KR101234807B1 - 혈관신생 촉진용 약학 조성물 및 혈관신생 촉진용 활성물질을 스크리닝하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 본 발명은 HSP27(Heat Shock Protein)에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 혈관신생 촉진용 약학 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 HSP27(Heat Shock Protein 27)에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 상처, 만성궤양, 허혈성 뇌졸중, 심근경색, 협심증 및 뇌혈관성 치매로 구성된 군에서 선택되는 혈관신생 의존성 질환 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 HSP27에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 in vitro에서 혈관내피세포의 성장을 촉진하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
혈관내피세포주를 시료들 각각으로 처리하는 단계;
혈관내피세포주 내의 HSP27의 함량을 측정하는 단계; 및
혈관내피세포주 내의 HSP27의 함량이 대조군에 비해 감소된 시료를 선택하는 단계를 포함하는 혈관신생 촉진용 활성물질 또는 혈관신생 의존성 질환 치료용 활성물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

Description

혈관신생 촉진용 약학 조성물 및 혈관신생 촉진용 활성물질을 스크리닝하는 방법{A pharmaceutical composition for promoting angiogenesis and a method of screening an active material for promoting angiogenesis}

본 발명은 혈관신생 촉진용 약학 조성물 및 혈관신생 촉진용 활성물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 혈관내피세포 성장을 저해하는 것으로 밝혀낸 열충격 단백질(HSP)의 기능을 억제하는 물질을 포함하는 혈관신생 촉진용 약학 조성물, 혈관신생 의존성 질환 치료용 약학 조성물, 그 열충격 단백질을 억제하는 물질을 선택함으로써 혈관싱생 촉진용 활성물질을 스크리닝하는 방법, 및 그 열충격 단백질을 억제하는 물질을 선택함으로써 혈관신생 의존성 질환 치료용 활성물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

신생혈관형성(angiogenesis)은 기존 혈관의 내피세포가 세포외 기질을 분해하고, 이동, 분열, 및 분화하여 새로운 모세혈관을 형성하는 현상으로, 성장과 생식, 상처치유 등의 생리적 과정에서 나타난다. 또한, 신생혈관형성은 종양의 성장, 관절염, 당뇨병 등의 병리적 상태와도 연관이 있다. 혈관형성은 혈관내피세포의 성장, 이동, 분화, 모세혈관 형성 등의 복잡한 일련의 과정이 필요하며, 이러한 과정에 관여하는 많은 혈관신생 촉진인자와 혈관신생 억제인자들이 발견되었다. 혈관신생 억제인자들은 혈관신생이 생성될 때 필요한 혈관신생 촉진인자들의 활성에 반대하여 활성화된다. 체내에 자연적으로 존재하는 혈관신생 억제제들은 독성이 적어 병리적인 혈관신생 억제에 사용될 수 있으므로 이와 관련된 많은 약물들이 개발 중에 있다.

과다한 혈관 형성은 질병 악화의 주원인이 되기도 하지만, 혈관의 미형성 또한 심각한 질병의 원인이 되고 있다. 혈관 신생은 상처 치유나 조직 재생에 필수적인 현상이라고 할 수 있는데, 예를 들어 혈관 형성이 미발달된 태반은 유산의 중요한 원인이 되며, 혈관의 미형성으로 인한 괴사, 궤양 및 허혈의 경우 조직이나 기관의 기능 이상을 유발하거나, 사망의 원인이 될 수 있다. 또한, 동맥경화증, 심근경색, 및 협심증과 같은 질병도 원활하지 못한 혈액공급이 원인이 되고 있다. 따라서, 혈관의 미형성으로 인한 저산소 상태 또는 저영양 상태의 유발로 인한 조직 손상을 감소시키고, 원활한 조직 재생을 위해 새로운 혈관 혈성을 유도하거나 촉진시키고자 하는 치료법 개발이 필요하다.

특히, 혈관신생은 상처받은 피부 조직이 재생되기 위한 필수적인 상처 회복 과정에 반드시 수반되어야 한다. 상처의 초기 단계에는 세포의 괴사와 혈관의 파괴로 인한 염증반응이 일어나게 되고, 이 염증 반응 이후에 혈액성분의 탈혈관 현상, 혈소판의 활성화 및 혈액응고와 함께, 칼리크레인, 트롬빈, 및 플라스민 등과 같은 생물학적 매개물질이 형성되는 일련의 과정을 거치게 된다.

혈관신생을 이용한 생체 질환의 치료를 혈관신생 치료라 하고, 이러한 혈관신생 치료는 상처, 만성궤양, 허혈성 뇌졸중, 심근경색, 협심증, 및 뇌혈관성 치매로 구성된 군에서 선택되는 혈관신생 의존성 질환의 치료에 효과적인 것으로 알려져 있다(한국특허공개 2009-0010662).

이미 혈관내피세포성장인자(VEGF)와 같은 혈관신생 촉진인자는 중증의 국소 빈혈을 위한 치료제로 사용되고 있다. 또한, 섬유아세포 성장인자, 표피 성장인자(epidermal growth factor) 및 혈소판 유도 내피 성장인자(platelet-derived epidermal growth factor) 등의 혈관신생 촉진인자들도 임상 치료를 위하여 연구되고 있다. 그러나, 상기 인자들은 단백질로서 분리, 정제하기 어렵고, 고가이므로 임상 적용에 어려움이 있다.

