KR101363299B1

KR101363299B1 - 염기성 아미노산 ｃ-말단을 갖는 폴리펩티드를 특이적인엔도프로테아제를 사용하여 아미드화시키는 방법

Info

Publication number: KR101363299B1
Application number: KR1020087007470A
Authority: KR
Inventors: 제바슈티안 리쏨; 파울 하버만; 크리스토프 살락나드; 프랑크 조허; 로르 랜드릭-부르탱
Original assignee: 사노피-아벤티스 도이칠란트 게엠베하
Priority date: 2005-09-27
Filing date: 2006-09-13
Publication date: 2014-02-21
Also published as: EP1931705A2; MY148447A; JP2009509515A; CN101268097A; WO2007036299A3; CA2623547A1; AU2006296818B2; KR20080061367A; CA2623547C; IL190229A0; ES2373237T3; US20100311112A1; US8765910B2; IL190229A; DK1931705T3; EP1931705B1; BRPI0616712B1; ATE523522T1; WO2007036299A2; BRPI0616712A2

Abstract

본 발명은 트립신의 생물학적 활성을 갖는 효소의 존재 하에서 2개의 펩티드를 반응시키는 단계 및, 필요한 경우, 수득가능한 화학식 I의 화합물을 단백질 화학적 정제로 처리하는 단계로 이루어지는, C-말단 아미드화된 2염기성 또는 다염기성 펩티드를 제조하는 방법에 관한 것이다.

C-말단 아미드화, GLP-1, 트립신, 엔테로키나제

Description

염기성 아미노산 Ｃ-말단을 갖는 폴리펩티드를 특이적인 엔도프로테아제를 사용하여 아미드화시키는 방법{Method for amidating polypeptides with basic aminoacid C-terminals by means of specific endoproteases}

본 발명은, 특히 GLP-1 또는 이의 유사체 또는 유도체의 생물학적 활성을 갖는, C-말단 아미드화된 2-염기성 또는 다염기성 펩티드를 제조하는 방법에 관한 것이다.

약제학적으로 관련된 펩티드 및 단백질의 안정성, 생체의학적(biomedical) 유용성 및 작용의 지속기간은 분자의 N- 또는 C-말단에 따라 크게 달라진다. 생체분자(biomolecule)의 반감기는 염기성 아미노산을 갖는 C-말단 연장에 의해 현저하게 영향을 받는다. 특히 우수한 약제학적 활성은, 하나 이상의 염기성 아미노산을 갖는 C-말단 연장에서 C-말단에 있는 아미노산이 아미노 아미드인 경우 달성될 수 있다.

이러한 펩티드계 활성 물질은, 펩티드가 충분히 작은 경우에는, 변형된 메리필드(Merrifield) 합성 프로토콜에 따라 완전한 화학적 합성으로 직접 제조할 수 있다. 하지만, 이러한 펩티드가 대량으로 필요한 경우에는 한계가 있다. 따라서, 합성에 사용될 아미노산을 먼저, 펩티드 합성에서 화학적 변형 후에 후속적으로 반응물로서 적당하도록 제조하고 정제해야 한다. 합성 종료시 보호 그룹의 제거 후, 이어서 표적 펩티드 또는 산물을 약제로서 정제하고 제형화할 수 있다. 또한, 펩티드의 조성에 따라, 근접효과(neighborhood effect)로 인하여 합성 동안에 개개의 결합 단계에서 잘못된 결합을 통한 제한된 수율, 라세미화 또는 부산물 형성이 일어나서, 산물의 전체 수율 또는 순도에 역효과를 줄 수 있다. 전합성은 필요한 산물을 대량으로 제조하기에는 매우 복잡하다. 그러므로 대안적인, 특히 생명공학적 방법을 통한 제조가 바람직할 것이다.

펩티드를 C-말단 아미드화시킬 수 있는 효소는 오랫동안 공지되어 왔다. 이러한 효소를 펩티딜글리신 알파-아미드화 효소(PAM)라고 한다[참조: Eipper et al. Mol. Endocrinol. 1987 Nov; 1(11):777]. 이러한 PAM 효소의 제조 및 정제는 당업자에게 통상적이며 문헌[참조: M. Nogudi et al. Prot. Expr. Purif. 2003, 28:293]에 상세히 기술되었다. 하지만, 상기 효소의 제조는, 예를 들면, 트립신 또는 카복시펩티다제와 같은 다른 산업적 효소의 제조와 관련하여 비용이 많이 든다.

효소를 아미드화될 전구체 단백질과 함께 동일한 숙주 세포에서 공동발현시킨다면, 이는 PAM을 사용한 "시험관내" 아미드화에 대한 대안이 된다. 이는 PAM 활성을 암호화하는 유전자 서열을 숙주-특이적 조절 서열의 조절 하에 숙주 세포 속에 도입시켜 달성된다. 상기 발현 서열을, 각각의 염색체 DNA 서열 속에 안정하게 혼입시키거나, 표적 단백질을 위한 발현 플라스미드와 유사한 제2의 플라스미드에 존재하게 하거나, 동일한 벡터 상에 제2의 발현 카세트(cassette)로서 통합시키거나, 동일한 프로모터 서열의 조절 하에 표적 단백질을 암호화하는 유전자 서열과 동일한 위상(phase)으로 폴리시스트로닉(polycistronic) 발현 접근법으로 클로닝할 수 있다. 하지만, 공개된 수율이 낮으므로, 대량의 제조는 상응하는 발효 용적을 통해서만 달성할 수 있다. 이는 보다 비용이 많이 드는 복잡한 정제를 필요로 하게 된다. 또한, 아미드화가 정량적으로 일어나지 않으므로, 비-아미드화된 필요한 단백질로부터 아미드화된 단백질을 분리해야 한다. 분비 제조 방법[참조: Hong et al., Appl Biochem Biotechnol. 2003;110, p.113-23]을 위한 결정은, 다염기성 C-말단을 갖는 단백질은 매우 적은 양으로만 분비되거나 전혀 분비되지 않는다는 사실을 고려해야 한다.

아미드화를 위한 추가적인 방법은 단백질-특이적 자가-절단 기전의 사용을 토대로 한다[참조: Cottingham et al. Nature Biotech. Vol. 19, 974-977, 2001]. 하지만, 이 반응과 티오에스테르 교환반응(transthioesterification)을 제어하는 것이 쉽지 않으므로, 불필요한 산물이 생성될 수 있다. 융합 단백질이 상대적으로 많이 관여하여 수율에 역효과를 줄 수 있다.

상기한 아미드화 방법은, 하나 이상의 아미노산 글리신 또는 대안으로 인테인(intein) 펩티드에 의해 연장된 표적 펩티드의 C-말단에서부터 시작한다. 하지만, C-말단 리신을 갖는 펩티드는, 서열에서 그 다음에 추가적인 리신 또는 아르기닌을 포함하지 않는 경우, 다량체 구조로 제조할 수 있고, 이를 후속적으로 트립신 또는 트립신-유사 효소로 분해하여 단량체 단위로 전환시킬 수 있다. 이러한 방식으로 고 수율을 달성할 수 있다. 이는 상기한 방법의 경우에는 불가능하다.

따라서, 공지된 생명공학적 제조 방법에는 단점이 있으며, C-말단에 하나 이상의 염기성 아미노산 리신 또는 아르기닌을 갖고 있으면서 말단 아미드화된 펩티드 또는 단백질을 적당한 비용으로 대량으로 제조하려는 목표는 아직 만족할만하게 해결되었다고 볼 수 없다.

하나 이상의 염기성 아미노산이 절두된(truncated) 표적 펩티드의 전구체를 대량으로 제조하고 나서 이 전구체를 리신아미드 또는 아르기닌아미드를 사용한 효소-촉매된 반합성으로 연장시키는 것이 가능하다면, 이는 대안적인 제조 방법이 될 것이다.

