KR101233667B1

KR101233667B1 - 고 농도의 ｒｎａ를 함유하는 칸디다 유틸리스 변이주

Info

Publication number: KR101233667B1
Application number: KR1020100073674A
Authority: KR
Inventors: 오재영; 이선희; 박진완; 박준석; 최인석; 박동철
Original assignee: 대상 주식회사
Priority date: 2010-07-29
Filing date: 2010-07-29
Publication date: 2013-02-15
Also published as: KR20120032064A

Abstract

본 발명은 MNNG(N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine)에 의하여 변이된 고 농도의 RNA(ribonucleic acid)를 함유하는 칸디다 유틸리스(Candida utilis) 변이주에 관한 것이다. 본 발명은 RNA 전구체의 생합성 강화를 통한 RNA 함량이 향상된 변이주로서 효모추출물의 원료로서 이용이 가능하며, 종래 식품 제조시 첨가되는 효모추출물보다 고 농도의 RNA를 함유함으로써 대량의 천연 핵산(예컨대, IMP 또는 GMP)을 제조할 수 있는 장점이 있다. 또한, 본 발명은 효모추출물을 이용하여 생산 할 수 있는 제품에 있어서 생산 비용을 절감하고 제품의 생산성 및 관능성을 향상시킬 수 있는 효과를 가진다.

Description

고 농도의 ＲＮＡ를 함유하는 칸디다 유틸리스 변이주{Mutants of Candida Utilis Containing High-Concentration Ribonucleic Acid}

본 발명은 MNNG(N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine)에 의하여 변이된 고 농도의 RNA(ribonucleic acid)를 함유하는 칸디다 유틸리스(Candida utilis) 변이주에 관한 것이다.

최근 식품산업에서 광우병(BSE), 멜라민 우유파동, 빈번한 이물 혼입사고 등 대형식품 사고가 발생함에 따라 소비자의 식품에 대한 안전·안심에 대한 인식이 향상되면서 조미소재의 시장에도 천연 조미소재가 관심을 받고 있다.

특히, 천연 조미소재 중에서도 구제역 및 광우병의 대한 전 세계적 공포 확산, 조류독감, 식품에 대한 알러지(Allgergy), GMO 문제 등 식품 전반에 있어 소비자의 안전에 대한 요구에 부합하는 소재로 효모추출물이 있다. 지금까지 효모추출물은 라면 스프나 레토르트 식품 등에 비프(beef) 향과 지미를 증강시키기 위해 사용되었다. 그러나 효모추출물의 경우 그 독특한 향과 진한 색으로 인해 사용량에 제한이 있었는데, 최근 효모취를 감소시키는 기술 개발과 여과기술의 발전으로 인해 이미, 이취가 제거되고 색이 진하지 않은 제품이 생산되고 있으며, 분해 정도를 조절하여 지미성분을 조절하거나 기능성 성분이 포함된 제품도 개발되고 있다.

효모추출물은 맛 성분 펩타이드(peptide)가 풍부하고, 아미노산 및 비타민, 미네랄 성분이 풍부하다. 그리고 천연 글루타민산 및 천연 핵산을 다량 함유하고 있다.

이런 특징으로 인해 식품에 사용시 우마미(Umami), 코쿠미(Kokumi), 농후미를 부여해주고 제품의 전체적인 맛을 부드럽게 해준다. 효모추출물은 향신감을 상승시켜 후추나 강황과 같은 비싼 향신료의 사용량을 줄일 수 있다. 또, 식품에 적용시 염을 적게 사용하여도 짠 맛을 상승시켜주는 효과를 주어 염의 사용량을 줄일 수 있다.

식품에 사용되는 효모추출물의 대부분은 베이스형으로 빵효모나 맥주효모를 분해하여 만들며 TN(total nitrogen)과 염은 높은 반면, 글루탐산의 함량은 3% 미만이다. 고글루탐산형 효모추출물은 글루탐산 함량이 베이스형 제품보다 3배 가량 높은 제품으로, MSG를 천연 조미소재로 대체하고자 하는 제품에 적용이 가능하다. 고핵산형 효모추출물은 효모유래의 RNA를 분해하여 천연 IMP, GMP 핵산을 다량 함유한 제품으로 식품에 응용 시 전체적인 맛을 부드럽게 해주며 지미를 맛 후반까지 끌어주는 역할을 한다. 이 제품은 기존의 효모 추출물보다 정미력이 월등히 우수하여 그 사용량이 급증하고 있다.