혈관내피세포성장인자(VEGF: vascular endothelial growth factor)는 혈관형성을 조절하는 대표적인 단백질이다. VEGF는 혈관내피세포에 존재하는 VEGF 수용체 1, 2, 또는 3(VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3)과 결합하여 VEGF 수용체(VEGFR)의 타이로신 인산화를 유도하여 혈관내피세포의 활성화를 가져오며, 결국 혈관신생과정에 중요한 영향을 미치게 된다. 그 중 VEGFR2의 인산화는 신생혈관 신호전달기전에 있어서 가장 중요한 역할을 하는 수용체이다. 이러한 VEGF를 타겟으로 하는 약물 중 임상적으로 사용되는 가장 대표적인 약물은 Avastin 이며, VEGF 중화항체에 해당하며 FDA 승인을 받았다.

한편, 저분자 열충격 단백질 27(Heat Shock Protein 27)은 활성산소(free radical), 열(heat), 독소(toxins)와 같은 외부환경적인 요인에 대하여 스스로 군집을 형성하여 이러한 스트레스에 대한 방어 능력을 가지는 샤페론(Charperon) 기능을 가지는 저분자량을 가지는 단백질이다(NCBI Gene Bank Accession Number: NP_001531.1). 본 발명자들은 저분자량의 열충격 단백질 27(이하 사람에서는 HSP27, 쥐에서는 HSP25)이 분비되는 것을 확인한 바 있다. 이러한 HSP27은 암세포의 사멸을 유도하는 단백질과 결합하여 암세포의 방사선 및 항암제에 대한 저항력을 증가시키는 등의 여러 기능이 알려져 있다(Oncogene. 2005 May 26;24(23):3715-25). 그러나, HSP27의 VEGF, 혈관신생촉진, 또는 상처치료촉진과의 상호관계에 대해서는 전혀 알려져 있는 바가 없다.

이에 본 발명자들은 혈관신생촉진에 효과적인 물질을 개발하기 위해 연구한 결과 HSP27이 VEGF에 의한 VEGFR2의 활성화를 저해하여 혈관내피세포의 성장을 저해한다는 것을 최초로 발견하였으며, 이에 기초하여 혈관신생 촉진용 조성물 및 혈관신생 촉진용 활성물질을 스크리닝 하는 방법을 개발하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 새로운 혈관신생 촉진용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 혈관신생 의존성 질환 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 in vitro에서 혈관내피세포의 성장을 촉진하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 혈관신생 촉진용 활성물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 혈관신생 의존성 질환 치료용 활성물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여,

본 발명은 HSP27(Heat Shock Protein 27)에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 혈관신생 촉진용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 HSP27(Heat Shock Protein 27)에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 상처, 만성궤양, 허혈성 뇌졸중, 심근경색, 협심증 및 뇌혈관성 치매로 구성된 군에서 선택되는 혈관신생 의존성 질환 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 HSP27에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 in vitro에서 혈관내피세포의 성장을 촉진하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은

혈관내피세포주를 시료들 각각으로 처리하는 단계;

혈관내피세포주 내의 HSP27의 함량을 측정하는 단계; 및

혈관내피세포주 내의 HSP27의 함량이 대조군에 비해 감소된 시료를 선택하는 단계를 포함하는 혈관 신생 촉진용 활성물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은

혈관내피세포주를 시료들 각각으로 처리하는 단계;

혈관내피세포주 내의 HSP27의 함량을 측정하는 단계; 및

혈관내피세포주 내의 HSP27의 함량이 대조군에 비해 감소된 시료를 선택하는 단계를 포함하는 상처, 만성궤양, 허혈성 뇌졸중, 심근경색, 협심증 및 뇌혈관성 치매로 구성된 군에서 선택되는 혈관신생 의존성 질환 치료용 활성물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 전체가 본 명세서에 참고로 통합된다.

본 발명이 제공하는 혈관 신생 촉진용 약학 조성물 또는 혈관신생 의존성 질환 치료용 약학 조성물은 HSP27의 VEGFR2 인산화 억제작용을 저해하는 기능 저해제를 포함하는 것을 특징으로 하며, 이는 본 발명자가 HSP27에 의해 VEGFR2의 인산화가 감소하며, HSP27의 기능을 억제할 경우 VEGFR2의 인산화가 증가하고, 실제 HSP27 기능 저해제를 상처가 있는 생체에 투여할 경우 상처 치유가 촉진되는 것을 최초로 발견한 것에 기초한 것이다. 여기에서, HSP27의 VEGFR2 인산화 억제작용을 저해하는 "기능 저해제"는 HSP27의 발현을 억제하거나 HSP27에 의한 VEGFR2 인산화 억제작용을 저해하는 물질을 포함한다.