문헌[참조: Levin et al. Biochemical Journal 63:308-16; 1956]에는 리신아미드 및 다양한 폴리리신아미드 펩티드에 대한 트립신의 효과가 기술되어 있다. 상기 문헌의 저자들의 결과는, 중간체 아미드가 결합 반응과 비교하여 유리 산으로 빠르게 가수분해되기 때문에, 리신아미드 유도체를 트립신의 영향 하에서 고분자량 리신아미드 유도체로 전환시킬 수 없다는 것을 제시한다. 이로부터, C-연결된 폴리리신아미드 또는 폴리아르기닌아미드 또는 폴리-Lys/Arg 혼합된 서열을 갖는 펩티드의 제법을 제공하는 트립신-촉매된 반합성 방법은 성공적이지 않거나 낮은 수율로만 성공적이라고 결론지을 수밖에 없다.

아미드화된 염기성 아미노산, 이의 유사체 또는 유도체를, C-말단 염기성 아미노산을 갖는 펩티드에, 놀랍게도 높은 수율(즉, > 30%)로 트립신-촉매된 연결을 가능하게 하는 펩티드 화학적 방법이 현재 밝혀졌다.

본 발명의 방법의 경우, 놀랍게도, 예를 들면 -Boc (t-부틸옥시카보닐), -Z (벤질옥시카보닐) 또는 -DDZ (디메틸페닐프로필옥시카보닐)와 같은 보호 그룹[참조: Pitraschke et al., Tetrahedron: Asymmetry 9, p 1505-1518, 1998]을 아미드화된 염기성 아미노산(리신아미드, 아르기닌아미드)에 도입시키는 것이 연결 반응의 효율성 및 선택성의 향상으로 이어지지 않는다는 것을 추가적으로 관찰할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 방법은, 보호 그룹으로 차폐시키는 과정을 생략하여, 보호 그룹의 제거 및 독성 시약의 처분을 통한 수율의 감소를 방지할 수 있다는 장점을 갖는다. 이는 화학적 전합성과 비교하여 막대한 비용상의 이득을 주는 방법을 제공한다.

따라서, 본 발명의 한가지 양상은 화학식 II의 화합물을 트립신의 생물학적 활성을 갖는 효소의 존재 하에서 화학식 III의 화합물과 반응시키고, 경우에 따라, 생성된 화학식 I의 화합물을 단백질 화학적 정제로 처리하여, 화학식 I의 C-말단 아미드화된 2-염기성 또는 다염기성 펩티드를 제조하는 방법이다:

(AA)_n-X_m-NH₂

(AA)_n-X_p

(X)_q-NH₂

상기 화학식 I, II 및 III에서,

(AA)_n은 동일하거나 상이한 종류의 n개의 아미노산으로 이루어진 펩티드이 고;

AA는 아미노산 또는 이의 유사체 또는 유도체이고;

n은 3 내지 2000의 정수이고;

X는 염기성 아미노산 또는 이의 유사체 또는 유도체이고;

m은 2 내지 15의 정수이고;

p 및 q는 정수이고;

p + q = m이고;

특히, m은 2 내지 10의 정수이거나, m은 2 내지 6의 정수이다.

본 발명의 추가적인 양상은, n이 10 내지 1000, 또는 15 내지 500, 또는 20 내지 400의 정수인 상기 방법이다.

본 발명의 추가적인 양상은,

a) 융합 펩티드의 일부분으로서 화학식 II의 화합물 하나 이상을 포함하는 융합 펩티드를 발현시키고;

b) 상기 화학식 II의 화합물을 상기 융합 펩티드로부터 화학적 또는 효소적 절단에 의해 제거시키고;

c) b) 단계로부터의 중간체를, 경우에 따라 단백질 화학적 정제 후, 트립신의 생물학적 활성을 갖는 효소의 존재 하에서 화학식 III의 화합물과 반응시키고;

d) 경우에 따라, 생성된 화학식 I의 화합물을 단백질 화학적 정제로 처리하여 분리하며;

이때, 특히 시아노겐 할라이드, 엔테로키나제, 인자 Xa, 제네나 제(Genenase), 트롬빈 또는 트립신을 사용하여 융합 단백질로부터 화학식 II의 화합물을 제거시키고; 보다 바람직하게는, 융합 단백질을 이.콜라이(E. coli), 에스.카르노서스(S. carnosus), 살모넬라(Salmonella), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 케이.락티스(K. lactis), 피.파스토리스(P. pastoris), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) 및 에스.세레비지애(S. cerevisiae)를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 발현 시스템에서 발현시키는 상기 방법이다.

본 발명의 추가적인 양상은, 상기 화학식 I의 펩티드가 GLP-1 또는 이의 유도체 또는 유사체의 생물학적 활성을 갖는 상기 방법이다.

본 발명의 추가적인 양상은, 화학식 I의 화합물이 화학식 IV를 특징으로 하는 상기 방법이고, 이는 특히 서열번호 1, 2, 3, 4 또는 5의 서열을 특징으로 할 수 있다:

본 발명은 또한 서열번호 2, 3, 4 또는 5의 서열을 특징으로 하는 화학식 I의 화합물, 이의 용도, 특히 데포(depot) 제형의 용도에 관한 것이다:

본 발명의 추가적인 양상은, 서열번호 2, 3, 4 또는 5의 서열을 특징으로 하는 화학식 I의 화합물 하나 이상을 포함하는 약제이다:

본 발명의 목적상 용어의 의미는 다음과 같다:

아미노산의 "유사체"라는 용어는 유전적 암호로 암호화되어 있지 않지만 펩티드 쇄 속에 혼입되는데 적당한 천연 아미노산을 의미한다. 아미노산의 유사체의 예로는 오르니틴 및 시트룰린이 있고, 또한 예를 들면, 2,4-디아미노부탄산; 3-메틸오르니틴; 4-메틸오르니틴; 5-아미노류신; 4-아미노류신; 3-아미노류신; 5-아미노노르류신; 4-아미노노르류신; 3-아미노노르류신; 4-아미노노르발린; 3-아미노노르발린; 6-메틸리신; 5-메틸리신; 4-메틸리신; 3-메틸리신과 같이 측쇄에 임의의 염기성 관능 그룹을 갖는 모든 추가적인 비-천연 아미노산이 있다.

아미노산의 "유도체"라는 용어는 하나 이상의 화학 그룹으로 치환된 아미노산 또는 아미노산의 유사체를 의미한다. 이러한 화학 그룹의 예로는 -Boc (t-부틸옥시카보닐), -Z (벤질옥시카보닐), -DDZ (디메틸페닐프로필옥시카보닐), -Fmoc (N-알파-(9-플루오레닐메틸옥시카보닐)), -2-브로모-Z, -2-클로로-Z, -Tfa (트리플루오로아세틸), -니코티노일, -4-니트로-Z, -2-피콜리노일, -Tos (4-톨루엔설포닐), -For (포밀), -비오티닐, -단실, -Dnp (디니트로페닐), -Mca (모노클로르아세틸), -Mtt (N-메틸트리틸), -Nde (N-1-(4-니트로-1,3-디옥소인단-2-일이덴)에틸), -아세트이미도일, -아세틸, -미리스토일, -팔미토일, N-리토콜릴-γ-글루타밀 또는 -ω-카복시헵타데카노일과 같은 펩티드 화학에서의 통상의 보호 그룹이 있다.