고핵산 효모추출물의 제조에 이용되는 효모의 RNA 함량은 제품의 품질을 결정짓는 중요한 인자이다. 배양조건에 따라 균체내 RNA 함량에 변화를 보이기도 하지만 RNA 함량이 높은 효모를 이용한다면 정미성 핵산(nucleotide)이 고농도로 함유된 효모추출물 제품 개발이 용이하기 때문이다. 일본 Kohjin사는 RNA함량이 높은 균체를 얻기 위한 방법으로 저온 감수성 변이주를 선별하여 RNA함량이 각각 20%인 칸디다 유틸리스(Candida utilis)균을 보고하였다(일본특허공개공보 제1999-196859호). 니혼 타바코(Nihon Tobacco)에서도 1999년 칸디다 유틸리스 균을 이용해 저온 감수성과 아스파테이트 하이드록사메이트(Aspartate hydroxamate) 내성주를 선별하여 최종 제품에서 4.4% GA (glutamic acid), 2.4% IMP (disodium 5'-inosinate) 및 1.8% GMP (disodium 5'-gunaylate)를 가지는 효모 추출물(extract)에 대하여 보고하였다. (주) 농심은 토양 및 식물체로부터 스크리닝을 통해 고핵산 효모엑기스 생산에 이용되는 사카로마이스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae: S .cerevisae) 균에 대하여 보고 하였으며(대한민국 특허공개공보 제1996-0034398호, 대한민국 특허공개공보 제1996-0034399호), RNase활성이 억제된 S .cerevisae 변이주를 이용하여 약 18% RNA 함량의 고핵산 효모 추출물 제조 방법에 대하여 보고하였다(대한민국 특허공개공보 제2003-0018736호). 또한, 아지노모토(Ajinomoto), 사포로 브루어리(Sapporo Brewery), 일본제지, 타케다(Takeda), 아사히(Asahi) 맥주에서도 효소분해를 이용한 고핵산 효모 추출물 개발에 대하여 보고하였다.

그러나, 현재까지의 보고된 문헌에서는 RNA 분해를 억제하거나 생육 촉진을 통하여 균체(효모)내 RNA 함량을 높이는 기술이 대부분이며, 직접적으로 RNA 전구체의 생합성 강화를 통한 RNA 함량 개선이 개선된 효모에 대해서는 아직까지 보고된 바 없다.

본 발명자들은 천연조미료의 원료로 이용할 수 있는 고 농도의 RNA(ribonucleic acid)를 함유하는 신규한 효모 균주를 개발하기 위하여 연구 노력한 결과, 효모 균주 칸디다 유틸리스에 MNNG (N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine)를 처리하여 고 농도의 RNA를 함유하는 칸디다 유틸리스 변이주를 제조함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 MNNG (N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine)를 처리하여 고 농도의 RNA를 함유하는 칸디다 유틸리스 변이주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 MNNG (N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine)를 처리하여 고 농도의 RNA를 함유하는 칸디다 유틸리스 변이주 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 MNNG(N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine)에 의하여 변이된 고 농도의 RNA(ribonucleic acid)을 함유하는 칸디다 유틸리스(Candida utilis) 변이주를 제공한다.

본 발명자들은 천연조미료의 원료로 이용할 수 있는 고 농도의 RNA를 함유하는 신규한 효모 균주를 개발하기 위하여 연구 노력한 결과, 효모 균주 칸디다 유틸리스에 MNNG(N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine)를 처리하여 고 농도의 RNA를 함유하는 칸디다 유틸리스 변이주를 제조하였다.

본 발명은 MNNG에 의하여 변이된 고 농도의 RNA를 함유하는 칸디다 유틸리스 변이주에 관한 것이다.

본 발명에서 모균주로 이용하는 효모 칸디다 유틸리스(토룰라(torula) 또는 토룰라 유틸리스(torula utilis)) 균주는 가공 식품 및 통조림 식품에서 향미료로서 폭 넓게 이용되는 균주이며, 한국미생물보존센터(KCCM 50342)로부터 분양 받은 균주이다.