본 발명자는 구체적으로, 인간의 혈관내피세포(HUVEC) 배양물에 VEGF를 단독으로 처리하거나, HSP27 단백 혹은 HSP27 중화항체를 처리한 후 VEGF를 처리한 경우, VEGF 단독 처리군은 대조군에 비해 혈관내피세포 성장율이 증가하였으며, HSP27과 VEGF의 조합 처리군이 VEGF 단독 처리군에 비해 혈관내피세포 성장률이 현저히 감소하였으며, HSP27 중화항체과 VEGF의 조합 처리군이 VEGF 단독 처리군에 비해 혈관내피세포 성장률이 현저히 증가하는 것을 확인하였다(도 1). 또한, 인간의 혈관내피세포(HUVEC) 배양물에 HSP27 단백 혹은 HSP27 중화항체를 처리한 후 VEGF를 처리한 다음, phsopho-VEGFR2, VEGFR2, 및 HSP27의 함량을 측정한 결과 HSP27 단백 처리군의 경우 phospho-VEGFR2의 함량이 대조군(IgG 투여)에 비해 현저히 감소하였고, VEGFR2 및 HSP27의 함량은 거의 변화가 없었으며(도 2), HSP27 중화항체 처리군의 경우 phospho-VEGFR2의 함량이 대조군(IgG 투여)에 비해 현저히 증가하였고, VEGFR2 및 HSP27의 함량은 거의 변화가 없는 것으로 나타났다(도 3). 또한, 실제로 등에 상처를 낸 마우스에게 HSP25 중화항체를 복강주사한 결과 대조군(IgG 투여)에 비해 상처의 크기가 3배 이하로 줄어든 것으로 확인되었다(도 4, 도 5). 또한, 그 마우스의 상처 부위에서의 혈관내피세포 분포량을 확인한 결과, HSP25 중화항체 처리군에서 혈관내피세포가 대조군에 비해 현저히 많이 분포하는 것으로 확인되었다(도 6).

따라서, 이러한 실험 결과로부터 HSP27의 경우 혈관내피세포의 성장을 억제하는데 반해, HSP27의 기능 저해제(예: HSP27 중화항체)는 혈관내피세포의 성장을 촉진하고, 이는 HSP27이 VEGFR2의 인산화를 억제하며, 결과적으로 HSP27의 기능 저해제는 VEGFR2의 인산화를 촉진시키는 작용에 의한 것이라는 것을 알 수 있다. 그러므로, HSP27의 발현을 저해하거나 HSP27의 VEGFR2 인산화 억제작용을 저해하는 물질인 HSP27의 기능 저해제는 혈관신생 촉진 또는 혈관신생 의존성 질환의 치료에 활성을 갖는다고 할 수 있다.

따라서, 본 발명은 상기 실험결과를 기초로 하여 HSP27의 기능 저해제를 포함하는 혈관신생 촉진용 약학 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 HSP27의 기능 저해제를 포함하는 상처, 만성궤양, 허혈성 뇌졸중, 심근경색, 협심증, 및 뇌혈관성 치매로 구성된 군에서 선택된 혈관신생 의존성 질환 치료용 약학 조성물을 제공한다.

상기 HSP27의 기능 저해제는 HSP27의 VEGFR2 인산화 억제작용을 저해하거나 HSP27 단백질의 발현을 억제하는 물질을 포함한다. 이러한 기능 저해제로는 예를 들어, HSP27 유전자에 대한 안티센스올리고뉴클레오티드, HSP27에 대한 표적 siRNA, 및 HSP27의 VEGFR2에 대한 인산화 억제작용에 대한 저해제 등을 들 수 있다.

따라서, 본 발명은 HSP27의 발현을 저해하는 HSP27 유전자에 대한 안티센스올리고뉴클레오티드를 포함한 약학 조성물을 제공한다. 상기 약학 조성물은 HSP27 유전자의 개시코돈 영역, 코딩영역, 5' 또는 3' 인트론-액손 접합부의 2 내지 10 뉴클레오티드 내 영역들에 대한 안티센스, 또는 유전자에 상보적인 mRNA에 대한 안티센스인 올리고뉴클레오티드를 포함한다.

유전자 발현을 저해하여 질병치료에 활용하는 것으로 siRNA가 널리 연구되고 있다. 따라서, 본 발명은 HSP27 표적 siRNA를 포함하는 상처 치료용 약학 조성물을 제공한다. HSP27 표적 siRNA는 이 분야에 공지된 방법을 참조하여 유전자 내의 표적부위를 찾아 적절히 디자인할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에 포함되는 siRNA는 표적 mRNA를 표적화하는 약 15개 내지 약 30 개의 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 19개 내지 약 25개의 뉴클레오티드로 이루어진 짧은 이중쇄 RNA를 포함하는 분리된 siRNA를 포함한다. siRNA는 센스 RNA 가닥과 상보적인 안티센스 RNA 가닥을 포함한다. 본 발명의 siRNA의 센스 및 안티센스 가닥은 두 개의 상보적이고 단일쇄인 RNA 분자를 포함하거나, 두 개의 상보적 부분이 염기쌍을 형성하고 단일쇄의 헤어핀(hairpin) 영역에 의해서 공유결합된 단일 분자를 포함할 수 있다.

본 발명에 포함되는 siRNA는 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 많은 기술을 이용하여 획득될 수 있다. 예를 들면, siRNA는 본 발명이 속하는 분야에서 알려진 방법을 이용하여 화학적으로 합성되거나 재조합 방법에 의해서 생산될 수 있다.