이러한 그룹으로는 또한 C(O)-(C₆-C₂₄)알킬 그룹, C(O)-(C₆-C₂₄)알케닐 그룹, C(O)-(C₆-C₂₄)알칸디에닐 그룹 또는 C(O)-(C₆-C₂₄)알칸트리에닐 그룹이 있고, 이때 알킬, 알케닐, 알칸디에닐 및 알칸트리에닐 그룹(존재하는 경우)은 분지쇄 또는 직쇄일 수 있다. (C₁-C₆)알킬은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 C 원자를 갖는 탄화수소 라디칼을 의미한다. (C₁-C₆)알킬 라디칼의 예로는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필 (1-메틸에틸), n-부틸, 이소부틸 (2-메틸프로필), 2급-부틸 (1-메틸프로필), 3급-부틸 (1,1-디메틸에틸), n-펜틸, 이소펜틸, 3급-펜틸, 네오펜틸, 헥실이 있다. 마찬가지로 (C₆-C₂₄) 알킬은 6 내지 24개의 C 원자를 갖는 탄화수소 라디칼을 의미한다. 알킬 라디칼은 직쇄 또는 분지쇄일 수 있다. 바람직한 (C₆-C₂₄) 알킬 라디칼로는 지방산 잔기, 예를 들면 헥실, 옥틸, 데칸일, 운데칸일, 도데칸일, 트리데칸일, 테트라데칸일 (미리스틸), 펜타데칸일, 헥사데칸일, 헵타데칸일, 옥타데칸일 (스테아릴), 노나데칸일, 아이코산일, 디코산일, 9,11-디메틸트리데칸일, 11-메틸 트리데칸일이 있다.

이러한 그룹으로는 또한 C(O)-페닐-(C₅-C₈)헤테로아릴-페닐 그룹, C(O)-바이페닐 또는 C(O)-테르페닐 그룹이 있고, 이때 페닐, 바이페닐, 테르페닐 또는 헤테로아릴 그룹은 비-치환되거나, (C₁-C₁₀)알킬 또는 O(C₁-C₁₀)알킬의 그룹으로부터 선택되는 하나 또는 2개의 그룹으로 치환된다. 일치환된 페닐 라디칼에서, 치환기는 2 위치, 3 위치 또는 4 위치에 존재할 수 있다. 이치환된 페닐은 2,3 위치, 2,4 위치, 2,5 위치, 2,6 위치, 3,4 위치 또는 3,5 위치에서 치환될 수 있다. 삼치환된 페닐 라디칼에서, 치환기는 2,3,4 위치, 2,3,5 위치, 2,4,5 위치, 2,4,6 위치, 2,3,6 위치 또는 3,4,5 위치에 존재할 수 있다. 헤테로아릴은, 예를 들면 푸라닐, 티에닐, 피롤릴, 이미다졸릴, 피라졸릴, 트리아졸릴, 테트라졸릴, 옥사졸릴, 이소옥사졸릴, 티아졸릴, 이소티아졸릴, 피리딜, 피라지닐, 피리미디닐, 피리다지닐, 인돌릴, 인다졸릴, 퀴놀릴, 이소퀴놀릴, 프탈라지닐, 퀴녹살리닐, 퀴나졸리닐 및 신놀리닐을 의미한다.

"염기성 아미노산"이라는 용어는 리신, 아르기닌, 또는 이의 유도체 또는 유사체, 예를 들면 오르니틴 또는 시트룰린, 바람직하게는 리신 또는 아르기닌, 특히 리신을 의미한다. 이와 관련하여, 리신 또는 아르기닌은, 카복스아미드 그룹 대신에, 하나 이상의 다른 반응 그룹, 특히 아미노 에스테르, 펩티드 에스테르, 무수물 및 할로겐화물의 그룹으로부터 선택되는 반응 그룹에 의해 유도체화될 수 있고, 마찬가지로 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다.

"트립신의 생물학적 활성을 갖는 효소"라는 용어는, 래트, 소, 돼지, 사람, 개, 마우스와 같은 통상적인 공급원으로부터 얻어지는 공지되어 있고 시판되는 트립신 외에도, 이의 동위효소(isoenzyme), 유도체 또는 변이체, 또한 관련성이 높은 생화학적 특성을 갖는 효소, 예를 들면 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum) 및 스트렙토마이세스(Streptomyces) [에스.그리세우스(S. griseus), 에스.엑스폴리아투스(S.　 exfoliatus), 에스.에리트라이우스(S. erythraeus), 에스.프라디애(S. fradiae) 및 에스.알비도플라부스(S. albidoflavus)] 기원의 트립신인 카텝신, 트립타제, 마스틴, 아크로신, 칼리크레인, 헵신, 프로스타신 I, 리실 엔도펩티다제 (Lys-C) 및 엔도프로테이나제-Arg-C (클로스트리파인)를 의미한다.

상기 목록은 한정적이지 않는다는 것과, 염기성 아미노산의 C-말단을 특이적으로 절단할 수 있는 추가적인 효소, 동위효소, 유도체 또는 변이체는 생명공학적 연구에서 계속적으로 발견되고 있다는 것은 당업자에게 명백하다. 대안으로, 효소의 특이성을, 펩티드 화학적 변형 또는 DNA 수준에서의 돌연변이 (뮤테인(mutein))에 의해 변화시킬 수 있다. 또한, 효소의 특이성 및 활성을, 적당한 반응 조건을 선택하여 현저하게 변형시킬 수 있다.

본 발명의 방법의 바람직한 양태에서, 이종성(heterologous) 펩티드를 생산하는 미생물의 능력이 사용된다. 이를 위하여, 목적하는 펩티드 서열을 상응하는 DNA 서열로 해독하여, 이를 숙주-특이적 프로모터 서열에 연결시킨다. 이 경우에, 발현 방법에 따라, 표적 펩티드를 발현시켜 세포에 의해 직접적으로 형성되게 하거나, 세포 내에 남아 존재하는 융합 펩티드로서 간접적으로 형성되게 할 수 있다.

적당한 융합 펩티드를 사용하는 융합 방법을 선택하는 경우, 융합 파트너들을 링커(linker)로 연결하여, 프로세싱 후 목적하는 표적 펩티드의 N 말단이 수득되는 방식으로 파트너들의 특이적인 분리가 일어나게 해야 한다는 것은 당업자에게 명백하다. 본 발명의 목적상, 표적 펩티드는 화학식 II의 화합물이다. 적당한 링커의 설계에 사용가능한 수많은 가능성이 당업자에게 공지되어 있으며 계속적으로 확장되고 있다. 예를 들어, 아미노산 메티오닌을 선택하는 경우, 시아노겐 할라이드를 사용한 화학적 절단이 가능하다. 예를 들어, 서열 DDDDK의 펜타펩티드를 링커로서 선택하는 경우, 엔테로키나제를 사용한 절단이 가능하다. 예를 들어, 테트라펩티드 서열 IEGR을 선택하는 경우, 인자 Xa로 절단시킬 수 있다. 적당한 설계의 경우, N 말단이 히스티딘으로 시작하는 펩티드에 대해 제네나제(Genenase)^®를 프로세싱 효소로서 사용할 수 있다. N 말단이 디펩티드 Gly-Ser을 특징으로 하는 경우, 테트라펩티드 LVPR을 링커로서 선택하여 트롬빈에 대한 인식 및 절단 부위를 생성할 수 있다. 펩티드 연결을 위하여 본 발명에 따라 트립신의 생물학적 활성을 갖는 효소를 사용하더라도, 본 발명의 방법에서는 현 시점에서 원칙적으로 이러한 효소를 사용할 수 있다. 따라서, 리신 또는 아르기닌을 융합 부분과 표적 펩티드 사이에 링커로서 삽입시키는 한, 수성 매질에서 처음에 트립신을 사용하여 융합 펩티드의 융합 부분을 제거시킬 수 있다.

