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KR101364003B1 - 활성화된 제ｖｉｉ 인자 폴리펩타이드를 포함하는 밀폐용기와 이의 제조방법 및, 키트와 키트의 사용방법 - Google Patents

활성화된 제ｖｉｉ 인자 폴리펩타이드를 포함하는 밀폐용기와 이의 제조방법 및, 키트와 키트의 사용방법 Download PDF

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KR101364003B1
KR101364003B1 KR1020077026371A KR20077026371A KR101364003B1 KR 101364003 B1 KR101364003 B1 KR 101364003B1 KR 1020077026371 A KR1020077026371 A KR 1020077026371A KR 20077026371 A KR20077026371 A KR 20077026371A KR 101364003 B1 KR101364003 B1 KR 101364003B1
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factor
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안네 샤를로테 아렌트센
페르 케르스고르
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노보 노르디스크 헬스 케어 악티엔게젤샤프트
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Abstract

본 발명은 용기 용적 1 ㎖당 2.5 내지 90 mg 범위의 양으로 활성화된 제VII 인자 폴리펩타이드의 조성물을 담은 밀폐 용기에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 이러한 밀폐 용기의 여러가지 제조방법과, 이러한 용기를 포함하는 키트 및 키트를 사용하는 방법에 관한 것이기도 하다.
제VII 인자, 밀폐 용기, 키트, 다용량, 액체 조성물

Description

활성화된 제ＶＩＩ 인자 폴리펩타이드를 포함하는 밀폐 용기와 이의 제조방법 및, 키트와 키트의 사용방법{A CLOSED CONTAINER COMPRISING AN ACTIVATED FACTOR VII POLYPEPTIDE, PROCESSES FOR THE PREPARATION OF THE SAME, AND A KIT AND A METHOD FOR USE OF THE KIT}
본 발명은 용기 용적 1 ㎖당 2.5 내지 90 mg 범위의 양의 활성화된 제VII 인자 폴리펩타이드의 조성물을 담은 밀폐 용기에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 용기의 여러가지 제조방법과, 이러한 용기를 포함하는 키트(kit) 및 키트를 사용하는 방법에 관한 것이다.
제VII 인자는 응고 캐스케이드에 관여하며, 각종 병리학적 증세를 치료하기 위한 유용한 치료제로 증명되었다. 따라서, 약학적으로 수용가능하고, 일정하며 예정된 임상적 효능을 가지는 활성화된 제VII 인자 폴리펩타이드를 포함하는 제형물에 대한 요구가 꾸준히 증가하고 있는 실정이다. 어떤 치료적 용도를 위해서는 활성화된 제VII 인자 폴리펩타이드를 상당히 다량, 예를 들면, 40 ㎍/체중kg 또는 그 이상의 양으로 투여하는 것이 요구된다.
현재 시중에서 판매중인, 재조합으로 제조된 제VII 인자 폴리펩타이드 조성 물 NovoSeven®(Novo Nordisk A/S, Denmark)은, 예를 들면 재조합 인간 제VIIa 인자 1.2 mg, NaCl 5.84 mg, CaCl2 2.94 mg, 2 H2O, GlyGly 2.64 mg, 폴리소베이트 80 0.14 mg, 및 마니톨 60.0 mg을 함유하는 바이얼(약 3.0 ㎖ 용기 용적)로서 제공된다. 이 제품은 사용하기 전에 주사용물(WFI) 2.0 ㎖을 타서 pH 5.5로 만들어, 약 0.6 mg/㎖의 제VII 인자 폴리펩타이드의 농축액을 생성한다.
활성화된 제VII 인자 폴리펩타이드(예를 들면 재조합으로 제조된 인간 제VIIa 인자)를 다량(예를 들면, 10-20 mg) 필요로 하는 치료적 용도를 위해서는, NovoSeven® 조성물과 같은 제형물을 활용하는 것이 불편할 수도 있는데, 이는 상당히 다량(예를 들면, 15-30 ㎖)을 전형적으로는 주사에 의해 투여하여야 하기 때문이다.
따라서, 정해진 용기 용적내에 상당한 다량의 제VII 인자 폴리펩타이드가 존재하여, 그 용적이 전형적으로는 주사에 의해 투여된 경우에 마지막 사용자에 대한 불편함을 최소화하는, 활성화된 제VII 인자 폴리펩타이드를 포함하는 액상 약학적 제품, 및 추후에 타서 쓰는 동결 건조된 약학적 제품에 대한 요구가 존재한다.
WO 03/055512 A1은 (i) 제VII 인자 폴리펩타이드; (ii) pH를 약 4.0 내지 약 8.0 범위로 유지하기 위해 적합한 제제; (iii) 칼슘 염, 마그네슘 염, 또는 이들의 혼합물 중에서 선택되는 제제를 포함하고, (iii)의 농도는 적어도 15 mM인 액체 수성 조성물을 개시하고 있다. 국제출원서에 개시된 발명은 다양한 농도 범위의 제VII 인자 폴리펩타이드를 활용할 수 있는 것으로 보이며, 상기 다양한 농도 범위에 는 약 0.1 mg/㎖ 내지 약 10 mg/㎖ 범위가 포함된다.
WO 2004/000347 A1은 물에 용해되었을 때, 5.0 내지 7.0 범위의 pH에서 제VII 인자 폴리펩타이드 (0.6 내지 10 mg/㎖), 칼슘 클로라이드 (5 내지 20 mM), NaCl (0-50 mM), 글리실클리신(glycylclycine) (0-15 mM), L-히스티딘 (0-20 mM), 마니톨 (20-40 mg/㎖), 수크로스 (5-20 mg/㎖), 메싸이오닌 (0-1 mg/㎖), 폴록사머 188 (0.5-3 mg/㎖)을 포함하는 조성물을 개시하고 있다.
WO 2004/082708 A1은 제VII 인자 폴리펩타이드 (0.1-10 mg/㎖) 및 pH를 약 5.0 내지 9.0 범위로 유지하기 위해 적합한 완충제를 포함하는 액체 수성 약학적 조성물을 개시하는데, 여기에서 복합체화되지 않은 칼슘 이온 (Ca2+) 대 제VII 인자 폴리펩타이드의 몰비는 0.5보다 작다.
WO 2004/112828 A1은 (i)제VII 인자 폴리펩타이드; (ii) pH를 약 4.0 내지 약 8.0 범위로 유지하기 위해 적합한 제제; (iii) 15 mM 미만의 농도인, 칼슘 염, 마그네슘 염, 또는 이들의 혼합물 중에서 선택된 제제; 및 (iv) 이온 강도 변형제를 포함하는 액체 수성 조성물을 개시하는데, 여기에서 조성물의 이온 강도는 적어도 200 mM이다. 국제출원서에 개시된 발명은 다양한 농도 범위에서 제VII 인자 폴리펩타이드를 적용할 수 있는 것으로 보이는데, 상기 다양한 농도 범위에는 약 0.1 mg/㎖ 내지 약 10 mg/㎖ 범위가 포함된다.
WO 2005/016365 A1은 (i) 적어도 0.01 mg/㎖의 제VII 인자 폴리펩타이드; (ii) pH를 약 5.0 내지 약 9.0 범위로 유지하기 위해 적합한 완충제; 및 (iii)- C(=N-Z1-R1)-NH-Z2-R2 모티프를 포함하는 적어도 하나의 안정화제(예를들면, 벤즈아미딘 또는 아르지닌)를 포함하는 액체 수성 약학적 조성물을 개시한다. 국제출원서에 개시된 발명은 다양한 농도 범위의 제VII 인자 폴리펩타이드를 활용할 수 있는 것으로 보이며, 상기 다양한 농도 범위에는 0.01-20 mg/㎖ 범위가 포함된다.
선출원된 출원서에서 다수의 출원인들이 제VII 인자 폴리펩타이드의 수용액을 비교적 넓은 농도 범위에서 활용하기 위한 선택사항을 포함시키고 있지만, 이들의 실제 실시예는 이러한 농도 범위 위의 영역에서 시험된 바 없으며, 선행하는 특허 중 어느 것도 상당한 다량의 활성화된 제VII 인자 폴리펩타이드를 포함하는 밀폐 용기를 기술하거나 제안한 적이 없다. 이러한 것은, 활성화된 제VII 인자 폴리펩타이드의 자체촉매작용적 파괴를 감소시킬 목적으로 수행되는 일반적인 측정과는 관계 없이, 제VII 인자 폴리펩타이드의 파괴 정도, 구체적으로는 중쇄 파괴 정도가 제VII 인자 폴리펩타이드 농도가 증가됨에 따라 현저히 증가하기 때문이고, 이러한 높은 파괴 정도는 치료적 용도로는 받아들일 수 없는 산물을 생성시키기 때문인 것으로 일반적으로 이해되고 있다.
또한, 기존의 시판되는 제품이 비교적 다량의 칼슘을 함유하고 있다는 점은 다량의 활성 성분(제VII 인자 폴리펩타이드)이 특정 증세의 치료를 위해서 필요한 경우에 문제를 일으킬 수 있는 것으로 생각된다. 이에 따라 칼슘이 다량 존재하면 고농도의 제VII 인자 폴리펩타이드가 적은 용적으로 존재해야만 한다.
용기의 단위 용적당 고함량의 활성화된 제VII 인자 폴리펩타이드를 함유하는 밀폐 용기를 수득하기 위해서는, 용기에 채워질 수 있는 정제되고 활성화된 제VII 인자 폴리펩타이드의 고농축 벌크(bulk)가 요구된다. 본원 이전에, 이것은 활성화된 제VII 인자 폴리펩타이드가 자가단백질분해 활성을 갖는 세린 프로테아제이기 때문에, 즉 단백질이 자기 스스로 자신의 파괴를 촉매하기 때문에 난관이 있거나 심지어는 불가능한 것이었다(참조: 예를 들면, "The Use of RP-HPLC for measuring activation and cleavage of rFVIIa during purification" by I. Mollerup et al., Biotechnol. Bioeng., vol. 48 (1995), 501-505 및 "Studies on coagulation factor VIIa autoproteolysis and formation of degradation products" by T. B. Hansen et al., poster presented at ACS (2003)). 파괴는 Lys38, Arg290 및 Arg135의 C-말단의 절단에 의해 유발된다. 절단되면 단백질은 이의 지혈기능을 잃어버려서, 치료적 효능을 상실한다. 파괴속도는 활성화된 제VII 인자 폴리펩타이드의 농도에 대한 비율을 2차식으로서 나타낸 것인데, 다음과 같다:
-d[FVIIa]/dt = k[FVIIa]2
여기에서, [FVIIa]는 활성화된 제VII 인자 폴리펩타이드의 농도이다.
상기 식은 활성화된 제VII 인자 폴리펩타이드가 예를 들어 10배로 농축된다면, 파괴 속도는 100배 증가할 것으로 예상된다는 의미이다.
활성화된 제VII 인자 폴리펩타이드를 농축시키는 것의 또다른 난관은 용해도인데, 이것은 활성화된 제VII 인자 폴리펩타이드가 임의의 소정의 완충액 중에서 특정한 농도에 이르면 침전되기 시작할 것이라는 의미이다.
발명의 간단한 설명
본 발명자는 자체촉매작용적 파괴의 정도, 구체적으로는 활성화된 제VII 인자 폴리펩타이드의 중쇄 파괴를 적당한 조건을 선택함으로써 억제할 수 있고, 파괴 정도도 예측되는 것보다 낮은 점에서, 적절한 다량의 활성화된 제VII 인자 폴리펩타이드를 갖는 편리한 약학적 제품(예를 들면, 바이얼(vial), 카풀(carpule) 등)을 제조할 수 있는 것이 실질적으로 가능함을 놀랍게도 발견하였다.
그러므로, 본 발명의 제 1 측면은 활성화된 제VII 인자 폴리펩타이드(i)의 조성물을 담은 밀폐 용기에 관한 것이고, 이 용기는 용기 용적 1 ㎖당 2.5 내지 90 mg 범위의 활성화된 제VII 인자 폴리펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 제 2 측면은 활성화된 제VII 인자 폴리펩타이드를 포함하는 밀폐 용기의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 제 3 측면은 활성화된 제VII 인자 폴리펩타이드의 고체 약학적 조성물을 함유하는 제 1 밀폐 용기(i)와, 고체 약학적 조성물에 대한 액체 수성 용매를 함유하는 제 2 용기(ii)를 포함하는 키트에 관한 것이고, 여기에서 제 1 용기는 제 1 용기 용적 1 ㎖당 2.5 내지 90 mg 범위의 활성화된 제VII 인자 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 담은 것이다.
본 발명의 제 4 측면은, 본원에서 정의된 바와 같은 키트로부터의 활성화된 제VII 인자 폴리펩타이드의 즉석(ready-to-use) 액체 수성 약학적 조성물의 제조방법에 관한 것이고, 이 방법은, 활성화된 제VII 인자 폴리펩타이드의 즉석 액체 수성 약학적 조성물을 형성하도록, 제 1 용기의 고체 약학적 조성물을 제 2 용기의 액체 수성 용매의 적어도 일 분획과 혼합하는 것을 포함하는 것을 특징으로 한다.
도 1은 FVIIa 농도(mg/㎖)의 함수로서의 광학밀도 OD600을 도시한다.
상기 언급한 바와 같이, 본 발명은 활성화된 제VII 인자 폴리펩타이드(i)의 조성물을 담은 밀폐 용기를 제공하는데, 이 용기는 용기 용적 1 ㎖당 활성화된 제VII 인자 폴리펩타이드를 2.5 내지 90 mg 범위로 포함하는 것을 특징으로 한다.
"밀폐"라는 용어는 용기의 내용물이 외부와 분리된다는 뜻이다. 따라서, 용기는 전형적으로는 용기의 내용물과 접하기 전에 밀봉을 파괴해야 하거나 캡을 제거해야 하는 방식으로 구성된다. 바람직한 양태에서, 용기는 물이나 가스가 새지 않는데, 예를 들면, 용기는 공기가 통하지 않아 공기나 수분이 용기 내부로 들어갈 수 없어서, 내용물의 파괴를 유발할 수 없다. 용기내 빈 공간은 불활성 기체로 채워질 수 있다. 불활성 기체는 질소, 아르곤 등으로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
용기(예를 들면, 바이얼, 카풀 또는 카트리지(예컨대 펜 도구에 사용하기 위한 카풀이나 카트리지와 같은 것))는 전형적으로는 유리나 플라스틱, 구체적으로는 유리로 만들어지지만, 임의로는 고무 격벽이나 다른 밀폐 수단으로 밀폐되어, 약학적 조성물 전체를 보존하면서 침투를 허용하지 않는다. 일 양태에서, 용기는 밀봉된 봉투, 예컨대 밀봉된 플라스틱 봉투, 예를 들자면 라미네이팅된 것(예를 들면 금속(알루미늄과 같은 것) 라미네이팅된 플라스틱 봉투)에 담긴 바이얼, 카풀 또는 카트리지이다. 효과적인 변형으로서, 용기는 실리카 코팅된 유리, 실리콘 코팅된 유리, 비(non)사이클릭 올레핀의 중합체, 사이클로올레핀 중합체, 및 사이클로올레핀/선형 올레핀 공중합체에서 선택된 내벽 물질을 가지며, 이에 대해서는, 본 출원보다 앞선 본 출원인의 출원 WO 2004/103398에 개시되어 있다.
본원에 사용된 "제품"이라는 용어는 활성화된 제VII 인자 폴리펩타이드의 조성물을 포함하는 용기를 말하는 것인데, 즉, "제품"이라는 용어는 전형적으로는, 활성화된 제VII 인자 폴리펩타이드의 조성물을 담은 시판되는 제품, 예컨대, 바이얼, 카풀 또는 카트리지이다.
"조성물"이라는 용어는 활성화된 제VII 인자 폴리펩타이드 및 임의로는 하나 이상의 첨가제, 예를 들면, 완충액, 안정화제, 삼투성 변형제(tonicity modifying agent) 등(하기 참조)을 포함하는 고체 또는 액체 혼합물을 말한다.
활성화된 제VII 인자 폴리펩타이드는 하기에서 추가로 정의하는 것과 동일한 의미이다.
"용기 용적 ㎖"이라는 용어는 밀리미터(㎖)로서 표현되는, 해당 용기의 내부 용적, 즉 제VII 인자 폴리펩타이드가 존재하는 용기내 내부공간의 용적을 의미하는 것이다. 밀폐(예를 들면, 밀봉된) 용기의 용적은 해당 밀폐된 빈 용기의 빈 공간의 용적으로서 정확히 정의될 수 있는데, 즉 용기 용적은 마개, 밀봉 등이 차지하지 않는 부분을 말한다. 예를 들면, 시판중인, 재조합으로 제조된 제VII 인자 폴리펩타이드 조성물인 NovoSeven?(Novo Nordisk A/S, Denmark)은 3가지의 상이한 크기의 바이얼로 제공되는데, 각각 (i) 4.3 ㎖ ± 0.5 ㎖의 용적, (ii) 7.1 ㎖ ±0.5 ㎖의 용적, (iii) 13.5 ㎖ ± 1.0 ㎖의 용적이 그것이다. 이러한 바이얼에서, 마개는 용기 용적 중 0.44 ㎖를 차지하므로, 이에 따라 해당 밀폐된 빈 용기의 빈 공간은 각각 (i) 3.86 ㎖ ± 0.5 ㎖, (ii) 6.66 ㎖ ± 0.5 ㎖, 및 (iii) 13.06 ㎖ ± 1.0 ㎖이 된다.
용기는 일반적으로는 용기 용적 1 ㎖당 2.5 내지 90 mg 범위, 예를 들면, 2.5 내지 75 mg 범위 또는 4 내지 90 mg 범위의 활성화된 제VII 인자 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 양태에서, 용기는 용적 1 ㎖당 4-60 mg, 예컨대 용적 1 ㎖당 4-50 mg, 또는 용적 1 ㎖당 5-25 mg, 또는 용적 1 ㎖당 6-15 mg을 포함한다. 다른 양태에서, 용기는 용적 1 ㎖당 2.5-60 mg, 예컨대 용적 1 ㎖당 2.5-50 mg, 또는 용적 1 ㎖당 2.5-40 mg, 또는 용적 1 ㎖당 2.5-30 mg을 포함한다. 일부 치료적 용도를 위해서는, 용기는 용적 1 ㎖당 4-15 mg, 또는 용적 1 ㎖당 6-40 mg, 또는 용적 1 ㎖당 10-30 mg 또는 용적 1 ㎖당 25-60 mg을 포함할 수 있다.
활성화된 제VII 인자 폴리펩타이드의 조성물은 용해된 형태, 예를 들면, 수용액 또는 현탁액일 수 있거나, 아니면 건조된 형태, 예를 들면 동결건조된 형태일 수 있다.
용해된 형태의 조성물
일 양태에서, 활성화된 제VII 인자 폴리펩타이드는 용해된 형태, 예를 들면, 수용액 형태이다. 바람직하게는 활성화된 제VII 인자 폴리펩타이드의 수용액은 액체 약학적 조성물, 구체적으로는 활성화된 제VII 인자 폴리펩타이드의 즉석 약학적 조성물이다.
"수용액"이라는 용어는, 주로 물로 구성된, 즉 유기 용매는 조성물의 최대 5%, 구체적으로는 최대 2%를 구성하는 용매에, 활성화된 제VII 인자 폴리펩타이드가 용해되어 있는 것을 의미한다.
인간과 같은 포유류에 직접 비경구로 투여하기에 유용한 수용액으로 만들기 위해서는, 조성물의 pH값을 적당한 한계치, 예컨대 약 5.0 내지 약 9.0으로 유지하는 것이 보통 요구된다. 소정의 조건 하에서 적당한 pH값을 부여하기 위해서는, 약학적 조성물은 전형적으로는 pH를 약 5.0 내지 약 9.0 범위로 유지하기 위해 적합한 완충제(ii)를 포함한다. 보관 및 취급 동안에 수용액을 더욱 안정하게 할 목적으로는, 용액의 pH는 바람직하게는 5.0 내지 7.0 범위이다. 바람직하게는, pH는 5.8 내지 6.5 범위, 또는 5.5 내지 6.2 범위, 더욱 바람직하게는 5.8 내지 6.2 범위이다.
"완충제"라는 용어는 용액의 pH를 약 5.0 내지 약 9.0의 수용가능한 범위, 구체적으로 약 5.0 내지 약 6.5, 예컨대 5.8 내지 6.5 또는 5.5 내지 6.2 범위, 특히 5.8 내지 6.2 범위로 유지하는 제제 또는 이러한 제제의 배합물을 포함하는 것이다. 일 양태에서, 조성물의 pH는 약 5.0 내지 약 6.5, 약 5.0 내지 약 6.0, 약 5.5 내지 약 6.5, 약 6.2 내지 약 6.5, 또는 약 5.7 내지 약 6.2, 또는 약 5.2 내지 약 5.7로 유지된다.
