CN1807456B - 重组人甲状旁腺激素pth1-34的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了含重组人甲状旁腺激素的融合蛋白Trx-PTH(1-34)(简称为“Trx-PTH1-34融合蛋白”)，编码该融合蛋白的DNA序列，含该DNA序列的载体，含该载体的宿主细胞，用基因工程制备该融合蛋白进而生产PTH1-34的方法。用肠激酶对该融合蛋白酶切，可产生具有高度生理活性的重组人甲状旁腺激素PTH(1-34)。本发明的表达产量高、纯化工艺简单、成本降低，可用于重组人甲状旁腺激素PTH(1-34)的大规模、工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种用基因工程方法制备含人甲状旁腺激素PTH1-34的融合蛋白(简称为“Trx-PTH1-34融合蛋白”)进而生产PTH1-34的方法。本发明还公开了编码该融合蛋白的DNA序列、含有该序列的重组表达载体和大肠杆菌重组表达菌株以及该融合蛋白的制备方法和用途。
背景技术
人甲状旁腺激素(PTH)是由人甲状旁腺的主细胞合成并分泌的单链多肽链激素，最初合成的是含115个氨基酸的前甲状旁腺激素原，在粗面内质网去掉N端25个氨基酸残基后形成甲状旁腺激素原。甲状旁腺素原在高尔基复合体内从N端去掉一个六肽，形成84个氨基酸的甲状旁腺激素，分子量9500。
PTH与甲状腺C细胞分泌的降钙素、1，25-二羟VD3共同调控血浆中的钙磷水平。PTH是肾脏和骨骼中钙、磷代谢的主要调节剂。其生理作用包括：骨代谢的调控、肾小管对钙、磷的重吸收以及肠钙的吸收[Potts JT et al，Parathyroid hormone：Chemistry，biosynthesis，and mode of action.Adv ProteinChem.1982；35：323-396]。
人PTH的cDNA序列最早是由Hendy GN等于1981年确定的[Hendy GNET AL，Nucleitide sequence of cloned cDNAs encoding humanpreproparathyroid hormone，PNAS USA 1981，78：7365-7369]。1983年，确定了PTH的基因序列[Tomas J et al，Nucleitide sequence of human preproparathyroidhormone gene，PNAS USA 1983，80：2127-2131]。
传统的生理学认为PTH对骨是分解代谢作用，但早在1929年就认为甲状旁腺的肽抽提物可以对骨骼产生合成代谢的作用，在动物体内产生骨组织的增加[Bauer W et al，Studies of phosphorus metabolism：study of bonetrabeculae as ready available reserve supply of calcium，1929，J.Exp.Med 49：145-162]。到目前为止的研究认为，成骨细胞和破骨细胞上均表达PTH的功能性受体，因此，PTH对骨可能有双重调节作用，PTH对破骨细胞有直接抑制作用，并具有由成骨细胞介导的间接调节作用[David W et al Anabolic Actions ofparathyroid hormone on bone 1993，Endocrine Reviews 14：690-709]。研究发现，PTH的给药方式会影响它对骨形成的效应，以PTH连续刺激，会抑制骨形成；而将PTH间歇性刺激，则会刺激骨形成[Canalis E et al，Insulin-like growthfactor I mediates selective anabolic effects of parathyroid hormone in bonecultures，J clin Invest 1989，83：60-65]。
PTH所有已知的细胞外生物学活性都位于这84个氨基酸的蛋白质的N末端，PTH1-34具有完整的PTH生物学活性[Ute CM et al，Structure-activityrelation of NH2-terminal human Parathyroid Hormone fragments，1998，TheJournal of Biological Chemistry，273：4308-4316]。因此，PTH1-34可以诱导骨质生成而有效治疗骨质疏松症[Felicia C et al Parathyroid responsivity inpostmenopausal women with osteoporosis during treatment with parathyroidhormone，J.Clin.Endocrinol.Metab.，Mar 1998；83：788-790；Etah S.et al，Parathyroid hormone as a therapy for idiopathic osteoporosis in men：effects onbone mineral density and bone markers，J.Clin.Endocrinol.Metab.，Sep 2000；85：3069-3076.]。