하지만, 대안으로 표적 펩티드가 배출(export)-적합성인 경우, 융합 펩티드의 형태로 또는 천연 형태로 세포 배양 배지 속에 분비시키는 것도 가능하다. 이 를 위하여, 재조합 숙주 세포를 사용하는 것도 가능하며, 이는 특히 미생물, 바람직하게는 세균 또는 효모의 세포이다. 세균 세포를 발현 시스템으로서 선택하는 경우, 표적 펩티드 또는 표적 펩티드 (즉, 본 발명의 목적상 화학식 II의 화합물)를 포함하는 상응하는 융합 펩티드를 직접 주변세포질(periplasm) 속으로 분비시키거나 배양 배지 속으로 분비시키는 것을 추가적으로 선택할 수 있다. 이와 관련하여, C-말단이 하나 이상의 염기성 아미노산으로 이루어진 경우, 배출이 종종 제한된다는 것이 당업자에게 명백하다.

본 목적상 원칙적으로 사용가능한 숙주 유기체 및 방법은 당업자에게 공지되어 있다[참조: Gellissen, Gerd (ed.) Production of Recombinant Proteins, ISBN　3-527-31036-3]. 또한 이들은 대부분 많은 공급업자로부터 시판된다. 언급될 수 있는 대표적인 공급업자로는 New England Biolabs, Invitrogen 및 Roche 회사가 있다. 이러한 회사의 카탈로그 설명에는 기술의 개관을 제공하는 문헌이 참조되어 있다. 이와 관련하여, 사용되는 미생물의 범위는 생명공학적 방법의 레퍼토리(repertoire)가 확장됨에 따라 계속적으로 확장되고 있다는 것이 또한 당업자에게 명백하다. 이와 관련하여 보다 구체적인 양태도 본 발명의 내용에 포함된다. 대표적으로 언급되는 숙주/벡터 시스템의 예는 다음과 같다: 세균 종류, 예를 들면 이.콜라이, 에스.카르노서스, 살모넬라, 바실러스 서브틸리스 또는 슈도모나스, 특히 슈도모나스 플루오레센스; 및 효모 종류, 예를 들면 케이.락티스, 피.파스토리스, 스키조사카로마이세스 폼베 및 에스.세레비지애.

하지만, 당업자는 예로서 언급된 이러한 시스템이, 예를 들면 적당한 프로모터 또는 다른 조절 핵산 서열의 선택, 사용되는 숙주 세포 및 벡터의 유전적 특성 (예: DNA 카피 수, 선별 수단의 선택 등과 관련된 특성)으로부터 많은 가능한 변화를 제공한다는 것을 인식하고 있다.

표적 펩티드를 분리된 형태로 수득하려는 경우에는, 물리화학적 특성으로 인해 각각의 표적 펩티드에 대해 특정한 정제 방법을 적용시켜야 한다는 것은 마찬가지로 당업자가 인식한다. 원칙적으로 이는 공지된 생화학 및 생물물리학적 분리 방법의 적당한 조합을 통해 달성된다. 마찬가지로 이와 관련해서, 신규 물질 (예: 크로마토그래피용)을 토대로 하여 목적하는 성공적인 정제를 달성하거나 최적화시킬 수 있는 새로운 가능성이 계속적으로 제시되고 있다는 것은 명백하다.

본 발명의 목적상, 전구체 펩티드를, 예를 들면 친화도 크로마토그래피에 의한 정제를 가능하게 하는 펩티드 서열과 융합시키는 것이 유리할 것이다.

본 발명을 보다 발전시키기 위하여, 미국특허공보 제US 2004/0106547호에 공개된 엑센딘(exendin) 유도체를 예로서 제조하였다. 엑센딘으로부터 유도된 이러한 펩티드는 혈당 강하 효과로 인해, 당뇨병 또는, 예를 들면 비만을 유도하는 기타 대사 장애의 치료를 위한 약제 개발에서 중요한 역할을 할 수 있다. 그러므로 약제학적 목적상, 적당한 형태의 사용가능한 이러한 펩티드를 수득하는 것은 유용하다.

국제공개공보 제WO 02/066628호에는 C-말단에 아미노산 Lys-Arg을 갖는 히루딘 유도체가 기술되어 있다. 항혈전 효과 프로파일을, C-말단 아르기닌을 아미드화시켜 변형시킬 수 있다. 이를 위하여, C-말단 리신을 갖는 전구체를 제조하고 나서, 아르기닌아미드와의 결합 반응을 본 발명에 따라 수행하여, 아미드화된 히루딘 유도체를 수득한다. 전구체는 본 특허원에 기술된 바와 같이 효모 분비를 통해 제조할 수 있다. 이를 위하여, 예를 들면, 유럽 특허원 제EP-A 0 324 712호에 기술된 Leu-히루딘에 대한 유전자 서열을 리신에 대한 코돈에 의해 연장시키고, 상기 특허에 예로서 기술된 방법을 이어서 수행하여 리신으로 연장된 히루딘을 제조한다. 대안으로, 세균에 의한 전구체의 분비 경로를 따르는 것도 가능하다. 이를 위하여, 예를 들면, 유럽 특허원 제EP-A 1 216 259호에 기술된 기술을 사용할 수 있다.

다음의 실시예는 본 발명을 설명하는 역할을 하며, 본 발명의 내용과 관련하여 결코 한정하는 의미가 아니다.

실시예 1: AVE(1-43)을 암호화하는 이.콜라이-특이적 DNA 서열의 합성

우선, 펩티드 AVE(1-43)(서열번호 7)을 암호화하는 유전자 서열(서열번호 6)을 제조하였다:

서열번호 6:

서열번호 7:

유전자 서열을 PCR 기술로 합성하였다. 이를 위하여, 다음의 5개의 프라이머를 화학적 DNA 합성으로 제조하였다. 이 합성은 Expedite™ DNA 합성 시스템[판매원: Applied Biosystems]을 사용하여 실시하였다.

a) 프라이머 zp5u는 서열번호 8의 서열을 갖는다:

서열번호 8은 센스(sense) 쇄 ("센스")의 1번 내지 23번 영역을 포함한다. CAC 트리플렛(triplet)은 표적 펩티드의 첫번째 아미노산으로서의 히스티딘을 암호화한다.

b) 프라이머 zp3a는 서열번호 9의 서열을 갖는다:

서열번호 9는 상보적인 쇄 ("안티센스(antisense)")의 1번 내지 59번 영역을 포함한다.

c) 프라이머 zp3b는 서열번호 10의 서열을 갖는다:

서열번호 10은 상보적인 쇄("안티센스")의 40번 내지 108번 영역을 포함한다.

d) 프라이머 zp3c는 서열번호 11의 서열을 갖는다:

서열번호 11은 상보적인 쇄("안티센스")의 91번 내지 159번 영역을 포함한다.

안티센스 트리플렛 CTT는 표적 펩티드의 마지막 아미노산(AA₄₃)을 암호화한다.

e) 프라이머 zp3d는 서열번호 12의 서열을 갖는다:

서열번호 12는 상보적인 쇄("안티센스")의 나머지 영역을 포함한다.

프라이머를 사용하여, 후속적으로 4 종류의 PCR 반응을 표준 조건 하에서 54℃에서 수행하였다. 반응 1에서는, 100ng의 각각의 프라이머 zp3a 및 zp5u를 사용하였다. PCR에서 사이클의 횟수는 5회였다. 두번째 반응에서는, 반응물의 1/40을 100ng의 각각의 프라이머 zp5u 및 zp3b와 10회 사이클로 반응시켰다. 반응 3에서는, 반응 2의 산물의 1/40을 100ng의 각각의 프라이머 zp5u 및 zp3c와 추가로 10회 사이클로 반응시켰다. 최종적으로, 목적하는 DNA 단편을, 25회 PCR 사이클에서 반응 3으로부터의 산물의 1/40 및 프라이머 zp5u 및 zp3d를 사용하여 합성하고, 단편의 길이를 겔 전기영동으로 확인하였다. 목적하는 DNA 단편을 정제하여, 제조업자(New England Biolabs)의 지침에 따라 제한 효소 EcoR1과 반응시키고 나서 Hind3 과 반응시켰다.