일 양태에서, 완충제(ii)는 MES, PIPES, ACES, BES, TES, HEPES, TRIS, 히스티딘, 이미다졸, 글리신, 글리실글리신, 글리신아미드, 인산, 아세트산(예를 들면, 소듐 또는 칼슘 아세테이트), 락트산, 글루타르산, 시트르산, 타타르산, 말산, 말레산, 및 석신산의 산 및 염으로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 하나의 성분이다. 혼합물이 특정한 범위로 pH 값을 제공할 수 있는 것이면, 완충제는 둘 이상의 성분의 혼합물을 포함할 수 있는 것으로 이해하여야 한다. 예를 들면, 아세트산 및 소듐 아세테이트 등을 언급할 수 있겠다.
완충제의 농도는 용액의 바람직한 pH를 유지하기 위해 선택된다. 다양한 양태에서, 완충제의 농도는 1-100 mM 범위, 1-50 mM 범위, 1-25 mM 범위, 또는 2-20 mM 범위이다.
3가지 필수 성분(제VII 인자 폴리펩타이드, 용매, 완충제)외에도, 액체 수성 약학적 조성물은 조성물의 제조, 제형화, 안정화, 또는 투여에 유익한 추가의 성분을 포함할 수 있다.
수용액의 안정도를 개선시키기 위하여, 수용액은 또한 하기 (iiia) 내지 (iiic)를 포함하는 하나 이상의 안정화제(iii)를 포함할 수 있다: 예를 들면, 칼슘 염 및 마그네슘염에서 선택된 하나 이상의 안정화제(iiia), 및/또는 산화상태 +II가의 제1계열 전이금속(아연 제외)으로 구성된 군 중에서 선택되는, 하나 이상의 2가 제1계열 전이금속형 안정화제(iiib); 및/또는 -C(=N-Z1-R1)-NH-Z2-R2 모티프를 포함하는 하나 이상의 안정화제(iiic); 이때 Z1 및 Z2는 독립적으로 -O-, -S-, -NRH-, 및 단일 결합으로 구성되는 군에서 선택되며, 여기에서 RH는 수소, C1 -4 -알킬, 아릴 및 아릴메틸로 구성되는 군 중에서 선택되며, R1 및 R2는 독립적으로 수소, 임의로는 치환된 C1 -6-알킬, 임의로는 치환된 C2 -6-알케닐, 임의로는 치환된 아릴, 임의로는 치환된 헤테로사이클릴로 구성되는 군 중에서 선택되거나, 또는 Z2 및 R2는 상기 정의된 바와 같고 -C=N-Z1-R1은 헤테로사이클릭 고리의 일부를 형성하거나, Z1 및 R1은 상기 정의된 바와 같고 -C-NH-Z2-R2는 헤테로사이클릭 고리의 일부를 형성하거나, 또는s-C(=N-Z1-R1)-NH-Z2-R2 는 헤테로사이클릭 고리를 형성하는데, 여기에서, Z1-R1-R2-Z2는 2가 라디칼이다.
칼슘 염 및 마그네슘 염( iiia )
일 양태에서, 안정화제는 칼슘 염 및 마그네슘 염으로부터 선택된 적어도 하나의 제제, 구체적으로는 칼슘 염을 포함한다.
칼슘 염의 예는 칼슘 클로라이드, 칼슘 아세테이트, 칼슘 글루코네이트(gluconate), 칼슘 라에불레이트(laevulate), 또는 이들의 혼합물이 있다.
마그네슘 염의 예는 마그네슘 클로라이드, 마그네슘 아세테이트, 마그네슘 설페이트, 마그네슘 글루코네이트, 마그네슘 라에불레이트, 강산의 마그네슘 염 또는 이들의 혼합물이 있다.
수용액 중의 (iiia)의 농도는 바람직하게는 적어도 15 mM, 예를 들면 적어도 25 mM, 예컨대 적어도 50 mM, 적어도 100 mM, 적어도 200 mM, 적어도 400 mM, 또는 적어도 800 mM이다.
바람직한 양태에서, 안정화제 (iiia)는 칼슘 클로라이드, 칼슘 아세테이트, 마그네슘 클로라이드, 마그네슘 아세테이트, 마그네슘 설페이트, 또는 이들의 혼합물 중에서 선택되고; 이온 강도 변형제 (iv)는 소듐 클로라이드 또는 소듐 클로라이드와 적어도 하나의 부가적인 이온 강도 변형제(하기 추가로 참조)의 혼합물 중에서 선택된다.
2가의 제1계열 전이금속형 안정화제 ( iiib )
다른 양태에서, 안정화제(iii)는 적어도 하나의 금속 함유 제제(iiib)를 포함하는데, 상기 금속은 산화수 +II가의 제1계열 전이금속으로 구성되는 군에서 선택된다.
본원에 사용된 "산화수 +II가의 제1계열 전이금속"이라는 용어는 타이타늄, 바나듐, 크로뮴, 망가니즈, 철, 코발트, 니켈 및 구리를 포함하는 것이다.
수성 환경에서 타이타늄 및 바나듐이 산화수 +II가로 존재할 수는 있지만, 크로뮴, 망가니즈, 철, 코발트, 니켈 및 구리 중에서 금속을 선택하는 것이 더욱 전형적이다. 이러한 금속에 상응하는 금속 함유 제제(iiib)의 상세한 예로는 크로뮴(II) 클로라이드, 망가니즈(II) 클로라이드, 철(II) 클로라이드, 코발트(II) 클로라이드, 니켈(II) 클로라이드, 및 구리(II) 클로라이드가 있다. 금속 함유 제제(iiib)는 둘 이상의 금속, 예를 들면, 둘 이상의 제1계열 전이금속을 포함할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 따라서 일부 예에서, 상기 언급한 제제 중 둘 이상이 배합되어 사용될 수 있다.
현재까지는, 가장 장래성 있는 금속은 구리 및 망가니즈이다. 상응하는 금속 함유 제제(iiib)의 상세한 예는 구리(II) 클로라이드 및 망가니즈(II) 클로라이드이다.
금속 함유 제제(또는 제제들)(iiib)의 농도는 전형적으로는 적어도 1 μM이다. 바람직한 (또는 필요한) 농도는 전형적으로는 선택된 금속 함유 제제(또는 제제들)에 따라, 더욱 구체적으로는 제VII 인자 폴리펩타이드에 대한 산화수 +II의 선택된 금속의 결합 친화도에 따라 달라진다.
다른 양태에서, 금속 함유 제제(iiib)는 적어도 5 μM, 적어도 25 μM, 적어도 50 μM, 적어도 100 μM, 적어도 200 μM, 적어도 400 μM, 적어도 500 μM, 적어도 800 μM, 적어도 900 μM, 적어도 1000 μM, 적어도 5 mM, 적어도 25 mM, 적어도 50 mM, 적어도 100 mM, 적어도 200 mM, 적어도 400 mM, 적어도 800 mM, 적어도 900 mM, 또는 적어도 1000 mM의 농도로 존재한다.
여러가지 양태에서, 금속 함유 제제(iii)(Me2+) 대 제VII 인자 폴리펩타이드(제제 (iiib) : 제VII 인자)의 몰비는 0.5 이상; 1 이상; 2 이상; 4 이상; 5 이상; 10 이상; 25 이상; 100 이상; 150 이상; 예를 들면 0.5-250 범위, 예컨대 0.5-150, 0.5-100; 0.5-25; 1-250; 1-100; 1-25; 1-10 범위이다.
구체적인 양태에서, 금속 함유 제제(iiib)의 금속은 구리이고, 상기 제제의 농도는 적어도 5 μM, 예컨대 적어도 10 μM, 또는 적어도 15 μM이다.
다른 구체적인 양태에서, 금속 함유 제제(iiib)의 금속은 망가니즈이고, 상기 제제의 농도는 적어도 100 μM, 예컨대 적어도 500 μM, 또는 적어도 1 mM이다.
벤즈아미딘 / 아르지닌형 안정화제( iiic )
다른 양태에서, 안정화제는 -C(=N-Z1-R1)-NH-Z2-R2 모티프를 포함하는 적어도 하나의 안정화제(iiic)를 포함하는데, 여기에서 Z1 및 Z2는 독립적으로 -O-, -S-, -NRH-및 단일 결합으로 구성되는 군 중에서 선택되며, RH는 수소, C1 -4-알킬, 아릴 및 아릴메틸로 구성되는 군 중에서 선택되며, R1 및 R2는 독립적으로 수소, 임의로는 치환된 C1 -6 알킬, 임의로는 치환된 C2 -6-알케닐, 임의로는 치환된 아릴, 임의로는 치환된 헤테로사이클릴로 구성되는 군에서 선택되거나, 또는 Z2 및 R2는 상기 정의된 바와 같고 -C=N-Z1-R1는 헤테로사이클릭 고리의 일부를 형성하거나, 또는 Z1 및 R1는 상기 정의된 바와 같고 -C-NH-Z2-R2는 헤테로사이클릭 고리의 일부를 형성하거나, 또는 -C(=N-Z1-R1)-NH-Z2-R2는 헤테로사이클릭 고리를 형성하는데, 여기에서 -Z1-R1-R2-Z2-는 2가 라디칼이다.
"C1 -6-알킬"이라는 용어는 비고리형(acyclic) 또는 고리형 포화 탄화수소 잔기를 포함하고자 하는 것이며, 상기 탄화수소 잔기는 1-6개의 탄소 원자를 갖는 것이고, 선형이거나 분지형일 수 있다. 구체적인 예는 메틸, 에틸, n-프로필, 아이소프로필, 사이클로프로필, n-부틸, 아이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, 사이클로프로필메틸, n-펜틸, 아이소펜틸, n-헥실 등이 있다. 마찬가지로, "C1 -4-알킬"이라는 용어는 비고리형 또는 고리형 포화 탄화수소 잔기를 포함하는 것으로서 상기 탄화수소 잔기는 1-4개 탄소 원자를 갖는 것이고, 선형이거나 분지형일 수 있다.
마찬가지로, "C2 -6-알케닐"이라는 용어는 비고리형 또는 고리형 탄화수소 잔기를 포함하는 것이고, 상기 탄화수소 잔기는 2-6개의 탄소 원자를 갖는 것이고, 하나의 불포화 결합을 포함하는 것으로서, 선형이거나 분지형일 수 있다. C2 -6-알케닐기의 예에는 비닐, 알릴, 부트-1-엔-1-일(but-1-en-1-yl), 부트-2-엔-1-일(but-2-en-1-yl), 펜트-1-엔-1-일(pent-1-en-1-yl), 및 헥스-1-엔-1-일(hex-1-en-1-yl)이 있다.
C1 -6-알킬 또는 C2 -6-알케닐기와 관련하여 "임의로는 치환된"이라는 용어는 해당 작용기가 1회 또는 수회, 바람직하게는 1-3회, 하이드록시, C1 -6-알콕시(즉, C1 -6-알킬-옥시), C2 -6-알케닐옥시, 옥소(케토 또는 알데하이드 작용기를 형성하는 것), 아릴, 아릴옥시(aryloxy), 아릴카보닐(arylcarbonyl), 헤테로사이클릴(heterocyclyl), 헤테로사이클릴옥시(heterocyclyloxy), 헤테로사이클릴카보닐(heterocyclylcarbonyl), 아미노, 모노 및 디(C1-6-알킬)아미노, 할로겐으로 구성된 군에서 선택된 작용기(들)로 치환될 수 있는 것을 가리키는 것으로서, 여기에서 임의의 아릴 및 헤테로사이클릴은 임의로는 치환된 아릴 및 헤테로사이클릴에 대해 하기에서 구체적으로 기재되는 바와 같이 치환될 수 있는 것이다.
"할로겐"은 플루오로, 클로로, 브로모, 및 아이오도를 포함한다.
본원에 사용된 "아릴"이라는 용어는 완전한 또는 부분적인 방향족 카보사이클릭 고리 또는 고리 시스템을 말하며, 예컨대 페닐, 나프틸(naphthyl), 1,2,3,4-테트라하이드로나프틸(1,2,3,4-tetrahydronaphthyl), 안트라실(anthracyl), 페난트라실(phenanthracyl), 피레닐(pyrenyl), 벤조피레닐(benzopyrenyl), 플루오레닐(fluorenyl) 및 잔테닐(xanthenyl)이 있고, 그 중 페닐이 바람직한 예이다.
"헤테로사이클릴"이라는 용어는 포화된, 부분적으로 포화된, 부분적인 방향족 또는 완전한 방향족 카복실 고리 또는 고리 시스템을 말하며, 여기에서 하나 이상의 탄소 원자는 헤테로원자, 예를 들면, 질소(=N- 또는 -NH), 황(-S-), 및/또는 산소(-O-) 원자로 치환되어 있는 것을 말한다. 이러한 헤테로사이클릴기의 예에는 옥사졸릴(oxazolyl), 옥사졸리닐(oxazolinyl), 옥사졸리디닐(oxazolidinyl), 아이소옥사졸릴(isoxazolyl), 아이소옥사졸리닐(isoxazolinyl), 아이소자졸리디닐(isoxazolidinyl), 옥사다이아졸릴(oxadiazolyl), 옥사다이아졸리닐(oxadiazolinyl), 옥사다이아졸리디닐(oxadiazolidinyl), 티아졸릴(thiazolyl), 아이소티아졸릴(isothiazolyl), 피롤릴(pyrrolyl), 피롤리닐(pyrrolinyl), 피롤리디닐(pyrrolidinyl), 이미다졸릴(imidazolyl), 이미다졸리닐(imidazolinyl), 이미다졸리디닐(imidaxolidinyl), 피라졸릴(pyrazolyl), 피리디닐(pyridinyl), 피라지닐(pyrazinyl), 피라다지닐(pyridazinyl), 피페리디닐(piperidinyl), 카우마릴(coumaryl), 퓨릴(furyl), 퀴놀릴(quinolyl), 벤조티아졸릴(benzothiazolyl), 벤조트리아졸릴(benzotriazolyl), 벤조다이아졸릴(benzodiazolyl), 벤조조졸릴(benzoxozolyl), 다이아졸릴(diazolyl), 다이아졸리닐(diazolinyl), 다이아졸리디닐(diazolidinyl), 트리아졸릴(triazolyl), 트리아졸리닐(triazolinyl), 트리아졸리디닐(triazolidinyl), 테트라졸(tetrazol)등이 있다. 바람직한 헤테로사이클릴기는 5-, 6- 또는 7-개 구성원의 모노사이클릭기, 예컨대 아이소자졸릴, 아이소자졸리닐, 옥사다이아졸릴, 옥사다이아졸리닐, 피롤릴, 피롤리닐, 다이아졸릴, 다이아졸리닐, 트리아졸릴, 트리아졸리닐, 이미다졸릴, 이미다졸리닐 등이 있다.
"헤테로사이클릭 고리"라는 용어는 "헤테로사이클릴"에 대해 정의된 것에 상응하는 고리를 의미한다.
"아릴", "헤테로사이클릴" 및 "헤테로사이클릭 고리"라는 용어와 관련하여, "임의로는 치환된"이라는 용어는 해당 작용기가 1회 또는 수회, 바람직하게는 1-3회, 하이드록시(에놀 시스템에서 존재하는 경우에는 토토머(tautomer)인 케토 형태로 대표할 수 있는 것), C1 -6-알킬, C2 -6-알케닐, 페닐, 벤질, C1 -6-알콕시, 옥소(토토머인 에놀 형태로 대표할 수 있는 것), 카복시, C1 -6-알콕시카보닐, C1 -6-알킬카보닐, 아미노, 모노- 및 디(C1 -6-알킬)아미노, 다이할로겐-C1 -4-알킬, 트리할로겐-C1 -4-알킬, 및 할로겐으로 구성된 군에서 선택된 작용기(들)로 치환될 수 있는 것을 가리키는 것이다. 가장 전형적인 치환체의 예에는 하이드록실, C1 -4-알킬, 페닐, 벤질, C1 -4-알콕시, 옥소, 아미노, 모노- 및 다이메틸아미노 및 할로겐이다.
R1 및 R2가 독립적으로 수소, 임의로는 치환된 C1 -6-알킬, 임의로는 치환된 C2-6-알케닐, 임의로는 치환된 아릴, 임의로는 치환된 헤테로사이클릴으로 구성된 군에서 선택될 수 있다는 사실 외에도, -C(=N-Z1-R1)-NH-Z2-R2모티프의 일부는 헤테로사이클릭 고리의 일부일 수 있는 반면에, 모티프의 다른 일부는 각각 Z1, Z2, R1 및 R2에 대해 정의된 것과 동일한 의미를 가질 수도 있다. 일부 흥미로운 양태에서, -C=N-Z1-R1은 1,2-다이아졸(diazole) 고리, 아이소자졸(isoxazole) 고리, 1,2,4-트리아졸(triazole) 고리, 및 1,2,4-옥사다이아졸(oxadiazole) 고리로 구성된 군에서 선택된 헤테로사이클릭 고리의 일부를 형성할 수 있거나, 또는 -C-NH-Z2-R2는 1,2-다이아졸린(diaxoline) 고리, 아이소자졸린(isoxazoline) 고리, 1,2,4-트리아졸린(triazoline) 고리, 및 1,2,4-옥사다이아졸린(oxadiazoline) 고리로 구성된 군에서 선택된 헤테로사이클릭 고리의 일부를 형성할 수도 있다. 이러한 헤테로사이클릭 고리는 상기에 기술한 바와 같이 치환될 수 있다.
일부 양태에서, R1 및 R2 중 적어도 하나는 수소인데, 예를 들면, 모두다 수소이다. 또한, 일부 양태에서, 상기 언급한 양태와 조합될 수 있는 양태에서는, Z1 및 Z2 중 적어도 하나는 단일 결합인데, 예를 들면, 모두다 단일 결합이다. 특정한 양태에서, R1 및 R2는 모두 수소이며, Z1 및 Z2는 모두 단일 결합이다.
-C(=N-Z1-R1)-NH-Z2-R2 모티프는 안정화제(iiic)의 안정화 효과를 위해 특히 중요한 것으로 생각된다. 특히, -C(=N-Z1-R1)-NH-Z2-R2 모티프는 제VII 인자 폴리펩타이드에 대한 기질의 아르지닌 잔기를 흉내내는 것으로 생각된다.
더욱 구체적인 양태에서, 안정화제 (iiic)는 -C-C(=N-Z1-R1)-NH-Z2-R2 모티프를 포함하는 아미딘 화합물 및 >N-C(=N-Z1-R1)-NH-Z2-R2 모티프를 포함하는 구아니딘 화합물로 구성되는 군에서 선택된 적어도 하나이다.
일부 양태에서, 안정화제 (iiic)는 모티프 -C6H4-C(=N-Z1-R1)-NH-Z2-R2를 포함하는 벤즈아미딘으로 구성된 군에서 선택된 적어도 하나의 아미딘 화합물인데, 여기에서 C6H4는 임의로는 치환된 벤젠 고리를 나타내고, 이 중에서 벤즈아미딘(R1 및 R2는 수소이고, Z1 및 Z2는 단일 결합이다)은 구체적인 양태를 구성한다.
다른 구체적인 양태에서, 벤즈아미딘은 모티프 >N-C6H4-C(=N-Z1-R1)-NH-Z2-R2를 포함하는데, 여기에서 C6H4는 임의로는 치환된 벤젠 고리를 나타내며, 즉 ㅇ-아미노-벤즈아미딘, m-아미노-벤즈아미딘 또는 p-아미노-벤즈아미딘이며, p-아미노-벤즈아미딘, 예컨대 p-아미노-벤즈아미딘이 현재 가장 유망하다.
p-아미노-벤즈아미딘의 다른 상세한 예는, 아벤티스사에 의해 EP 1 162 194 Al에서 개시된 것이 있는데, 특히, 1-6항 및 섹션 [0009]-[0052]에서 규정된 것을 참조하면 되고, 또한 EP 1 270 551 Al에서 개시된 것은 특히 1 항과 2항 그리고 섹션[0010]-[0032]에서 규정된 것을 참조하면 된다.
다른 양태에서, 안정화제 (iiic)는 -CH2-NH-C(=N-Z1-R1)-NH-Z2-R2 모티프를 포함하는 구아니딘 화합물로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 하나의 구아니딘 화합물이다. 구아니딘 화합물의 예는 아르지닌, 아르지닌 유도체 및 적어도 하나의 아르지닌 잔기를 포함하는 2-5 아미노산 잔기의 펩타이드로 구성되는 군에서 선택되는 것들이다. 아르지닌은 구체적인 양태를 구성한다.
