KR101391332B1

KR101391332B1 - 카바페넴 제제에 내성을 보이는 아시네토박터 속의 균을 용균하는 박테리오파아지

Info

Publication number: KR101391332B1
Application number: KR1020120053306A
Authority: KR
Inventors: 용동은; 전종수
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2012-05-18
Filing date: 2012-05-18
Publication date: 2014-05-07
Also published as: KR20130129326A

Abstract

본 발명은 강력한 항균제인 카바페넴에 대한 내성을 보이는 아시네토박터 균속을 용균하는 박테리오 파아지에 관한 것으로, 액체 배지를 이용한 박테리오파아지 증식법을 새롭게 고안하여 기존 방법으로는 검출할 수 없었던 카바페넴 항생제 내성 아시네토박터 균속에 대하여 특이적 사멸능을 갖는 용균성 박테리오 파아지를 민감하게 검출하여, 카바페넴 항생제 내성 아시네토박터 균속에 의해 유발되는 질환의 예방 및 치료 목적으로 이용할 수 있다.

Description

카바페넴 제제에 내성을 보이는 아시네토박터 속의 균을 용균하는 박테리오파아지 {ＬＹＴＩＣＢＡＣＴＥＲＩＯＰＨＡＧＥＳＰＥＣＩＦＩＣＦＯＲＡＣＩＮＥＴＯＢＡＣＴＥＲＧＥＮＵＳＲＥＳＩＳＴＡＮＴＴＯＣＡＲＢＡＲＰＥＮＥＭ}

본 발명은 강력한 항균제인 카바페넴에 대한 내성을 보이는 아시네토박터 속의 균을 용균시키는 박테리오파아지에 관한 것이다.

아시네토박터 속의 균은 그람음성 간균으로 포도당 비발효 세균이며, 이들은 토양, 물, 하수 등을 포함한 자연환경, 사람의 피부, 구강, 호흡기계 점막 등에 상재균으로 분포한다. 이들 세균은 신생아, 비장 절제술 시행 환자, 장기간 스테로이드를 투여한 환자, 항암 치료 중인 암환자, 장기 이식 환자, 집중치료실 환자와 같은 면역력이 저하된 고위험군에서 내인성 기회감염의 주요 원인균이다(Patrick PR, et al.eds. Manual of Clinical Microbiology. 8th eds. ASM press. 2003). 최근에는, 항생제 내성 세균이 점차 증가하고 있으며 가장 강력한 항균력을 보이는 항생제인 카바페넴 제제에도 내성을 보이는 아시네토박터 균주가 등장하였다. 90-60 rule에 의하면 감염증 환자를 감수성을 보이는 항균제를 이용하여 적절한 치료를 하는 경우 약 90%의 양호한 예후를 기대할 수 있고, 내성을 보이는 항균제로 치료하는 경우는 약 60% 밖에 반응하지 않았다 (Rex JH and Pfaller MA. Has antifungal susceptibility testing come of age? Clin Infect Dis. 2002; 15; 35(8):982). 이에 따라서, 다제내성 세균감염증 치료에 대한 대안 물질로써 기존의 화합요법제제를 보완할 수 있는 박테리오파아지에 대한 필요성이 대두하였다.

항생제 내성 박테리아의 출현 이후 기존의 항생제 대체제로서의 관심으로부터 항균제로서의 박테리오파아지 사용이 하나의 가능성으로 제기되었다. 박테리오파아지는 생존을 위해 세균에 감염되어 그 세포 내에서만 증식하며, 박테리오파아지와 그 숙주 간의 관계는 높은 특이성을 갖는 것으로 알려져 있다. 세균을 감염시킬 때, 파아지는 용균성(Lytic) 또는 용원성(Lysogenic) 생활사를 따른다. 용균성 파아지는 숙주의 세포 기구들이 파아지 자신의 구조물들을 만들게 한 후 세포를 파괴하거나 용해시켜 새로운 파아지 입자들을 방출시킨다. 용원성 파아지는 자신의 핵산을 숙주세포의 염색체에 편입시켜 세포를 파괴하지 않고 세포와 함께 복제된다. 일정한 조건이 되면 용원성 파아지는 용균성으로 전환될 수 있다.

