MXPA05003871A - Promotor a proteina de union a interleucina-18, su preparacion y uso. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere al promotor de proteina de union a interleucina-18 (IL-18BP), a su preparacion y uso.

Description

PROMOTOR A PROTEINA DE UNION A 1NTERLEUC1NA-18, SU PREPARACION Y USO CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere al promotor de la proteína de unión a interleucina-18 (IL-18BP), a su preparación y uso.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Las proteínas de unión a la citocina (receptores solubles de citocina) son usualmente los dominios de unión a ligando extracelular de sus receptores de citocina de superficie celular respectivos. Estos se producen ya sea mediante procesamiento alternativo o mediante escisión proteolítica del receptor de superficie celular. Estos receptores solubles se han descrito en el pasado: por ejemplo, los receptores solubles para IL-6 e IFNy (Novick et al. 1989), TNF (Engelmann et al. 1989 y Engelmann et al. 1990), IL-1 e IL-4 (Mallszewski et al. 1990) e IFNo/ß (Novick et al. 1994, Novick et al. 1992). Una proteína de unión a citocina, denominada osteoprotegerina (OPG, también conocida como factor inhibidor de osteoclasto-OCIF), un miembro de la familia TNFR/Fas, parece ser el primer ejemplo de un receptor soluble que existe solamente como una proteína secretada (Anderson et al. 1997, Simonet et al. 1997, Yasuda et al. 1998).

Una proteína de unión a interleucina-18 (IL-18BP) se purificó mediante afinidad, en una columna IL-18, a partir de orina (Novick et al. 1999). IL-18BP suprime la inducción de IFNy por IL-18, y activación de NF-kB por IL-18 in vitro. Además, IL-18-BP inhibe la inducción de IFNy en ratones inyectados con LPS. El gen de IL-18BP se localizó en el cromosoma humano 11 , y no se pudo encontrar un exón que codifica para un dominio transmembranal en la secuencia genómica de 8.3 kb que comprende el gen de IL-18BP. Hasta el momento se han encontrado cuatro ¡soformas de IL-18BP generadas mediante procesamiento alternativo de ARNm en humanos. Estas fueron designadas IL-18BP a, b, c, y d, todas compartiendo el mismo N-terminal y difiriendo en el C-terminal (Novick et al 1999). Estas isoformas varían en su capacidad de unirse a IL-18 (Kim et al. 2000). De las cuatro, se sabe que las isoformas IL-18BP de humano (hlL-18BP) a y c tienen una capacidad neutralizante para IL-18. La isoforma más abundante de IL-18BP, la isoforma variante procesada a, exhibe una alta afinidad para IL-18 con a rápida velocidad de unión y una lenta velocidad de desunión, y una constante de disociación (Kd) de aproximadamente 0.4 nM (Kim et al. 2000). La IL- 8BP se expresa constitutivamente en el bazo (Novick 1999), y circula a concentraciones plasmáticas de 2.5 ng/ml (Novick et al. 2001). Los residuos implicados en la interacción de la IL-18 con la IL-18BP se han descrito a través del uso de modelamiento por computadora (Kim et al. 2000) y se basan en la interacción entre la proteína similar IL-?ß con el IL-1R tipo I (Vigers et al. 1997). De conformidad con el modelo de unión de la IL-18 a la IL-18BP, se ha propuesto que el residuo Glu en la posición 42 y el residuo Lys en la posición 89 de la IL-18, se unen a Lys-130 y a Glu-114 en la IL-18BP, respectivamente (Kim et al. 2000). Como se mencionó, la IL-18 induce el IFNy el cual, a su vez, se reportó recientemente que induce la generación de ARNm de la IL-18BPa in vitro (Muhl et al 2000). Por lo tanto, la IL-18BPa podría servir como una señal de "cierre", terminando la respuesta inflamatoria. La IL-18BP es significativamente homóloga a una familia de proteínas codificada por diversos virus de viruela (Novick et al. 1999, Xiang y oss 1999). La inhibición de IL-18 mediante esta IL-18BP viral putativa puede atenuar la respuesta inflamatoria Th1 antiviral. La IL-18BP de suero se eleva significativamente en la sepsis, indicando su papel en la regulación de las respuestas inmunes in vivo (Novick et al. 2001). De hecho, la IL-18BP se induce por IFNy en diversas células, sugiriendo que sirve como un inhibidor de retroalimentación negativa de la respuesta inmune mediada por la IL-18 (Mughl et al. 2000). Los resultados preliminares indican que el ARNm de la IL-18BP se detecta en leucocitos, colon, intestino delgado, próstata y particularmente en células del bazo (Novick et al. 1999). Las células componentes del bazo consisten de macrófagos, linfocitos, y células plasmáticas con células adicionales derivadas a partir de la circulación. La actividad de los elementos que controlan la transcripción, el promotor y los potenciadores varían considerablemente entre los diferentes tipos celulares. Los promotores y potenciadores consisten de arreglos cortos de secuencias de ADN que interaccionan específicamente con las proteínas celulares implicadas en la transcripción (revisado en Dynan y Tjian 1985, McKnight y Tjian 1986, Sassone-Corsi y Borreli 1986 y Maniatis et al 1987). La combinación de diferentes secuencias de reconocimiento y las cantidades de los factores de transcripción cognados determinan la eficiencia con la cual se transcribe un gen dado en un tipo celular particular. Muchos promotores eucariónticos contienen dos tipos de secuencias de reconocimiento: la caja TATA y los elementos promotores hacia el extremo 5'. Se piensa que la caja TATA, localizada 25-30 pb hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción, está implicada en el direccionamiento de la ARN polimerasa II para iniciar la síntesis de ARN en el sitio correcto. En contraste, los elementos promotores hacia el extremo 5' determinan la velocidad a la cual se inicia la transcripción. Los elementos potenciadores pueden estimular la transcripción hasta 1000 veces a partir de promotores homólogos o heterólogos asociados. No obstante, a diferencia de los elementos promotores hacia el extremo 5', los potenciadores son activos cuando se colocan hacia el extremo 3' a partir del sitio de inicio de la transcripción o a distancia considerable a partir del promotor. Muchos potenciadores de genes celulares trabajan exclusivamente en un tejido particular o tipo celular (revisado por Voss et al. 1986, Maniatis et al. 1987). Además ciertos potenciadores se vuelven activos solamente bajo condiciones específicas que se generan por la presencia de un inductor, tal como una hormona o un ion metálico (revisado por Sassone-Corsi y Borrelli 1986 y Maniatis 1987). Debido a estas diferencias en las especificidades de la célula de los potenciadores celulares, la elección de los elementos promotores y potenciadores a ser incorporados en un vector de expresión eucarióntica se determinará por los tipos celulares en los cuales se va a expresar el gen recombinante. Contrariamente, el uso de un vector prefabricado que contiene un promotor específico y un potenciador celular puede limitar severamente los tipos celulares en los cuales se puede obtener la expresión. Muchos elementos potenciadores derivados a partir de los virus tienen un intervalo de hospedero más amplio y son activos en una variedad de tejidos, aunque se observan diferencias cuantitativas significativas entre los diferentes tipos celulares. Por ejemplo, el potenciador temprano SV40 es activo de manera promiscua en muchos tipos celulares derivados a partir de una variedad de especies de mamíferos, y consecuentemente se han utilizado vectores que incorporan este potenciador (Dijkema et al. 1985). Otras dos combinaciones de potenciador/promotor que son activas en un amplio intervalo de células se derivan a partir del repetido largo (LTR) del genoma del virus de sarcoma de Rous (Gorman et al 1982b) y a partir de citomegalovirus de humano (Boshart et al. 1985).

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La invención se refiere a una secuencia de ADN que codifica el promotor de la IL-18BP de humano (SEQ ID NO: 1 ), o un fragmento tal como aquel en la SEQ ID NOS 2 ó 3, o un derivado funcional del mismo en donde el extremo 3' de dicha secuencia de ADN o fragmento de la misma comprende uno o más nucleótidos a partir del extremo 5' de la SEQ ID NO: 5. Más específicamente, un derivado de conformidad con la invención puede ser el ADN de la invención mutado en uno o más sitios AP1 presentes en un elemento silenciador presente en la secuencia, y la secuencia de ADN puede contener adicionalmente un gen operativamente asociado al promotor de la IL-18BP. En un aspecto de la invención, el gen puede codificar por ejemplo una IL-18BP o una proteína heteróloga tal como luciferasa, interferón-beta, TNF, eritropoietina, activador del plasminógeno tisular, factor estimulante de la colonia de granulocitos, manganeso superóxido dismutasa, una inmunoglobulina, o fragmento de los mismos, hormona de crecimiento, FSH, hCG, IL-18, hsLDLR y proteínas de unión al receptor TNF. La invención provee un vector que comprende una secuencia de ADN que codifica el promotor de la IL-18BP de humano, una célula hospedera que comprende el vector por ejemplo células CHO, WISH, HepG2, Cos, CV-1 , HeLA, y Hakat U937, y un método para la producción de una proteína recombinante que comprende cultivar la célula hospedera y aislar la proteína recombinante producida. Además, la invención provee un vector de virus recombinante el cual comprende una porción del genoma del virus, un fragmento de ADN que codifica un gen de interés y un fragmento de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica el promotor de la IL-18BP de humano. Más específicamente la porción viral puede ser por ejemplo un virus adeno asociado, y un retrovirus tal como VIH, HFV, MLV, FIV y VSV. También la presente invención provee un método para regular la expresión específica de célula de un gen de interés, que comprende transducir una célula de mamífero blanco con el vector viral de la invención en una célula blanco tal como una célula madre hematopoiética, y un monocito. El gen de interés puede ser por ejemplo una proteína que confiere resistencia a la infección por VIH. La regulación de la expresión específica de la célula de un gen de interés se puede utilizar en el tratamiento de por ejemplo infección por VIH, el tratamiento de trastornos hematopoiéticos tales como SCID, enfermedad granulomatosa crónica y talasemia. La invención provee adicionalmente un método de terapia génica para el tratamiento de una enfermedad en un individuo que exhibe IFNy elevado en un tejido corporal, que comprende la administración de una cantidad efectiva del vector viral de la invención, opcionalmente comprendiendo de manera adicional la administración de IL-6 y/o TNF-a y o los factores IRF y o C/???ß. En otro aspecto la invención se refiere a ratones transgénicos que contienen la secuencia de ADN que codifican una secuencia de ADN de la invención. Además la invención enseña el uso de una secuencia de ADN que codifica el promotor de la IL-18BP de humano (SEQ ID NO: 1), o un fragmento o un derivado funcional del mismo en donde el extremo 3' de dicha secuencia de ADN o fragmento de la misma comprende uno o más nucleótidos a partir del extremo 5' de la SEQ ID NO: 5, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad. También, la invención provee una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de una secuencia de ADN que codifica el promotor de la IL-18BP de humano (SEQ ID NO: 1), o un fragmento o un derivado funcional del mismo en donde el extremo 3' de dicha secuencia de ADN o fragmento de la misma comprende uno o más nucleótidos a partir del extremo 5' de la SEQ ID NO: 5.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La figura 1 muestra una representación esquemática de la región del promotor del gen de la IL-18BP, incluyendo los 5 elementos reguladores. Las figuras 2A - 2B muestran las cinéticas de la inducción de la IL-18BP y la sinergia con TNFa e IL-6. (A) El IFNy induce a la IL-18BP de manera dosis y tiempo-dependiente en las células WISH de humano. Las células se incubaron con las concentraciones indicadas del IFNy por 24 y 48 horas. (B) Efectos sinergísticos del TNFa; IL-6 y su combinación sobre IL-18BP inducida por el IFNy. Las células HepG2 se incubaron con las combinaciones indicadas de IFNy (100 U/ml), TNFa (20 ng/ml) e IL-6 (300 U/ml). La inducción de IL-18BP por cada combinación fue significativamente superior (p<0.05) que la inducción por IFNy solo. Los datos son media ± DE (n=3, para A. n=4, para B) La figura 3 muestra una representación esquemática de la organización conservada exón-intrón de los genes de la IL-18BP de humano y de ratón. El gen de la IL-18BPa de humano se comparó con el gen de la IL- 18BPd de ratón. Los exones se indican. El sitio de inicio de la transcripción, sitio de inicio de la traducción (ATG), codón de paro (paro) y la señal de poliadenilación (PAS) se indican para el gen de la IL-18BPa de humano. Las figuras 4A - 4B muestran que la inducción de la IL-18BP por el IFNy está en el nivel transcripcional y depende de la síntesis de proteína de novo. (A) RT-PCR semi-quantitativa del ARNm de la IL-18BP a partir de las células HepG2 que fueron pre-incubadas con actinomicina D (1 g/ml1 30 minutos), lavadas e incubadas con IFNy (100 U/ml) por los tiempos indicados.