"아르지닌 유도체"라는 용어는 아르지닌 동족체, N-말단 작용화된 아르지닌(예를 들면, N-메틸화된 및 N-아실화된(예를 들면, 아세틸화된) 유도체), C-말단 작용화된 아르지닌(예를 들면, C-아미드화된, C-알킬아미드화된, 및 C-알킬화된 유도체), 및 이들의 배합물을 포함하는 용어이다.
상기에서도 언급하였듯이, 안정화제의 주요 모티프는 -C(=N-Z1-R1)-NH-Z2-R2이다. 안정화제의 다른 부분도 중요할 수 있는데, 특히 환자에 의한 안정화 효과 및 내성(tolerance)을 최적화하는 면에서 중요할 수 있다. 전형적으로는, 안정화제는 Y-C(=N-Z1-R1)-NH-Z2-R2식을 갖는데, 여기에서 Y는 유기 라디칼이다. 라디칼 Y는 전형적으로는 안정화제의 효능을 개선시키기 위하여 선택된다. 또한, 라디칼 Y는 화학식 -C(=N-Z1-R1)-NH-Z2-R2의 추가적인 모티프를 하나 이상 포함할 수 있다.
안정화제의 분자량은 전형적으로는 최대 1000 Da이고, 예컨대 최대 500 Da이다.
안정화제(또는 안정화제들)(iiic)의 농도는 전형적으로는 적어도 1 μM이다. 바람직한(또는 필요한)농도는 전형적으로는 선택된 안정화제(또는 안정화제들)에 따라, 더욱 구체적으로는 제VII 인자 폴리펩타이드에 대한 선택된 안정화제의 결합 친화도에 따라 달라진다.
다른 양태에서, 안정화제 (iiic)는 적어도 5 μM, 적어도 10 μM, 적어도 20 μM, 적어도 50 μM, 적어도 100 μM, 적어도 150 μM, 적어도 250 μM, 적어도 500 μM, 적어도 1 mM, 적어도 2 mM, 적어도 4 mM, 적어도 5 mM, 적어도 8 mM, 적어도 9 mM, 적어도 10 mM, 적어도 15 mM, 적어도 20 mM의 범위의 농도로 존재하며, 예컨대 20-2000 μM 범위, 50-5000 μM 범위, 0.1-10 mM 범위, 0.2-20 mM 범위, 또는 0.5-50 mM 범위의 농도로 존재한다.
여러가지 양태에서, 안정화제 (iii) 대 제VII 인자 폴리펩타이드(안정화제 (iiic) : FVII)의 몰비는: 0.1 이상, 0.5 이상, 1 이상, 2 이상, 5 이상, 10 이상, 25 이상, 100 이상, 250 이상, 1000 이상, 2500 이상, 또는 5000 이상, 예컨대, 예를 들면, 0.1-10000, 0.1-5000, 0.1-2500, 0.1-1000, 0.1-250, 0.1-100, 0.1-25, 0.1-10, 0.5-10000, 0.5-5000, 0.5-2500, 0.5-1000, 0.5-250, 0.5-100, 0.5-25, 0.5-10, 1-10000, 1-5000, 1-2500, 1-1000, 1-250, 1-100; 1-25; 1-10, 10-10000, 10-5000, 10-250, 1000-10000, 또는 1000-5000 범위이다.
일 양태에서, 안정화제 (iiic)는 벤즈아미딘이고, 상기 제제의 농도는 적어도 0.5 mM, 예컨대 적어도 2 mM이지만, 치환된 벤즈아미딘은 더 낮은 농도로 첨가될 수 있기 때문에 더욱 잠재성이 있을 것으로 예상된다.
일 양태에서, 안정화제 (iiic)는 아르지닌이고, 상기 제제의 농도는 적어도 2 mM, 예컨대 적어도 10 mM이다.
상기 언급한 안정화제 (iiia), (iiib) 및 (iiic)는 배합되어 사용될 수 있는 것으로 이해하여야 할 것이다.
기타 첨가제
또한, 조성물은 삼투성 변형제(v)를 추가로 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "삼투성 변형제"라는 용어는 용액의 삼투압에 기여하는 제제를 포함한다. 삼투성 변형제(v)는 중성 염, 아미노산, 2-5 아미노산 잔기의 펩타이드, 단당류, 이당류, 다당류, 및 당 알콜로 구성되는 군에서 선택된 적어도 하나의 제제를 포함한다. 일부 양태에서, 조성물은 이러한 제제를 배합하여 둘 이상 포함한다.
"중성 염"이라는 것은 수용액에 용해된 경우에 산도 염기도 아닌 염을 의미하는 것이다.
일 양태에서, 적어도 하나의 삼투성 변형제 (v)는 소듐 염, 포타슘 염, 칼슘 염, 및 마그네슘 염으로 구성된 군에서 선택된 중성 염이고, 예컨대 소듐 클로라이드, 포타슘 클로라이드, 칼슘 클로라이드, 칼슘 아세테이트, 칼슘 글루코네이트, 칼슘 라에불레이트, 마그네슘 클로라이드, 마그네슘 아세테이트, 마그네슘 글루코네이트, 및 마그네슘 라에불레이트로 구성된 군에서 선택된 중성 염이다.
다른 양태에서, 삼투성 변형제 (v)는 칼슘 클로라이드, 칼슘 아세테이트, 마그네슘 클로라이드 및 마그네슘 아세테이트로 구성된 군에서 선택된 적어도 하나와 배합된, 소듐 클로라이드를 포함한다.
또다른 양태에서, 삼투성 변형제 (v)는 소듐 클로라이드, 칼슘 클로라이드, 수크로스, 글루코스, 및 마니톨로 구성된 군에서 선택된 적어도 하나이다.
다른 양태에서, 삼투성 변형제 (v)는 적어도 1 mM, 적어도 5 mM, 적어도 10 mM, 적어도 20 mM, 적어도 50 mM, 적어도 100 mM, 적어도 200 mM, 적어도 400 mM, 적어도 800 mM, 적어도 1000 mM, 적어도 1200 mM, 적어도 1500 mM, 적어도 1800 mM, 적어도 2000 mM, 또는 적어도 2200 mM의 농도로 존재한다.
다른 일련의 양태에서, 삼투성 변형제 (v)는 5-2200 mM, 예컨대 25-2200 mM, 50-2200 mM, 100-2200 mM, 200-2200 mM, 400-2200 mM, 600-2200 mM, 800-2200 mM, 1000-2200 mM, 1200-2200 mM, 1400-2200 mM, 1600-2200 mM, 1800-2200 mM, 또는 2000-2200 mM; 5-1800 mM, 25-1800 mM, 50-1800 mM, 100-1800 mM, 200-1800 mM, 400-1800 mM, 600-1800 mM, 800-1800 mM, 1000-1800 mM, 1200-1800 mM, 1400-1800 mM, 1600-1800 mM; 5-1500 mM, 25-1400 mM, 50-1500 mM, 100-1500 mM, 200-1500 mM, 400-1500 mM, 600-1500 mM, 800-1500 mM, 1000-1500 mM, 1200-1500 mM; 5-1200 mM, 25-1200 mM, 50-1200 mM, 100-1200 mM, 200-1200 mM, 400-1200 mM, 600-1200 mM, 또는 800-1200 mM 범위의 농도로 존재한다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 적어도 하나의 삼투성 변형제 (v)는 이온 강도 변형제(iv)이다.
가장 바람직하게는, 본 발명의 용기내 조성물은 이온 강도 변형제 (iv)를 포함한다. 따라서, 수용액은 바람직하게는 하나 이상의 이온 강도 변형제(들) (iv) 뿐 아니라 이온 강도 변형제(들)이 아닌 하나 이상의 삼투성 변형제들 (v)을 포함한다.
본원에서 사용된 "이온 강도 변형제"는 용액의 이온 강도에 영향을 미치는 제제를 포함한다. 이 제제에는 중성 염, 아미노산, 2 내지 5 아미노산 잔기의 펩타이드가 포함되나 이에 국한되는 것은 아니다. 일부 양태에서, 조성물은 이러한 제제를 둘 이상 배합하여 포함한다.
이온 강도 변형제 (iv)의 바람직한 예는 중성염, 예컨대 소듐 클로라이드, 포타슘 클로라이드, 칼슘 클로라이드 및 마그네슘 클로라이드(후자의 두개는 "안정화제"(상기 참조))로서 추가로 간주될 수도 있다)가 있다. 바람직한 제제(iv)는 소듐 클로라이드이다.
"이온 강도"라는 용어는 화학식 μ=1/2 ∑([i](Zi 2))에 의해 정의되는 용액의 이온 강도(μ)로서, 여기에서 μ는 이온 강도이고, [i]는 이온의 밀리몰 농도이며, Zi는 이온의 전하(+ 전하 또는 - 전하)를 나타낸다(참조: 예를 들면 Solomon, Journal of Chemical Education, 78(12) : 1691-92, 2001; James Fritz and George Schenk: Quantitative Analytical Chemistry, 1979).
본 발명의 일 양태에서, 수용액의 이온 강도는 적어도 약 50 mM, 예컨대, 적어도 약 100 mM이다. 본 발명의 다른 양태에서, 수용액의 이온 강도는 적어도 200 mM, 예를 들면 적어도 400 mM, 예컨대 적어도 800 mM, 적어도 1000 mM, 적어도 1200 mM, 적어도 1500 mM, 적어도 1800 mM, 적어도 2000 mM, 또는 적어도 2200 mM이다. 이러한 양태의 특별한 변형으로서, 수용액내 안정화제(들) (iiia) (즉, 칼슘 몇 및 마그네슘 염)의 농도는 15 mM 이하이지만, 적어도 100 mM NaCl이 동시에 존재한다.
일부 특정한 양태에서, 삼투성 변형제 (v) 및 이온 강도 변형제 (iv)의 총 농도는 삼투성 및 이온 강도에 대해 임의의 기타 성분이 미칠 수 있는 영향에 따라, 1-500 mM 범위, 예컨대 1-300 mM 범위, 또는 10-200 mM 범위, 또는 20-150 mM 범위이다.
일 양태에서 조성물은 등장액이며, 다른 양태에서 조성물은 고장액이다.
"등장액"이라는 용어는 "혈청에 등장성"이라는 뜻인데, 즉, 약 300 ± 50 milliosmol/kg이라는 뜻이다. 삼투성이란 투여하기 전 용액의 삼투압의 정도를 의미한다. "고장액"이라는 용어는 생리학적 수준의 혈청보다 삼투압 수준이 더 높은 것을 의미하는데, 예컨대 300 ± 50 milliosmol/kg 이상의 수준을 말한다.
조성물은 비이온성 계면활성제도 포함할 수 있다. 계면활성제(또한 세제로도 알려져 있다)는 일반적으로는 공기/용액 계면 유발성 압력 및 용액/계면 유발성 압력(예를 들면, 단백질 응집을 초래하는 것)으로부터 단백질을 보호하는 제제를 포함한다.
전형적인 유형의 비이온성 계면활성제는 폴리소베이트(polysorbates), 폴록사머(poloxamers), 폴리에틸렌 알킬 에테르(polyoxyethylene alkyl ethers), 폴리에틸렌/폴리프로필렌 블록 공중합체(polyethylene/polypropylene block co-polymers), 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol, PEG), 폴리에틸렌 스테아레이트(polyxyethylene stearates) 및 폴리옥시에틸렌 캐스터 오일이 있다.
비이온성 계면활성제의 상세한 예는 트윈(Tween)®, 폴리소베이트 20(polysorbate 20), 폴리소베이트 80, Brij-35 (폴리옥시에틸렌 도데실 에테르), 폴록사머 188(poloxamer 188), 폴록사머 407, PEG8000, Pluronic® 폴리올, 폴리옥시-23-로릴 에테르, Myrj 49, 및 크레모포(Cremophor) A가 있다.
일 양태에서, 비이온성 계면활성제는 중량의 0.005-2.0% 양으로 존재한다.
다른 양태에서, 조성물은 항산화제(vi)를 추가로 포함한다. 다른 양태에서, 항산화제는 L-메싸이오닌, D- 메싸이오닌, 메싸이오닌 유사체, 메싸이오닌-함유 펩타이드, 메싸이오닌-동족체, 아스코브산, 시스테인, 호모시스테인, 글루타치온, 시스틴(cystine), 및 시스스타치오닌(cysstathionine)으로 구성되는 군에서 선택된다. 바람직한 양태에서, 항산화제는 L-메싸이오닌이다.
항산화제(vi)의 농도는 전형적으로는 0.1-5.0 mg/㎖ 범위, 예컨대 0.1-4.0 mg/㎖ 범위, 0.1-3.0 mg/㎖ 범위, 0.1-2.0 mg/㎖ 범위, 또는 0.5-2.0 mg/㎖ 범위이다.
구체적인 양태에서, 조성물은 항산화제를 포함하지 않고; 대신에 제VII 인자 폴리펩타이드의 산화에 대한 취약성은 대기중 공기를 배제시킴으로써 제어한다. 항산화제의 사용은 또한 대기중 공기의 배제와 함께 조합하여 사용할 수도 있는 것이다.
본 발명의 용기에 사용하기에 유용한 적당한 수용액은 바람직하게는 5 mg/㎖ 이상, 또는 6 mg/㎖ 이상, 예컨대 7 mg/㎖ 이상, 또는 8 mg/㎖ 이상, 또는 9 mg/㎖ 이상, 또는 10 mg/㎖ 이상의 활성화된 제VII 인자 폴리펩타이드의 농도를 가지는 것으로 생각된다.
용기내에 담긴 용해된 조성물은 바람직하게는 활성화된 제VII 인자 폴리펩타이드가 본원에서 정의된 바와 같이 "안정한" 것이다.
밀폐 용기의 여러가지 양태는 다음과 같이 구체적으로 유리한 것으로 보여지는데, 그 양태들은 예를 들면 (i) 내지 (iv)와 같다:
(i) 수용액은
용기 용적 1 ㎖당 적어도 2.5 mg의 활성화된 제VII 인자 폴리펩타이드(i)
pH를 약 5.0 내지 약 6.5 범위로 유지하기 위해 적합한 완충제(ii)
를 포함하고, 상기 수용액의 이온 강도는 적어도 50 mM인 것을 특징으로 하는 본원에서 규정된 바와 같은 용기.
(ii) 수용액은
용기 용적 1 ㎖당 적어도 2.5 mg의 활성화된 제VII 인자 폴리펩타이드(i)
pH를 약 5.0 내지 약 6.5 범위로 유지하기 위해 적합한 완충제(ii)
적어도 15 mM 범위의 농도의 칼슘 염에서 선택된 적어도 하나의 안정화제(iiia)
를 포함하고, 상기 수용액의 이온 강도는 적어도 50 mM인 것을 특징으로 하는 본원에서 규정된 바와 같은 용기.
(iii) 수용액은
용기 용적 1 ㎖당 적어도 2.5 mg의 활성화된 제VII 인자 폴리펩타이드(i)
pH를 5.0 내지 약 6.5 범위로 유지하기 위해 적합한 완충제(ii)
적어도 하나의 2가 제1계열 전이금속형 안정화제(iiib)
를 포함하고, 상기 안정화제(iiib) 대 FVII 폴리펩타이드의 몰비는 0.5 이상이며, 상기 수용액의 이온 강도는 적어도 50 mM인 것을 특징으로 하는 본원에서 규정된 바와 같은 용기.
(iv) 수용액은
용기 용적 1 ㎖당 적어도 2.5 mg의 활성화된 제VII 인자 폴리펩타이드(i)
pH를 5.0 내지 약 6.5 범위로 유지하기 위해 적합한 완충제(ii)
적어도 하나의 벤즈아미딘/아르지닌형의 안정화제(iiic)
를 포함하고, 상기 안정화제(iiic) 대 FVII 폴리펩타이드의 몰비는 0.1 이상이며, 상기 수용액의 이온 강도는 적어도 50 mM인 것을 특징으로 하는 본원에서 규정된 바와 같은 용기.
건조된 형태의 조성물
다른 양태에서, 조성물은 건조된 형태인데, 특히 조성물은 약 3% 이하의 수분 함량을 가진다. 바람직하게는, 조성물은 동결건조된 형태이다.
동결 건조 과정에서의 파괴 및 전단력에 견딜 수 있게 조성물을 안정화하기 위해서는, 적어도 하나의 안정화제, 구체적으로는 하기 a) 내지 e)로 구성된 군 중에서 선택된 적어도 하나의 안정화제를 포함하는 것이 유리하다: a) 항산화제와 마니톨의 배합물; b) 메싸이오닌과 폴리올의 배합물; c) 당류와 마니톨의 배합물; d) 수크로스와 폴리올의 배합물; 및 e) 메싸이오닌.
활성화된 제VII 인자 폴리펩타이드의 동결건조 조성물의 안정화에 대해서는 본원에 참조로서 인용되는 WO 2004/000347에 추가로 상세히 기술되어 있다.
제품을 사용하기 전에, 동결건조 조성물은 해당되는 치료적 용도를 위해 유용한 액체, 전형적으로는 수성 완충액에 타서 사용한다. 이러한 수성 완충액은 수성 용매, 완충액(ii), 하나 이상의 안정화제(iii), 하나 이상의 삼투성 변형제(v), 하나 이상의 이온 강도 변형제(iv), 항산화제(vi) 등 상기 기술한 것들을 포함할 수 있다.
구체적으로는, 용기(이의 "건조형" 조성물을 함유하는 용기)는 조성물에 수용액을 탄 후에 상기 정의한 바와 같은 용기를 생성하게 된다.
용기내에 담긴 건조형 조성물은 바람직하게는 활성화된 제VII 인자 폴리펩타이드가 본원에서 정의된 바와 같이 "안정한" 것이다.
활성화된 제 VII 인자 폴리펩타이드의 조성물을 담은 용기의 제조
본 발명의 밀폐 용기는 여러가지 방법으로 제조할 수 있고, 하기를 보면 이는 명백해질 것이다. 전형적으로는, 밀폐 용기의 제조방법은 하기의 (i) 내지 (iv) 단계를 포함한다: (i) 활성화된 제VII 인자 폴리펩타이드를 농축된 형태로 만드는 단계; (ii) 적당한 용기가 존재하지 않는 경우, 용기가 용기 용적 1 ㎖당 2.5 내지 90 mg 범위의 활성화된 제VII 인자 폴리펩타이드를 포함하도록, 농축된 제VII 인자 폴리펩타이드의 적어도 일부(전형적으로는 용액 형태이다)를 용기내로 담는 단계; (iii) 임의로는 농축된 제VII 인자 폴리펩타이드를 동결건조하는 단계; 및 (iv) 밀폐 용기로 제공될 수 있도록 용기를 밀봉하는 단계.
(i)에 관해
제VII 인자 폴리펩타이드의 농축액을 수득하기 위한 적당한 여러가지 방법의 예들은 하기에 추가로 기술한다.
( ii )에 관해
적당한 용기가 존재하지 않는 경우, 용기가 용기 용적 1 ㎖당 2.5 내지 90 mg 범위의 활성화된 제VII 인자 폴리펩타이드를 포함하도록, 농축된 제VII 인자 폴리펩타이드의 적어도 일부(농축액)를 용기내에 담는다. 담기 전에 또는 담는 것과 관련하여, 농축액은 완충액(ii), 하나 이상의 안정화제(iii), 하나 이상의 삼투성 변형제(v), 하나 이상의 이온 강도 변형제(iv), 및 항산화제(vi) 등 상기에 기술된 바와 같은 것들을 첨가하여 변형할 수 있고, 예를 들면, 크로마토그래피 과정, 기계적 과정(예를 들면, 멸균 여과 또는 바이러스 여과와 같은 여과)의 의해 제품을 추가로 정제하여, 용기내에 보관하기에 적합한 제품을 제공하도록 할 수 있다. 이러한 밀폐 용기는 바람직하게는 상기에 정의된 바와 같은 것이다.
( iii )에 관해
일부 중요한 양태에서, 농축액(가능하게는 상기의 (ii) 밑에 기술된 바와 같이 변형된 후의 농축액)은 용기내에 담긴 다음에는 상기 기술된 바와 같이 타서 쓸 수 있는 보관용 건조형 제품을 수득하기 위하여 동결건조될 수 있다(상기 참조).