본 발명은 다제내성 세균감염증 치료의 대안 물질로 기존의 화학용법 제제를 보완할 수 있는 용균성 박테리오파아지를 기존과는 다른 방법으로 스크리닝하여 다제내성 아시네토박터 속의 균을 선택적으로 사멸시킬 수 있는 새로운 용균성 박테리오파아지를 분리하고, 분리된 박테리오파아지의 형태적 및 유전적 특성을 분석하여 이를 타 박테리오파아지와 구별하여 특징지을 수 있는 유전체의 유전자 서열을 비교하여 차별성을 확인한 후, 이러한 파아지를 포함하는 다제내성 아시네토박터 속의 균에 의해 유발되는 질환의 치료용 약학 조성물을 개발하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 항생제 카바페넴 내성 아시네토박터 속의 균에 대한 특이적 감염 및 사멸능을 갖는 신규한 박테리오파아지 및 상기 박테리오파아지의 용균 효소를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 카바페넴 내성 아시네토박터 속의 균에 대한 특이적 감염 및 사멸능을 갖는 신규한 박테리오파아지 및 이의 용균 효소를 이용하여 카바페넴 내성 아시네토박터 속의 균에 의해 유발되는 질환의 예방 및 치료용 조성물과 질환 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물, 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "일 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.

본 발명은 국내 병원 임상 검체에서 아시네토박터 속의 균에 의한 카바페넴 내성 감염증을 치료하는 목적으로, 상기 균속을 용균시키는 파아지의 전 유전체 분석을 통하여 다양한 용균 효소 유전자를 확보하여 이를 분리 정제하였다. 이를 통해, 카바페넴 내성 아시네토박터 속의 균 감염에 대한 용균성을 갖는 용균 효소(서열번호 1)를 함유하는 용균성 박테리오파아지(서열번호 2)를 분리하였고, 이를 포함하는 질환 치료용 약학 조성물 및 질환 개선용 식품 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명에서는 상기 용균 효소의 아미노산 서열(서열번호 1)을 제공한다.

본 발명은 대장균 숙주 세포에서 서열번호 1의 용균 효소를 발현시켜서, 정제하는 방법 및 용균능을 측정하는 방법을 제공한다. 대장균 숙주 세포에서 서열번호 1의 용균 효소를 발현시키는 방법은 다음 단계를 포함한다: (a) 검출가능한 레벨의 서열번호 1의 용균 효소를 생성시키기에 충분한 양으로 용균 효소를 암호화하는 유전자를 본 발명에서 목적하는 발현 플라스미드에 클로닝하여 만든 재조합 벡터를 전기장 충격법을 사용하여 대장균 숙주 세포내로 삽입함으로써 원하는 단백질을 대량으로 생산해낼 수 있는 형질전환체를 제조하는 단계, 및 (b) 생성된 용균 효소 단백질을 정제하는 단계: 유전공학분야에서 사용되는 통상의 방법에 따라 상기 대장균 형질전환체를 적당한 항생제를 포함한 LB 고체를 이용하여 37˚C에서 18시간 동안 배양하며, 이 때 형성된 단일 콜로니를 적당한 항생제가 첨가된 LB 배지에 접종하며, 섭씨 37˚C 에서 16시간 배양한 후 적당량을 취하여 LB 배지에 접종하며, 대장균 배양액의 양을 조절하여 OD₆₀₀이 0.12 이하가 되도록 하고 같은 온도에서 계속 배양하여 OD₆₀₀이 0.6~0.8에 도달하였을 때 배양액을 18˚C로 냉각시키며, 이어서 발현유도 물질은 IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid)를 첨가하여 IPTG의 최종농도가 O.5MM이 되도록 하고, 18˚C에서 18시간 더 배양하여 목적하는 단백질의 발현을 대량으로 과발현시키고 발현된 단백질을 정제한다. 암모늄 설페이트 침전법, 페닐 세파로즈 수지 칼럼을 이용하는 정제방법에 의해 단백질을 수득하며, 이에 대한 폴리아크릴아마이드겔 전기영동 및 웨스턴블롯팅을 수행하여 정제된 단백질이 목적하는 단백질임을 확인한다.