당업자는 투여 대상자에게 투여될 본 발명의 안티센스올리고뉴클레오티드 및 siRNA의 유효량을 대상자의 크기 및 체중, 질병의 진행 정도, 나이, 건강상태, 성별, 투여경로 및 국소 또는 전신 투여와 같은 인자를 고려하여 용이하게 결정할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 안티센스올리고뉴클레오티드 및 siRNA의 유효량은 질병부위 또는 이와 인접한 부위에서 약 1 nM 내지 약 100 nM의 세포간 농도를 포함한다. 필요에 따라서 상기 농도보다 더 높게 또는 더 낮게 투여될 수 있다. 본 발명의 안티센스올리고뉴클레오티드 및 siRNA는 전달시약과 조합하여 그 자체로써 또는 이들을 발현하는 재조합 플라스미드 또는 바이러스 벡터로써 대상자에게 투여될 수 있다. 적절한 전달시약으로는 리포펙틴, 리포펙타민, 셀펙틴, 고분자양이온(예, 폴리리신) 또는 리포좀을 포함한다. 본 발명의 안티센스올리고뉴클레오티드 및 siRNA을 포함하는 약학 조성물은 gene gun, 초음파 또는 전기충격 등을 이용하여 세포 내로 전달할 수 있다.

HSP27은 VEGFR2의 인산화를 억제함으로써 혈관내피세포의 증식 및 혈관신생을 떨어뜨린다. 따라서, 본 발명은 HSP27 단백질의 VEGFR2 인산화 억제 작용에 대한 저해제를 포함하는 혈관신생 촉진용 약학 조성물을 포함한다. 또한, 본 발명은 HSP27 단백질의 VEGFR2 인산화 억제 작용에 대한 저해제를 포함하는 상처, 만성궤양, 허혈성 뇌졸중, 심근경색, 협심증, 및 뇌혈관성 치매로 구성된 군에서 선택된 혈관신생 의존성 질환 치료용 약학 조성물을 제공한다.

이러한 HSP27 단백질의 VEGFR2 인산화 억제 작용에 대한 저해제는 HSP27 단백질이 VEGFR2 인산화 억제 작용을 하는 것을 저해하는 임의의 물질을 포함하며, 대표적으로 HSP27 단백에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다.

본 발명에서 "항체"란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명에서 사용되는 항체는 단클론 또는 다클론 항체, 면역학적으로 활성인 단편(예를 들어, Fab 또는 (Fab)₂ 단편), 항체 중쇄, 인간화 항체, 항체 경쇄, 유전자 조작된 단일쇄 Fv 분자, 키메릭 항체 등일 수 있다.

HSP27은 널리 공지되어 있는 단백질(NCBI Gene Bank Accession Number: NP_001531.1)이므로 본 발명에서 사용되는 항체는 공지된 HSP27 단백질을 항원으로 하여 면역학 분야에 널리 알려져 있는 통상의 방법으로 제조할 수 있다. 본 발명에 따른 항체의 항원으로서 사용되는 HSP27 단백은 천연에서 추출하거나 합성될 수 있으며 DNA 서열을 기초로 하여 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다. 유전자 재조합 기술을 이용할 경우 단백질을 코딩하는 핵산을 적절한 발현벡터에 삽입하고, 재조합 발현벡터로 형질전환된 형질전환체에서 목적으로 하는 단백질이 발현되도록 숙주 세포를 배양한 후 형질전환체로부터 목적으로 하는 단백질을 회수함으로써 수득될 수 있다.

예를 들어, 다클론 항체는 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 항체는 말, 소, 염소, 양, 개, 닭, 칠면조, 토끼, 마우스 또는 랫트와 같은 여러 온혈동물을 이용하여 제조할 수 있다.

단클론 항체도 공지된 융합방법(fusion method)(Kohler and Milstein, European J. Immunol. 6:511-519 1976), 재조합 DNA 방법(US 4,816,567), 및 파지 항체 라이브러리(Clackson et al., Nature, 352, 624-628, 1991; Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 58:1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 또한, HSP27의 단클론 항체는 상기 공지된 방법에 의해 직접 제조할 수도 있으나, 시중에서 판매되는 HSP27의 단클론 항체(SPA-800, Stressgen, 캐나다)를 직접 구입하여 이용할 수도 있다.

본 발명의 조성물은 약제학적 분야에서 통상적인 방법에 따라 국소투여용 제제 또는 주사제로서 제형화시켜 투여할 수 있다.

이러한 국소 투여용 제제 또는 주사제는 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상의 주사제 제조방법에 따라 제조될 수 있다.

국소 투여용 제제는 치료가 필요한 부위로의 피부를 통한 투과에 적합한 액상 또는 반액상 제제를 포함한다. 액상 제제의 예로는 국소 용액이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 반액상 제제의 예로는 리니멘트, 로숀, 크림, 연고, 또는 페이스트, 겔, 에뮤겔 등이 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 이러한 약제학적 성분은 통상적으로 사용되며 약제학적 제제의 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자들이 일반적으로 인식하고 있는 것들이다.

본 발명의 국소 용액은 수성 또는 유성의 용액 또는 현탁제로서 제조될 수 있다. 이러한 제제는 바람직하게는 계면활성제를 포함하는, 살균제(bactericidal agent) 및/또는 살진균제 및/또는 그 외의 적절한 보존제의 적절한 수성 용액에 약제학적 화합물을 용해함으로써 제조될 수 있다. 유성 용액의 제조에 적합한 용매로는 글리세롤, 희석된 알콜, 및 프로필렌 글리콜이 있다. 선택적으로는, L-메탄올을 국소 용액에 부가할 수 있다.

