KR101140498B1 - Ｉｌ-ｂｐ의 프로모터, 이의 제조 및 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인터루킨-18 결합 단백질(IL-18BP)의 프로모터 및 이의 제조, 용도에 관계한다.

Description

ＩＬ-ＢＰ의 프로모터, 이의 제조 및 용도{promoter to IL-18BP, its preparation and use}

본 발명은 인터루킨-18 결합 단백질(IL-18BP)의 프로모터 및 이의 제조, 용도에 관계한다.

사이토킨 결합 단백질(가용성 사이토킨 수용체)는 이들 각 세포 표면 사이토킨 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인이다. 세포 표면 수용체의 단백질 절단 또는 유전자 변이형(alternative splicing)에 의해 생성될 수 있다. 이와 같은 가용성 수용체에 대해 이미 기술된 바 있다. 예를 들면, IL-6 및 IFNγ의 가용성 수용체(Novick et al. 1989), TNF(Engelmann et al. 1989 and Engelmann et al. 1990), IL-1 및 IL-4(Maliszewski et al. 1990), IFNα/β(Novick et al. 1994, Novick et al. 1992)등에 대해 기술된 바 있다. 오스테오프로테게린(OPG)로 명명된 한 가지 사이토킨-결합 단백질(OPG, 또는 파골세포 저해인자-OCIF로도 공지됨)는 TNFR/Fas 패밀리의 구성원으로써 분비 단백질로만 존재하는 가용성 수용체의 제1 실시예로 보인다(Anderson et al. 1997, Simonet et al. 997, Yasuda et al. 1998).

뇨로부터 IL-18 컬럼에서 인터루킨-18 결합 단백질(IL-18BP)을 친화력을 이용하여 정제하였다(Novick et al. 1999). IL-18BP는 IFNγ의 IL-18 유도, NF-kB in vitro IL-18 활성화를 못하게 한다. 또한, IL-18-BP은 LPS를 투여한 IFNγ유도를 저해한다. IL-18BP 유전자는 사람 염색체 11에 위치하고, IL-18BP 유전자로 구성된 8.3kb 게놈 서열에서 막 통과 도메인을 인코드하는 엑손은 발견되지 않았다. 변형 mRNA 접합에 의해 생성되는 4가지 IL-18BP 동소체가 지금까지 확인되었다. 이 동소체를 각각 IL-18BP a, b, c, d로 명명하였고, 모두 동일한 N-단부를 공유하였고, C-단부는 상이하다(Novick et al 1999).

이들 동소체들의 IL-18에 결합하는 능력은 다양하다(Kim et al. 2000). 4가지 동소체중에 사람 IL-18BP(hIL-18BP) 동소체 a와 c는 IL-18에 대해 중화 능력을 가지는 것으로 공지되어 있다. 가장 풍부한 IL-18BP 동소체이고, 접합 변이 동소체 a는 IL-18에 대해 매우 높은 친화력을 가지고(신속하게 결합하고, 서서히 분리되는), 약 0.4nM의 해리 상수(Kd)를 가진다(Kim et al. 2000). IL-18BP는 비장에서 발현되고(Novick 1999), 2.5ng/ml 혈장 농도로 순환된다(Novick et al. 2001). IL-18과 IL-18BP의 상호작용에 관련되는 잔지에 대해서는 컴퓨터 모델링(Kim et al. 2000) 과 IL-β와 IL-1R 타입 I의 상호작용(Vigers et al. 1997)을 근거하여 설명된 바 있다. IL-BP에 결합하는 IL-18 결합 모델에 따라 IL-18의 위치 42의 Glu와 89의 Lys 잔기가 IL-18BP의 Lys-130, Glu-114에 각각 결합하는 것으로 보인다(Kim et al. 2000).

전술한 것과 같이, IL-18은 IFNγ를 유도하고, 이는 다시 IL-18BPa mRNA 생성 in vitro을 유도한다고 보고된 바 있다(Muhl et al 2000). 따라서, IL-18BPa이 염증 반응을 종료시키는 "shut off" 시그날로 작용할 수 있을 것이다.

IL-18BP은 몇 가지 폭스바이러스에 인코드된 단백질 패밀리간에 상당한 상동성을 가진다(Novick et al.1999, Xiang and Moss 1999). 이와 같은 가상 바이러스성 IL-18BP에 의한 IL-18 저해로 염증성 항-바이러스성 Th1 반응을 감쇠시킬 수 있다. 폐혈증에서는 혈청 IL-18BP의 양이 상당히 상승되어 있는데, 이는 in vivo 면역 반응을 조절하는 역할을 한다는 것을 암시한다(Novick et al. 2001). 또한, 다양한 세포에서 IFNγ에 의해 IL-18BP가 유도되는데, 이는 IL-18-중개된 면역 반응의 네가티브 피이드백 저해물질로 작용한다는 것을 말한다(Mughl et al. 2000).

1차 연구 결과에서 IL-18BP mRNA가 백혈구세포, 결장, 소장, 전립선에서 감지되었고, 특히 비장 세포에서 감지되었다(Novick et al.1999). 비상 세포 성분은 대식세포, 임파세포, 혈장 세포와, 순환계에서 유도된 추가 세포로 구성된다.

전사, 프로모터, 인헨서를 조절하는 성분 활성은 상이한 세포형에 따라 다양하다. 프로모터와 인헨서는 전사 연관된 세포 단백질과 특이적으로 상호작용하는 짧게 배열된 DNA 서열로 구성된다(reviewed in Dynan and Tjian 1985, McKnight and Tjian 1986, Sassone-Corsi and Borreli 1986 and Maniatis et al 1987). 상이한 인지 서열과 동족의 전사 인자 량을 조합하면 특정 세포내에서 주어진 유전자가 전사되는 효율을 결정할 수 있다. 많은 진핵 프로모터에는 두 가지 인지 서열이 포함되는데, TATA 박스와 상류(upstream) 프로모터 요소이다. 전사 개시 부위의 상류 25-30bp에 위치하는 TATA 박스는 RNA 중합효소 II에 의해 정확한 부위에서 RNA 합성이 시작되도록 하는데 연관이 있는 것으로 보인다. 대조적으로, 상류 프로모터 원소는 전사가 개시되는 속도를 결정한다. 인헨서 원소는 연결된 상동성 또는 이형 프로모터로부터 최소 1000배까지 전사를 촉진시킬 수 있다. 그러나, 상류 프로모터 원소와는 달리 인헨서는 전사 개시 부위의 하류에 위치할 때 또는 프로모터와 상당한 거리를 두고 있을 때 활성이 있다. 세포 유전자의 많은 인헨서가 특정 조직 또는 세포와 배태적으로 일한다(reviewed by Voss et al. 1986, Maniatis et al. 1987). 또한 일부 인헨서는 호르몬 또는 금속 이온과 같은 유도물질 존재하에서 만들어지는 특정 조건하에서만 활성을 가진다(reviewed by Sassone-Corsi and Borrelli 1986 and Maniatis 1987). 세포 인헨서의 이와 같은 상이한 세포 특이성으로 인하여, 진핵 발현 벡터내로 결합되는 프로모터 및 인헨서 요소를 선택하는 것은 재조합 유전자가 발현되는 세포 형에 의해 결정될 수 있다. 가역적으로, 특정 프로모터 및 세포 인헨서를 포함하는 미리 작제된 벡터는 발현을 얻을 수 있는 세포 형을 상당히 제한시킬 수도 있다.

바이러스에서 유도된 많은 인헨서 요소는 상이한 세포간에 상당한 양적인 차이를 가지기는 하지만, 광역의 숙수 범위를 가지고, 다양한 조직에서 활성을 가진다. 예를 들면, SV40 초기 인헨서는 다양한 포유류 종에서 유도된 많은 세포 형태에서 무차별적인 활성을 가지고, 이와 같은 인헨서가 결합된 벡터를 지속적으로 이용하여 왔다(Dijkema et al. 1985). 광역의 세포에서 활성을 가지는 두개의 다른 인헨서/프로모터 복합물은 라우스 살코마 바이러스(Rous sarcoma virus) 게놈(Gorman et al 1982b) 및 사람의 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus(Boshart et al. 1985)의 긴 반복체(LTR)에서 유도하였다.

발명의 요약

본 발명은 사람의 IL-18BP프로모터를 인코드하는 DNA 서열(SEQ ID NO:1), 또는 이의 단편(SEQ ID NOS 2 또는 3) 또는 기능성 유도체(DNA 서열 또는 이의 단편의 3' 단편에 SEQ ID NO: 5의 5' 말단의 하나이상의 뉴클레오티드로 구성된다)에 관계한다.

좀더 구체적으로는, 본 발명에 따른 유도체는 서열에 있는 침묵 요소에에 있는 하나이상의 AP1 부분에 돌연변이된 DNA가 될 수 있고, DNA 서열에는 IL-18BP 프로모터에 기능적으로 연결된 유전자를 추가 포함할 수 있다.

본 발명의 한 측면에서, 유전자는 IL-18BP 또는 루시페라제, 인터페론-베타, TNF, 에리트로포이에틴, 조직 플라스미노겐 활성인자, 과립구 콜로니 자극인자, 망가니즈-슈퍼옥사이드 디스뮤타제, 면역글로불린 또는 이의 단편, 성장 호르몬, FSH, hCG, IL-18, hsLDLR, TNF 수용체 결합 단백질와 같은 이형 단백질을 인코드할 수 있다.

본 발명은 사람 IL-18BP 프로모터를 인코드하는 DNA 서열을 가지는 벡터를 제공하는데, 벡터를 가지는 숙주 세포 예를 들면, CHO, WISH, HepG2, Cos, CV-1, HeLA, Hakat U937 세포 및 숙주 세포를 배양하고, 생산된 재조합 단백질을 분리하는 단계로 구성된 재조합 단백질을 생산하는 방법 또한 제공한다.

또한, 본 발명은 재조합 벡터도 제공하는데, 이 벡터는 바이러스 게놈의 일부분, 목표하는 유전자를 인코드하는 DNA 단편, 사람 IL-18BP 프로모터를 인코드하는 DNA 서열로 구성된 DNA 단편으로 구성된다. 좀더 특별하게는 바이러스 일부분은 아데노-연관된 바이러스, 레트로바이러스 예를 들면, HIV, HFV, MLV, FIV, VSV이 될 수도 있따.

또한 본 발명은 목표하는 유전자의 세포 특이적 발현을 조절하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 조혈간 세포 및 단세포와 같은 표적 세포에서 본 발명의 바이러스 벡터로 표적 포유류 세포에 트랜스듀스시키는 것으로 구성된다. 목표하는 유전자는 HIV 감염에 대한 저항성을 부여하는 단백질이 될 수 있다. 목표하는 유전자의 세포 특이적 발현을 조절함으로써 HIV 감염, 조혈성 질환, 예를 들면, SCID, 만성 육아종증 및 지중해 빈혈과 같은 질환을 치료할 수 있다.

본 발명은 또한 신체 조직에서 IFNγ 수준이 상승되는 개체에서 나타나는 질환을 치료하기 위한 유전자 요법을 제공하는데, 이 방법은 본 발명의 바이러스 벡터 효과량을 투여하는 것이며, 이때 IL-6, TNF-α, IRF , C/EBPβ를 선택적으로 함께 투여할 수 있다.

본 발명의 또 다른 특징은 본 발명의 DNA 서열을 인코드하는 DNA 서열을 가지는 유전자전이된 생쥐에 관계한다.

또한, 본 발명은 질병 치료용 약물을 제조하는데 있어서 사람 IL-18BP 프로모터(SEQ ID NO:1) 또는 이의 단편 또는 기능적 유도체( (DNA 서열 또는 이의 단편의 3' 단편에 SEQ ID NO: 5의 5' 말단의 하나이상의 뉴클레오티드로 구성된다)를 인코딩하는 DNA 서열을 이용하는 것에 관계한다.