상기와 같은 방법으로 제조한 용균 효소 단백질을 단독으로 항생제 내성 균주에 처리하면 박테리오파아지를 처리한 것과 같은 용균 효과를 얻을 수 있고, 그 방법은 다음과 같다. 정제된 용균 단백질은 브래드포드 어세이를 통해 정량을 실시한다. A600에서 1이 되는 흡광도가 될 때까지 배양한 항생제 내성 균주를 원심분리하여 인산염 완충액 (10mM K₂HPO₄, 10mM KH₂PO₄, pH=7.2)에 재부유시키고 나서 약 10⁵ 세포를 용균 단백질 50μg과 혼합하여 최종 부피 100㎕를 만들었다. 이 혼합물을 37˚C에서 1시간 동안 배양한 후 LB 아가 플레이트에 도말하여 37˚C에서 하룻밤 동안 배양하여 플레이트에 생긴 콜로니 숫자를 세어서 용균 단백질의 용균능을 측정하였다. 대조군으로는 용균 단백질이 없는 인산염 완충액을 단독으로 사용하였다. 항균력은 다음의 등식을 이용해 계산하였다.

항균력(%)= (N ₀ -N ₁ )/N ₀ ×100%

여기서, N ₀ 은 대조군 플레이트에 형성된 콜로니 숫자이고 N ₁ 은 실험군 플레이트에 형성된 콜로니 숫자이며, 용균능 측정은 3회 반복하였다 (Appl Microbiol Biotechnol (2011) 90:529-539, Antibacterial activity of Acinetobacter baumannii phageΦAB2 endolysin(LysAB2) against both Gram-positive and Gram-negative bacteria).

또한, 본 발명에서는 카바페넴 내성 아시네토박터 속의 균 감염에 대한 용균성을 갖는 서열번호 1의 용균 효소를 함유하는 용균성 박테리오파아지의 서열(서열번호2)을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에서, 항생제 내성 아시네토박터 속의 균에 대한 박테리오 파아지는 서열번호 1의 용균 효소를 제공하고, 상기 구체예의 용균성 박테리오파아지의 기탁번호는 KFCC11524P이며, 상기 구체예의 박테리오파아지는 서열번호 2의 박테리오파아지이며, 상기 구체예의 항생제 내성 아시네토박터 속의 균에 속하는 균종은 Acinetobacter baumannii, Acinetobacter calocoaceticus, Acinetobacter haemolyticus, Acinetobacter junii, Acinetobacter johnsonii, Acinetobacter lwoffii, Acinetobacter radioresistens 중에서 선택하는 어느 하나이며, 상기 구체예의 항생제는 카바페넴이며, 상기 구체예의 항생제 내성 아시네토박터 속의 균이 생산하는 효소는 카바페넴아제이며, 상기 구체예의 항생제 내성 아시네토박터 속의 균이 생산하는 카바페넴아제는 OXA형이다.

본 발명의 일 구체예에서, 서열번호 1의 용균 효소를 함유하는 용균성 박테리오파아지를 유효성분으로 포함하는 항생제 내성 아시네토박터 속의 균에 의해 유발되는 질환의 치료용 약학 조성물을 제공하며, 상기 구체예에서 서열번호 1의 용균 효소를 함유하는 용균성 박테리오파아지를 유효성분으로 포함하는 항생제 내성 아시네토박터 속의 균에 의해 유발되는 질환의 개선용 식품 조성물을 제공하며, 상기 구체예의 질환은 C형 간염, 수족구병, 임질, 클라미디아, 연성하감, 성기단순포진, 첨규콘딜롬, 반코마이신내성황색포도알균감염증, 반코마이신내성장알균감염증, 메티실린내성황색포알균감염증, 다제내성녹농균감염증, 다제내성아시네토박터바우마니균감염증, 카바페넴내성장내속균종감염증, 장관감염증, 급성호홉기감염증, 엔테로바이러스감염증 중에서 선택하는 어느 하나의 질환이다.

본 발명의 일 구체예에서, 서열번호 1의 폴리펩타이드를 제공하며, 상기 구체예에서 서열번호 1로 기재되는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산분자를 제공하며, 상기 구체예에서 상기 핵산분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하며, 상기 구체예에서 상기 재조합 벡터를 형질전환시킨 미생물을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에서, 서열번호 1의 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항생제 내성 아시네토박터 속의 균에 의해 유발되는 질환의 치료용 약학 조성물을 제공하며, 상기 구체예에서 서열번호 1의 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항생제 내성 아시네토박터 속의 균에 의해 유발되는 질환의 개선용 식품 조성물을 제공한다.

강력한 항균제인 카바페넴 내성 아시네토박터 속의 균에 대하여 특이적 사멸능을 갖는 신규한 박테리오파아지 및 이로부터 분리한 용균 효소를 이용하여 카바페넴 내성 아시네토박터 속의 균에 의해 유발되는 질환의 예방 및 치료 목적으로 활용할 수 있다.