본 발명에 따른 로숀 및 리니멘트제는 멸균 수성 용액과 선택적으로 살균제를 함유하는 피부에 적용하기에 적절한 것을 포함한다. 또한, 알콜 또는 아세톤과 같은 피부의 건조와 냉각을 촉진하는 제제, 및/또는 글리세롤 또는 피마자유나 땅콩유와 같은 오일과 같은 보습제를 포함할 수 있다.

크림, 연고제, 또는 페이스트는 반고형 제제이다. 이러한 반고형 제제는 미세하게 분배된 또는 파우더 형태의 약제학적으로 허용 가능한 염을 혼합함으로써, 유지상의 또는 비유지상의 베이스와 함께 적절한 기계의 도움으로 단독으로 또는 수성이나 비수성의 유체에서의 용액이나 현탁액으로 제조될 수 있다. 상기 베이스는 탄화수소를 함유할 수 있다. 탄화수소의 예로는 경질, 연질, 또는 액상 파라핀, 글리세롤, 밀납, 금속 비누, 점액질, 천연 원료 오일(예: 아몬드유, 옥수수유, 땅콩유, 또는 올리브유), 울 지방, 또는 그 유도체, 및/또는 지방산(예: 스테아르산, 또는 올레산)이 있으나 이에 한정되지는 않는다. 상기 제제는 또한 음이온, 양이온, 또는 비이온성 계면활성제와 같은 계면활성제를 함유할 수 있다. 계면활성제의 예로는 소르비탄 에스테르 또는 그의 폴리옥시에틸렌 유도체(예: 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르), 및 그의 카르복시메틸렌 유도체(예: 카르보폴)가 있다. 천연 검과 같은 현탁화제, 규소 실리카와 같은 셀룰로오스 유도체 무기물, 및 라놀린과 같은 기타 성분이 포함될 수 있다. 연고제의 경우에는, 폴리에틸렌 글리콜 540, 폴리에틸렌 글리콜 3350, 및 프로필 글리콜 또한 약제학적 화합물과 함께 혼합하여 사용할 수 있다.

본 발명의 겔 또는 에뮤겔 제제는 약제학적 제제에 통상적으로 사용되는 임의의 겔 형성 시약을 포함한다. 겔 형성 제제의 예로는 메틸 셀룰로오스, 히드록시에틸 셀룰로오스, 및 카르복시메틸 셀룰로오스와 같은 셀룰로오스 유도체; 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈과 같은 비닐 폴리머; 및 카르보폴과 같은 카르복시폴리-메틸렌 유도체가 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 또 다른 겔 형성 제제는 펙틴, 검(예: 아라비아검, 트라가칸타검, 알긴산(alginate), 카라기네이트(carrageenate), 한천, 및 젤라틴)이다. 바람직한 겔 형성 제제는 카르보폴이다. 또한, 겔 또는 에뮤겔 제제는 보존제, 항산화제, 안정화제, 발색제, 및 향료와 같은, 이러한 종류의 제제에 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다.

상기 언급된 제제에 사용되는 부형제 및 보조제와 제제의 제조방법은 당해 기술분야에 널리 알려져 바에 따라 선택하고 제조할 수 있다(예를 들어 Remington's Pharmaceutical Science 최신판에 기재된 방법들).

본 발명의 약학 조성물의 투여량 및 투여시기는 투여대상의 나이, 성별, 상태, 체중, 투여경로, 투여 횟수, 약의 형태에 따라서 달라진다. 일일 투여량은 약 0.01 ug/kg 내지 10g/kg이고, 바람직하게는 0.01 mg/kg 내지 100mg/kg 이다.

본 발명의 약학 조성물이 유전자 치료제로 사용될 경우는 핵산을 직접 주사하거나 또는 핵산이 포함된 수송체(벡터)를 투여할 수 있다. 핵산분자의 경우 투여량은 발현벡터, 투여대상 등에 좌우된다. 바이러스 벡터의 경우, 바이러스 벡터를 함유하는 재조합 바이러스의 양은 10³ 내지 10¹² pfu/kg 범위이다. 또한, 상기 핵산은 리포솜, 바이러스, gene gun, 폴리머, 초음파, 전기충격을 이용해 전달될 수 있다.

본 발명에 따르면, HSP27 항체는 HSP27의 VEGFR2의 인산화 억제를 차단시켜 혈관내피세포의 성장을 촉진시키는 효과가 있으므로, 혈관내피세포의 성장을 촉진시키는데 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명은 다른 측면에 있어서, HSP27에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 in vitro에서 혈관내피세포의 성장을 촉진하는 방법을 제공한다.

HSP27에 특이적으로 결합하는 항체는 앞서 설명한 바와 같은 항체가 이용될 수 있으며, 혈관내피세포의 성장 촉진은 성장시키고자 하는 혈관내피세포에 HSP27에 특이적으로 결합하는 항체를 단지 부가함으로써 이루어질 수 있다.