전형적으로는, 용기는 바이얼, 카풀, 주사기 등이다. 일 양태에서, 용기는 적어도 두개의 구획(예를 들면 카풀)을 가지는데, 여기에서 제 1 구획은 활성화된 제VII 인자 폴리펩타이드를 담은 것이다. 이의 변형된 양태에서, 제 1 구획의 활성화된 제VII 인자 폴리펩타이드는 동결건조된 형태이고, 제 2 구획은 상기 활성화된 제VII 인자 폴리펩타이드의 수성 용매를 담은 것이다. 이의 또다른 변형된 양태에서, 제 1 구획의 활성화된 제VII 인자 폴리펩타이드는 수용액이고, 제 2 구획은 활성화된 제VII 인자 폴리펩타이드에 대한 수성 용매를 담은 것이다. 상기 두가지 경우에 있어, 목적은 상기 정의한 바와 같은 즉석 조성물을 제조하고자 하는 것이다.
( iv )에 관해
마지막 단계로서, 용기를 밀폐 또는 밀봉처리하여 통상의 수단에 의해 밀폐 용기를 제공하도록 할 수 있는데, 예를 들면 바이얼, 카풀 등을 형성하도록 할 수 있다. 그 후에 용기에 레이블링하고 용기를 포장할 수 있다.
음이온 교환 크로마토그래피 ( AIEC )
하나의 중요한 다른 양태에서, 농축액은 음이온 교환 물질을 사용하여 수득하는데, 이것은 예정된 pH의 완충액으로 세척 및/또는 용리하는 것을 포함한다.
본 발명의 이 측면에 따르면, 적어도 16 mg/㎖까지의 제VII 인자 폴리펩타이드 농도를 수득하는 것이 명백히 가능한데, 이에 대해서는 하기의 실험절차 부분을 참조하면 될 것이고, 이에 따라서 본원에 주어진 가이드라인에 따라 더 최적화하면, 활성화된 제VII 인자 폴리펩타이드의 양이 용기 용적 1 ㎖당 2.5-90 mg 범위인, 본원에서 정의된 밀폐 용기를 제조하기 위해 적합한 농축액을 제공할 수 있게 될 것으로 예상된다.
기본적인 양태 중 하나는, 제VII 인자 폴리펩타이드의 약물 물질의 농축 방법인데, 상기 약물 물질, 상기 방법은 하기의 (a) 내지 (c)의 단계를 포함한다:
(a) 약물 물질의 일부가 음이온 교환 물질에 결합하는 것을 촉진하는 조건 하에서 음이온 교환 물질과 약물 물질을 접촉시키는 단계(이 단계는 또한 "로딩하는"것으로 표현된다);
(b) pH가 5.5 내지 7.0 범위인, 또는 대안적으로는 1-7 mM Ca2 + 존재하에서pH가 8.5 내지 9.5 범위인 세척 완충액으로 상기 음이온 교환 물질을 세척하는 단계; 및
(c) pH가 3.0 내지 7.0 범위인 용리 완충액으로 상기 음이온 교환 물질을 용리하는 단계 및 로딩한 것에 대한 용출액으로서 제VII 인자 폴리펩타이드의 더욱 농축된 용액을 수집하는 단계.
농축된 제VII 인자 폴리펩타이드를 AIEC 에 의해 수득하기 위해서 미리 필요한 것은 세척 및 용리 동안에 제VII 인자 폴리펩타이드의 최대한의 용해도를 유지하면서 용리 강도를 향상시키는 것이다. 이것은 예를 들면, 하기(a) 내지 (c)에 의해 수득된다:
(a) 로딩하는 동안에 pH를 약 5.5-7.0으로 유지하거나, 또는 대안적으로는 1-7 mM Ca2 + 존재하에서 pH를 8.5 내지 9.5로 유지하는 것;
(b) 세척 동안에 이온 강도를 40-250 mM(예를 들면, NaCl)로, 바람직하게는 75-100 mM로 유지하는 것(150 mM 이상의 이온 강도는 제VII 인자 폴리펩타이드의 "블리딩(bleeding)"을 유발할 수 있다); 및
(c) 용리 동안에 칼슘 농도 및/또는 이온 강도(예를 들면, NaCl)를 증가시키는 것 및/또는 용리 동안에 pH를 낮추는 것, 예를 들면, 5.0-7.0 범위에서 3.0-4.9 범위까지 낮추는 것을 예컨대 구배로서 또는 단계적으로서 수행하는 것.
AIEC는 특히 제VII 인자 폴리펩타이드의 "산업적규모(또는 대규모)" 약물 물질에 적당한 것으로 생각되나, 이에 국한시키고자 하는 것은 아니다. "산업적규모"라는 용어는 전형적으로는 액체 제VII 인자 폴리펩타이드 조성물의 용적이 적어도 100 ℓ, 예컨대 적어도 500 ℓ, 예를 들면 적어도 1000 ℓ, 또는 적어도 5000 ℓ인 과정을 의미하거나, 조성물의 중량이 적어도 100 kg, 예컨대 적어도 500 kg, 예를 들면 적어도 1000 kg, 또는 적어도 5000 kg인 과정을 의미한다.
단계 (a) -약물 물질과 음이온 교환 물질을 접촉시키는 단계
본 방법의 첫번째 단계는, 제VII 인자 폴리펩타이드의 약물 물질을 음이온 교환 물질과 접촉시키는 단계이다. 목적은 음이온 교환 물질에 제VII 인자 폴리펩타이드의 약물 물질의 일부가 결합하는 것을 촉진하는 것이다.
단계 (a)와 관련하여 "일부"라는 용어는 제VII 인자 폴리펩타이드의 약물 물질 중에 존재하는 적어도 30%(즉, 30-100%)의 제VII 인자 폴리펩타이드의 양(mass)을 의미하는 것이다. 최상의 예에서 제VII 인자 폴리펩타이드 양의 30% 이상, 예를 들면, 적어도 50%, 또는 적어도 70%, 또는 대부분에 결합하는 것이 바람직한 것으로 이해되어야 한다. "대부분(predominant portion)"이라는 용어는 제VII 인자 폴리펩타이드의 약물 물질 중에 존재하는 제VII 인자 폴리펩타이드의 적어도 90%의 양을 의미한다. 바람직하게는 더 높은 비율의 일부가 음이온 교환 물질에 결합하는데, 예를 들면 제VII 인자 폴리펩타이드의 약물 물질 중에 존재하는 제VII 인자 폴리펩타이드의 적어도 95%의 양, 또는 적어도 98%의 양, 또는 적어도 99%의 양, 또는 심지어는 실질적으로 전부가 결합한다.
제VII 인자 폴리펩타이드의 약물 물질은 전형적으로는 산업적규모 제조과정에서 유래하는 것인데, 예를 들면, 세포 배양액, 클로닝된 동물(예를 들면, 소, 돼지, 양, 염소 및 물고기) 또는 곤충 등에서 유래한 것이고, 특히 세포 배양액으로부터 유래한 것이다.
음이온 교환 물질은 바람직하게는 강한 음이온 교환 물질인데, 예를 들면 4차 암모늄기를 갖는 음이온 교환 물질이다. 이러한 물질 중 시판되는 예에는 애머샴 바이오사이언시즈(Amersham Biosciences)사의 Q-세파로즈 패스트 플로우(Q-Sepharose Fast Flow), Q-세파로즈 하이 퍼포먼스(Q-Sepharose High Performance) 및 모노 Q(Mono Q), 퍼셉티브 바이오시스템즈(PerSeptive Biosystems)사의 POROS HQ 50, 그리고 토소 바이오사이언시즈(Tosoh Biosciences)사의 토요펄 수퍼 Q(Toyopearl Super Q)가 있다.
음이온 교환 물질의 가장 일반적인 배열은 컬럼 형식이다. 배치(batch) 용기내 배열도 물론 가능하다.
제VII 인자 폴리펩타이드의 약물 물질은 전형적으로는 앞서 수행한 정제 단계로부터 직접 수득하거나, 앞서 수행한 정제 단계에서 pH, 이온 강도, 2가 금속 이온 등의 킬레이션 등 필요한 것을 조정한 것으로부터 수득한다.
음이온 교환 물질에 적용하기 전 및 적용할 때 약물 물질의 pH는 desGla-제VII 인자와 같은 파괴 산물의 형성 및 중쇄 파괴에 중요한 역할을 한다. 따라서, 약물 물질은 액체 형태이고, 이의 pH는 음이온 교환 물질에 적용하였을 때 5.5-7.0 범위, 예를 들면 5.7-6.5, 구체적으로는 5.8-6.5 또는 5.5-6.2인 것이 바람직하다. 약 5.5보다 pH가 낮은 경우에는, 특히 칼슘이 없는 경우, 이량체 형성 경향이 뚜렷해진다. 대안적으로는, 로딩 용액의 pH는 소량의 칼슘, 예컨대 1-7 mM의 존재하에서 8.5 내지 9.5 범위이다.
전형적으로는, 전도력은 2-30 mS/cm 범위, 예컨대 5-15 mS/cm이다. 약물 물질의 온도는 전형적으로는 0-15℃, 예컨대 2-10℃ 부근이다.
결합된 제VII 인자 폴리펩타이드를 갖는 음이온 교환 물질의 온도는 전형적으로는 0-15℃, 예컨대 2-10℃ 부근인데, 예를 들면, 온도가 제어되는 냉각 자켓 및 용액을 사용하여 특정한 범위로 유지된다.
제VII 인자 폴리펩타이드의 약물 물질의 접촉은 전형적으로는 통상적인 프로토콜에 따라 수행하는데, 즉, 약물 물질의 농도, 온도, 이온 강도 등을 통상적으로 사용할 수 있으며, 통상적으로 사용하기 전에 음이온 교환 물질을 세척하고 평형유지할 수 있다.
제VII 인자 폴리펩타이드의 로딩양은 전형적으로는 매트릭스(습한 형태의 음이온 교환 물질) 1 리터당 10-40 g 범위이고 예를 들면 1 리터당 15-30 g이며, 약물 물질은 전형적으로는 시간당 3-200 컬럼 용적(column volume)의 유속으로 적용된다.
단계 (b)-세척 단계
제VII 인자 폴리펩타이드의 약물 물질을 음이온 교환 물질에 결합시킨 후에는, 용리를 시작하기 전에 제VII 인자 폴리펩타이드의 최적의 용해도를 위해 적당한 이온 강도를 제공하기 위하여 세척 단계(b)를 수행한다. 이 단계는 또한 pH<7.0에서 수행하였을 때 desGla-제VII 인자의 제거를 제공하기도 한다.
이러한 세척 단계(b)는 바람직하게는 pH가 5.5-7.0 범위인 세척 완충액에 의해 달성된다. 일부 흥미로운 양태에서, 세척 완충액의 pH는 최대 6.8, 또는 최대 6.7, 또는 최대 6.6, 또는 최대 6.5, 또는 최대 6.4이다. 바람직하게는, pH는 5.7-6.5 범위, 구체적으로는 5.8-6.5 또는 5.5-6.2이다. 일부 흥미로운 양태에서는, 예컨대, 7 mM까지의 소량의 칼슘이 존재하는 가운데 로딩하면 세척 동안에 pH를 약 9.0에서 5.5-7.0까지 변하게 한다.
세척 단계(b)는 전형적으로는 시간당 3-200 컬럼 용적의 유속으로 수행된다.
세척 완충액은 전형적으로는 MES, PIPES, ACES, BES, TES, HEPES, TRIS, 히스티딘, 이미다졸, 글리신, 글리실글리신, 글리신아미드, 인산, 아세트산(예를 들면, 소듐 또는 칼슘 아세테이트), 락트산, 글루타르산, 시트르산, 타타르산, 말산, 말레산, 및 석신산의 산 및 염으로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 하나의 성분이다. 혼합물이 특정한 범위로 pH 값을 제공할 수 있는 것이면, 완충제는 둘 이상의 성분의 혼합물을 포함할 수 있는 것으로 이해하여야 한다. 이러한 예로서, 아세트산 및 소듐 아세테이트 등을 언급할 수 있겠다.
세척 완충액은 또한 염 등을 포함할 수도 있는데, 전형적으로는 음이온의 농도가 컬럼으로부터 제VII 인자 폴리펩타이드의 용리를 수행하기에 불충분한 정도이며, 예를 들면, 이것은 4-250 mM의 이온 강도에 상응하는 것이다. pH 6.0에서, 세척 완충액은 50-250 mM NaCl, 약 10 mM 히스티딘(완충제) pH 6.0의 조성을 가질 수 있다. 모든 예에서, 세척 완충액의 이온 강도는 제VII 인자 폴리펩타이드의 종국적인 침전을 피할 정도로 높아야 하나, 제VII 인자 폴리펩타이드의 "블리딩"이 시작되는 것만큼 높지는 않아야 하는 것이 중요하다.
(b) 세척 단계는 하나, 두개 또는 여러개 상이한 세척 완충액을 사용하여 수행할 수 있거나, 구배를 가진 세척 완충액을 사용하여 수행할 수 있음을 숙지하여야 할 것이다.
단계 (c) - 용리 단계
세척 단계(c) 후에는, 음이온 교환 물질을 용리 완충액으로 용리하며, 제VII 인자 폴리펩타이드의 농축된 약물 물질을 용출액으로서 수집한다.
용리 단계(c)에 대해서는 여러가지로 다양화하는 것이 가능하다. 용리를 비교적 고속으로 수행한 경우, 용리가 7.0 이상의 pH에서 수행된 경우라 해도 상당량의 desGla-제VII 인자 형성 및 중쇄 파괴가 억제될 수 있을 것이다. 그러나, desGla-제VII 인자 형성 및 중쇄 파괴를 막기 위해서는, 용리 완충액의 pH가 3.0-7.0 범위, 예컨대 4.0-7.0 범위인 것이 바람직하다. 일부 흥미로운 양태에서는, 용리 완충액의 pH는 최대 6.8, 또는 최대 6.7, 또는 최대 6.6, 또는 최대 6.5, 또는 최대 6.4이다.
5-25 mM의 양으로 칼슘 이온이 존재하면 파괴를 감소시키는 것으로 보이고, 이에 대해서는, 하기의 이온 강도에 관한 언급부분을 참조하면 된다.
용리 단계(b)는 전형적으로는 시간당 3-200의 컬럼 용적의 유속으로 수행한다.
용리는 여러가지 방식으로 수행할 수 있는데, 예컨대 2가 양이온을 포함하는 용리 완충액을 사용하여, 어떤 고농도의 음이온을 활용하여 경쟁적 용리를 수행할 수도 있고, 그렇지 않으면 pH 구배를 이용하여, 또는 전술한 것을 복합적으로 사용하여 수행할 수 있다.
일 양태에서, 용리는 하나 이상의 2가 양이온(들)을 포함하는 용리 완충액을 사용하여 달성된다. 2가 양이온(들)의 농도는 적어도 5 mM, 예를 들면 적어도 10 mM, 예를 들면 적어도 15 mM, 또는 심지어 적어도 30 mM이다.
2가 양이온(들)은 바람직하게는 Ca2 +, Sr2 +, Mg2 +, 및 Ba2 +로 구성되는 군 중에서 선택된 적어도 하나의 2가 양이온을 포함한다. 이러한 양이온은 제VII 인자 폴리펩타이드의 Gla-도메인에 결합하는 경향을 가지므로, 음이온 교환 물질로부터 제VII 인자 폴리펩타이드의 약물 물질이 유리되는 것을 촉진할 것이다. 일 바람직한 양태에서, 2가 양이온(들)은 Ca2+를 포함한다.
용리 완충액의 2가 양이온(들)의 농도는 전형적으로는 적어도 5 mM, 예컨대 5-100 mM 범위, 예를 들면 10-50 mM 범위이다.
하나의 변형적인 양태에서, 용리 완충액은 2가 양이온(들)(예를 들면, Ca2 +)에 대한 구배 완충액인데, 예를 들면, 2가 양이온(들)(예를 들면, Ca2 +)의 최초 농도는 0-20 mM 범위이지만, 구배 완충액의 2가 양이온(들)(예를 들면, Ca2 +)의 최종 농도는 15-100 mM 범위인 완충액을 말한다.
다른 양태에서, 용리 단계(c)는 하나 이상의 음이온, 예컨대 1가-, 2가- 또는 3가 음이온으로 약물 물질을 경쟁적 용리시킴으로써 수행한다. 이러한 음이온은 전형적으로는 클로라이드, 아세테이트, 말로네이트(malonate), 포스페이트, 카보네이트, 설페이트, 및 니트레이트로 구성되는 군 중에서 선택되며; 구체적으로는 클로라이드(Cl-), 아세테이트 및 말로네이트 중에서 선택된다.
하나의 변형적인 양태에서, 용리 완충액의 Cl-의 농도는 100-800 mM 범위, 예를 들면 200-500 mM 범위이다. 대안적으로는 용리 완충액은 Cl-의 농도에 대해 구배 완충액인데, 예를 들면, Cl-의 초기 농도는 0-300 mM 범위이고, Cl-의 최종 농도는 300-1000 mM 범위인 구배 완충액이다.
또 하나의 변형적인 양태에서, 용리 완충액의 말로네이트의 농도는 100-800 mM 범위인데, 예를 들면, 200-500 mM 범위이다. 대안적으로는 용리 완충액은 말로네이트의 농도에 대해 구배 완충액인데, 예를 들면 말로네이트의 초기 농도는 0-300 mM 범위이고, 말로네이트의 최종 농도는 300-1000 mM 범위인 구배 완충액이다.
또 하나의 변형적인 양태에서, 용리 완충액의 아세테이트의 농도는 100- 1000 mM 범위인데, 예를 들면, 400-800 mM 범위이다. 대안적으로는 용리 완충액은 아세테이트의 농도에 대해 구배 완충액인데, 예를 들면 아세테이트의 초기 농도는 0-400 mM 범위이고, 아세테이트의 최종 농도는 400-1000 mM 범위인 구배 완충액이다.
또 하나의 변형적인 양태에서, 용리 완충액은 pH에 대해 구배 완충액이다. 하나의 변형적인 양태에서, 구배 완충액의 초기 pH는 5.0-7.0 범위이고, 구배 완충액의 최종 pH는 3.0-4.9 범위이다.
용리 단계(c)에 관해서는 일반적으로, 용리 완충액의 이온 강도는 100-1000 mM 범위, 예컨대 200-800 mM (예를 들면, NaCl)인 것이 바람직하다.
보통은 음이온 교환 물질은 순차적으로 단계들을 밟은 후에 재사용할 목적으로 재생된다.
본 과정은 제VII 인자 폴리펩타이드의 농축된 약물 물질을 수득하기 위해 특히 유용하며, (a)-(c) 단계에 대한 pH 조건을 적당하게 선택한 경우라면, 제VII 인자 폴리펩타이드 구조의 파괴 산물의 형성을 최소화할 수 있어서, 매우 고농도의 제VII 인자 폴리펩타이드를 수득하는 동시에 과정의 전체적인 수율을 증대시킬 수 있다.
그러므로, 본 발명의 바람직한 양태는, 적어도 5 mg/㎖의 제VII 인자 폴리펩타이드의 용출액을 포함하는 제VII 인자 폴리펩타이드의 약물 물질을 정제하기 위한 방법을 제공하는 것이고, 상기 방법은 하기의 (a) 내지 (c) 단계를 포함하는 것이다:
(a) 음이온 교환 물질에 약물 물질의 일부를 결합시키는 것을 촉진하는 조건 하에 상기 음이온 교환 물질과 약물 물질을 접촉시키는 단계, 이때 약물 물질은 액체 형태이고 이의 pH는 5.5-7.0 범위이며, 대안적으로는 1-7 mM Ca2 +의 존재하에 8.5-9.5인 것이다;
(b) pH가 5.5 내지 7.0 범위이고 이온 강도가 75-100 mM NaCl 범위인 세척 완충액으로 음이온 교환 물질을 세척하는 단계; 및
(c) 용리 완충액으로 음이온 교환 물질을 용리하는 단계, 이때 용리 완충액의 pH는 2.0-7.0 범위이고, 2가 양이온, 예컨대 칼슘을 포함하는 것이며, 용리 완충액은 100-300 mM NaCl 존재하에 10-30 mM의 2가 양이온에 대한 이온 강도를 가지는 것이며, 농축액을 용리시키기 위한 2가 양이온 단독으로 사용되면 농도는 적어도 50 mM이어야 하는 것인 용리 단계와; 눈에 띄는 제VII 인자 폴리펩타이드 파괴 산물의 증가 없이 적어도 5 mg/㎖의 제VII 인자 폴리펩타이드의 농축액을 포함하는 정제된 약물 물질을 수집하는 단계.
