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CN103608663B - 生物样品中的核酸分子的检测方法 - Google Patents

生物样品中的核酸分子的检测方法 Download PDF

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Abstract

本核酸分子的检测方法具有如下工序：制备包含核酸探针和生物样品的样品溶液的工序，所述核酸探针与分析对象的核酸分子特异地杂交；使前述制备工序中制备的样品溶液中的核酸分子与前述核酸探针缔合的工序；和在前述缔合工序后，通过扫描分子计数法计算前述制备工序中制备的样品溶液中的、包含前述核酸探针的缔合体的分子数的工序；该方法具有：在前述计算工序之前从前述样品溶液中去除蛋白质的工序、或者在前述制备工序之前从前述生物样品中去除蛋白质的工序。

Description

生物样品中的核酸分子的检测方法
技术领域
本发明涉及使用共聚焦显微镜、多光子显微镜的光线系统等能够检测来自溶液中的微小区域的光的光学体统从而检测生物样品中的核酸分子的方法。
本申请基于2011年4月20日在日本提交的特愿2011-094293号要求优先权，本文援引其内容。
背景技术
随着近年来光学测量技术的发展，使用共聚焦显微镜的光学系统和也能够光子计数(单光子检测)的超高灵敏度的光检测技术，能够检测/测定单光子或单分子荧光水平的微弱光。因此，提出了使用前述的这类微弱光的检测技术检测生物分子等分子间相互作用或结合/解离反应的各种装置或方法。例如，对于荧光相关光谱分析(FluorescenceCorrelationSpectroscopy：FCS。例如，参见专利文献1、2、非专利文献1～3)中，使用激光共聚焦显微镜的光学系统和光子计数技术，测定来自在样品溶液中的微小区域(显微镜的激光聚光而成的焦点区域，被称为共焦体积(confocalvolume)。)内出入的荧光分子或进行了荧光标记的分子(荧光分子等)的荧光强度。荧光相关光谱分析基于由测定的荧光强度的自相关函数的值所决定的微小区域内部的荧光分子等的平均滞留时间(平移扩散时间)以及滞留的分子数的平均值，取得荧光分子等的运动速度或大小、浓度的信息。或者，荧光相关光谱分析基于前述的荧光分子等的平均滞留时间以及滞留的分子数的平均值，检测分子的结构或大小的变化、分子的结合/解离反应或者分散/聚集等各种现象。此外，利用荧光强度分布分析(Fluorescence-IntensityDistributionAnalysis：FIDA。例如，专利文献3)或光子计数直方图(PhotonCountingHistogram：PCH。例如，专利文献4)中，生成与FCS同样计算的在共焦体积内出入的荧光分子等的荧光强度的直方图。荧光强度分布分析中，对于生成的直方图的分布通过统计学模型式进行拟合，计算荧光分子等的固有亮度的平均值和滞留在共焦体积内的分子数的平均值。荧光强度分布分析根据上述信息，推测分子结构或大小的变化、结合/解离状态、分散/聚集状态等。此外，专利文献5、6中公开了：基于使用共聚焦显微镜的光学系统测定出的样品溶液的荧光信号的时程，检测荧光性物质的方法。专利文献7公开了一种信号运算处理技术，其用于：使用光子计数技术，测量在流式细胞仪内流过的荧光微粒或固定在基板上的荧光微粒所发出的微弱光，检测液流中或基板上存在的荧光微粒。
特别的是，通过应用FCS、FIDA等、使用了共聚焦显微镜的光学系统和光子计数技术的微小区域的荧光测量技术的方法，测定所必需的样品浓度比以前低得多且可以是微量(每次测定中可重复进行数次的秒数量级时间的测定。)。另外，通过上述的方法，测定时间大幅地缩短(每次测定中秒数量级的时间的测量可重复数次)。因此，这些技术特别是例如在以下的情况下，与现有的生物化学的方法相比较，能够低廉地或者迅速地进行实验或检测，可以期待成为强效的工具：
˙在医学/生物学的研究开发领域中，针对经常使用的稀少或者高价的样品进行分析的情况。
˙用于疾病的临床诊断或筛选生理活性物质等被检体数量多的情况下。
另一方面，对于检测具有特定碱基序列的核酸的方法，已大量报道了使用探针或引物等人工合成的短链寡核苷酸研究核酸的碱基序列的方法。特别是，生物样品通常如临床检查中的被检体等是微量的情况多。因此，分析生物样品中的核酸时，将该生物样品中所含的核酸使用PCR等通常的分子生物学的手法扩增后或者与扩增同时地检测靶核酸的方法是通用的。另外，生物样品中通常除了核酸以外还含有多种多样的物质，有时还包含核酸扩增反应的抑制物质。因此，利用核酸扩增反应精度良好地检测核酸的情况下，为了降低以核酸扩增反应的抑制物质为代表的杂质的影响，预先从生物样品中选择性提取核酸并回收是必要的。例如，专利文献8中公开有，通过使用了磁性粒子的核酸回收方法从生物样品中提取核酸，接着使用核酸扩增法这样的通常的分子生物学的手法从提取的核酸中检测靶核酸的方法。另外，专利文献9公开有使血液凝固之后，对于得到的血清进行核酸扩增处理，由此将血液中所含的核酸扩增反应的抑制物质去除，扩增靶核酸而进行检测的方法。其他的，专利文献10中公开有对于将血液稀释、加热后的样品进行核酸扩增处理而检测靶核酸的方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2005-098876号公报