La RT-PCR del ARNm de la ß actina se muestra como un control (B) RT-PCR semi-quantitativa del ARNm de la IL-18BP a partir de las células HepG2 que fueron pre-incubadas con cicioheximída (20 µg/ml) e IFNy (100 U/ml) por los tiempos indicados. Las figuras 5A - 5B muestran la actividad basal y la actividad inducida por IFNy de los vectores reporteros de luciferasa que portan el promotor de la IL-18BP de humano. El tamaño del inserto, que se extiende a partir del sitio de inicio de la transcripción (+1) se proporciona en paréntesis.

Los números en círculo representan los diversos elementos de respuesta: 1.

GAS. 2. IRF-E. 3. C/EBP-E (2 sitios). Silenciador 5. Potenciador Dístal. Los cuadrados llenos ilustran la mutación en un elemento de respuesta específico. Las células HepG2 fueron co-transfectadas con el vector reportero indicado y con pSV40 GAL. Todos los valores de luciferasa se normalizaron a la actividad de ß galactosidasa. (A) Actividad de la luciferasa en los extractos de células no inducidas en relación con aquella de las células transfectadas con el vector pGL3-Básico. (B) Actividad de la luciferasa en las células transfectadas con vectores seleccionados e inducidos con IFNy. Las veces de inducción están sobre la actividad basal como se proporciona en (A). La figura 6 muestra que IRF-1 es esencial para la expresión de la IL-18BP en ratones. La IL-18BP en suero de ratones C57BI/6 IRF-1"'" y ratones control C57BI/6 que se inyectaron intraperitonealmente con IFNy de murino (53,000 u/ratón). Los ratones fueron sangrados antes de la inyección y 24 horas después de la inyección. La IL-18BP en suero se determinó mediante ELISA. Los datos son media ± DE (n=6 para cada grupo). Las diferencias entre la IL-18BP en suero en ratones control y ratones deficientes en IRF, así como la inducción de la IL-18BP en los ratones control fueron estadísticamente significativos (p < 0.05). Las figuras 7A - 7D muestran el papel de IRF-1 y de C/???ß en la inducción del gen de la IL-18BP y su asociación. (A) ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA ejemplo 18) de las sondas dsADN que corresponden a las bases -33 a -75 (IRF-E, panel izquierdo) y -8 a -55 (GAS, panel derecho). Las células HepG2 se trataron con IFNy por los tiempos indicados y los extractos nucleares se dejaron reaccionar con las sondas IRF- E o GAS. Las bandas cambiadas están indicadas por las cabezas de flecha llenas. El complejo GAS también se sometió a un súper cambio con los anticuerpos indicados. La banda súper cambiada se indica por una cabeza de flecha abierta. (B) RT-PCR semi-quantitativa del ARNm de la IL-18BP a partir de células HepG2 que fueron transfectadas con las combinaciones indicadas de los vectores de expresión IRF-1 o C/???ß. En donde se indicó, se añadió el IFNy y las células se cosecharon 5 horas después. Los valores se normalizaron a ARNm de ß actina. (C) Actividad luciferasa en células transfectadas con el vector reportero de luciferasa pGL3 (1272), que contiene el promotor completo de la IL-18BP, junto con la concentración indicada de pCDNA3-IRF-1 (círculos) y 1 µ9/106 células de pCDNA3-C/EBP . Alternativamente, las células se transfectaron con la concentración indicada de pCDNA3-C/EBPp (cuadrados) y 0.1 µ? 06 células de pCDNA3-IRF-1. La actividad de luciferasa se normalizó mediante la actividad pGal. (D) Inmunoblots de extractos nucleares y citoplásmicos (véase el ejemplo 17 para la preparación de extractos) de células tratadas con IFNy (100 U/ml, 2 horas). Los extractos se inmunoprecipitaron (IP) y se sometieron a inmunoblot (IB) con los anticuerpos indicados. Las figuras 8A - 8B muestran los factores de unión al promotor de la IL-18BP después de la inducción por IFNy (A) EMSA con la C/???ß proximal y los extractos celulares totales siguiendo al tratamiento con IFNy. En donde se indicó, los extractos se súper cambiaron con los anticuerpos indicados. (B) EMSA con una sonda que corresponde al potenciador distal y a los extractos celulares totales siguiendo al tratamiento con IFNy. En donde se indicó, los extractos se súper cambiaron con los anticuerpos indicados, con o sin competencia con dsADN que corresponde a la mitad proximal de la sonda. Las bandas cambiadas están indicadas por las cabezas de flecha llenas y la banda súper cambiadas se indican por las cabezas de flecha abiertas.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención se refiere al promotor de la IL-18BP de humano. Este promotor dirige la expresión constitutiva de la IL-18BP en células particulares, por ejemplo en monocitos y la inducción de la expresión de la IL-18BP mediada por IFNy en muchas células. El promotor de la IL-18BP de humano es capaz de dirigir la expresión constitutiva e inducida por IFNy de una proteína heteróloga. La invención se refiere a una secuencia de ADN que codifica el promotor de la IL-18BP de humano (SEQ ID NO: 1), o un fragmento o un derivado funcional del mismo en donde el extremo 3' de dicha secuencia de ADN o fragmento de la misma comprende uno o más nucieótidos a partir del extremo 5' de la SEQ ID NO: 5. El ARNm de la IL-18BP se detecta en leucocitos, colon, intestino delgado, próstata y principalmente en células del bazo (Novick et al. 1999). En uno de los ejemplos a continuación se mostró que la proteína IL-18 se expresa constitutivamente en monocitos.

Se encontró que la expresión de la IL-18BP se indujo por IFNy, no solamente en monocitos sino también en muchas células diferentes y que esta inducción se puede mejorar adicionalmente mediante la inducción de la IL-6 y del TNFa. Se encontró que la síntesis de novo de proteína es esencial para la activación del gen de la IL-18BP por el IFNy. El sitio de inicio de la transcripción de ARNm de la IL-18BPa de humano se determinó mediante 5' RACE. Por lo tanto se encontró que el extremo 3' del ARNm de la proteína dedo de zinc localizada hacia el extremo 5' del gen de la IL-8BP limita la secuencia reguladora potencial hacia el extremo 5' de la IL-18BPa a 1601 bases hacia el extremo 5' de la base 1. Seis elementos reguladores (figura 1) fueron identificados dentro de esta región (a partir de la transcripción proximal a la transcripción dlstal): 1-Una secuencia gamma-activada (GAS) en las bases -24 a -32, 2- Un elemento de respuesta IRF-1,2 (IRF-E) bases de extensión -57 a -69, 3- y 4- dos elementos de respuesta C/EBP en las bases -309 a -322 y -621 a - 634, 5- Un silenciador en los residuos -625 a -1106 y 6- Un elemento potenciador con las bases de extensión -1106 a -1272. Una serie de los vectores reporteros para luciferasa con truncaciones progresivas en el extremo 5' del fragmento de 1601 pb se evaluaron en células HepG2 (una línea de carcinoma hepatocelular de humano). La región de 1272 kb establecida en SEQ ID NO: 1 dirige tanto, una expresión basal observada en ciertos tejidos y tipos celulares, así como también una inducción por IFNy. La evaluación de la actividad del promotor sobre fragmentos de ADN sucesivamente truncados dentro de esta región demostró que un fragmento de ADN de 122 pb, proximal al sitio de inicio de la transcripción establecido en SEQ ID NO: 3 comprende el promotor mínimo. Este promotor mínimo también es inducible. No obstante, otras secuencias reguladoras hacia el extremo 5' de este promotor mínimo contribuyen al grado de inducción. Se encontró que un fragmento de ADN de 635 pb que contiene además del elemento IRF-1 y GAS dos elementos ?????ß, establecido en SEQ ID NO: 2, confiere inducción máxima de expresión de luciferasa por IFNy. Los experimentos in vivo llevados a cabo con ratones deficientes en IRF-1 confirmó la importancia de IRF-1 como un mediador de expresión basal de IL-18BP así como en la expresión de IL-18BP inducida por IFNy. Se encontró que después de la inducción por IFNy, se induce la expresión del factor IRF-1 y el factor se forma en complejo con C/???ß la cual se presenta constitutivamente en las células. El complejo se une al elemento promotor GAS proximal y a su elemento promotor IRF-E adyacente. Se encontró que el potenciador presente en el sitio de transcripción distal terminal interactúa con el promotor basal a través de IRF-1. La presente invención se refiere al promotor de la IL18BP de SEQ ID NO: 1 o a un fragmento del mismo y métodos para regular la expresión del gen. Más particularmente, la presente invención se refiere a las secuencias de ADN aisladas de la IL-18BP de 1272 pb (SEQ ID NO: 1) o un fragmento de la misma tales como, 635 pb (SEQ ID NO: 2) y 122 pb (SEQ ID NO: 3) las cuales son capaces de dirigir la expresión del gen. Esta región promotora de la IL-18BP ha sido clonada y secuenciada y corresponde a los nucleótidos en la región de 1272 pb hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción de la IL-18BP (SEQ. ID. NO: 1). La presente invención abarca todo ei promotor de la IL-18BP (SEQ ID NO: 1), pero también secuencias de ADN que comprenden un fragmento del mismo (SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3), capaces de dirigir la transcripción del gen, y por lo tanto finalmente la transcripción del gen, y se pueden utilizar con otras porciones de la región promotora de IL-18BP o alternativamente con promotores heterólogos o elementos promotores heterólogo para controlar la transcripción del gen. Este promotor o fragmento del mismo es capaz de llevar a cabo inducción por IFNy. Dicha inducción se puede mejorar adicionalmente mediante la sobre-expresión de IRF- y/o C/???ß y/o mediante tratamiento con la IL-6 y/o TNFct Los derivados funcionales del promotor establecido en SEQ ID NO: 1 , o fragmento de la misma tales como SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3 son mutantes en donde 1 a 10, preferiblemente 1 a 5, más preferiblemente 1 nucleótido se reemplaza con otro, o está deletado y los cuales son capaces de dirigir la expresión del gen y la inducción por IFNy. Las secuencias de ADN de la presente invención que comprenden un promotor de la IL-18BP (SEQ ID NO: 1) o un fragmento de las mismas tales como aquellas en SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3, se pueden aislar utilizando diversos métodos conocidos en la técnica. Se pueden emplear al menos tres métodos principales alternativos: (1 ) el aislamiento de la secuencia de ADN a partir del ADN genómico el cual contiene la secuencia; (2) la síntesis química de la secuencia de ADN; y (3) la síntesis de la secuencia de ADN por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En el primer método, se puede seleccionar una librería de ADN genómico de humano con el objeto de identificar una secuencia de ADN que comprende un promotor de la IL-18BP o un elemento promotor de la IL-18BP. En el segundo método, se puede sintetizar químicamente una secuencia de ADN que comprende un promotor de la IL-18BP o un elemento promotor de la IL-18BP. Por ejemplo, se puede sintetizar una secuencia de ADN que comprende una región promotora de la IL-18BP o un promotor de la IL-18BP como una serie de 100 bases de oligonucleótidos que posteriormente se pueden ligar secuencialmente (vía sitios de restricción terminal apropiados) de manera que se forma la secuencia lineal correcta de nucleótidos. En el tercer método, se puede sintetizar una secuencia de ADN que comprende una región promotora de la IL-18BP o un promotor de la IL-18BP utilizando PCR. Brevemente, se pueden utilizar pares de oligonucleótidos de ADN sintético de al menos 15 bases en longitud (iniciadores de PCR) que hibridan con cadenas opuestas de la secuencia de ADN blanco para amplificar enzimáticamente la región de ADN que interviene en la secuencia blanco. Los ciclos repetidos de desnaturalización por calor del molde, fijación de los Iniciadores y extensión de los extremos 3' de los iniciadores fijados con una ADN polimerasa producen la amplificación del segmento definido por los extremos 5" de los iniciadores de PCR. Véase, Patentes de E.U.A. Nos.4,683,195 y 4,683,202. Se mostró que el promotor de la IL-18BP de la invención es capaz de conferir expresión basal y también expresión inducida por IFNy de un gen heterólogo. Por lo tanto, el promotor de IL-18BP tienen tanto actividad basal como actividad inducible. Mientras que la secuencia nucleotídica del promotor se establece en la SEQ. ID. NO. 1 o en los fragmentos de la misma que tienen actividades promotoras y se hace referencia a dicha secuencia en la especificación, se reconoce que se pueden elaborar los derivados nucleotídicos que no afectan la función del promotor o del elemento promotor. Estas secuencias nucleotídicas modificadas se pueden preparar, por ejemplo, al mutar la secuencia nucleotídica de manera que la mutación produzca la deleción, sustitución, inserción, inversión o adición de uno o más nucleótidos utilizando diversos métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se pueden emplear los métodos de mutagénesis sitio dirigida descritos en Taylor, J. W. et al., Nucí. Acids Res. 13, 8749-8764 (1985) y Kunkel, J. A., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82, 482-492 (1985). Además, los equipos para mutagénesis sitio dirigida se pueden obtener a partir de vendedores comerciales. Por ejemplo, un equipo para llevar a cabo mutagénesis sitio dirigida se puede obtener a partir de Amersham Corp. (Ariington Heights, lis.). La presente invención incluye ADN que contiene secuencias al menos 50% idénticas y preferiblemente 75% idénticas y más preferiblemente 90% idénticas a SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3 respectivamente, con la condición de que la actividad promotora se retenga y/o mejore. Uno de dichos derivados por ejemplo en SEQ ID NO: 1 es aquél mutado en uno o en los tres sitios API presentes en la región silenciadora. La secuencia nucleotídica que comprende el promotor de la IL-18BP, un fragmento del mismo y/o un derivado del mismo puede estar operativamente asociado a la región codificante de cualquier gen de interés para expresar ese gen en una célula hospedera apropiada. Por operativamente asociado se entiende operativamente asociado al promotor y a los elementos. Para la expresión de un gen de interés, se prefiere que todo el promotor de la IL-18BP en SEQ. ID. NO: 1 o un fragmento del mismo tal como en SEQ ID 2 o SEQ ID NO: 3 o un derivado del mismo esté operativamente asociado al gen de interés. Como se muestra a continuación en la sección de ejemplos, el promotor de la IL-18BP, o un fragmento del mismo tales como aquellas en SEQ ID NO: 2 o en SEQ ID NO: 3 es capaz de dirigir la expresión de genes heterólogos. También se contempla la expresión de genes homólogos con el promotor de la invención. El promotor puede contener adicionalmente un intrón, por ejemplo el primer intrón de la IL-18BP.