하이드록시아파타이트( Hydroxyapatite )
필요한 변경을 가한 상기의 AIEC 과정의 변형에서, 필요한 변경을 가한 활성화된 제VII 인자 폴리펩타이드를 포함하는 밀폐 용기의 제조방법은, 하기의 (a) 내지 (f) 단계를 포함한다:
(a) 하이드록시아파타이트 물질에 제VII 인자 폴리펩타이드의 일부를 결합시키는 것을 촉진하는 조건 하에 상기 하이드록시아파타이트 물질과 상기 제VII 인자 폴리펩타이드를 포함하는 용액을 접촉시키는 단계(예를 들면, 10 mM 칼슘의 존재하에 약 15 mg/㎖ 겔까지 로딩);
(b) 임의로는 세척 완충액으로 상기 하이드록시아파타이트 물질을 세척하는 단계(예를 들면, 처음에 0.1 M 포스페이트, pH 6.8로 세척하고, 그 후에 10 mM 포스페이트, pH 6.8로 세척);
(c) pH가 5.5 내지 7.0 범위인 용리 완충액으로 상기 하이드록시아파타이트 물질을 용리하는 단계, 및 활성화된 제VII 인자 폴리펩타이드 용출액을 수집하는 단계;
(d) 용기가 용기 용적 1 ㎖당 활성화된 제VII 인자 폴리펩타이드를 2.5 내지 90 mg 범위로 포함하도록, 용출액의 적어도 일부를 용기내에 담는 단계;
(e) 임의로는 용출액을 동결건조하는 단계; 및
(f) 밀폐 용기로 제공되도록 용기를 밀봉하는 단계.
이의 변형적 양태에서, 8 mg/㎖의 벌크 농도를 수득하는 것도 가능하였다.
한외여과( Ultrafiltration )
한외여과(UF)는 극히 작은 입자 및 용액에 용해된 분자를 분리하는데 사용되는, 압력으로 구동되는 막기반 분리 기술의 일종이다. 분리를 위한 기본 원리는 분자크기이지만, 다른 인자, 예컨대 분자 모양 및 전하도 중요한 역할을 한다. 막 세공보다 더 크기가 큰 분자는 막 표면에 남아있어서 한외여과 과정 동안에 농축될 것이다. 막의 표면 상에 농축된 분자가 쌓이는 것을 피할 수 있도록 용액이 막을 지속적으로 통과할 수 있도록 하는데 펌프가 사용될 수 있으며, 막의 세공을 통해 물(또는 액체) 및 작은 분자, 예컨대 완충액 성분을 이동시키기 위해 필요한 압력을 발생시키기 위해서도 펌프를 사용할 수 있다.
한외여과막의 보유력은 분자량 컷오프(Molecular Weight Cutoff, MWCO)로서 표현된다. 이 값은 막에 의해 90% 보유된 희석된 구형 용질(즉, 전형적인 단백질)의 대략적인 분자량(MW)을 말한다. 하지만 분자의 모양도 막에 의한 보유력에 직접적인 영향을 미칠 수 있다. 예를 들면, DNA와 같은 선형 분자는 동일한 분자량의 구형 종이라면 이를 보유할 세공을 통과할 수 있을 것이다.
한외여과 과정에 의해 더 농축된 초기 조성물은 전형적으로는 상기 기술한 바와 같은 AIEC 과정의 초기 물질과 동일한 성질을 갖는 것이다. 이온 강도는 전형적으로는 40-250 mM 범위이고, 하나 이상의 부가적 제제, 예컨대 탄수화물(예를 들면 수크로스 마니톨 등) 등 및 완충액, 삼투성 변형제 및 이온 강도 변형제 등을 상기에 최종 조성물로서 기술한 바와 같이 포함하는 것이 바람직하다. 초기 조성물의 pH는 전형적으로는 5.5-7.0 범위이고, 구체적으로는 5.5-6.5 범위이다. pH가 5.5보다 낮은 경우에는 제VII 인자 폴리펩타이드의 침전이 보통 관찰된다. 대안적으로는 pH는 9.0-10.0 범위일 수 있다. 최상의 예에서, 저온에서, 예를 들면, 0-15℃ 범위의 온도에서, 예컨대 2-10℃ 부근의 온도에서 본 과정을 수행하는 것이 바람직하다.
한외여과에는 다음과 같은 세가지 일반적인 용도가 있다:
1. 농축. 한외여과는 희석 단백질의 농축을 위한 매우 효과적인 방법이다(보통은 90% 이상의 회수율을 가진다).
2. 탈염 및 완충액 교환(투석여과). 한외여과는 염을 제거하거나 교환하고, 세제를 제거하며, 결합된 분자로부터 분리하며, 저분자량 물질을 제거하거나, 이온성 또는 pH 환경을 신속히 변화시키기 위한 매우 편리하고 효과적인 방법을 제공한다.
3. 분획화. 한외여과는 유사한 분자량을 갖는 두 분자를 정밀하게 분리하는 것을 수행할 수는 없을 것이다. 분리되어야 할 분자는 효과적인 분리를 위해서는 크기면에서 적어도 한 등급(10X) 달라야 한다.
한외여과에 대해 더 자세한 설명을 위해서는 하기의 문헌을 참조하면 된다: 예를 들면, "Microfiltration and ultrafiltration. Principles and Applications." by Leos J. Zeman and Andrew L. Zydney. Marcel Dekker, Inc. 270 Madison Avenue, New York (1996).
따라서, 본 발명의 용기는 하기 (a) 내지 (d) 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다:
(a) 제VII 인자 폴리펩타이드의 농축 용액을 수득하도록, 제VII 인자 폴리펩타이드를 포함하는 용액을 한외여과 및/또는 투석여과에 투입하는 단계;
(b) 용기가 용기 용적 1 ㎖당 활성화된 제VII 인자 폴리펩타이드 2.5 내지 90 mg 범위를 포함하도록 농축 용액의 적어도 일부를 용기에 담는 단계;
(c) 임의로는 용액을 동결건조하는 단계; 및
(d) 밀폐 용기로 제공되도록 용기를 밀봉하는 단계.
침전
단백질을 침전시킨 다음에 침전물을 소량의 동일한 또는 새로운 완충액에 용해시키면 단백질 농축액을 만들 수 있다. 침전은 pH 조정 및/또는 침전제의 첨가에 의해 수행할 수 있다. 하지만 침전제는 단백질에 영향을 미칠 수 있고(예를 들면 유기 용매의 경우 변성), 침전물에 남아 있을 수도 있으며 이에 따라 침전물을 재용해시킨 후에도 용액 속에 남아있을 수 있다. 일부 침전제는 단백질에 매우 순하기 때문에 심지어는 단백질을 안정화시킬 수도 있고, 잔여 침전제는 나중에 예를 들면, 탈염, 투석여과(완충액 교환), 투석 또는 동결건조(에탄올과 같은 유기 용매를 제거하는 것)에 의해 제거할 수 있다.
PEG는 매우 용해도가 높고, 전하를 띠지 않는 가연성의 중합체로서 단백질을 거의 변성시키지 않거나 또는 약간만 변성시킨다. 이에 따라 PFG를 사용하면 안전하고 편리한 방식으로 전도력을 증가시키지 않으면서 단백질을 침전시킬 수 있다.
단백질 침전에 사용되는 일반적인 방법은 고농도의 염으로 염화(salting out)하는 것인데, 보통은 암모늄 설페이트, 즉 (NH4)2SO4가 이의 높은 용해도 때문에 사용된다. 암모늄 설페이트는 또한 단백질과 상호작용하지 않고, 심지어는 단백질에 대해서 안정화 효과를 가질 수도 있기 때문에 바람직하다.
본 과정들이 진행되는 온도는 전형적으로는 0-15℃, 예컨대 2-10℃ 부근이다.
따라서, 본 발명에 따른 용기는 하기의 (a) 내지 (f) 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수도 있다:
(a) 제VII 인자 폴리펩타이드의 침전을 촉진하도록 제VII 인자 폴리펩타이드를 포함하는 용액을 포화된 암모늄 설페이트 용액과 배합하는 단계;
(b) 제VII 인자 폴리펩타이드 농축액을 제조하기 위해서 수성 용매에 침전된 제VII 인자 폴리펩타이드를 재용해시키는 단계;
(c) 임의로는 상기 농축액을 탈염하는 단계;
(d) 용기가 용기 용적 1 ㎖당 활성화된 제VII 인자 폴리펩타이드를 2.5 내지 90 mg 범위로 포함하도록, 농축액의 적어도 일부를 용기내에 담는 단계;
(e) 임의로는 용액을 동결건조하는 단계; 및
(f) 밀폐 용기로 제공되도록 용기를 밀봉하는 단계.
동결건조
동결건조는 승화라고 하는 간단한 물리적 현상을 사용하여 수행한다. 승화는 고체가 중간상태의 액체 상을 통하지 않고 증기 상태로 상태 변화하는 것을 가리킨다. 예를 들면 단백질의 동결 용액으로부터 물을 추출하기 위해서, 동결건조 방법은 하기의 단계로 구성된다:
1. 용액을 동결시켜 용액 속의 물이 얼음이 되도록 하는 단계;
2. 진공하에서, 물을 수증기로 바로 승화시키는 단계;
3. 수증기를 빼내는 단계;
4. 일단 얼음이 승화되면 용질(단백질)을 동결건조시켜 회수할 수 있도록 하는 단계.
동결 건조법에 대해 더욱 자세한 설명을 보기 위해서는 하기의 문헌을 참조하면 된다: 예를 들면, "Freeze- Drying/Lyophilization of Pharmaceutical and Biological Products, Second Edition, Series: Drugs and the Pharmaceutical Sciences, Volume: 137, Marcel Dekker, Inc. 270 Madison Avenue, New York (2004).
따라서, 본 발명에 따른 용기는 하기 (a) 내지 (f) 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수도 있다:
(a) 약 3% 이하의 수분 함량을 갖는 제VII 인자 폴리펩타이드의 조성물을 수득하도록 제VII 인자 폴리펩타이드를 포함하는 용액을 동결건조하는 단계;
(b) 제VII 인자 폴리펩타이드의 농축액을 제조하도록 수성 용매에 동결건조된 제VII 인자 폴리펩타이드를 재용해하는 단계;
(c) 임의로는 농축액을 탈염하는 단계;
(d) 용기가 용기 용적 1 ㎖당 활성화된 제VII 인자 폴리펩타이드 2.5 내지 90 mg 범위를 포함하도록 농축액의 적어도 일부를 용기내에 담는 단계;
(e) 임의로는 용액을 동결건조하는 단계;
(f) 밀폐 용기로 제공되도록 용기를 밀봉하는 단계.
활성화된 제 VII 인자 폴리펩타이드의 조성물을 담은 용기의 용도
밀폐 용기로 대표되는 약학적 제품은 특히 상당히 다량의 활성화된 제VII 이자 폴리펩타이드가 하나의 용기로 제공될 수 있는 치료적 용도를 위해 유용하다. 따라서, 본 발명은 구체적으로는 치료제로서 사용하기 위해 본원에서 정의된 바와 같은 약학적 제품을 제공하는데, 더욱 구체적으로는 제VII 인자 반응성 증후군, 예컨대 응고인자 결핍(예를 들면, A형 혈우병, B형 혈우병, 제XI 응고 인자 결핍, 제VII 응고인자 결핍)에 의해 유발된 출혈성 질병; 혈소판감소증 또는 빌러브란트씨병에 유발된 출혈성 질병, 또는 응고 인자 억제제에 의해 유발된 질병, 및 혈관내부 출혈, 또는 임의의 원인에 의한 과다 출혈을 포함하는 출혈성 질병을 치료하기 위한 치료제로서 사용하기 위해 본원에서 정의된 바와 같은 약학적 제품을 제공한다. 제조물은 수술을 받은 환자나 다른 외상을 가진 환자에게, 또는 항응고제 치료를 받은 환자에게 투여할 수 있으며, 특히 40 μg/체중kg 이상의 투여량을 필요로 하는 증세를 가진 환자에게 투여할 수 있다.
"치료"라는 용어는 질병, 증세 또는 질환의 퇴치를 목적으로, 개체, 예컨대 포유류, 구체적으로는 인간을 관리하고 돌보는 것으로서 정의되며, 징후 또는 합병증의 발병을 예방하고, 또는 징후나 합병증을 완화하며, 또는 질병, 증세 또는 질환을 제거하기 위한 제VII 인자 폴리펩타이드의 투여를 포함한다. 제VII 인자 폴리펩타이드를 함유하는 본 발명에 따른 약학적 조성물은 이러한 치료가 필요한 개체에 비경구적으로 투여될 수 있다. 비경구적 투여는 주사기를 사용하여, 임의로는 펜형 주사기를 사용하여 피하, 근육내, 또는 정맥내 주사를 통해 수행될 수 있다. 대안적으로는, 비경구적 투여는 주입 펌프를 사용하여 수행할 수 있다.
중요한 양태에서, 약학적 조성물은 당업계에 공지되어 있는 방법에 따라 피하, 근육내 또는 정맥내 주사하도록 변형된다.
키트 및 키트의 사용방법
상기를 고려하여, 본 발명은 상기에 정의된 신규 용기를 포함하는 키트도 제공한다. 따라서, 본 발명은 (i) 활성화된 제VII 인자 폴리펩타이드의 고체 약학적 조성물을 함유하는 제1 밀폐 용기와, (ii) 상기 고체 약학적 조성물에 대한 액체 수성 용매를 함유하는 제 2 용기를 포함하는 키트를 제공하며, 여기에서 제 1 용기는 제 1 용기 용적 1 ㎖당 2.5-90 mg 범위의 활성화된 제VII 인자 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 담은 것을 특징으로 한다.
제 1 용기, 조성물 및 활성화된 제VII 인자 폴리펩타이드는 상기에서 일반적으로 및 구체적으로 밀폐 용기에 관해 정의한 바와 같다.
일 양태에서, 제 1 용기 및 제 2 용기는 카풀로서 배열되는데, 여기에서 제 1 구획은 제 1 용기에 해당하고, 나머지 이에 근접한 구획은 제 2 용기에 해당한다.
본 발명은 또한 키트의 의료적 용도, 상기 정의된 키트로부터의 활성화된 제VII 인자 폴리펩타이드의 즉석 액체 수성 약학적 조성물의 제조방법을 제공하며, 상기의 방법은 활성화된 제VII 인자 폴리펩타이드의 즉석 액체 수성 약학적 조성물을 형성하도록, 제 1 용기의 고체 약학적 조성물을 제 2 용기의 액체 수성 용매의 적어도 일 분획과 혼합하는 단계를 포함하는 것이다.
방법의 변형적인 양태에서, 제 2 용기의 액체 수성 용매의 본질적으로 전부가 제 1 용기의 고체 약학적 조성물과 혼합된다.
활성화된 제 VII 인자 폴리펩타이드
본원에서 사용된 "FVII", "제VII 인자 폴리펩타이드" 또는 "FVII 폴리펩타이드"라는 용어는 야생형 인간 제VIIa 인자(즉 U.S. 특허 제4,784,950호에서 기술된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드)의 아미노산 서열 1-406을 포함하는 임의의 단백질, 및 이의 변이체 뿐만 아니라, 제VII 인자 관련 폴리펩타이드, 제VII 인자 유도체, 및 제VII 인자 컨쥬게이트를 의미한다. 이는 야생형 인간 제VIIa 인자와 비교하여 동일하거나 개선된 생물학적 활성을 보이는 FVII 변이체, 제VII 인자 관련 폴리펩타이드, 제VII 인자 유도체 및 제VII 인자 컨쥬게이트를 포함한다.
"제VII 인자"라는 용어는 절단되지 않은(자이모겐(zymogen))형태의 제VII 인자 폴리펩타이드 뿐 아니라, 단백질분해되어 이들의 상응하는 생물적활성형인 것도 포함하는 것이며, 후자의 것은 제VIIa 인자라고 지칭된다. 전형적으로는 제VII 인자는 152번째 및 153번째 잔기 사이에서 절단되어 제VIIa 인자를 생성한다. 이러한 제VII 인자의 변이체는 인간 제VII 인자와 비교하여 상이한 특성을 보일 수 있는데, 이러한 것에는 안정성, 인지질 결합정도, 변경된 특이적 활성 등이 포함된다.
본원에서 사용된 "야생형 인간 FVIIa"라는 용어는 미국 특허 제4,784,950호에 기술된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 말한다.
본원에서 사용된 "제VII 인자 관련 폴리펩타이드"라는 용어는 제VIIa 인자 생물학적 활성이 실질적으로 변형된, 예컨대 야생형 제VIIa 인자의 활성에 비교하여 활성이 감소된 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 포괄하는 용어이다. 이러한 폴리펩타이드에는 폴리펩타이드의 생물학적 활성을 변형시키거나 파괴하는, 특정 아미노산 서열 변경이 도입된 제VII 인자 또는 제VIIa 인자를 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다.
본원에 사용된 "제VII 인자 유도체"라는 용어는 야생형 제VII 인자와 비교하여 실질적으로 동일하거나 개선된 생물학적 활성을 보이는 FVII 폴리펩타이드를 지칭하기 위한 것으로서, 모(母)펩타이드 중 하나 이상의 아미노산이 유전적 및/또는 화학적 및/또는 효소를 통해 변형된 것, 예를 들면, 알킬화, 글리코실화, PEG화, 아실화, 에스테르 형성 또는 아미드 형성 등으로 된 것을 말한다. 여기에는 PEG화된 인간 제VIIa 인자, 시스테인-PEG화된 인간 제VIIa 인자 및 이의 변이체가 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다. 제VII 인자 유도체의 비제한적인 예에는, WO 03/31464 및 미국특허출원 US 20040043446, US 20040063911, US 20040142856, US 20040137557, 및 US 20040132640 (Neose Technologies, Inc.)에서 기술된 글리코PEG화된 제VII 인자 유도체; WO 01/04287, 미국특허출원 20030165996, WO 01/58935, WO 03/93465 (Maxygen ApS) 및 WO 02/02764, 미국특허출원 20030211094 (University of Minnesota)에서 기술된 FVII 컨쥬게이트가 있다.
"개선된 생물학적 활성"이라는 용어는 i) 재조합 야생형 인간 제VIIa 인자에 비해 실질적으로 동일하거나 증가된 단백질분해 활성을 갖는 FVII 폴리펩타이드 또는 ii) 재조합 야생형 인간 제VIIa 인자에 비해 실질적으로 동일하거나 증가된 TF 결합 활성을 갖는 FVII 폴리펩타이드 또는 iii) 재조합 야생형 인간 제VIIa 인자에 비해 혈장내에서 실질적으로 동일하거나 증가된 반감기를 갖는 FVII 폴리펩타이드를 가리키는 것이다. "PEG화된 인간 VIIa 인자"라는 용어는 인간 제VIIa 폴리펩타이드에 컨쥬게이팅된 PEG 분자를 갖는 인간 제VIIa 인자를 가리키는 것이다. PEG 분자는 제VIIa 인자 폴리펩타이드의 임의의 아미노산 잔기 또는 탄수화물 잔기를 포함하는 제VIIa 인자 폴리펩타이드의 임의의 일부에 부착될 수 있는 것으로 이해된다. "시스테인-PEG화된 인간 제VIIa 인자"라는 용어는 인간 제VIIa 인자에 도입된 시스테인의 설프히드릴(sulfhydryl)기에 컨쥬게이팅된 PEG 분자를 갖는 제VIIa 인자를 의미한다.
재조합 야생형 인간 제VIIa 인자에 비해 실질적으로 동일하거나 증가된 단백질 분해 활성을 갖는 제VII 인자 변이체의 비제한적인 예에는 하기의 것이 포함된다: S52A- FVIIa, S60A-FVIIa ( Lino et al., Arch. Biochem. Biophys. 352: 182-192, 1998); U.S. Patent No. 5,580,560에서 기술된 바와 같은 증가된 단백질 분해 안정성을 보이는 FVIIa 변이체; 290번째와 291번째 잔기 사이에서 단백질분해적으로 절단되거나, 315번째와 316번째 잔기 사이에서 단백질 분해적으로 절단된 제VIIa 인자(Mollerup et al., Biotechnol. Bioeng. 48:501-505, 1995); 제VIIa 인자자의 산화형(Kornfelt et al., Arch. Biochem. Biophys. 363:43-54, 1999); PCT/DK02/00189(WO 02/077218에 상응하는 것이다)에서 기술된 바와 같은 FVII 변이체; 및 WO 02/38162에서 기술된 바와 같은 증가된 단백질 분해 안정성을 보이는 FVII 변이체 (Scripps Research Institute); WO 99/20767, 미국 특허 US 6017882 및 US 6747003, 미국 특허 출원 20030100506 (University of Minnesota) 및 WO 00/66753, 미국 특허 출원 US 20010018414, US 2004220106, 및 US 200131005, 미국 특허 US 6762286 및 US 6693075 (University of Minnesota)에서 기술된 바와 같이 변형된 Gla-도메인을 가지고 향상된 막결합성을 보이는 FVII 변이체; 및 WO 01/58935, 미국 특허 US 6806063, 미국 특허 출원 20030096338 (Maxygen ApS), WO 03/93465 (Maxygen ApS), WO 04/029091 (Maxygen ApS), WO 04/083361 (Maxygen ApS), 및 WO 04/111242 (Maxygen ApS), 및 WO 04/108763 (Canadian Blood Services)에서 기술된 바와 같은 FVII 변이체.