또한, 본 발명에 따르면, HSP27 단백질은 VEGFR2의 인산화를 억제함으로써 혈관신생을 감소시키므로, 미지의 물질들 중에서 HSP27의 발현을 감소시키는 물질을 선택함으로써 혈관신생 촉진용 활성물질을 선별할 수 있다.

따라서, 본 발명은 또 다른 측면에 있어서, 상기 HSP27 단백질이 VEGFR2의 인산화 억제 의해 혈관신생을 저해한다는 것을 발견한 것에 기초하여 혈관신생 촉진용 활성물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

상기 혈관신생 촉진용 활성물질을 스크리닝하는 방법은

혈관내피세포주를 시료들 각각으로 처리하는 단계;

혈관내피세포주 내의 HSP27의 함량을 측정하는 단계; 및

혈관내피세포주 내의 HSP27의 함량이 대조군에 비해 감소된 시료를 선택하는 단계를 포함한다.

또한, 본 발명은 또 다른 측면에 있어서, 상기 HSP27 단백질이 VEGFR2의 인산화 억제 의해 혈관신생을 저해한다는 것을 발견한 것에 기초하여 상처, 만성궤양, 허혈성 뇌졸중, 심근경색, 협심증 및 뇌혈관성 치매로 구성된 군에서 선택되는 혈관신생 의존성 질환 치료용 활성물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

상기 상처 혈관신생 의존성 질환 치료용 활성물질을 스크리닝하는 방법은

혈관내피세포주를 시료들 각각으로 처리하는 단계;

혈관내피세포주 내의 HSP27의 함량을 측정하는 단계; 및

혈관내피세포주 내의 HSP27의 함량이 대조군에 비해 감소된 시료를 선택하는 단계를 포함한다.

상기 HSP27의 함량은 예를 들어 노던블롯방법으로 HSP27의 mRNA의 양을 측정하거나 또는 HSP27 단백질에 대한 항체를 사용하여 HSP27 단백질의 발현량을 측정하여 결정할 수 있으며, 이러한 방법은 당해 기술분야에 공지된 방법을 이용하여 실시할 수 있다.

상기 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 HSP27의 발현을 저해하거나 HSP27의 VEGFR2의 인산화 억제작용을 저해하는 물질인 HSP27의 기능 저해제는 혈관신생을 촉진하는데 효과가 있을 뿐만 아니라, 이러한 혈관신생 촉진효과에 의해 상처, 만성궤양, 허혈성 뇌졸중, 심근경색, 협심증 및 뇌혈관성 치매로 구성된 군에서 선택되는 혈관신생 의존성 질환을 치료하는데 효과가 있다. 또한, 이러한 HSP27의 함량의 변화를 측정함으로 혈관신생 촉진용 활성물질 및 혈관신생 의존성 질환 치료용 활성물질을 스크리닝 하는데 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 기술은 세포내 단백질 간의 신호 전달 및 신호 맵핑의 체계적 연구에 의한 신의약 타겟을 발굴하는 진보된 기술이다.

도 1은 HSP27 단백 또는 HSP27 중화항체를 혈관내피세포(HUVEC)에 처리하였을 경우 VEGF에 의한 혈관내피세포의 성장 변화를 MTT 증식 어세이를 이용하여 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 HSP27 단백을 혈관내피세포(HUVEC)에 처리하였을 경우 VEGF에 의한 VEGFR2의 인산화 정도를 웨스턴 블랏팅으로 확인한 결과를 촬영한 사진이다.
도 3은 HSP27 중화항체를 혈관내피세포(HUVEC)에 처리하였을 경우 VEGF에 의한 VEGFR2의 인산화 정도를 웨스턴 블랏팅으로 확인한 결과를 촬영한 사진이다.
도 4는 펀치로 등에 상처를 낸 Balb/C 마우스에 IgG 또는 마우스 HSP25 중화항체를 복강주사할 경우 4 일 및 9 일 후의 상처의 치유 정도를 육안으로 관찰한 결과를 촬영한 사진이다.
도 5는 펀치로 등에 상처를 낸 Balb/C 마우스에 IgG 또는 마우스 HSP25 중화항체를 복강주사할 경우 4 일 및 9 일 후의 상처의 면적을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 도 4의 각각의 상처부분의 조직을 혈관내피세포 마커인 PECAM-1을 사용하여 면역염색과 형광염색을 실시한 다음 광학 현미경으로 혈관밀도를 관찰한 결과를 촬영한 사진이다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.

실험방법

1) 사용세포주의 배양: 사람의 혈관내피세포(HUVEC)를 Lonza 회사에서 구입하였으며, 혈관내피세포에 필요한 다양한 성장인자들이 포함되어 있는 EGM 배지를 이용하여, 섭씨 37℃, 5% CO₂ 조건의 배양기에서 배양하였다.

2) 혈관내피세포 성장 측정(proliferation assay): 세포를 24 well 세포배양접시에 각 well 당 7000 개의 세포를 깔아서 37℃ CO₂ 배양기에서 24 시간 배양하였다.

