KR101083420B1 - 유방암 진단용 빈쿨린 자가항체 및 이를 이용한 진단키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 자가항체를 이용한 유방암 진단방법에 관한 것으로, 구체적으로, 서열번호 2로 기재되는 빈쿨린(Vinculin) 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 유방암 진단용 빈쿨린 자가항체를 이용하여 유방암을 진단하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 진단 방법은 비교적 채취가 용이한 혈액을 검체로 하기 때문에 생검을 대상으로 하는 기존의 유방암 진단방법과는 달리 환자에게 부담을 주지 않고 매우 간편하게 유방암을 진단할 수 있을 뿐만 아니라 진단의 정확도 및 민감도가 높아 유방암의 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

유방암, 진단용 자가항체, 혈액 시료, 빈쿨린

Description

유방암 진단용 빈쿨린 자가항체 및 이를 이용한 진단키트{Autoantibody against Vinculin for breast cancer diagnosis and diagnosis kit using the same}

본 발명은 자가항체를 이용한 유방암 진단방법에 관한 것이다.

유방암의 원인에 대해 명확하게 밝혀진 것은 없지만, 여성 호르몬, 가족력, 과거력, 출산력, 식생활 습관 등의 다양한 인자들이 거론되고 있다. 2005년 통계청 조사에 의하면, 한국 여성의 유방암 발생은 최근 급격히 증가하여 1998년 자궁경부암을 추월한 이래 2001년 발생한 한국 여성암 환자의 16.1%를 차지하면서 위암을 제치고 여성암 1위가 되었다. 특히, 2002년에는 2001년에 비해 유방암(11.1%)이 가장 급증한 암으로 나타나 저출산, 짧은 수유기간, 이른 초경, 늦은 폐경 등 생리적으로 왕성한 신체적 변화를 겪는 시기의 여성들에서는 여성호르몬의 자극을 받는 횟수의 급격한 증가로 인한 유선조직의 민감도 증가, 식생활의 서구화, 생활환경의 오염 등의 이유로 유방암 발생이 급격하게 증가하고 있다.

이러한 유방암의 발생빈도 및 유방암으로 인한 사망률의 증가는 현재의 서구 화 실태로 보아 앞으로도 상당기간 지속될 것으로 예상된다. 따라서 유방암으로 인한 사망률을 줄이기 위해서는 유방암을 효과적으로 진단하는 것이 매우 중요하다(Tuli et al., Breast J. 12:343-348, 2006). 유방암은 암세포의 성장으로 인한 주변 조직의 침범 또는 림프절 전이 등의 증상을 초래하는 것이 보통이지만, 대부분이 아무런 증상 없이도 자가검진으로 진단될 수 있다.

유방암을 진단하기 위해서 여러 가지 방법이 복합적으로 사용되고 있는데, 현재까지는 유방암 환자의 70%가 자가진단에 의해서 내원하고 있다. 그러나 이러한 자가진단 방법은 악성종양과 양성 혹을 구분하는 것이 매우 어렵다는 단점이 있다. 그 밖에, 유방암의 진단방법으로 X-선 유방촬영법, 초음파검사법, 세침흡입세포검사법, 자기공명촬영법 등이 있다. X-선 유방촬영법은 X-선으로 유방을 찍어 검사하는 방법으로 혹이 양성인지 악성인지를 감별하는데 우수할 뿐만 아니라, 숨어 있는 혹을 발견하는 방법으로서 자가진단으로 혹이 만져지기 이전에 초기의 유방암을 진단하는데 가장 효과적인 방법이다. 그러나, 유방촬영법은 젊은 여성같이 유선이 많이 발달 되어 있다거나 유방이 작고 섬유질이 많은 우리나라 여성에게서는 진단율이 떨어지는 단점이 있으며, 자주 찍으면 오히려 유방암이 유발될 수도 있다는 논란이 있다. 이러한 유방촬영법의 대안으로 초음파검사법이 사용되고 있는데, 초음파검사법은 물혹과 단단한 혹을 구별하는데 효과적이긴 하지만, 악성종양과 양성 혹을 감별하는 능력은 떨어진다. 이에, 최종적으로는 조직검사를 통해 확인하는 것이 중요하다. 그러나 조직검사는 개체로부터 생검에 의해 조직을 채취하는 과정을 거쳐야 하므로, 진단이 용이하지 않다.

이러한 기존 진단방법의 단점을 보완하기 위한 방법으로 비교적 채취가 용이한 환자의 혈액에서 종양 표지자(marker)의 농도를 측정하여 유방암을 진단하려는 시도가 있었다(Clinton et al., Biomed Sci. Instrum. 39:408-414, 2003; Rui et al., Proteomics 3:433-439, 2003; Soletormos et al., Dan Med Bull 48:229-255, 2001). 그러나 이러한 종양 표지자들의 진단적 또는 예후 인자로서의 가치가 연구되고는 있지만, 아직까지 제한적으로 사용되고 있을 뿐으로 공식적으로 권장되고 있는 유방암 표지자는 없는 실정이다.

이에, 본 발명자들은 유방암 환자의 혈액에서 특이적으로 양이 변화는 자가항체를 유방암의 진단에 이용하는 방법을 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 빈쿨린 단백질의 자가항체가 정상인에 비하여 유방암 환자의 혈액에서 특이적으로 그 양이 감소하여 존재한다는 사실을 발견하였고, 이의 항체 및 항원을 이용한 면역화학적 방법으로 유방암을 간편하게 진단할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 서열번호 2로 기재되는 빈쿨린(Vinculin) 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 유방암 진단용 자가항체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 빈쿨린 자가항체에 특이적인 빈쿨린 항원이 고체기질에 고정되어 포함되는 유방암 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 개체로부터 분리된 시료 내의 상기 빈쿨린 자가항체의 측정방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 빈쿨린 자가항체에 특이적으로 결합할 수 있는, 서열번호 2로 기재되는 빈큘린 단백질의 전장 또는 일부가 고형 기질에 집적된 유방암 진단용 바이오칩을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2로 기재되는 빈쿨린(Vinculin) 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 유방암 진단용 빈쿨린 자가항체를 제공한다.

