사이의 공유 결합을 형성할 수 있는 화학 부위 또는 기능 군이다. 예를 들어, 아민-반응성 활성화 군은 토실레이트, 메실레이트, 할로(클로로, 브로모, 플루오로, 요오도), N-하이드록시숙신이미딜 에스테르(NHS) 등과 같은 친전자성 군을 포함한다. 티올과 반응할 수 있는 활성화 군은 예를 들어 말레이미드, 요오도아세틸, 아크릴롤일, 피리딜 디설파이드, 5-티올-2-니트로벤조산 티올(TNB-티올) 등을 포함한다. 알데히드 기능 군은 아민- 또는 하이드라지드-함유 분자에 커플링될 수 있으며, 아지드 군은 3가 인산 군과 반응하여 포스포라미데이트 또는 포스포이미드 링크를 형성할 수 있다. 활성화 군을 분자로 도입하는 적합한 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, Hermanson, G. T., Bioconjtzgate Techniques. Academic Press: San Diego, CA (1996) 참조).

본 발명은 CXCL13 폴리펩티드, 핵산 또는 항체의 발현 또는 활성을 조절하기 위한 약제학적 조성물을 제조하는 방법을 포함한다. 이러한 방법은 약제학적으로 허용되는 담체를 CXCL13 폴리펩티드, 핵산 또는 항체의 발현 또는 활성을 조절하는 시약으로 제제화하는 것을 포함한다. 이러한 조성물은 또한 추가의 활성 시약을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 약제학적으로 허용되는 담체를, CXCL13 폴리펩티드, 핵산 또는 항체의 발현 또는 활성을 조절하는 시약 및 하나 이상의 추가의 활성 화합물과 제제화함으로써 약제학적 조성물을 제조 방법을 포함한다.

발현 또는 활성을 조절하는 시약은 예를 들어, 소분자일 수 있다. 예를 들어, 이러한 소분자는 펩티드, 펩티드모방체, 아미노산, 아미노산 유사체, 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 유사체, 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체, 몰 당 약 10,000 그램 미만의 분자량을 갖는 유기 또는 무기 화합물(예를 들어, 이종유기 및 유기금속 화합물을 포함), 몰 당 약 5,000 그램 미만의 분자량을 갖는 유기 또는 무기 화합물, 몰 당 약 1,000 그램 미만의 분자량을 갖는 유기 또는 무기 화합물, 몰 당 약 500 그램 미만의 분자량을 갖는 유기 또는 무기 화합물 및 염, 에스테르 및 이러한 화합물의 기타 약제학적으로 허용되는 형태를 포함한다.

소분자 시약 및 단백질 또는 폴리펩티드 시약의 적합한 용량은 일반적인 의사, 수의사 또는 연구자의 지식 내의 다수의 인자에 좌우된다는 것을 이해할 것이다. 이들 시약의 용량(들)은, 대상 또는 치료될 샘플의 상동성, 크기 및 증상에 따라 변할 것이고, 또한 적용된다면, 투여될 조성물의 경로에 따라 변할 것이며, 개업의가 CXCL13 폴리펩티드, 핵산 또는 항체 상에서 시약의 원하는 효과에 따라 변할 것이다. 소분자의 예시적 용량은 대상 또는 샘플 중량의 킬로그램 당 밀리그램 또는 마이크로그램 양을 포함한다(예: 킬로그램 당 약 1 마이크로그램 내지 킬로그램 당 약 500 밀리그램, 킬로그램 당 약 100 마이크로그램 내지 킬로그램 당 약 5 밀리그램 또는 킬로그램 당 약 1 마이크로그램 내지 킬로그램 당 약 50 마이크로그램). 단백질 또는 폴리펩티드의 예시적 용량은 대상 또는 샘플 중량의 킬로그램 당 그램, 밀리그램 또는 마이크로그램 양을 포함한다(예: 킬로그램 당 약 1 마이크로그램 내지 킬로그램 당 약 5 그램, 킬로그램 당 약 100 마이크로그램 내지 킬로그램 당 약 500 밀리그램 또는 킬로그램 당 약 1 밀리그램 내지 킬로그램 당 약 50 밀리그램). 이들 시약의 적합한 용량은 조절된 발현 또는 활성에 대한 시약의 효능에 달려있다는 것을 또한 이해할 것이다. 이러한 적합한 용량은 본원에서 기재한 어세이를 사용하여 결정될 수 있다.

하나 이상의 이들 시약이 CXCL13 폴리펩티드, 핵산 또는 항체의 발현 또는 활성을 조절하기 위하여 동물(예: 인간)에 투여될 경우, 의사, 수의사 또는 연구자는 예를 들어, 우선 상대적으로 저용량, 이어서 적합한 반응을 수득할 때가지 용량을 증가하여 처방할 수 있다. 또한, 임의의 특정한 동물 대상에 대하여 특정한 용량이 사용되는 특정 시약의 활성, 대상의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성 및 다이어트, 투여의 시간, 투여의 경로, 배출율, 임의의 시약 조합 및 조절될 발현 또는 활성을 포함하는 다양한 인자에 달려있다는 것을 이해할 것이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 그의 의도된 투여 경로와 융화되도록 제제화된다. 투여 경로의 예는 비경구, 예를 들어, 정맥내, 피내, 피하, 경구(예: 흡입 또는 구강내), 경피(국소), 경점막, 및 직장 투여를 포함한다. 비경구, 피내, 또는 피하 적용을 위한 용액 또는 현탁액은 하기 성분을 포함할 수 있다: 멸균 희석액, 예컨대, 주사용수, 생리 식염수, 고정 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 항균제, 예컨대, 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예컨대, 아스코르브산 또는 소듐 비설파이트; 킬레이트제, 예컨대, 에틸에네디아민-테트라아세트산; 완충액, 예컨대, 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트 및 등장성 조정을 위한 시약, 예컨대, 소듐 클로라이드 또는 덱스트로오스. pH는 산 또는 염기, 예컨대, 염산 또는 소듐 하이드록사이드로 조정될 수 있다. 비경구 제제는 앰플, 1회용 주사기, 또는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 다중 용량 바이알로 봉입될 수 있다.

주사용으로 적합한 약제학적 조성물 적합한 멸균 수용액(수용성) 또는 멸균 주사용 용액 또는 현타액의 즉석의 제조를 위한 현탁액 및 멸균 산제를 포함한다. 정맥내 투여를 위하여, 적합한 담체는 생리 식염수, 정균수, Cremophor EL(BASF; Parsippany, N.J.) 또는 인산 생리 식염수(PBS)를 포함한다. 모든 경우, 조성물은 멸균되어야 하고 주사가 용이하도록 유동성이어야 한다. 제조 및 저장 조건 하에 안정적이어야하고 미생물, 예컨대, 박테리아 및 진균류의 오염 기능에 대하여 보존되어야 한다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적합한 혼합물을 포함하는 분산 매질 또는 용매일 수 있다. 적합한 유동성은 예를 들어, 코팅, 예컨대, 레시틴을 사용하여, 분산제의 경우에 요구되는 입자 크기에 의해, 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 많은 경우, 조성물에서 등장화제, 예를 들어, 당, 폴리알코올, 예컨대, 만니톨, 솔비톨, 또는 소듐 클로라이드를 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 주사용 조성물의 지속적인 흡수는 조성물에서 흡수 지연 시약, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함함으로써 유도될 수 있다. 본 조성물의 안정화에 유용한 약제학적 부형제 및 첨가제는 폴리펩티드, 펩티드, 아미노산, 지질 및 탄수화물(예를 들면, 모노사카리드, 디-, 트리-, 테트라- 및 올리고사카리드와 같은 당류; 알디톨, 알돈산, 에스테르화된 당 등 유도된 당류; 및 다당류 또는 당 폴리머)을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니며, 이들은 단독으로 또는 조합하여 사용되고, 단독 또는 1-99.99 중량% 또는 부피%의 조합으로 존재한다. 예시적이지만 비제한적인 폴리펩티드 부형제는 인간 혈청 알부민(HSA), 재조합 인간 알부민(rHA), 젤라틴, 카제인 등과 같은 혈청 알부민을 포함한다. 완충 투여량에서도 역할을 갖는, 대표적 아미노산은 알라닌, 글리신, 아르기닌, 베타인, 히스티딘, 글루탐산, 아스파르트산, 시스테인, 리신, 루신, 이소루신, 발린, 메티오닌, 페닐알라닌, 아스파탐 등을 포함한다. 바람직한 아미노산은 글리신이다.

멸균 주사 용액은 적합한 용매 중의 요구되는 양으로 활성 화합물(예: 폴리펩티드 또는 항체)을, 요구되는 상기 열거한 성분의 하나 또는 조합과 통합한 다음 멸균 여과하여 제조될 수 있다. 일반적으로 분산제는 활성 화합물을 기본적 분산 매질을 포함하는 멸균 비히클로 통합한 다음 상기 열거한 것들 중 요구되는 기타 성분을 통합함으로써 제조된다. 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균 산제의 경우, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조이고 이는 그들의 사전의 무균 용액으로부터 임의의 추가의 원하는 성분과 활성 성분의 산제를 제공한다. 이러한 무균 용액의 제조 방법의 비제한적 예시 및 방법은 한정하는 것은 아니나, Gennaro, Ed., Rentington's Pharmaceutical Sciences, 18^th Edition, Mack Publishing Co. (Easton, PA) 1990에 공지되어 있다.

경구 조성물은 일반적으로 불활성 희석액 또는 식용 담체를 포함한다. 이들은 젤라틴 캡슐로 봉입되거나 정제로 압축될 수 있다. 경구 치료적 투여의 목적을 위하여, 활성 화합물은 부형제와 함께 통합될 수 있고 정제, 트로키제 또는 캡슐의 형태로 사용될 수 있다. 경구 조성물은 또한 양치질 물약용을 위하여 유동성 담체를 사용하여 제조될 수 있고, 여기에서 유동성 담체 중의 화합물은 경구적으로 스위시드하게 뱉거나 삼키게 적용된다.

약제학적 융화성 결합제 및/또는 애쥬번트 물질은 조성물의 부분으로서 포함될 수 있다. 정제, 환, 캡슐, 트로키제 등은 임의의 하기 성분 또는 유사한 성질의 화합물을 포함할 수 있다: 결합제, 예컨대, 미정질 세포, 검 트래거캔스 또는 젤라틴; 부형제, 예컨대, 스타치 또는 락토오스, 붕해제, 예컨대, 알긴산, 프리모겔 또는 콘 스타치; 윤활제, 예컨대, 마그네슘 스테아레이트 또는 스테로테스; 활제, 예컨대, 콜로이드성 이산화규소; 감미제, 예컨대, 수크로오스 또는 사카린; 또는 향미제, 예컨대, 페퍼민트, 메틸 살리실레이트 또는 오렌지 향.