동시에, 플라스미드 pUC19 [판매원: New England Biolabs]의 DNA를 효소 EcoR1 및 Hind3과 반응시켰다. 절단 단편의 혼합물을 1.2% 아가로스 겔 상에서 분리하고 나서, pUC19로부터의 나머지 벡터 단편 및 반응 4로부터의 목적하는 산물을 분리하였다. 정제된 단편을 16℃에서 하룻밤 동안 T4 리가제 반응으로 연결시켰다. 이어서, 컴피턴트(competent) 이.콜라이 세포[판매원: Stratagene](이.콜라이 XL10 Gold 균주)를 연결 혼합물로 형질전환시키고, 25 mg/l 앰피실린을 포함하는 한천 플레이트 상에 평판배양하였다. 플라스미드 DNA를 개개의 클론으로부터 분리하여, DNA 서열 분석으로 특성규명하였다.

목적하는 단편의 플라스미드 DNA를 pSCHPUCZP1-43이라고 명명하였고, 이는 이.콜라이 K12 세포에서 화학식 I의 화합물을 합성하기 위한 발현 벡터를 제조하기 위한 출발 물질로서 역할을 하였다.

실시예 2: AVE(1-43)에 대한 발현 벡터의 작제

내용이 명백히 본원에 참조로서 인용되는 미국특허 제5,496,924호에는, 테일러된(tailored) 융합 단백질의 제조를 원칙적으로 가능하게 하는 발현 시스템이 제안되어 있다. 상기 시스템의 장점은 작은 밸러스트(ballast) 부분을 갖는 융합 단백질을 제조할 수 있다는 것이다. 상기 발현 시스템은 본 특허원에서 예로서 사용된다. 서열 단편 A-B를 엔테로키나제 인식 서열 DDDDK를 통해 AVE(1-43)과 융합시키면, 다음의 유전자 서열 및 아미노산 서열 (서열번호 13 및 14)을 갖는 융합 단 백질이 생성된다:

서열번호 13:

ATG 및 AAG 코돈은 융합 펩티드의 첫번째 및 마지막 아미노산을 암호화한다.

서열번호 14:

암호화된 유전자 서열을 PCR 기술로 제조하였다. 이를 위하여, 다음의 프라이머를 합성하였다:

1) 프라이머 psw3_zpcolf (서열번호 15):

이 경우에, 상기 프라이머의 서열은 엔테로키나제 인식 부위 및 AVE₁ _-43-암호화 서열의 시작 부분을 담당한다.

2) 프라이머 psw3_zpcolrev (서열번호 16):

이 경우에, 상기 서열은 미국특허 제5,496,924호의 표 1에 제시된 인터루킨-2로부터 유래된 합성 서열에 상응하며, 아미노산 34번 내지 38번 및 아미노산 메티 오닌에 대한 코돈의 2/3을 담당한다. 프라이머 서열의 나머지는 프라이머 psw3_zpcolf와 중첩된다.

3) pBprimef1 (서열번호 17):

상기 프라이머는 플라스미드 pK50에 존재하는 EcoRI 절단 부위와 상류에 하이브리드화한다 (미국특허 제5,496,924호의 도 33 참조).

4) Hind3 절단 부위를 갖는 psw3_ave_1-43_rev (서열번호 18):

두 PCR을 동시에 수행하였다. 하나의 반응은 플라스미드 pK50의 DNA에 대하여 프라이머 쌍 pBprimef1 및 psw3_zpcolrev를 사용하여 50℃에서 수행하였고, 다른 반응은 프라이머 쌍 psw3_zpcolf 및 psw3_ave_1-43_rev를 사용하여 54℃에서 플라스미드 pSCHPUCZP1-43의 DNA에 대해 수행하였다. PCR 산물을 겔 전기영동으로 분획화한 후 정제하여, 각각의 분취액을 1:1 비로 혼합하고 나서, 세번째 PCR에서 프라이머 쌍 pBprimef1 및 psw3_ave_1-43_rev와 반응시켰다. PCR 산물을 EcoR1 및 Hind3 효소와 반응시키고, 동시에 상기 효소에 의해 개방된 플라스미드 pK50 속으로 삽입하는 T4 리가제 반응에서 사용하였다. 컴피턴트 이.콜라이 BL21 세포를 상기 연결 혼합물로 형질전환시켜, 25 mg/l 앰피실린을 포함하는 선별 한천 상에 평판배양하였다. 플라스미드 DNA를 일부 클론으로부터 재분리하여, PCR로 분석하고 나서, DNA 서열 분석을 하였다. 정확한 플라스미드를 pBZP43이라고 명명한다. 이.콜라이 BL21:pBZP43 클론을 융합 단백질의 발현에 대해 확인한다. 이는 미국특 허 제5,496,924호의 실시예 14와 유사한 방식으로 수행한다. 발현 산물을 질량 분석법 및 SDS-PAGE로 분석하고, N 말단을 단백질 서열 분석으로 결정하였다. 대량의 물질을 발효시키는데 적당한 클론을 선별하였다.

실시예 3: AVE(1-39)에 대한 발현 벡터의 작제

플라스미드 pBZP43을 주형으로서 사용하고, 프라이머 pBprimef1 (실시예 2) 및 psw3_ave_39rev를 사용하여 PCR 반응을 수행한다. PCR 산물을 효소 제조업자의 지침에 따라 제한 효소 EcoRI 및 NotI과 반응시키고, EcoRI/NotI으로 개방된 플라스미드 pBZP43 속에 T4 리가제 반응으로 삽입시킨다. 그 결과 생성된 플라스미드 pBZP39를 사용하여, 실시예 2에 기술된 방법을 계속한다.

psw3_ave_39rev (서열번호 19):

TTT 트리플렛은 39번 위치의 리신을 암호화한다.

실시예 4: AVE(1-38-Arg)에 대한 발현 벡터의 작제

플라스미드 pBZP43을 주형으로서 사용하고, 프라이머 pBprimef1 (실시예 2) 및 psw3_ave38_argrev를 사용하여 PCR 반응을 수행한다. PCR 산물을 효소 제조업자의 지침에 따라 제한 효소 EcoRI 및 NotI과 반응시키고, EcoRI/NotI으로 개방된 플라스미드 pBZP43 속에 T4 리가제 반응으로 삽입시킨다. 그 결과 생성된 플라스 미드 pBZP38arg를 사용하여, 실시예 2에 기술된 방법을 계속한다.

프라이머: psw3_ave38_argrev (서열번호 20):

AGG 트리플렛은 39번 위치의 아르기닌을 암호화한다.

실시예 5: 실시예 2 내지 4에서 작제된 균주의 발효

발효는 독일 특허원 제DE 10 2004 058306.4호(실시예 3)에 기술된 바와 약간 다르게 수행하였다. 표적 펩티드 유도체(융합 단백질)를 암호화하는 다양한 플라스미드 벡터로 형질전환된 이.콜라이 BL21 세포를, 발효기에서 미네랄 염 배지 또는 복합 배지 (실시예 1 참조) 중에서 30℃ 또는 37℃ 그리고 pH 7.0에서 배양하였다. pH를 NH₄ ⁺ 용액 (수중 26%)으로 조절하였다. 배양액의 통기는, 배양 브로쓰(broth) 중의 용존 산소를 30%로 일정하게 유지시키는 제어 방법에 의해 확보하였다. 공급 배치(fed batch) 공정의 경우, 미네랄 염 배지 중에 글루코스 용액 (60% w/v)을 공급하였다 (8 g/L/h 내지 26 g/L/h). 단백질 발현을 IPTG (1 내지 4 mM 최종 농도 (f.c.))를 첨가하여 유도하였다. 유도 지속기간은 6 내지 8시간이었다. 표적 단백질의 발현을 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)으로 검출하였다.