1% 우태아 혈청(FBS, GIBCO)를 첨가한 Opti-MEM 배지(GIBCO)에 HSP27(Stressgen, 캐나다)(1ug/ml) 또는 HSP27 중화항체(Stressgen, 캐나다)(0.5ug/ml)를 한 시간 처리한 후 VEGF(30ng/ml)를 첨가하여 3 일 후에 다음과 같이 MTT 어세이를 실시하였다. 배지를 제거하고 PBS 완충용액으로 두 번 세포를 세척한 후 5 mg/ml MTT(Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide) 용액을 각 웰에 100 ul 첨가하여 37℃에 4 시간 반응시켰다. MTT 용액을 제거한 후, 세포에 200 ul 4 mM HCl 용액을 첨가한 후 15 분 Shaker에서 흔들어 반응시킨 후 대조 파장 620 nm를 가진 590 nm에서 흡광도를 측정하였다.

3) 전기영동과 면역반응을 이용한 단백질 분석: 시료 속의 단백질을 분석하기 위하여 우선 PAGE(polyacrylamide gel electrophoresis)를 수행한 후, 웨스턴블랏을 수행하였다. 실험하고자 하는 세포들을 우선 용해용액 [120 mM NaCl, 40 mM Tris (pH 8.0), 0.1% NP40]에 현탁하여 세포들을 터뜨린 다음, 일정량의 단백질을 10% SDS-PAGE를 통해 분자량별로 분리한 다음, 단백질들을 니트로셀룰로오스 멤브레인에 옮긴 다음 면역블롯팅(immunoblotting)을 이용하여 분석하였다.

4) 상처치유 동물실험모델: 8 주령의 수컷 Balb/C 마우스의 등 쪽에 6.5mm 지름의 펀치를 이용하여 상처를 내었다. 이틀에 한번씩 40 mg/kg의 대조군 IgG(sigma)와 HSP27 중화항체를 복강주사한 후 상처의 크기를 관찰하였다.

5) 조직면역염색: 마우스의 상처조직부분을 포르말린(formalin)으로 하루 동안 고정시키고 파라핀 섹션을 만들었다. 조직을 크실렌, 95, 90, 70 % 에탄올 용액에 순서대로 담가서 파라핀을 제거한 후 3% 과산화수소에 15 분 반응시킨 후 PBS(0.1% Triton x-100포함) 용액에 1:100으로 준비된 CD31항체(Santacruz)를 실온에서 한 시간 이상 반응시켰다. 이차 항체로서 비오티닐화 이차 항체(Zymed)를 30 분 반응시킨 후 스트렙타비딘-HRP(Zymed)를 15분 반응시킨 후 DAB (3,3′-Diaminobenzidine) 를 반응시켰다. 3 분 후 조직이 갈색으로 발색되면 PBS에 세척하여 반응을 중지시키고, 헤마톡실린에 5 분 담가 핵염색을 하였다. 흐르는 물에 세척 후, 70, 90, 95 % 에탄올과 크실렌 용액에 순서대로 담근 후 글리세롤을 한 방울 떨어뜨린 후 커버 슬라이드(cover slide)를 덮고 현미경(Carl Zeiss Vision)으로 관찰하였다.

실시예 1: HSP27 중화항체의 혈관내피세포 성장 촉진 확인

사람의 혈관내피세포주 HUVEC에 HSP27(1ug/ml) 단백 또는 HSP27 중화항체(0.5ug/ml)를 한 시간 처리한 후 사람의 혈관내피세포성장인자(VEGF) 30 ng/ml를 처리한 후 3일 후에 MTT 분석법을 통해 세포성장 정도를 측정하였다. HSP27 단독 처리군, HSP27 중화항체 단독 처리군, VEGF 단독 처리군, VEGF 및 HSP27 조합 처리군, VEGF 및 HSP27 중화항체 조합 처리군에 대한 세포성장 정도를 측정한 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1은 HSP27 단백 또는 HSP27 중화항체를 혈관내피세포(HUVEC)에 처리하였을 경우 VEGF에 의한 혈관내피세포의 성장 변화를 MTT 증식 어세이를 이용하여 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 1에 따르면, HSP27 및 VEGF 조합 처리군의 세포들은 VEGF 단독 처리군에서의 혈관내피세포 성장률보다 적었고, 반면 HSP27 중화항체 및 VEGF를 조합 처리군의 혈관내피세포성장률은 VEGF단독 처리군에 보다 현저히 증가히였다. HSP27 및 HSP27 중화항체 각각의 단독 처리군은 세포성장률에 변화를 주지 않았다.

실시예 2: HSP27 중화항체의 VEFGR2 인산화 촉진 효과 확인

사람의 혈관내피 세포주 HUVEC에 HSP27(1ug/ml)단백 또는 HSP27 중화항체(0.5ug/ml)를 한 시간 처리한 후 사람의 혈관내피세포성장인자(VEGF) 30 ng/ml를 5분 처리하여 세포를 분획하여, Phospho-VEGFR2, VEGFR2, HSP27중화항체(Stressgen, 캐나다)를 이용하여 웨스턴 블랏팅을 실시하였다. 단백질의 동량정량 확인을 위해 β-actin 항체로 웨스턴 블랏팅을 실시하였다. HSP27 단백을 처리한 군의 Phospho-VEGFR2, VEGFR2, HSP27의 정량 결과를 도 2에, HSP27 중화항체을 처리한 군의 Phospho-VEGFR2, VEGFR2, HSP27의 정량 결과를 도 3에 나타내었다.