또한, 본 발명은 사람 IL-18BP 프로모터(SEQ ID NO:1) 또는 이의 단편 또는 기능적 유도체( (DNA 서열 또는 이의 단편의 3' 단편에 SEQ ID NO: 5의 5' 말단의 하나이상의 뉴클레오티드로 구성된다)를 인코딩하는 DNA 서열로 구성된 약학 조성 물을 제공한다.

도 1에서는 5 조절 원소를 포함하는 IL-18BP 유전자의 프로모터 부분을 나타낸다.

도 2에서는 IL 18 BP 유도 역학 및 TNF□ 및 IL-6의 시너지 효과를 나타낸 것이다. (A)는 IFNγ가 사람 WISH 세포에서 약량 및 시간에 따른 반응으로 IL-18BP 를 유도한다는 것을 보여준다. 세포를 24시간 및 48시간 동안 지정된 농도로 배양하였다. (B) TNF-α□ 및 IL6, 이들을 복합하였을 경우에 IFNγ가 IL-18BP 를 유도하는데 있어서 시너지 효과를 나타낸 것이다. HepG2 세포는 IFNγ(100 U/ml), TNF-α□(20 ng/ml), IL(300 U/ml)의 지정한 복합물로 배양하였다. 각 복합물에 의해 IL-18 BP 유도 정도는 IFNγ 단독으로 사용하였을 경우에 비해 상당히 높았다 (p < 0.05). 데이타는 평균±SD(A의 경우에는 n=3, B의 경우에는 n=4)으로 나타내었다.

도 3. 사람 및 생쥐 IL 유전자의 보존된 엑손-인트론 조직을 나타낸다. 사람의 IL 유전자를 쥐의 것과 비교하였다. 엑손을 표시하였다. 사람의 IL 유전자상에 전사 개시 부위, 해독 개시 부위(ATG), 종료 코돈(Stop), 폴리아데닐화 부위(PAS)를 표시하였다.

도 4. IFNγ에 의해 IL-18BP 유도는 전사 수준에서 이루어지는 것이며, 이는 de novo 단백질 합성에 의존한다. (A) HepG2 세포를 안티시아민 D(1 mg/ml, 30 min)으로 배양시키고, IFNg(100 U/ml)로 세척하고, 지정 시간동안 배양한 후에, 얻 은 IL-18BP mRNA의 세미-정량 RT-PCR한 것이다. β-악틴 mRNA의 RT-PCR에서 사이클로헥시미드(20 mg/ml) 및 IFNγ(100U/ml)으로 지정 시간동안 선배양한 HepG2 세포 IL-18BP mRNA의 대조군(B)이다.

도 5. 사람 IL-18BP 프로모터를 가지는 루시페라제 리포터 벡터의 기초 IFN γ 활성과 유도된 활성을 나타낸다. 괄호에는 전사 개시 부위(+1)에서 연장되는 삽입 부분을 나타낸 것이다. ①과 같은 번호는 다양한 반응 원소를 나타낸다(1. GAS. 2. IRF3. C/EBP-E(2 sites). Scilencer 5. Distal enhancer. ■는 특정 반응 요소에 돌연변이를 나타낸다. HepG2 세포에 표시된 벡터 및 pSV40 βGAL를 함께 트랜스펙션시켰다. 모든 루시페라제를 β-갈락토시다제 활성으로 표준화시켰다. (A) 유도안된 세포 추출물에서 루시페라제 활성은 pGL3-기초 벡터로 트랜스펙션된 세포에 관계한다. (B) 선별된 벡턱로 트랜스펙션되고, IFNγ에 의해 유도된 세포에서 루시페라제 활성. (A)에 제고이된 것과 같이 유도 배수는 기저 활성이상이다.

도 6. 생쥐에서 IRF-1이 IL-18BP 활성에 필수적이라는 것을 보여준다. C57Bl/6 IRF-1^-/- IL-18BP 및 대조군 C57 Bl/6 생쥐에 복막으로 뮤린 IFNγ(53,000 u/mouse)를 주사하였다. 주사전에 피를 뽑고, 주사후 24시간에 피를 뽑는다. ELISA를 이용하여 혈청 IL-18BP를 측정하였다. 데이타는 평균 ±SE(각 그룹에서 n=6이다). 대조군에서 혈청 IL-18BP 와 IRF-결손 생쥐에서의 차이 및 대조군 생쥐에서 IL-18BP 유도와의 차이는 통계학적으로 유의성이 있다(p < 0.05).

도 7에서는 IL-18BP 유전자 유도 및 연합에서 IRF-1 및 C/EBPβ의 역할을 나타낸 것이다. (A)는 염기 -33에서 -75(IRF 좌측 패널) 및 -8 내지 -55(GAS, 우측패널)에 상응하는 dsDNA의 전기영동 이동성 변이 검사이다. HepG2 세포는 지정 시간동안 IFNγ로 처리하고, 핵산 추출물이 IRF 또는 GAS 프로체와 반응하게 한다. 이동 밴드는 ▶로 나타낸다. GAS 복합체는 지정 항체와 과다 이동을 하게 된다. 과다 이동(슈퍼 쉬프트) 밴드는 ▷로 나타내었다. (B) IRF-1 또는 C/EBPβ 발현 벡터에 감염된 HepG2 세포 IL-18BP의 세미-정량 RT-PCR. 지정한 것과 같이, IFNγ를 첨가하고, 세포를 5시간 후에 회수한다. 값은 βactin mRNA에 대해 표준화시킨다.(C) 루시페라제 리포터 벡터 pGL3(1272)(완전한 IL-18BP 프로모터을 포함)로 트랜스펙션시키고, 동시에 지정 농도의 pCDNA3-IRF(○), 10⁶ 세포당 pCDNA3-C/EBPβ 1㎍과 함께 배양된 세포에서 루시페라제 활성을 나타낸다. 또는 세포에 지정된 농도의 pCDNA3-IRF(□), 10⁶ 세포당 pCDNA3-C/EBPβ 1㎍과 함께 트랜스펙션시켰다. 루시페라제 활성은 βGal 활성으로 표준화시킨다.(D) IFNγ(100U/㎖, 2h)으로 처리한 세포의 핵 및 세포질 추출물(추출물을 만드는 실시예 17 참조) 면역 블랏팅을 나타낸 것이다. 추출물은 지정된 항체와 면역침전(IP) 및 면역블랏(IB)을 한 것이다.

도 8. IFNγ 유도시에 IL-18BP 프로모터에 결합하는 인자를 나타낸 것이다. (A) IFN γ 처리한 후에 전단 C/EBPβ E 및 전체 세포 추출물을 가지는 EMSA. 지적한 바와 같이 추출물은 지정 항체와 함께 과다 이동하였다. (B) IFN γ 처리한 후에 말단 인센서 및 전체 세포 추출물에 상응하는 프로브를 가지는 EMSA. 지적한 바와 같이 추출물은 프로브의 전단 절반에 상응하는 ds DNA와 경쟁 유무에 상관없이 지정 항체와 함께 과다 이동하였다. 이동된 밴드는 ▶로 나태내었고, 과다 이동 밴드는 ▷로 나타내었다.

본 발명은 사람 IL-18BP의 프로모터에 관계한다. 이 프로모터는 특정 세표 예를 들면 단세포에서 IL-18BP 의 구성적 발현을 유도하고, 많은 세포에서 IL-18BP 발현의 IFNγ 중개된 유도를 유도한다. 사람의 IL-18BP 프로모터는 구성적 및 IFNγ 유도된 이질성 단백질의 발현을 지시할 수 있다.

본 발명은 사람의 IL-18BP프로모터을 인코드하는 DNA 서열(SEQ ID NO:1), 또는 이의 단편(SEQ ID NOS 2 또는 3) 또는 기능성 유도체(DNA 서열 또는 이의 단편의 3' 단편에 SEQ ID NO: 5의 5' 말단의 하나이상의 뉴클레오티드로 구성된다)에 관계한다.

IL-18BP mRNA는 임파세포, 결장, 소장, 전립선에서 감지되고, 주로 비장 세포에서 감지된다(Novick et al.1999). 하기에서 설명하는 구체예에서, IL-18 단백질은 단세포에서 구성적으로 발현된다.

단세포 뿐만 아니라 많은 상이한 세포에서 IFNγ에 의해 IL-18BP 발현이 유도되는데, IL-6 및 TNF-α를 추가함으로써 이와 같은 발현이 유도될 수 있다.

IFNγ에 의한 IL-18BP 유전자 활성화에 De novo 단백질 합성이 필수적이라는 것을 알았다.

사람의 IL-18Pa mRNA의 전사 개시 부분은 5' RACE을 이용하여 확인하였다.

IL-18BP 유전자의 상류에 위치한 Zn 핑거 단백질의 3' 말단 mRNA가 발견되어, 염기 1의 상류 1601 염기까지 IL-18BPa의 잠재 상류 조절 서열을 제한한다.

이 부분내에(전사 전단에서 전사 말단까지) 6개의 조절 요소(도 1)이 확인되었다; 첫째- 염기 -24에서 -32까지 감마-활성화 서열(GAS); 둘째- 염기 -57 에서 -69까지 이어지는 IRF-1,2 반응 요소(IRF-E); 셋째 및 넷째- 염기 309에서 332, 그리고 621 에서 634까지 두개 C/EBPβ반응 요소; 다섯째- 잔기 625에서 1106까지에 있는 침묵 요소; 여섯번째- 염기 1106에서 1272까지 연장되는 인헨서 요소. HepG2세포(사람의 간세포 암종 세포주)에서 1601bp 단편의 5' 단부에 점진적으로 절두시킨 일련의 루시페라제 리포터 벡서를 테스트하였다. SEQ ID NO: 1에서 제시하는 1272kb 부분은 일부 조직 및 세포형에서 볼 수 있는 기분 발현을 지시할 뿐만 하이나, IFNγ에 의한 유도도 지시한다. 이부분내에 연속적으로 절두된 DNA 단편 상에 프로모터 활성 테스트에서 SEQ ID NO: 3 에서 나타내는 전사 개시 부분의 전단에 있는 122 bp DN단편이 최소의 프로모터로 구성된다는 것을 설명한다. 이와 같은 최소단위 프로모터 또한 유도성이다. 그러나, 이 최소단위 프로모터의 상류에 다른 조절 서열이 유도 크기(정도)에 관여한다. IRF-1 및 GAS 요소에 추가적으로, SEQ ID NO: 2에서 제시하는 두개 C/EBPβ요소를 포함하는 635bp의 DNA 단편이 IFNγ에 의한 루시페라제 활성을 최대한으로 유도하는데 기여하는 것이 밝혀졌다.

IRF-1-결손 생쥐에서 실시한 In-vivo 실험에서 IRF1가 기저수준의 IL 발현 및 IFNγ-유도된 발현의 중개물질로 중요하다는 것을 확인하였다.

또한 IFNγ유도시에, IRF-1 인자 발현이 유도되고, 이 인자는 세포에 구성적으로 존재하는 C/EBPβ에 복합된다는 것도 밝혀졌다. 이 복합체는 전단 GAS 프로모터 요소 및 이에 인접한 IRF-E 프로모터 요소에 결합한다.

전사 부위 단부에 있는 인헨서는 IRF를 통하여 기초 프로모터와 상호작용하는 것으로 밝혀졌다.

본 발명은 IL-18BP 프로모터(SEQ ID NO:1), 또는 이의 단편 및 유전자 발현을 조절하는 방법에 관계한다. 좀더 구체적으로는, 본 발명은 IL-18BP의 1272bp로 된 분리된 DNA 서열(SEQ ID NO:1), 또는 이의 단편 예를 들면, 유전자 발현을 지시할 수 있는 단편 635 bp(SEQ ID NO: 2), 122bp(SEQ ID NO: 3)을 제공한다.

이와 같은 IL-18BP 프로모터 부분을 클로닝하여, IL-18BP의 전사개시 부분 (SEQ. ID. NO: 1)의 상류 1272bp에 있는 뉴클레오티드에 상응한다.