PTH1-34在体内很不稳定，含量很低，从天然组织中分离提取几乎不可能。为使hPTH1-34在临床上得到广泛应用，必须找到一种可靠的可以获得大量产品的方法。化学合成的成本和风险性太高，不适合大量生产PTH1-34。随着基因工程重组技术的发展，人们可利用该技术来生产重组甲状旁腺激素。
然而，目前已有的生产工艺在表达量纯度和生理活性上难以令人满意。因此，本领域迫切需要开发表达量高、纯度高、工艺简单且成本低廉的大规模生产具有完全天然甲状旁腺激素生理活性的PTH1-34的生产工艺。
发明内容
本发明的一个目的就是提供一种用于生产甲状旁腺激素PTH1-34的中间体，它是含有载体pET32b自身编码的融合蛋白序列和人甲状旁腺激素PTH1-34的蛋白序列的融合蛋白。
本发明的另一目的是提供编码所述融合蛋白的DNA、含该DNA序列的载体，含该载体的宿主细胞。
本发明的另一目的是提供一种成本低廉和/或步骤简便的生产PTH 1-34的方法。
在本发明的第一方面，提供了一种融合蛋白，其特征在于，它包括以下元件：
(a)硫氧还蛋白元件，该元件具有硫氧还蛋白或其活性片段的氨基酸序列；
(b)甲状旁腺素PTH1-34元件，该元件具有人甲状旁腺素PTH1-34或其活性片段的氨基酸序列；以及
(c)位于硫氧还蛋白元件和甲状旁腺素PTH1-34元件之间的连接肽序列，所述的连接肽含有6组氨酸标签序列和肠激酶酶切位点序列。
在另一优选例中，所述的融合蛋白由元件(a)、(b)和(c)构成。
在另一优选例中，所述的硫氧还蛋白元件具有SEQ ID NO：2中第1-109位的氨基酸序列；
所述的甲状旁腺素PTH1-34元件具有SEQ ID NO：4中第1-34位的氨基酸序列；
或者，所述的接头肽序列具有SEQ ID NO：2中第110-158位的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述的融合蛋白含有SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列。
在本发明的第二方面，提供了一种分离的DNA分子，它编码所述的融合蛋白。
在另一优选例中，所述的DNA分子具有SEQ ID NO：1中所示的核苷酸序列。
在本发明的第三方面，提供了一种载体，其特征在于，它含有上述编码本发明融合蛋白的DNA分子。更佳地，所述的载体是表达载体pET32-Trx-PTH1-34。
在本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，它含有本发明上述的载体。较佳地，所述的宿主细胞是大肠杆菌。更佳地，所述的宿主细胞是大肠杆菌重组菌株B21(DE3)/Trx-PTH1-34。
在本发明的第五方面，提供了一种产生本发明上述的融合蛋白的方法，它包括步骤：
在适合表达所述融合蛋白的条件下，培养上述的宿主细胞，从而表达出所述的融合蛋白；和分离所述的融合蛋白。
在另一优选例中，所述的方法还包括步骤：将分离的融合蛋白用肠激酶酶切，然后分离切下的甲状旁腺素PTH1-34。
在本发明的第六方面，提供了本发明上述融合蛋白的用途，它被用作制备甲状旁腺素PTH1-34的中间体。
附图说明
图1是本发明制备方法的流程示意图。
图2显示了PTH1-34的cDNA序列(SEQ ID NO：3)。
图3显示了PTH1-34的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。
图4显示了Trx-rhPTH1-34融合基因序列(SEQ ID NO：1)及推导的融合蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。图中硫氧还蛋白元件SEQ ID NO：2中为1-109位，甲状旁腺素PTH1-34元件为159-192位，连接肽为110-158位，包括6His(117-122位)、凝血酶(thrombin)酶切位点(126-131位)、S·Tag(134-148位)、肠激酶酶切位点(154-158位)。