야생형 FVIIa에 비해 증가된 생물학적 활성을 갖는 FVII 변이체의 비제한적인 예에는 하기에서 기술된 바와 같은 FVII 변이체: WO 01/83725, WO 02/22776, WO 02/077218, PCT/DK02/00635 (WO 03/027147에 상응), 덴마크 특허출원 PA 2002 01423 (WO 04/029090에 상응), 덴마크 특허출원 PA 2001 01627 (WO 03/027147에 상응); WO 02/38162 (Scripps Research Institute);와 JP 2001061479 (Chemo-Sero-Therapeutic Res Inst.)에서 기술된 바와 같은 향상된 활성을 갖는 FVIIa 변이체가 포함된다.
제VII 인자의 변이체의 예에는 하기의 것이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다: L305V-FVII, L305V/M306D/D309S-FVII, L305I-FVII, L305T-FVII, F374P-FVII, V158T/M298Q-FVII, V158D/E296V/M298Q-FVII, K337A-FVII, M298Q-FVII, V158D/M298Q-FVII, L305V/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII, V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII, K157A-FVII, E296V-FVII, E296V/M298Q-FVII, V158D/E296V-FVII, V158D/M298K-FVII, 및 S336G-FVII, L305V/K337A-FVII, L305V/V158D-FVII, L305V/E296V-FVII, L305V/M298Q-FVII, L305V/V158T-FVII, L305V/K337A/V158T-FVII, L305V/K337A/M298Q-FVII, L305V/K337A/E296V-FVII, L305V/K337A/V158D-FVII, L305V/V158D/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V-FVII, L305V/V158T/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V-FVII, L305V/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, S314E/K316H-FVII, S314E/K316Q-FVII, S314E/L305V-FVII, S314E/K337A-FVII, S314E/V158D-FVII, S314E/E296V-FVII, S314E/M298Q-FVII, S314E/V158T-FVII, K316H/L305V-FVII, K316H/K337A-FVII, K316H/V158D-FVII, K316H/E296V-FVII, K316H/M298Q-FVII, K316H/V158T-FVII, K316Q/L305V-FVII, K316Q/K337A-FVII, K316Q/V158D-FVII, K316Q/E296V-FVII, K316Q/M298Q-FVII, K316Q/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D-FVII, S314E/L305V/E296V-FVII, S314E/L305V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/K337A/E296V-FVII, S314E/L305V/K337A/V158D-FVII, S314E/L305V/V158D/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V-FVII, S314E/L305V/V158T/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V-FVII, S314E/L305V/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316H/L305V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D-FVII, K316H/L305V/E296V-FVII, K316H/L305V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T-FVII, K316H/L305V/K337A/V158T-FVII, K316H/L305V/K337A/M298Q-FVII, K316H/L305V/K337A/E296V-FVII, K316H/L305V/K337A/V158D-FVII, K316H/L305V/V158D/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V-FVII, K316H/L305V/V158T/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V-FVII, K316H/L305V/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316Q/L305V/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158D-FVII, K316Q/L305V/E296V-FVII, K316Q/L305V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T-FVII, K316Q/L305V/K337A/V158T-FVII, K316Q/L305V/K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/K337A/E296V-FVII, K316Q/L305V/K337A/V158D-FVII, K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V-FVII, K316Q/L305V/V158T/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V-FVII, K316Q/L305V/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/K337A-FVII, F374Y/V158D-FVII, F374Y/E296V-FVII, F374Y/M298Q-FVII, F374Y/V158T-FVII, F374Y/S314E-FVII, F374Y/L305V-FVII, F374Y/L305V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D-FVII, F374Y/L305V/E296V-FVII, F374Y/L305V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158T-FVII, F374Y/L305V/S314E-FVII, F374Y/K337A/S314E-FVII, F374Y/K337A/V158T-FVII, F374Y/K337A/M298Q-FVII, F374Y/K337A/E296V-FVII, F374Y/K337A/V158D-FVII, F374Y/V158D/S314E-FVII, F374Y/V158D/M298Q-FVII, F374Y/V158D/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E-FVII, F374Y/V158T/M298Q-FVII, F374Y/V158T/E296V-FVII, F374Y/E296V/S314E-FVII, F374Y/S314E/M298Q-FVII, F374Y/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/K337A/V158D-FVII, F374Y/L305V/K337A/E296V-FVII, F374Y/L305V/K337A/M298Q-FVII, F374Y/L305V/K337A/V158T-FVII, F374Y/L305V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158D/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/E296V/V158T-FVII, F374Y/L305V/E296V/S314E-FVII, F374Y/L305V/M298Q/V158T-FVII, F374Y/L305V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/S314E-FVII, F374Y/K337A/S314E/V158T-FVII, F374Y/K337A/S314E/M298Q-FVII, F374Y/K337A/S314E/E296V-FVII, F374Y/K337A/S314E/V158D-FVII, F374Y/K337A/V158T/M298Q-FVII, F374Y/K337A/V158T/E296V-FVII, F374Y/K337A/M298Q/E296V-FVII, F374Y/K337A/M298Q/V158D-FVII, F374Y/K337A/E296V/V158D-FVII, F374Y/V158D/S314E/M298Q-FVII, F374Y/V158D/S314E/E296V-FVII, F374Y/V158D/M298Q/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E/M298Q-FVII, F374Y/V158T/M298Q/E296V-FVII, F374Y/E296V/S314E/M298Q-FVII, F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E-FVII, F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-FVII, F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-FVII, F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII, S52A-제VII 인자, S60A-제VII 인자; R152E-제VII 인자, S344A-제VII 인자, T106N-FVII, K143N/N145T-FVII, V253N-FVII, R290N/A292T-FVII, G291N-FVII, R315N/V317T-FVII, K143N/N145T/R315N/V317T-FVII; 및 233Thr 내지 240Asn의 아미노산 서열에서 치환, 첨가 또는 결실을 가지는 FVII; 304Arg 내지 329Cys의 아미노산 서열에서 치환, 첨가 또는 결실을 가지는 FVII; 및 1531Ie 내지 223Arg의 아미노산 서열에서 치환, 첨가, 또는 결실을 가지는 FVII.
본 발명의 목적상, 제VII 인자 폴리펩타이드의 생물학적 활성("제VII 인자 생물학적 활성")은 제VII 인자 결핍 혈장 및 트롬보플라스틴을 사용하여 혈액 응고를 촉진하기 위한 제조물의 능력을 측정함으로써 정량할 수 있는데, 이는 예를 들면 미국 특허 5,997,864에서 기술된 바와 같다. 이 분석방법에서는, 생물학적 활성은 대조군 샘플에 대비되는 응고되는 시간의 감소율로서 표현되며, 1 유닛/㎖ 제VII 인자 활성을 함유하는 인간 표준 혈청 풀(pool)과 비교함으로써 "제VII 인자 유닛"으로 변환된다. 대안적으로는, 제VIIa 인자 생물학적 활성은 하기 (i) 내지 (v)를 수행함으로써 정량할 수 있다.
(i) 지질막 및 제X 인자가 끼워진 TF를 포함하는 시스템에서, 활성화된 제X 인자(제Xa 인자)를 생성시킬 수 있는 제VII 인자 폴리펩타이드의 능력을 측정하는 것(Persson et al., J. Biol. Chem. 272: 19919-19924, 1997);
(ii) 액체 시스템에서, 제X 인자 가수분해를 측정하는 것("인 비트로(In Vitro ) 단백질분해 분석방법"(분석방법 2), 하기 참조);
(iii) 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance)에 근거한 장치를 사용하여 TF에 대한 제VII 인자 폴리펩타이드의 물리적인 결합능을 측정하는 것(Persson, FEBS Letts. 413:359-363, 1997);
(iv) 제VII 인자 폴리펩타이드에 의한 합성 기질의 가수분해능을 측정하는 것("인 비트로 가수분해 분석방법"(분석방법 1), 하기 참조); 및
(v) TF가 없는 인 비트로 시스템에서, 트롬빈의 발생을 측정하는 것("트롬빈 발생 분석방법"(분석방법 3), 하기 참조).
일부 양태에서, 제VII 인자 폴리펩타이드는 인간 제VIIa 인자이고, 바람직하게는 재조합으로 제조된 인간 제VIIa 인자이다.
다른 양태에서, 제VII 인자 폴리펩타이드는 제VII 인자 서열 변이체이다.
일부 양태에서, 제VII 인자 폴리펩타이드는 야생형 인간 제VII 인자와는 상이한 글리코실화를 갖는다.
다양한 양태에서, 예를 들면, 제VII 인자 폴리펩타이드가 제VII 인자 관련 폴리펩타이드이거나 제VII 인자 서열 변이체인 경우에, 제VII 인자 폴리펩타이드와 본래의 인간 제VIIa 인자(야생형 FVIIa)의 활성 간의 비율은, 본 명세서에서 기술된 바와 같이 "인 비트로 단백질분해 분석방법"(분석방법 2)에 의해 시험하였을 때, 적어도 약 1.25, 바람직하게는 적어도 약 2.0, 또는 4.0, 가장 바람직하게는 적어도 약 8.0이다.
일부 양태에서, 예를 들면, 제VII 인자 폴리펩타이드가 제VII 인자 관련 폴리펩타이드, 특히 변이체인 경우에, 제VII 인자 폴리펩타이드와 본래의 인간 제VIIa 인자(야생형 FVIIa)의 활성 간의 비율은, 본 명세서에서 기술된 바와 같이 "인 비트로 가수분해 분석방법"(분석방법 1, 하기 참조)에 의해 시험하였을 때, 적어도 약 1.25이고, 다른 양태에서, 그 비율은 적어도 약 2.0이며, 다른 양태에서, 그 비율은 적어도 약 4.0이다.
본 발명에 따른 조성물은 안정하기 때문에 유용하며, 바람직하게는 제VII 인자 폴리펩타이드의 즉석 조성물이기 때문에 유용하다. 조성물은 전형적으로는 2 내지 8℃ 범위의 온도에 보관한 경우 적어도 6개월 간은 안정하며, 바람직하게는 36개월까지 안정하다.
"안정하다"라는 용어는 (i) 2 내지 8℃에서 6개월간 보관한 후 1단계 응고 분석방법(분석방법 4)에 의해 측정된 바에 따르면 조성물이 초기 생물학적 활성의 적어도 50%를 보유하는 것, 또는 (ii) 2 내지 8℃에서 6개월간 보관한 후, 중쇄 파괴 산물의 함량이 제VII 인자 폴리펩타이드의 최초 함량의 최대 40%(w/w)인 것을 의미한다.
"초기 함량"이라는 용어는 조성물 제조시 조성물에 첨가된 제VII 인자 폴리펩타이드의 양을 말하는 것이다.
바람직하게는, 안정한 조성물은 2 내지 8℃에서 6개월간 보관한 후 초기 생물학적 활성의 적어도 70%, 예컨대 적어도 80%, 또는 적어도 85%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95%를 보유한다.
바람직하게는, 여러 양태에서, 안정한 조성물내 중쇄 파괴 산물 함량의 증가율은 제VII 인자 폴리펩타이드의 초기 함량의 약 30% (w/w) 이하, 약 25% (w/w) 이하, 약 20% (w/w) 이하, 약 15% (w/w) 이하, 약 10% (w/w) 이하, 약 5% (w/w) 이하, 또는 약 3% (w/w) 이하이다.
바람직한 양태에서, (i) 20 내지 28℃에서 6개월간 보관한 후 1단계 응고 분석방법(분석방법 4)에 의해 측정된 바에 따르면 조성물은 초기 생물학적 활성의 적어도 50%를 보유하거나, (ii) 20 내지 28℃에서 6개월간 보관한 후 중쇄 파괴 산물의 함량 증가율은 제VII 인자 폴리펩타이드의 초기 함량의 최대 40%(w/w)이다. 더욱 바람직한 양태에서, (i) 37 내지 43℃에서 6개월간 보관한 후 1단계 응고 분석방법(분석방법 4)에 의해 측정된 바에 따르면 조성물은 초기 생물학적 활성의 적어도 50%를 보유하거나, (ii) 37 내지 43℃에서 6개월간 보관한 후 중쇄 파괴 산물의 함량 증가율은 제VII 인자 폴리펩타이드의 초기 함량의 최대 40%(w/w)이다.
제 VII 인자 폴리펩타이드의 제조 및 정제
본 발명에 사용하기에 적합한 정제된 인간 제VIIa 인자는 바람직하게는 DNA 재조합 기술로 만들어지는데, 이러한 기술에 관하여는 예를 들면 하기의 문헌에 기술되어 있다: Hagen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 2412-2416, 1986, 또는 유럽 특허 No. 0 200 421 (ZymoGenetics, Inc.).
제VII 인자는 또한 하기의 문헌에 기술된 방법으로 제조될 수도 있다: Broze and Majerus, J.Biol.Chem. 255 (4) : 1242-1247, 1980 및 Hedner and Kisiel, J. Clin. Invest. 71 : 1836-1841, 1983. 이러한 방법들은 검출가능한 양의 다른 혈액 응고 인자 없이 제VII 인자를 생산한다. 최종 정제 단계로서 추가로 겔 여과를 포함시키면 더욱 정제된 제VII 인자를 수득할 수 있다. 제VII 인자는 공지된 방식, 예를 들면 각종 상이한 혈장 단백질, 예컨대 제XIIa 인자, 제IX 인자 또는 Xa 인자에 의해, 활성화된 제VIIa 인자로 전환된다. 대안적으로는, Bjoern et al. (Research Disclosure, 269 September 1986, pp. 564-565)에도 기술된 바와 같이, 제VII 인자는 이온 교환 크로마토그래피 컬럼, 예컨대 Mono Q® (Pharmacia fine Chemicals) 등, 또는 자가활성화 용액을 통과시킴으로써 완전히 활성화시킬 수 있다.
제VII 인자 관련 폴리펩타이드는 야생형 제VII 인자의 변형을 통해, 또는 재조합 기술을 통해 제조될 수 있다. 야생형 제VII 인자와 비교하면 변경된 아미노산 서열을 갖는 제VII 인자 관련 폴리펩타이드는, 야생형 제VII 인자를 암호화하는 핵산 서열을 아미노산 코돈을 변경하거나, 천연 제VII 인자를 암호화하는 핵산 서열에서 공지된 방식으로, 예를 들면 부위특이적 돌연변이발생시켜 일부 아미노산 코돈을 제거함으로써 변형시키면 제조할 수 있다.
제VIIa 인자 분자의 기능에 필수적인 영역 밖에 치환하여, 활성인 폴리펩타이드를 생성할 수 있음은 당업자에게 자명한 사실이다. 제VII 인자 폴리펩타이드의 활성에 필수적이어서, 바람직하게는 치환되지 않을 아미노산 잔기는 당업계에 공지된 절차에 따라 동정할 수 있는데, 이러한 절차에는 부위-지향적 돌연변이발생 또는 알라닌 스캐닝 돌연변이발생(참조:예를 들면, Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085)이 있다. 후자의 기술을 살펴보면 분자내 양으로 하전된 모든 분자에 돌연변이를 도입하고, 생성된 돌연변이 분자가 응집되는지 시험하여, 각각 분자의 활성에 필수적인 아미노산 잔기를 동정하기 위한 교차 활성을 측정하게 된다. 기질-효소 상호작용 부위도 자기공명분석, 크리스탈로그래피(crystallography) 또는 광친화성 레이블링(photoaffinity labelling)과 같은 기술에 의해 측정된 3차원 구조의 분석을 통해 결정할 수 있다(참조: 예를 들면, de Vos et al., 1992, Science 255: 306- 312; Smith et al., 1992, Journal of Molecular Biology 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Letters 309: 59-64).
하나의 뉴클레오타이드를 다른 뉴클레오타이드로 교환하기 위하여 핵산 서열에 돌연변이를 도입하는 것은 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 부위 지향적 돌연변이발생법을 사용함으로써 달성할 수 있다. 특히 유용한 것은, 미지의 삽입체와 희망하는 돌연변이를 함유하는 두개의 합성 프라이머를 갖는 수퍼-코일드, 더블 스트랜드 DNA 벡터를 활용하는 절차이다. 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 각각이 벡터의 반대 스트랜드에 상보적이며, Pfu DNA 폴리머라아제를 사용하여 온도가 순환하여 반복되는 동안에 연장된다. 프라이머를 도입하면, 스태깅된 틈을 함유하는 돌연변이 발생한 플라스미드가 생성된다. 온도가 순환하여 반복되는 것이 끝나면, 메틸화 및 반메틸화된 DNA에 대해 특이적인 Dpnl로 산물을 처리하는데, 이것은 모DNA 주형을 분해하고, 돌연변이를 함유한 합성된 DNA를 선택하기 위한 것이다. 변이체를 생성하고, 동정하며, 분리하기 위한 당업계에 공지되어 있는 다른 절차도 사용할 수 있으며, 이러한 것에는 예컨대, 유전자 셔플링(gene shuffling) 또는 파지 디스플레이 기술(phage display technique)이 있다.
오리진의 세포로부터 폴리펩타이드를 분리하는 것은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 달성할 수 있는데, 이러한 방법에는 접착 세포 배양액으로부터 희망하는 산물을 함유하는 세포 배양 배지를 분리하는 것; 비접착 세포를 제거하기 위하여 원심분리하거나 여과하는 것; 등이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다.
임의로는, 제VII 인자 폴리펩타이드는 추가로 정제할 수 있다. 정제는 당업계에 공지된 임의의 방식을 사용하여 달성할 수 있는데, 이러한 방식에는 친화 크로마토그래피, 예컨대 항-제VII 인자 항체 컬럼(참조: 예를 들면, Wakabayashi et al., J. Biol. Chem. 261 : 11097, 1986; 및 Thim et al., Biochem. 27:7785, 1988); 소수성 상호작용 크로마토그래피; 이온교환 크로마토그래피; 크기배제 크로마토그래피; 전기영동 절차(예를 들면, 등전성 포커싱(isoelectric focusing, IEF) 용해도차(예를 들면, 암모늄 설페이트 침전), 또는 추출 등이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다. 이에 대해서는 일반적으로는 Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, New York, 1982; 및 Protein Purification, J. C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989을 참조하면 된다. 정제 후에는, 제조물은 바람직하게는 숙주 세포에서 유래한 제VII 인자 폴리펩타이드가 아닌 것을 10 wt% 미만, 더욱 바람직하게는 5 wt% 미만, 및 가장 바람직하게는 1 wt% 미만 함유한다.
제VII 인자 폴리펩타이드의 농축액을 제조하는데 있어 완전히 활성화되지 않은 경우에, 제VII 인자 폴리펩타이드는, 제XIIa 인자 또는 트립신형 특이성을 갖는 다른 프로테아제에 의해, 예컨대 IXa 인자, 칼리크레인(kallikrein), 제Xa 인자, 및 트롬빈에 의해 단백질분해성 절단으로 절단될 수 있다. 이에 관해서는 하기의 문헌을 참조하면 된다: 예를 들어 Osterud et al., Biochem. 11 :2853 (1972); Thomas, U.S. Patent No. 4,456,591; 및 Hedner et al., J. Clin. Invest. 71 : 1836 (1983). 대안적으로는, 제VII 인자 폴리펩타이드는 이온 교환 크로마토그래피 컬럼, 예컨대 Mono Q? (Pharmacia fine Chemicals) 등, 또는 자가활성화 용액을 통과함으로써 활성화될 수 있다.
실험절차
일반적 방법
제 VII 인자 폴리펩타이드의 생물학적 활성을 측정하기 위해 적합한 분석방법
본 발명에 유용한 제VII 인자 폴리펩타이드는 간단한 인 비트로 예비 시험으로서 수행될 수 있는 적당한 분석방법에 의해 선택될 수 있다. 이에 따라, 본 명세서에서는 제VII 인자 폴리펩타이드의 활성에 대한 간단한 시험("인비트로 가수분해 분석방법"이라고 칭함)을 기술한다.