본 발명은 전체 IL-18BP 프로모터(SEQ ID NO:1), 또는 유전사 전사를 지시하여, 결국에는 유전자 발현을 지시할 수 있는 이의 단편(SEQ ID NO: 2), 122bp(SEQ ID NO: 3)을 포함하고, 이와 같은 유전다 단편은 IL-18BP 프로모터의 다른 부분 또는 이질성 프로모터 또는 이질성 프로모터 요소와 함께 이용되어, 유전자 전사를 조절한다. 이와 같은 프로모터 또는 이의 단편은 IFNγ에 의해 유도될 수 있다. 이와 같은 유도는 IRF-1 또는 C/EBPβ의 과다 발현에 의해 추가 강화될 수 있으며, 또는 IL-6 또는 TNF-α에 의해 처리하여 강화될 수 있다.

SEQ ID NO:1에서 제시하고 있는 프로모터의 기능적 일부분 또는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 3의 단편은 돌연변이인데, 예를 들면, 1 내지 10개, 적절하게는 1 내지 5개, 좀더 적절하게는 1개 뉴클레오티드가 다른 것으로 치환되거나 또는 결손되나 유전자 발현 및 IFNγ 유도 지시는 시킬 수 있다.

본 발명의 DNA 서열은 IL-18BP 프로모터(SEQ ID NO: 1) 또는 이의 단편(SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:3)을 공지의 방법을 이용하여 분리할 수 있다. 적어도 3가지 또 다른 방법을 이용할 수 있다:

(1) 서열을 포함하는 게놈 DNA로부터 DNA 서열을 분리;(2) DNA 서열의 화학적 합성; (3) 폴리메라제 쇄 연장 반응(PCR)을 이용한 DNA 서열 합성.

제 1 방법에서, 사람 게놈 DNA 라이브러리를 스크리닝하여, IL-18BP 프로모터 또는 IL-18BP 프로모터 요소를 포함하는 DNA 서열을 확인한다. 두번째 방법에서는 IL-18BP 프로모터 또는 IL-18BP 프로모터 요소를 포함하는 DNA 서열을 화학적으로 합성할 수 있다. 예를 들면, 정확하게 선형의 뉴클레오티드 서열을 만들기 위해 연속적으로 결찰될 수 있는(적절한 말단 제한 부위를 통하여) 일련의 100개 올리노뉴클레오티드로 형태로 IL-18BP 프로모터 부분 또는 IL-18BP 프로모터를 포함하는 DNA 서열을 합성할 수 있다.

세번째 방법에서, IL-18BP 프로모터 또는 IL-18BP 프로모터 요소를 포함하는 DNA 서열을 PCR을 이용하여 합성할 수 있다. 간략하게 설명하면, 표적 DNA 서열의 반대 가닥에 하이브리드될 수 있는 길이가 적어도 15개 염기쌍(PCR프라이머)의 한쌍의 합성 DNA 올리고뉴클레오티드를 이용하여 표적 서열상에 DNA 간섭 부분을 효소적으로 증폭시킬 수 있다. 주형의 열 변성, 프라어미의 어닐링, 어닐된 프라이머의 3' 말단에 DNA 폴리메라제로 연장시키는 과정을 반복하면, PCR 프라이머의 5' 말단에에 정해진 단편이 증폭된다(참고 U.S. Pat. Nos. 4,683,195 및 4,683,202.)

본 발명의 IL-18 BP 프로모터는 이질성 유전자의 기초적인 발현 및 IFNγ 에 의해 유도되는 발현을 지시할 수 있다. 따라서, 본 발명의 IL-18BP 프로모터는 기초적인 활성 및 유도성 활성을 모두 보유한다. 프로모터의 뉴클레오티드 서열은 SEQ. ID. NO.1에 제시한 것이거나 프로모터의 활성 부분을 가지는 이 서열의 단편이 된다. 명세서에 있는 서열을 참고로 한다. 프로모터 또는 프로모터 요소에 영향을 주지않는 뉴클레오티드 유도체도 고려할 수 있다. 이와 같은 변형된 뉴클레오티드 서열을 만드는데 있어서, 공지의 다양한 방법을 이용하여 돌연변이로 인하여 한개 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 결손, 치환 삽입 또는 역전 또는 추가하여 만들 수 있다. 예를 들면, Taylor, J. W. et al., Nucl. Acids Res. 13, 8749-8764(1985) and Kunkel, J. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 482-492(1985)에서 설명하는 부위-직접적인 돌연변이 생성용 시판되는 키트를 구입할 수도 있다. 예를 들면, Amersham Corp.(Arlington Heights, Ill.)에서 시판된는 부위-직접 돌연변이 생성용 키트를 구입할 수 있다. 본 발명에는 프로모터 활성이 유지되거나 강화되는 조건을 만족한다면, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 적어도 50% 동일한, 바람직하게는 75% 동일한, 더욱 바람직하게는 90% 동일한 DNA 서열도 포함한다. 이와 같은 유도체 예를 들면, SEQ ID NO:1의 유도체는 침묵 부분에 있는 AP1 부위 세개 모두 쪼는 적어도 한개에서 돌연변이가 있는 것이다.

IL-18BP 프로모터 또는 이의 단편으로 구성된 뉴클레오티드 서열, 이의 단편 또는 이의 유도체는 임의 목적하는 유전자의 코딩 부분에 기능적으로 연결되어, 적절한 숙주 세포에서 유전자를 발현시킨다. 기능상으로 연결된 이란 의미는 프로모터 또는 요소에 기능을 하도록 연결된 것을 말한다. 목표하는 유전자를 발현시키기 위해, SEQ. ID. NO.1의 전체 IL-18BP 프로모터 또는 SEQ ID 2 또는 SEQ ID NO:3의 단편 또는 이의 유도체를 목표하는 유전자에 기능적으로 연결시킬 수 있다. 실시예 부분에서 볼 수 있는 것과 같이, IL-18BP 프로모터 또는 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:3에서 볼 수 있는 것과 같은 단편은 이질성 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 본 발명의 프로모터를 가지는 상동성 유전자 발현도 고려할 수 있다.

프로모터에는 추가로 인트론을 포함할 수도 있는데, 예를 들면, IL-18BP의 제 1 인트론을 포함할 수 있다. "기능적으로 연결된" IL-18BP 프로모터 또는 프로모터 요소는 적절한 리딩 프레임으로 연결된 핵산의 전사를 지시할 수 있다. 이질성 프로모터에 대해서, 본 발명의 프로모터 및 요소는 각 이질성 프로모터의 기능을 조절할 수 있도록 연결되어 있다. 상기에서 설명한 것과 같이, 본 발명의 IL-18BP 프로모터, 이의 단편 및 유도체 서열을 이용하여 임의 목표 유전자를 발현시킬 수 있다. 일반적으로 이 목적을 위해 발현 벡터를 이용할 수 있다. 따라서, 본 발명에는 IL-18BP 프로모터 또는 이의 단편 또는 유도체로 구성된 유전자 발현을 지시할 수 있는 분리된 DNA 서열을 가지는 발현 벡터도 포함된다. 이와 같은 발현 벡터에는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:3에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 가지는 IL-18BP 프로모터, 이의 단편 또는 이의 유도체를 포함하는 것이 바람직하다. IL-18BP 프로모터, 이의 단편 또는 이의 유도체 및 이의 변형된 뉴클레오티드 서열에 기능적으로 연결된 상동성 또는 이질성 유전자를 추가로 포함할 수도 있다.

본 발명에서 발현 벡터로 유용한 것은 "플라스미드"형으로 벡터형의 원형 이중 가닥 DNAs를 말하는데, 주로 염색체에 결합되지 않는다. 그러나, 본 발명은 등가의 기능을 하는 본 발명 분야에 공지된 다른 형태의 발현 벡터도 포함된다.

본 발명에서 유용한 발현 벡터에는 복제 원점, 목표하는 유전자의 앞쪽(상류)에 위치한 IL-18BP 프로모터, 전사 종료 서열 및 나머지 벡터 유전자를 포함한다. 발현 벡터에는 또한 본 발명 분야에 공지된 다른 DNA 서열도 포함되는데, 이와 같은 서열은 발현 벡터에 안정성을 제공하는 안정성 리더 서열, 발현 벡터의 배출시키는데 이용되는 분비 리더 서열, (예를 들면, 생장 배지에 영양소 유무 또는 다른 유도물질에 의해 조절되는) 구조 유전자의 발현을 허용하는 서열, 형질변환된 숙주 세포에서 표현형 선별을 할 수 있도록 하는 표식 서열 및 제한 효소 엔도뉴클레아제에 의해 절단될 수 있는 부위를 제공하는 서열등이 포함될 수 있다. 이용될 수 있는 실제 발현 벡터의 성질은 이용되는 숙주 세포와 양립할 수 있어여 한다. 본 발명에서 고려할 수 있는 발현 벡터는 적어도 전사를 지시할 수 있고, 적절하게는 IL-18BP 프로모터 부분, 또는 IL-18BP 프로모터 또는 이의 변형된 뉴클레오티드 서열에 의해 명령을 받은 목표하는 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 복제 원점으로 적절한 것으로 예를 들다면, 원숭이 바이러스 40(SV40)가 포함된다. 적절한 종료 서열에는 원숭이 바이러스 40(SV40)의 것이 포함될 수 있다. 본 발명의 프로모터는 임의 목표하는 유전자를 발현시키는데 이용되는데, 예를 들면, 목표하는 유전자는 인터페론-베타, TNF, 에리트로포이에틴, 조직 플라스미노겐 활성인자, 과립구 콜로니 자극인자, 망가니즈-슈퍼옥사이드 디스뮤타제, 면역글로불린 또는 이의 단편, 성장 호르몬, hsLDLR, FSH, hCG, IL-18, TNF 수용체 결합 단백질 및 IL-18 결합 단백질을 인코드하는 치료 물질의 유전자가 될 수 있다. 이들 모든 물질은 공지된 것으로 대부분이 시판되는 것을 이용하면 된다.

원하는 코딩 서열 및 콘트롤 서열을 포함하는 적절한 발현 벡터는 당분야에 공지된 표준 재조합 DNA 기술을 이용하여 작제할 수 있는데, 공지된 방법은 Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989)에서 설명하고 있다. 본 발명은 추가로 IL-18BP 프로모터 부분 또는 IL-18BP 프로모터 또는 이의 변형된 서열로 구성된 유전자 발현을 지시할 수 있는 분리된 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터를 가지고 있는 숙주 세포에 관계한다. 적절하게는 IL-18BP 프로모터 부분은 SEQ ID NO:1에서 제공하는 IL-18BP의 전사 개시 부분의 상류 1272bp에 상응하는 뉴클레오티드 서열 또는 SEQ ID NO: 2에서 제시하는 전사 개시 부분의 상류 635 bp에 상응하는 뉴클레오티드 서열의 단편 또는 SEQ ID NO:3에서 제시하는 전사 개시 부분의 상류 122bp에 상응하는 뉴클레오티드 서열의 단편을 포함한다. SEQ ID NO:1에서 제시하는 IL-18BP 프로모터 또는 IL-18BP 프로모터 부분에 기능적으로 연결된 상동성 또는 이질성 유전자를 추가로 포함하는 숙주 세포가 바람직하다. 예를 들면 적절한 숙주 세포에는 사람 HeLa 세포 또는 아프리카 그린 원숭이 세포 CV-1 및 COS-1, CHO 세포, HepG2, WISH 세포, Hakat U937 등이 포함된다. 적절한 숙주세포는 IFNγ를 포함하여, IL-18BP 프로모터 유도를 허용하여 목표하는 유전자의 발현을 강화시킨다. 숙주 세포로 발현 벡터를 도입시키는 방법은 당분야에 공지된 여러 방법을 이용하면 된다. 예를 들면, 발현 벡터를 숙주 세포에 트랜스펙션시키는 방법으로는 인산칼슘 침전 방법을 이용할 수 있다. 그러나, 숙주 세포로 발현 벡터를 도입시키는 다른 방법 예를 들면, 전기천공, 바이로리스틱(biolistic) 융합, 리포좀 융합, 핵 인젝션, 바이러스 또는 파아지 감염등의 방법도 이용할 수 있다. 적절한 숙주 세포내로 발현 벡터가 도입되기만 하면, 숙주 세포를 배양시켜, 목표하는 유전자에 인코드되는 폴리펩티드를 분리시킬 수 있다. 또는 적절한 숙주 세포로 발현 벡터를 도입시킨 후에, 세포를 세양시키고, 원하는 세포 밀도에 도달하면, IFNγ로 세포를 자극시키고, 목표하는 유전자에 인코드된 폴리펩티드를 분리시킬 수 있다.