도 2는 HSP27 단백을 혈관내피세포(HUVEC)에 처리하였을 경우 VEGF에 의한 VEGFR2의 인산화 정도를 웨스턴 블랏팅으로 확인한 결과를 촬영한 사진이다.

도 3은 HSP27 중화항체를 혈관내피세포(HUVEC)에 처리하였을 경우 VEGF에 의한 VEGFR2의 인산화 정도를 웨스턴 블랏팅으로 확인한 결과를 촬영한 사진이다.

도 2에 따르면, VEGF에 의한 VEGFR2의 인산화는 재조합 HSP27 단백질(1ug/ml, 3ug/ml)을 세포에 전처리하였을 경우 현저히 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 이에 반해, VEGFR2 발현양과 HSP27 발현에는 영향을 주지 않는 것으로 확인되었다.

도 3에 따르면, VEGF에 의한 VEGFR2의 인산화는 HSP27 중화항체를 전처리하였을 경우 현저히 증가하는 것을 확인 할 수 있었다. 이에 반해, VEGFR2 발현량과 HSP27 발현량에는 영향을 주지 않는 것으로 확인되었다.

실시예 3: 동물모델에서 HSP25 중화항체에 의한 상처치유증진 효과

펀치를 이용하여 Balb/C 마우스 등에 상처를 낸 후 IgG(Stressgen, 캐나다) 또는 마우스 HSP25 중화항체(Stressgen, 캐나다)를 복강주사하여 4일 및 9일 후 각각 상처의 치유 정도를 육안으로 관찰하고 사진을 촬영하였다. 사진 촬영의 결과를 도 4 및 도 5에 나타내었다.

도 4는 펀치로 등에 상처를 낸 Balb/C 마우스에 IgG 또는 마우스 HSP25 중화항체를 복강주사할 경우 4 일 및 9 일 후의 상처의 치유 정도를 육안으로 관찰한 결과를 촬영한 사진이다.

도 5는 펀치로 등에 상처를 낸 Balb/C 마우스에 IgG 또는 마우스 HSP25 중화항체를 복강주사할 경우 4 일 및 9 일 후의 상처의 면적을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 4 및 도 5에 따르면, 대조군에 비하여 HSP25 중화항체를 처리하였을 경우 9 일후 상처의 크기가 3 배 이하로 줄어드는 것으로 확인되었다.

실시예 4: 동물모델을 HSP25 중화항체로 처리 시 혈관내피세포 밀도 확인

상기 실시예 3의 마우스의 상처 부위에 대해, 혈관내피세포 마커인 PECAM-1을 이용하여 조직면역염색 방법에 따라 면역염색 및 면역형광염색을 실시하여 광학 현미경으로 혈관밀도정도를 관찰하였다. 현미경 관찰 결과를 촬영한 사진을 도 6에 나타내었다.

도 6은 도 5의 각각의 상처부분의 조직을 혈관내피세포 마커인 PECAM-1을 사용하여 면역염색과 형광염색을 실시한 다음 광학 현미경으로 혈관밀도를 관찰한 결과를 촬영한 사진이다.

도 6의 결과에 따르면, 대조군에 비해 HSP25 중화항체를 처리하였을 경우 PECAM-1에 염색된 세포들이 상처부위에 많이 나타나는 것으로 확인되었다. 또한, HSP25 중화항체를 처리하였을 경우 PECAM-1에 갈색으로 염색된 혈관들이 더 많이 나타났다.

따라서, HSP27 중화항체는 VEGF에 의한 VEGF 수용체(VEGFR2)의 활성을 증진시켜 신생혈관형성과정을 촉진시킴으로서 상처치유 효율을 증진시킨다는 것을 알 수 있다.

Claims (10)

1. HSP27(Heat Shock Protein 27)에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 혈관신생 촉진용 약학 조성물.
2. HSP27(Heat Shock Protein 27)에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 상처, 만성궤양, 허혈성 뇌졸중, 심근경색, 협심증 및 뇌혈관성 치매로 구성된 군에서 선택되는 혈관신생 의존성 질환 치료용 약학 조성물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 주사 투여용인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 국소 투여용인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
6. 제5항에 있어서, 용액, 겔, 에뮤겔(emugel), 크림, 연고, 또는 로숀의 형태인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
7. HSP27에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 in vitro에서 혈관내피세포의 성장을 촉진하는 방법.
8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
9. 혈관내피세포주를 시료들 각각으로 처리하는 단계;
   혈관내피세포주 내의 HSP27의 함량을 측정하는 단계; 및
   혈관내피세포주 내의 HSP27의 함량이 대조군에 비해 감소된 시료를 선택하는 단계를 포함하는 혈관신생 촉진용 활성물질을 스크리닝하는 방법.
10. 혈관내피세포주를 시료들 각각으로 처리하는 단계;
    혈관내피세포주 내의 HSP27의 함량을 측정하는 단계; 및
    혈관내피세포주 내의 HSP27의 함량이 대조군에 비해 감소된 시료를 선택하는 단계를 포함하는 상처, 만성궤양, 허혈성 뇌졸중, 심근경색, 협심증 및 뇌혈관성 치매로 구성된 군에서 선택되는 혈관신생 의존성 질환 치료용 활성물질을 스크리닝 하는 방법.

Images