图5是表达载体的电泳图。其中各泳道如下：1.1kb DNA Ladder标准品；2.pET32-Trx-PTH(1-34)质粒XhoI单酶切；3.pET32-Trx-PTH(1-34)质粒KpnI单酶切；4.pET32-Trx-PTH(1-34)质粒XhoI/KpnI双酶切；5.pET32-Trx-PTH(1-34)质粒；6.100bp DNA Ladder标准品。
图6显示了Trx-rhPTH融合蛋白诱导表达的SDS-PAGE电泳图。其中各泳道如下：1.标准分子量蛋白；2.诱导前；3.诱导后。
图7显示了Trx-rhPTH1-34融合蛋白的亲和柱层析结果。
图8显示了Trx-rhPTH1-34融合蛋白经37℃、24小时酶切后的电泳图。其中各泳道如下：A：分子量标准蛋白；B：酶切后样品；C：酶切沉淀；D：酶切前融合蛋白。
图9显示了对PTH1-34纯品的电泳图。
图10显示了对PTH1-34纯品的HPLC图。
图11显示了在大鼠摘除卵巢性骨质疏松模型中，生理盐水治疗组严重骨质疏松。
图12显示了在大鼠摘除卵巢性骨质疏松模型中，20μg·Kg-1·d-1PTH1-34治疗组大鼠骨质生成，骨结构恢复。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，发现对于PTH1-34这样的短肽而已，直接表达存在相当的困难，因为PTH1-34易受到宿主细胞内蛋白酶的水解。为了便于高表达PTH1-34和简便地纯化PTH1-34，本发明人将Trx基因和PTH1-34基因融合在一起，产生由氨基酸连接肽(linker)连接的Trx-PTH1-34的融合蛋白。在融合蛋白中，硫氧还蛋白对该融合蛋白的可溶性及稳定性非常重要。此外，连接肽中的6个连续组氨酸，可极大方便融合蛋白的纯化；连接肽中的DDDDK五肽既是连接肽，又是牛肠激酶特异性切割点，因此可以方便从融合蛋白上切下PTH1-34。在此基础上完成了本发明。
定义
如本文所用，术语“硫氧还蛋白和甲状旁腺素PTH1-34的融合蛋白”、“Trx-PTH1-34融合蛋白”等可互换使用，都指由硫氧还蛋白元件的氨基酸序列和甲状旁腺素PTH1-34元件的氨基酸序列融合而成的蛋白。此外，所述融合蛋白可以具有或没有起始的甲硫氨酸或信号肽。
如本文所用，术语融合蛋白中“硫氧还蛋白元件”指在所述融合蛋白中的一部分氨基酸序列，该序列与天然的或变异的全长硫氧还蛋白或其活性片段具有基本上相同的氨基酸序列，并且具有与天然硫氧还蛋白基本上相同的生物活性。优选的硫氧还蛋白元件是全长的硫氧还蛋白或其活性片段，如SEQID NO：2中第1-109位的氨基酸序列。
如本文所用，术语融合蛋白中“甲状旁腺素PTH1-34元件”或“PTH1-34元件”可互换使用，指在所述融合蛋白中的一部分氨基酸序列，该序列与天然的或变异的甲状旁腺素PTH1-34或其活性片段具有基本上相同的氨基酸序列，并且具有与天然甲状旁腺素PTH1-34基本上相同的生物活性。优选的PTH1-34元件是人甲状旁腺素PTH1-34，更佳地具有SEQ ID NO：4中第1-34位的氨基酸序列，即成熟的人甲状旁腺激素N末端的1至34位氨基酸组成的蛋白序列(图2和图3)。
硫氧还蛋白和甲状旁腺素PTH1-34的序列可以源自人，也可以源自非人的动物。然而，优选的是人的天然序列。
如本文所用，术语“连接肽”或“氨基酸连接肽”可互换使用，指位于硫氧还蛋白元件的氨基酸序列和PTH1-34元件的氨基酸序列之间的、起连接作用的短肽。连接肽的长度通常为5-50个氨基酸，较佳地为10-40个氨基酸。技术人员可按照本领域常规方法(如参见PNAS 1998；95：5929-5934；ProteinEng，2000；13(5)：309-312；Protein Eng，2003；15(11)：871-879等文献)设计连接肽。通常，连接肽不影响或严重影响硫氧还蛋白元件的氨基酸序列和PTH1-34元件的氨基酸序列形成正确的折叠和空间构象。
优选的连接肽例子包括(但并不限于)：为了有利于蛋白折叠成相互独立的结构域，用DDDDK等序列作为连接肽是合适的(SEQ ID NO：2中第154-158位)。相似的，糜蛋白酶1、木瓜蛋白酶、纤维蛋白溶酶、纤维蛋白酶、胰蛋白酶等的酶切位点也可设计作为氨基酸连接肽。为了有利于纯化，可把6His作为连接肽，以便用金属亲和层析纯化Trx-PTH1-34融合蛋白。此外，还可将上述连接肽结合形成新的连接肽。一种特别优选的连接肽具有SEQ IDNO：2中第110-158位的氨基酸序列，该连接肽融合了蛋白酶切位点(肠激酶)和金属亲和层析位点6His，此外，还融合了凝血酶(thrombin)酶切位点和S·Tag，有利于用其他方法进行鉴定和纯化。