인비트로 가수분해 분석방법(분석방법 1)
본래의(야생형) 제VII 인자 및 제VII 인자 폴리펩타이드(모두 이후로는 "제VIIa 인자"로 칭함)를 특정한 활성에 대해 분석할 수 있다. 이들은 특정 활성을 직접 비교하기 위해 평행 분석할 수도 있다. 이 분석방법은 마이크로적정 플레이트(MaxiSorp, Nunc, Denmark)에서 수행한다. 최종 농도가 1 mM인 색깔을 나타내는 (chromogenic) 기질인 D-Ile-Pro-Arg-p-니트로아닐라이드(nitroanilide) (S- 2288, Chromogenix, Sweden)을, 0.1 M NaCl, 5 mM CaCl2 및 1 mg/㎖ 소 혈청 알부민을 함유하는 50 mM HEPES(pH 7.4) 중에 있는 제VII 인자(최종 농도 100 nM)에 첨가한다. SpectraMaxTM 340 플레이트 리더(plate reader) (Molecular Devices, USA)에서 405 nM에서의 흡광도를 연속적으로 측정한다. 20분 배양한 동안에 발현된 흡광도에서, 효소를 함유하지 않는 빈(blank) 웰(well)중의 흡광도를 뺀 것을, 제VII 인자 폴리펩타이드와 야생형 제VIIa 인자의 활성 간의 비율을 계산하기 위해 사용한다: 비율 = (A405 nm 제VII 인자 폴리펩타이드)/(A405 nm 야생형 제VIIa 인자).
상기를 기준으로, 본래의 제VIIa 인자와 비교하여 그보다 낮은, 그에 필적하는 또는 그보다 높은 활성을 지닌 제VII 인자 폴리펩타이드를 동정할 수 있는데, 예를 들면, 제VII 인자 폴리펩타이드의 활성 대 본래의 제VII 인자(야생형 FVII)의 활성 간의 비율이 약 1.0인 것과 1.0 이상인 제VII 인자 폴리펩타이드를 동정할 수 있다.
제VII 인자 폴리펩타이드의 활성을 또한 예컨대 제X 인자와 같은 생리학적 기질을 사용하여 측정할 수도 있는데("인비트로 단백질분해 분석방법"), 여기에서는 적당하게는 100-1000nM의 농도에서 사용하고, 생성된 제Xa 인자는 적당한 색깔을 나타내는 기질(예를 들면, S-2765)의 첨가후에 측정한다. 뿐만 아니라, 활성 분석방법은 생리학적 온도에서 수행할 수 있다.
인비트로 단백질분해 분석방법(분석방법 2)
본래의(야생형) 제VIIa 인자 및 제VII 인자 폴리펩타이드(둘 다 이후 "제VIIa 인자"로 칭함)는 그들의 특이적 활성을 직접 비교하기 위하여 평행분석할 수 있다. 이 분석방법은 마이크로적정 플레이트(MaxiSorp, Nunc, Denmark)에서 수행한다. 0.1 M NaCl, 5 mM CaCl2 및 1 mg/㎖ 소 혈청 알부민을 함유하는 100㎕의 50 mM HEPES(pH 7.4) 중에 있는 제VIIa 인자(10 nM) 및 제X 인자(0.8μM)를 15분간 인큐베이팅한다. 그 다음에, 0.1M NaCl, 20 mM EDTA 및 1 mg/㎖ 소 혈청 알부민을 함유하는 50 ㎕ 50 mM HEPES(pH 7.4)를 첨가하여, 제X 인자 절단을 중단시킨다. 생성된 제Xa 인자 양을 색상을 나타내는 기질인, Z-D-Arg-Gly-Arg-P-니트로아닐라이드(nitroanilide) (S-2765, Chromogenix, Sweden)를 최종 농도 0.5 mM로 첨가함으로써 측정한다. SpectraMaxTM 340 플레이트 리더(plate reader) (Molecular Devices, USA)에서 405 nM에서의 흡광도를 연속적으로 측정한다. 10분 배양한 동안에 발현된 흡광도에서, FVIIa를 함유하지 않는 빈 웰 중의 흡광도를 뺀 것을, 제VII 인자 폴리펩타이드와 야생형 제VIIa 인자의 단백질분해 활성 간의 비율을 계산하기 위해 사용한다: 비율 = (A405 nm 제VII 인자 폴리펩타이드)/(A405 nm 야생형 제VIIa 인자).
상기 식을 기준으로, 본래의 제VIIa 인자와 비교하여 그보다 낮은, 그에 필적하는, 또는 그보다 높은 활성을 지닌 제VII 인자 폴리펩타이드를 동정할 수 있는데, 예를 들면, 제VII 인자 폴리펩타이드의 활성과 본래의 제VII 인자(야생형 FVII)의 활성 간의 비율이 약 1.0이거나 1.0 이상인 제VII 인자 폴리펩타이드를 동정할 수 있다.
트롬빈 생성 분석방법(분석방법 3)
제VII 인자 폴리펩타이드가 트롬빈을 생성시킬 수 있는 능력을 모든 적절한 응고 인자 및 생리학적 농도에서의 억제제(A형 혈우병 증상을 보일 때 제VIII 인자는 제외) 및 활성화된 혈소판을 포함하는 분석방법(분석방법 3)으로 측정할 수 있다(본원에 참조로서 인용되는 Monroe et al. (1997) Brit. J. Haematol. 99, 542-547의 543페이지에 기술되어 있는 바와 같다).
1단계 응고 분석방법(응고 분석방법)(분석방법 4)
제VII 인자 폴리펩타이드를 1단계 응고 분석방법(분석방법 4)을 사용하여 특이적 활성("응고 활성")에 대해 분석할 수도 있다. 이러한 목적을 위하여, 시험할 샘플을 50 mM PIPES-완충액 (pH 7.2), 1% BSA에 희석시키고, 40 μl를 40 μl의 제VII 인자 결핍 혈장 및 80 μl의 Innovin® (Dade-Behring; cat. no. B4212-50)과 함께 인큐베이팅한다. 응고 시간을 측정하고, 평행선 분석방법으로 참고적 표준값을 사용하여 표준 곡선과 비교한다.
중쇄 파괴 및 산화 형태(분석방법 5)
하기의 실시예에서 중쇄 파괴 산물 함량 및 산화 형태 함량을 다음에서 기술하는 바와 같이 역상(reverse-phase) HPLC(RP-HPLC)에 의해 측정한다.
전매특허의 4.5x250 mm 부틸결합 실리카 컬럼 상에서 입자 크기 5 μm 및 세공 크기 300 Å로 하여 역상 HPLC를 수행한다. 컬럼 온도: 70℃. A-완충액: 0.1% v/v 트리플루오로아세트산. B-완충액: 0.09% v/v 트리플루오로아세트산, 80% v/v 아세토니트릴. 컬럼을 X 내지 (X+13)% B까지 30분간 선형 구배를 주어 용리하였다. X는 FVIIa가 대략 26분간 보유 시간을 가지고 용리되도록 조정하였다. 유속: 1.0 ㎖/min. 검출: 214 nm. 로딩: 25 μg FVIIa.
응집물의 함량(분석방법 6)
하기의 실시예에서, 응집물의 함량을 하기에 기술하는 바와 같이 비변성 크기 배제 HPLC(SE-HPLC)에 의해 측정한다. 비변성 크기 배제 크로마토그래피는 이동상으로서 0.2 M 암모늄설페이트, 5% 2-프로판올 pH 7.0을 사용하여 Waters Protein Pak 300 SW 컬럼, 7.5 x 300 mm에서 수행한다. 유속: 0.5 ㎖/min. 검출: 215 nm. 로딩: 25 μg FVIIa.
desGla -제 VII 인자 폴리펩타이드 구조의 함량의 측정
완전한 길이의 제VII 인자 폴리펩타이드 구조에 대한 desGla-제VII 인자 폴리펩타이드 구조의 함량을 SDS-PAGE에 의해 측정한다. 150 μl의 샘플을 50 μl의 샘플 완충액 (비환원성, NuPAGE)에 첨가하고, 5분간 끓인다. 10 μl의 샘플을 12% BisTris NuPAGE Gel (Invitrogen)에 로딩한다. 겔을 200 볼트, 120 mA에서 55분간 전개시킨다. 코마시 브릴리언트 블루 용액(coomassie brilliant blue solution)을 사용하여 겔을 염색하고, 탈염색한 뒤 건조시킨다. 해당하는 desGla-제VII 인자 폴리펩타이드 함량은 desGla-제VII 인자 폴리펩타이드 밴드가 있는 영역의 넓이를, 대략 50 kDa에서의 제VII 인자 폴리펩타이드 밴드 및 45 kDa에서의 desGla-제VII 인자 폴리펩타이드 밴드가 있는 영역으로 나누어 계산한다.
대안적으로는, desGla-제VII 인자 폴리펩타이드 구조의 함량은 음이온 교환 HPLC로 측정할 수도 있다. 이 방법은 완전한 제VII 인자 폴리펩타이드에서 Gla-도메인이 적은 제VII 인자 폴리펩타이드를 분리하는 방법이다. Gla-도메인이 적은 제VII 인자 폴리펩타이드의 함량은 제VII 인자 관련 피크 영역에서 차지하는 %로서 표현된다. 분석용 컬럼은 DNAPac PA-100, 250x4 mm(Dionex Corp.)를 사용한다. 컬럼을 유속 1.0 ㎖/분으로, 30분 이상, pH 9.0에서 0-0.5 M 암모늄 아세테이트로 선형 구배를 사용하여 용리시킨다. 용출액의 280 nM에서의 흡광도를 관찰한다.
하기의 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것이다. 이러한 실시예는 오로지 설명하기 위한 것이며, 청구항에 의해 정해지는 본 발명의 범위를 어떠한 방식으로든 제한하고자 하는 것은 아님을 밝혀둔다.
실시예 1
애머샴 Q-세파로즈 패스트 플로우 매질(Amersham Q-sepharose Fast Flow media)로 채워지고, 50 mM NaCl, 20 mM 트라이-소듐-시트레이트(tri-sodium-citrate), pH 7.0를 함유하는 용액으로 평형이 유지되는, 음이온 교환 크로마토그 래피(AIEC) 컬럼(1.6 cm 내부직경 x 7.5 cm 길이 = 15 ㎖ 컬럼 용적(CV))에서 농축액 분석을 실시한다. 로딩은 1.4 mg/㎖ FVIIa를 함유하는 12 CV의 용액이고, 그 후 50 mM NaCl, 20 mM 트라이-소듐-시트레이트, pH 7.0를 사용하여 7 CV 세척을 실시한다. 용리는 50 mM NaCl, 20 mM 트라이-소듐-시트레이트, pH 4.2까지 단계적 구배를 사용하여 수행한다. 전체적인 정제는 40 CV/h의 유속 및 5℃의 온도에서 수행한다. 대략 3.3 CV 후에 산물 정점(peak)이 용리되고, 용출액을 pH 6.0/NaOH로 조정한다. 용출액 농도는 RP-HPLC에 의해 측정하면 3.3 mg/㎖이다.
실시예 2
애머샴 Q-세파로즈 패스트 플로우 매질로 채워지고, 10 mM EDTA, 10 mM 히스티딘, pH 6.0을 함유하는 용액으로 평형이 유지되는, AIEC 컬럼(상기와 크기는 같은 것)에서 농축액 분석을 실시한다. 로딩은 1.4 mg/㎖ FVIIa를 함유하는 12 CV의 용액이고, 그 후 175 mM NaCl, 10 mM 히스티딘, pH 6.0을 사용하여 1회 5 CV 세척한 다음에, 50 mM NaCl, 10 mM 히스티딘, pH 6.0을 사용하여 2회 5 CV 세척한다. 용리는 10 mM 히스티딘에 의해 pH 6.0으로 완충되는 30 mM CaCl2, 50 mM NaCl까지 단계적 구배를 사용하여 수행한다. 전체적인 정제는 40 CV/h의 유속 및 5℃의 온도에서 수행한다. 대략 1.9 CV 후에 산물 정점이 용리된다. 용출액 농도는 RP-HPLC에 의해 측정하면 6.1 mg/㎖이다.
실시예 3
애머샴 Q-세파로즈 패스트 플로우 매질로 채워지고, 10 mM EDTA, 10 mM 히스 티딘, pH 6.0을 함유하는 용액으로 평형이 유지되는, AIEC 컬럼(상기와 크기는 같은 것)에서 농축액 분석을 실시한다. 로딩은 1.4 mg/㎖ FVIIa를 함유하는 12 CV의 용액이고, 그 후 50 mM NaCl, 10 mM 히스티딘, pH 6.0을 사용하여 5 CV 세척한다. 용리는 10 mM 히스티딘에 의해 pH 6.0으로 완충되는 30 mM CaCl2, 50 mM NaCl까지 단계적 구배를 사용하여 수행한다. 전체적인 정제는 40 CV/h의 유속 및 5℃의 온도에서 수행한다. 대략 1.9 CV 후에 산물 정점이 용리된다. 용출액 농도는 RP-HPLC에 의해 측정하면 5.4 mg/㎖이다.
실시예 4
애머샴 Q-세파로즈 패스트 플로우 매질로 채워지고, 10 mM EDTA, 10 mM 히스티딘, pH 6.0을 함유하는 용액으로 평형이 유지되는, AIEC 컬럼(상기와 크기는 같은 것)에서 농축액 분석을 실시한다. 로딩은 1.4 mg/㎖ FVIIa를 함유하는 12 CV의 용액이고, 그 후 50 mM NaCl, 10 mM 히스티딘, pH 6.0을 사용하여 5 CV 세척한다. 용리는 10 mM 히스티딘에 의해 pH 6.0으로 완충되는 10 mM CaCl2, 50 mM NaCl까지 단계적 구배를 사용하여 수행한다. 전체적인 정제는 40 CV/h의 유속 및 5℃의 온도에서 수행한다. 대략 2.2 CV 후에 산물 정점이 용리된다. 용출액 농도는 RP-HPLC에 의해 측정하면 4.6 mg/㎖이다.
실시예 5
애머샴 Q-세파로즈 패스트 플로우 매질로 채워지고, 10 mM EDTA, 10 mM 히스티딘, pH 6.0을 함유하는 용액으로 평형이 유지되는, AIEC 컬럼(상기와 크기는 같 은 것)에서 농축액 분석을 실시한다. 로딩은 1.4 mg/㎖ FVIIa를 함유하는 12 CV의 용액이고, 그 후 50 mM NaCl, 10 mM 히스티딘, pH 6.0을 사용하여 5 CV 세척한다. 용리는 10 mM 히스티딘에 의해 pH 6.0으로 완충되는 10 mM CaCl2, 100 mM NaCl까지 단계적 구배를 사용하여 수행한다. 전체적인 정제는 40 CV/h의 유속 및 5℃의 온도에서 수행한다. 대략 1.4 CV 후에 산물 정점이 용리된다. 용출액 농도는 RP-HPLC에 의해 측정하면 9.1 mg/㎖이다.
실시예 6
애머샴 Q-세파로즈 패스트 플로우 매질로 채워지고, 10 mM EDTA, 10 mM 히스티딘, pH 6.0을 함유하는 용액으로 평형이 유지되는, AIEC 컬럼(상기와 크기는 같은 것)에서 농축액 분석을 실시한다. 로딩은 1.4 mg/㎖ FVIIa를 함유하는 12 CV의 용액이고, 그 후 50 mM NaCl, 10 mM 히스티딘, pH 6.0을 사용하여 5 CV 세척한다. 용리는 10 mM 히스티딘에 의해 pH 6.0으로 완충되는 10 mM CaCl2, 200 mM NaCl까지 단계적 구배를 사용하여 수행한다. 전체적인 정제는 40 CV/h의 유속 및 5℃의 온도에서 수행한다. 대략 1.4 CV 후에 산물 정점이 용리된다. 용출액 농도는 RP-HPLC에 의해 측정하면 10.0 mg/㎖이다.
실시예 7
어플라이드 바이오시스템즈 POROS 50 HQ 매질(Applied Biosystems POROS 50 HQ media)로 채워지고, 10 mM EDTA, 10 mM 히스티딘, pH 6.0을 함유하는 용액으로 평형이 유지되는, AIEC 컬럼(상기와 크기는 같은 것)에서 농축액 분석을 실시한다. 로딩은 1.4 mg/㎖ FVIIa를 함유하는 11 CV의 용액이고, 그 후 50 mM NaCl, 10 mM 히스티딘, pH 6.0을 사용하여 5 CV 세척한다. 용리는 10 mM 히스티딘에 의해 pH 6.0으로 완충되는 10 mM CaCl2, 100 mM NaCl까지 단계적 구배를 사용하여 수행한다. 평형유지, 로딩 및 세척은 80 CV/h의 유속 및 5℃의 온도에서 수행하고, 용리는 40 CV/h의 유속에서 수행한다. 대략 1.5 CV 후에 산물 정점이 용리된다. 용출액 농도는 RP-HPLC에 의해 측정하면 6.6 mg/㎖이다.
실시예 8
어플라이드 바이오시스템즈 POROS 50 HQ 매질로 채워지고, 10 mM EDTA, 10 mM 히스티딘, pH 6.0을 함유하는 용액으로 평형이 유지되는, AIEC 컬럼(상기와 크기는 같은 것)에서 농축액 분석을 실시한다. 로딩은 1.4 mg/㎖ FVIIa를 함유하는 11 CV의 용액이고, 그 후 50 mM NaCl, 10 mM 히스티딘, pH 6.0을 사용하여 5 CV 세척한다. 용리는 10 mM 히스티딘에 의해 pH 6.0으로 완충되는 10 mM CaCl2, 200 mM NaCl까지 단계적 구배를 사용하여 수행한다. 평형유지, 로딩 및 세척은 80 CV/h의 유속 및 5℃의 온도에서 수행하고, 용리는 40 CV/h의 유속에서 수행한다. 대략 1.4 CV 후에 산물 정점이 용리된다. 용출액 농도는 RP-HPLC에 의해 측정하면 16.0 mg/㎖이다.
실시예 9
어플라이드 바이오시스템즈 POROS 50 HQ 매질로 채워지고, 10 mM EDTA, 10 mM 히스티딘, pH 6.0을 함유하는 용액으로 평형이 유지되는, AIEC 컬럼(상기와 크 기는 같은 것)에서 농축액 분석을 실시한다. 로딩은 1.4 mg/㎖ FVIIa를 함유하는 11 CV의 용액이고, 그 후 50 mM NaCl, 10 mM 히스티딘, pH 6.0을 사용하여 5 CV 세척한다. 용리는 10 mM 히스티딘에 의해 pH 6.0으로 완충되는 30 mM CaCl2, 100 mM NaCl까지 선형 구배를 사용하여 5 CV에 걸쳐 수행한다. 평형유지, 로딩 및 세척은 80 CV/h의 유속 및 5℃의 온도에서 수행하고, 용리는 40 CV/h의 유속에서 수행한다. 대략 3.0 CV 후에 산물 정점이 용리된다. 용출액 농도는 RP-HPLC에 의해 측정하면 8.2 mg/㎖이다.
실시예 10
어플라이드 바이오시스템즈 POROS 50 HQ 매질로 채워지고, 10 mM 글리실글리신, 5 mM CaCl2, pH 9.0을 함유하는 용액으로 평형이 유지되는, AIEC 컬럼(상기와 크기는 같은 것)에서 농축액 분석을 실시한다. 로딩은 0.7 mg/㎖ FVIIa 및 5 mM CaCl2를 함유하는 22 CV의 용액이고, 그 후 50 mM NaCl, 10 mM 히스티딘, pH 6.0을 사용하여 5 CV 세척한다. 용리는 10 mM 히스티딘에 의해 pH 6.0으로 완충되는 30 mM CaCl2, 100 mM NaCl까지 선형 구배를 사용하여 5 CV에 걸쳐 수행한다. 평형유지 및 세척은 120 CV/h의 유속 및 5℃의 온도에서 수행하고, 용리는 40 CV/h의 유속에서 수행한다. 대략 2.9 CV 후에 산물 정점이 용리된다. 용출액 농도는 RP-HPLC에 의해 측정하면 7.8 mg/㎖이다.