이.콜라이 BL21/pBZP43에서의 AVE 전구체 융합 단백질의 발현을 하기한 바와 같이 수행하였다:

100㎕의 세포 현탁액을 -80℃에서 보관한 이.콜라이 BL21 세포의 연속 배양액으로부터 제거하여, 0.5L의 예비배양 배지 중에서 진탕하면서 37℃에서 10 내지 16시간 동안 항온처리하였다. 발효기 내의 주요 배양액을 적당량의 예비배양액으로 접종하여, 접종 밀도가 0.01 내지 0.05 OD₆₀₀이 되게 하였다.

예비배양 배지:

5 g/L 박토 트립톤(Bacto tryptone)

10 g/L 효모 추출물

5 g/L NaCl

주요 배양 배지:

탄소원으로서 글루코스를 이용하는 제한된 미네랄 염 배지(최소 배지)[참조: Jeffrey H. Miller: Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory (1972)].

주요 배양 배지 중에 처음에 존재했던 글루코스가 소모된 후, 글루코스 용액을 공급하였다. 단백질 발현을 IPTG (1mM f.c.)를 첨가하여 유도하고, 유도 후 융합 단백질의 최대 발현을 관찰하였다. SDS-PAGE 분석 시스템 [판매원: Novex] (NuPage® Novex 12% 겔 시스템, Invitrogen™)을, 예를 들어, 제조업자의 지침에 따라 사용하여, 다양한 배양 시점에 발효기로부터 제거한 0.02 OD_600nm의 세포 현탁 액 각 경우의 발효를 분석하였다.

실시예 6: 실시예 5에서 제조된 융합 단백질의 정제

1000g의 재조합 이.콜라이 균주 바이오매스(biomass)를 1000ml의 Tris 완충액 (50mM Tris/HCl, pH 7.4) 중에 재현탁시켰다. 세포를 고압 균질화 (Rannie 고압 균질기, 1000 bar)로 2회 파괴시켰다. 벤조나제(Benzonase)(1000 U/L) 및 염화마그네슘(10mM)을 첨가하여 1.5시간 동안 게놈 DNA를 분해시켰다. 융합 단백질을 확장층(expanded bed) 크로마토그래피로 정제하였다. 이를 위하여, 세포 균질액을 완충액 (50mM Tris/HCl, pH 7.4)을 사용하여 10리터로 희석시켜, 완충액 (50mM Tris/HCl, pH 7.4)으로 미리 평형화시킨 크로마토그래피 칼럼 (Streamline SP XL, GE Healthcare) 상에 직접 로딩하였다. 샘플 로딩 후, 평형화 완충액 (6 칼럼 용적)으로 세척하고 나서, 7% 고-염 완충액 (50mM Tris/HCl pH 7.4; 1M NaCl)으로 추가로 세척하였다. 용출은, 10 칼럼 용적의 20% 고-염 완충액으로 세척하여 실시하였다. 용출 풀(pool)을 SDS 겔 전기영동 (NuPage^® Novex 12% 겔 시스템, Invitrogen) 및 HPLC로 확인하였다. 엔테로키나제 완충액 (50mM Tris/HCl pH 7.4; 50mM NaCl, 2mM CaCl₂) 속으로 투석여과시킨 후, 융합 단백질 풀을 프로테아제 절단 반응에 사용하였다. 융합 단백질을, 제조업자의 지침에 따라 엔테로키나제 완충액 (20mM Tris/HCl, 50mM NaCl, 2mM CaCl₂ pH 7.4) 중에서 엔테로키나제[판매원: Invitrogen]로 절단하였다.

실시예 7: 엔테로키나제 절단 반응물로부터 절단 산물의 분리

절단 산물의 분리는, 독일 특허원 제DE 102004058306.4호의 실시예 6에 따라 실시한다. 엔테로키나제로 융합 단백질을 절단한 후, 절단 산물을 이온 교환 크로마토그래피 (Source 30S, Amersham Biosciences)로 서로 분리시켰다. 용액의 이온 농도는, H₂O로 희석하여 약 7 mS/cm가 되게 하였다. 단백질 용액을, 미리 평형화시킨 칼럼 (20mM Tris/HCl, pH 7.4; NaCl을 사용하여 전도도를 약 7mS/cm로 조절함) 상에 로딩한 후, 비-결합된 물질을 15%의 완충액 B (20mM Tris/HCl, pH 7.4; 500mM NaCl)로 씻어냈다. AVE 펩티드 전구체의 용출은, 100%의 완충액 B까지 10 칼럼 용적에 걸쳐 구배를 가하여 실시하였다. AVE 전구체 함유 분획을 SDS 겔 전기영동, HPLC 및 질량 분석법으로 확인하였다. 상응하는 분획을 배합하여 탈염시키고, 유기 용매를 제거한 후, 동결건조시켰다.

실시예 8: AVE(1-39)와 H-Lys(Boc)-NH₂와의 펩티드 연결

0.2mg의 AVE(1-39) (MW 4218; 0.047μmol; 1 g/L 최종 농도)를 1.5mL 폴리프로필렌 반응용기 속에 계량한다. 11㎕의 0.1M 피리딘-아세테이트 완충액 (pH 5.6), 0.1M 피리딘-아세테이트 완충액 (pH 5.6) 중의 60㎕의 129 g/L H-Lys(Boc)-NH₂.HCl 용액 (7.75mg의 H-Lys(Boc)-NH₂.HCl = 27.5μmol = AVE(1-39) 1몰 당 585 mol의 H-Lys(Boc)-NH₂.HCl을 함유함) 및 119㎕의 DMF를 첨가한다. 투명한 용액을 12℃에서 평형화시킨다. 10㎕의 2 g/L 트립신 수용액 (0.02mg의 트립신 = AVE(1-39) 1g 당 0.002g의 트립신을 함유함)을 첨가하여 반응을 개시시킨다. 반응 용액을 1000분^- ¹으로 진탕하면서 12℃에서 항온처리한다. 공정 제어를 위한 샘플을 정기적으로 채취하고, 9 용적의 17% 물, 17% 아세토니트릴 및 64% 트리플루오로아세트산 용액으로 희석하여 종결시킨다. 반응 경과를 LC-MS로 추적한다. 최대 수율에 도달한 후, 트리플루오로아세트산을 첨가하여 반응물을 pH 2.5 미만으로 산성화시켜, 크로마토그래피로 정제한다.

실시예 9: AVE(1-43)과 H-Lys-NH₂와의 펩티드 연결

3.85mg의 AVE(1-43) (MW 4731; 0.814μmol; 20 g/L 최종 농도)을 1.5ml 폴리프로필렌 반응용기 속에 계량한다. 0.1M 아세트산나트륨 완충액 (pH 5.8) 중의 41㎕의 620 g/L H-Lys-NH₂.2HCl 용액 (25.6mg의 H-Lys-NH₂.2HCl = 117.5μmol = AVE(1-43) 1몰 당 144 mol의 H-Lys-NH₂.2HCl을 함유함), 116㎕의 DMF 및 32㎕의 0.1M 아세트산나트륨 완충액 (pH 5.8)을 첨가한다. 투명한 용액을 12℃에서 평형화시킨다. 2.9㎕의 20 g/L 트립신 수용액 (0.06mg의 트립신 = AVE(1-43) 1g 당 0.015g의 트립신을 함유함)을 첨가하여 반응을 개시시킨다. 반응 용액을 900분^- ¹으로 진탕하면서 12℃에서 항온처리한다. 공정 제어를 위한 샘플을 정기적으로 채취하고, 9 용적의 17% 물, 17% 아세토니트릴 및 64% 트리플루오로아세트산 용액으로 희석하여 종결시킨다. 반응 경과를 LC-MS로 추적한다. 최대 수율에 도달한 후, 트리플루오로아세트산을 첨가하여 반응물을 pH 2.5 미만으로 산성화시켜, 크로마토그래피로 정제한다.