목표하는 유전자를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터를 가지는 숙주 세포는 당분야에 공지된 방법을 이용하여 확인할 수 있다. 예를 들면, DNA-DNA 하이브리드반응, 표적 유전자 기능의 유무 평가, 숙주 세포에 목표하는 유전자의 mRNA 전사체 생산으로 측정되는 전사 수준 평가, 면역학적 유전자 생성물을 감지하는 등의 방법을 이용할 수 있다.

본 발명의 발현 벡터, 플라스미드 또는 DNA 분자의 서열은 당분야에 공지된 다양한 방법을 이용하여 결정할 수 있다. 예를 들면, Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467(1977)에서 설명하는 디데옥시 사슬 종료 방법, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 560-564(1977)에서 설명하는 Maxam-Gilbert 방법을 이용할 수 있다. IL-18BP 프로모터내에 특이적 뉴클레오티드 또는 부분은 조절을 위해 필수적으로 확인해야 한다는 것이다. 이들 부분 또는 뉴클레오티를 요소의 구조적 절단 부분에 위치시키고, 프로모터 돌연변이의 기능을 분석하는 실험을 수행할 수도 있다. 예를 들면 PCR을 이용하여 프로모터 요소의 단일 염기쌍 돌연변이, 또는 하기에서 설명하는 것과 같은 progrsive 결손을 만들 수 있다. 이와 같은 방식으로 상당수의 돌연변이된 프로모터 부분 또는 결손 구조를 증폭시키고, 이를 리포터 구조에 다시 클론시키고, 트랜스펙션 및 루시페라제 검사 기술(하기 실시예에서 설명)을 이용하여 평가하였다. 이와 같이 증폭된 단편은 IL-18BP 프로모터로 다시 클론시키고, 그리고 이질성 프로모터 구조에도 클론시킨다. 이와 같은 방식으로 유전자 전사를 지시하는데 중요한 정확한 뉴클레오티드 서열을 확인할 수 있다. 이와 같은 분석으로 프로모터 기능에 영향을 주지 않는 뉴클레오티드 변화를 확인하고 또한 프로모터 기능을 증가시킬 수 있는 뉴클레오티드 변화도 확인한다. 따라서, 기능적 유도체 프로모터 및 프로모터 요소를 확인할 수 있다.

풋프린트(footprint) 및 겔-이동 연구를 통하여 프로모터 부분 또는 프로모터의 기능을 분석한다. 단백질 결합을 중재하는데 중요한 정확한 염기쌍을 알면 전사 반응을 중개하는데 중요한 염기에 대한 증거를 제공할 수 있다.

따라서, 본 발명은 DNA-단백질 상호작용에 중요한 염기쌍을 포함한다. 이와 같은 염기쌍을 밝힐 수 있다. 관님 부분을 포함하는 게놈 단편을 in vitro 풋프린팅 실험에 이용할 수 있다[Galas et al., Nucleic Acids Res. 9, 6505-6525(1981)]. 분리된 제한효소 단편을 방사능라벨시키고, 연속하여 단편에 결합할 수 있는 DNA 결합 단백질을 포함하는 것으로 기대되는 세포로부터 확립된 기술을 이용하여 얻은 핵 추출물과 배양시킨다[예를 들면, Dignam et al., Nucleic Acids Res. 11, 1475-1489(1983)]. 라벨된 DNA를 핵 추출물과 배양시키고, DNAse I로 절단하고, 변성 폴리아크릴아미드 겔상에서 전기영동시킨다. 세포 추출물에 포함된 DNA 결합 단백질은 라벨된 제한효소 단편에 포함된 이들 인지 서열에 결합하고, DNase에 의해 절단되는 것으로부터 DNA를 보호한다. 보호 부분은 결합 부위를 설명한다. 단편의 Maxam and Gilbert 서열 반응을 마커로 이용하여 DNase 절단으로부터 보호된 뉴클레오티드를 정의한다. 본 발명은 또한 프로모터 또는 프로모터 요소와 상호작용하는 트란스-작용 인자를 확인하고, 특징화시킬 수 있다. 시스-작용 조절 서열은 단백질의 결합 부위로 작용할 수 있는데, 이를 작용인자(TAF)라고 명명한다[Dynan W. S., Tjian T. Nature 316, 774-778(1985); Maniatis, T. et al., Science 236, 1237-1245(1987)]. 각 유전자는 조절 서열에 한개 또는 그이상의 단백질에 결합하는 것으로 보이고, 이들 단백질은 전사를 조절하는 방식으로 다른 단백질 및 RNA 폴리메라제 II와 상호작용한다.

시스-작용 서열 DNA 단편에 결합하고, 전기영동상의 이동성을 지연시키는 이들 능력으로 인하여 핵 추출물에서 TAFs를 확인하였다[Dignam, J. D. et al., Nucleic Acids Res. 11, 1475-1489(1983); Dynan, W., Cell 58, 1-4(1989); Fletcher, C. et al., Cell 773-781(1987); Scheidereit, C. et al., Cell 51, 783-793(1987)]. 시스-작용 서열은 핵 추출물에서 결합 활성을 결정하는 겔 지체 검사에 유용하다. 겔 이동 검사 방법은 문헌에서 설명되어 있고, 풋프린터 실험에서 이용되는 대부분의 동일한 시약을 포함한다[Fried, M. et al., Nucleic Acids Res. 9, 6505-6525(1981); Revzin, A., Biotechniques 7, 346-355(1989); Strauss, F. A. et al., Cell 37, 889-901(1984)]. ³²P-라벨된 제한 효소 단편 또는 상보 올리고의 어닐된 쌍을 결합 완충액에 있는 핵 추출물 및 polyd(I-C)와 함께 배양시키고, 이 반응 산물은 비-변성 아크릴아미드 겔상에서 전기영동시킨다. 단백질이 DNA에 결합되어 있기 때문에 자가방사능동위원소 사진으로 측정된 겔상의 DNA 단편의 이동성이 지연된다. 지연 정도는 단백질의 크기에 대한 함수가 될 수 있다.

공지의 기술을 이용하여 확인된 결합 단백질을 정제할 수 있고, 궁극적으로 클론시킨다.

IL-18BP의 프로모터는 유전자 전이 연구에도 이용될 수 있다. 유전자 전이 생쥐는 암을 포함하는 인간의 여러 질환을 연구하는데 강력한 유전적 모델이 될 수도 있다. 유전자 조절 연구에 대해 중요한 in vivo 방법을 제공하는 것으로써 이는 이미 확인된 것이며, 상당한 연구가 트랜스펙션 리포터 유전자(루시페라제)를 이용하여 실시되었다[Palmiter, F. L. et al., Ann. Rev. Genet. 20, 465-499(1986)]. 시그날을 분석하여 유전자 발현의 발생학적 연관을 설명하는 연구는 세포 배양 모델에서 실시될 수가 없고, 이는 유전자 전이 모델에서 아마도 가장 잘연구될 것이다. 종간에 조절 서열들이 상당히 보존되어 있어, 사람의 조절 시그날이 쥐의 전사 기전에 의해 정확하게 해석될 수 있기 때문에 이와 같은 형태의 실험이 가능하다.

유전자 전이 생쥐에서 발현되는 구조는 IL-18BP 유전자 조절에 대해 많은 정보를 제공할 수 있다.

당분야에 공지된 방법을 이용하여 유전자 전이 생쥐를 만들 수 있다. 유전자 전이 동물을 만드는 방법에 가장 널리 이용되는 방법은 수정란의 수컷 전핵으로 DNA 분자를 주사하는 것이다[Brinster et al., Cell 27, 223(1981); Costantini et al., Nature 294, 982(1981); Harpers et al., Nature 293, 540(1981); Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 5016(1981); Gordon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73, 1260(1976)].

DNA 분자를 수정난 세포로 주사하면, 세포를 난자를 수용하는 암컷 자궁에 이식하고, 동물로 발생될 수 있도록 한다. 따라서, 생성된 모든 세포는 도입된 유전자 서열을 포함할 수 있다.

생성된 유전자 전이 생쥐 또는 파운더(founders)를 만들수 있고, 이의 후손은 분석하여 전이유전자를 발현시키는 파운더로부터 라인을 확립할 수 있다. 유전자 전이 동물에서, 다중 조직을 스크리닝하여 유전자 발현에 대해 관찰하였다. 다양한 생쥐 주에 있는 RNA 연구에서 전이 유전자의 발현 수준에 결합 부위의 독립적인 평가를 가능하게 한다(Hogan, B. et al., Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1986).

IL-18BP 프로모터 및 프로모터 요소는 유전자 요법을 실행할 수 있는 유용한 수단을 제공할 수도 있다.

"유전자 요법"은 치료용 목적으로 살아있는 세포의 생물학적 성질을 변형시키기 위해 유전자 생성물의 발현을 변형 또는 조절하기 위해 유전 물질을 투여하는 것이다.

세포는 동종이계(allogeneic) 또는 자가이식(autologous) 세포가 될 수도 있다. 개체에 연속적으로 투여하기 위해 ex-vivo 로 변형시키거나 또는 개체에 바로 유전자 요법 생성물에 의해 in vivo 변형된다.

대부분의 경우, IL-18BP 프로모터 또는 이의 단편을 이용하여, IL-18BP 유전자가 정상적으로 발현되는 세포, 예를 들면 단핵세포에서 유전자 발현을 지시할 수 있을 것이다. 사람을 포함하는 동물로 구조물을 전이시키는데 이용되는 당분야의 임의 수단을 이용할 수 있다. 이와 같은 방법에는 바이러스 벡터, 특히, 레트로아비러스 벡터(Zweibel et al, Science 243, 220(1989), 뿐만 아니라 다른 방법도 이용할 수 있다.

재조합 AAV 벡터는 간 및 골근육에 치료 유전자 전달을 보장하는 것으로 공지되어 왔다(Snyder et al. 1997, Murphy et al. 1997, Song et al. 1998, Snyder et al. 1999, Herzog et al. 1997). 클로팅 인자 IX를 분쇄시킨 생쥐에서는 심각한 출혈성 질환이 나타나고 혈우병 B 환자에서 볼 수 있는 표현형과 유사한 것이 나타난다. Wang et al. 1999의 보고에 따르면 간-특이적 인헨서/프로모터의 제어하에 개과(canine) 인자IX cDNA를 인코드하는 재조합 아데노-연합 바이러스(AAV)를 문맥으로 1회 주사하면 장기적이로 완벽하게 출혈 질환을 치유할 수 있다는 것이다.

뮤린 백혈병 바이러스(MVL)와 같은 온코레트로바이러스와 같은 레트로바이러스 벡터가 유전자를 전달하는데 가장 많이 이용되는 벡터인데, 표적 세포의 염색체로 벡터 게놈이 결합되어 전이 유전자가 안정적으로 별현된다(I.M. Verma and N. Somia. Nature 389, 239(1997). 그러나 이와 같은 벡터가 세포 분열에도 특히 효과가 있는 것으로 증명되었다. HIV 벡터와 같은 레티바이러스 벡터는 비-분열 세포에서 현재 이용되고 있다(Mioshi et al. Science 1999 283: 682-686). 대식세포와 같은 비-분열 세포를 감염시키는 렌티바이러스의 능력으로 유전자 전달 도구로써 훌륭한 후보물질이 될 수 있다. HIV 벡터는 조용한 사람의 조혈 간 세포(HSCs)의 트랜스덕션을 실행할 수 있다.