흡입에 의한 투여를 위하여, 화합물은 적합한 추진제, 예를 들어, 가스, 예컨대, 이산화탄소 또는 분무기를 포함하는 압축 용기 또는 디스펜서로부터 에어로졸화된 입자의 형태로 전달된다. 대안적으로, 입자로서 제제화된 조성물은 U.S. 특허 번호: 4530464; 4533082; 5838350; 6113001; 6514496; 5518179; 5152456; 5261601; 및 4605167에 지시되어 있는 바와 같이 진동 또는 초음파 수단을 포함하는 정전기적, 기계적 수단으로 분산될 수 있다.

전신 투여는 또한 경점막 또는 경피 수단에 의할 수 있다. 경점막 또는 경피 투여를 위하여, 투과된 장벽에 대한 적합한 침투제가 제제에 사용된다. 이러한 침투제는 일반적으로 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 경점막 투여를 위하여 세정제, 담즙산염 및 후시딘산 유도체를 포함한다. 경점막 투여는 비강 분무제 또는 좌약의 사용을 통하여 달성될 수 있다. 경피 투여를 위하여, 활성 화합물은 당업계에 일반적으로 알려진 바와 같이 연고, 고약, 겔, 또는 크림으로 제제화된다.

화합물은 또한 직장 전달을 위하여 정체관장 또는 좌약(예: 통상의 좌약 기저, 예컨대, 코코아 버터 및 기타 글리세리드와 함께)의 형태로 제조될 수 있다.

일 구체예에서, 활성 화합물은 신체로부터 빠른 배출에 대하여 화합물을 보호할 수 있는 예컨대, 임플란트 및 마이크로캡슐화된 수송계를 포함하는 담체로 제조된다. 생분해성, 생체융화성 폴리머, 예컨대, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리아세트산이 사용될 수 있다. 이러한 제제의 제조 방법은 당업자들에게 명백할 것이다. 리포좀 현탁액(상기 또는 본원에 통합되는 단일클론 항체를 갖는 리포좀을 포함)이 또한 약제학적으로 허용되는 담체로서 사용될 수 있다. 특히 바람직한 조성물 및 방법이 U.S. 특허 번호 5,891,468 및 6,316,024에 기재되어 있다.

용이한 투여 및 단위 제형을 위한 용량의 균일함에서 경구 또는 비경구 조성물을 제제화하는 것이 특히 이점이 있다. 본원에서 사용된 단위 제형은 치료될 대상을 위하여 균일한 용량으로서 적합한 단위로 물리적으로 분리되는 것을 의미한다. 각 단위는 요구되는 담체와 관련된 바라는 치료적 효과를 생성하기 위하여 계산된 활성 화합물의 미리측정된 양을 포함한다. 본 발명의 단위 제형에 대한 설명은 활성 화합물의 독특한 특성 및 달성될 특정한 치료적 효과 및 개체의 치료를 위한 활성 화합물을 제제화하는 분야에서의 고유의 한정에 따라 직접적으로 기술된다.

항체에 있어서, 바람직한 용량은 체중의 약 0.1 mg/kg 내지 100 mg/kg이다(일반적으로 약 10 mg/kg 내지 20 mg/kg). 항체가 뇌에서 기능한다면, 약 50 mg/kg 내지 100 mg/kg의 용량이 일반적으로 적절하다. 일반적으로, 부분 인간 항체 및 전체 인간 항체는 다른 항체보다 인체 내에서 더 긴 반감기를 갖는다. 따라서, 저 용량의 사용 및 작은 투여 횟수가 가능하다. 변형, 예컨대, 지질화는 항체를 안정화시키고 흡수 및 조직 통과(예: 뇌의 통과)를 증진시키는데 사용될 수 있다. 항체의 지질화의 방법은 Cruikshank 등에 의해((1997) J. Acquired Immune Deficiency Syndromes and Human Retrovirology 14:193) 보고되어 있다.

CXCL13 길항제 핵산 분자는 벡터로 삽입될 수 있고 유전자 요법 벡터로서 사용될 수 있다. 유전자 요법 벡터는 예를 들어, 정맥내 주사, 국부 투여(U.S. 특허 번호 5,328,470) 또는 정위 주사(예를 들어, Chen et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 :3054- 3057)에 의해 대상에 전달될 수 있다. 유전자 요법 벡터의 약제학적 제제는 허용되는 희석액 중의 유전자 요법 벡터를 포함하거나 유전자 전달 비히클을 함유하는 서방성 매트릭스를 포함할 수 있다. 대안적으로, 완전한 유전자 전달 벡터가 재조합 세포, 예를 들어, 레트로바이러스 벡터로부터 손상되지 않게 생산될 수 있을 경우, 약제학적 제제는 유전자 전달계를 생산하는 하나 이상의 세포를 포함할 수 있다.

약제학적 조성물은 투여를 위한 지침서와 함께 용기, 팩 또는 디스펜서에 포함될 수 있다.

시약유전체학(Pharmacogenomics)

본원에 기재된 스크리닝 어세이에 의해 확인되는, CXCL13 폴리펩티드의 활성 또는 발현 상에 자극 또는 저해성을 갖는 시약 또는 조절제는 폴리펩티드의 비정상적인 활성과 관련된 질환을 치료(예방적이거나 치료적으로)하기 위하여 개체에 투여될 수 있다. 이러한 치료와 관련하여, 개체의 시약유전체학(즉, 개체의 유전자형 사이에서의 관계 및 외부 화합물 또는 시약에 대한 개체의 반응에 대한 연구)이 고려될 수 있다. 치료의 물질대사에서의 상이함은 심각한 독성 또는 시약유도성 활성 시약의 혈액 농도와 용량의 관계를 바꿈으로서 치료적 실패를 유도할 수 있다. 따라서, 개체의 시약유전체학은 개체의 유전자형의 고려 하에 예방 또는 치료적 치료를 위하여 유효한 시약(예: 시약)을 선택해야 한다. 이러한 시약유전체학은 또한 적합한 용량 및 치료적 처방을 결정하는데 사용될 수 있다. 따라서, 개체에서 CXCL13 폴리펩티드의 활성, CXCL13 핵산의 발현 또는 CXCL13 유전자의 돌연변이 함량이 결정되어 개체의 치료적 또는 예방적 치료를 위한 적합한 시약(들)을 선택할 수 있다.

시약유전체학은 기능된 사람에서 변경된 시약 위치 및 비정상적인 기능에 기인한 반응에서 임상적으로 중요한 유전적 변경을 다룬다. 예를 들어, Linder (1997) Clin. Chem. 43(2):254-266을 참조할 수 있다. 일반적으로, 시약유전체학 조건의 두가지 타입이 분류될 수 있다. 유전적 조건은 "변경된 시약 기능"으로서 언급되는 신체 상에서 시약 기능의 방법을 변경하는 단독 인자로서 유전된다. 유전적 조건은 "변경된 시약 물질대사"로서 언급되는 신체 상에서 시약 기능의 방법을 변경하는 단독 인자로서 유전된다. 이들 시약유전체학 조건은 드문 결함 또는 다형체로서 발생할 수 있다. 예를 들어, 글루코오스-6-포스페이트 데하이드로겐아제(G6PD) 결함은 일반적으로 유전되는 효소병증이고 주요 임상적 합병증은 산화 시약(항-말라리아제, 술폰아미드, 진통제, 니트로푸란)의 소화 및 파바빈의 소비 후의 용혈이다.

예시적인 구체예로서, 효소를 물질대사로 변화시키는 시약의 활성은 시약의 농도 및 기간의 주요 결정인자이다. 효소를 물질대사로 변화시키는 시약(예: N-아세틸트랜스퍼라아제 2(NAT 2) 및 사이토크롬 P450 효소 CYP2D6 및 CYP2C19)의 유전적 다형체의 발견은 일부 환자가 예상되는 시약 효과를 수득할 수 없거나 시약의 표준적이고 안정한 용량을 섭취한 후에 과도한 시약 반응 및 심각한 독성을 나타내는 이유를 설명한다. 이들 다형체는 집단에서 두개의 표현형, 대사기능이 좋은 집단(extensive metabolizer; EM) 및 대사기능이 낮은 집단(poor metabolizer; PM)으로 발현된다. PM의 유행은 다른 집단 사이에서와 상이하다. 예를 들어, CYP2D6에 대한 유전자 암호화는 고다형적이고 몇몇의 돌연변이가 PM에서 확인되었으며, 이는 모두 기능적 CYP2D6의 부재를 유도한다. CYP2D6 및 CYP2C19의 대사기능이 낮은 집단은 그들이 표준 용량을 제공 받을 때 매우 자주 과도한 시약 반응 및 부기능을 경험한다. 대사산물이 활성 치료적 부위에 있을 경우, PM은 그의 CYP2D6-형성 대사산물 모르핀에 의해 매개되는 코데인의 진통제 효과에 대하여 증명된 바, 치료적 반응을 나타내지 않을 것이다. 다른 극단적인 상태는 표준의 용량에 반응하지 않는 집단으로 매우 빠른 대사기능 집단(ultra-rapid metabolizer)으로 불린다. 최근, 매우 빠른 대사기능의 분자 기초가 CYP2D6 유전자증폭으로 확인되었다.

따라서, 개체에서 CXCL13 폴리펩티드의 활성, 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 발현 또는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자의 돌연변이 함량은 개체의 치료적 또는 예방적 치료를 위하여 적합한 시약(들)을 선택하는데 결정적일 수 있다. 또한, 시약유전체학 연구는 개체의 시약 반응 표현형의 확인을 위하여 시약 대사 효소를 암호화하는 다형의 대립유전자의 유전자형 분석(genotyping) 적용에 사용될 수 있다. 이 지식이 투여 또는 시약 선택에 적용될 경우, 역 반응 또는 치료적 실패를 피할 수 있으므로 대상을 폴리펩티드의 활성 또는 발현의 조절제, 예컨대, 본원에서 기재한 예시의 스크리닝 어세이의 하나로 확인되는 조절제로 처리할 경우 치료 또는 예방을 증진시킬 수 있다.

치료 방법

본 발명은 CXCL13 폴리펩티드의 비정상적인 발현 또는 활성과 관련이 있고/있거나 CXCL13 폴리펩티드가 연루되는 질환의 위험이 있거나(걸리기 쉬운) 또는 질환을 갖는 대상을 치료하기 위한 예방 및 치료 방법을 제공한다.

본 발명은 당업계에 공지되거나 본 명세서에 기재된 바와 같이, 적어도 하나의 CXCL13 길항제를 사용하여 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에서 적어도 하나의 CXCL13 관련 질병 또는 증상을 조절하거나 치료하기 위한 방법을 제공한다.

CXCL13 길항제의 조성물은 폐 질환-관련 증상, 예컨대, 천식, 폐기종, COPD 및 신생아 만성 폐 질병의 치료에서 치료적 용도를 찾을 수 있다.