또한, 본 발명은 1) 개체로부터 분리된 시료 내의 상기 빈쿨린 자가항체의 농도를 측정하는 단계;

2) 단계 1)의 상기 자가항체의 농도가 정상인보다 낮은 경우, 유방암에 걸린 개체로 선별하는 단계를 포함하는 유방암 진단을 위한 상기 자가항체의 측정방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 빈쿨린 자가항체에 특이적인 빈쿨린 항원이 고체기질에 고정되어 포함되는 유방암 진단용 키트를 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 빈쿨린 자가항체에 특이적으로 결합할 수 있는, 서열번호 2로 기재되는 빈큘린 단백질의 전장 또는 일부가 고형 기질에 집적된 유방암 진단용 바이오칩을 제공한다.

이하, 본 발명에서 사용한 용어를 설명한다.

용어 "자가항체"는 자기의 체성분과 특이적으로 반응하는 항체를 말하는데, 평소에는 면역체계의 자기조절과정을 통해 해로운 자가항체가 일상적으로 제거되지만 때로 특수한 경우에 이 과정이 실패하여 자신의 구성성분과 반응하는 항체가 증식하거나 감소되어 류머티즘과 같은 각종 질환을 일으키게 된다. 암세포가 발생하여 증식하면, 각종 면역세포들이 관여하게 되는데, 이러한 과정에서 자가항체가 증식 또는 감소할 수 있고, 이와 같은 특성을 이용하여 최근 암과 관련된 자가항체에 관한 연구가 이루어지고 있다. 빈쿨린은 세포의 부착과 이동에 관련되어 세포사이의 상호작용을 해주는 역할을 하는 것으로 빈쿨린이 감소하면 세포와 세포사이가 느슨해져 암세포가 다른 곳으로 잘 전이할 수 있게 하는 것으로 알려져 있으며 (Seimiya M et al., Hepatology 48:519-530, 2008), 따라서 본 발명에서 정상인 보다 유방암 환자에서 특이하게 빈쿨린 자가항체의 양이 감소한 것이 상기 기작에 기 인한 것으로 추정된다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 2로 기재되는 빈쿨린(Vinculin) 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 유방암 진단용 빈쿨린 자가항체를 제공한다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 2차원 전기영동에 의해 분리된 유방암 환자의 종양간질액 내 단백질(도 1 참조)을 항원으로 하고, 정상인 혈장과 유방암 환자의 혈장을 1차 항체로 이용하여 면역블롯팅을 한 결과, 유방암 환자 혈장에서는 검출되지 않았으나(도 2b 참조), 정상인의 혈장에서는 검출된 스팟(도 2a 참조)을 확인하였다. 즉, 유방암 환자의 혈장 내에 상기 스팟에 해당하는 단백질의 자가항체가 감소된 것을 확인하였다. 상기 스팟을 질량분석한 결과, 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 트립틱 펩티드(tryptic peptide)로, 이는 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 빈쿨린 단백질 도메인에 해당하는 것으로 동정되었다(도 3 참조). 이로부터 환자의 혈장에서 특이적으로 감소하는 자가항체의 목표가 되는 항원의 스팟이 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖고 등전점이 5.5, 분자량이 120 kDa인 빈쿨린 단백질인 것을 확인하였다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 정제된 빈쿨린 단백질을 항원으로, 정상인 혈장과 유방암 환자의 혈장을 1차 항체로 이용하여 면역블롯팅을 한 결과, 정상인의 혈장은 500 ng까지 빈쿨린 단백질과 높은 감도로 반응하였으나, 유방암 환자에 서는 그 반응이 확연히 차이가 있었다(도 4 참조). 또한, 17명의 정상인 혈장과 17명의 유방암 환자의 혈장을 이용하여 각각 확인한 결과, 정상인에게서 검출세기가 더 높았다(도 5 참조). 구체적으로, 정상인 17명의 평균 반응세기는 3.8이었고, 유방암 환자 17명의 평균 반응세기는 2.0이었다(도 6a 참조). 즉, 유방암 환자의 빈쿨린 자가항체의 양이 두 배 정도 감소한 것을 확인하였으며, 이는 통계적으로도 유의한 차이를 보였다(P<0.05, t-test). 또한, ROC 곡선(Receiver Operation Characteristic curve)에서는 AUC(area under the curve) = 0.74으로 95% 신뢰구간에서 하한 0.57, 상한 0.91일때 정확도(accuracy) 0.74로 신뢰할 만한 정확도를 나타냈다(도 6b 참조). 또한 표준오차 0.09에 유의 확률이 0.02 로써 p-value<0.05 이므로, 빈쿨린 자가항체를 이용하여 유방암을 진단하는 방법이 통계적으로 유의함을 확인하였다.

이에 본 발명의 서열번호 2로 기재되는 빈쿨린(Vinculin) 단백질에 특이적으로 결합하는 빈쿨린 자가항체는 유방암 진단에 유용하게 이용될 수 있다.

상기 빈쿨린 자가항체는 정상인의 혈액에 존재하고, 유방암 환자의 혈액에서 상기 자가항체의 양이 감소하는 것으로 확인되었고, 이의 항원으로 기능하는 빈쿨린 단백질을 구입하여 정상인과 유방암 환자의 혈액 시료를 대상으로 면역블롯팅을 수행한 결과, 유의한 결과를 얻어 상기 빈쿨린 자가항체가 유방암의 진단 마커로 사용할 수 있음을 확인하였다.

또한, 본 발명은 1) 개체로부터 분리된 시료 내의 상기 빈쿨린 자가항체의 농도를 측정하는 단계;

2) 단계 1)의 상기 자가항체의 농도가 정상인보다 낮은 경우, 유방암에 걸린 개체로 선별하는 단계를 포함하는 유방암 진단을 위한 상기 자가항체의 측정방법을 제공한다.

본 발명의 구체적인 실시예에서 유방암 환자의 혈장 내에서 자가항체가 감소된 것으로 확인된 단백질 스팟을 선정하였다(도 2 참조). 상기 스팟을 질량분석한 결과, 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 트립틱 펩티드(tryptic peptide)로, 이는 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖는, 등전점이 5.5, 분자량이 120 kDa인 빈쿨린 단백질 도메인에 해당하는 것으로 동정되었다(도 3 참조). 본 발명의 구체적인 실시예에서는 정상인의 혈장은 적은 농도의 빈쿨린 재조합 단백질과 높은 감도로 반응하였으나, 유방암 환자에서는 그 반응이 확연히 줄어든 것을 확인하였다(도 4 참조). 또한, 17명의 정상인 혈장과 17명의 유방암 환자의 혈장을 이용하여 각각 확인한 결과, 정상인에게서 검출세기가 더 높았다(도 5 참조). 즉, 유방암 환자의 빈쿨린 자가항체의 양이 두 배 정도 감소한 것을 확인하였으며, 이는 통계적으로도 유의한 차이를 보였다(도 6a 참조; P<0.05, t-test). 또한, ROC 곡선에서는 AUC(area under the curve) = 0.74으로 95% 신뢰구간에서 하한 0.57, 상한 0.91일때 정확도(accuracy) 0.74로 신뢰할 만한 정확도를 나타냈다(도 6b 참조). 또한 표준오차 0.09에 유의 확률이 0.02 로써 p-value<0.05 이므로, 빈쿨린 자가항체를 이용하여 유방암을 진단하는 방법이 통계적으로 유의함을 확인하였다.