실시예 10: AVE(1-39)와 H-Lys-NH₂와의 펩티드 연결

0.2mg의 AVE(1-39) (MW 4218; 0.047μmol; 1 g/L 최종 농도)를 1.5mL 폴리프로필렌 반응용기 속에 계량한다. 11㎕의 0.1M 피리딘-아세테이트 완충액 (pH 5.6), 0.1M 피리딘-아세테이트 완충액 (pH 5.6) 중의 60㎕의 100 g/L H-Lys-NH₂.2HCl 용액 (6.0mg의 H-Lys-NH₂.2HCl = 27.5μmol = AVE(1-39) 1몰 당 585 mol의 H-Lys-NH₂.2HCl을 함유함) 및 119㎕의 DMF를 첨가한다. 투명한 용액을 12℃에서 평형화시킨다. 10㎕의 2 g/L 트립신 수용액 (0.02mg의 트립신 = AVE(1-39) 1g 당 0.002g의 트립신을 함유함)을 첨가하여 반응을 개시시킨다. 반응 용액을 1000분^- ¹으로 진탕하면서 12℃에서 항온처리한다. 공정 제어를 위한 샘플을 정기적으로 채취하고, 9 용적의 17% 물, 17% 아세토니트릴 및 64% 트리플루오로아세트산 용액으로 희석하여 종결시킨다. 반응 경과를 LC-MS로 추적한다. 최대 수율에 도달한 후, 트리플루오로아세트산을 첨가하여 반응물을 pH 2.5 미만으로 산성화시켜, 크로마토그래피로 정제한다.

실시예 11: AVE(1-39)와 H-Arg-NH₂와의 펩티드 연결

0.2mg의 AVE(1-39) (MW 4218; 0.047μmol; 1 g/L 최종 농도)를 1.5mL 폴리프로필렌 반응용기 속에 계량한다. 11㎕의 0.1M 피리딘-아세테이트 완충액 (pH 5.6), 0.1M 피리딘-아세테이트 완충액 (pH 5.6) 중의 60㎕의 113 g/L H-Arg-NH₂.2HCl 용액 (6.77mg의 H-Arg-NH₂.2HCl = 27.5μmol = AVE(1-39) 1몰 당 585 mol의 H-Arg-NH₂.2HCl을 함유함) 및 119㎕의 DMF를 첨가한다. 투명한 용액을 12℃에서 평형화시킨다. 10㎕의 2 g/L 트립신 수용액 (0.02mg의 트립신 = AVE(1-39) 1g 당 0.002g의 트립신을 함유함)을 첨가하여 반응을 개시시킨다. 반응 용액을 1000분^- ¹으로 진탕하면서 12℃에서 항온처리한다. 공정 제어를 위한 샘플을 정기적으로 채취하고, 9 용적의 17% 물, 17% 아세토니트릴 및 64% 트리플루오로아세트산 용액으로 희석하여 종결시킨다. 반응 경과를 LC-MS로 추적한다. 최대 수율에 도달한 후, 트리플루오로아세트산을 첨가하여 반응물을 pH 2.5 미만으로 산성화시켜, 크로마토그래피로 정제한다.

실시예 12: AVE(1-43)과 H-Arg-NH₂와의 펩티드 연결

0.25mg의 AVE(1-43) (MW 4731; 0.047μmol; 1.1 g/L 최종 농도)를 1.5mL 폴리프로필렌 반응용기 속에 계량한다. 11㎕의 0.1M 피리딘-아세테이트 완충액 (pH 5.6), 0.1M 피리딘-아세테이트 완충액 (pH 5.6) 중의 60㎕의 113 g/L H-Arg- NH₂.2HCl 용액 (6.77mg의 H-Arg-NH₂.2HCl = 27.5μmol = AVE(1-43) 1몰 당 585 mol의 H-Arg-NH₂.2HCl을 함유함) 및 119㎕의 DMF를 첨가한다. 투명한 용액을 12℃에서 평형화시킨다. 10㎕의 2 g/L 트립신 수용액 (0.02mg의 트립신 = AVE(1-43) 1g 당 0.002g의 트립신을 함유함)을 첨가하여 반응을 개시시킨다. 반응 용액을 1000분^-1으로 진탕하면서 12℃에서 항온처리한다. 공정 제어를 위한 샘플을 정기적으로 채취하고, 9 용적의 17% 물, 17% 아세토니트릴 및 64% 트리플루오로아세트산 용액으로 희석하여 종결시킨다. 반응 경과를 LC-MS로 추적한다. 최대 수율에 도달한 후, 트리플루오로아세트산을 첨가하여 반응물을 pH 2.5 미만으로 산성화시켜, 크로마토그래피로 정제한다.

실시예 13: AVE(1-38)-Arg과 H-Lys-NH₂와의 펩티드 연결

0.2mg의 AVE(1-38)-Arg (MW 4246; 0.047μmol; 1 g/L 최종 농도)를 1.5mL 폴리프로필렌 반응용기 속에 계량한다. 11㎕의 0.1M 피리딘-아세테이트 완충액 (pH 5.6), 0.1M 피리딘-아세테이트 완충액 (pH 5.6) 중의 60㎕의 100 g/L H-Lys-NH₂.2HCl 용액 (6.0mg의 H-Lys-NH₂.2HCl = 27.5μmol = AVE(1-38)-Arg 1몰 당 585 mol의 H-Lys-NH₂.2HCl을 함유함) 및 119㎕의 DMF를 첨가한다. 투명한 용액을 12℃에서 평형화시킨다. 10㎕의 2 g/L 트립신 수용액 (0.02mg의 트립신 = AVE(1-38)-Arg 1g 당 0.002g의 트립신을 함유함)을 첨가하여 반응을 개시시킨다. 반응 용액 을 1000분^- ¹으로 진탕하면서 12℃에서 항온처리한다. 공정 제어를 위한 샘플을 정기적으로 채취하고, 9 용적의 17% 물, 17% 아세토니트릴 및 64% 트리플루오로아세트산 용액으로 희석하여 종결시킨다. 반응 경과를 LC-MS로 추적한다. 최대 수율에 도달한 후, 트리플루오로아세트산을 첨가하여 반응물을 pH 2.5 미만으로 산성화시켜, 크로마토그래피로 정제한다.

실시예 14: AVE(1-43)과 H-Lys(Boc)-NH₂와의 펩티드 연결

20mg의 AVE(1-43) (MW 4731; 1.058μmol; 20 g/L 최종 농도)를 2mL 폴리프로필렌 반응용기 속에 계량한다. 0.1M 시트르산나트륨 완충액 (pH 5.5) 중의 370㎕의 482 g/L H-Lys(Boc)-NH₂.HCl 용액 (155mg의 H-Lys(Boc)-NH₂.HCl = 550μmol = AVE(1-43) 1몰 당 130 mol의 H-Lys(Boc)-NH₂.HCl을 함유함) 및 600㎕의 DMF를 첨가한다. 투명한 용액을 12℃에서 평형화시킨다. 30㎕의 3.3 g/L 트립신 수용액 (0.1mg의 트립신 = AVE(1-43) 1g 당 5mg의 트립신을 함유함)을 첨가하여 반응을 개시시킨다. 반응 용액을 1000분^- ¹으로 진탕하면서 12℃에서 항온처리한다. 공정 제어를 위한 샘플을 정기적으로 채취하고, 9 용적의 17% 물, 17% 아세토니트릴 및 64% 트리플루오로아세트산 용액으로 희석하여 종결시킨다. 반응 경과를 LC-MS로 추적한다. 최대 수율에 도달한 후, 트리플루오로아세트산을 첨가해서 최종 농도가 50%(v/v)가 되게 하여 반응물을 산성화시킨다. 이로 인해 반응이 종결되고, 동시 에 Boc 보호 그룹이 정량적으로 제거된다. 반응 산물을 크로마토그래피로 정제한다.