一种特别优选的融合蛋白是由硫氧还蛋白、连接肽和PTH1-34所构成的融合蛋白，其中连接肽由以下元件构成：组氨酸标签(His·Tag)、凝血酶(thrombin)酶切位点、S·Tag和肠激酶(enterokinase，EK)酶切位点。更佳地，该融合蛋白具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
编码本发明融合蛋白的DNA序列，可以全部人工合成。也可用PCR扩增或合成的方法获得硫氧还蛋白和或甲状旁腺素PTH1-34的编码DNA序列，然后将其拼接在一起，形成编码本发明融合蛋白的DNA序列。
在获得了编码本发明新融合蛋白的DNA序列之后，将其连入合适的表达载体，再转入合适的宿主细胞。最后，培养转化后的宿主细胞，通过分离纯化得到本发明的新的融合蛋白。
如本文所用，术语“载体”包括质粒、粘粒、表达载体、克隆载体、病毒载体等。代表性的状态包括(但并不限于)：能在真核细胞如CHO、COS系列等真核细胞中表达的载体，能在酿酒酵母或毕氏酵母中表达的载体，能在家蚕等昆虫细胞中表达的载体以及原核表达载体。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体如市售的载体。比如，选用市售的载体，然后将编码本发明新融合蛋白的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，可以形成蛋白表达载体。
如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻近，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，更佳地是家蚕细胞。
在获得转化的宿主细胞后，可在适合表达本发明融合蛋白的条件下培养该细胞，从而表达出融合蛋白。可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明的Trx-PTH1-34融合蛋白可作为生产PTH1-34的中间体。因此，本发明还提供了一种制备PTH1-34的新方法。该方法包括：
(1)培养大肠杆菌重组菌株B21(DE3)/Trx-PTH1-34，加入诱导剂诱导表达Trx-PTH1-34融合蛋白。
(2)从培养物中提取Trx-PTH1-34融合蛋白。例如可以通过离心收集菌体、加裂解液超声破菌、稀释离心、收集上清过滤取滤液而获得。
(3)亲和柱层析纯化融合蛋白，例如使用螯合Sepharose FF柱并用Sephadex G25(fine)换液。
(4)用对应于切割位点的酶(例如当使用DDDDK时，用肠激酶(EK)酶切)酶切Trx-PTH1-34融合蛋白，从而切下PTH1-34。
(5)用阴离子交换层析、阳离子交换层析等常规手段分离纯化出PTH1-34。
本发明的主要优点如下：
(1)在融合蛋白中，硫氧还蛋白对该融合蛋白的可溶性及稳定性非常重要，从而有利于蛋白的表达。
(2)位于融合蛋白中部的6个连续组氨酸，可极大方便融合蛋白的纯化。
(3)DDDDK五肽既是连接肽，又是牛肠激酶特异性切割点，因此可以方便从融合蛋白上切下PTH1-34。
(4)表达量高、纯化工艺简便、产率高、成本低廉，适合大规模生产。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
Trx-PTH1-34表达载体和宿主细胞的构建
制备过程参见图1。
(a)PTH1-34的制备
设计合成了两条引物，它们分别对应PTH 1-8氨基酸残基和29-34氨基酸残基，用于PCR克隆人PTH 1-34cDNA。引物序列如下：
5′引物：
5′ATCTGGGTACCGACGACGACGACAAGTCTGTGAGTGAAATACAGCTTAT 3′(SEQ ID NO：5)
3′引物：
5′TTATCAAAAATTGTGCACATCCTGC 3′(SEQ ID NO：6)
5′引物包含肠激酶切点DDDDK及PTH(1-34)的N端基因序列，并引入KpnI切点；3′引物含PTH(1-34)的C端基因序列及终止密码子。用上述引物，以常规制备的人甲状旁腺激素cDNA为模板进行PCR。然后用Invitrogen公司的PCR2.1-TOPO克隆试剂盒将PCR产物直接克隆到PCR2.1载体(Invitrogen公司)中，得到PCR2.1-rhPTH(1-34)重组载体，转化DH5α进行DNA测序。测序结果表明所克隆得到的PTH(1-34)基因序列与预期序列一致。
(b)表达载体pET32-Trx-PTH1-34的制备
PCR2.1-rhPTH(1-34)载体经过KpnI和XhoI酶切后克隆到经过相同酶切的pET32b(+)载体(购自Novagen公司)中转化常规的大肠杆菌DH5α，得到重组表达载体pET32-Trx-PTH(1-34)，进行测序。酶切鉴定图谱见图5。