이에 본 발명의 빈쿨린 자가항체의 측정방법은 유방암 진단에 유용하게 이용될 수 있다.

상기 빈쿨린 자가항체는 정상인의 혈액에 존재하고, 유방암 환자의 혈액에서 상기 자가항체의 양이 감소하는 것으로 확인되었고, 이의 항원으로 기능하는 빈쿨린 단백질을 구입하여 정상인과 유방암 환자의 혈액 시료를 대상으로 면역블롯팅을 수행한 결과, 유의한 결과를 얻어 상기 빈쿨린 자가항체가 유방암의 진단 마커로 사용할 수 있음을 확인하였다.

상기 시료는 혈청, 혈장 또는 혈액을 사용할 수 있고, 상기 시료는 실험을 용이하게 수행하고, 마커의 탐지감도를 증가시키도록 준비될 수 있는데 예를 들어 개체로부터 추출한 혈액 시료는 원심분리, 알부민 제거키트를 이용한 알부민 제거, 음이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 크기별 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography), 액체 크로마토그래피, 연속추출(sequential extraction) 또는 젤 전기영동 등의 방법을 이용하여 전처리될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

단계 1)의 측정은 빈쿨린 단백질을 항원으로 이용하여 상기 상기 빈쿨린 자가항체와의 항원항체 반응을 측정하는 방법 또는 상기 항원 및 자가항체 복합체에 검출체를 처리한 후 검출체의 양을 측정함으로써 유방암을 진단할 수 있다. 상기 측정 방법으로는 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 비색법(colorimetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment) 및 섬광계수법(scintillation counting method)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법 등이 있을 수 있다.

또한, 본 발명은 빈쿨린 자가항체에 특이적인 빈쿨린 항원이 고체기질에 고정되어 포함되는 유방암 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 구체적인 실시예에서 유방암 환자의 혈장 내에서 자가항체가 감소된 것으로 확인된 단백질 스팟을 선정하였다(도 2 참조). 상기 스팟을 질량분석한 결과, 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 트립틱 펩티드(tryptic peptide)로, 이는 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖는, 등전점이 5.5, 분자량이 120 kDa인 빈쿨린 단백질 도메인에 해당하는 것으로 동정되었다(도 3 참조). 본 발명의 구체적인 실시예에서는 정상인의 혈장은 적은 농도의 빈쿨린 재조합 단백질과 높은 감도로 반응하였으나, 유방암 환자에서는 그 반응이 확연히 줄어든 것을 확인하였다(도 4 참조). 또한, 17명의 정상인 혈장과 17명의 유방암 환자의 혈장을 이용하여 각각 확인한 결과, 정상인에게서 검출세기가 더 높았다(도 5 참조). 즉, 유방암 환자의 빈쿨린 자가항체의 양이 두 배 정도 감소한 것을 확인하였으며, 이는 통계적으로도 유의한 차이를 보였다(도 6a 참조; P<0.05, t-test). 또한, ROC 곡선에서는 AUC(area under the curve) = 0.74으로 95% 신뢰구간에서 하한 0.57, 상한 0.91일때 정확도(accuracy) 0.74로 신뢰할 만한 정확도를 나타냈다(도 6b 참조). 또한 표준오차 0.09에 유의 확률이 0.02 로써 p-value<0.05 이므로, 빈쿨린 자가항체를 이용하여 유방암을 진단하는 방법이 통계적으로 유의함을 확인하였다.

이에 본 발명의 빈쿨린 자가항체에 특이적인 빈쿨린 항원은 유방암 진단용 키트에 유용하게 이용될 수 있다.

상기 빈쿨린 자가항체는 정상인의 혈액에 존재하고, 유방암 환자의 혈액에서 상기 자가항체의 양이 감소하는 것으로 확인되었고, 이의 항원으로 기능하는 빈쿨린 단백질을 구입하여 정상인과 유방암 환자의 혈액 시료를 대상으로 면역블롯팅을 수행한 결과, 유의한 결과를 얻어 상기 빈쿨린 자가항체가 유방암의 진단 마커로 사용할 수 있음을 확인하였다.

상기 키트는 시료 내 빈쿨린 자가항체의 양이 정상인에 비해 줄어드는지 여부를 구별하여 의사 등 진료 행위자가 유방암을 진단하는 것을 가능하게 할 뿐 아니라, 치료에 대한 환자의 반응을 모니터하여 그 결과에 따라 치료를 변경하는 것을 가능하게 한다. 또한, 유방암 모델(예: 마우스, 랫트 등의 동물모델)의 생체 내 또는 생체 외에서 하나 이상의 마커의 발현을 조절하는 화합물을 동정하는데 사용될 수 있다. 이에, 본 발명의 마커는 표준 물질로 상기 키트에 추가로 포함될 수 있다.

빈쿨린 자가항체에 특이적으로 결합하는 항원은, 서열번호 2로 기재된 빈쿨린 단백질의 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 이용하여 합성하거나, 빈쿨린 단백질을 발현하는 세포로부터 분리 및 정제하여 추출하거나, 유전자 재조합 기술을 이용하여 숙주생물로부터 생산하거나, 구입하여 사용(제품번호: H00007414-P01, Abnova, USA)할 수 있다.

상기 빈쿨린 항원은 세척이나 복합체의 분리 등 그 이후의 단계를 용이하게 하기 위해 고형 기질(solid substrate)에 결합될 수 있다. 고형 기질은 예를 들어 합성수지로 제작된 웰플레이트, 니트로셀룰로오스, 유리기판, 금속기판, 유리섬유, 미세구체 및 미세비드 등이 있다. 또한, 상기 합성수지에는 폴리에스터, 폴리비닐, 폴리염화비닐, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, PVDF 및 나일론 등이 있다.

또한, 개체로부터 수득된 시료를 고형 기질에 결합된 빈쿨린 항원과 접촉시키는 경우, 시료는 항원과 접촉 전에 알맞은 정도로 희석될 수 있다.