실시예 15: 아미드화된 AVE 유도체의 정제

이어서, 연결 반응으로부터의 반응 혼합물을 Amberchrom CG300 XT 20을 지지물질로서 사용하여 RP 크로마토그래피로 분리시키고 나서, 아미드화된 표적 펩티드를 Source 30S를 지지체로서 사용하여 이온 교환 단계를 통해 적당한 용출액 분획으로부터 분리시킨다. Amberchrom 칼럼 상에서 탈염시키고 나면, 약제로서 제형화하는데 사용가능한 산물이 수득된다. 산물의 구조의 동일성을 MALDI-MS 및 NMR 분석으로 증명하였다.

실시예 16: Leu-히루딘₁ _-65 Lys-Arg-NH₂의 제조

유럽 특허원 제EP-A 1 216 259호의 실시예 1에는 세균 상청액 속으로 Leu-히루딘이 분비되게 하는 발현 플라스미드의 제조가 기술되어 있다. 플라스미드의 DNA를 표준 PCR에서 주형으로서 사용한다. 반응에 사용되는 정방향 프라이머는 상기 실시예에 기술된 서열 smompaf2이다. 사용되는 역방향 프라이머는 다음의 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 hir_lys66_rev (서열번호 21)이다.

상기 밑줄친 코돈은 리신을 암호화한다. 위치 22번 내지 위치 40번(말단)의 서열은 유럽 특허원 제EP-A 1 216 259호의 표 1에 제시된 서열의 서열 단편 178번 내지 195번에 상보적이다. 상기 실시예에 기술된 바와 같이, PCR을 수행하고, 산물을 제한 효소 EcoR1 및 Hind3로 분해시켜, 동일한 효소로 개방된 벡터 pJF118 속에 삽입시킨다. 특성규명 후, DNA를 유럽 특허원 제EP-A 1 216 259호의 실시예 11에서와 같이 이.콜라이 K12 속으로 형질전환시켜, 중간 산물을 발현시키고 정제한다. 이어서, 본 특허원의 실시예 13과 마찬가지로, 상응하는 몰농도로 아르기닌아미드와 반응시켜 Leu-히루딘₁ _-65 Lys-Arg-NH₂를 수득한다. 중간 숙주 균주로서 사용된 MC1061 균주에서 직접 발현을 수행하는 경우에는, 산물이 주변세포질 공간(periplasmic space)에서도 발견된다. 이 경우, 추가적인 후처리 단계로서 공지된 방법에 따라 세포를 파괴시켜 중간 산물을 분리하는 것이 필요하다.

실시예 17: AVE 유도체에 대한 펩티드 연결 반응의 분석

실시예 8 내지 14에 따른 연결 반응 후, Symmetry 300 150 x 4.6mm, 5㎛ 칼럼[판매원: Waters] 상에서 RP-HPLC로 분석한다. 0.1% (v/v) 포름산 (용리액 A) 및 0.1% 포름산 함유 아세토니트릴 (용리액 B)을 용리액으로서 사용한다. 60℃의 칼럼 온도에서 15분에 걸친 20%에서부터 50%까지의 B의 선형 구배 및 1 mL/분의 유속을 사용하여 용출시킨다. 215nm에서 검출을 실시한다. 일반적으로 5㎕의 1:25-희석된 반응 샘플을 주입한다. 탈보호된 AVE 유도체를 7 내지 10분의 잔류 시간(retention time)에서 검출한다.

<110> Sanofi-Aventis Deutschland GmbH <120> Method for amidating polypeptides with basic aminoacid C-terminals by means of specific endoproteases <130> DE 2005/042 <150> DE 10 2005 046 113.1 <151> 2005-09-27 <160> 21 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 44 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> description of the artificial sequence: exendin-4 derivative <400> 1 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys 35 40 <210> 2 <211> 40 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> description of the artificial sequence: exendin-4 derivative <400> 2 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Ser Lys Lys 35 40 <210> 3 <211> 40 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> description of the artificial sequence: 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<400> 6 ttttttaagc ttgcacggtg aaggtacctt cacctccgac ctgtccaaac agatggaaga 60 agaagctgtt cgtctgttca tcgaatggct gaaaaacggt ggtccgtcct ccggtgctcc 120 gccttcgaaa aagaagaaaa agtgataata gcatgcacgt gcggccgcac ctggtcgacg 180 aattcaaaaa aa 192 <210> 7 <211> 44 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> description of the artificial sequence: exendin-4 derivative <400> 7 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys 35 40 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> description of the artificial sequence: primer <400> 8 ttttttaagc ttgcacggtg aag 23 <210> 9 <211> 59 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> description of the artificial sequence: primer <400> 9 cttccatctg tttggacagg tcggaggtga aggtaccttc accgtgcaag cttaaaaaa 59 <210> 10 <211> 69 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> description of the 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Claims

HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSKK KKK (서열번호 7)의 서열을 특징으로 하는 펩티드를,

염기성 아미노산의 C-말단 펩티드 결합을 절단할 수 있고, 트립신, 카텝신, 트립타제, 마스틴, 아크로신, 칼리크레인, 헵신, 프로스타신 I, 리실 엔도펩티다제 및 엔도프로테이나제-Arg-C로 이루어진 군으로부터 선택되는트립신의 생물학적 활성을 갖는 효소의 존재 하에,

H-Arg-NH₂ 또는 H-Lys-NH₂와 반응시켜 화학식 I의 C-말단 아미드화된 2-염기성 또는 다염기성 펩티드를 제조하는 방법.

화학식 I

(AA)-X-NH₂

상기 화학식 I에서,

AA는 HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSKK KKKK-NH₂ (서열번호 1) 또는 HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSKK KKKR-NH₂(서열번호 4)의 서열을 특징으로 하는 펩티드이고;

X는 리신 또는 아르기닌이다.
제1항에 있어서, 서열번호 1의 서열을 특징으로 하는 펩티드 제조의 경우, 서열번호 7의 서열을 특징으로 하는 펩티드와 H-Lys-NH₂와의 몰비가 1:144이고, 서열번호 4의 서열을 특징으로 하는 펩티드 제조의 경우, 서열번호 7의 서열을 특징으로 하는 펩티드와 H-Arg-NH₂와의 몰비가 1:585인, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,

a) 서열번호 7의 서열을 특징으로 하는 펩티드를 포함하는 융합 펩티드를 발현시키고;

b) 상기 서열번호 7의 서열을 특징으로 하는 펩티드를 효소적 절단에 의해 상기 융합 펩티드로부터 제거시키고;

c) b) 단계의 중간체를, 트립신, 카텝신, 트립타제, 마스틴, 아크로신, 칼리크레인, 헵신, 프로스타신 I, 리실 엔도펩티다제 및 엔도프로테이나제-Arg-C로 이루어진 군으로부터 선택되는 트립신의 생물학적 활성을 갖는 효소의 존재 하에 H-Arg-NH₂ 또는 H-Lys-NH₂와 반응시키는, 방법.
제3항에 있어서, 상기 융합 단백질로부터의 제거를 시아노겐 할라이드, 엔테로키나제, 인자 Xa, 제네나제(Genenase), 트롬빈 또는 트립신을 사용하여 수행하는 방법.
제4항에 있어서, 상기 융합 단백질을 이. 콜라이(E. coli), 에스. 카르노서스(S. carnosus), 살모넬라(Salmonella), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 케이. 락티스(K. lactis), 피. 파스토리스(P. pastoris), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) 및 에스. 세레비지애(S. cerevisiae)를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 발현 시스템에서 발현시키는 방법.
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