본 발명은 또한 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에서 제한하는 것은 아니지만 적어도 하나의 류마티스 관절염, 연소성 류마티스 관절염, 전신 발현 연소성(onset juvenile) 류마티스 관절염, 건선 관절염, 강직성 척추염, 위궤양. 혈청반응음성 관절병증, 골관절염, 염증성 장질환, 궤양성 대장염, 전신성 홍반성 루푸스, 항인지질 증후군, 홍채모양체염/포도막염/시신경염, 특발성 폐섬유증, 전신 혈관염/베게너육아종증, 유육종증, 고환염/정관 절제술 역전 과정, 알레르기성/아토피성 질환, 알레르기성 비염, 습진, 알레르기성 접촉 피부염, 알레르기성 결막염, 과민성 폐렴, 이식, 기관 이식 거부반응, 이식편대숙주병, 전신 염증성 반응 증후군, 폐혈증 증후구, 그람 양성 패혈증, 그람 음성 패혈증, 배양 음성 패혈증, 진균성 패혈증, 호중구감소성 열, 요로성패혈증, 수막구균혈증, 외상/출혈, 화상, 전리 방사선 노출, 급성 췌장염, 성인성 호흡곤란 증후군, 류마티스 관절염, 알코올-유도성 간염, 만성 염증성 병, 유육종증, 크론 병, 겸상적혈구성 빈혈, 당뇨, 신증, 아토피성 질환, 과민 반응, 알레르기성 비염, 고초열, 다년성 비염, 결막염, 자궁내막증, 두드러기, 전신성 아나필락시스(systemic anaphalaxis), 피부염, 악성빈혈, 용혈성 질환, 혈소판감소증, 임의의 기관 또는 조직의 이식편거부반응, 신장 이식거부반응, 심장 이식거부반응, 간 이식거부반응, 췌장 이식거부반응, 폐 이식거부반응, 골수 이식(BMT) 거부반응, 피부 동종이식거부반응, 연골 이식거부거부반응, 뼈 이식거부반응, 소장 이식거부거부반응, 태아 흉선 임플란트 거부반응, 부갑상선이식거부반응, 임의의 기관 또는 조직의 이종이식거부반응, 동종이식거부반응, 항-수용체 과민반응, 그레이브스 병, 레이노 질환, B형 인슐린-내성 당뇨병, 중증 근무력증, 항체 관련성 세포독성, III형 과민반응, 전신성 홍반성 루푸스, POEMS 증후군(폴리신경병증, 장기거대증, 내분비병증, 단일클론 감마병증 및 피부변성 증후군), 항인지질 증후군, 천포창, 피부경화증, 혼재성 결합조직 질환, 특발성 애디슨병, 당뇨병, 만성 활성 간염, 원발성 담낭 경변증, 백반, 혈관염, MI 심장절개 증후군, IV형 거부반응, 접촉성 피부염, 과민성 폐렴, 동종이식거부반응, 세포내 유기체에 의한 흑색종, 약물 과민증, 대사성/특발성, 윌슨병, 혈색소증, 알파-1-항트립신 결핍증, 당뇨병성 망막병증, 하시모토 갑상선염, 골다공증, 시상하부하수체부신계 평가, 원발성 담낭 경변증, 갑상선염, 뇌척수염, 악액질, 낭성섬유증, 가족성 적혈구잠식성 림프조직구증, 피부이상, 건선, 탈모증, 신증후군, 신장염, 사구체신염, 급성 신부전증, 혈액투석, 요독증, 독성, 자간전증, okt3 요법, 항-cd3 요법, 사이토카인 요법, 화학요법, 방사선 요법(예: 제한하는 것은 아니지만, 토스트헤니아(toasthenia), 빈혈, 악액질 등), 만성 살리실산 중독 등을 포함하는, 적어도 하나의 면역 관련 질병을 조절 또는 치료하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 각각 본 명세서에서 참고 문헌으로 인용되는, the Merck Manual, 12th-17th Editions, Merck & Company, Rahway, NJ(1972, 1977, 1982, 1987, 1992, 1999), Pharmacotherapy Handbook, Wells et al., eds., Second Edition, Appleton and Lange, Stamford, Conn. (1998, 2000)을 참조할 수 있다.

본 발명은 또한, 백혈병, 급성 백혈병, 급성 림프모세포성 백혈병(ALL), B-세포, T-세포 또는 FAB ALL, 급성 골수성 백혈병(AML), 급성 전골수구성 백혈병(APL), 만성 골수성 백혈병(CML), 만성 림프모세포성 백혈병(CLL), 모발상세포 백혈병, 골수이형성 증후군(myelodyplastic syndrome, MDS), 림프종, 호킨스 질환, 악성 림프종, 비-호킨스 림프종, 버키트림프종, 다중 흑색종, 카포시육종, 결장직장암종, 췌장암종, 비인강악성종양, 악성조직구증, 종양부수증후군/악성종양의 과칼슘혈증, 충실성 종양(solid tumor), 선암종, 육종, 악성 흑색종, 혈관종, 전이성 질환, 암 관련 뼈의 재흡수, 암관련 골통 등의 적어도 하나를 포함하나 이에 한정되지는 않는, 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에서 적어도 하나의 악성 질환을 조절 또는 치료하기 위한 방법을 제공한다.

CXCL13 폴리펩티드의 비정상적인 발현 또는 활성으로 특정지어지는 질환은 또한 본 출원의 다른 곳에 기재되어 있다.

1. 예방 방법

일 측면에서, 본 발명은 대상에 폴리펩티드의 발현 또는 적어도 하나의 활성을 조절하는 시약을 투여함으로써 대상에서 CXCL13 폴리펩티드의 비정상적인 발현 또는 활성과 관련 질병 또는 증상을 적어도 실질적으로 예방하는 방법을 제공한다. CXCL13 폴리펩티드의 비정상적인 발현 또는 활성에 의해 유발되거나 기인되는 질병의 위험에 있는 대상은 예를 들어, 본원에서 기재한 임의의 진단 또는 예후 어세이 또는 이의 조합으로 확인될 수 있다. 예방 시약의 투여는 비정상적인 유형의 증후군 특성의 발현에 앞서 일어날 수 있고 이로써 질병 또는 질환이 예방 또는 대안적으로, 그의 진행을 지연시킬 수 있다. 비정상적인 유형에 따라, 예를 들어, 효능제 또는 길항제 시약은 대상을 치료하기 위하여 사용될 수 있다. 적합한 시약은 본원에 기재한 스크리닝 어세이를 기초로 하여 결정될 수 있다.

2. 치료 방법

본 발명의 다른 측면은 치료적 목적을 위하여 CXCL13 폴리펩티드의 발현 또는 활성을 조절하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 조절 방법은 세포를, 폴리펩티드의 하나 이상의 활성을 조절하는 시약과 접촉시키는 것을 포함한다. 활성을 조절하는 시약은 본원에서 기재한 바와 같은 시약, 예컨대, 핵산 또는 단백질, 펩티드, 펩티드모방체, 다른 소분자 또는 폴리펩티드의 천연 유래의 동종의 리간드일 수 있다. 일 구체예에서, 시약은 폴리펩티드의 하나 이상의 생물학적 활성을 조절한다. 다른 구체예에서, 시약은 CXCL13 폴리펩티드의 하나 이상의 생물학적 활성을 억제한다. 이러한 저해성 시약의 예시는 안티센스 핵산 분자 및 항체 및 본원에서 기재한 다른 방법을 포함한다. 이들 조절 방법은 시험관 내(예: 세포를 시약과 함께 배양함으로써) 또는 대안적으로 생체 내(예: 시약을 대상에 투여함으로써)에서 수행될 수 있다. 그러므로 본 발명은 비정상적인 CXCL13 폴리펩티드의 발현 또는 활성으로 특정지어 지는 질병 또는 질환으로 고통받는 개체를 치료하는 방법을 제공한다. 일 구체예에서, 방법은 발현 또는 활성을 조절(예: 상향 조절 또는 하향 조절)하는 시약(본원에 기재한 스크리닝 어세이로 확인되는 시약) 또는 시약의 조합을 투여하는 것을 포함한다. 활성의 억제는 활성 또는 발현이 비정상적으로 높거나 상향 조절된 상황 및/또는 감소된 활성이 이로운 효과를 가져올 것 같은 상황에서 바람직하다.

본 발명의 방법은 적어도 하나의 CXCL13 길항제 또는 특정 부분 또는 변이체를 포함하는 유효량의 조성물 또는 약제학적 조성물을 이러한 조절, 치료 또는 요법을 요하는 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에 투여하는 것을 포함한다. 이러한 방법은 임의로 또한 이러한 면역 질병을 치료하기 위하여 공동 투여 또는 조합 요법을 포함하고, 여기에서 상기의 적어도 하나의 CXCL13 길항제, 이의 특정 부분 또는 변이체는 또한, 글루티라머 아세테이트(예: 코팍손), 사이클로파스파미드, 아자티오프린, 글루코코티코스테로이드, 메토트렉사트, 파클리탁셀, 2-클로로데옥시아데노신, 미토잔트론, IL-10, TGBb, CD4, CD52, 안테그렌, CD11, CD18, TNF알파, IL-1, IL-2, 및/또는 CD4 항체 또는 항체 수용체 융합, 인터페론 알파, 면역글로블린, 리스마이드(Requinimax™), 인슐린 유사 성장 인자-1(IGF-1), 엘프로딜, 피르페니돈, 경구 미엘린 또는 미엘린 파과의 자가면역 억제, T-세포의 세포 기능의 면역 조절, 활성화, 분화, 이동 및/또는 억제, T 세포 수용체/펩티드/MHC-Ⅱ 상호기능의 억제, T 세포 에너지의 유도, 자가반응성 T 세포의 결실, 뇌혈관 장벽을 가로지르는 트래피킹의 환원, 전-염증성(Th 1)의 균형의 변형 및 면역조절(Th2) 사이토카인, 매트릭스 메탈로프로테아제 억제제의 억제, 신경보호, 신경아교증의 환원, 재-미엘린화의 진행의 적어도 하나의 하나 이상에서 기능하는 화합물, TNF 길항제 (예: 한정하는 것은 아니나, TNF Ig 유도 단백질 또는 단편, 수용성 TNF 수용체 또는 이의 단편, 융합 단백질 또는 소분자 TNF 길항제), 항류머티즘제, 근육 이완제, 마약, 비-스테로이드성 항염증제(NSAID), 진통제, 마취제, 진정제, 국소 마취제, 신경 근육 차단제, 항균제(예를 들어, 아미노글리코시드, 항진균제, 구충제, 항바이러스제, 카바페넴, 세팔로스포린, 플루오르퀴놀론, 마크롤라이드, 페니실린, 설폰아미드, 테트라사이클린, 또다른 항균제), 건선치료제, 코르티코스테로이드, 단백동화 스테로이드, 미네랄, 영양제, 갑상선제, 비타민, 칼슘 관련 호르몬, 지사제, 진해약, 구토방지제, 항궤양제, 완화제, 항응고제, 에리트로포이에틴(예, 에포에틴 알파), 필그라스팀(예, G-CSF, 뉴포젠), 사르그라모스팀(GM-CSF, 루카인), 면역제, 면역글로블린, 면역억제제(예, 바실릭시마브, 사이클로스포린, 다클리주마브), 성장 호르몬, 호르몬 대체 시약, 에스트로겐 수용체 조절제, 산동제, 조절마비제, 알킬화제, 항대사시약, 유사분열 억제제, 방사성 의약품, 항울제, 항조병제, 항정신병약, 불안 완화제, 수면제, 교감신경흥분제, 흥분제, 도네페질, 타크린, 천식 약제, 베타 기능제, 흡입 스테로이드, 류코트리엔 억제제, 메틸크산틴, 크로몰린, 에피네프린 또는 유사체, 도나제 알파(풀모자임), 사이토카인 또는 사이토카인 길항제 중의 적어도 하나로부터 선택된 적어도 하나를 투여 전, 동시에 및/또는 후에 투여하는 것을 포함한다. 적합한 투여량은 당업계에서 공지되어 있다. 예를 들어, 각 문헌이 본원에 참조로서 전체적으로 통합되는, Wells et al., eds., Pharmacotherapy Handbook, 2^nd Edition, Appleton and Lange, Stamford, CT (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, CA (2000)을 참조할 수 있다.