실시예 11
어플라이드 바이오시스템즈 POROS 50 HQ 매질로 채워지고, 10 mM 글리실글리 신, 5 mM CaCl2, pH 9.0을 함유하는 용액으로 평형이 유지되는, AIEC 컬럼(상기와 크기는 같은 것)에서 농축액 분석을 실시한다. 로딩은 0.7 mg/㎖ FVIIa 및 5 mM CaCl2를 함유하는 22 CV의 용액이고, 그 후 50 mM NaCl, 10 mM 히스티딘, pH 6.0을 사용하여 1회 5 CV 세척한 후, 10 mM 히스티딘, pH 6.0을 사용하여 2회 2 CV 세척한다. 용리는 10 mM 히스티딘에 의해 pH 6.0으로 완충되는 50 mM CaCl2까지 선형 구배를 사용하여 5 CV로 수행한다. 평형유지 및 세척은 120 CV/h의 유속 및 5℃의 온도에서 수행하고, 용리는 40 CV/h의 유속에서 수행한다. 대략 3.2 CV 후에 산물 정점이 용리된다. 용출액 농도는 RP-HPLC에 의해 측정하면 7.3 mg/㎖이다.
실시예 12
어플라이드 바이오시스템즈 POROS 50 HQ 매질로 채워지고, 10 mM 글리실글리신, 5 mM CaCl2, pH 9.0을 함유하는 용액으로 평형이 유지되는, AIEC 컬럼(상기와 크기는 같은 것)에서 농축액 분석을 실시한다. 로딩은 0.7 mg/㎖ FVIIa 및 5 mM CaCl2를 함유하는 22 CV의 용액이고, 그 후 5 mM CaCl2, 10 mM 히스티딘, pH 6.0을 사용하여 1회 5 CV 세척한 후, 10 mM 히스티딘, pH 6.0을 사용하여 2 CV 2회 세척한다. 용리는 10 mM 히스티딘에 의해 pH 6.0으로 완충되는 50 mM CaCl2까지 선형 구배를 사용하여 5 CV에 걸쳐 수행한다. 평형유지 및 세척은 120 CV/h의 유속 및 5℃의 온도에서 수행하고, 용리는 40 CV/h의 유속에서 수행한다. 대략 3.2 CV 후에 산물 정점이 용리된다. 용출액 농도는 RP-HPLC에 의해 측정하면 6.4 mg/㎖이다.
실시예 13
어플라이드 바이오시스템즈 POROS 50 HQ 매질로 채워지고, 10 mM 글리실글리신, 5 mM CaCl2, pH 9.0을 함유하는 용액으로 평형이 유지되는, AIEC 컬럼(상기와 크기는 같은 것)에서 농축액 분석을 실시한다. 로딩은 0.7 mg/㎖ FVIIa 및 5 mM CaCl2를 함유하는 22 CV의 용액이고, 그 후 5 mM CaCl2, 10 mM 히스티딘, pH 6.0을 사용하여 1회 5 CV 세척한 후, 10 mM 히스티딘, pH 6.0을 사용하여 2 CV 2회 세척한다. 용리는 10 mM 히스티딘에 의해 pH 6.0으로 완충되는 50 mM CaCl2까지 단계적 구배를 사용하여 수행한다. 로딩 및 세척은 120 CV/h의 유속 및 5℃의 온도에서 수행하고, 용리는 40 CV/h의 유속에서 수행한다. 대략 1.3 CV 후에 산물 정점이 용리된다. 용출액 농도는 RP-HPLC에 의해 측정하면 16.0 mg/㎖이다.
실시예 14
어플라이드 바이오시스템즈 POROS 50 HQ 매질로 채워지고, 10 mM 글리실글리신, 5 mM CaCl2, pH 9.0을 함유하는 용액으로 평형이 유지되는, AIEC 컬럼(상기와 크기는 같은 것)에서 농축액 분석을 실시한다. 로딩은 0.7 mg/㎖ FVIIa 및 5 mM CaCl2를 함유하는 22 CV의 용액이고, 그 후 5 mM CaCl2, 10 mM 히스티딘, pH 6.0을 사용하여 6 CV 세척한다. 용리는 10 mM 히스티딘에 의해 pH 6.0으로 완충되는 50 mM CaCl2까지 선형 구배를 사용하여 5 CV에 걸쳐 수행한다. 로딩 및 세척은 120 CV/h의 유속 및 5℃의 온도에서 수행하고, 용리는 40 CV/h의 유속에서 수행한다. 대략 2.8 CV 후에 산물 정점이 용리된다. 용출액 농도는 RP-HPLC에 의해 측정하면 7.8 mg/㎖이다.
실시예 15
어플라이드 바이오시스템즈 POROS 50 HQ 매질로 채워지고, 10 mM 글리실글리신, 5 mM CaCl2, pH 9.0을 함유하는 용액으로 평형이 유지되는, AIEC 컬럼(상기와 크기는 같은 것)에서 농축액 분석을 실시한다. 로딩은 0.7 mg/㎖ FVIIa 및 5 mM CaCl2를 함유하는 22 CV의 용액이고, 그 후 5 mM CaCl2, 10 mM 히스티딘, pH 6.0을 사용하여 6 CV 세척한다. 용리는 10 mM 히스티딘에 의해 pH 6.0으로 완충되는 50 mM CaCl2까지 선형 구배를 사용하여 2 CV에 걸쳐 수행한다. 로딩 및 세척은 120 CV/h의 유속 및 5℃의 온도에서 수행하고, 용리는 40 CV/h의 유속에서 수행한다. 대략 2.0 CV 후에 산물 정점이 용리된다. 용출액 농도는 RP-HPLC에 의해 측정하면 9.0 mg/㎖이다.
상기 서술한 실시예 1-15의 수행 조건 및 용출액에 대한 분석 데이터를 하기의 표 1에 제시한다.
Figure 112007081301958-pct00001
침전
실시예 16
50 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 10 mM 글리실-글리신, pH 6.4를 함유하는 완충액 중에 1.2 mg rFVIIa/㎖의 농축액을 갖는 250 ㎖의 rFVIIa 벌크(bulk) 용액에, 112.5 g의 암모늄 설페이트(65% 포화도)를 첨가하였다. 부드럽게 15분간 교반한 후, 용액을 대략 4000 G(4500 rpm)로, 헤로스 소르발 라보퓨지(Heraus Sorvall Labofuge)에서, 4℃에서 1시간 동안 원심분리하였다. 침전물을 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 10 mM 히스티딘, pH 6.0을 함유하는 30 ㎖의 완충액에 용해시킨 다음에, 0.2μm 필터에 여과하였다. 재용해시킨 침전물 중의 rFVIIa의 농도는 OD280에 의해 8.3 mg/㎖까지 측정되었고, RP-HPLC에 의해 7.8 mg/㎖까지 측정되었다. 중쇄 파괴 산물의 함량은 침전 전에 8.3%였고, 침전 후에 8.5%였다. GD-FVIIa는 약간 감소되었고, 침전시 올리고머/이량체는 약간 증가되었다(표 2 참조).
Figure 112007081301958-pct00002
한외여과
실시예 17
실험실규모 TFF 시스템(Millipore, Biomax 30 kD 멤브레인이 있는 Pellicon XL 여과 장치(Millipore no. PXB030A50)가 장착된 것)를 247 ㎖ rFVIIa 벌크의 한외여과에 사용하였다. UF는 2-8℃와, 20-30 ㎖/분의 막을 통과하는 유속, 및 1-1.5 bar의 입력압력에서 수행하였다. UF 전에, 벌크는 50 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 10 mM 글리실-글리신, pH 6.05 완충액 중에 1.2 mg/㎖의 rFVIIa를 함유하였다. 벌크에는 최종 농도 20 mM이 될 때까지 시트레이트를 첨가하였고, 용적이 80 ㎖가 될 때까지 UF-시스템에서 농축시켰다. 200 mM NaCl, 1 mM 시트레이트, pH 6.0를 함유하는 완충액 400 ㎖를 사용하여, 투석여과를 일정한 용적에서 수행하였다. 투석여과 후에, 용적이 40 ㎖가 될 때까지 추가로 농축시켰다. 투석여과/농축 후의 rFVIIa의 농도는 OD28O 및 SEC-HPLC에 의해 측정한 바에 따르면 6.3 mg/㎖였다. 중쇄 파괴, GD-FVIIa 또는 중합체의 수준에는 그다지 변화가 발견되지 않았지만, 올리고머/이량체의 수준은 약간 증가하였다(표 3 참고).
Figure 112007081301958-pct00003
실시예 18
실시예 17에서 사용된 것과 동일한 UF-시스템을 투석여과 없이 rFVIIa 벌크의 농축액에 대해 사용하였다. 농축하기 전에, rFVIIa 벌크의 용적은 189 ㎖였고, rFVIIa 벌크의 농도는 50 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 10 mM 글리실-글리신, pH 6.05를 함유하는 완충액 중에 1.1 mg/㎖였다. CaCl2를 첨가하여, CaCl2의 최종 농도를 총 30 mM까지 증가시켰다. UF에 의해 농축된 후, 용액의 용적은 23 ㎖였고, rFVIIa 농축액의 농도는 OD280으로 측정된 바에 따르면 7.1 mg/㎖였고, SEC-HPLC로 측정된 바에 따르면 7.6이었다. UF 전과 UF 후에, 중쇄 파괴, GD-FVIIa, 중합체, 또는 올리고머/이량체의 수준에는 별다른 변화가 관찰되지 않았다. (표 4 참조)
Figure 112007081301958-pct00004
실시예 19
실시예 17에서 사용된 것과 동일한 UF-시스템을 투석여과 없이 rFVIIa 벌크의 농축액에 대해 사용하였다. 농축하기 전에, rFVIIa 벌크의 용적은 188 ㎖였고, rFVIIa 벌크의 농도는 50 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 10 mM 글리실-글리신, pH 6.81를 함유하는 완충액 중에 1.1 mg/㎖였다. 수크로스를 첨가하여, 최종 농도가 3%(w/w)가 되도록 하였다. UF에 의해 농축된 후 용액의 용적은 25 ㎖였고, rFVIIa 농축액의 농도는 OD280으로 측정된 바에 따르면 8.3 mg/㎖였고, SEC-HPLC로 측정된 바에 따르면 8.8이었다. UF 전과 UF 후에, 중쇄 파괴, GD-FVIIa, 중합체, 또는 올리고머/이량체의 수준에는 별다른 변화가 관찰되지 않았다. (표 5 참조)
Figure 112007081301958-pct00005
실시예 20
1.5 mg/㎖ 내지 12.0 mg/㎖의 rFVIIa 농축액을 실시예 19에서와 동일하게 수행하되, 단 3%(w/w) 마니톨을 수크로스 대신에 첨가한 것은 다르게 하여 수행하였다. 이 용액은 농축되는 동안에 눈으로는 투명해보였고, UF 전과 UF 후에, 중쇄 파괴, 산화, GD-FVIIa, 중합체, 또는 올리고머/이량체의 수준에는 별다른 변화가 관찰되지 않았다.
실시예 21
실시예 17에서 사용된 것과 동일한 UF-시스템을 투석여과 없이 rFVIIa 벌크의 농축액에 대해 사용하였다. 농축하기 전에, rFVIIa 벌크의 용적은 203 ㎖였고, rFVIIa 벌크의 농도는 50 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 10 mM 글리실-글리신, pH 6.62를 함유하는 완충액 중에 1.3 mg/㎖였다. NaCl을 첨가하여, NaCl의 최종 농도를 총 100 mM으로 높였다. UF에 의해 농축된 후 용액의 용적은 19 ㎖였고, rFVIIa 농축액의 농도는 OD280으로 측정된 바에 따르면 11.6 mg/㎖였고, SEC-HPLC로 측정된 바에 따르면 11.7이었다. UF 전과 UF 후에, 중쇄 파괴, GD-FVIIa, 중합체, 또는 올리고머/이량체의 수준에는 별다른 변화가 관찰되지 않았다(표 6 참조).
Figure 112007081301958-pct00006
실시예 22
실시예 17에서 사용된 것과 동일한 UF-시스템을 투석여과 없이 rFVIIa 벌크의 농축액에 대해 사용하였다. 농축하기 전에, 벌크는 50 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 10 mM 글리실글리신, pH 6.0을 함유하는 완충액 중에 1.42 mg/㎖의 rFVIIa를 함유했다. CaCl2를 첨가하여, CaCl2의 최종 농도를 총 30 mM으로 증가시켰다. 벌크를 UF-시스템에서, OD280으로 측정된 바에 따르면 25.3 mg/㎖, SEC-HPLC로 측정된 바에 따르면 24.1 mg/㎖의 농도까지 농축시켰다. 용액은 농축되는 동안에 눈으로 보기에는 투명했고, 농축의 막바지에는 OD600이 0.014까지 증가하였다. UF 전과 UF 후에, 중쇄 파괴, 산화, GD-FVIIa, 중합체, 또는 올리고머/이량체의 수준에는 별다른 변화가 관찰되지 않았다(표 6 참조).
Figure 112007081301958-pct00007
실시예 23
실험실규모 TFF 시스템(Millipore, Biomax 30 kD 멤브레인이 있는 Pellicon XL 여과 장치(Millipore no. PXB030A50)가 장착된 것)를 234 ㎖ rFVIIa 벌크의 한외여과에 사용하였다. UF는 2-8℃와, 20-30 ㎖/분의 막을 통과하는 유속, 및 1-1.5 bar의 입력압력에서 수행하였다. UF 전에, 벌크는 50 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 10 mM 글리실-글리신, pH 5.53 완충액 중에 1.3 mg/㎖의 rFVIIa를 함유하였다. 벌크를 UF-시스템에서 농축시켰고, 농축되는 동안에 외관을 관찰하였으며, OD600으로 투명도를 측정하였다. 벌크를 42 ㎖(계산한 농도 7.2 mg/㎖)까지 농축시켰더니, 용액이 불투명해졌으며, 밤새 2-8℃에 두었더니 침전물이 형성되었다. 용액을 34 ㎖(계산한 농도 8.9 mg/㎖)까지 추가로 농축시켰더니, 침전물은 투명해보였다. 농축의 제 1 파트 동안에 OD600은 약간 증가되었지만, 농축액이 34 ㎖까지 감소된 경우에는 갑자기 증가하였다(도 1).
한외여과에 관련한 상기의 모든 실시예에서, 응고 분석방법(분석방법 4)에 의해 측정된, 특이적 활성에 대한 별다른 변화(제VII 인자 폴리펩타이드 ㎍당 IU)는 관찰되지 않았다.
조성물의 제조 및 안정화도 검사
실시예 24
농축된 rFVIIa 제형물의 안정도를 조사하기 위하여 하기의 조성물을 제조하였다:
15 mg/㎖ rFVIIa(바이얼 용적 1 ㎖당 3.9 mg의 rFVIIa에 해당한다)
1.55 mg/㎖ 히스티딘
1.32 mg/㎖ 글리실글리신
5.84 mg/㎖ 소듐 클로라이드
1.47 mg/㎖ 칼슘 클로라이드
25.0 mg/㎖ 마니톨
10.0 mg/㎖ 수크로스
0.07 mg/㎖ 트윈 80
pH = 5.50
조성물을 정제된 벌크 용액(15.6 mg/㎖)로부터 제조하였다. 부형제를 벌크 용액에 첨가하였고, 생성되는 용액을 멸균된 멤브레인 필터(0.2 마이크론 세공 크기 또는 등가물)를 사용하여 멸균 여과하였다. 1.0 ㎖의 생성된 용액을 멸균 유리 바이얼(대략 3.86 ㎖)에 채웠다. 바이얼을 동결건조하고, 마개를 막은 다음 알루미늄 재질의 뚜껑을 따는 유형의 캡으로 밀봉하였다.
안정화도 검사를 25℃에서 수행하였다.
Figure 112007081301958-pct00008
Figure 112007081301958-pct00009
안정화도 검사를 40℃에서 수행하였다.
Figure 112007081301958-pct00010
실시예 25
농축된 rFVIIa 제형물의 안정화도를 조사하기 위하여 하기의 조성물을 제조하였다:
20 mg/㎖ rFVIIa(바이얼 용적 1 ㎖당 13.0 mg의 rFVIIa에 해당한다)
2.34 mg/㎖ 소듐 클로라이드
1.55 mg/㎖ 히스티딘
5.15 mg/㎖ 칼슘 클로라이드 2H2O
25.0 mg/㎖ 마니톨
10.0 mg/㎖ 수크로스
0.07 mg/㎖ 트윈 80
0.5 mg/㎖ 메싸이오닌
pH = 6.00
조성물을 정제된 벌크 용액(20 mg/㎖)로부터 제조하였다. 부형제를 벌크 용액에 첨가하였고, 생성되는 용액을 멸균된 멤브레인 필터(0.2 마이크론 세공 크기 또는 이에 등가물)를 사용하여 멸균 여과하였다. 2.5 ㎖의 생성된 용액을 멸균 유리 바이얼(대략 3.86 ㎖)에 채웠다. 바이얼을 동결건조하고, 마개를 막은 다음 알루미늄 재질의 뚜껑을 따는 유형의 캡으로 밀봉하였다.
안정화도 검사를 25℃에서 수행하였다.
Figure 112007081301958-pct00011
실시예 26
농축된 rFVIIa 제형물의 안정화도를 조사하기 위하여 하기의 조성물을 제조하였다:
20 mg/㎖ rFVIIa(카트리지 용적 1 ㎖당 20.0 mg의 rFVIIa에 해당한다)
1.55 mg/㎖ 히스티딘
5.15 mg/㎖ 칼슘 클로라이드 2H2O
1.22 mg/㎖ 억제제 0008
pH = 6.50
조성물을 정제된 벌크 용액(20 mg/㎖)로부터 제조하였다. 부형제를 벌크 용액에 첨가하였고, 생성되는 용액을 멸균된 멤브레인 필터(0.2 마이크론 세공 크기 또는 등가물)를 사용하여 멸균 여과하였다. 3.0 ㎖의 생성된 용액을 멸균 유리 카트리지(대략 3.0 ㎖)에 채우고 알루미늄 캡으로 밀봉하였다.
안정화도 검사를 5℃에서 수행하였다.
Figure 112007081301958-pct00012
실시예 27
농축된 rFVIIa 제형물의 안정화도를 조사하기 위하여 하기의 조성물을 제조하였다:
5 mg/㎖ rFVIIa(카트리지 용적 1 ㎖당 5.0 mg의 rFVIIa에 해당한다)
1.55 mg/㎖ 히스티딘
122.5 mg/㎖ 칼슘 클로라이드 2H2O
2.45 mg/㎖ 소듐 아세테이트
pH = 6.50
조성물을 정제된 벌크 용액(7.1 mg/㎖)로부터 제조하였다. 부형제를 벌크 용액에 첨가하였고, 생성되는 용액을 멸균된 멤브레인 필터(0.2 마이크론 세공 크기 또는 이에 등가물)를 사용하여 멸균 여과하였다. 3.0 ㎖의 생성된 용액을 멸균 유리 카트리지(대략 3.0 ㎖)에 채우고 알루미늄 캡으로 밀봉하였다.
안정화도 검사를 5℃에서 수행하였다.
Figure 112007081301958-pct00013

Claims (31)

  1. (a) 음이온 교환 물질에 제 VIIa 인자의 일부를 결합시키는 것을 촉진하는 조건 하에, 상기 음이온 교환 물질과 재조합으로 제조된 인간 제 VIIa 인자를 포함하는 용액을 접촉시키는 단계에 있어서, 상기 제 VIIa 인자 용액은 pH가 5.5 내지 7.0 범위, 또는 1-7 mM 칼슘 이온(Ca2+)의 존재 하에 pH가 8.5 내지 9.5 범위인 단계;
    (b) pH가 5.5 내지 7.0 범위인 세척 완충액으로 상기 음이온 교환 물질을 세척하는 단계; 및
    (c) pH가 3.0 내지 7.0 범위이고 적어도 10mM 농도로 Ca2+을 포함하는 용리 완충액으로 상기 음이온 교환 물질을 용리하는 단계, 및 제 VIIa 인자를 포함하는 용출액을 수집하는 단계를 포함하는, 활성화된 제 VII 인자 폴리펩타이드의 농축액을 수득하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 단계 (c)의 용리 완충액은 10 내지 50mM의 Ca2+을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 단계 (c)의 용리 완충액은 Ca2+에 대한 구배 완충액이고, 여기서 Ca2+의 최초 농도는 0 내지 20mM 범위이고 Ca2+의 최종 농도는 15 내지 100mM 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (c)의 용리 완충액은 클로라이드, 아세테이트, 말로네이트, 포스페이트, 카보네이트, 설페이트, 및 니트레이트로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 1가-, 2가- 또는 3가 음이온을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 단계 (c)의 용리 완충액은 100 내지 800mM 농도의 클로라이드 음이온(Cl-)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (c)의 용리 완충액은 100 내지 1000mM의 이온 강도를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (b)의 세척 완충액은 40 내지 250mM의 이온 강도에 상응하는 염을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 음이온 교환 물질은 하이드록시아파타이트 물질인 것을 특징으로 하는 방법.
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