본 발명에서 변이주를 제조하는 이용하는 물질인 MNNG(N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine)은 인간세포 및 그 외 동물세포에 대하여 발암을 일으키는 물질일 뿐 만 아니라 박테리아에 대하여 DNA를 손상시켜 돌연변이를 일으키는 물질로 알려져 있다(Pleven, C. et al, Glioblastomas and chemical mutagenesis in biology laboratories. Report of 3 deaths in the same institute(Fr.). Arch. Mal. prof., 44: 411-418(1983); Martin, M.S. et al, Susceptibility of inbred rats to gastric and duodenal carcinomas induced by N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine. J. natl Cancer Inst., 53: 837-840(1974); IARC Monographs, Suppl. 6: 394-398(1987))

본 발명은 돌연변이원(mutagen)인 MNNG에 의하여 변이된 칸디다 유틸리스 변이주이며, 상기 MNNG의 화학 구조는 하기 화학식 1에 나타내었다.

화학식 1

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 칸디다 유틸리스 변이주는 머캅토퓨린(mercaptopurine)에 내성을 가지며, 상기 머캅토퓨린에 대한 내성은 상기 MNNG에 의하여 나타난 결과이다. 보다 구체적으로, 본 발명 칸디다 유틸리스 변이주는 모균주인 칸디다 유틸리스 KCCM 50342 균주에 돌연변이 유발원인 MNNG를 처리하고 머캅토퓨린이 포함된 배지에서 사멸되지 않고 증식하는 균주를 선별(selection)하여 분리된 균주이다.

본 명세서에서 머캅토퓨린을 언급하면서 사용되는 표현 “내성 균주 또는 내성 균체”는 머캅토퓨린에 의하여 사멸되지 아니하거나 생장의 중단 없이 계속적인 증식이 가능한 균주 또는 균체를 의미한다.

본 발명에서 이용하는 균주는 칸디다 유틸리스 균주라면 제한없이 이용이 가능하며, 바람직하게는 켄디다 유틸리스(Candida utilis) KCCM 50342 균주이다.

본 발명에서 칸디다 유틸리스 변이주는 고 농도의 RNA를 함유하는 균주이다.

본 명세서에서 표현 “고 농도의 RNA를 함유하는”은 자연계에 존재하는 야생형 칸디다 유틸리스 또는 그 외 물리적 또는 화학적으로 변이된 칸디다 유틸리스 균주 내 포함되어 있는 RNA 함량 보다 최소 10 중량% 이상 증가 또는 향상된 평균 RNA 함량을 함유하는 것을 의미하며, 이러한 균체 내 고농도의 RNA 함량 증가는 상기 MNNG를 칸디다 유틸리스 균주에 처리함으로써 도달된 결과이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서의 칸디다 유틸리스 변이주는 건조 균체 당 18-25 중량%의 RNA를 함유하며, 보다 바람직하게는 20-22 중량%의 RNA를 함유한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 칸디다 유틸리스 균주를 배지에 배양시키는 단계; 및 (b) 상기 균주 배지에 MNNG(N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine)를 첨가하여 변이시키는 단계를 포함하고 고 농도의 RNA(ribonucleic acid)을 함유하는 것을 특징으로 하는 칸디다 유틸리스 변이주 제조 방법을 제공한다.

본 발명에서 상기 단계 (a)에서의 배지는 당업계에서 효모, 특히 칸디다 유틸리스 균주 배양을 위하여 이용될 수 있는 모든 배지를 포함한다.

바람직하게는, 본 발명에서 이용하는 균주의 배지 조성으로서는, 탄소원으로서 통상의 미생물의 배양에 이용되는 글루코오스, 자당(sucrose), 초산, 에탄올, 당밀(molasses) 및 아황산펄프폐액 등으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상이 이용되고, 질소원으로서는, 요소, 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄 혹은 인산암모늄 등의 무기염, 카세인, 효모 추출물, 맥아추출물, 펩톤 및 콘 스팁 리커(corn steep liquor: CSL) 등의 질소유기물 등으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상이 사용된다.

본 발명에서 단계 (b)는 MNNG를 배지에 첨가하여 칸디다 유틸리스 균주를 변이시키는 공정을 포함한다.

바람직하게는, 본 발명에서 배지에 첨가하는 MNNG의 농도는 50-500 ㎍/㎖이며, 보다 바람직하게는 100-400 ㎍/㎖이고, 보다 더 바람직하게는 150-300 ㎍/㎖이다.

본 발명은 단계 (b)에 의해서 변이된 칸디다 유틸리스 변이주를 머캅토퓨린이 첨가된 균주 배지에서 배양시키는 단계를 포함한다.