사람의 조혈간세포(HSC)는 유전되는 조혈성 질환 및 다른 수득 질환의 유전자 요법의 매력적인 표적이 되는데 그 이유는 이들 세포가 전반적인 조혈계를 재생시킬 수 있는 능력이 있기 때문이다. 예를 들면, 조혈성 간 세포는 사람의 면역결핍 바이러스-1(HIV-1)에 관련된 것으로 공지된 단세포를 재생시킬 수 있다. 조혈간 세포를 이용한 유전자 요법 분야에 15년이상의 연구에도 불구하고, 이들 세포안으로 효과적이고 안정적으로 유전자를 삽입시킬 수 없는 주요 문제점이 남아있다. 모로니 뮤린 백혈병 바이러스(MLV)계 레트로바이러스 벡터가 광범위하게 이용되지만, 사람의 다능 HSC내로 유전자 전달 효율이 상대적으로 낮으며 유전자 발현 정도도 만족스럽지 않다.

최근에는 HIV-1 감염에 저항성을 가지는 단세포 개발을 목적으로 HIV-1 복제를 저해하는 유전자로 조혈간 세포를 유전적으로 변형시키는 시도가 있었다(Kohn et al. 1999).

이론적으로 조혈간 세포로 HIV-1에 저항성을 가지는 유전자를 삽입시키면 후손으로 생성되는 성숙한 단세포 및 다른 HIV-1 감염가능한 세포에 유전자가 존재하게 될 것이다. 따라서, 단세포에서 활성을 가지는 IL-18BP 프로모터 또는 이의 단편을 HIV-1 유전자 요법에 이용하면 유익하다.

대부분의 혈액 유전 질환(예를 들면, SCID 만성 육아종증, 지중해빈혈등)의 유전자 요법에는 이식가능하고, 자가 재생할 수 있는 HSCs로 ex vivo 유전자를 전달하여 한개 이상의 세포계에서 전이유전자 발현을 조절할 수 있다. 특정 HSCs 후손(예를 들면, 혈색소병증 또는 지중해빈혈, HIV-1 감염)등의 질환을 치료하는데에는 세포주 특이적 방식으로 치료 유전자를 제한적으로 발현시키는 것이 필요하다(lotti et al. 2002). 이와 같은 경우에, 이전된 유전자의 전사 표적화는 강제적 요건이다. 상이한 세포형에서 유전자 발현은 이용된 프로모터의 상대적인 강도에 따라 달라진다. 그러나, 대부분의 임상 연구에서는 바이러스성 구조적 프로모터를 이용하여 전이 유전자 발현을 구동시키도록 시행되었다. 예를 들면, HIV-1에서 벡터는 내부 CMV 프로모터 및 뮤린 CMV 프로모터, 뮤린 레트로바이러스 벡터 LTR을 이용한다. 바이러스의 긴 말단 반복부위(LTR)과 내부 인텐서-프로모터사이의 전사 간섭 및 복합 조절 서열의 유전적 불안정성으로 인하여 레트로바이러스 벡터의 프레임워크(framework)에 적절한 전이유전자 조절이 힘들다. 본 발명에서 단핵 세포에서 전사를 구동시키는 것으로 공지된 IL-18BP 프로모터를 이용하여 단핵 세포의 전구물질인 HSC에서 전이유전자 발현을 구동시킨다.

"항 HIV 유전자"를 이용하여 조혈 간 세포를 유전적으로 변형시키면 이식후에 HIV 감염에 저항성이 있는 임파세포 및 단세포 발생이 가능하다. HIV 감염된 환자의 HSC에서 회수할 수 있고, CD34+ 세포를 분리시키고, in vitro에서 IL-18BP 프로모터 제어하에(레트로바이러스 프로모터 대신) HIV-저해 단백질을 운반하는 레트로 바이러스 벡터로 트랜스덕션시키고, 트랜스덕션된 세포를 이들 환자에 다시 주입시킨다(Kohn et al. 1999).

HSC의 소스로 가장 흔히 이용되는 것이 말초 혈액 조혈 세포(PBSC)인데, 자가 이식시에는 대부분 골수로 대체된다(Gale et al. 1992 and Kessinger et al. 1991). G-CSF 또는 GM-CSF와 같은 인자를 투여하여 골수에서 말초순환계로 PBSC를 결집(mobilized)시키고, 백혈구 성분 채집술(leukapheresis)을 이용하여 수득할 수 있다. 몇가지 연구에서 볼 수 있는 것과 같이 골수 대신에 말초 혈액 간세포를 이식하여 접목(engraftment)이 일어난다는 것을 확인하였다(Henon et al 1992 and Chao et al. 1993). CSF-결집된 PBSC를 포함하는 클론원성 조상 세포는 제트로바이러스 중개된 유전자 전달에 상당히 민감하고, 반면에 PBSC에서 장기간의 재구성 간세포의 트랜스덕션 율은 골수와 비슷하다(Breni et al. 1992, Cassel et al. 1993, Dunbar et al. 1995). HIV-1 감염된 개체는 질병의 초기 단계에서 임의 내생 HIV-1 수준을 증가시키지 않고도 G-CSF-결집된 PBSC의 결집 및 수득이 가능하다(Junker et al. 1997 and Slobod et al. 1996).

조혈간 세포의 또 다른 소스는 탯줄 혈액(UCB)인데, 탯줄 혈액은 레트로바이러스 트랜스덕션에 골수 세포의 몇 배이상 민감한 것으로 나타났다(Moritz et al. 1993 and Hao et al. 1995). HIV-1 감염된 태아에서는 UCB 세포 및 HSC를 이용하는 것이 특히 유익하다. 이와 같은 전이는 대부분 임신시기에 일어나기 때문에, 탯줄 혈액에는 정상 조혈 간 세포 기능을 하는 정상 세포가 포함되어 있을 것이고, 이것은 HIV-1 감염된 어린이 및 어른의 골수에서는 감소될 것이다(Kearns et al. 1997).

HIV-1 복제("항-HIV 유전자")를 억제할 수 있는 상당수의 합성 유전자가 개발되었는데, 바이러스 단백질 또는 세포 공동-수용체의 발현을 저해할 수 있는 안티센스, 리보자임, 우성-네가티브 돌연변이(예를 들면, RevM10), RNA 디코이(decoys), 세포내 상체등이 포함된다(Veres et al. 1996, Zhou et al. 1994, Couture et al 1996, Malim et al. 1989, bahner et al 1993 and Sullenger et al. 1990, Lee et al. 1994, Marasco et al 1997 and Chen et al. 1997). 많은 경우에 이와 같은 항-HIV-1 유전자는 모델 시스템에서 HIV-1 복제를 상당히 억제할 수 있고, 일부 경우에는 세포내로 바이러스가 침입하는 것도 제한시킨다(36, 39-44). 환자의 HSC 100%와 생성된 단세포는 HIV-1 복제를 지원할 수 없도록 만드는데, 이로써 바이러스 부담이 감소되는 결과를 얻을 수 있다. 이론적으로, 의심이 가는 세포의 99.9%에서 HIV-1 복제를 적극적으로 저해하여 바이러스에 3-log 감소를 얻을 수 있고 매우 효과적인 항-레트로아비러스 요법의 효과를 얻을 수 있다. 그러나, 사람의 조혈 간세포 트랜스덕션의 비율을 효과적으로 높이는 능력의 한계로 대부분의 감염되기 쉬운 세포를 보호하는 것이 현실적으로 불가능하다. 효과의 또 다른 기전은 HIV-1 복제 활성을 적극적으로 지원하지 못하게 만든 세포를 바이러스에 의해 유도된 세포 병인성으로부터 보호하여, 보호안된 세포와 비교하였을 때 선택적인 생존 장점을 가지는 것이 가능하다. 이와 같은 경우에 보호된 세포의 많은 수는 증가된 비율의 모든 단세포로 구성될 수 있고, 이는 면역 기능의 일부를 보존할 수 있게 한다.

본 발명은 약학적으로 수용가능한 캐리어 및 적절한 약물을 인코드하는 목표 유전자에 기능적으로 연결된 IL-18BP 프로모터 또는 프로모터 부분에 상응하는 본 발명의 서열을 가지는 바이러스로 구성된 약학 조성물에 관계한다. 이와 같은 조성물을 IFNγ 수준이 상승된 세포로 약물을 표적화시키는데 적절하게 이용할 수 있을 것이다.

본 발명을 지금까지 설명하였는데, 다음 실시예는 설명을 위해 제공되는 것이며 본 발명의 범위를 이에 한정시키지 않는다는 것을 인지할 것이다.

실시예 1:

단세포에서 IL-18BP의 기초적인 발현.

IL-18BP mRNA는 백혈구세포, 결장, 소장, 전립선 및 특히 비장세포에서 발견된다(Novick et al.1999). 비장 세포는 대식세포, 임파세포, 혈장세포 및 순환계에서 유도된 추가 세포로 구성된다.

세포에서 IL-18BP 단백질 발현을 결정하기 위채, 특정 ELISA 테스트를 이용한다(실시예 12). 사람의 말초 혈액 단세포(PBMC)는 구성적으로 IL(0.7-1.5 ng/ml)을 생산한다. 조직임파종을 가지는 환자의 늑막 유출물로부터 수득한 악성 종양 세포인 U-937 세포는 IL-18BP을 발현시키지 않았다. U-937 세포는 포르볼 에스테르로 처리하면 말토 단세포 분화를 유도할 수 있다. TPA(10ng/ml)로 자극후에 대식세포 유사 세포에서 세포 분화후에만 IL-18BP 발현 기저 수준이 0.07 ± 0.01 ng/ml이 감 지되었다. 이와 같은 결과에서 단세포 및 대식세포에서 구조적으로 IL-18BP가 발현된다는 것이 확인되었다.

실시예 2:

다양한 상이한 세포에서 IL-18BP 발현 유도.

케라틴 세포, 결장 암종 세포주, 1차 신장 메산지움(mesangial) 세포와 같은 다양한 세포에서 IFNγ가 IL-18BP mRNA 및 단백질을 유도한다는 것은 보고된 바 있다(Muhl et al. 2000). 다양한 사람 세포 및 말초 혈액 단세포 (PBMC)에서 IFNγ 및 다른 사이토킨에 의한 IL-18BP 유도를 연구한 바 있다. 약량 의존적인 방식으로 IFNγ는 IL-18BP 발현을 유도하는데(실시예 11의 mRNA 모니터링 및 실시예 12의 ELISA), WISH 및 HepG2 세포에서 EC₅₀이 50U/ml으로 나타났다(도 2A 및 B). IL-18BP는 이 농도가 24시간에 비교하여 48시간에 훨씬 높아지기 때문에(도 2A) WISH 세포의 배양 상청액에서 축적되는 것으로 보인다.

사람의 말초 혈액 단세포(PBMC)는 구성적으로 IL-18BP(0.7-1.5 ng/ml)을 생산하고 , IFNγ(100 U/ml)로 처리하면 이 IL-18BP 수준이 각각 24시간과 48시간에 1.7±0.1 및 2.1±0.3배 증가하였다(p<0.05, n=4). PBMC와 TPA로 선-처리하여도 IL-18BP 생산에는 효과가 없었다.

IFNγ에 의한 IL-18BP 유도를 U937 세포주에서 테스트하였다. 미분화된 U937세포에서 IFNγ는 IL-18BP를 유도하지 못하였지만, 대식세포형 세포에서 포로볼 에스테르(TPA, 10ng/ml)로 분화시킨 후에, IL-18BP의 기저 수준은 0.07 ± 0.01 ng/ml이었고, IFNγ(100U/ml, 24 h) 유도시에는 4.6±0.05 배 증가하였고, 96시간에는 더욱 증가되었다(데이타 제공안함).