(c)大肠杆菌重组菌株B21(DE3)/Trx-PTH1-34的构建
用CaCl2法将表达载体pET32-Trx-PTH(1-34)转化常规的大肠杆菌BL21(DE3)，筛选阳性克隆，就得到表达Trx-PTH(1-34)融合蛋白的工程菌，即大肠杆菌重组菌株B21(DE3)/Trx-PTH1-34。
实施例2
Trx-PTH1-34的表达
挑取转化平板上的阳性大肠杆菌B21(DE3)/Trx-PTH1-34，划线在含100μg/ml Amp的LB+1％葡萄糖的琼脂平板上，37℃培养16小时，挑选生长良好的单菌落接种于LB+1％葡萄糖的培养液(含Amp 100μg/ml)，37℃，270rpm，培养过夜。将过夜菌1∶50接种于LB+1％葡萄糖的培养液(含Amp 100μg/ml)，37℃振荡培养。当OD600达0.6～0.8时，加IPTG至终浓度1mM，诱导3小时。菌液经4000rpm 10min离心去上清，沉淀菌体加入上样缓冲液，100℃水浴5min破菌，离心后取可溶蛋白上清液上SDS-PAGE电泳(积层胶5％，分离胶12％)，染色、脱色、扫描分析。
因Trx-PTH(1-34)融合蛋白含192个氨基酸，理论分子量应为22KD，结构如图4所示。SDS-PAGE电泳结果表明：在14KD和31KD之间有明显诱导表达条带，与分子量大小预期相符，融合蛋白表达量占菌体总蛋白25％左右，表达为可溶性蛋白(图6)。
所述cDNA在大肠杆菌细胞中与Trx融合表达。表达产物为PTH1-34与硫氧还蛋白(Thioredoxin)由DDDDK五肽连接，该序列是牛肠激酶特异性切割点。硫氧还蛋白对该融合蛋白的可溶性及稳定性非常重要，而融合蛋白中部的6个连续组氨酸对融合蛋白的纯化极有帮助。
实施例3
融合蛋白和PTH1-34的分离纯化
(a)融合蛋白的分离纯化
工程菌的发酵后在冰浴条件下超声波处理菌体悬浮液，破菌后，4℃，9000rpm离心20min，Trx-EK-PTH融合蛋白主要在上清中。
如下进行金属螯合柱层析亲和柱层析纯化：60mM咪唑、500mM NaCl，pH8.0，20mM PB上样缓冲液平衡3个柱体积。将超声上清0.45μm膜过滤上柱后，用60mM咪唑，500mM NaCl，pH8.0，20mM PB缓冲液平衡至基线平稳，去除部分杂蛋白。以160mM咪唑，500mM NaCl，pH8.0，20mM PB缓冲液洗脱融合蛋白，收集融合蛋白峰，经SDS-PAGE电泳检测，分子量为22KD左右，与理论值一致，纯度80％左右(图7)。
(b)酶切形成PTH1-34
肠激酶(EK)酶切融合蛋白：37℃恒温酶切24小时，电泳可见清晰rhPTH及Trx降解条带(图8)。
(c)阴离子交换层析和阳离子交换层析
阴离子交换层析
DEAE Sepharose FF阴离子交换层析纯化rhPTH(1-34)
Trx-HisTag-EK-PTH(1-34)融合蛋白经肠激酶酶解后，处于pH8.0的20mM PB缓冲体系中。采用相同缓冲体系平衡DEAE Sepharose FF柱后，样品直接上样，收集PTH(1-34)所在的穿透液，1M NaCl的pH8.0的20mM PB缓冲液洗脱杂峰。
阳离子交换层析
CM Sepharose FF柱层析
平衡：用平衡缓冲液pH6.4，20mM PB平衡柱。
上样前样品pH调节：0.5N HCl调节DEAE Sepharose FF柱纯化所得的rhPTH(1-34)样品pH至6.4
上样：调节好pH的rhPTH(1-34)样品上样。
淋洗再平衡：用平衡缓冲液pH6.5，20mM PB淋洗平衡到基线。
分段洗脱：A液：20mM NaCl，pH6.4，20mM PB
B液：120mM NaCl，pH6.4，20mM PB
C液：1M NaCl，pH6.4，20mM PB
其中B液洗脱峰为rhPTH(1-34)目标蛋白峰。
经过CM Sepharose FF柱的纯化，得到的rhPTH(1-34)纯度可以达到95％以上，收率大于70％，比活性大于8.0×103IU/mg，热原小于2.5EU/mg
经阴离子交换层析和阳离子交换层析后得到的rhPTH(1-34)纯度可以达到95％以上(图9)。
(d)HPLC纯度。
主要仪器：Waters2487高效液相色谱仪，Waters C18高效液相色谱柱。
方法：流动相，色谱纯乙腈(含0.08％TFA，梯度0-75％)。检测波长280nm，流速0.8ml/min。蛋白上样量10-20μg。
结果：标准品与样品的主峰保留时间一致，纯度大于95％(图10)。
| 峰名称 | 保留时间(分) | 面积(V×秒) | 面积％ | 高度(V) | 高度％ | |