바람직하게는, 상기 머캅토퓨린이 첨가된 균주 배지는 100-1500 ㎎/ℓ 머캅토퓨린을 포함하고, 보다 바람직하게는 400-1200 ㎎/ℓ, 보다 더 바람직하게는 600-1000 ㎎/ℓ, 가장 바람직하게는 700-800 ㎎/ℓ 머캅토퓨린을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 머캅토퓨린이 첨가된 균주 배지로부터 고 농도의 RNA을 함유하는 균주를 선별하는 단계를 추가적으로 포함한다.

본 발명의 명세서에서의 일 실시예에 따르면, 본 발명에서 고 농도의 RNA을 함유하는 균주를 선별하는 단계는 칸디다 유틸리스 변이주로부터 RNA 추출한 후 Torula Teast RNA(Sigma R6625)의 260 ㎚ UV 값과 비교하여 정량하는 단계를 포함한다.

바람직하게는, 상기 칸디다 유틸리스 변이주로부터 RNA 추출하는 방법은 칸디다 유틸리스 변이주에 1-50% 퍼클로릭 산(perchloric acid)을 첨가한 후 90-130℃에서 30분 내지 3시간 동안 오토클레이브(autoclave)를 실시하는 단계를 포함하며, 보다 바람직하게는 5-15% 퍼클로릭 산을 첨가한 후 95-120℃에서 40분 내지 2시간 동안 오토클레이브를 실시하는 단계를 포함하고, 가장 바람직하게는 9-11% 퍼클로릭 산을 첨가한 후 100-110℃에서 50-70분 동안 오토클레이브를 실시하는 단계를 포함한다.

본 발명의 칸디다 유틸리스 변이주 제조 방법은 상기 MNNG에 의하여 변이된 고 농도의 RNA(ribonucleic acid)을 함유하는 칸디다 유틸리스 변이주를 제조하는 방법과 동일함으로, 이 둘 사이의 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 MNNG(N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine)에 의하여 변이된 고 농도의 RNA(ribonucleic acid)를 함유하는 칸디다 유틸리스(candida utilis) 변이주 및 이의 제조방법을 제공한다.

(ⅱ) 본 발명은 RNA 전구체의 생합성 강화를 통한 RNA 함량이 향상된 변이주로서 효모추출물의 원료로서 이용이 가능하며, 종래 식품 제조시 첨가되는 효모추출물보다 고 농도의 RNA를 함유함으로써 대량의 천연 핵산(예컨대, IMP 또는 GMP)을 제조할 수 있는 장점이 있다.

(ⅲ) 또한, 본 발명은 효모추출물을 이용하여 생산 할 수 있는 제품에 있어서 생산 비용을 절감하고 제품의 생산성 및 관능성을 향상시킬 수 있는 효과를 가진다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 “%“는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.

실시예 1: 약제내성 균주의 분리

2 ℓ 배플드 플라스크(baffled flask)에 YM 배지(글루코오스 1.0%, 효모추출물 0.3%, 맥아추출물 0.3% 및 펩톤 0.5%)를 200 ㎖ 담은 후, 1일 전 평판 배지에서 활성화시킨 켄디다 유틸리스(Candida utilis) KCCM 50342 균주 1 루프(loop)를 접종하고 610 nm에서 OD(optimal density)가 7.0-9.0이 될 때까지 배양온도 30℃ 및 교반속도 140 rpm 조건하에서 배양하였다. 배양된 균주를 3 ㎖ 취한 후 포스페이트 버퍼(phosphate buffer; pH 6.0)로 2회 수세한 후, 동일한 볼륨(volume)으로 현탁하였다. 균주가 포함된 현탁액에 200 ㎍/㎖ 농도의 MNNG(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine; Fluka chemie AG, 스위스)를 첨가한 후 180 rpm에서 20분간 처리하였다. 마지막으로 포스페이트 완충액으로 잔존하는 MNNG를 제거한 후 머켑토퓨린(Mercaptopurine)이 800 mg/ℓ 포함된 평판배지에 MNNG를 처리한 균주를 적당히 희석하여 도말하였다. 균주가 도말된 배지를 30℃ 인큐베이터에서 인큐베이션시켰으며, 인큐베이션시킨 후 2-3일째에 먼저 자란 콜로니를 중심으로 YM 평판배지로 옮겨 균체 당 RNA 함량을 비교하였다.