도 1은 다제내성 아시네토박터 속의 균의 유전체 DNA를 제한효소 Sma I으로 절단하여 전기영동을 실시한 결과이다.
도 2는 도 1의 결과를 OXA-형 카바페넴아제 유전자, 삽입서열 공통 구역1 조성물, 인테그론에 근거하여 작성한 계통수이다.
도 3은 용균성 박테리오파아지 YMC/B1251 ABA BP의 전 유전체를 분석한 결과이다.
도 4는 상기 파아지의 용균성 단백질과 다른 파아지의 용균성 단백질에 대한 계통수이다.
도 5는 상기 파아지의 용균성 단백질과 ABA phiAB2 용균 단백질에 대한 서열을 정렬하여 비교분석한 결과이다.

이하, 본 발명의 구성요소와 기술적 특징을 다음의 실시예들을 통하여 보다 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 하기 실시예들은 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 발명의 범위가 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예1 . 카바페넴 내성 임상검체 균주 분리 수집 및 균주 은행 구축

(1) 임상 검체 분리 균주 수집: 인덱스 균주 뱅크 구축

세브란스 병원의 환자들로부터 호흡기 감염증, 패혈증 및 농양 검체를 수집하였으며 각 검체에 대한 임상적 위중도 평가 기준은 다음과 같다. 호흡기 검체는 그룹 4,5,6으로 제한하였고, 패혈증 검체는 3 쌍 배양 중 2 쌍 이상에서 증식하였으며, 농양 검체는 심부농양 주사기 아스피레이트에 제한하였다. 상기 검체로부터 아시네토박터 속의 균에 속하는 병원균을 배양 분리하였고, 균주의 동정을 위해 전통적 방법을 통한 생화학적 동정을 실시하였다. 감수성 결과는 Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2010)을 기준으로 판독하였다. 감수성 시험은 Mueller-Hinton 아가를 사용하여 외기 37˚C에서 하룻밤 동안 배양하는 CLSI disk diffusion 시험방법을 사용하였다. 아시네토박터에 대한 시험 항균제는 Imipenem, Meropenem, Ampicillin, Piperacillin, Amoxicillin/Clavulanic acid,　Ampicillin/Sulbactam, Cefoperazone/Sulbactam, Aztreonam, Ceftazidime,　

Cefepime, Cefotaxime, Cefoxitin, Cephalothin, Gentamicin, Tobramycin,　

Amikacin, Netilmicin, Cotrimoxa, Levofloxacin, Tetracycline를 사용하였다. 카바페넴 내성 균주을 선별하기 위해 Imipenem Hodge test를 통해 카바페넴아제를 발현하는 균주를 1차 선별하였고, 이후에 Imipenem EDTA double disk synergy test를 통해 metallo-β-lactamase를 발현하는 균주를 선별하였는데, 양성 및 음성 대조를 포함한 PCR을 실시하였고 사용한 프라이머 세트는 표 1에 나타내었다.

타겟	프라이머	프라이머 서열(5'-3')	결과물크기
bla _VIM	VIM2FR-F VIM2FR-R	ATGTTCAAACTTTTGAGTAAG CTACTCAACGACTGAGCG	801bp
bla _IMP	IMP1-F IMP1-R	CATGGTTTGGTGGTTCTTGT ATAATTTGGCGGACTTTGGC	450bp
bla _SIM _-1	SIM-1 MP F SIM-1 MR R	TACAAGGGATTCGGCATCG TAATGGCCTGTTCCCATGTG	571bp
bla _SPM _-1	SPM-1-A SPM-1-B	CTGCTTGGATTCATGGGCGC CCTTTTCCGCGACCTTGATC	784bp
bla _GIM _-1	GIM1-F GIM1-R	ATTACTTGTAGCGTTGCCAGCT TAATCAGCCGACGCTTCAG	726bp
bla _AIM _-1	Yong MBLF Yong MBLRF	GGCATTGATGCGCATCAAGG GAAGACGTCGTCCGAGATCG	726bp
bla _NDM _-1	KP05506 M13 R3 KP05506 M13 R2	CAATATTATGCACCCGGTCG ATCATGCTGGCCTTGGGGAA	726bp
bla _HKM _-1	KHM-1 F KHM-1 R	GGTATGCGCTGACGATTCAT TACCGCATGGCTAAGATTGC	526bp
bla _SME	SME1-3 F SME1-3 R	AGCGGTTCCCTTTATGCAGT CGTGATGCTTCCGCAATAGT	661bp
bla _IMI, bla _NMC	IMI NMC F IMI NMC R	CGATTGGGTAGTTGGCGATA CGATTCTTGAAGCTTCTGCG	173bp
bla _GES	GES 2456 F GES 2456 R	CGAAAAAGCAGCTCAGATCG TGTCCGTGCTCAGGATGAGT	761bp
bla _KPC	KPC 1-4 F KPC 1-4 R	TGGACACACCCATCCGTTAC GACGGCCAACACAATAGGTG	515bp