본 발명의 키트는 추가로 상기 빈쿨린 자가항체에 특이적으로 결합하는 검출체를 포함할 수 있다. 상기 검출체는 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 또는 콜로이드 등으로 표지한 접합체(conjugate)일 수 있고, 바람직하게는 상기 빈쿨린 자가항체에 특이적으로 결합할 수 있는 2차 항체일 것이다. 예를 들어, 상기 발색효소는 퍼록시다제(peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase) 또는 산성 포스파타제(acid phosphatase)[예: 양고추냉이 퍼록시다제(horseradish peroxidase)]일 수 있고; 형광물질인 경우, 콜로이드 골드(Coloid gold), 플루오레신카복실산(FCA), 플루오레신 이소티오시아네이트(FITC), RITC(Rhodamine-B-isothiocyanate), 플루오레신 티오우레아(FTH), 7-아세톡시쿠마린-3-일, 플루오레신-5-일, 플루오레신-6-일, 2',7'-디클로로플루오레신-5-일, 2',7'-디클로로플루오레신-6-일, 디하이드로테트라메틸로사민-4-일, 테트라메틸로다민-5-일, 테트라메틸로다민-6-일, 4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸 또는 4,4-디플루오로-5,7-디페닐-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸 등을 사용하 는 것이 가능하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 진단 키트는 상기 항원 및 자가항체의 항원항체 반응을 측정하는 방법 또는 상기 항원 및 자가항체 복합체에 검출체를 처리한 후 검출체의 양을 측정함으로써 유방암을 진단할 수 있다. 상기 항원항체 반응으로서 효소면역측정법 (ELISA), 면역침강법, 형광면역법, 효소기질발색법, 항원항체응집법 등을 들 수 있고, 검출체의 양 측정이나 존재 검출은 발색, 형광, 발광, 화학발광(chemiluminescence), 흡광도, 반사 또는 투과를 통해 이루어질 수 있다.

상기 검출체의 양을 탐색하는 방법으로는 초고속 스크리닝(high throughput screening, HTS) 시스템을 이용하는 것이 바람직하고, 여기에는 검출체에 결합된 발색효소의 발색을 유도하는 기질을 처리하여 발색반응을 측정하는 방법; 검출체로 형광물질이 부착되어 형광을 검출함으로써 수행되는 형광법 또는 검출체로 방사선 동위원소가 부착되어 방사선을 검출함으로써 수행되는 방사선법; 검출체의 표지 없이 표면의 플라즈몬 공명 변화를 실시간으로 측정하는 SPR(surface plasmon resonance) 방법 또는 SPR 시스템을 영상화하여 확인하는 SPRI(surface plasmon resonance imaging) 방법을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

예를 들어 발색을 유도하는 기질은 발색효소에 따라 선택하여 사용하는 것이 바람직하며, TMB (3,3',5,5'-tetramethyl bezidine), ABTS [2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)], OPD (o-phenylenediamine) 등을 사용할 수 있다. 이때, 발색제 기질은 완충용액(0.1 M NaAc, pH 5.5)에 용해된 상태로 제공되는 것이 더욱 바람직하다. TMB와 같은 발색기질은 검출체에 결합된 발색효소 에 의해 분해되어 발색 침적체를 생성하고 그 발색 침적체의 침적 정도를 육안으로 확인함으로써 빈쿨린 단백질의 자가항체 존재 유무를 검출한다. 또한, 상기 형광법은 형광 스캐너 프로그램을 이용하여 상기 형광물질로 라벨링된 검출체를 스포팅하여 신호를 확인하는 방법으로, 이 방법을 적용하여 결합 정도를 확인할 수 있다. 상기 SPR 시스템은 형광법과는 달리 시료를 형광물질로 표지할 필요가 없이 항체의 결합 정도를 실시간으로 분석하는 것이 가능하나 동시다발적인 시료 분석이 불가능하다는 단점이 있다. SPRI의 경우에는 미세정렬 방법을 이용하여 동시다발적인 시료 분석이 가능하지만 탐지 강도가 낮은 단점이 있다.

또한, 본 발명의 키트는 상기 항원항체 결합 반응 및 검출체의 결합반응 후, 남은 물질들을 제거하기 위한 세척액을 추가로 포함할 수 있다. 상기 세척액은 인산염 완충용액, NaCl 및 트윈 20(Tween 20)을 포함하는 것이 바람직하며, 0.02 M 인산염 완충용액, 0.13 M NaCl, 및 0.05% 트윈 20(Tween 20)으로 구성된 완충용액(PBST)이 더욱 바람직하나, 이에 제한되지 않는다. 세척액은 항원항체 결합반응 후 항원항체 결합체에 검출체를 반응시킨 다음 적당량을 고정체에 가하여 3 내지 6회 세척한다. 반응 정지용액은 바람직하게는 황산 용액(H₂SO₄)이 사용될 수 있으나, 이이 제한되지는 않는다.

본 발명에서 유방암 진단 마커로 선별된 빈쿨린 단백질의 자가항체는 지금까지 유방암의 발병 및 진행을 진단할 수 있는 표지로서 사용될 수 있음이 알려지지 않았다. 따라서 빈쿨린 단백질의 자가항체를 유방암의 진단 마커로 이용하는 것은 본 발명이 최초이다. 또한, 상기 자가항체는 혈액에서 검출이 가능하기 때문에 생검(biopsy)을 통해서만 진단이 가능하던 기존의 방법과는 달리 환자에게 불편을 초래하지 않으면서 간편한 방법으로 유방암을 진단하는데 활용될 수 있다.

아울러, 본 발명은 상기 빈쿨린 자가항체에 특이적으로 결합할 수 있는, 서열번호 2로 기재되는 빈큘린 단백질의 전장 또는 일부가 고형 기질에 집적된 유방암 진단용 바이오칩을 제공한다.