Un promotor o elemento promotor de la IL-18BP "operativamente asociado" dirigirá la transcripción de una molécula de ácido nucleico unida en un marco apropiado de lectura. Con respecto a los promotores heterólogos, los promotores y elementos de la invención están operativamente asociados cuando controlan la función de dichos promotores heterólogos. Como se mencionó anteriormente, el promotor de la IL-18BP, un fragmento del mismo y una secuencia derivada del mismo de la presente invención se pueden utilizar para expresar cualquier gen de interés. Típicamente, se utiliza un vector de expresión para este propósito. Por lo tanto, la presente invención se refiere adicionalmente a los vectores de expresión que comprenden una secuencia de ADN aislada capaz de dirigir la expresión génica la cual comprende un promotor de la IL-18BP o un fragmento del mismo o un derivado del mismo. Los vectores de expresión preferiblemente contienen un promotor de la IL-18BP o un fragmento del mismo o un derivado del mismo que tiene una secuencia nucleotídica que corresponde a SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3, respectivamente o fragmentos de las mismas y/o derivados. También se prefieren vectores de expresión que comprenden adicionalmente un gen homólogo o heterólogo operativamente asociado al promotor de la IL-18BP o un fragmento del mismo y/o un derivado de la misma secuencia nucleotídica modificada del mismo. Los vectores de expresión de utilidad en la presente invención frecuentemente están en la forma de "plásmidos", los cuales se refieren a ADN circulares de cadena doble los cuales, en su forma de vector, no están unidos al cromosoma. No obstante, se pretende que la invención incluya tales otras formas de vectores de expresión las cuales sirven a funciones equivalentes y las cuales se vuelven conocidas en la técnica subsecuentemente en la presente invención. Los vectores de expresión útiles en la presente invención típicamente contienen un origen de replicación, un promotor de la IL-18BP localizado en el frente del (por ejemplo, hacia el extremo 5' del) gen de interés, secuencias para terminación de la transcripción y el vector remanente. Los vectores de expresión también pueden incluir otras secuencias de ADN conocidas en la técnica, por ejemplo, secuencias líder para estabilidad las cuales se proveen para estabilidad del producto de expresión, secuencias líder secretorias las cuales se proveen para secreción del producto de expresión, secuencias que permiten la expresión del gen estructural a ser modulado (por ejemplo, mediante la presencia o ausencia de nutrientes u otros inductores en el medio de crecimiento), marcando secuencias que son capaces de proveer selección fenotípica en células hospederas transformadas, y secuencias las cuales proveen sitios para escisión por endonucleasas de restricción. Las características del vector de expresión actual utilizado deben ser compatibles con la célula hospedera la cual se va a emplear. Un vector de expresión como se contempla por la presente invención es al menos capaz de dirigir la transcripción, y preferiblemente la expresión, del gen de interés dirigido por la región promotora de la IL-18BP o promotor de la IL-18BP o una secuencia nucleotídica modificada del mismo. Los orígenes de replicación adecuados incluyen, por ejemplo, aquel del virus de simio 40 (SV40). Las secuencias de terminación adecuadas incluyen, por ejemplo, aquella del virus de simio 40 (SV40). El promotor de la invención se puede emplear para la expresión de virtualmente cualquier gen de interés, por ejemplo, aquellos que codifican productos terapéuticos tales como interferón-beta, TNF, eritropoietina, activador del plasminógeno tisular, factor estimulante de la colonia de granulocito, manganeso superóxido dismutasa, una inmunoglobulina, o fragmento de los mismos, hormona de crecimiento, hsLDLR, FSH, hCG, IL-18, proteínas de unión al receptor TNF y proteínas de unión a la IL-18. Todos estos materiales se conocen en la técnica y muchos están comercialmente disponibles. Los vectores de expresión adecuados que contienen las secuencias codificantes y secuencias control deseadas se pueden construir utilizando técnicas estándares de ADN recombinante conocidas en la técnica, muchas de las cuales se describen en Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989). La presente invención se refiere adicionalmente a células hospederas que contienen un vector de expresión que comprende una secuencia de ADN aislada capaz de dirigir la expresión génica la cual comprende una región promotora de la IL-18BP o un promotor de la IL-18BP o secuencias nucleotídicas modificadas del mismo. Preferiblemente, la región promotora de la IL-18BP tiene la secuencia nucleotídica que corresponde a 1272 pb hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción de la IL-18BP establecido en SEQ ID NO: 1, o un fragmento del mismo tal como la secuencia nucleotídica que corresponde a 635 pb hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción establecido en SEQ ID NO: 2 o un fragmento del mismo tal como la secuencia nucleotídica de 122 pb hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción establecido en SEQ ID NO: 3. También se prefieren las células hospederas que contienen un vector de expresión que comprende adicionalmente un gen homólogo o heterólogo operativamente asociado a la región promotora de la IL-18BP o la IL-18BP establecida en SEQ ID NO: 1 o un fragmento del mismo. Las células hospederas adecuadas incluyen, por ejemplo, células HeLa de humano o células CV-1 y COS-1 de mono verde africano, células CHO, HepG2, células WISH, Hakat U937 etc. Se prefieren las células hospederas que contienen receptores para IFNy, los cuales permiten la inducción del promotor de la IL- 8BP y por lo tanto la expresión mejorada del gen de interés. Los vectores de expresión se pueden introducir dentro de las células hospederas mediante diversos métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la transfección de células hospederas con vectores de expresión se puede llevar a cabo mediante el método de precipitación con fosfato de calcio. No obstante, también se pueden emplear otros métodos para introducir vectores de expresión dentro de células hospederas, por ejemplo, electroporación, fusión biolística, fusión liposomal, inyección nuclear e infección viral o de fago. Una vez que se ha introducido un vector de expresión dentro de una célula hospedera apropiada, la célula hospedera se puede cultivar y se puede aislar el polipéptido codificado por el gen de interés. Alternativamente una vez que se ha introducido un vector de expresión dentro de una célula hospedera apropiada, la célula se puede cultivar y después de alcanzar una densidad celular deseada, las células se pueden estimular con IFNy y se puede aislar el polipéptido codificado por el gen de interés. Las células hospederas que contienen un vector de expresión las cuales contienen una secuencia de ADN que codifica un gen de interés se pueden identificar utilizando diversos métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se pueden emplear hibridación ADN-ADN, evaluación de la presencia o ausencia de las funciones del gen marcador, evaluación del nivel de transcripción como se mide por la producción de transcritos de ARNm del gen de interés en la célula hospedera, y detectando inmunológicamente el producto génico. Las secuencias de ADN de vectores de expresión, plásmidos o moléculas de ADN de la presente invención se pueden determinar por diversos métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se pueden emplear el método de terminación de la cadena dideoxi como se describe en Sanger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467 (1977), o el método axam-Gilbert como se describe en Proc. Nati. Acad. Sci. USA 74, 560-564 (1977). Debe entenderse que los nucleótidos específicos o regiones dentro del promotor de la IL-18BP se pueden identificar como sea necesario para la regulación. Estas regiones o nucleótidos se pueden localizar mediante disección estructural fina de los elementos, y se pueden estudiar mediante experimentos que analizan la capacidad funcional de mutantes del promotor. Por ejemplo, utilizando PCR se pueden generar mutaciones de un par de bases particular de los elementos promotores o deleciones progresivas, como aquellas empleadas en la sección de ejemplos a continuación. De esta manera, se amplifican numerosas regiones promotoras mutadas o construcciones de deleción, y luego se clonan de vuelta dentro de las construcciones reporteras y se evalúan con las técnicas de ensayo de transfeccion y de luciferasa (como se establece en la sección de ejemplos a continuación). Los fragmentos amplificados se pueden clonar de vuelta dentro del contexto del promotor de la IL-18BP y también dentro de las construcciones del promotor heterólogo. De esta manera, se identifican las secuencias nucleotídicas exactas que son importantes en el direccionamiento de la transcripción del gen. Este análisis también identificará cambios en nucleótidos que no afectan la función del promotor, o que pueden incrementar la función del promotor. Por lo tanto, también se pueden construir los promotores derivados funcionales y los elementos promotores. El análisis funcional de la región promotora o promotor se puede facilitar mediante los estudios de caracterización y cambio en gel. El conocimiento de los pares de bases exactos importantes para mediar la unión de las proteínas provee evidencia de las bases importantes en la mediación de la respuesta transcripcional. Por lo tanto la invención abarca adicionalmente los pares de bases importantes en la interacción ADN-proteína. Dichos pares de bases se pueden elucidar. Los fragmentos genómicos que contienen las áreas de interés se pueden emplear en los experimentos de caracterización in vitro [Galas et al., Nucleic Acids Res. 9, 6505-6525 (1981)]. El fragmento de restricción aislado puede estar radiomarcado y subsecuentemente se incuba con extractos nucleares elaborados con técnicas establecidas a partir de células que se espera que contengan proteínas de unión a ADN las cuales se unirán al fragmento [por ejemplo, Dignam et al., Nucleic Acids Res. 1 , 1475-1489 (1983)]. Los fragmentos de ADN marcados se incuban con los extractos nucleares, se digieren con DNAsa I, y se someten a electroforesis en un gel de poliacrilamida desnaturalizante. Las proteínas de unión al ADN en el extracto celular se unen a su secuencia de reconocimiento contenida en el fragmento de restricción marcado, y se protege el ADN de la digestión por la DNAsa. Las regiones de protección delinean el sitio de unión. Se pueden utilizar las reacciones para secuenciación del fragmento de Maxam y Gilbert como un marcador para definir los nucleótidos protegidos de la digestión por DNAsa. La invención se formula adicionalmente a la identificación y caracterización de factores transactivadores los cuales interaccionan con el promotor o con los elementos promotores. Las secuencias reguladoras que actúan en cis sirven corno sitios de unión para las proteínas las cuales se denominan factores transactivadores (TAF) [Dynan W. S., Tjian T. Nature 316, 774-778 (1985); Maniatis, T. et al., Science 236, 1237-1245 (1987)]. Se presume que cada gen se une a una o más proteínas en cada una de sus secuencias reguladoras, y estas proteínas interaccionan entre sí y con la ARN polimerasa II en una manera que controla la transcripción. Los TAFs se han identificado en los extractos nucleares mediante su capacidad para unirse a y retrasar la movilidad electroforética de los fragmentos de ADN de la secuencia que actúa en cis [Dignam, J. D. et al., Nucleic Acids Res. 11 , 1475-1489 (1983); Dynan, W., Cell 58, 1-4 (1989); Fletcher, C. et al, Cell 773-781 (1987); Scheidereit, C. et al., Cell 51 , 783-793 (1987)]. Las secuencias que actúan en cis son útiles en los ensayos de retraso en gel para determinar la actividad de unión en los extractos nucleares. La tecnología para ensayos de cambio en gel se describe en la literatura e incluye muchos de los mismos reactivos utilizados en los experimentos de caracterización [Fried, M. et al., Nucleic Acids Res. 9, 6505-6525 (1981); Revzin, A., Biotechniques 7, 346-355 (1989); Strauss, F. A. et al., Cell 37, 889-901 (1984)]. Cualesquiera de los fragmentos de restricción marcados con 32 P o pares fijados de oligos complementarios se incuban con extractos nucleares y poli d(l-C) en un regulador de pH para unión, y los productos de esta reacción se someten a electroforesis sobre un gel de poliacrilamida no desnaturalizante. La ubicación del fragmento de ADN sobre el gel como se determina con autorradiografía se retrasa en los casos en donde la proteína se ha unido al ADN. El grado de retraso es una función relativa del tamaño de la proteína. Posteriormente las proteínas de unión así identificadas se pueden purificar y finalmente se pueden clonar utilizando técnicas conocidas. El promotor de la IL-18BP también encuentra uso en estudios transgénicos. Los ratones transgénicos proveen un modelo genético poderoso para el estudio de numerosas enfermedades en humano incluyendo el cáncer. Estos también han provisto un método importante ¡n vivo para el estudio de la regulación génica que ha confirmado y extendido las observaciones elaboradas con los experimentos transfección del gen reportero (por ejemplo luciferasa) [Palmiter, F. L. et al., Ann. Rev. Genet. 20, 465-499 (1986)]. Los estudios se dirigen a la disección de las señales que permiten el desarrollo de la relación de la expresión génica que extrañamente se lleva a cabo en modelos de cultivo de células y probablemente se estudia de mejor manera con un modelo transgénico. Este tipo de experimento es posible debido a la notable conservación entre las especies de secuencias reguladoras, de tal manera que las señales reguladoras en humano se interpretan de manera precisa por la maquinaria de transcripción del ratón. Por lo tanto las construcciones expresadas en ratones transgénicos podrían proveer gran información acerca de la regulación del gen de la IL-18BP. Los ratones transgénicos se pueden elaborar mediante los métodos conocidos en la técnica. El método más ampliamente utilizado a través del cual se han producido animales transgénicos implica la inyección de una molécula de ADN dentro del pronúcleo del macho de un huevo fertilizado [Brinster et al., Celi 27, 223 (1981); Costantini et al., Nature 294, 982 (1981); Harpers et al., Nature 293, 540 (1981); Wagner et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78, 5016 (1981); Gordon et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 73, 1260 (1976)]. Una vez que la molécula de ADN ha sido inyectada dentro de la célula huevo fertilizada, la célula se implanta dentro del útero de la hembra recipiente y se permite desarrollar hacia un animal. Por lo tanto, todas las células del animal resultante deben contener la secuencia génica introducida. Los ratones transgénicos resultantes o fundadores se pueden cruzar y los descendientes se analizan para establecer las líneas a partir de los fundadores que expresan el transgén. En los animales transgénicos, se pueden seleccionar múltiples tejidos para observar la expresión génica. Los estudios de ARN en las diversas líneas de ratón permitirán la evaluación de la independencia del sitio de integración a los niveles de expresión del transgén. Véase, Hogan, B. et al., Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1986). El promotor de la IL-18BP y los elementos promotores también pueden proveer métodos útiles para llevar a cabo la terapia génica. "Terapia génica" es la administración del material genético para modificar o manipular la expresión de un producto génico para alterar las propiedades biológicas de las células vivas para uso terapéutico. Las células pueden ser alogenéicas o autólogas. Las células se pueden modificar ex-vivo para la administración subsecuente al sujeto o se pueden alterar in vivo mediante productos de terapia génica que se proporcionan directamente al sujeto. En gran parte, las construcciones que comprenden el promotor de la IL-18BP o un fragmento del mismo y/o un derivado del mismo serán utilizados para dirigir la expresión génica en aquellas células cuando el gen de la IL-18BP se expresa normalmente, por ejemplo células mononucleares. Se pueden utilizar cualesquiera métodos disponibles en la técnica para la transferencia de las construcciones hacia el interior de los animales, incluyendo humanos. Esto incluye vectores virales, particularmente vectores retrovirales (véase, por ejemplo, Zweibel et al, Science 243, 220 (1989), y las referencias citadas en éste), así como a otros métodos. Se ha mostrado que los vectores recombinantes AAV son bastante prometedores para la administración de genes terapéuticos en el hígado y en el músculo esquelético (Snyder et al. 1997, Murphy et al. 1997, Song et al. 1998, Snyder et al. 1999, Herzog et al. 1997). Los ratones generados mediante la alteración del gen del factor de coagulación IX exhiben trastornos de sangrado severo y se parecen mucho al fenotipo observado en pacientes con hemofilia B. Se ha reportado (Wang et al. 1999) que una inyección intraportal particular de un vector viral recombinante adeno-asociado (AAV) que codifica el ADNc del factor IX de canino bajo el control de un potenciador/promotor específico de hígado produce una corrección a largo plazo y completa del trastorno de sangrado. Los vectores retrovirales, derivados a partir de oncoretrovirus tal como el virus de leucemia de murino (MVL), han sido los vectores más ampliamente utilizados para la transferencia del gen debido a que el genoma del vector se integra dentro de los cromosomas de las células blanco, produciendo la expresión estable de los transgenes (I. . Verma y N. Somia. Nature 389, 239 (1997) No obstante, estos vectores han probado ser especialmente buenos para células en división. Los vectores letivirales tales como los vectores de VIH se utilizan habitualmente para células que no se encuentran en división Mioshi et al. Science 1999 283: 682-686. La capacidad de los lentivirus para infectar a las células que no se encuentran en división tales como macrófagos los hacen buenos candidatos para uso como herramientas de transferencia de genes. Los vectores de VIH facilitan la transducción de células hematopoiéticas madre quiescentes de humano (HSCs). Las células madre hematopoiéticas de humano (HSC) son un blanco atractivo para terapia génica de trastornos hematopoiéticos heredables así como otros trastornos adquiridos debido a que estas células tienen la capacidad de generar todo el sistema hematopoiético. Por ejemplo las células madre hematopoiéticas pueden regenerar a las células monocíticas las cuales se sabe que están implicadas en la patogénesis del virus de inmunodeficiencia de humano-1 (VIH-1).