(2) Pulse-field gel electrophoresis를 이용한 색인 계통의 클론성 판정

(Birren and Lai Academic Press. Inc., San Diego, 1993)

시험세균을 Mueller-Hinton 한천 배지에 접종한 후 35˚C에서 12시간 배양하고 살린-에틸렌디아민 사아세트산 용액에 부유하고, 원심 분리하여 침전물을 37˚C에 보관된 Pett IV 용액 500 μL에 다시 부유하였다. 부유액 130 μL와 50˚C에 보온한 2% low-melting 아가로즈 동량을 혼합한 아가로즈 플러그를 만들어 용해 용액 1mL에 넣고 37˚C 온수조에서 1시간 동안 반응시킨 후, ESP 용액에서 15~48시간 반응시킨다. 이후, 아가로즈 Plug를 PMSF(단백질 분해효소 저해제) 용액 1.5mL에 넣어 중화시키고 TE 완충액 1.5mL를 이용하여 세척하였다. 세척한 아가로즈 플러그를 제한효소 완충액 1.5mL에 실온에서 1시간 동안 넣어둔 후에 다시 제한효소 Spe I를 넣은 제한효소 완충액 100μL에 옮겨 넣고 37˚C에서 18시간 동안 반응시킨다. 제한효소를 처리한 아가로즈 Plug를 1% 아가로즈 젤과 CHEF-DRII(Bio-Rad Laboratories)을 이용하여 전기영동을 실시하였다.

(2) 균주 수집 및 스크리닝 결과

임상검체에서 분리된 아시네토박터 속의 균 2831주 중에서 카바페넴 제제인 Imipenem에 내성을 보이는 2173주를 수집하였다. 이들 중에서 변형한 Hodge test를 시행한 결과, 2083주가 카바페넴아제를 생성함을 규명하였다. 이는 카바페넴 내성 균주 중 95.8%에 해당한다. 이들 중 Imipenem-EDTA double-disk synergy 시험을 시행한 결과, 30주가 metallo-beta-lactamase를 생성하는 것을 확인하였다. PFGE를 시행한 결과 3 band 이상의 차이를 보여 클론성이 상이한 13개 그룹으로 구분하였다 (도1, 도2). 13개의 pulsotype 중 4개의 우성은 OXA-51형과 OXA-23형의 카바페넴아제를 주로 생성하였고 OXA-24형과 OXA-58형은 검출되지 않았다 (도 2). ISAba1이 OXA형 카바페넴아제 유전자 상에 모두 검출되었고, 13개의 pulsotype 중에서 9개 군과 11개 군에서 인테그론과 삽입서열 공통구역 1 유전자를 검출하였다.

실시예 2. 파아지 은행 구축을 위한 검체 수집 및 파아지 분리 정제

(1) 파아지 은행 구축을 위한 검체 수집

세브란스 병원의 오수 처리시설에서 최초 침전지를 거친 후 부유물질 및 침사물이 제거된 처리수 2L를 채취하였다. 이는 화학처리 시설 전 단계의 오수로 제한하였다. 수집한 시료에 1L당 염화나트륨 58g을 첨사한 후 10000g에서 10분간 원심 분리하여 200nm 밀리포어 필터로 여과하였다. 얻어진 여과액에 폴리에틸렌글리콜(PEG, 분자량 8000)을 10% V/V으로 첨가하고 4˚C에서 12시간 동안 냉장 보관하였다. 12시간 냉장 보관된 여과액을 12000g에서 20분간 원심 분리하여 침전물을 파아지 희석 완충액 (SM 완충액)에 재 부유하여 냉동 보관하였다. 이를 3회 반복하여 300mL의 박테리오파아지 부유액을 채취하였다.