IL-18 BP 발현시에 IFNγ2, IFNβ, IL-1, IL-6, IL-12, IL-18, TNF-α와 같은 다른 사이토킨의 효과를 HepG2 세포에서 테스트하였다(도 2B). 세포를 IFNγ유무와는 무관하에 상이한 사이토킨으로 배양시킨 후에 수득된 결과에서 IFNγ2, IFNβ, IL-1, IL-6, IL-12, IL-18, TNF-α는 단독으로 IL-18BP를 유도하지 못하였다. 그러나, HepG2 세포에서 IL-6 및 TNF-α는 IFNγ와 시너지효과를 가지므로, IL-18BP를 통계학적으로 상당히 증가시킨다는 것을 알 수 있다.

이와 같은 결과를 볼때, 단세포 및 상이한 여러 세포에서 IL-18BP는 IFNγ에 의해 유도될 수 있다. IFNγ에 의한 IL-18BP 유도는 IL-6 및 TNF-α을 첨가하여 더욱 강화될 수 있다.

실시예 3:

de novo 단백질 합성을 필요로 하는 IFNγ는 전사적으로 IL-18BP 유전자를 조절된다.

전사 수준에서 IFNγ에 의해 IL-18BP mRNA가 유도되는 지를 체크하기 위해, 해독 저해물질, 악티노마이신 D 존재하에 HepG2 및 Wish 세포에서 인터페론 효과를 측정하였다(도. 3A). HepG2 세포에서 IFNγ로 처리한 후 3시간 뒤에 세비-정량 RT-PCR에 의해 증가된 IL-18BP mRNA 수준을 감지할 수 있으나 Hakat 및 WISH 세포에서는 5시간 후에나 감지할 수 있다. IFNγ으로 자극시키기 전에 악티노마이신 D로 HepG2 및 WISH 세포를 선처리하면 다양한 시간대에서 IL-18BP mRNA 발현이 되 지 않는데, 이는 IFNγ가 de-novo mRNA 합성을 자극한다는 것을 나타내는 것이다.

IFNγ처리후에 24시간 및 그 후에 IL-18BP이 축적되는데, 이는 전사 인자 예를 들면 IFNγ 단백질의 선행 유도시에 IL-18BP 발현에 의존한다는 것을 뒷받침해준다. 따라서, 이와 같은 가설을 확인하기 위해, 단백질 저해물질, 사이클로헥시미드를 이용하여 IFNγ에 의한 IL-18BP mRNA 유도에서 de-novo 단백질 합성이 필요한지를 테스트하였다. 도 3B에서 요약하고 있는 결과를 보면, 사이클로헥시미드로 세포를 선-처리하면 IL-18 BP mRNA 유도가 되지 않았다. 이 결과는 IFNγ에 의해 . IL-18BP 유전자 활성화에 de novo 단백질 합성이 필수적이라는 것을 알 수 있다.

실시예 4:

IL-프로모터를 매핑하기 위해 IL-18BPa 및 이의 프로모터 부분의 전사 개시 부분 확인

IL-18BP 프로모터 부분을 연구하기 위해, 전사 개시 부분을 특이적으로 배치시키는 것이 필요하다.

사람의 IL-18BP mRNA의 전사 개시 부분은 5' RACE(RACE 실시예 14)에 의해 결정될 수 있다. IL-18BPa에 상응하고, 가장 풍부한 접합 변이체인 유일한 한가지 PCR 생성물을 5' RACE을 통하여 얻을 수 있다. 이 생성물의 DNA 서열 분석으로 전사 개시 부분과 추가 50bp 엑손 및 게놈 IL-18BP DNA의 위치 785-835(Entrez pubmed 뉴클레오티드 데이타베이스, 번호 No. AF110798에서도 볼 수 있음)에 상응하는 사람의 IL-18 BP mRNA에 전사 부분이 나타났다. 따라서, 새로운 5' 엑손이 첨가되는 mRNA와 게놈 DNA를 비교함으로써 새로운 엑손-인트론 맵을 만들었다(도 4참고).

IL-18BPa(염기e 1)의 전사 개시 부분을 가지고, IL-18BP 프로모터 부분에 상응하는 염기 1의 상류 사람 게놈 DNA(염색체 11q 클론:RP11-757C15, Accession No AP000719.4, 염기 152,178의 상류)를 추가 분석할 수 있다. BLAST 프로그램을 이용하여 NCBI에서 발현된 서열 태크(EST) 데이타베이스와 이 DNA를 비교함으로써, 아연-핑커 단백질(Accession No. AK001961)을 코드하는 + 가닥 상류 유전자가 나타났다. 아연-핑거 단백질의 mRNA 서열은 "Instant RACE" 프로그램 (www.LabOnWeb.com)을 이용하여 추가 연장되고, 사람의 EST의 광범위한 수득을 스캔한다. 이 프로그램은 Zn-핑커 단백질의 3' 말단 mRNA를 게놈 클론 RP11-757C15의 뉴클레오티드 150,517에서 두며, 따라서 IL-18BPa의 잠재적 상류 조절 서열에서 염기1의 상류 1661 염기까지 제한한다.

실시예 5:

이질성 유전자의 구성적 발현을 촉진시키는 능력이 있는 IL-BP 유전자의 상류 최소 프로모터의 조사

루시페라제 리포터 유전자와 같은 이질성 유전자의 발현을 지시할 수 있는 IL-18BP 유전자 최소 DNA 단편을 찾기 위해, 염기 1의 상류 DNA 서열에 상응하는 1601bp, 전사 시작 부위(SEQ ID NO:5)의 상류 50bp를 포함하는 벡터와 루시페라제 유전자에 융합된 DNA의 절두형을 가지는 벡터(도 5A)를 만들었다(실시예 15). DNA 상류 1601 bp을 포함하는 벡터((pGL3(1601))에 트랜스펙션된 사람 HepG2 세포에서 루시페라제 활성은 비어있는 pGL3 벡터를 이용하여 얻은 결과보다 10.3±0.9배 높 았다. 동일한 DNA를 반대 방향으로 삽입시킨 벡터 pGL3(1601)에서는 이와 같은 활성이 관찰되지 않았다. 이 결과는 염기 1의 상류 1601bp DNA가 기초적인 프로모터 활성을 가진다는 것을 설명하는 것이다. 이 단편 1601bp의 서열 검사에서 TATA 박스가 포함되어 있지 않은 대신에 전사 개시 부위에 인접하여 염기 위치 -3 내지 -9, -39 내지 -48, -122 내지 -132에서 몇 개의 GC 리치(rich) 도메인이 나타났다. TFSEARCH 프로그램을 이용한 1601bp DNA 서열 분석에 따르면 염기 -24 내지 -32에서 감마-활성화된 서열(GAS)이 확인되었다(도 1). 추가 분석에 따르면 염기 -57 내지 -69까지 이어진 IRF1,2 반응 요소(IRF-E) 및 염기 -309 내지 -322와 -621 내지 -643에 두 개 C/EBPβ 반응 요소(C/EBP-E)가 확인되었다.

1601 bp 단편의 5‘단부에서 점진적으로 절두시킨 일련의 루시페라제 리포터 벡터를 테스트하였따. 도 5A에서 요약한 결과를 보면, pGL3(122), IRF 및 GAS만 포함하는 구조 모두에서 기초적인 프로모터 활성을 지원하는데 pGL(1601)와 같은 정도의 효과가 있었다는 것이다.

이와 같은 결과에서 IRF 및 GAS 요소를 포함하는 122bp 단편(SEQ ID NO:3)은 이질성 유전자의 기초 활성을 촉진시키는데 충분하다는 것을 알 수 있다(도 5A).

실시예 6:

이질성 유전자의 발현을 촉진시킬 수 있는 IL-18BP 유전자 상류 최소 프로모터 조사

IFNγ 유도된 루시페라제 발현을 촉진시킬 수 있는 IL-18BP 프로모터 상류 최소 단위 DNA 단편을 확인하기 위해, 선행 실시예의 절두 DNA 벡터를 IFNγ 존재 하에서 트랜스펙션된 HepG2 세포에서 테스트하였다(트랜스펙션 도면 5B, 실시예 16 참고).

도 5B에 요약한 결과를 참고하면, 24시간 후 루시페라제 활성이 IFNγ에 의해 IRF-E 및 GAS 요소만을 포함하는 벡터(pGL3(122) 벡터)가 가지는 기초 수준의 약 33배 증가되었다. 이 결과로 IRFE-GAS쌍이 IFNγ에 의한 이질성 유전자 유도를 중개할 수 있다는 것을 알 수 있다. C/EBP-E1 및 2 요소(pGL3(656))를 포함시키면 기준 활성의 약 88배가 증가되는데, 이는 IFNγ에 의한 유도에 이들 요소들이 중요하다는 것을 설명하는 것이다. 대조적으로, 이와 같은 삽입체(pGL3(1106))에 추가 상류 DNA를 포함시키면 상기 기초 수준이상의 루시페라제 활성 유도가 사라졌다. 이 결과에서 염기 -656 내지 -1106사이(제2 C/EBP-E1 요소)에 침묵요소(silencer)가 있다는 것을 시사한다. 세개 AP1 반응 요소들이 이 침묵 부분에 있고, c-Jun이 이에 결합하여, 세 개 AP-1 반응 요소 모두를 통하여 IL-18BP 유전자의 침묵에 관여하는 것으로 보인다.

침묵 부위의 상류 88개 염기로 프로모터를 추가 연장시키면(pGL3(1272)) IFNγ에 대한 반응이 복귀되는데, 이는 염기 -1106 내지 -1272까지에 인헨서 요소가 있고, IFNγ에 의해 이의 활성이 이웃하는 침묵요소의 효과를 얻제한다는 것을 시사한다. 서열을 연장하여도 기준 활성 및 IFNγ-유도된 활성에 영향을 주지 못하는 것으로 모든 상류 조절 서열이 염기 -1 내지 -1272(SEQ ID NO:1)내에 위치한다는 것을 시사하는 것이다.

테스트된 모든 구조중에서 pGL3(656)의 유도성이 가장 컸고, 이는 이 DNA 단 편에 IL-18BP의 최적의 유도성 프로모터가 포함되어 있다는 것을 말하는 것이다.

이 결과에서 최소 유도성 프로모터는 IRF-E 및 GAS가 포함된 전사 시작 부위의 상류 122bp(SEQ ID NO:3)에 위치한다는 것을 보여주고, 최대 및 최적의 유도성 프로모터는 IRF-E 및 GAS에 추가하여 두 개 C/EBPβ 요소를 포함하는 전사 개시 부위의 상류 656bp (SEQ ID NO: 2)에 위치한다.

실시예 7:

in vivo 에서 IL-18BP 발현에 IRF-1 관련

IFR-1의 연관성을 조사하기 위해, IRF-1이 결손된 생쥐에서 IL-18BP 발현시 IL-18BP 프로모터에서 발견되는 결합 부위에 대해 연구하였다.

IRF-결손 생쥐(Jackson laboratories, Bar Harbor ME)에서 뮤린 IFNγ 투여전과 후에 IL-18BP 수준을 측정하여, 대조군 C57B1/6 쥐와 비교하였다(도 6). 대조군 C57B1/6 쥐에서 기준 혈청 IL-18BP는 9.1±1.9ng/㎖이고, IFNγ에 의해 22.4±2.2 ng/㎖까지 상승되었다. 대조적으로 IRF-1 결손된 생쥐에서 혈청 IL-18BP는 감지 한계범위 이하였고, IFNγ에 의해 유도된 경우에 겨우 0.7±1.15ng/㎖까지 증가되었다. 이 결과에서 IRF1은 IL-18BP의 기초 발현 및 IFNγ에 의한 유도 발현 모두에서 중요한 중개물질이라는 것이 확인되었다.