본 발명의 조성물, 조합 치료, 공동-투여, 장치 및/또는 방법에 적합한 TNF 길항제(본 발명의 적어도 하나의 항체, 이의 특정 부분 및 변이체를 또한 포함)는, 항-TNF Ig 유도 단백질, 이의 항원-결합 단편 및 TNF에 특이적으로 결합하는 수용체 분자; 탈리도미드, 테니댑, 포스포디에스터라제 저해제(예를 들어, 펜톡시필린 및 롤리프람), A2b 아데노신 수용체 기능제 및 A2b 아데노신 수용체 인핸서와 같이 TNF 합성, TNF 방출 또는 표적 세포에 그것의 활성을 예방 및/또는 저해하는 화합물; 미토겐 활성화 단백질(MAP) 키나제 저해제와 같이 TNF 수용체 신호를 예방 및/또는 저해하는 화합물; 메탈로프로티나제 저해제와 같이 막 TNF 절단을 차단 및/또는 저해하는 화합물; 앤지오텐신 전환 효소(ACE) 저해제(예를 들어, 카프토프릴)과 같이 TNF 활성을 차단 및/또는 저해하는 화합물; 및 MAP 키나제 저해제와 같이 TNF 생산 및/또는 합성을 차단 및/또는 저해하는 화합물을 함유하나, 이에 한정된 것은 아니다.

본 발명에서 사용되는 "종양 괴사 요소 Ig 유도 단백질", "TNF Ig 유도 단백질", "TNFα Ig 유도 단백질" 또는 단편 등은 시험관 내, 인 시츄 및/또는 바람직하게 생체 내에서 TNFα 활성을 감소, 차단, 저해, 폐기 또는 간섭한다. 예를 들어, 본 발명의 적합한 TNF 인간 Ig 유도 단백질은 TNFα에 결합할 수 있으며, 항-TNF Ig 유도 단백질, 이의 항원-결합 단편 및 특정 돌연변이 또는 TNFα에 특이적으로 결합하는 이의 도메인을 포함한다. 적합한 TNF 항체 또는 단편은 또한, TNF RNA, DNA 또는 단백질 합성, TNF 방출, TNF 수용체 신호, 막 TNF 절단, TNF 활성, TNF 생산 및/또는 합성을 감소, 차단, 폐기, 간섭, 예방 및/또는 저해할 수 있다.

키메라 Ig 유도 단백질 cA2는 마우스 항-인간 TNFα IgG1 Ig 유도 단백질을 중화시키는 고-친화도의 항원 결합 가변 영역, 설계된 A2 및 인간 IgG1의 불변 영역, 카파 면역글로블린으로 구성된다. 인간 IgG1 Fc 영역은 동종이계의 Ig 유도 단백질 작동체 기능을 개선하고, 순환하는 혈청 반감기를 증가시키고 Ig 유도 단백질의 면역원성을 감소시킨다. 키메라 Ig 유도 단백질 cA2의 결합도 및 에피토프 특이적은 뮤린 Ig 유도 단백질 A2의 가변 영역으로부터 유래된다. 특정 구체예에서, 뮤린 Ig 유도 단백질 A2의 가변 영역을 암호화하는 핵산에 대한 바람직한 소스는 A2 하이브리도마 세포주이다.

키메라 A2(cA2)는 용량 의존적인 방식으로 자연적 및 재조합 인간 TNFα의 독성 효과를 중화시킨다. 키메라 Ig 유도 단백질 cA2 및 재조합 인간 TNFα의 결합 어세이로부터, 키메라 Ig 유도 단백질 cA2의 친화도 함량은 1.04 x 10¹⁰M^-1로 계산되었다. 경쟁적 억제에 의한 단일 Ig 유도 단백질 특이적 및 친화도를 결정하는 바람직한 방법은 본원에서 참조로서 그의 전체가 통합되는, Harlow, et al., Ig derived proteins: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1988; Colligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc, 및 Wiley Interscience, New York, (1992-2003); Kozbor et al., Immunol. Today, 4:72-79 (1983); Ausubel et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York (1987-2003); 및 Muller, Meth. Enzymol., 92:589-601 (1983)에서 찾을 수 있다.

특정 구체예에서, 뮤린 단일 Ig 유도 단백질 A2는 c134A로 설계된 세포주에 의해 생산된다. 키메라 Ig 유도 단백질 cA2는 c168A로 설계된 세포주에 의해 생산된다.

본 발명에서 이용될 수 있는 단일클론 항-TNF Ig 유도 단백질의 추가적인 예는 당업계에 개시되어 있다(예를 들어, 전체가 참조로써 본원에 통합되는, 미국 특허 번호 5,231,024호; Moller, A. et al., Cytokine 2(3): 162-169 (1990); 미국 출원 번호 07/943,852(1992년 9월 11월자로 출원); Rathjen et al, 국제 출원 번호 WO 91/02078(1991년 2월 21일자로 공개); Rubin et al, EPO 특허 출원 번호 0 218 868(1987년 4월 22일자로 공개); Yone et al, EPO 특허 출원 번호 0 288 088(1988년 10월 26일자로 공개); Liang, et al, Biochem. Biophys. Res. Comm. 737:847-854 (1986); Meager, et al, Hybridoma 5:305-311 (1987); Fendly et al., Hybridoma 6:359-369 (1987); Bringman, et al., Hybridoma 5:489-507 (1987); 및 Hirai, et al., J. Immunol. Meth. 96:57-62 (1987) 참조).

TNF 수용체 분자

본 발명에서 유용한 바람직한 TNF 수용체 분자는 고친화성으로 TNFα에 결합하고[참고, 예를 들어, Feldmann 등, 국제 출원 번호 WO 92/07076(1992년 4월 30일자로 공개); Schall 등, Cell 61 : 361-370 (1990); 및 Loetscher 등, Cell 61 : 351-359 (1990), 이들은 본 명세서의 참고 문헌에 수록된다], 임의의 저면역원성을 갖는 것이다. 특히, 55 kDa(p55 TNF-R) 및 75 kDa(p75 TNF-R) TNF 세포 표면 수용체가 본 발명에 유용하다. 수용체의 세포외 도메인(ECD) 또는 그의 기능성 부분를 포함하는 이들 수용체의 잘려진(Truncated) 형태(예를 들어, Corcoran 등, Eur. J. Biochem. 223 : 831-840 (1994) 참조)도 본 발명에 또한 유용하다. ECD를 포함하는 TNF 수용체의 잘려진 형태는 소변 및 혈청에서 30 kDa 및 40 kDa TNFα 저해성 결합 단백질로서 검출될 수 있다(Engelmann, H. 등, J. Biol. Chem. 265 : 1531-1536 (1990)). TNF 수용체 다중결합 분자 및 TNF 면역수용체 융합 분자 및 그의 유도체 및 단편 또는 부분은 본 발명의 방법 및 조성물에 유용한 TNF 수용체 분자의 추가적 예이다. 본 발명에서 사용될 수 있는 TNF 수용체 분자는 증후 및 저독성의 탁월한 경감으로 연장된 기간 동안 환자를 치료하는 그들의 능력에 의해 특정지어진다. 저면역원성 및/또는 고친화성 뿐만아니라, 다른 정의되지 않는 특성은 치료적 결과를 달성하는데 기여할 수 있다.

본 발명에 유용한 TNF 수용체 다중결합 분자는 하나 이상 폴리펩티드 링커 또는 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 다른 비펩티드 링커를 통해 결합된 두개 이상의 TNF 수용체의 ECD의 모든 또는 하나의 기능성 부분을 포함한다. 다중결합 분자는 또한 다중결합 분자의 직접적 발현에 대하여 분비된 단백질의 신호 펩티드를 포함한다. 이들 다중결합 분자 및 그의 생산 방법은, 참조로 본원에 통합되는, 미국 특허 번호 08/437,533(1995년 5월 9일자로 출원)에 기재되어 있다.

본 발명의 조성물 및 방법에서 유용한 TNF 면역수용체 융합 분자는 하나 이상의 면역글로블린 분자의 적어도 하나의 부분 및 하나 이상의 TNF 수용체의 모든 또는 기능적 부분을 포함한다. 이들 면역수용체 융합 분자는 모노머, 또는 헤테로- 또는 호모-멀티머로서 조합될 수 있다. 면역수용체 융합 분자는 또한 1가 또는 다가일 수 있다. 이러한 TNF 면역수용체 융합 분자의 예는 TNF 수용체/IgG 융합 단백질이다. TNF 면역수용체 융합 분자 및 그의 생산 방법은 당업계에 기재되어 있다[Lesslauer et al., Eur. J. Immunol. 27:2883-2886 (1991); Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535-10539 (1991); Peppel et al., J. Exp. Med. 174:1483-1489 (1991); Kolls et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:215-219 (1994); Butler et al., Cytokine 6(6):616-623 (1994); Baker et al., Eur. J. Immunol. 24:2040-2048 (1994); Beutler et al., U.S. 특허 번호 5,447,851; 및 U.S. 출원 번호 08/442,133(1995년 5월 16일자로 출원), 이들 참조는 전체적으로 본원에 참조로서 통합된다]. 면역수용체 융합 분자의 생산 방법은 또한 전체가 본원에 참조로서 통합되는, Capon 등의 U.S. 특허 번호 5,116,964; Capon 드의 U.S. 특허 번호 5,225,538; 및 Capon et al., Nature 337:525-531 (1989)에서 찾을 수 있다.

TNF 수용체 분자의 기능 등가물, 유도체, 단편 또는 영역은 TNF 수용체 분자를 암호화하는, 본 발명에서 사용될 수 있는 기능적으로 유사한 TNF 수용체 분자(예: 고 친화도로 TNFα와 결합하고 저면역원성을 가짐)에 대하여 충분한 크기 및 서열인 TNF 수용체 분자 서열의 부분 또는 TNF 수용체 분자의 부분을 의미한다. TNF 수용체 분자의 기능 등가물은 또한 본 발명에서 사용될 수 있는 기능적으로 유사한, 변형된 TNF 수용체 분자(예: 고 친화도로 TNFα와 결합하고 저면역원성을 가짐)를 포함한다. 예를 들어, TNF 수용체 분자의 기능 등가물은 "침묵" 코돈 또는 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 첨가(예: 다른 산성 아미노산에 대한 하나의 산성 아미노산의 치환; 또는 다른 소수성 아미노산을 암호화하는 코돈에 대하여 동일하거나 상이한 소수성 아미노산을 암호화하는 하나의 코돈의 치환)를 포함할 수 있다. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc 및 Wiley-lnterscience, New York (1987-2003)을 참조할 수 있다.