본 발명의 구체적인 실시예에서 유방암 환자의 혈장 내에서 자가항체가 감소된 것으로 확인된 단백질 스팟을 선정하였다(도 2 참조). 상기 스팟을 질량분석한 결과, 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 트립틱 펩티드(tryptic peptide)로, 이는 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖는, 등전점이 5.5, 분자량이 120 kDa인 빈쿨린 단백질 도메인에 해당하는 것으로 동정되었다(도 3 참조). 본 발명의 구체적인 실시예에서는 정상인의 혈장은 적은 농도의 빈쿨린 재조합 단백질과 높은 감도로 반응하였으나, 유방암 환자에서는 그 반응이 확연히 줄어든 것을 확인하였다(도 4 참조). 또한, 17명의 정상인 혈장과 17명의 유방암 환자의 혈장을 이용하여 각각 확인한 결과, 정상인에게서 검출세기가 더 높았다(도 5 참조). 즉, 유방암 환자의 빈쿨린 자가항체의 양이 두 배 정도 감소한 것을 확인하였으며, 이는 통계적으로도 유의한 차이를 보였다(도 6a 참조; P<0.05, t-test). 또한, ROC 곡선에서는 AUC(area under the curve) = 0.74으로 95% 신뢰구간에서 하한 0.57, 상한 0.91일때 정확도(accuracy) 0.74로 신뢰할 만한 정확도를 나타냈다 (도 6b 참조). 또한 표준오차 0.09에 유의 확률이 0.02 로써 p-value<0.05 이므로, 빈쿨린 자가항체를 이용하여 유방암을 진단하는 방법이 통계적으로 유의함을 확인하였다.

이에 본 발명의 빈쿨린 항원이 집적된 바이오칩은 유방암 진단에 유용하게 이용될 수 있다.

상기 바이오칩은 바람직하게는 단백질칩 또는 핵산 어레이 등이 있다.

빈쿨린 자가항체에 특이적으로 결합하는 빈큘린 단백질의 전장 또는 일부는, 서열번호 2로 기재된 빈쿨린 단백질의 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 이용하여 합성하거나, 빈쿨린 단백질을 발현하는 세포로부터 분리 및 정제하여 추출하거나, 유전자 재조합 기술을 이용하여 숙주생물로부터 생산하거나, 구입하여 사용(제품번호: H00007414-P01, Abnova, USA)할 수 있다.

또한, 본 발명의 바이오칩의 고형 기질은 플라스틱, 유리, 금속 및 실리콘으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 그 표면에 상기 항체를 부착시키기 위해 화학 처리되거나 링커 분자가 결합하여 있을 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 바이오칩은 시료에서 전체 단백질을 채취하여 바이오칩과 반응시켜 손쉽고 정확하게 유방암 진단을 수행할 수 있다.

상기 바이오칩의 기판에 코팅된 활성기는 상기 물질을 결합하는 역할을 하며, 아민기(amine group), 알데하이드기(aldehyde group), 카르복실기(carboxyl group) 및 티올기(thiol group)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 당업자에게 단백질 분자를 기판에 결합할 수 있는 활성기로 알려진 모든 활성기가 사용 가능하며, 이제 한정되는 것은 아니다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 진단 방법은 비교적 채취가 용이한 혈액을 검체로 하기 때문에 생검을 대상으로 하는 기존의 유방암 진단방법과는 달리 환자에게 부담을 주지 않고 매우 간편하게 유방암을 진단할 수 있을 뿐만 아니라 진단의 정확도 및 민감도가 높아 유방암의 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.

이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

<실시예 1> 연구대상

연구대상은 정상인 및 유방암 환자로 하였다. 실시예 2에서는 서울대학교 병원으로부터 제공받은 정상인(17명) 및 유방암 환자(17명)로부터 수득한 혈장을 종류별로 일정량씩 각각 풀링(pooling) 하여 사용하였고, 실시예 3에서는 위와 동일한 샘플로 환자와 정상인 혈장을 개별적으로 실험에 이용하였다.

상기 연구대상들로부터 혈액을 채취한 후, 원심분리를 거쳐 혈장만을 수득하여 영하 70℃에서 폴리프로필렌 용기에 보관되었다. 혈장 채취는 서면으로 된 사 전동의 후에 이루어졌다. 본 기관의 의학연구윤리심의위원회(Institutional Review Board)는 연구 목적으로 이러한 환자에게서 생화학적 물질과 정보를 수집하는 것을 승인하였다.

<실시예 2> 유방암 환자의 종양간질액 내의 단백질을 항원으로 이용한 혈액 내 자가항체 검출

<2-1> 면역 블롯팅 수행

유방암 환자로부터 생검을 통해 얻어낸 조직을 PBS(인산완충용액)에 씻은 후, 새로운 PBS에 37℃에서 1시간 정도 배양하여 종양간질액을 얻어내어 냉동보관 하였다. 보관된 종양간질액을 원심분리하여 상층을 취하여 실험에 용이하게 하기위해 알부민 제거 키트(Vivapure Anti-HSA/IgG kit, Sartorious group, Germany)를 사용하여 알부민을 제거하였다. 알부민을 제거한 종양간질액로부터 아세톤(acentone) 침강법으로 단백질을 추출한 뒤, 브래드포드(Bradford) 방법으로 단백질의 농도를 측정하였다. 100 ㎍의 단백질을 pH 5.3-6.5의 범위를 가진 IPG 스트립(strip; GE Healthcare, Sweden)에 12 시간 동안 재수화(Rehydration)하였고, 100V에서 1시간, 500V에서 1시간, 1000V에서 1시간, 3000V에서 1시간, 6000V에서 3시간 동안 등전점에 따라 분리하였다. 단백질이 분리된 IPG 스트립을 50 mM 트리스(Tris-HCl, pH 8.8), 9 M 우레아, 30% 글리세롤, 2% SDS, 0.1% DTT가 포함된 용액에서 30분간 반응시킨 후, 12% 농도 구배를 가지는 젤 상에서 다시 분리하였다. 상기 젤은 2세트로 수행하였으며, 한세트는 쿠마시 염색법(Coomassie staining)으 로 염색하였고(도 1), 나머지 한세트의 분리된 단백질을 50 mM 트리스, 130 mM 글리신, 0.05% SDS, 12.5% 메탄올이 포함된 용액 내에서 PVDF 막으로 전이(transfer)시켰다. 전이된 막에 5% 탈지분유가 용해된 TBST(Tris buffered saline tween 20)를 가하여 비특이적인 결합을 차단하였고, 정상인 혈장과 유방암 환자 혈장을 각각 TBST에 1:200으로 희석하여 3시간 동안 PVDF 막과 반응시켰다. 이어 1:5000으로 희석한 이차 항체 항-인간 IgG-HRP(GE Healthcare, Sweden)와 1시간 동안 반응시켰고 다시 ECL(Enhanced chemiluminance; GE Healthcare, Sweden)을 가하여 암실에서 X-ray 필름에 감광시켰다.