A pesar de los más de 15 años de investigación en el campo de la terapia génica utilizando células madre hematopoiéticas, el principal obstáculo sigue siendo la incapacidad de insertar eficientemente y de manera estable genes dentro de estas células. Los vectores retrovirales basados en el virus de la leucemia de murino Moloney (MLV) han sido utilizados más extensivamente, pero producen una transferencia génica relativamente baja dentro de las HSC pluripotenciales de humano y una expresión génica la cual frecuentemente es poco satisfactoria. Recientemente, los intentos para llevar a cabo la modificación genética de las células madre hematopoiéticas con genes que inhiben la replicación del VIH-1 se pretenden, para el desarrollo de monocitos resistentes a la infección por VIH-1 (Kohn et al. 1999). Teóricamente, la inserción de un gen capaz de conferir resistencia al VIH-1 dentro de las células madre hematopoiéticas podría producir que ese gen se encuentre presente en los monocitos maduros descendientes y en otras células susceptibles al VIH-1. Por lo tanto, es ventajoso el uso de un promotor el cual está activo en células monocitos tal como el promotor de la IL-18BP o un fragmento del mismo, para terapia génica de VIH-1. La terapia génica de la mayoría de los trastornos genéticos sanguíneos (por ejemplo SCID enfermedad granulomatosa crónica, talasemia etc.) requiere la transferencia del gen ex vivo dentro de las HSCs transplantables, auto-renovadoras y la regulación de la expresión del transgén en uno o más linajes celulares. La corrección de los trastornos que afectan a una progenie específica de las HSCs (por ejemplo hemoglobinopatías o talasemias, infección por ViH-1 ) requiere la expresión restringida del gen terapéutico de manera específica del linaje celular (lotti et al. 2002). En estos casos, es obligatorio el direccionamiento transcripcional del gen transferido. La expresión génica en diferentes tipos celulares es dependiente de la fuerza relativa del promotor utilizado. No obstante, la mayoría de los estudios preclínicos llevados a cabo hasta ahora dependen del uso de promotores virales, constitutivos para dirigir la expresión del transgén. Por ejemplo en el vector de VIH-1 se utiliza un promotor interno del CMV y el promotor del CMV de murino del vector retroviral LTR de murino. La regulación apropiada del transgén en el marco de lectura de un vector retroviral es una empresa difícil, debido a la interferencia transcripcional entre el repetido terminal largo viral (LTR) y los promotores potenciadores internos y a la inestabilidad genética de las secuencias reguladoras complejas. En la presente invención el promotor de la IL-18BP el cual se sabe que dirige la transcripción en las células mononucleares se utiliza para dirigir la expresión del transgén en HSCs, el precursor de dichas células mononucleares. La modificación genética de las células madre hematopoiéticas con "genes anti VIH" podría llevar al desarrollo de linfocitos y monocitos resistentes a la infección por VIH después del transplante. Las HSC de pacientes infectados con VIH-1 se pueden recuperar, células CD34+ aisladas, transducidas in vitro con un vector retroviral que porta una proteína inhibidora del VIH-1 bajo el control del promotor de la IL-18BP (en lugar del promotor retroviral) y reinfusionando estas células dentro de estos pacientes (Kohn et al. 1999). La fuente de HSC más comúnmente utilizada es la de las células madre hematopoiéticas de sangre periférica (PBSC), las cuales son reemplazadas en gran medida por la médula ósea en el ambiente de transplantes autológos (Gale et al. 1992 y Kessinger et al. 1991). Las PBSC se movilizan a partir de la médula ósea hacia la circulación periférica mediante la administración de factores tales como G-CSF o GM-CSF por 3-5 días y se pueden recolectar mediante leucaféresis. Diversos estudios han mostrado que el injerto ocurre más rápido cuando se transplantan células madre de sangre periférica en lugar de la médula ósea (Henon et al 1992 y Chao et al. 1993). Las células progenitoras clonogénicas contenidas en las PBSC movilizadas por G-CSF son muy susceptibles de llevar a cabo transferencia génica mediada por retroviral, mientras que la velocidad de transducción de las células madre reconstituidas a largo plazo en PBSC no es mejor que la realizada por las células de la médula ósea (Breni et al. 1992, Cassel et al. 1993, Dunbar et al. 1995). Se ha mostrado que los sujetos infectados por VIH-1 pueden tener una movilización y recolección exitosa de las PBSC movilizadas por G-CSF sin ningún incremento en los niveles endógenos del VIH- , al menos durante las etapas tempranas de la enfermedad (Junker et al. 1997 y Slobod et al. 1996). Otra fuente de células madre hematopoiéticas es la sangre del cordón umbilical (UCB) la cual ha demostrado ser susceptible a la transduccion retroviral, incluso potencialmente más susceptibles que las células de médula ósea (Moritz et al. 1993 y Hao et al. 1995). El uso de las células HSC UCB puede ser particularmente benéfico para los neonatos infectados porVIH-1. Puesto que la transmisión es principalmente perinatal, la sangre de cordón umbilical debe contener números normales y funciones normales de las células madre hematopoiéticas, las cuales pueden estar disminuidas en la médula ósea de los niños y adultos infectados por VIH-1 (Kearns et al. 1997). Se ha desarrollado un gran número de genes sintéticos los cuales pueden suprimir la replicación del VIH-1 ("genes anti-VIH-1"), incluyendo: antisentido, ribozimas, mutantes dominantes negativos (por ejemplo RevMIO), ARN señuelo, anticuerpos intracelulares para prevenir la expresión de las proteínas virales o de los co-receptores celulares, etc. (Veres et al. 1996, Zhou et al. 1994, Couture et al 1996, Malim et al. 1989, Bahner et al 1993 y Sullenger et al. 1990, Lee et al. 1994, Marasco et al 1997 y Chen et al. 1997). En muchos casos, se han mostrado que estos genes anti-VIH-1 en los sistemas modelos son capaces de suprimir significativamente la replicación del VIH-1 y en algunos casos incluso limitan la entrada del virus dentro de las células (36, 39-44). Si esencialmente 100% de las HSC del paciente y las células monocíticas resultantes se pueden hacer incapaces de mantener la replicación por VIH-1, es probable que se produzcan las cargas virales disminuidas. Teóricamente, la inhibición activa de la replicación del VIH-1 en 99.9% de las células susceptibles podría requerir el producir una reducción de log 3 en la carga del virus, un efecto que frecuentemente se produce por la terapia anti-retroviral altamente efectiva. No obstante, con las capacidades limitadas para transducir de manera efectiva los altos porcentajes de las células madre hematopoiéticas de humano, actualmente no es posible proteger a la mayoría de las células susceptibles. Un mecanismo alternativo para eficiencia se basa en la posibilidad de que las células diseñadas para ser incapaces de mantener la replicación activa del VIH-1 se pueden proteger a partir de la citopaticitidad inducida por el virus y por lo tanto tiene una ventaja de supervivencia selectiva en comparación con las células no protegidas. En ese caso, un número modesto de células protegidas puede comprender un porcentaje incrementado de todos los monocitos, que produce cierta conservación de la función inmune. La presente invención también se refiere a las composiciones farmacéuticas que comprenden un vehículo farmacéuticamente aceptable y un virus que comprende una secuencia de la presente invención que corresponde a la región promotora de la IL-18BP o el promotor operativamente asociado a un gen de interés que codifica para un fármaco adecuado. Estas composiciones se pueden utilizar preferiblemente para el direccionamiento de un fármaco a los tejidos en los cuales están elevados los niveles del IFNy. Una vez que se ha descrito la invención, ésta se entenderá más fácilmente mediante la referencia a los siguientes ejemplos que se proveen a manera de ilustración y no se pretende que limiten a la presente invención.