일반적인 용어로 본 발명을 설명함과 동시에, 본 발명의 구체예는 하기 실시예로 더욱 설명하고자 하나, 이로 청구의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예 1

CXCL13 mRNA 전사 수준은 병든 폐 조직에서 증가된다.

CXCL13 단백질을 암호화하는 mRNA 전사의 수준은 대조군 C57BL6 마우스와 비교하여 비처리된 SP-C/TNFα 마우스의 폐 조직 및 TNFα 특정 mAb로 처리된 SP-C/TNFα 마우스에서 상승하였다(도 1). SP-C/TNF-알파 마우스는 폐 조직에서 뮤린 TNFα를 구조적으로 과발현하는 C57BL6 마우스 스트레인으로부터 유래된 트랜스제닉 마우스이다. 폐에서 TNFα의 과발현(SP-C/TNFα 트랜스제닉 마우스)은 폐 염증, 폐기종, 폐 섬유증[16] 및 이소성 림프성 여포의 형성을 포함하는, COPD 환자에서 발견되는 것들과 유사한 많은 병리학적 변화를 일으킨다. SP-C/TNFα 마우스는 폐 염증, 폐기종, 폐 섬유증 및 울혈성 폐쇄성 폐 질병(COPD)과 같은 폐 질병의 모델이다. 폐에서의 이소성 림프성 여포의 형성은 이들 각각의 폐 질병과 관련된 병리이다. 폐에서의 이소성 림프성 여포는 폐 및 다른 폐 조직으로의 B 세포의 침윤을 통하여 형성될 수 있다. 도 1의 결과는 SP-C/TNFα 마우스의 폐 조직에서 증가된 CXCL13 단백질 수준이 폐에서의 이소성 림프성 여포의 형성 및 이들 동물에서 관련된 폐 질병의 개시에 기여함을 나타낸다.

이 실험을 위하여, 12주령의 대조군 C57BL6 마우스 및 비처리된 SP-C/TNFα 마우스에 6주 동안 매주 월요일 및 금요일에 200 μL의 PBS를 복막내 주사하였다. SP-C/TNFα 마우스에 6주 동안 매주 월요일 및 금요일에 복막내 주사로 200 μL의 PBS 중의 0.5 mg의 TNFα 특정 cV1q mAb를 제공하였다. cV1q mAb는 뮤린 TNFα와 결합하는 단일 랫트 IgG1 이소타입 단일클론 항체이다. cV1q mAb를 표준의 방법을 사용하여 생산하였다. 주사 6주 후, 마우스를 국제 동물 보호 및 사용 가이드라인에 따라 희생시켰다.

폐를 특정의 동물로부터 제거하고, 균질화하고, mRNA를 표준의 방법을 사용하여 추출하고 분리하였다. 또한 CXCL13 mRNA 및 GAPDH mRNA에 대하여 특이적인 RT-PCR을 표준의 방법을 사용하여 수행하였다. 이어서 CXCL13 및 GAPDH mRNA 수준을 표준의 방법을 사용하여 정량하고 CXCL13 mRNA 수준을 GAPDH 하우스킵핑(housekeeping) 유전자 mRNA 수준에 대하여 일반화하였다. 표시된 데이터는 5마리의 상이한 마우스에서 일반화된 CXCL13 mRNA 수준의 평균 +/- 표준 편차를 나타낸 것이다(도 1).

실시예 2

TNFα 및 CXCL13에 대하여 특이적인 단일클론 항체에 의한 공동 요법은 폐 질병 증후군을 경감시킨다.

SP-C/TNFα 마우스에서 TNFα 및 CXCL13에 대하여 특이적인 mAb의 공동 투여는 폐 질병 증후군을 경감시켰다(도 2). 이소성 여포 크기는 비처리된 대조군 동 물에 비하여 TNFα 및 CXCL13에 대하여 특이적인 mAb로 공동처리된 SP-C/TNFα 마우스에서 유의하게 감소하였다. 8주 동안 항-TNFα mAb로 처리된 SP-C/TNFα 트랜스제닉 마우스에서, 호중구의 기도 침윤은 유의하게 감소하였으나, 치료는 이소성 림프성 여포에 거의 영향을 미치지 않았다. 이 결과는 일단 형성된 이소성 림프성 여포는 TNFα 독립적인 방식으로 그들의 항상성을 유지한다는 것을 의미한다.

이 실험을 위하여, 12주령의 대조군 SP-C/TNFα 마우스에 6주 동안 매주 월요일 및 금요일에 복막내 주사하였다. 대조군 동물에는 200 μL의 PBS 주사를 단독으로 제공하였다. 항-TNFα 처리 동물에는 200 μL의 PBS 중의 0.5 mg의 TNFα 특이적 cV1q mAb를 제공하였다. 항-CXCL13 처리 동물에는 200 μL의 PBS 중의 0.5 mg의 CXCL13 특이적 MAB4701 mAb를 제공하였다. 공동처리 동물에는 200 μL의 PBS 중의 0.5 mg의 TNFα 특이적 cV1q mAb 및 0.5 mg의 CXCL13 특이적 MAB4701 mAb를 제공하였다. MAB4701은 뮤린 CXCL13과 결합하는 단일 랫트 IgG1 이소타입 단일클론 항체이다. MAB4701 mAb는 표준의 방법을 사용하여 생성하였고 상업적으로(R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN) 이용가능하다. 주사 6주 후, 마우스를 국제 동물 보호 및 사용 가이드라인에 따라 희생시켰다. 폐를 희생시킨 동물로부터 제거여 자르고, 슬라이드에 표본화하고, 조직병리학 분석을 표준의 방법을 사용하여 이소성 여포 크기 및 형성을 정량하기 위하여 수행하였다. Phase 3 Imaging System(Glen Mills, PA) 및 관련된 분석 소프트웨어로 검경을 수행하고 마우스 당 조직 슬라이드 당 10-20 여포의 크기를 측정하기 위하여 사용하였다. 표시된 데이터(도 2)는 각 처리 그룹 당 5마리의 상이한 마우스에서의 결과의 평균 +/- 표준 편차를 나타낸 것이다.

상기 기재된 결과는 단독의 항-CXCL13 요법이 호흡-관련 질병을 치료하는데 유용할 수 있다는 가설을 세울 수 있다. 마우스 모델은 TNFα의 증가된 발현을 가지므로, 항-CXCL13 요법의 TNFα 단독 억제는 이 모델에서 질병 상태의 개선을 나타낼 필요가 있을 수 있다. TNFα가 과발현되지 않는 모델에 있어서, CXCL13의 억제는 질병 상태의 개선에 대하여 충분할 수 있다. 또한 상기 기재한 모델에서, TNF 발현은 트랜스제닉 동물을 통하여 일어나고 질병 진행에 독립적이다. 병리학적 상황, 예를 들어, 환자 치료에서, TNF 발현은 대부분 염증의 환원을 감소시킬 것이고, CXCL13 길항제가 TNFα 생산 세포의 이동 및 축적을 감소시킬 수 있다면, 이는 단독으로 효과적인 치료일 수 있다. 이는 생체 내 질병 모델에서 검사된다.

실시예 3

TNF-알파 및 CXCL13에 대하여 특이적인 단일클론 항체의 공동 요법은 폐 조직으로의 B-세포 침윤을 감소시킨다

TNF-알파 및 CXCL13에 대하여 특이적인 mAb의 공동 투여는 폐 조직으로의 B-세포 침윤을 감소시킨다(도 3, 4, 5 및 6). B-세포 침윤은 CD22.2, CD19, CD45R/B220 및 CD4 B-세포 마커 각각의 검출을 통한 유세포 측정법으로 평가하였다. 폐 조직에서 B-세포 침윤은 비처리된 대조군 동물에 비하여 TNFα 및 CXCL13에 대하여 특이적인 mAb를 공동 투여한 SP-C/TNFα 마우스에서 유의하게 감소하였다(도 3, 4, 5 및 6).

동물을 상기 실시예 2에서 기재한 바와 같이 준비하고 처리를 수행하였다. 주사 6주 후, 마우스를 국제 동물 보호 및 사용 가이드라인에 따라 희생시켰다. 이어서 폐 조직을 갈고 37℃에서 45분 동안 콜라겐아제 VII(1500 IU/ml)으로 소화시켜 개체의 세포로부터 분리하였다. 이어서 세포 프랩을 표준의 방법을 사용하여 상업적으로 이용가능한 CD22.2(도 3), CD19(도 4), CD45R/B220(도 5) 및 CD4(도 6) 특이적 mAb를 표지하여 배양하였다. 준비된 세포 집단에서 B-세포는 CD22.2, CD19, CD45R/B220 또는 CD4 마커를 함유하고 상업적으로 이용가능한 CD22.2, CD19, CD45R/B220 또는 CD4 mAb와 배양한 후 표지되어 검출가능하다. 이 표지는 유세포 측정법에 의한 B-세포의 확인을 기초로 한다. 유세포 측정법 분석을 표준의 방법을 사용하여 세포 집단에서 수행한 다음 세포 집단에서 존재하는 B-세포의 퍼센트를 표준의 방법을 사용하여 각각의 마커에 대하여 결정하였다. 표시된 데이터(도 3, 4, 5 및 6)는 각 처리 그룹 당 5마리의 폐 세포 프랩의 분석에서의 결과의 평균 +/- 표준 편차를 나타낸 것이다.

본원에서 기재한 CXCL13, CXCR5 및 TNFα의 서열은 하기와 같다:

표 3

실시예 4

TNFα 및 CXCL13에 대하여 특이적인 단일클론 항체의 공동 투여는 전신성 홍반성 루프스와 관련된 신장 병리를 치료한다

TNFα 및 CXCL13에 대하여 특이적인 mAb의 공동 투여는 전신성 홍반성 루프스(SLE)의 뮤린 모델에서 전신성 홍반성 루프스와 관련된 신장 병리를 치료하였다. 사구체신염은 사구체라 불리는 신장 내부 구조의 염증이고 SLE의 특징이다. 단백뇨는 소변으로의 혈청 단백질의 과도한 분비이고 사구체신염과 관련된 SLE로부터 기인한 신장 질병의 척도이다. 신장 조직에서의 조직학적 변화, 예컨대, 주위 림프구 침윤 병소의 형성은 사구체신염과 관련된 SLE로부터 기인한 신장 질병의 다른 척도이다.

TNFα 및 CXCL13에 대하여 특이적인 mAb의 공동 투여는 SLE 증후군을 나타내는 NZB/W F1 마우스의 소변에서 사구체신염 관련 단백질 수준을 PBS 비히클을 단독으로 제공받은 비처리 대조군 NZB/W F1 마우스의 그것보다 낮게 감소시켰다(도 7).