(2) 용균성 파아지 선별 및 정제

가) 용균반 검사를 이용한 파아지 정제 (Kropinski AM et al. In Bacteriophages. Clokie MRJ and Kropinski AM, eds. Humana Press, 2009)

용균성 파아지의 분리 정제는 Spot Test법 (Mazzocco A et al. In Bacteriophages, Clokie and Kropinski AM, eds. Humana Press. 2009)으로 실행하였다. 확보된 균주를 맥콘키 한천배지에서 접종 후 외기 35˚C에서 하룻밤 동안 배양하였다. 배양 후, 투명한 플라크 형성을 보고 파아지에 감수성인 균주를 선별하였다. 감수성인 균주를 맥콘키 한천배지에 접종하여 35˚C에서 12시간 동안 배양하였다. 살린 1ml 튜브에 McFarland 0.5 탁도로 각 균주의 현탁액 제조하고 H 탑 아가 (3 ml), 감수성 박테리아 100ul 및 파아지 용액 (각각 1ul, 10ul 및 50ul)을 섞어 LB 아가에 도포한 후, 35˚C에서 12시간 동안 배양하였다. 플라크 관찰한 후에 파스퇴르 파이펫으로 플라크를 채취하여 SM 완충용액에 희석하고 다시 감수성인 균주 현탁액을 이용하여 3회 반복 정제하였다. 이렇게 얻어진 순수한 박테리오파아지는 SM 완충용액에 희석하고 다시 감수성인 균주 현탁액을 이용하여 3회 반복 정제하였다. 이렇게 얻어진 순수한 박테리오파아지는 SM 완충용액에 희석하여 보관하였고 사용시에 Spot test를 이용하여 각 파아지 용액의 역가를 측정하였다.

나) 증식법을 이용한 OXA-형 카바페넴아제 생성 아시네토박터 속의 균의 용균성 파아지 분리

LB broth를 이용하여 37 ˚C 배양기에서 하룻밤 동안 종균한 균액에 오수 PEG 처리법으로 획득한 박테리오파아지 부유액을 1차 처리하였다. 이후에 얻어진 상층액을 다시 PEG 처리하여 2차 박테리오파아지 부유액을 획득하였고, 이어서 spot test를 통해 OXA-형 카바페넴아제 생성 아시네토박터 속의 균에 대한 용균성 파아지를 선별하였다 (표 2). 얻어진 용균성 박테리오파아지를 Kropinski 등의 double agar overlay plaque assay를 통하여 3회 분리 정제하여 순 배양된 박테리오파아지를 확보하였다.

Pulsotype 및 OXA-생성 Acinetobacter baumannii strains	PEG 처리 후 증폭시킨 박테리오 파아지를 이용한 Spot test 결과
#1 (832, YMC/8/11/B6183)	Plaque 관찰, 약한 활성
#2 (748, YMC/8/10/B7070)	Plaque 없음.
#3 (210, YMC/8/4/B974)	Plaque 없음.
#4 (427, YMC/9/2/B317)	Plaque 관찰.
#5 (862, YMC/9/3/B162)	Plaque 없음.
#6 (456, YMC/9/2/B1251)	Plaque 관찰.
#7 (1004, YMC/9/3/B1744)	Plaque 관찰.
#8 (4286, YMC/9/8/B3635)	Plaque 없음.
#9 (1501, YMC/9/4/B73)	Plaque 관찰.
#10 (6001, YMC/9/11/B2460)	Plaque 없음.
#11 (3075, YMC/9/6/B5007)	Plaque 관찰.
#12 (546, YMC/8/8/B1075)	Plaque 없음.
#13 (3094, YMC/8/7/B3094)	Plaque 관찰.

(3) OXA-형 카바페넴아제-생성 아시네토박터 속의 균의 용균성 파아지에 대한 용균능 측정

각 pulsotype 13개의 index strain 13가지 균주에 대한 용균성 박테리오파아지의 용균력 범위를 측정한 결과, 서로 상이한 용균범위를 가지고 있었다. pulsotype 6번의 균주 ABA 456과 pulsotype 13번 균주 ABA 3094에서 분리된 Φ 456과 Φ 3094는 강력한 플라크 생성을 보여주었다. 특히, 박테리오파아지 Φ456은 pulsotype 4번, 6번, 7번에 모두 강력한 플라크 생성을 보이고 있으므로 넓은 범위의 용균성 박테리오파아지인 것을 확인하였다 (표 3).