EJEMPLOS EJEMPL0 1 Expresión basal de la IL-18BP en monocitos El ARNm de la IL-18BP se detecta en leucocitos, colon, intestino delgado, próstata y particularmente en células del bazo (Novick et al. 1999). Las células del bazo consisten de macrófagos, linfocitos, y células plasmáticas con células adicionales derivadas a partir de la circulación. Con el objeto de determinar la expresión de la proteína de la IL-18BP en las células, se utilizó una prueba de ELISA especifica (ejemplo 12). Se encontró que las células mononucleares de sangre periférica de humano (PB C) producen de manera constitutiva la IL-18BP (0.7-1.5 ng/ml). Las células U-937, una línea celular derivada a partir de células malignas obtenidas a partir de la efusión pleural de un paciente con linfoma histiocítico, no expresan ninguna IL-18BP. Las células U-937 se pueden inducir hacia la diferenciación terminal monocítica mediante tratamiento con ésteres de forbol. Una expresión basal de la IL-18BP de 0.07 + 0.01 ng/ml se detectó solamente después de la diferenciación de las células hacia células semejantes a macrófagos mediante la estimulación con TPA (10 ng/ml). Estos resultados muestran que la IL-18BP se produce de manera constitutiva en monocitos y macrófagos.

EJEMPLO 2 Inducción de la expresión de la 1L-18BP en diversas células diferentes Se ha reportado previamente que el ARNm de la IL-18BP inducida por IFNy y proteína en diversas líneas celulares tales como la línea celular de queratinocitos, una línea celular de carcinoma de colon y en células mesangiales renales primarias (Muhl et al. 2000). Se estudió la inducción de la IL-18BP en diversas líneas celulares de humano y en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) mediante IFNy y otras citocinas. La expresión de la IL-18BP inducida por IFNy (véase el ejemplo 11 para monitoreo del ARNm y el ejemplo 12 para ELISA) de manera dependiente, exhibió una EC50 a 50 U/ml en células WISH y HepG2 (figura 2A y 2B). La IL-18BP aparentemente se acumula en los sobrenadante del cultivo de las células WISH, puesto que su concentración fue mayor a las 48 horas en comparación con las 24 horas (figura 2A). Las células mononucleares de sangre periférica de humano (PBMC) producen constitutivamente IL-18BP (0.7-1.5 ng/ml), y el tratamiento con IFNy (100 U/ml) incrementa el nivel de la IL-18BP por 1.7 ± 0.1 y 2.1 ± 0.3 veces a las 24 y 48 horas, respectivamente (p < 0.05, n=4). No se observó ningún efecto sobre la producción de la IL-18BP después del pre-tratamiento de la PBMC con TPA.

La inducción de la IL-18BP mediante IFNy se evaluó en la línea celular U937. El IFNy no indujo IL-18BP en células U937 no diferenciadas, no obstante, después de la diferenciación con éster de forbol (TPA, 10 ng/ml) en las células similares a macrófago, se obtuvo un nivel basal de la IL-18BP (0.07 ± 0.01 ng/ml), y se incrementó por 4.6 ± 0.05 veces después de la inducción con IFNy (100 U/ml, 24 horas), incrementándose adicionalmente a las 96 horas (no mostrado). El efecto de otras citocinas, tales como IFN 2, IFNp, IL-1 , IL-6, IL-12, IL-18 y TNFcc, sobre la expresión de la IL-18BP se evaluó en las células HepG2 (figura 2B). Los resultados obtenidos después de la incubación de las células con las diferentes citocinas en la presencia o ausencia de IFNy (figura 1 PNAS web) muestra que IFNa2, IFN , IL-1, IL-6, IL-12, IL-18 y TNFa no indujo IL-18BP sola. No obstante, en las células HepG2 la IL-6 y el TNFa actuaron de manera sinergística con el IFNy, proveyendo un incremento estadísticamente significativo de la IL-18BP. Estos resultados indican que la IL-18BP puede ser inducida por IFNy, en monocitos y en muchas células diferentes. La inducción de la IL-18BP por IFNa se mejora adicionalmente por la inducción de la IL-6 y el TNFa.

EJEMPLO 3 El gen de la IL-18BP se regula de manera transcripcional por el IFNy, reguiriendo síntesis de novo de la proteína Con el objeto de verificar si la inducción del ARNm de la IL-18BP por IFNy se encuentra al nivel transcripcional, se midió el efecto del interferón sobre las células HepG2 y Wish en la presencia de un inhibidor de la traducción, actinomicina D (figura 3). El incremento en los niveles del ARNm de la IL-18BP fue detectable mediante RT-PCR semi-quantitativo después de 3 horas de tratamiento con IFNy en células HepG2 y solamente después de 5 horas en células Hakat y WISH. El pre-tratamiento de las células HepG2 y WISH con actinomicina D antes de la estimulación con IFNy elimina la expresión del ARNm de la IL-18BP en diversos puntos de tiempo, indicando que el IFNy estimula la síntesis de novo del ARNm. La acumulación de la IL-18BP fue evidente a las 24 horas y posteriormente siguiendo al tratamiento con IFNy, apoyando una dependencia de la expresión de la IL-18BP sobre la inducción precedente de las proteínas, por ejemplo factores de transcripción, por IFNy. Por lo tanto con el objeto de confirmar dicha hipótesis, se empleó adicionalmente un inhibidor de la proteína, cícloheximida, para evaluar si la inducción del ARNm de la IL-18BP por IFNy requiere la síntesis de novo de proteínas. Los resultados resumidos en la figura 3 muestran que el pre-tratamiento de las células con cícloheximida elimina la inducción del ARNm de la IL-18BP. Este resultado indica que la síntesis de novo de ia proteína es esencial para la activación del gen de la IL-18BP por el IFNy.

EJEMPLO 4 Definiendo el sitio de inicio de la transcripción de la IL-18BPa y su región promotora, con el objeto de mapear el promotor de la IL-18BP Con el objeto de estudiar la región promotora de la IL-18BP, se requiere ¡nicialmente localizar de manera específica el sitio de inicio de la transcripción. El sitio de inicio de la transcripción del ARNm de la IL-18BPa de humano se determinó mediante 5' RACE (RACE ejemplo 14). Solamente un producto de PCR, que correspondía a IL-18BPa, la variante de procesamiento más abundante, se obtuvo mediante 5' RACE. El análisis de la secuencia de ADN de este producto reveló el sitio de inicio de la transcripción y un exón adicional de 50 pb siguiendo al sitio de inicio de la transcripción en el extremo 5' del ARNm de la IL-18BPa de humano, que corresponde a las posiciones 785-835 de ADN genómico de la IL-18BP (que se puede encontrar en la base de datos Entrez pubmed nucleotide datábase, No. de acceso AF110798). Por consiguiente, se generó un mapa novedoso de exón-intrón mediante la comparación del-ADN genómico con el ARNm al cual se añadió el exón-5' novedoso. (Véanse las figuras 4A-4B). Teniendo el sitio de inicio de la transcripción de la IL-18BPa (base 1), el ADN genómico de humano hacia el extremo 5' de la base 1 (cromosoma 11q clona: RP11-757C15, No de acceso AP000719.4 nucleótidos hacia el extremo 5' de la base 152,178) que corresponde a la región promotora de la IL- 8BP se pudo analizar adicionalmente. La comparación de este ADN con respecto a la base de datos de las secuencias tag expresadas (EST) en NCBI por el programa BLAST reveló un gen en el extremo 5' en la cadena +, que codifica para una proteína dedo de zinc (No. de acceso AK001961). La secuencia de ARNm depositada de esta proteína dedo de Zn se elongó adicionalmente por el programa "Instant RACE" (www. LabOnWeb. com), el cual selecciona una colección extensa de ESTs de humano. El programa coloca el extremo 3' del ARNm de la proteína dedo de zinc en el nucleótido 150,517 de la clona genómica RP11-757C 5, por lo tanto limitando la secuencia reguladora potencial hacia el extremo 5' de la IL-18BPa a 1661 bases hacia el extremo 5' de la base .