또한, TNFα 및 CXCL13에 대하여 특이적인 mAb의 공동 투여는 SLE 증후군을 나타내는 NZB/W F1 마우스의 SLE의 관련 신장 질병의 심각성 등급 점수를 PBS 비히클을 단독으로 제공받은 비처리 대조군 NZB/W F1 마우스의 그것보다 낮게 감소시켰다(도 8). NZB/W F1 마우스에서 SLE의 관련 신장 질병의 심각성은 등급 점수 시스템을 사용하여 결정하였다. 점수는 각각의 처리 그룹으로부터의 NZB/W F1 마우스의 신장 조직에서의 신장 조직의 조직학적 관찰 및 사구체신염 관련 단백질 수준의 심각성으로 확인되는 동맥주위 림프구 침윤물 병소의 수에 기초하였다(도 8).

이들 실험을 위하여, 12주령의 NZB/W F1 마우스를 Jackson Labs(Bar Harbor, ME)으로부터 입수하였다. NZB/W F1 마우스는 나이가 들어감에따라 전신성 홍반성 루프스(SLE)-유사 증후군을 나타내고 승인된 SLE의 뮤린 모델이다. 0일에, 연구 동물을 랜덤하게 대조군 또는 처리 그룹으로 할당하였다(n=15/그룹). 동물에 18주령부터 38주령에 걸쳐 PBS 비히클(대조군 동물), 항-CXCL13 mAb(마우스 당 PBS 중 1 mg), 항-TNFα mAb(마우스 당 PBS 중 1 mg) 또는 항-CXCL13 mAb(마우스 당 PBS 중 1 mg) 및 항-TNFα mAb(마우스 당 PBS 중 1 mg) 모두를 복막내 주사로 투여하였다. 항-CXCL13 mAb는 랫트 항-CXCL13 mAb(R&D Systems Inc., Minneapolis, MN)를 중화시켰다. 항-TNF-알파 mAb는 표준의 방법을 사용하여 생성된 랫트 항-TNF-알파 mAb(Centocor, Inc)를 키메라화한다. 소변을 주기적으로 자유롭게 채취하여 -8O℃에 저장하였다. 동물을 연구의 마지막에 희생시키고 신장을 다음의 분석 전 적합한 저장 완충액 중에 채취하였다. 동물을 승인된 국제 동물 보호 및 사용 가이드라인을 사용하여 보호하고 다루고 희생시켰다.

회수한 소변에 존재하는 총 단백질 및 크레아틴을 표준의 방법 및 Ace Analyzer(Alpha Wasserman, West Caldwell, NJ)를 사용하여 결정하였다. 소변의 총 단백질을 100 μl의 희석되지 않은 소변 샘플에서 측정하였고, 크레아틴을 탈이온된 멸균 H₂O 중의 100 μl의 1:10 희석된 소변 샘플에서 측정하였다. 이어서 이들 값을 소변의 총 단백질 대 크레아틴의 산출 비율을 계산하는데 사용하였다. 소변의 총 단백질/크레아틴 비율은 플러스 또느 마이너스 표준 오차로서 측정하였고 샘플 간의 통계적으로 유의한 차이는 p-값 < 0.05에서 표준의 t-검정에 의한 분산의 양측 검증을 사용하여 결정하였다.

조직학적 분석을 동물이 38주령일때 수득한 신장에서 수행하였다. 수득한 신장을 즉시 0.1 M 포스페이트 완충액, 0.7% 파라포름알데하이드, 75 mM L 리신 및 10 mM NalO₄로 구성된 0.7% 과요오드 리신 파라포름알데하이드(PLP) 완충액에 침지시켰다. 신장을 PLP 완충액으로 하룻밤 동안 고정시킨 후, 파라핀 블록에 포매시켰다. 7 μM 절편의 제조 및 헤마톡실린 및 에오신 염색을 위하여 표준의 방법을 사용하였다. 샘플을 맹검 방식으로 SLE 관련 신장 질병의 심각성에 대하여 실험하고 점수를 매겼다. 점수는 각각의 처리 그룹으로부터 NZB/W F1 마우스의 신장 조직에서의 신장 조직의 조직학적 관찰 및 사구체신염 관련 단백질 수준의 심각성으로 확인되는 동맥주위 림프구 침윤물 병소의 수에 기초하였다. 등급 분석 상의 분산의 크루스칼-왈리스 검정을 던의 교정으로 수행하고 p-값 < 0.05를 통계적 유의성이 허용되는 처리 그룹 간의 차이를 확인하기 위하여 사용하였다.