그 결과, 정상인 혈장과 유방암 환자의 혈장에서 X-ray 필름에 차이가 나는 스팟을 선별하여 쿠마시 염색법(Coomassie staining)으로 염색한 젤(도 1a)과 대조한 뒤, 대응되는 스팟들 중 발현량이 정상과 유방암 환자 사이에서 유의하게 다른 스팟들을 선별하였다(도 2). 유방암 환자 혈장과 반응시킨 막에서는 스팟이 검출되지 않았으나(도 2b), 정상인의 혈장과 반응시킨 막에서는 검출되었으므로(도 2a), 유방암 환자의 혈장 내에 상기 스팟에 해당하는 단백질의 자가항체가 감소된 것을 확인하였다.

<2-2> 탠덤질량분석 수행

상기 스팟(도 1b)을 쿠마시 염색법으로 염색한 젤로부터 분리한 후, 트립신(Promega Madison, USA)으로 처리(100 ng)하여 다수의 펩티드 절편으로 분리하였고, 각 절편의 질량을 탠덤질량분석기(기기: Linear Iontrap quadrupole mass spectrometery, Thermo finnigan, USA)로 측정하였다. 측정 결과로부터 컴퓨터 분 석 프로그램을 사용하여 데이터베이스를 검색하였다. 상기 과정에서 서열번호 1(GWLRDPSASPGDAGEQAIR)로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 트립틱 펩티드(tryptic peptide)가, 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 빈쿨린 단백질 도메인에 해당하는 것으로 동정되었다(도 3). 이로부터 환자의 혈장에서 특이적으로 감소하는 자가항체의 목표가 되는 항원의 스팟이 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖고 등전점이 5.5, 분자량이 120 kDa인 빈쿨린 단백질인 것을 확인하였다.

<실시예 3> 빈쿨린 자가항체를 이용한 면역블롯팅

<3-1> 혈액내 자가항체 양의 비교

500 ng부터 2 ㎍까지 희석한 빈쿨린 단백질(제품번호: H00007414-P01, Abnova, USA)을 12% 폴리아크릴아마이드 젤에서 전기영동한 후, PVDF 막으로 전이시켰다. 정상인 및 유방암 환자 혈장을 빈쿨린 단백질이 전이된 고정체 막에 가하여 반응시켰고, 다시 항-인간 IgG-HRP와 ECL을 이용하여 빈쿨린 단백질에 대한 자가항체를 검출하였다.

그 결과, 도 4에서 나타난 바와 같이 정상인의 혈장은 500 ng까지 빈쿨린 단백질과 높은 감도로 반응하였으나, 유방암 환자에서는 그 반응이 확연히 차이가 있었다.

<3-2> 자가항체 발현양상의 확인

17명의 정상인 혈장과 17명의 유방암 환자 혈장을 빈쿨린 단백질의 자가항체를 분석하기 위하여, 1 ㎍의 정제된 빈쿨린 단백질을 전기영동한 후, PVDF 막에 전 이시켰고, 각각 정상인 혈장과 유방암 환자의 혈장에 반응시켰고 항-인간 IgG-HRP와 ECL을 이용하여 검출하였다.

그 결과, 도 5에서 나타난 바와 같이 정상인에게서 검출세기가 더 높았다. 구체적으로 도 6a에서 나타난 바와 같이 정상인 17명의 평균 반응세기는 3.8이었고, 유방암 환자 17명의 평균 반응세기는 2.0이었다. 즉, 유방암 환자의 빈쿨린 자가항체의 양이 두 배 정도 감소한 것을 확인하였으며, 이는 통계적으로도 유의한 차이를 보였다(P<0.05, t-test).

또한, 도 6b에서 나타난 바와 같이 ROC 곡선(Receiver Operation Characteristic curve)에서는 AUC(area under the curve) = 0.74으로 95% 신뢰구간에서 하한 0.57, 상한 0.91일때 정확도(accuracy) 0.74로 신뢰할 만한 정확도를 나타냈다. 또한 표준오차 0.09에 유의 확률이 0.02 로써 p-value<0.05 이므로, 빈쿨린 자가항체를 이용하여 유방암을 진단하는 방법이 통계적으로 유의함을 확인하였다.

도 1은 이차원전기영동으로 유방암 환자의 종양간질액에서 단백질을 분리하여 쿠마시 염색법(Coomassie staining)으로 염색한 결과이다:

a: 전체 단백질; 및,

b: 빈쿨린 단백질 스팟.

도 2는 PVDF 막으로 전이시킨 유방암 환자의 종양간질액 단백질 항원에 대한 면역블롯팅 결과를 나타낸 도이다:

a: 정상인 혈장을 1차 항체로 이용; 및,

b: 유방암 환자 혈장을 1차 항체로 이용.

도 3은 정상인 및 유방암 환자의 혈장을 이용한 면역블롯팅 결과 선발된 스팟의 텐덤질량분석(tandem mass spectrometry) 스펙트럼 결과를 나타낸 도이다.

도 4는 정제된 빈쿨린 단백질의 농도에 따른 정상인 및 유방암 환자의 혈장을 이용한 면역블롯팅 결과를 나타낸 도이다.

도 5는 PVDF 막으로 전이시킨 정제된 빈쿨린 단백질 항원에 대한 면역블롯팅 결과를 나타낸 도이다:

a: 정상인 17명의 혈장을 1차 항체로 이용; 및,

b: 유방암 환자 17명의 혈장을 1차 항체로 이용.

도 6은 도 5의 결과를 통계 처리한 결과를 나타낸 도이다:

a: 상자수염도(Box-and-Whisker plot); 및,

b: ROC 곡선.