EJEMPLO 5 Exploración del promotor mínimo, hacia eí extremo 5' del gen de la IL- 18BP. capaz de promover la expresión constitutiva de un gen heteróloqo Con el objeto de encontrar el fragmento mínimo del ADN, hacia el extremo- 5' del gen de la-IL-18BPr capaz de-dirigir la-expresión de un gen exógeno tal como el gen reportero de luclferasa, un vector que contiene hasta 1601 pb que corresponden a la secuencia de ADN hacia el extremo 5' de la base 1 e incluyendo 50 pb hacia el extremo 3' del sitio de inicio de la transcripción (SEQ ID NO: 5) y se generaron vectores que tienen formas truncadas de este ADN (figura 5A) fusionado al gen de luciferasa (ejemplo 15). La actividad luciferasa en células HepG2 de humano (una línea de carcinoma hepatocelular de humano) transfectadas con un vector (pGL3 (1601)) que comprende el extremo hacia 5" del ADN de 1601 pb hacia el extremo 5' fue de 10.30 ± 9 veces mayor que aquella obtenida con el vector pGL3 vacío. Dicha actividad no se observó cuando se insertó el mismo ADN en la orientación opuesta (pGL3 (-1601). Este resultado demuestra que el ADN de 1601 pb hacia el extremo 5' de la base 1 tiene una actividad promotora basal. El examen de secuencia de este fragmento de 1601 pb de ADN revela que no incluye un elemento caja TATA, pero tiene diversos dominios ricos en GC cerca de sitio de inicio de la transcripción en las bases -3 a -9, -39 a -48 y -122 a -132. El análisis de la secuencia de 1601 pb del ADN por el programa TFSEARCH identificó una secuencia gamma activada (GAS) en las bases -24 a -32 (figura ). El análisis adicional reveló un elemento de respuesta IRF1, 2 (IRF-E) bases extendidas -57 a -69 y dosC/???ß elementos de respuesta (C/EBP-E) en las bases -309 a -322 y -621 a -634. Se evaluó una serie de los vectores reporteros para luciferasa con truncaciones progresivas en el extremo 5' del fragmento de 1601 pb. Los resultados resumidos en la figura 5A muestran que todas las construcciones, incluyendo pGL3 (122), que contiene solamente los elementos IRF y GAS, fueron al menos tan efectivas como pGL3 (1601) en el apoyo de la actividad promotora basal. Estos resultados revelan que el fragmento de 122 pb (SEQ ID NO: 3) que comprende los elementos IRF y GAS es adecuado para promover la actividad basal de un gen heterólogo (figura 5A).

EJEMPLO 6 Exploración del promotor mínimo, hacia el extremo 5' del gen de la IL- 18BP, capaz de promover la expresión inducible de un gen heterólogo Con el objeto de identificar el fragmento mínimo de ADN, hacia la región 5' del promotor de la IL-18BP, capaz de promover la expresión de luciferasa inducida por IFNy, los vectores de ADN truncados a partir del ejemplo precedente se evaluaron en las células HepG2 transfectadas en la presencia del IFNy (figura 5B para las transfecciones véase el ejemplo 16). Los resultados resumidos en la figura 5B muestran que después de 24 horas con IFNy se incrementa la actividad de luciferasa por 33 veces sobre el nivel de expresión basal en el vector incluyendo solamente los elementos IRF-E y GAS (pGL3 (122) vector). Este resultado demuestra que el par IRF-E-GAS sólo puede mediar la inducción del gen heterólogo mediante IFNy. La inclusión de los elementos C/EBP-E1 y 2 (pGL3 (656)) incrementa significativamente la inducción d la actividad dé luciferasa por él IFNy a 88 veces sobre la actividad basal, que demuestra la importancia de estos elementos en la inducción por IFNy. En contraste, la inclusión de un ADN adicional hacia el extremo 5' a dicho inserto (pGL3 (1106)) elimina la inducción de actividad de luciferasa por arriba de su nivel basal. Este resultado sugiere que un elemento silenciador reside en las bases -656 a -1106 (hacia el extremo 5' del segundo elemento C/EBP-E1). Se demostró que los tres elementos AP1 de respuesta están presentes dentro de la región silenciador y que c-Jun se une a, y está implicada en el silenciamiento del gen de la IL-18BP a través de los tres elementos de respuesta AP-1. La extensión adicional del promotor mediante 88 bases hacia el extremo 5' del silenciador (pGL3 (1272)) restablece la respuesta a IFNy, sugiriendo que un elemento potenciador reside en las bases -1106 a -1272, y esta activación por IFNy suprime el efecto del silenciador vecino. La extensión adicional de la secuencia no afecta la actividad basal o la actividad inducida por IFNy, sugiriendo que todas las secuencias reguladoras hacia 5' se localizan dentro de las bases -1 a -1272 (SEQ ID NO:1). A partir de todas las construcciones evaluadas la inducción de la pGL3 (656) es la mayor, indicando que este fragmento de ADN contiene el promotor inducible óptimo de la IL-18BP. Los resultados muestran que el promotor inducible mínimo se localiza a 122 pb hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción (SEQ ID NO: 3) que contiene los elementos IRF-E y GAS, en donde el promotor inducible máximo y óptimo se localiza a 656 bp hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción (SEQ ID NO: 2) que contiene además de los elementos IRF-E y GAS, dos elementos C/???ß.

EJEMPLO 7 Participación del IRF-1 en la expresión de la 1L-18BP in-vivo Para explorar la participación del IFR-1, se estudió el sitio de unión el cual se encontró en el promotor de la IL-18BP, en la expresión de la IL-18BP en ratones deficientes en IRF-1 Los niveles de la IL-18BP se midieron en los ratones deficientes en IRF-1 (Jackson laboratories, Bar Harbor ME) antes y después de la administración de IFNy de murino y en comparación con aquellos en los ratones control C57B1/6 (figura 6). La IL-18BP del suero basal en los ratones control C57B1/6 fue de 9.11 ± 9 ng/ml y se incrementó significativamente por IFNy a 22.4 2.2 ng/ml. En contraste, la IL-18BP de suero en los ratones deficientes en IRF-1 fue una continuación del límite de detección y se incrementó a solamente 0.71 ± 15 ng/ml con el IFNy. Este resultado confirmó la importancia del IRF-1 como un mediador basal así como la expresión de la IL-18BP inducida por el IFNy.

EJEMPLO 8 Detección de los factores de transcripción que se unen al promotor de la IL-18BP bajo condiciones inductivas Los ensayos del cambio de movilidad electroforética (EMSA ejemplo 18) se emplearon para identificar interacciones proteína-ADN entre los diversos elementos de respuesta dentro de promotor 1L-18BP. Las sondas de ADNds marcada que corresponden a las bases -33 a -75 (que contienen el IRF-E) y -8 a -55 (que contienen el GAS) se dejaron unir a los expertos nucleares de las células control y de las células tratadas con IFNy. Un complejo de sonda que contiene IRF-E y la proteína(s) nuclear fue evidente después de la incubación de las células por 1 hora con IFNy y la respuesta máxima se observó a las 3 horas (figura 7A, líneas 1-5). Como se esperaba, la adición de los anticuerpos a IRF-E ocasionó un "super-cambio", mientras que los anticuerpos control anti-transducor señal y anti-activador de la transcripción 1 (STAT1 ) no tuvieron efecto (datos no mostrados). En contraste con IRF-E, la sonda que contiene GAS se asoció constitutivamente con una proteína (figura 7A, línea 6), y este complejo se mejoró después de la inducción de las células con IFNy por 3 a 6 horas (líneas 7, 8). Se espera que GAS se una al dímero STAT1 inducido por IFNy. No obstante, el complejo no sé "afectó "por los anticuerpos a"STAT1 (línea 10), sugiriérTdó que el dímero STAT1 inducido por IFNy no estaba asociado con este GAS. El mismo resultado negativo se observó con los extractos nucleares de las células tratadas con IFNy por solamente 15 o 30 minutos (datos no mostrados). De manera sorprendente, este complejo se eliminó mediante anticuerpos a C/EBP (3 (línea 9) y se súper cambió con antibodiesa IRF-1 (línea 10). Por lo tanto la sonda de ADN que contiene GAS parece unirse a C/EBP sin importar la ausencia de un C/???ß consenso. Los resultados obtenidos con EMSA indican que después de la inducción con IFNy, IRF-1 se une al elemento IRF-E en el promotor IL-18BP. Además, se forma un complejo que comprende IRF-1 y C/???ß y se une al elemento GAS.

EJEMPLO 9 Exploración del papel del complejo IRF-1 -C/EBP3 en la inducción de la IL-18BP Para estudiar adicionalmente el papel de IRF-1 y de C/???ß en la inducción del gen de la IL-18BP, se midió el ARNm de la IL-18BP mediante PT-PCR semi-cuantitativo después de la sobre-expresión de IRF-1 y de C/???ß mediante el empleo de vectores de expresión para transfección (ejemplo 14, figura 7B). La sobre-expresión ya sea del factor de transcripción o una combinación de ambos factores en las células HepG2 no induce en el ARNm de la IL-18BP. Este resultado sugiere que se requieren factores adicionales inducidos por IFNy para la activación del gen de la IL-18BP. La transfección de las células con cualquiera de los vectores de expresión después de su inducción con IFNy reduce realmente el ARNm de la IL-18BP en comparación con IFNy solo. En contraste, la co-expresión de los dos factores de transcripción incrementa la inducción del ARNm de la IL-18BP por IFNy. Este resultado sugiere que IRF-1 y C/???ß debe estar presente a una cierta relación, posiblemente formando un complejo con el complejo de inicio de la transcripción. Para estudiar adicionalmente la posible interacción entre IRF-1 y C/???ß se llevaron a cabo una titulación de la actividad de luciferasa mediante la co-transfección de células con pGL3 (1272), una cantidad fija del vector de expresión IRF-1 y cantidades variables del vector de expresión C/???ß. De manera similar, se midió la actividad de luciferasa cuando el vector C/???ß se mantuvo constante y con cantidades variables del vector IRF-1. En ambos casos se obtuvo una curva dosis-respuesta en forma de campana, sugiriendo que la inducción óptima de la IL-18BP requiere una relación molar fija entre estos dos factores de transcripción (figura 7C). Se llevaron a cabo los estudios de inmunoprecipitación con el objeto de confirmar la asociación física entre IRF-1 y C/???ß (ejemplo 19, figura 7D). La inmunoprecipitación (ip) después del immunoblot (ib) de proteínas nucleares y citoplásmicas (ejemplo 15) a partir de las células tratadas con IFNy con anticuerpos a C/???ß reveló que C/???ß se expresa constitutivamente en células HepG2 y se transloca hacia el núcleo en respuesta al IFNy (panel superior). En contraste al C/???ß el cual no se induce por IFNy, ip e ib de extractos celulares con anticuerpos a IRF-1 reveló que IFNy induce la expresión de IRF-1. Pero de manera similar a C/???ß, después de la inducción con IFNy, IRF-1 se transloca hacia el núcleo (panel medio). Ip con anticuerpos a C/???ß seguido por ib con anticuerpos a IRF-1 reveló la presencia de un complejo estable IRF-1 -C/???ß en la fracción nuclear (panel inferior). Estos resultados confirman la formación del complejo IRF-l-C/???ß después de la inducción con IFNy y es la primera demostración de la existencia de dicho complejo entre estos dos factores transcripcionales. Por lo tanto después de la inducción con IFNy, la secuencia que contiene GAS proximal y se IRF-E adyacente se une el complejo del C/???ß y IRF-1.