특정 구체예에 대한 참조로 상기에 설명과 기재를 하였지만, 본 발명을 나타내는 설명으로 한정하고자 하는 것은 아니다. 오히려, 본 발명은 CXCL13 길항제 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 항체, 장치 및 본원에서 개시한 이의 키트 및 용도, 및 CXCL13의 수준을 조절하는 방법, 추가로 TNF-α의 수준을 단독으로 조절하는 방법에 관한 것이고, 다양한 변형이 본 발명의 개념을 벗어나는 일 없이 청구항의 대등한 범위 및 영역 내의 설명에서 이루어 질 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> CENTOCOR, INC. <120> CXCL13 ANTAGONISTS AND THEIR USE FOR THE TREATMENT OF INFLAMMATORY DISEASES <130> CEN5134PCT <140> TO BE ASSIGNED <141> 2007-04-20 <150> 60/794,018 <151> 2006-04-21 <150> 60/909,128 <151> 2007-03-30 <160> 12 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 327 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 1 atgaggctca gcacagcaac gctgcttctc ctcctggcca gctgcctctc tccaggccac 60 ggtattctgg aagcccatta cacaaactta aaatgtaggt gttctggagt gatttcaact 120 gttgtcggtc taaacatcat agatcggatt caagttacgc cccctgggaa tggctgcccc 180 aaaactgaag ttgtgatctg gaccaagatg aagaaagtta tatgtgtgaa tcctcgtgcc 240 aaatggttac aaagattatt aagacatgtc caaagcaaaa gtctgtcttc aactccccaa 300 gctccagtga gtaagagaag agctgcc 327 <210> 2 <211> 109 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Met Arg Leu Ser Thr Ala Thr Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ser Cys Leu 1 5 10 15 Ser Pro Gly His Gly Ile Leu Glu Ala His Tyr Thr Asn Leu Lys Cys 20 25 30 Arg Cys Ser Gly Val Ile Ser Thr Val Val Gly Leu Asn Ile Ile Asp 35 40 45 Arg Ile Gln Val Thr Pro Pro Gly Asn Gly Cys Pro Lys Thr Glu Val 50 55 60 Val Ile Trp Thr Lys Met Lys Lys Val Ile Cys Val Asn Pro Arg Ala 65 70 75 80 Lys Trp Leu Gln Arg Leu Leu Arg His Val Gln Ser Lys Ser Leu Ser 85 90 95 Ser Thr Pro Gln Ala Pro Val Ser Lys Arg Arg Ala Ala 100 105 <210> 3 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 atgaagttca tctcgacatc tctgcttctc atgctgctgg tcagcagcct ctctccagtc 60 caaggtgttc tggaggtcta ttacacaagc ttgaggtgta gatgtgtcca agagagctca 120 gtctttatcc ctagacgctt cattgatcga attcaaatct tgccccgtgg gaatggttgt 180 ccaagaaaag aaatcatagt ctggaagaag aacaagtcaa ttgtgtgtgt ggaccctcaa 240 gctgaatgga tacaaagaat gatggaagta ttgagaaaaa gaagttcttc aactctacca 300 gttccagtgt ttaagagaaa gattccc 327 <210> 4 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Lys Phe Ile Ser Thr Ser Leu Leu Leu Met Leu Leu Val Ser Ser 1 5 10 15 Leu Ser Pro Val Gln Gly Val Leu Glu Val Tyr Tyr Thr Ser Leu Arg 20 25 30 Cys Arg Cys Val Gln Glu Ser Ser Val Phe Ile Pro Arg Arg Phe Ile 35 40 45 Asp Arg Ile Gln Ile Leu Pro Arg Gly Asn Gly Cys Pro Arg Lys Glu 50 55 60 Ile Ile Val Trp Lys Lys Asn Lys Ser Ile Val Cys Val Asp Pro Gln 65 70 75 80 Ala Glu Trp Ile Gln Arg Met Met Glu Val Leu Arg Lys Arg Ser Ser 85 90 95 Ser Thr Leu Pro Val Pro Val Phe Lys Arg Lys Ile Pro 100 105 <210> 5 <211> 705 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 5 atgagcacag aaagcatgat ccgcgacgtg gaactggcag aagaggcact cccccaaaag 60 atggggggct tccagaactc caggcggtgc ctatgtctca gcctcttctc attcctgctt 120 gtggcagggg ccaccacgct cttctgtcta ctgaacttcg gggtgatcgg tccccaaagg 180 gatgagaagt tcccaaatgg cctccctctc atcagttcta tggcccagac cctcacactc 240 agatcatctt ctcaaaattc gagtgacaag cctgtagccc acgtcgtagc aaaccaccaa 300 gtggaggagc agctggagtg gctgagccag cgcgccaacg ccctcctggc caacggcatg 360 gatctcaaag acaaccaact agtggtgcca gccgatgggt tgtaccttgt ctactcccag 420 gttctcttca agggacaagg ctgccccgac tacgtgctcc tcacccacac cgtcagccga 480 tttgctatct cataccagga gaaagtcaac ctcctctctg ccgtcaagag cccctgcccc 540 aaggacaccc ctgagggggc tgagctcaaa ccctggtatg agcccatata cctgggagga 600 gtcttccagc tggagaaggg ggaccaactc agcgctgagg tcaatctgcc caagtactta 660 gactttgcgg agtccgggca ggtctacttt ggagtcattg ctctg 705 <210> 6 <211> 234 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Met Ser Thr Glu Ser Met Ile Arg Asp Val Glu Leu Ala Glu Glu Ala 1 5 10 15 Leu Pro Gln Lys Met Gly Gly Phe Gln Asn Ser Arg Arg Cys Leu Cys 20 25 30 Leu Ser Leu Phe Ser Phe Leu Leu Val Ala Gly Ala Thr Thr Leu Phe 35 40 45 Cys Leu Leu Asn Phe Gly Ile Gly Pro Gln Arg Asp Glu Lys Phe Pro 50 55 60 Asn Gly Leu Pro Leu Ile Ser Ser Met Ala Gln Thr Leu Thr Leu Arg 65 70 75 80 Ser Ser Ser Gln Asn Ser Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala 85 90 95 Asn His Gln Val Glu Glu Gln Leu Glu Trp Leu Ser Gln Arg Ala Asn 100 105 110 Ala Leu Leu Ala Asn Gly Met Asp Leu Lys Asp Asn Gln Leu Val Val 115 120 125 Pro Ala Asp Gly Leu Tyr Leu Val Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly 130 135 140 Gln Gly Cys Pro Asp Tyr Val Leu Leu Thr His Thr Val Ser Arg Phe 145 150 155 160 Ala Ile Ser Tyr Gln Glu Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Val Lys Ser 165 170 175 Pro Cys Pro Lys Asp Thr Pro Glu Gly Ala Glu Leu Lys Pro Trp Tyr 180 185 190 Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Gln 195 200 205 Leu Ser Ala Glu Val Asn Leu Pro Lys Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser 210 215 220 Gly Gln Val Tyr Phe Gly Val Ile Ala Leu 225 230 <210> 7 <211> 699 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 atgagcactg aaagcatgat ccgggacgtg gagctggccg aggaggcgct ccccaagaag 60 acaggggggc cccagggctc caggcggtgc ttgttcctca gcctcttctc cttcctgatc 120 gtggcaggcg ccaccacgct cttctgcctg ctgcactttg gagtgatcgg cccccagagg 180 gaagagttcc ccagggacct ctctctaatc agccctctgg cccaggcagt cagatcatct 240 tctcgaaccc cgagtgacaa gcctgtagcc catgttgtag caaaccctca agctgagggg 300 cagctccagt ggctgaaccg ccgggccaat gccctcctgg ccaatggcgt ggagctgaga 360 gataaccagc tggtggtgcc atcagagggc ctgtacctca tctactccca ggtcctcttc 420 aagggccaag gctgcccctc cacccatgtg ctcctcaccc acaccatcag ccgcatcgcc 480 gtctcctacc agaccaaggt caacctcctc tctgccatca agagcccctg ccagagggag 540 accccagagg gggctgaggc caagccctgg tatgagccca tctatctggg aggggtcttc 600 cagctggaga agggtgaccg actcagcgct gagatcaatc ggcccgacta tctcgacttt 660 gccgagtctg ggcaggtcta ctttgggatc attgccctg 699 <210> 8 <211> 233 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Ser Thr Glu Ser Met Ile Arg Asp Val Glu Leu Ala Glu Glu Ala 1 5 10 15 Leu Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Gln Gly Ser Arg Arg Cys Leu Phe 20 25 30 Leu Ser Leu Phe Ser Phe Leu Ile Val Ala Gly Ala Thr Thr Leu Phe 35 40 45 Cys Leu Leu His Phe Gly Val Ile Gly Pro Gln Arg Glu Glu Phe Pro 50 55 60 Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro Leu Ala Gln Ala Val Arg Ser Ser 65 70 75 80 Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro 85 90 95 Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu 100 105 110 Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser 115 120 125 Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly 130 135 140 Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala 145 150 155 160 Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro 165 170 175 Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu 180 185 190 Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu 195 200 205 Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly 210 215 220 Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu 225 230 <210> 9 <211> 2824 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 gctgccacct ctctagaggc acctggcggg gagcctctca acataagaca gtgaccagtc 60 tggtgactca cagccggcac agccatgaac tacccgctaa cgctggaaat ggacctcgag 120 aacctggagg acctgttctg ggaactggac agattggaca actataacga cacctccctg 180 gtggaaaatc atctctgccc tgccacagag gggcccctca tggcctcctt caaggccgtg 240 ttcgtgcccg tggcctacag cctcatcttc ctcctgggcg tgatcggcaa cgtcctggtg 300 ctggtgatcc tggagcggca ccggcagaca cgcagttcca cggagacctt cctgttccac 360 ctggccgtgg ccgacctcct gctggtcttc atcttgccct ttgccgtggc cgagggctct 420 gtgggctggg tcctggggac cttcctctgc aaaactgtga ttgccctgca caaagtcaac 480 ttctactgca gcagcctgct cctggcctgc atcgccgtgg accgctacct ggccattgtc 540 cacgccgtcc atgcctaccg ccaccgccgc ctcctctcca tccacatcac ctgtgggacc 600 atctggctgg tgggcttcct ccttgccttg ccagagattc tcttcgccaa agtcagccaa 660 ggccatcaca acaactccct gccacgttgc accttctccc aagagaacca agcagaaacg 720 catgcctggt tcacctcccg attcctctac catgtggcgg gattcctgct gcccatgctg 780 gtgatgggct ggtgctacgt gggggtagtg cacaggttgc gccaggccca gcggcgccct 840 cagcggcaga aggcagtcag ggtggccatc ctggtgacaa gcatcttctt cctctgctgg 900 tcaccctacc acatcgtcat cttcctggac accctggcga ggctgaaggc cgtggacaat 960 acctgcaagc tgaatggctc tctccccgtg gccatcacca tgtgtgagtt cctgggcctg 1020 gcccactgct gcctcaaccc catgctctac actttcgccg gcgtgaagtt ccgcagtgac 1080 ctgtcgcggc tcctgacgaa gctgggctgt accggccctg cctccctgtg ccagctcttc 1140 cctagctggc gcaggagcag tctctctgag tcagagaatg ccacctctct caccacgttc 1200 taggtcccag tgtccccttt tattgctgct tttccttggg gcaggcagtg atgctggatg 1260 ctccttccaa caggagctgg gatcctaagg gctcaccgtg gctaagagtg tcctaggagt 1320 atcctcattt ggggtagcta gaggaaccaa cccccatttc tagaacatcc ctgccagctc 1380 ttctgccggc cctggggcta ggctggagcc cagggagcgg aaagcagctc aaaggcacag 1440 tgaaggctgt ccttacccat ctgcaccccc ctgggctgag agaacctcac gcacctccca 1500 tcctaatcat ccaatgctca agaaacaact tctacttctg cccttgccaa cggagagcgc 1560 ctgcccctcc cagaacacac tccatcagct taggggctgc tgacctccac agcttcccct 1620 ctctcctcct gcccacctgt caaacaaagc cagaagctga gcaccagggg atgagtggag 1680 gttaaggctg aggaaaggcc agctggcagc agagtgtggc cttcggacaa ctcagtccct 1740 aaaaacacag acattctgcc aggcccccaa gcctgcagtc atcttgacca agcaggaagc 1800 tcagactggt tgagttcagg tagctgcccc tggctctgac cgaaacagcg ctgggtccac 1860 cccatgtcac cggatcctgg gtggtctgca ggcagggctg actctaggtg cccttggagg 1920 ccagccagtg acctgaggaa gcgtgaaggc cgagaagcaa gaaagaaacc cgacagaggg 1980 aagaaaagag ctttcttccc gaaccccaag gagggagatg gatcaatcaa acccggcggt 2040 cccctccgcc aggcgagatg gggtggggtg gagaactcct agggtggctg ggtccagggg 2100 atgggaggtt gtgggcattg atggggaagg aggctggctt gtcccctcct cactcccttc 2160 ccataagcta tagacccgag gaaactcaga gtcggaacgg agaaaggtgg actggaaggg 2220 gcccgtggga gtcatctcaa ccatcccctc cgtggcatca ccttaggcag ggaagtgtaa 2280 gaaacacact gaggcaggga agtccccagg ccccaggaag ccgtgccctg cccccgtgag 2340 gatgtcactc agatggaacc gcaggaagct gctccgtgct tgtttgctca cctggggtgt 2400 gggaggcccg tccggcagtt ctgggtgctc cctaccacct ccccagcctt tgatcaggtg 2460 gggagtcagg gacccctgcc cttgtcccac tcaagccaag cagccaagct ccttgggagg 2520 ccccactggg gaaataacag ctgtggctca cgtgagagtg tcttcacggc aggacaacga 2580 ggaagcccta agacgtccct tttttctctg agtatctcct cgcaagctgg gtaatcgatg 2640 ggggagtctg aagcagatgc aaagaggcaa gaggctggat tttgaatttt ctttttaata 2700 aaaaggcacc tataaaacag gtcaatacag tacaggcagc acagagaccc ccggaacaag 2760 cctaaaaatt gtttcaaaat aaaaaccaag aagatgtctt caaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2820 aaaa 2824 <210> 10 <211> 372 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Met Asn Tyr Pro Leu Thr Leu Glu Met Asp Leu Glu Asn Leu Glu Asp 1 5 10 15 Leu Phe Trp Glu Leu Asp Arg Leu Asp Asn Tyr Asn Asp Thr Ser Leu 20 25 30 Val Glu Asn His Leu Cys Pro Ala Thr Glu Gly Pro Leu Met Ala Ser 35 40 45 Phe Lys Ala Val Phe Val Pro Val Ala Tyr Ser Leu Ile Phe Leu Leu 50 55 60 Gly Val Ile Gly Asn Val Leu Val Leu Val Ile Leu Glu Arg His Arg 65 70 75 80 Gln Thr Arg Ser Ser Thr Glu Thr Phe Leu Phe His Leu Ala Val Ala 85 90 95 Asp Leu Leu Leu Val Phe Ile Leu Pro Phe Ala Val Ala Glu Gly Ser 100 105 110 Val Gly Trp Val Leu Gly Thr Phe Leu Cys Lys Thr Val Ile Ala Leu 115 120 125 His Lys Val Asn Phe Tyr Cys Ser Ser Leu Leu Leu Ala Cys Ile Ala 130 135 140 Val Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Ala Val His Ala Tyr Arg His 145 150 155 160 Arg Arg Leu Leu Ser Ile His Ile Thr Cys Gly Thr Ile Trp Leu Val 165 170 175 Gly Phe Leu Leu Ala Leu Pro Glu Ile Leu Phe Ala Lys Val Ser Gln 180 185 190 Gly His His Asn Asn Ser Leu Pro Arg Cys Thr Phe Ser Gln Glu Asn 195 200 205 Gln Ala Glu Thr His Ala Trp Phe Thr Ser Arg Phe Leu Tyr His Val 210 215 220 Ala Gly Phe Leu Leu Pro Met Leu Val Met Gly Trp Cys Tyr Val Gly 225 230 235 240 Val Val His Arg Leu Arg Gln Ala Gln Arg Arg Pro Gln Arg Gln Lys 245 250 255 Ala Val Arg Val Ala Ile Leu Val Thr Ser Ile Phe Phe Leu Cys Trp 260 265 270 Ser Pro Tyr His Ile Val Ile Phe Leu Asp Thr Leu Ala Arg Leu Lys 275 280 285 Ala Val Asp Asn Thr Cys Lys Leu Asn Gly Ser Leu Pro Val Ala Ile 290 295 300 Thr Met Cys Glu Phe Leu Gly Leu Ala His Cys Cys Leu Asn Pro Met 305 310 315 320 Leu Tyr Thr Phe Ala Gly Val Lys Phe Arg Ser Asp Leu Ser Arg Leu 325 330 335 Leu Thr Lys Leu Gly Cys Thr Gly Pro Ala Ser Leu Cys Gln Leu Phe 340 345 350 Pro Ser Trp Arg Arg Ser Ser Leu Ser Glu Ser Glu Asn Ala Thr Ser 355 360 365 Leu Thr Thr Phe 370 <210> 11 <211> 2636 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 11 cgacatcaga cagtgaccag cctggtgacg cagagctgca gctatgaact acccactaac 60 cctggacatg ggctccatca catacaatat ggatgacctg tacaaggaac tggccttcta 120 cagtaacagc acggagattc ccctacagga cagtaacttc tgctctacag tcgagggacc 180 cttactgacg tcctttaagg cggtattcat gcctgtggcc tacagcctca tcttcctcct 240 gggtatgatg ggaaacatcc tggtgctggt aatcctggag aggcaccggc acactcggag 300 ctcaaccgag accttcctgt tccacctcgc agtagccgac cttctcttag tcttcatcct 360 gccttttgca gtggctgagg gctctgtggg ttgggtccta gggaccttcc tctgcaaaac 420 tgtgatcgct ctgcacaaga tcaatttcta ctgcagcagc ctgctgctgg cctgtatagc 480 tgtagaccgg tacctagcca tcgtccatgc tgttcacgcc taccgccgcc gtcgactcct 540 ctccatccac atcacctgca cggccatttg gctggccggc ttcctgttcg ccttaccgga 600 actcctcttt gccaaggttg gccaacctca taacaacgac tccttaccac agtgcacctt 660 ctcccaggaa aacgaagcgg aaactagagc ctggttcacc tcccgtttcc tctaccacat 720 cgggggcttc ctactaccga tgcttgtgat gggatggtgt tacgtgggcg tggtccacag 780 gctactgcag gcccagcggc gccctcagcg gcagaaggcg gtcagggtgg ccattttagt 840 gacaagcatt ttcttcctct gctggtcgcc ctaccacatt gtcatcttcc tagatacact 900 ggagaggctg aaggctgtga atagcagctg cgagctgagt ggctatctct ctgtggccat 960 caccttgtgt gaattcctgg gcctggcaca ctgctgtctc aatcccatgc tctacacctt 1020 cgctggcgta aagttccgca gtgacctctc tcggcttctg accaagctgg gctgtgctgg 1080 cccggcctcc ctttgccaac ttttccccaa ctggcgcaag agtagtctct ctgagtcaga 1140 gaatgctact tccctcacca ccttctagat cccggaagtc tcggggcccc tgtctgtttc 1200 tgttttcctt gggaggataa agtggtggcg gaacccatcc aactcgagct tgggccagtg 1260 tccccagatg ggaaagctag ataaactctc tcaaactttc ccaaagggga aagcagccca 1320 aaggcaaagc aagctatatc caggccacct gtatcacctt agatgaagag aactccatac 1380 acctcccatc ctaaccagct aaagctaagc tcagctttat ttcttcctgg ccatagggac 1440 aaccacctct gctgtggccc acagtctcat cttcctcctg attatgagcc cagactctcc 1500 tcccagaatg tattccatca tcttaaagac tactggctgc cacagctacc caccactcct 1560 ataccacaga ggaatagcca gctggcggcg gcagactatg gccttaatgt gcctgtctca 1620 taaatacaga cttcatgcca gaccttcaac cgtgcctttc tcttaaccaa gcagaaagct 1680 gaaaccgatc tactttaggt agctgtctgg ttccaaccta accagcattg ggtcagcccc 1740 atgttactgg atcttggatt acagactgag ggcaagttcc agaaggttct ggaagctagc 1800 cagtatccta agaagagtaa agggcaagcc agcaggaaag aggcccagtg gaaaagtgga 1860 aagacacctt ttccaggctc taaggaagaa caagtaaaaa tcaaacccag ctgtcttctc 1920 cacccaatgt accaaagctt acagactggt ggggaaatga gatccagggc cctcgtggat 1980 tctacgcacc aatggggaag gaagccaact tgcctgggga aagcaagata gcaaagtggt 2040 cctagcctcg agagagggga cacctagcta agagaatgac gacagaggtt cctgtcttca 2100 ttaggcagag gcaatataag aagccaacct gggcaggcaa gtcctcaaac cccaggaagg 2160 cagtaccctg cccctgggag ggtaccactc acatggaacc agaggaagct gctccatgca 2220 tacatagggg aagttagcag gcaattctga gctcggcttc ctcccagcca ccgatctggg 2280 ggcgtggggg taggaagcag agttgcctag taccactcaa gccaaccgta caagctccct 2340 gggggatccc actggggaaa ccaatgctat agcttcagag actgtatcct cattgcagaa 2400 ccgtgaagac acctggggac ccccttttct gctcccagca tccaacaacc agctgggaag 2460 aggcaaaccg ggcacagaaa taaaaatgca agagatggca tttttgaatt ttctcttttt 2520 aataaaaagg cacctataaa acaggtcaat acaggcagag acccccggaa caagcctaaa 2580 aagtgtttca aaataaaaac aggaagatgt cttcaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 2636 <210> 12 <211> 374 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 12 Met Asn Tyr Pro Leu Thr Leu Asp Met Gly Ser Ile Thr Tyr Asn Met 1 5 10 15 Asp Asp Leu Tyr Lys Glu Leu Ala Phe Tyr Ser Asn Ser Thr Glu Ile 20 25 30 Pro Leu Gln Asp Ser Asn Phe Cys Ser Thr Val Glu Gly Pro Leu Leu 35 40 45 Thr Ser Phe Lys Ala Val Phe Met Pro Val Ala Tyr Ser Leu Ile Phe 50 55 60 Leu Leu Gly Met Met Gly Asn Ile Leu Val Leu Val Ile Leu Glu Arg 65 70 75 80 His Arg His Thr Arg Ser Ser Thr Glu Thr Phe Leu Phe His Leu Ala 85 90 95 Val Ala Asp Leu Leu Leu Val Phe Ile Leu Pro Phe Ala Val Ala Glu 100 105 110 Gly Ser Val Gly Trp Val Leu Gly Thr Phe Leu Cys Lys Thr Val Ile 115 120 125 Ala Leu His Lys Ile Asn Phe Tyr Cys Ser Ser Leu Leu Leu Ala Cys 130 135 140 Ile Ala Val Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Ala Val His Ala Tyr 145 150 155 160 Arg Arg Arg Arg Leu Leu Ser Ile His Ile Thr Cys Thr Ala Ile Trp 165 170 175 Leu Ala Gly Phe Leu Phe Ala Leu Pro Glu Leu Leu Phe Ala Lys Val 180 185 190 Gly Gln Pro His Asn Asn Asp Ser Leu Pro Gln Cys Thr Phe Ser Gln 195 200 205 Glu Asn Glu Ala Glu Thr Arg Ala Trp Phe Thr Ser Arg Phe Leu Tyr 210 215 220 His Ile Gly Gly Phe Leu Leu Pro Met Leu Val Met Gly Trp Cys Tyr 225 230 235 240 Val Gly Val Val His Arg Leu Leu Gln Ala Gln Arg Arg Pro Gln Arg 245 250 255 Gln Lys Ala Val Arg Val Ala Ile Leu Val Thr Ser Ile Phe Phe Leu 260 265 270 Cys Trp Ser Pro Tyr His Ile Val Ile Phe Leu Asp Thr Leu Glu Arg 275 280 285 Leu Lys Ala Val Asn Ser Ser Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Leu Ser Val 290 295 300 Ala Ile Thr Leu Cys Glu Phe Leu Gly Leu Ala His Cys Cys Leu Asn 305 310 315 320 Pro Met Leu Tyr Thr Phe Ala Gly Val Lys Phe Arg Ser Asp Leu Ser 325 330 335 Arg Leu Leu Thr Lys Leu Gly Cys Ala Gly Pro Ala Ser Leu Cys Gln 340 345 350 Leu Phe Pro Asn Trp Arg Lys Ser Ser Leu Ser Glu Ser Glu Asn Ala 355 360 365 Thr Ser Leu Thr Thr Phe 370