실시예 8:

유도 환경하에서 IL-18BP 프로모터 에 결합하는 전사 인자 감지

IL-18BP 프로모터내에 다양한 반응 요소중에서 단백질-DNA 상호작용을 확인하기 위해 전기영동 이동성 변이 검사(EMSA 실시예 18)를 이용하였다. 염기 -33 내 지 -75(IRF-E 함유 및 -8 내지 -55(GAS 함유)에 상응하는 라벨된 ds DNA 프로브가 대조군 세포 및 IFNγ-처리된 세포 핵 추출물에 결합시켰다. IRFE-팜유 프로브와 핵 단백질로된 복합물은 세포를 IFNγ와 1시간동안 배양후에 나타났고, 최대 반응은 3시간째에 나타났다(도 7 A, 라인 1-5). 예상대로, IRFE에 대한 항체를 첨가하면, “슈퍼-쉬프트(super shift)”가 나타났으나, 대조군인 전사 1의 시그날 변환물질 및 활성물질(STAT1)에 대한 항체는 어떠한 영향도 주지 않았다(데이타 나타내지 않음). IRF-E의 경우와는 대조적으로, GAS-함유 프로브는 구성적으로 단백질과 연합되어 있고, (도. 7 A, 라인 6), 3 내지 6시간동안 세포 배양시에 이 복합체가 강화되었다. (라인 7,8). GAS는 IFNγ-유도된 STAT1 이량체에 결합하는 것으로 예측된다. 그러나, 이 복합체는 STAT1에 대한 항체에 영향을 받지 않는데(라인 10), 이는 IFNγ-유도된 STAT1 이량체가 GAS와는 연합되지 않는다는 것을 시사하는 것이다. IFNγ로 15분 또는 30분만 처리한 세포 핵 추출물에서도 동일한 네가티브 결과를 얻을 수 있다(데이타 나타내지 않음). 놀라운 것은, 이와 같은 복합체는 C/EBPβ(라인 9)에 대한 항체에 의해 제거되고, IRF에 대한 항체에 의해 슈퍼-쉬프트가 나타난다(라인 10). GAS-함유하는 DNA 프로브는 콘센선스 C/EBPβ E가 없음에도 불구하고 C/EBPβ 에 결합하는 것으로 보인다.

EMSA에서 얻은 결과를 보면, IFNγ로 유도시에, IRF-1는 IL-18BP 프로모터에 있는 IRF-E 요소에 결합한다는 것을 알 수 있다. 또한, IRF-1 및 C/EBPβ로 구성된 복합체가 형성되고, GAS 요소에 결합한다.

실시예 9:

IL-18BP 유도시에 IRF-1-C/EBPβ 복합체 역할 조사

IL-18BP 유전자 유도에서 IRF1 및 C/EBPβ의 역할에 대해 추가 조사하기 위해, 발현 벡터의 트랜스펙션을 이용하여, IRF1 및 C/EBPβ를 과다발현시킨 후에 반-정량성 RT-PCR을 이용하여 IL-18BP mRNA를 측정하였다(실시예 14, 도. 7 B). HepG2세포에서 이들 두 인자의 복합 또는 전사 인자의 과다 발현으로 IL-18BP mRNA가 유도되지는 않았다. 이 결과는 IL-18BP 유전자의 발현을 위해서는 추가적인 IFNγ-유도된 인자들이 요구된다는 것을 시사하는 것이다. 발현 벡터중 하나를 세포에 트랜스펙션시키고, 이어서 IFNγ로 유도하면 IFNγ만을 이용한 경우와 비교하였을 때 실질적으로 IL-18BP mRNA가 감소되었다. 대조적으로 두 전사 인자의 공동 발현으로 IFNγ에 의한 IL-18BP mRNA 유도가 증가되었다. 이 결과는 전사 개시 복합체내에 IRF1 및 C/EBPβ가 특정 비율로 존재하여 복합체를 형성한다는 것을 시사하는 것이다. IRF1 및 C/EBPβ 간에 가능한 상호작용에 대해 추가 연구하기 위해, pGL3(1272), 고정된 양의 IRF-1 발현 벡터와 C/EBPβ 발현벡터의 양을 달리하면서 세포에 동시 트랜스펙션시켜 루시페라제 활성 역가를 조사하였다. 유사하게, C/EBPβ 벡터의 양을 일정하게 하고, IRF 벡터의 양을 변화시키면서 루시페라제 활성을 측정하였다. 두가지 경우에서 종모양의 약량-반응 곡선을 얻을 수 있었는데, 이는 최적의 IL-18BP 유도에는 이들 두 개 전사 인자의 고정된 몰 비율이 필요하다는 것을 시사하는 것이다(도. C).

면역침전 연구를 실시하여 IRF1 및 C/EBPβ 사이에 물리적인 연합이 있는지를 확인하였다(실시예 19, 도 7 D). IFNγ로 처리된 세포의 핵 및 세포질 단백질( 실시예 15)과 C/EBPβ에 대한 항체를 이용한 면역침전(ip) 및 면역블랏팅(ib)에서 C/EBPβ는 HepG2 세포에서 구성적으로 발현되고, IFNγ에 반응하여 핵으로 전치된다는 것이 밝혀졌다(상측 패널). IFNγ에 의해 유도안된 C/EBPβ에 대조적으로, 세포 추출물과 IRF1에 대한 항체를 이용한 ip 및 ib에서 IFNγ는 IRF1 발현을 유도한다는 것이 나타났다. C/EBPβ에 유사하게, IFNγ 유도시에, IRF-1가 핵으로 전치된다(중앙 패널). C/EBPβ에 대한 항체를 이용한 ip와 IRF1에 대한 항체를 이용한 ib에서는 핵 분취물에 안정적인 IRF-1-C/EBPβ 복합체가 있다는 것이 밝혀졌다(하측 패널). 이와 같은 결과는 IFNγ 유도시에 IRF-1-C/EBPβ 복합체가 형성되고, 이들 두 전사인자사이에 이와 같은 복합체가 존재한다는 것을 처음으로 설명하는 것이다. IFNγ유도시에, 전단 GAS 포함 서열과 이에 인접한 IRFE가 C/EBPβ 및 IRF 복합체에 결합한다.

실시예 10:

IL-18BP 프로모터 활성에서 C/EBP-Es의 역할 조사

-309 내지 -322 및 -621 내지 -634 위치에 두 개 C/EBPβ 부위에는 인접한 IRF-E을 가지지 않는다. 또한 -309 내지 -322 위치에 C/EBPβ에 상응하는 프로브를 이용한 EMSA(실시예 18)에서 C/EBPβ(▷)에 대한 항체와는 슈퍼-쉬프트가 있는 지연 밴드(▶)가 나타났으나, IRF에 대한 항체와는 나타나지 않았다(도. 8 A). 따라서, 이 부위는 C/EBPβ에 결합하나 IRF-1와 복합체를 이루는 부위에는 결합하지 않는다는 결론을 얻었다. 또한, 구성적으로 C/EBPβ는 발현시키나 IRF1가 부족한 유도안된 HepG2 세포의 핵 추출물에서 이와 같은 밴드가 나타났다. 사실, IFNγ는 이들 세포에서 C/EBPβ 발현을 증가시키지는 않으며(도. 8D), 결과적으로 지연 밴드의 강도도 증가되지 않았다(도. 8 A). 말단 C/EBPβ 부위를 이용한 실험에서도 유사한 결과를 얻었다(데이타 나타내지 않음).

이 결과들로부터 IRF-1과는 달리 C/EBP 전사인자는 구성적으로 발현되며, IFNγ에 의해 유도되지 않으며, IRF-1 및 GAS에 결합하는 것에 추가하여, IL-18BP 프로모터에 있는 C/EBP 요소에도 결합한다.

실시예 11:

IL-18BP 발현시에 인핸서의 역할에 대한 연구.

말단 인헨서의 조절 역할을 연구하기 위해, 뉴클레오티드 -1081 내지 -1272dp 상응하는 192bp DNA 프로브를 이용한 EMSA(실시예 18) 하였다. 대조군 HepG2 세포의 핵 추출물과 이 프로브가 복합체를 형성하였다(도. 8 B, ▶). 세포를 IFNγ로 처리시에, 복합체는 좀더 강력하고 더욱 지연된 밴드가 나타났다. IRF1, C/EBPβ, cFos에 대한 항체와 이들 복합체의 초변이가 형성되었다. 이들중에서 항-IRF-1만이 초변이를 도출하였다(도. 8 B, ▷). 뉴클레오티드에 상응하는 라벨안된 dsDNA는 라벨된 프로브와 경쟁하지 않았는데, 이는 핵 단백질이 잔기 -1175 내지 -1272dp 결합한다는 것을 나타내는 것이다. IRF-E가 말단 부분에서만 확인되기 때문에, 이 결과는 말단 인헨서가 아마도 전단 IRF-E와 연합되어 있을 것이라는 것을 시사한다.

이 결과들로부터 말단 인헨서는 IRF-1을 통하여 기저 프로모터와 상호작용한다는 것을 알 수 있다.

실시예 12:

IL-18BP의 ELISA.

Novick et al 2001에서 설명하는 것과 같이 이중 항체 ELISA를 이용하여 사람의 IL-18BP을 측정하였다. 토끼 항원 친화력-정제된 뮤린 IL-18BP에 대한 단클론 항체 및 바이오티닐화된 항체(이들 두 가지 항체는 Cytolab, Israel에서 구함)를 이용하여, 생쥐의 IL-18BP을 측정하였다.

실시예 13:

RNA 분리 및 역전사(RT)

무-혈청 배지로 처리후에, HepG2 및 WISH 세포(106)는 지적한 시간에대 회수하고, 전체 RNA를 TRI 시약을 이용하여 추출하였다. 무작위 핵사머(hexamers)와 SuperscriptII(Invitrogen™, Leek, The Netherlands)를 이용하여(제조업자의 지시에 따라) cDNA를 만들었다. 다음의 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하였다;

사람 IL-18BP, 5'CACGTCGTCACTCTCCTGG 및 5'CGACGTGACGCTGGACAAC;

사람 IRF-1 5'GACCCTGGCTAGAGATGCAG 및 5'GAGCTGCTGAGTCCATCAG;

사람 β악틴 5'GTGGGGCGCCCCAGGCACCA 및 5'CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC..

초기 변성(90℃, 2 분), 변성(92℃, 45초) 28회, 어닐링(62℃, 1분), 연장(72℃, 1.5분), 최종 연장(72℃, 10분) 과정으로 증폭시켰다. 생성된 PCR 산물을 아가로즈(1%) 겔 전기영동을 이용하여 해리하였다.

실시예 14:

5' cDNA 단부(5' RACE)의 신속한 증폭.

제조업자의 지시에 따라 5' RACE를 5'RACE 시스템(GIBCO BRL)으로 실행하였다. 간단하게 설명하면, IFNγ-처리된 WISH 세포의 전체 RNA를 IL-18BPa mRNA(GenBank Accession No. AF110799)의 뉴클레오티드 89-70에 대해 상보적인 프라이머를 이용하여 역-전사시키고(실시예 13), 새로 합성된 단부에 고정(anchor) DNA를 붙였다. 고정 DNA에 상보적인 포워드(forward) 프라이머와 IL-18BP mRNA의 뉴클레오티드 31-11에 상보적인 네스티드(nested) 역 프라이머를 이용하여 PCR 하였다. PCR 생성물을 서브클론시키고, DNA 서열 분석하였다.

실시예 15:

플라스미드와 클로닝.