| 1 | Peak1 | 15.135 | 11813 | 0.29 | 1667 | 0.40 |
| 2 | Peak2 | 15.313 | 14891 | 0.36 | 2016 | 0.49 |
| 3 | Peak3 | 16.514 | 46693 | 1.13 | 2651 | 0.64 |
| 4 | Peak4 | 16.772 | 3992187 | 96.86 | 400614 | 97.18 |
| 5 | Peak5 | 17.280 | 24035 | 0.58 | 2563 | 0.62 |
| 6 | Peak6 | 26.611 | 31830 | 0.77 | 2724 | 0.66 |
实施例4
PTH1-34的活性测试
在本实施例中，用常规方法测定实施例3中所制备的PTH1-34。简而言之，方法如下：通过检测PTH1-34刺激UMR 106细胞产生cAMP的量。采用化学发光试剂盒检测样品和标准品刺激UMR 106细胞产生cAMP的量，将获得的数据进行“S”型曲线回归，分别获得样品和标准品的EC50值进行比较，得出样品的比活性。
结果：样品的比活性大于8.0×103IU/mg。这表明，用本发明方法生产的PTH1-34具有完全的天然甲状旁腺激素的生理活性。
此外，还进行了常规的动物试验。在大鼠摘除卵巢性骨质疏松模型中，PTH1-3420μg/kg组，经过治疗的大鼠骨密度为0.322g/cm2，而生理盐水治疗组为0.262g/cm2(图11和12)。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110>上海赛金生物医药有限公司
<120>重组人甲状旁腺激素PTH1-34的制备方法
<130>041425
<160>6
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>579
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>甲状旁腺素融合蛋白的编码序列
<400>1
atgagcgata aaattattca cctgactgac gacagttttg acacggatgt actcaaagcg 60
gacggggcga tcctcgttga tttctgggca gagtggtgcg gtccgtgcaa aatgatcgct 120
ccgattctgg atgaaatcgc tgacgaatat cagggcaaac tgaccgttgc aaaactgaac 180
atcgatcaaa acccgggcac tgcgccgaaa tatggcatcc gtggtatccc gactctgctg 240
ctgttcaaaa acggtgaagt ggcggcaacc aaagtgggtg cactgtctaa aggtcagttg 300
aaagagttcc tcgacgctaa cctggccggt tctggttctg gccatatgca ccatcatcat 360
catcattctt ctggtctggt gccacgcggt tctggtatga aagaaaccgc tgctgctaaa 420
ttcgaacgcc agcacatgga cagcccagat ctgggtaccg acgacgacga caagtctgtg 480
agtgaaatac agcttatgca taacctggga aaacatctga actcgatgga gagagtagaa 540
tggctgcgta agaagctgca ggatgtgcac aatttttga 579
<210>2
<211>192
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>甲状旁腺素融合蛋白
<400>2
Met Arg Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp
1 5 10 15
Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp
20 25 30
Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp
35 40 45
Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn
50 55 60
Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu
65 70 75 80
Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser
85 90 95
Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly
100 105 110
Ser Gly His Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
115 120 125
Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln
130 135 140
His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ser Val
145 150 155 160
Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser Met
165 170 175
Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His Asn Phe
180 185 190
<210>3
<211>105
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>3
tctgtgagtg aaatacagct tatgcataac ctgggaaaac atctgaactc gatggagaga 60
gtagaatggc tgcgtaagaa gctgcaggat gtgcacaatt tttga 105
<210>4
<211>34
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>4
Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn
1 5 10 15
Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His
20 25 30
Asn Phe
<210>5
<211>49
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>5
atctgggtac cgacgacgac gacaagtctg tgagtgaaat acagcttat 49
<210>6
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>6
ttatcaaaaa ttgtgcacat cctgc 25
Claims (8)
1.一种融合蛋白，其特征在于，它包括以下元件：
(a)硫氧还蛋白元件，该元件具有硫氧还蛋白或其活性片段的氨基酸序列；
(b)甲状旁腺素PTH1-34元件，该元件具有人甲状旁腺素PTH1-34或其活性片段的氨基酸序列；以及
(c)位于硫氧还蛋白元件和甲状旁腺素PTH1-34元件之间的连接肽序列，所述的连接肽含有6组氨酸标签序列和肠激酶酶切位点序列；
所述的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
2.一种分离的DNA分子，其特征在于，它编码权利要求1所述的融合蛋白。
3.如权利要求2所述的DNA分子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示。
4.一种载体，其特征在于，它含有权利要求2所述的DNA分子。
5.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求4所述的载体。
6.一种产生权利要求1所述的融合蛋白的方法，其特征在于，它包括步骤：
在适合表达所述融合蛋白的条件下，培养权利要求5所述的宿主细胞，从而表达出所述的融合蛋白；和分离所述的融合蛋白。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，还包括步骤：将分离的融合蛋白用肠激酶酶切，然后分离切下的甲状旁腺素PTH1-34。
8.权利要求1所述的融合蛋白的用途，其特征在于，用作制备甲状旁腺素PTH1-34的中间体。
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| 陈均勇等.重组人甲状旁腺激素(1-34)在大肠杆菌中的表达与纯化.南京大学学报(自然科学)40 1.2004,40(1),48-65页,具体参见[摘要,1材料与方法]. * |
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