<110> Korea Instititue of Science and Technology <120> Autoantibody against Vinculin for diagnosis of breast cancer and diagnosis kit using the same <130> 8P-11-64 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tryptic peptide <400> 1 Gly Trp Leu Arg Asp Pro Ser Ala Ser Pro Gly Asp Ala Gly Glu Gln 1 5 10 15 Ala Ile Arg <210> 2 <211> 1134 <212> PRT <213> Homo sapiens Vinculin <400> 2 Met Pro Val Phe His Thr Arg Thr Ile Glu Ser Ile Leu Glu Pro Val 1 5 10 15 Ala Gln Gln Ile Ser His Leu Val Ile Met His Glu Glu Gly Glu Val 20 25 30 Asp Gly Lys Ala Ile Pro Asp Leu Thr Ala Pro Val Ala Ala Val Gln 35 40 45 Ala Ala Val Ser Asn Leu Val Arg Val Gly Lys Glu Thr Val Gln Thr 50 55 60 Thr Glu Asp Gln Ile Leu Lys Arg Asp Met Pro Pro Ala Phe Ile Lys 65 70 75 80 Val Glu Asn Ala Cys Thr Lys Leu Val Gln Ala Ala Gln Met Leu Gln 85 90 95 Ser Asp Pro Tyr Ser Val Pro Ala Arg Asp Tyr Leu Ile Asp Gly Ser 100 105 110 Arg Gly Ile Leu Ser Gly Thr Ser Asp Leu Leu Leu Thr Phe Asp Glu 115 120 125 Ala Glu Val Arg Lys Ile Ile Arg Val Cys Lys Gly Ile Leu Glu Tyr 130 135 140 Leu Thr Val Ala Glu Val Val Glu Thr Met Glu Asp Leu Val Thr Tyr 145 150 155 160 Thr Lys Asn Leu Gly Pro Gly Met Thr Lys Met Ala Lys Met Ile Asp 165 170 175 Glu Arg Gln Gln Glu Leu Thr His Gln Glu His Arg Val Met Leu Val 180 185 190 Asn Ser Met Asn Thr Val Lys Glu Leu Leu Pro Val Leu Ile Ser Ala 195 200 205 Met Lys Ile Phe Val Thr Thr Lys Asn Ser Lys Asn Gln Gly Ile Glu 210 215 220 Glu Ala Leu Lys Asn Arg Asn Phe Thr Val Glu Lys Met Ser Ala Glu 225 230 235 240 Ile Asn Glu Ile Ile Arg Val Leu Gln Leu Thr Ser Trp Asp Glu Asp 245 250 255 Ala Trp Ala Ser Lys Asp Thr Glu Ala Met Lys Arg Ala Leu Ala Ser 260 265 270 Ile Asp Ser Lys Leu Asn Gln Ala Lys Gly Trp Leu Arg Asp Pro Ser 275 280 285 Ala Ser Pro Gly Asp Ala Gly Glu Gln Ala Ile Arg Gln Ile Leu Asp 290 295 300 Glu Ala Gly Lys Val Gly Glu Leu Cys Ala Gly Lys Glu Arg Arg Glu 305 310 315 320 Ile Leu Gly Thr Cys Lys Met Leu Gly Gln Met Thr Asp Gln Val Ala 325 330 335 Asp Leu Arg Ala Arg Gly Gln Gly Ser Ser Pro Val Ala Met Gln Lys 340 345 350 Ala Gln Gln Val Ser Gln Gly Leu Asp Val Leu Thr Ala Lys Val Glu 355 360 365 Asn Ala Ala Arg Lys Leu Glu Ala Met Thr Asn Ser Lys Gln Ser Ile 370 375 380 Ala Lys Lys Ile Asp Ala Ala Gln Asn Trp Leu Ala Asp Pro Asn Gly 385 390 395 400 Gly Pro Glu Gly Glu Glu Gln Ile Arg Gly Ala Leu Ala Glu Ala Arg 405 410 415 Lys Ile Ala Glu Leu Cys Asp Asp Pro Lys Glu Arg Asp Asp Ile Leu 420 425 430 Arg Ser Leu Gly Glu Ile Ser Ala Leu Thr Ser Lys Leu Ala Asp Leu 435 440 445 Arg Arg Gln Gly Lys Gly Asp Ser Pro Glu Ala Arg Ala Leu Ala Lys 450 455 460 Gln Val Ala Thr Ala Leu Gln Asn Leu Gln Thr Lys Thr Asn Arg Ala 465 470 475 480 Val Ala Asn Ser Arg Pro Ala Lys Ala Ala Val His Leu Glu Gly Lys 485 490 495 Ile Glu Gln Ala Gln Arg Trp Ile Asp Asn Pro Thr Val Asp Asp Arg 500 505 510 Gly Val Gly Gln Ala Ala Ile Arg Gly Leu Val Ala Glu Gly His Arg 515 520 525 Leu Ala Asn Val Met Met Gly Pro Tyr Arg Gln Asp Leu Leu Ala Lys 530 535 540 Cys Asp Arg Val Asp Gln Leu Thr Ala Gln Leu Ala Asp Leu Ala Ala 545 550 555 560 Arg Gly Glu Gly Glu Ser Pro Gln Ala Arg Ala Leu Ala Ser Gln Leu 565 570 575 Gln Asp Ser Leu Lys Asp Leu Lys Ala Arg Met Gln Glu Ala Met Thr 580 585 590 Gln Glu Val Ser Asp Val Phe Ser Asp Thr Thr Thr Pro Ile Lys Leu 595 600 605 Leu Ala Val Ala Ala Thr Ala Pro Pro Asp Ala Pro Asn Arg Glu Glu 610 615 620 Val Phe Asp Glu Arg Ala Ala Asn Phe Glu Asn His Ser Gly Lys Leu 625 630 635 640 Gly Ala Thr Ala Glu Lys Ala Ala Ala Val Gly Thr Ala Asn Lys Ser 645 650 655 Thr Val Glu Gly Ile Gln Ala Ser Val Lys Thr Ala Arg Glu Leu Thr 660 665 670 Pro Gln Val Val Ser Ala Ala Arg Ile Leu Leu Arg Asn Pro Gly Asn 675 680 685 Gln Ala Ala Tyr Glu His Phe Glu Thr Met Lys Asn Gln Trp Ile Asp 690 695 700 Asn Val Glu Lys Met Thr Gly Leu Val Asp Glu Ala Ile Asp Thr Lys 705 710 715 720 Ser Leu Leu Asp Ala Ser Glu Glu Ala Ile Lys Lys Asp Leu Asp Lys 725 730 735 Cys Lys Val Ala Met Ala Asn Ile Gln Pro Gln Met Leu Val Ala Gly 740 745 750 Ala Thr Ser Ile Ala Arg Arg Ala Asn Arg Ile Leu Leu Val Ala Lys 755 760 765 Arg Glu Val Glu Asn Ser Glu Asp Pro Lys Phe Arg Glu Ala Val Lys 770 775 780 Ala Ala Ser Asp Glu Leu Ser Lys Thr Ile Ser Pro Met Val Met Asp 785 790 795 800 Ala Lys Ala Val Ala Gly Asn Ile Ser Asp Pro Gly Leu Gln Lys Ser 805 810 815 Phe Leu Asp Ser Gly Tyr Arg Ile Leu Gly Ala Val Ala Lys Val Arg 820 825 830 Glu Ala Phe Gln Pro Gln Glu Pro Asp Phe Pro Pro Pro Pro Pro Asp 835 840 845 Leu Glu Gln Leu Arg Leu Thr Asp Glu Leu Ala Pro Pro Lys Pro Pro 850 855 860 Leu Pro Glu Gly Glu Val Pro Pro Pro Arg Pro Pro Pro Pro Glu Glu 865 870 875 880 Lys Asp Glu Glu Phe Pro Glu Gln Lys Ala Gly Glu Val Ile Asn Gln 885 890 895 Pro Met Met Met Ala Ala Arg Gln Leu His Asp Glu Ala Arg Lys Trp 900 905 910 Ser Ser Lys Pro Gly Ile Pro Ala Ala Glu Val Gly Ile Gly Val Val 915 920 925 Ala Glu Ala Asp Ala Ala Asp Ala Ala Gly Phe Pro Val Pro Pro Asp 930 935 940 Met Glu Asp Asp Tyr Glu Pro Glu Leu Leu Leu Met Pro Ser Asn Gln 945 950 955 960 Pro Val Asn Gln Pro Ile Leu Ala Ala Ala Gln Ser Leu His Arg Glu 965 970 975 Ala Thr Lys Trp Ser Ser Lys Gly Asn Asp Ile Ile Ala Ala Ala Lys 980 985 990 Arg Met Ala Leu Leu Met Ala Glu Met Ser Arg Leu Val Arg Gly Gly 995 1000 1005 Ser Gly Thr Lys Arg Ala Leu Ile Gln Cys Ala Lys Asp Ile Ala Lys 1010 1015 1020 Ala Ser Asp Glu Val Thr Arg Leu Ala Lys Glu Val Ala Lys Gln Cys 1025 1030 1035 1040 Thr Asp Lys Arg Ile Arg Thr Asn Leu Leu Gln Val Cys Glu Arg Ile 1045 1050 1055 Pro Thr Ile Ser Thr Gln Leu Lys Ile Leu Ser Thr Val Lys Ala Thr 1060 1065 1070 Met Leu Gly Arg Thr Asn Ile Ser Asp Glu Glu Ser Glu Gln Ala Thr 1075 1080 1085 Glu Met Leu Val His Asn Ala Gln Asn Leu Met Gln Ser Val Lys Glu 1090 1095 1100 Thr Val Arg Glu Ala Glu Ala Ala Ser Ile Lys Ile Arg Thr Asp Ala 1105 1110 1115 1120 Gly Phe Thr Leu Arg Trp Val Arg Lys Thr Pro Trp Tyr Gln 1125 1130