OXA-형 카바페넴아제-생성 아시네토박터 속의 균	용균성 박테리오파아지를 이용한 Spot test결과						(-) 물을 이용한 대 조군
OXA-형 카바페넴아제-생성 아시네토박터 속의 균	Φ51 (LB)	Φ427 (LB)	Φ456 (LB)	Φ1004 (LB)	Φ3075 (LB)	Φ3094 (LB)	(-) 물을 이용한 대 조군
#1(832, YMC/8/11/B6183)	-	trace	-	-	-	-	-
#4(427, YMC/9/2/B317)	-	+1	+3	+1	-	-	-
#6(456, YMC/9/2/B1251)	-	-	+3	+1	-	-	-
#7(1004,YMC/9/3/B1744)	-	-	+3	-	-	-	-
#9(1501,YMC/9/4/B73)	-	trace	-	-	-	-	-
#11(3075,YMC/9/6/B5007)	-	trace	trace	-	-	-	-
#13(3094,YMC/8/7/B3094)	-	-	-	-	-	+3	-

실시예 3. OXA -형 카바페넴아제 -생성 아시네토박터에 대한 용균성 파아지의 전자 현미경 분석

분리된 박테리오파아지는 에너지 여과 투과 전자현미경을 이용하여 형태를 분석했다. 형태적으로 짧은 꼬리와 육각형 머리(head)를 가지는 단축 50nm, 장축 100nm 정도의 파아지이며 분류상 Podoviridae에 속하는 것으로 분류했다.

실시예 4. YMC /B1251 ABA BP 의 전 유전체 서열 분석

전 유전체 서열분석을 통해 YMC/B1251 ABA BP의 전 유전체 (45364bp. 62 ORF, G+C contents 39.05%)를 분석했다 (도 3, 표 4). 용균성에 관련된 후보 단백질 (Endolysin, gp51: [Erwinia phage vB EamP-S6]/ 서열 동일성 51%)은 계통수를 통해 다른 파아지의 용균성 관련 단백질과 매우 상이한 차이가 있는 것으로 나타냈다 (도 4, 도 5).

본 발명에 따른 물질을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 멸균 주사용액, 사전 충전식 주사 용액제의 형태 또는 동결건조된 형태로 제형화할 수 있다. 상세하게는, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물은 1일 0.2 내지 200㎎/㎏으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수 회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 폴리펩타이드를 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합체, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.

하기에 본 발명의 조성물을 위한 제제예를 예시한다. 단, 하기 제제예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 제제예에 의해 한정되는 것은 아니다.

제제예 1: 산제의 제조

데옥시시코닌 300 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들 및 본원 발명의 조성물을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2: 정제의 제조

데옥시시코닌 50 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들 및 본원 발명의 조성물을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3: 캡슐제의 제조

데옥시시코닌 50 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분 및 본원 발명의 조성물을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4: 주사제의 제조

데옥시시코닌 50 mg

주사용 멸균 증류수 적량

pH 조절제 적량

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 (2㎖) 상기의 성분 함량 및 본원 발명의 조성물을 혼합하여 제조한다.

제제예 5: 액제의 제조

데옥시시코닌 100 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분 및 본원 발명의 조성물을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6: 건강 식품의 제조

데옥시시코닌 1000 ㎎

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 B1 0.13 ㎎

비타민 B2 0.15 ㎎

비타민 B6 0.5 ㎎

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 ㎎

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄산마그네슘 25.3 ㎎

제1인산칼륨 15 ㎎

제2인산칼슘 55 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

염화마그네슘 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분 및 본원 발명의 조성물을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7: 건강 음료의 제조

데옥시시코닌 1000 ㎎

구연산 1000 ㎎

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수를 가하여 전체 900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분 및 본원 발명의 조성물을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2l용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

한국미생물보존센터(국내)