EJEMPLO 10 Exploración del papel del C/EBP-Es en la actividad del promotor de la IL- 18BP Los dos ciclos C/???ß en las posiciones -309 a -322 y -621 a - 634 no tienen un IRF-E adyacente. De hecho, EMSA (ejemplo 18) de una sonda que corresponde a los sitios C/???ß en las posiciones -309 a -322 reveló una banda retardada (cabeza de flecha llena) que fue súper cambiada con anticuerpos a C/???ß (cabeza de fecha abierta) pero no con anticuerpos a IRF-1 (figura 8A). Por lo tanto, se concluyó que este sitio se une a C/???ß y no a su complejo con IRF-1. Además, esta banda se generó con un extracto nuclear de las células HepG2 no inducidas que expresa constitutivamente C/???ß pero carecen de IRF-1. De hecho, el IFNy no incrementa la expresión de C/???ß en estas células (figura 8B) y consecuentemente no incrementa la intensidad de la banda retrasada (figura 8A). Se obtuvieron resultados similares con el sitio C/???ß más distal (datos no mostrados). Los resultados muestran que el factor de transcripción C/EBP a diferencia del IRF-1 , se expresa constitutivamente y no se induce por IFNy y que además de la unión a IRF-1 y a GAS, se une a ambos elementos C/EBP presentes en el promotor IL-18BP.

EJEMPLO 11 Estudio del papel del potenciador en la expresión de la IL- 8BP El papel regulador del potenciador distal se estudió mediante EMSA (ejemplo 18) con una sonda de ADN de 192 pb, que corresponde a los nucleótidos -1081 a -1272. El extracto nuclear de las células HepG2 control formó un complejo con esta sonda (figura 8B, cabeza de flecha llena). Después del tratamiento de las células con IFNy, el complejo fue más intenso y de alguna manera se retrasó más. Posteriormente se realizó súper cambio de este complejo con los anticuerpos dirigidos en contra de IRF-1, C/???ß y cFos. De estos, solamente anti IRF-1 produjo un súper cambio (figura 8B, cabeza de flecha vacía). Un dsADN no marcado que corresponde a los nucleotides -1083 a -1174 no compite con uña sonda radiomarcada, indicando que las proteínas nucleares se unieron a los residuos -1 75 a -1272. Puesto que IRF-E se identificó solamente en la región proximal, este resultado sugiere que el potenciador distal estaba probablemente asociado con el IRF-E proximal. Estos resultados indican que el potenciador distal interactúa con el promotor basal a través de IRF-1.

EJEMPLO 12 ELISA para la IL-18BP La IL-18BP de humano se midió mediante un ELISA de anticuerpo doble como se describió (Novick et al 2001). La IL-18BP de ratón se midió mediante un ELISA de anticuerpo doble utilizando anticuerpo policlonal purificado mediante afinidad con antígeno de conejo a la IL- 8BP de murino y anticuerpo biotinilado que se obtuvo partir de Cytolab, Israel.

EJEMPL0 13 Aislamiento de ARN v transcripción reversa (RT)-PCR Después del tratamiento en medio libre de suero, las células HepG2, y WISH (10) se cosecharon a los tiempos ubicados y el ARN total se extrajo utilizando reactivo TRI. El ADNc se preparó utilizando hexámeros al azar y.SuperscriptlL (InvitrogenT , Leek, Los países bajos) de conformidad con las instrucciones del fabricante. El PCR se llevó a cabo con los siguientes iniciadores: IL-18BP de humano, 5' CACGTCGTCACTCTCCTGG y 5' CG ACGTG ACG CTGG ACAAC ; IRF-1 de humano 5' GACCCTGGCTAGAGATGCAG y 5" GAGCTGCTGAGTCCATCAG; ß Actina de humano 5' GTGGGGCGCCCCAGGCACCA y 5' CTCCTTAATGTCACGCACG ATTTC . Las amplificaciones se realizaron mediante desnaturalización inicial (92°C, 2 minutos), 28 ciclos de desnaturalización (92°C, 45 segundos), fijación (62°C,1 minuto) y extensión (72°C, 1.5 minutos), y extensión final (72°C, 10 minutos). Los productos de PCR resultantes se resolvieron mediante electroforesis en gel de agarosa (1%).

EJEMPLO 14 Amplificación rápida de los extremos 5' de ADNc (5'RACE) 5' RACE se llevó a cabo con un sistema 5' RACE (GIBCO BRL) de conformidad con las instrucciones del fabricante. Brevemente, el ARN total a partir de las células WISH tratadas con IFNy se transcribió de manera reversa (ejemplo 13) con un iniciador complementario a los nucleótidos 89-70 del ARNm de la IL-18BPa (GenBank No. de acceso AF110799) seguido por modificación del extremo de los extremos recientemente sintetizados con un ADN ancla. Posteriormente el PCR se llevó a cabo con un iniciador hacia adelante complementario al ADN ancla y a un iniciador reverso anidado complementario a los nucleótidos 31-11 del ARNm de la IL-18BPa. Posteriormente los productos de PCR fueron subclonados y se sometieron a análisis de secuencia del ADN.

EJEMPLO 15 Plásmidos y clonación Toda la región promotora de la IL-18BPa putativa de1601 pb se obtuvo mediante PCR del ADN genómico utilizando un iniciador sentido (S4753. pgl) que contiene un sitio Kpn I (5' CTATATGGTACCCACCCTTCCTTTTACTTTTTCC) e iniciador reverso (R1exA) que contiene el sitio NHe I (5TATCGCTAGCCAGTCACACAGGGAGGCAGT). El producto de PCR se clonó dentro del vector pGEM-T Easy (Promega, Madison, Wl) y se verificó mediante análisis de secuencia de ADN. Se aisló un fragmento Kpn l-Nhe I a partir del pGEM-T Easy clone y se ligó dentro del vector pGL3-Básico (Promega) utilizando el equipo de ligación rápida de ADN (Roche) para producir pGL3 (1601). Una serie de reporteros 5-truncados (pGL3 (1454), pGL3 (1274), pGL3 (1106), pGL3 (656), pGL3 (280) y pGL3 (122) se preparó similarmente con el mismo iniciador reverso y con los siguientes iniciadores sentido, respectivamente: S334.pgl 5': CTATATGGTACCCATGAACTAGACACCTAGAG; . .S4-|5.pgl5': .CTATATGGTACCCTACAAGAAGTTTGAGATCA; . S50i.pgl5': CTATATGGTACCCAGCCGTTGCACCCTCCCAATCAC ; LexD pgl 5'CTATATGGTACCGTCTTGGAGCTCCTAGAGG; S504.pgl 5'CTATATGGTACCCACCAAAGTCCTGACACTTG y S139. pgl 5'TTGGTACCCACTGAACTTTGGCTAAAGC. Todos los productos de PCR también se clonaron dentro del vector pGL3-Básico en la orientación opuesta para servir como controles.

EJEMPLO 16 Ensayos de transfección transitoria Las células HepG2 o WISH en placas de 6 pozos (0.5x106/pozo) se transfectaron utilizando FuGENE 6 y el vector reportero indicado a luciferasa (0.5 g/pozo) y pSV40(3GAL (0.2 µg/pozo, Promega) de conformidad con las instrucciones del fabricante. En ciertos casos la co-transfección se realizó con los siguientes factores de expresión: pcDNA3-IRF-1 (0.07-1.5 g/pozo, amablemente provisto por Dr. B. Levy, Technion, Israel); pcDNA3-C/EBP (0.5-2.5 µg/-pozoI amablemente provisto por Dr. D.Zipori, Weizmann Institute of Science). Después de 16 horas las células se trataron ya sea con IFNy (100 U/ml), IL-6 (150 U/ml), TNFct (10 ng/ml) o a sus combinaciones indicadas en medio libre de suero por 24 horas. Luego las células se recolectaron, lisaron y se midió la actividad de luciferasa. Todos los resultados se normalizaron en contra de actividad a ß-galactosidasa.

EJEMPLO 17 Preparación de extractos nucleares y citoplásmicos Las células se lavaron 3 veces con solución salina con pH regulado con fosfato enfriada con hielo (PBS) e inmediatamente se congelaron en nitrógeno líquido. Los concentrados celulares se re-suspendieron en cuatro volúmenes celulares empaquetados de regulador de pH citoplásmico (10 mM Hepes, pH 7.9, 10 mM NaCI, 0.1 mM EDTA, 5% (en volumen) glicerol, 1.5 mM MgCfe, 1 mM ditiotreitol (DTT), 0.5 mM PMSF, 50 mM NaF, 0.1 mM Na3V04, 2mM EGTA, 10mM EDTA, 10 mM Na2Mo04, 2 µg/ml de cada leupeptina, pepstatina y aprotinina). El lisado se centrifugó (3000 x g, 10 minutos) y se recolectó el sobrenadante que contenía las proteínas citoplásmicas. El concentrado se re-suspendió en 2.5 volúmenes de células empaquetadas de regulador de pH nuclear (idéntico al regulador de pH citoplásmico excepto que el NaCI se incrementó a 0.42 M). Los restos nucleares se resolvieron mediante centrifugación (15,000xg, 20 minutos a 4°C), las alícuotas del sobrenadante se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80°C. Se determinó la concentración de proteína mediante un equipo de reactivo para ensayo de proteína BCA (Pierce, Rockford USA) utilizando albúmina de suero de bovino como un estándar.

EJEMPLO 18 Ensayos de cambio de movilidad electroforética Oligonucleótidos ds que corresponden a elementos de respuesta seleccionados (10 pmol) se marcaron con [32p] 3 ATP mediante poiinucleótido cinasa (New England Biolabs). Los extractos nucleares (5 µg de proteína) se pre-incubaron (15 minutos, 0°C) junto con poli (dl-dC) (Amersham Pharmacia biotechnology) en 20 µ? de regulador de pH IEMSA (20 mM Hepes pH 7.5; 5 mM MgC , 2 mM EDTA, 5 mM DTT y 5% (en volumen) de glicerol). Luego se añadió una sonda marcada (3x104 cpm) y la incubación se continuó por 30 minutos adicionales a temperatura ambiente. Para las muestras de ensayos de súper cambio se incubaron con los anticuerpos indicados (4 µg, 1 hora a 0°C) antes de la adición de la sonda. Un exceso de 200 veces de los competidores de tipo silvestre y de los competidores mutados se añadieron junto con la sonda relevante. Las mezclas de reacción se sometieron entonces a electroforesis en geles de poliacrilamida no desnaturalizantes al 5%. Los geles se secaron al vacío y se sometieron a autorradiografía durante toda la noche a -80°C.

EJEMPLO 19 Análisis de ínmunoprecipitación (ip) e ¡nmunoblot (ib) Los extractos de proteína nuclear o citoplásmica (80 se incubaron con 6 µg de los anticuerpos policlonales indicados durante toda la noche a 4°C y se Ínmunoprecipitación con glóbulos de proteína G Sepharose (Pharmacia) por 1 hora a temperatura ambiente. Luego los glóbulos se sometieron a ebullición en regulador de pH para muestra de SDS-PAGE que contenía 10% DTT y el sobrenadante se resolvió mediante SDS-PAGE (10% acrilamida) bajo condiciones reductoras. Posteriormente el gel se sometió a blot sobre una membrana de nitrocelulosa y las proteínas se detectaron con los anticuerpos indicados. Los complejos inmunes se identificaron mediante el equipo de detección Super SignalT (Pierce).

EJEMPLO 20 Preparación de CHOr-hsLDLR utilizando el promotor de la 1L-18BP Las células CHO recombinantes estables que expresan LDLR soluble de humano se generan mediante la co-transfección de las células CHO-DUKX que carecen del gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) (Urlaub, G. et al. ,-1980) con dos vectores de expresión: uno que contiene el dominio de unión al ligando terminal N del LDLR, que inicia en el residuo de aminoácidos Asp (+ 4) hasta Glu 291 (+291), y pDHFR, que contiene el gen de murino para DHFR, DHFR controlada por el promotor temprano de SV40 y el gen sLDLR por el promotor de la IL-18BP (SEQ ID NO: 2) y elementos para terminación de la transcripción de la región temprana del SV40. La transfeccion se lleva a cabo mediante liposomas catiónicos utilizando LipofectAmine (Gibco BRL), de conformidad con el protocolo descrito por el fabricante. Setenta y dos horas después de la transfeccion las células se transfieren a un medio de selección que carece de deoxi y ribonucleósidos y que está sustentado con 10% de FCS dializado. Las células que expresan actividad del DHFR son capaces de formar colonias, las cuales se aislan mediante levantamiento de las células con discos de papel empapados en tripsina. Las células se crecen y se seleccionan por actividad del r-hsLDLR. Las células transfectadas se someten entonces a amplificación génica mediante MTX, seguido por la subclonación y selección de las clonas productoras estables.