KpnI 부위를 포함하는 센스 프라이머(S4753.pgl)(5'CTATATGGTACCCACCCTTCCTTTTACTTTTTCC)와 NheI 부위를 포함하는 역 프라이머(5'TATCGCTAGCCAGTCACACAGGGAGGCAGT)(R1exA)를 이용하여 게놈 DNA를 PCR하여 전체 가상 IL-18BPa 프로모터 부분을 얻었다. PCR 생성물을 pGEM-T Easy 벡터(Promega, Madison, WI)에 서브클론시키고, DNA 서열 분석하였다. pGEM-T Easy 클론으로부터 Kpn I-Nhe 단편을 분리시켜, Rapid DNA Ligation Kit(Roche)를 이용하여 pGL3-Basic 벡터(Promega)에 결찰시켜, pGL3(1601)을 얻었다. 5'-절두된 리포터(pGL3(1454), pGL3(1274), pGL3(1106), pGL3(656), pGL3(280), pGL3(122)를 동일한 역 프라이머와 다음의 센스 프라이머들을 이용하여 준비하였다;

모든 PCR 생성물을 pGL3 Basic 벡터에 대조군과는 반대 방향으로 클론시켰다.

실시예 16:

일시적인 트랜스펙션 검사.

6웰 플레이트(0.5x106/well)에 HepG2 또는 WISH 세포에 FuGENE 6, 지적된 루시페라제 리포터 벡터(0.5mg/well), pSV40bGAL(0.2mg/well, Promega)를 이용하여 제조업자의 지시에 따라 트랜스펙션시켰다. 일부 경우에는 다음의 발현 벡터를 함께 트랜스펙션시켰다: pcDNA3-IRF(0.07~1.5mg/well, Dr. B. Levy, Technion, Israel 제공); pcDNA3-C/EBPb(0.5~2.5mg/well, Dr. D. Zipori, Weizmann Institute of Science 제공). 16시간 후에 IFNγ(100U/ml), IL-6(150U/ml), TNFα(10 ng/ml) 또는 이들 복합물로 4시간동안 무혈청 배지에서 세포를 처리하였다. 그 다음 세포를 회수하고, 용해시켜, 루시페라제 활성을 측정하였다. β-갈락토시다제 활성에 대해 표준화시켰다.

실시예 17:

핵 및 세포질 추출물 준비.

세포를 얼음으로 냉각시킨 인산완충염(PBS)으로 3회 세척시키고, 액화 질소에서 바로 냉동시킨다. 세포 펠렛을 세포질 완충액(10mM Hepes, pH 7.9, 10mM NaCl, 0.1mM EDTA, 5%(부피) 글리세롤, 1.5mM MgCl2, 1mM 디티오트레톨(DTT), 0.5 mM PMSF, 50mM NaF, 0.1mM Na3VO4, 2mM EGTA, 10mM EDTA, 10mM Na2MoO4, 루페틴, 펩스타틴, 아프로티닌 각 2mg/ml) 4배 세포 용적에 재현탁시켰다. 용해물을 원심분리하여(3000xg, 10분) 세포질 단백질을 포함하는 상층액을 수득한다. 펠렛은 핵 완충액(NaCl이 0.42M로 증가된 것을 제외하고는 세포질 완충액과 동일함) 2.5배 세포 용적에 재현탁시켰다. 핵 찌꺼지를 원심분리(15,000xg, 20분. 4°C)에서 제거하고, 상층액을 액화질소를 이용하여 냉동시키고, 80°C에 저장한다. 단백질 농도는 BC단백질 검사 시약 키트(Pierce, Rockford USA)에서 기준으로 BSA(bovine serum albumin)를 이용하여 측정하였다.

실시예 18:

전기영동 이동성 변이 연구.

선택된 반응 요소(10pmol)에 상응하는 ds 올리고뉴클레오티드를 폴리뉴클레오티드 카이나제(New England Biolabs)를 이용하여 [32P]3 ATP로 라벨시켰다. 핵 추출물(5㎍ 단백질)을 poly(dI-dC)(Amersham Pharmacia biotechnology)와 함께 20 ml EMSA 완충액(20mM Hepes pH 7.5; 5mM MgCl2, 2mM EDTA, 5mM DTT, 5% 글리세롤)에서 선처리시켰다(15분간, 0°C). 라벨된 프로브(3x104cpm)를 추가시키고, 추가 30분간 실온에서 더 처리하였다. 초-변이 검사를 위해 샘플에 프로브를 추가시키 기 전에 지정 항체(4mg, 1시간, 0°C)로 지속 처리하였다. 관련 프로브와 함께 200배의 야생형 및 돌연변이형 경쟁 물질을 함께 첨가하였다. 반응 혼합물을 5% 비-변성 폴리아크릴아미드 겔상에서 전기영동시켰다. 겔을 진공에서 건조시키고, -80°C에서 하룻밤동안 자가방사사진을 촬영하였다.

실시예 19:

면역침전(ip) 및 면역블랏팅(ib) 분석.

핵 또는 세포질 단백질 추출물(80mg)을 4℃에서 하룻밤동안 지적 다클론 항체 6㎎과 배양시키고, 실온에서 1시간동안 Protein G Sepharose beads(Pharmacia)로 면역 침전시켰다. 베드는 10% DTT를 포함하는 SDS-PAGE에서 가열시키고, 상층액은 환원 조건하에서 SDS-PAGE(10% 아크릴아미드)로 해리시켰다. 그 다음 겔을 니트로셀룰로오즈 막에 블랏팅시키고, 지정 항체에 대한 단백질을 감지한다. 면역 복합체는 Super Signal™(Pierce) 감지 키트를 이용하여 확인할 수 있다.

실시예 20:

IL-18BP 프로모터를 이용한 CHO r-hsLDLR 준비

디하이드로폴레이트 확원효소(DHFR) 유전자가 부족한 CHO-DUKX 세포(Urlaub, G. et al., 1980)에 두 개 발현 벡터를 동시-트랜스펙션시켜 사람의 가용성 LDLR를 발현시키는 안정적인 재조합 CHO 세포를 만들 수 있는데, 이때 벡터중 하나는 아미노산 잔기 Asp(+ 4)에서 시작하여 Glu 291(+291)까지의 LDLR의 N-말단 리간드 결합 부분이 있고, DHFR 뮤린 유전자를 포함하는 pDHFR, DHFR은 SV40 초기(early) 프로모터에 제거를 받고 및 sLDLR 유전자는 IL-18BP 프로모터(SEQ ID NO:2)에 제어를 받고, SV40 초기 부분의 전사 종료 요소를 포함하는 벡터이다. 제조업자의 지시에 따라 LipofectAmine(Gibco BRL)을 이용하여 양이온 리포좀으로 트랜스펙션을 실시한다. 트랜스펙션 후 72시간 후에, 세포를 데록시 및 리보뉴클레오시드가 부족하고, 10% 투석된 FCS가 보충된 선택 배지로 옮긴다. DHFR 활성을 나타내는 세포는 콜로니를 형성하고, 트립신을 적신 페이퍼를 이용하여 세포를 들어올림으로써 분리할 수 있다. 세포를 생장시키고, r-hsLDLR 활성에 대해 스크리닝시킨다. 트랜스펙센된 세포는 MTX를 이용하여 유전자 증폭시키고, 서브클로닝후에 안정적인 생산 클론을 선별한다.

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Claims (34)

1. 사람 IL-18BP 프로모터를 인코딩하는 DNA 서열(SEQ ID NO:1), 또는 SEQ ID NO: 2와 SEQ ID NO:3에서 선택된 이 서열의 단편에 있어서, 이때 상기 DNA 서열의 3' 말단은 SEQ ID NO: 5을 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 서열.
2. 삭제
3. 제 1항에 있어서, 단편은 SEQ ID NO:2를 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 서열.
4. 제 1항에 있어서, 단편은 SEQ ID NO:3을 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 서열.
5. 제 1항, 제3항 또는 제4항중 어느 한 항에 있어서, 인트론을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 서열.
6. 제 5항에 있어서, 인트론은 IL-18BP의 제 1 인트론으로 구성되는 것을 특징으로 하는 DNA 서열.
7. 제 1항, 제3항 또는 제4항중 어느 한 항에 있어서, IL-18BP 프로모터에 작동가능하게 연결된 유전자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 서열.
8. 제 1항에 있어서, 유전자는 IL-18BP를 인코딩하는 것을 특징으로 하는 DNA 서열.
9. 제 1항에 있어서, 유전자는 이질성 단백질을 인코딩하는 것을 특징으로 하는 DNA 서열.
10. 제 9항에 있어서, 이질성 유전자는 루시페라제 유전자를 인코딩하는 것을 특징으로 하는 DNA 서열.
11. 제 9항에 있어서, 이질성 유전자는 인터페론-베타, TNF, 에리트로포이에틴, 조직 플라스미노겐 활성인자, 과립구 콜로니 자극인자, 망가니즈-슈퍼옥사이드 디스뮤타제(manganese-superoxide dismutase), 면역글로불린 또는 이의 단편, 성장 호르몬, FSH(follicle-stimulating hormone), hCG(human chorionic gonadotrophin), IL-18(Interleukin-18), hsLDLR(human low density lipoprotein ), 또는 TNF(Tumor necrosis factors) 수용체 결합 단백질에서 선택되는 단백질을 인코딩하는 것을 특징으로 하는 DNA 서열.
12. 제 1항, 제3항 또는 제4항중 어느 한 항에 따른 DNA 서열을 포함하는 벡터.
13. 제 12항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
14. 제 13항에 있어서, 포유동물 세포인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
15. 제 14항에 있어서, CHO, WISH, HepG2, Cos, CV-1, HeLA, 또는 Hakat U937 세포에서 선택되는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
16. 재조합 단백질의 생산 방법에 있어서, 제13항에 따른 숙주 세포를 배양하고; 생산된 재조합 단백질을 분리하는 것을 특징으로 하는 생산 방법.
17. 바이러스 게놈의 일부분; 목표하는 유전자를 인코딩하는 DNA 단편; 제 1항, 제3항, 제4항중 어느 한 항에 따른 사람 IL-18BP 프로모터를 인코딩하는 DNA 서열을 포함하고 목표하는 유전자에 작동가능하게 연결된 DNA 단편을 포함하는 재조합 바이러스 벡터.
18. 제 17항에 있어서, 목표하는 유전자는 인터페론-베타, TNF, 에리트로포이에틴, 조직 플라스미노겐 활성인자, 과립구 콜로니 자극인자, 망가니즈-슈퍼옥사이드 디스뮤타제, 면역글로불린 또는 이의 단편, 성장 호르몬, FSH, hCG, IL-18, hsLDLR, 또는 TNF 수용체 결합 단백질에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스 벡터.
19. 제 17항에 있어서, 바이러스 게놈의 일부분은 아데노-연관된 바이러스에 속하는 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스 벡터.
20. 제 17항에 있어서, 바이러스 게놈의 일부분은 레트로바이러스에 속하는 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스 벡터.
21. 제 20항에 있어서, 레트로바이러스는 HIV(Human immunodeficiency virus), HFV(Human Foamy Virus), MLV(murine leukemia viruses), FIV(Feline immunodeficiency virus ), 또는 VSV(Vesicular stomatitis virus)에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스 벡터.
22. 목표하는 유전자의 세포 특이적 발현을 조절하는 시험관내 방법에 있어서, 제 17항에 따른 벡터로 표적 포유동물 세포를 형질도입하는 것을 특징으로 하는 방법.
23. 제 22항에 있어서, 표적 세포는 조혈 줄기 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
24. 제 22항에 있어서, 표적 세포는 단핵구인 것을 특징으로 하는 방법.
25. 제 24항에 있어서, 표적 세포는 대식세포인 것을 특징으로 하는 방법.
26. 제 22항에 있어서, 목표하는 유전자는 HIV 감염에 대한 저항성을 공여하는 단백질을 인코딩하는 것을 특징으로 하는 방법.
27. 삭제
28. 삭제
29. 제 1항, 제3항 또는 제4항중 어느 한 항에 따른 DNA 서열을 인코딩하는 DNA 서열을 보유하는 유전자도입 생쥐.
30. 삭제
31. 삭제
32. 삭제
33. 삭제
34. 삭제

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