Claims (19)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 1) 개체로부터 분리된 시료 내의 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 빈쿨린(Vinculin) 단백질에 특이적으로 결합하는 빈쿨린 자가항체의 농도를 측정하는 단계;

   2) 단계 1)의 상기 자가항체의 농도가 정상인보다 낮은 경우, 유방암에 걸린 개체로 선별하는 단계를 포함하는 유방암 진단을 위한 상기 자가항체의 측정방법.
5. 제 4항에 있어서, 상기 시료는 혈청, 혈장 및 혈액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 측정방법.
6. 제 4항에 있어서, 상기 시료는 원심분리, 알부민 제거키트를 이용한 알부민 제거, 음이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 크기별 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography), 액체 크로마토그래피, 연속추출(sequential extraction) 또는 젤 전기영동으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법을 이용하여 전처리되는 것을 특징으로 하는 측정방법.
7. 제 4항에 있어서, 단계 1)의 측정은 빈쿨린 단백질을 항원으로 이용하여 상기 빈쿨린 자가항체와의 항원항체 반응을 측정하는 방법 또는 상기 항원 및 자가항체 복합체에 검출체를 처리한 후 검출체의 양을 측정함으로써 측정되는 것을 특징으로 하는 측정방법.
8. 제 7항에 있어서, 단계 1)의 측정은 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 비색법(colorimetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수 법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment) 및 섬광계수법(scintillation counting method)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 측정방법.
9. 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 빈쿨린(Vinculin) 단백질에 특이적으로 결합하는 빈쿨린 자가항체에 특이적인 빈쿨린 항원이 고체기질에 고정되어 포함되는 유방암 진단용 키트.
10. 제 9항에 있어서, 분석 대상이 되는 시료는 혈청, 혈장 및 혈액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 진단용 키트.
11. 제 9항에 있어서, 상기 항원은 서열번호 2로 공지된 빈쿨린 단백질의 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 이용하여 합성하는 방법, 빈쿨린 단백질을 발현하는 세포로부터 분리 및 정제하여 추출하는 방법, 유전자 재조합 기술을 이용하여 숙주생물로부터 생산하는 방법 및 구입하는 방법(제품번호: H00007414-P01, Abnova, USA)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 진단용 키트.
12. 제 11항에 있어서, 추가로 상기 빈쿨린 자가항체에 특이적으로 결합하는 검출체, 세척액 및 효소반응 정지액을 포함하는 것을 특징으로 하는 진단용 키트.
13. 제 12항에 있어서, 상기 검출체는 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 및 콜로이드로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나로 표지된 접합체인 것을 특징으로 하는 진단용 키트.
14. 제 13항에 있어서, 발색효소로 표지된 접합체인 경우 추가로 발색기질을 포함하는 것을 특징으로 하는 진단용 키트.
15. 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 빈쿨린(Vinculin) 단백질에 특이적으로 결합하는 빈쿨린 자가항체에 특이적으로 결합할 수 있는, 서열번호 2로 기재되는 빈쿨린 단백질의 전장 또는 일부가 고형 기질에 집적된 유방암 진단용 바이오칩.
16. 제 15항에 있어서, 상기 바이오칩은 단백질칩 또는 핵산 어레이인 것을 특징으로 하는 바이오칩.
17. 제 15항에 있어서, 상기 빈쿨린 단백질의 전장 또는 일부는 서열번호 2로 공지된 빈쿨린 단백질의 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 이용하여 합성하는 방법, 빈쿨린 단백질을 발현하는 세포로부터 분리 및 정제하여 추출하는 방법, 유전자 재조합 기술을 이용하여 숙주생물로부터 생산하는 방법 및 구입하는 방법(제품번호: H00007414-P01, Abnova, USA)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 바이오칩.
18. 제 15항에 있어서, 상기 고형 기질은 플라스틱, 유리, 금속 및 실리콘으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 바이오칩.
19. 제 15항에 있어서, 분석을 위한 시료는 혈청, 혈장 및 혈액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 바이오칩.

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