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LISTADO DE SECUENCIAS <110> Yeda Research and Development Co. Ltd Rubinstein, Menachem Novick, Daniela Hurgin, Vladimir <120> Promotor a protelna de unión a Interleucina-18 , su preparación y uso <130> 596PCT <150> 152232 <151> 2002-10-10 <160> 5 <170> Patentln versión 3.1 <210> 1 <211> 1272 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 1 catgaactag acacctagag aagaaggatg tgacttgtag tatcctatgt ctaaattagg so aatatgaatc tggtttttct acaagaagtt tgagatcaca gctgactgtg ttcctgatgc 120 atccaccaaa cccagttcca tctgtgggcc tccctggctc tgtcaccagc cgttgcaccc 180 tcccaatcac aggagtcaca aacctcagac atgcagctcc tgtccacact taatatatgc 240 atgcattgga tcacccagcc ctggtctttc tgcctccatg gataactgca tgaccctgag 300 agaaaacctc cttagattta gcatcctagg ttcctcacac gcctcaccct gaatcctggc 3S0 cctcccgcag ccccagcgcc atttgtccca tcagtgacaa gattcatatt ctgatgtaga 420 ctctgttgcc agagccagtg ttgagccagt ccgcctcttc cccgggaagt gcctgccctt 480 ccctcctgtt agggttggct ctcgagcttg tgtgccagtt cctgggttgg ccgtgagagt 540 tctacagaca aggaggaagt gctctcggtg tatttcctgt ggtgggttca cacgcagcta 600 gacacagcta acttgagtct tggagctcct agagggaagc ttctggaaag gaaggctctt 660 caggacctct taggagccag gtaggagtct gggactacta gtgaacctag acctgtggct 720 ctggccagag gggctaggat gagagacaga gggtgtgatg gtgggtgctg ggagatgtag 780 ccgaccttgg ggctggtggc tgggggagtg ggtagcctgg gaaaggccag gatgtggacg 840 gactggtatg gcattgagcc tgaagtggtc caacttgggg ttccccagtg cctaggaaag 900 ttgtcccctt gaatgtcagt gtgaaggtga aggaggaagc agatgcctgt tcatatggaa 960 acaaagacct ggctgtgaag aggggaggcg gacaccaaag tcctgacact tgggcgggac 1020 agaattgatc tgtgagagac tcatctagtt cataccctag gtgaccctgg gggtggcatg 1080 ggggtagatt agagatccca gtctggtatc ctctggagag taggagtccc aggagctgaa 1140 ggtttctggc cactgaactt tggctaaagc agaggtgtca cagctgctca agattccctg 1200 gttaaaaagt gaaagtgaaa tagagggtcg gggcagtgct ttcccagaag gattgctcgg 1260 catcctgccc tt 1272 210> 2 211> 634 212> ADN <213> Homo sapiens 400> 2 gcttctggaa aggaaggctc ttcaggacct cttaggagcc aggtaggagt ctgggactac 60 tagtgaacct agacctgtgg ctctggccag aggggctagg atgagagaca gagggtgtga 120 tggtgggtgc tgggagatgt agccgacctt ggggctggtg gctgggggag tgggtagcct 180 gggaaaggcc aggatgtgga cggactggta tggcattgag cctgaagtgg tccaacttgg 240 ggttccccag tgcctaggaa agttgtcccc ttgaatgtca gtgtgaaggt gaaggaggaa 300 gcagatgcct gttcatatgg aaacaaagac ctggctgtga agaggggagg cggacaccaa 360 agtcctgaca cttgggcggg acagaattga tctgtgagag actcatctag ttcataccct 420 aggtgaccct gggggtggca tgggggtaga ttagagatcc cagtctggta tcctctggag 480 agtaggagtc ccaggagctg aaggtttctg gccactgaac tttggctaaa gcagaggtgt 540 cacagctgct caagattccc tggttaaaaa gtgaaagtga aatagagggt cggggcagtg 600 ctttcccaga aggattgctc ggcatcctgc cctt 634 <210> 3<211> 122<212> ADN<213> Homo sapiens<400> . 3 cactgaactt tggctaaagc agaggtgtca cagctgctca agattccctg gttaaaaagt - 60 gaaagtgaaa tagagggtcg gggcagtgct ttcccagaag gattgctcgg catcctgccc 120 tt 122 <210> 4 <211> 1061 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 4 tgcagctcct gtccacactt aatatatgca tgcattggat cacccagccc tggtctttct 60 gcctccatgg ataactgcat gaccctgaga gaaaacctcc ttagatttag catcctaggt 120 tcctcacacg cctcaccctg aatcctggcc ctcccgcagc cccagcgcca tttgtcccat 180 cagtgacaag attcatattc tgatgtagac tctgttgcca gagccagtgt tgagccagtc 240 cgcctcttcc ccgggaagtg cctgcccttc cctcctgtta gggttggctc tcgagcttgt 300 gtgccagttc ctgggttggc cgtgagagtt ctacagacaa ggaggaagtg ctctcggtgt 360 atttcctgtg gtgggttcac acgcagctag acacagctaa cttgagtctt ggagctccta 420 gagggaagct tctggaaagg aaggctcttc aggacctctt aggagccagg taggagtctg 480 ggactactag tgaacctaga cctgtggctc tggccagagg ggctaggatg agagacagag 5 0 ggtgtgatgg tgggtgctgg gagatgtagc cgaccttggg gctggtggct gggggagtgg 600 gtagcctggg aaaggccagg atgtggacgg actggtatgg cattgagcct gaagtggtcc 660 aacttggggt tccccagtgc ctaggaaagt tgtccccttg aatgtcagtg tgaaggtgaa 720 ggaggaagca gatgcctgtt catatggaaa caaagacctg gctgtgaaga ggggaggcgg 780 acaccaaagt cctgacactt gggcgggaca gaattgatct gtgagagact catctagttc 840 ataccctagg tgaccctggg ggtggcatgg gggtagatta gagatcccag tctggtatcc 900 tctggagagt aggagtccca ggagctgaag gtttctggcc actgaacttt ggctaaagca 960 gaggtgtcac agctgctcaa gattccctgg ttaaaaagtg aaagtgaaat agagggtcgg 1020 ggcagtgct tcccagaagg attgctcggc atcctgccct t 1061 210> 5 211> 51 212> ADN 213> Homo sapiens 400> 5 ccagaagca gctctggtgc tgaagagagc actgcctccc tgtgtgactg g

Claims (13)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1. - Una secuencia de ADN que codifica el promotor de la IL-18BP de humano (SEQ ID NO: 1), o un fragmento o un derivado funcional del mismo en donde el extremo 3' de dicha secuencia de ADN o fragmento de la misma comprende uno o más nucleótidos a partir del extremo 5' de la SEQ ID NO: 5.

2. - La secuencia de ADN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada además porque el derivado está mutado en uno o más sitios AP1 presentes en un elemento silenciador presente en la secuencia.

3. - La secuencia de ADN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada además porque el fragmento comprende la SEQ ID NO: 2.

4. - La secuencia de ADN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada además porque el fragmento comprende la SEQ ID NO: 3.

5. - La secuencia de ADN de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada además porque comprende adicionalmente un intrón.

6. - La secuencia de ADN de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque el intrón _ consiste del primer intrón de la IL-18BP.

7. - La secuencia de ADN de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque contiene adicionalmente un gen operativamente asociado al promotor de la 1L-18BP. 8.- La secuencia de ADN de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque el gen codifica la IL-18BP. 9.- La secuencia de ADN de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque el gen codifica una proteína heteróloga. 10.- La secuencia de ADN de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque el gen heterologo codifica el gen de luciferasa. 11.- La secuencia de ADN de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque el gen heterologo codifica una proteína seleccionada a partir del interferón-beta, TNF, eritropoietina, activador del plasminógeno tisular, factor estimulante de la colonia de granulocito, manganeso superóxido dismutasa, una inmunoglobulina, o fragmento de los mismos, hormona de crecimiento, FSH, hCG, IL-18, hsLDLR y proteínas de unión al receptor del TNF. 12. - Un vector que comprende una secuencia de ADN como la que se reclama en cualesquiera de las reivindicaciones precedentes. 13. - Una célula hospedera que comprende un vector como el que se reclama en la reivindicación 12. 14-- La_ célula hospedera de conformidad con . la reivindicación 13, caracterizada además porque es una célula de mamífero. 15.- La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada además porque se selecciona a partir de las células CHO, WISH, HepG2, Cos, CV-1, HeLA, y Hakat U937. 16. - Un método para la producción de una proteína recombinante que comprende cultivar una célula hospedera como la que se reclama en cualesquiera de las reivindicaciones 13 a 15 y aislar la proteína recombinante producida. 17. - Un vector de virus recombinante el cual comprende una porción del genoma del virus, un fragmento de ADN que codifica un gen de interés y un fragmento de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica el promotor de la IL-18BP de humano, como la que se reclama en cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 6, operativamente asociado al gen de interés. 1

8. - El vector de virus recombinante de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque el gen de interés se selecciona a partir de interferón-beta, TNF, eritropoietina, activador del plasminógeno tisular, factor estimulante de la colonia de granulocito, manganeso superóxido dismutasa, una inmunoglobulina, o fragmento de los mismos, hormona de crecimiento, FSH, hCG, IL-18, hsLDLR y proteínas de unión al receptor del TNF. 19.- El vector de virus recombinante de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque, la porción. del genoma viral pertenece a un virus adeno asociado. 20.- El vector de virus recombinante de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque la porción del genoma viral pertenece a un retrovirus. 21 - El vector de virus recombinante de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque el retrovirus se selecciona a partir de HIV, HFV, MLV, FIV y VSV. 22. - El uso de una célula de mamífero transducida con un vector como el que se reclama en cualesquiera de las reivindicaciones 17 a 21 , para preparar un medicamento para regular la expresión específica de célula de un gen de interés. 23. - El uso como se reclama en la reivindicación 22, en donde la célula blanco es una célula madre hematopoiética. 24. - El uso como se reclama en la reivindicación 22, en donde la célula blanco es un monocito. 25. - El uso como se reclama en la reivindicación 24, en donde la célula blanco es un macrófago. 26. - El uso como se reclama en cualesquiera de las reivindicaciones 22 a 25, en donde el gen de interés codifica una proteína que confiere resistencia a la infección por VIH. 27. - El uso como se reclama en la reivindicación 26, para el tratamiento de la infección por VIH. 28. - El uso como se reclama en _ cualesquiera de las reivindicaciones 22 a 25, para el tratamiento de trastornos hematopoiéticos. 2

9. - El uso como se reclama en la reivindicación 28, en donde el trastorno hematopoiético se selecciona a partir de SCID, enfermedad granulomatosa crónica y talasemia. 30. - El uso de un vector como el que se reclama en cualesquiera de las reivindicaciones 17 a 21, para preparar un medicamento para el tratamiento de una enfermedad en un individuo que exhibe elevado IFNy en un tejido corporal. 31. - El uso como se reclama en la reivindicación 30, en donde comprende adicionalmente la administración de la IL-6 y/o del TNF-a y o factores IRF y o C/???ß. 32.- Ratones transgénicos que contienen la secuencia de ADN que codifica una secuencia de ADN como la que se reclama en cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 11. 33. - El uso de una secuencia de ADN que codifica el promotor de la IL-18BP de humano (SEQ ID NO: 1), o un fragmento o un derivado funcional del mismo en donde el extremo 3' de dicha secuencia de ADN o fragmento de la misma comprende uno o más nucleótidos a partir del extremo 5' de la SEQ ID NO: 5, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad. 34. - Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de una secuencia de ADN que codifica el promotor de la IL-18BP de humano (SEQID NO: 1), o un fragmento o un derivado funcional del mismo en donde el extremo 3' de dicha secuencia de ADN o fragmento de la misma comprende uno o más nucleótidos a partir del extremo 5' de la SEQ ID NO: 5.