Claims

a) 세포, 조직, 기관 또는 동물에서 CXCL13 활성을 억제하는데 유효한 양의 CXCL13-결합 단일클론 항체 또는 그의 CXCL13-결합 단편; 및

b) 상기 세포, 조직, 기관 또는 동물에서 TNFα 활성을 억제하는데 유효한 양의 TNFα-결합 단일클론 항체 또는 그의 TNFα-결합 단편을 포함하되,

상기 항체 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, facb, pFc', Fd, Fv 또는 scFv 단편인, 상기 세포, 조직, 기관 또는 동물에서 만성 폐쇄성 폐질환(COPD) 또는 전신성 홍반성 루프스로부터 선택되는 CXCL13 활성-관련 질환 치료용 배합물.
제1항에 있어서, 항체 단편이 Fab, Fab', 또는 F(ab')2 단편인 것을 특징으로 하는 배합물.
제1항에 있어서, 동물이 포유류인 것을 특징으로 하는 배합물.
제3항에 있어서, 적어도 하나의 단일클론 항체 또는 단편이 비경구, 피하, 근육내, 정맥내, 관절내, 기관지내, 복강내, 낭내, 연골내, 강내, 복내(intracelial), 소뇌내, 뇌실내, 결장내, 경부내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심장막공간내(intrapericardiac), 복막내, 흉막내, 전립선내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 척수내, 활액내, 흉부내, 자궁내, 방광내, 병변내, 볼루스, 질내, 직장내, 구강내, 설하, 비강내 및 경피로부터 선택된 적어도 하나의 방법으로 투여되는 것을 특징으로 하는 배합물.
제4항에 있어서, 단일클론 항체 또는 단편이 포유류의 kg 체중 당 약 0.05 mg 내지 약 30.0 mg의 양으로 투여되는 것을 특징으로 하는 배합물.
제4항에 있어서, 포유류가 인간 환자인 것을 특징으로 하는 배합물.
제4항에 있어서, 단일클론 항체 또는 단편이 복막내로 투여되는 것을 특징으로 하는 배합물.
제4항에 있어서, 단일클론 항체 또는 단편이 볼루스 투여되고, 이어서 상기 항체가 주입(infusion)에 의해 투여되는 것을 특징으로 하는 배합물.
a) CXCL13-결합 항체 또는 그의 CXCL13-결합 단편; 및

b) TNFα-결합 항체 또는 그의 TNFα-결합 단편을 포함하되,

동물에서 전신성 홍반성 루프스의 증상을 감소시키기에 유효한 양으로 상기 각 항체 또는 결합 단편을 포함하고, 상기 항체 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, facb, pFc', Fd, Fv 또는 scFv 단편인, 전신성 홍반성 루프스에 걸린 동물 치료용 배합물.
제9항에 있어서, 동물이 포유류인 것을 특징으로 하는 배합물.
제10항에 있어서, 포유류가 인간인 것을 특징으로 하는 배합물.
제9항에 있어서, 각 항체 또는 항체의 결합 단편의 양이 동물의 kg 체중 당 약 0.05 mg 내지 약 50.0 mg인 것을 특징으로 하는 배합물.
제12항에 있어서, 각 항체 또는 항체의 결합 단편의 양이 동물의 kg 체중 당 약 25 mg 내지 약 40 mg인 것을 특징으로 하는 배합물.
제9항에 있어서, 전신성 홍반성 루프스의 증상이 신장 조직을 검사하여 확인된 동맥주위 림프구 침윤물 병소의 개수인 것을 특징으로 하는 배합물.
제9항에 있어서, 전신성 홍반성 루프스의 증상이 총 소변 단백질 대 총 소변 크레아틴의 비율인 것을 특징으로 하는 배합물.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제