실시예 2: RNA 생산성 확인 배양

YM 플레이트에서 계대된 균을 사용하여 YM 액체 배지에서 씨드(seed) 배양을 수행하였다. 씨드 배양은 100 ㎖ 배플드 플라스크에 10 ㎖의 YM 배지를 담아, 플레이트상의 균을 1 루프를 접종하고, 30℃ 배양온도 및 180 rpm 교반속도로 8시간 배양하였다. 본 배양은 100 ㎖ 배플드 플라스크에 글루코오스 5%, CSL 1%, (NH₄)₂SO₄ 0.2%, MgSO₄ 0.1%, KH₂PO₄ 0.1%의 배지 10 ㎖을 담아, 씨드 배양된 균을 200 ㎕ 접종한 후 배양온도 30℃ 및 교반속도 180 rpm으로 잔당이 0.5% 이하가 되도록 배양하였다.

플라스크 배양에서의 1차 선별과정을 거쳐 RNA 함량의 향상을 보이는 변이주를 대상으로 5 ℓ 발효조를 이용하여 2차 균체별 RNA 함량비교를 진행하였다. 글루코오스 7-8%, CSL 1%, (NH₄)₂SO₄ 0.3%, MgSO₄ 0.1%, KH₂PO₄ 0.1%를 기본배지로 사용하였으며, 워킹 볼륨(working volume) 2.5 ℓ 및 교반속도 500-700 rpm, 통기량 1.0 vvm, pH 4.0-5.0에서 실험을 진행하였다.

실시예 3: 균주 별 RNA 함량 측정

배양된 효모 균체내 RNA를 추출하기 위하여 배양액 3 ㎖ 중의 균체를 4000 rpm에서 5분간 원심분리하여 회수한 뒤, 증류수를 첨가하여 세척하였다. 그 다음. 세척된 균체에 10% 퍼클로릭 산(Perchloric acid) 5 ㎖을 첨가한 후 100-110℃ 에서 1시간 동안 오토클레이브(autoclave)를 하였다. 추출된 RNA는 상온에서 식힌 후, 원심분리를 거쳐서 상등액을 필요에 따라 희석시킨 후, UV 260 ㎚에서 흡광도(Ultraspec 3000, Pharmacia Biotech)를 측정하여 토룰라 이스트 RNA(Torula Yeast RNA; Sigma R6625)로 작성한 검량 곡선과 비교하여 정량하였다.

상기의 방법에 따라 반복적 확인 실험을 진행한 결과, 최종적으로 RNA 함량이 가장 우수한 것을 Candida utilis DS102-32로 명명하고, 기탁기관 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2010년 7월 1일자로 기탁하였으며, 기탁번호 KCTC 11720BP를 부여받았다. 모 균주 및 본 연구에 의하여 변이시킨 변이 균주에 있어서의 균체당 RNA 함량을 하기 표 1에 나타내었다.

균 주	건조 균체량 (DCW, g/ℓ)	RNA농도(g/ℓ)	균체당 RNA함량 (중량%)
KCCM50342	24.1	4.12	17.1
DS102-32	23.5	4.97	21.1

한국생명공학연구원

KCTC11720

20100701

Claims

MNNG(N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine)에 의하여 변이된 고 농도의 RNA(ribonucleic acid)를 함유하며 머캅토퓨린(mercaptopurine)에 내성을 갖는 칸디다 유틸리스(Candida utilis) DS102-32 균주(기탁번호 KCTC 11720BP).
제 1 항에 있어서, 상기 칸디다 유틸리스 DS102-32 균주는 건조 균체 당 18-25 중량%의 RNA를 함유하는 것을 특징으로 하는 균주.
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(a) 칸디다 유틸리스 균주를 배지에 배양시키는 단계; 및 (b) 상기 균주 배지에 MNNG(N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine)를 첨가하여 변이시키는 단계를 포함하고, 고 농도의 RNA(ribonucleic acid)을 함유하며 머캅토퓨린(mercaptopurine)에 내성을 갖는 칸디다 유틸리스 DS102-32 균주(기탁번호 KCTC 11720BP)의 제조 방법.
제 5 항에 있어서, 상기 방법은 머캅토퓨린(mercaptopurine)이 첨가된 균주 배지로부터 고 농도의 RNA을 함유하는 균주를 선별하는 단계를 추가적으로 포함하는 제조 방법.
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