KFCC11524P

20120308

서열목록 전자파일 첨부

Claims

카바페넴 내성 아시네토박터 바우마니에 대한 서열번호 1의 용균 효소를 암호화하는 핵산을 함유하는 용균성 박테리오파아지.
제 1항에 있어서,
상기 박테리오파아지는 기탁번호 KFCC11524P인 것을 특징으로 하는, 용균성 박테리오파아지.
제 1항에 있어서,
상기 박테리오파아지는 서열번호 2인 것을 특징으로 하는, 용균성 박테리오파아지.
삭제
삭제
제 1항에 있어서,
　상기 카바페넴 내성 아시네토박터 바우마니가 생산하는 효소는 카바페넴아제인 것을 특징으로 하는, 용균성 박테리오파아지.
제 1항에 있어서,
상기 카바페넴 내성 아시네토박터 바우마니가 생산하는 카바페넴아제는 OXA형인 것을 특징으로 하는, 용균성 박테리오파아지.
삭제
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카바페넴 내성 아시네토박터 바우마니에 대한 서열번호 1의 용균 효소를 함유하는 용균성 박테리오파아지를 유효성분으로 포함하는 카바페넴 내성 아시네토박터 바우마니에 의해 유발되는 질환의 치료용 약학 조성물에서,
상기 질환은 C형 간염, 수족구병, 임질, 클라미디아, 연성하감, 성기단순포진, 첨규콘딜롬, 반코마이신내성황색포도알균감염증, 반코마이신내성장알균감염증, 메티실린내성황색포알균감염증, 다제내성녹농균감염증, 다제내성아시네토박터바우마니균감염증, 카바페넴내성장내속균종감염증, 장관감염증, 급성호홉기감염증, 엔테로바이러스감염증 중에서 선택하는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 카바페넴 내성 아시네토박터 바우마니에 의해 유발되는 질환의 치료용 약학 조성물.
제 12항에 있어서,
　상기 용균성 박테리오파아지는 기탁번호 KFCC11524P인 것을 특징으로 하는,　카바페넴 내성 아시네토박터 바우마니에 의해 유발되는 질환의 치료용 약학 조성물.
제 12항에 있어서,
상기 용균성 박테리오파아지는 서열번호 2인 것을 특징으로 하는,　카바페넴 내성 아시네토박터 바우마니에 의해 유발되는 질환의 치료용 약학 조성물.
삭제
삭제
제 12항에 있어서,
상기 카바페넴 내성 아시네토박터 바우마니가 생산하는 효소는 카바페넴아제인 것을 특징으로 하는, 카바페넴 내성 아시네토박터 바우마니에 의해 유발되는 질환의 치료용 약학 조성물.
제 17항에 있어서,
상기 카바페넴아제는 OXA-형인 것을 특징으로 하는, 카바페넴 내성 아시네토박터 바우마니에 의해 유발되는 질환의 치료용 약학 조성물.
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카바페넴 내성 아시네토박터 바우마니에 대한 서열번호 1의 용균 효소를 함유하는 용균성 박테리오파아지 또는 서열번호 1의 용균 효소를 유효성분으로 포함하는 카바페넴 내성 아시네토박터 바우마니에 의해 유발되는 질환의 개선용 식품 조성물에서,
상기 질환은 C형 간염, 수족구병, 임질, 클라미디아, 연성하감, 성기단순포진, 첨규콘딜롬, 반코마이신내성황색포도알균감염증, 반코마이신내성장알균감염증, 메티실린내성황색포알균감염증, 다제내성녹농균감염증, 다제내성아시네토박터바우마니균감염증, 카바페넴내성장내속균종감염증, 장관감염증, 급성호홉기감염증, 엔테로바이러스감염증 중에서 선택하는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 카바페넴 내성 아시네토박터 바우마니에 의해 유발되는 질환의 개선용 식품 조성물.
제 23항에 있어서,
상기 용균성 박테리오파아지는 기탁번호 KFCC11524P인 것을 특징으로 하는,　카바페넴 내성 아시네토박터 바우마니에 의해 유발되는 질환의 개선용 식품 조성물.
제 23항에 있어서,
상기 용균성 박테리오파아지는 서열번호 2인 것을 특징으로 하는, 카바페넴 내성 아시네토박터 바우마니에 의해 유발되는 질환의 개선용 식품 조성물.
삭제
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제 23항에 있어서,
상기 카바페넴 내성 아시네토박터 바우마니가 생산하는 효소는 카바페넴아제인 것을 특징으로 하는, 카바페넴 내성 아시네토박터 바우마니에 의해 유발되는 질환의 개선용 식품 조성물.
제 28항에 있어서,
상기 카바페넴아제는 OXA-형인 것을 특징으로 하는, 카바페넴 내성 아시네토박터 바우마니에 의해 유발되는 질환의 개선용 식품 조성물.