专利文献2：日本特开2008-292371号公报
专利文献3：日本专利第4023523号公报
专利文献4：国际公开第2008-080417号公报
专利文献5：日本特开2007-20565号公报
专利文献6：日本特开2008-116440号公报
专利文献7：日本特开平4-337446号公报
专利文献8：日本专利第2965131号公报
专利文献9：日本专利第3575633号公报
专利文献10：日本特开2006-187221号公报
非专利文献
非专利文献1：金城政孝、蛋白質核酸酵素、1999年、第44卷、第9号、第1431～1438页。
非专利文献2：Meyer-Alms、FluorescenceCorrelationSpectroscopy、R.Rigler著、Springer、柏林、2000年、第204～224页。
非专利文献3：加藤则子等4名、遺伝子医学、2002年、第6巻、第2号、第271～277页。
发明内容
发明要解决的问题
上述FCS、FIDA、PCH等光分析技术简而言之是通过统计学处理计算所测量的荧光强度随时间波动的大小，根据该波动的大小确定在样品溶液中的微小区域内部出入的荧光分子等的各种特性。因此，为了在上述光分析技术中获得有意义的结果，就样品溶液中作为观察对象的荧光分子等的浓度或数密度而言，优选制备成使平衡状态下出入于微小区域内部的荧光分子等的数量为能够在每次长度为秒数量级的测量时间内进行统计学处理的数量。优选适宜制备成为在微小区域内经常地存在有一个左右的荧光分子等。典型地,共焦体积成为1fL程度,所以荧光分子等的浓度优选为1nM程度或者以上。换言之,当样品溶液中的观测对象粒子的浓度或数密度与能够统计学处理的程度相比大幅下降时(例如,大幅低于1nM时),出现了观测对象物在测量时间内很少进入微小区域内的状态,在荧光强度的测量结果中,长时间地包含观测对象物在微小区域内完全不存在的状态,并且显著的荧光强度的观测量减少。结果,如上所述的基于荧光强度的统计学波动的光分析技术,无法获得有意义的或精度良好的分析结果。
在专利文献5、6中记载的使用共聚焦显微镜的光学系统检测荧光物质的方法中，公开了：不进行如上所述的关于荧光强度波动的统计学处理，而可以获得显著强度的荧光信号的频率与样品中的荧光分子等的粒子数的相关性。这是因为,通过持续数秒的测量时间中有无产生显著强度的荧光信号,可以查清样品中有无作为观察对象的荧光分子等。特别是在专利文献6中，提出了产生搅拌样品溶液的随机流动时，检测灵敏度提高。然而，这些方法只能检测由于扩散或随机流动而存在的概率性进入微小区域内部的荧光分子等的存在，而不能掌握荧光分子等粒子在微小区域内部的行为。例如不能实现粒子的计数、定量计算粒子的浓度或数密度。此外，专利文献7中记载的技术是逐个检测流式细胞仪的液流中的荧光微粒或固定在基质上的荧光微粒的存在的技术，而不是用于检测样品溶液中在通常的状态下溶解或分散的分子或胶体等的粒子的技术。即,专利文献7所述的技术并不是用于检测样品溶液中随机运动的粒子的技术，所以并不能实现定量地计算样品溶液中溶解或分散的粒子的浓度或数密度。另外,专利文献7的技术包含流式细胞仪中的测量或者荧光粒子向基板上的固定化处理的过程。因此可以认为,专利文献7的技术中,检测所需要的样品量远大于FCS、FIDA、PCH等光分析技术的情况,同时对实施者要求复杂的高难度的操作技术。
另外,如果是具备充分的检测灵敏度的检测方法,不必预先进行核酸扩增反应,也能够期待从只极微量地含有作为检测对象的靶核酸的生物样品中直接检测到靶核酸。然而,生物样品中与核酸一起包含的杂质中有具备自身荧光的物质。因此,想要直接通过光分析技术检测生物样品中的核酸的情况下,存在由来源于生物样品的各种杂质产生非特异的信号的问题。另外,存在前述来源于生物样品的各种杂质阻挡透过光的问题。成为光学测定障碍的杂质的存在,在光分析技术的检测灵敏度越高时问题越严重。即,由血液、组织等来源于生物的样品通过高灵敏度的光分析技术进行靶核酸的检测时，由于测定对象以外的成为测定障碍的杂质，难以正确地测量测定对象本身的浓度。
本发明的目的在于提供检测包含着各种各样的物质的生物样品中的核酸分子的方法。本发明提供的方法使用新型的光分析技术。该新型的光分析技术不包含如FCS、FIDA、PCH等光分析技术中进行的统计处理。因此，对于观测对象粒子的浓度或数密度低于这些光分析技术的处理水平的样品溶液，也能够检测观测对象粒子的状态或特性。
用于解决问题的方案
本发明提供的检测方法所使用的新型的光分析技术具有以下的特征。即，作为检测核酸的方法，有使用与生物样品中的核酸分子特异地杂交的核酸探针，根据是否形成该核酸探针的缔合体来检测生物样品中的核酸分子的方法。该方法中，通过使用扫描分子计数法进行包含核酸探针的缔合体的检测，即便在样品中的分析对象的核酸分子的浓度非常低的情况下，也能够灵敏度良好地检测核酸分子。进一步，在检测包含核酸探针的缔合体之前，预先将来源于生物样品的杂质去除，由此能够精度良好地检测核酸分子。
上述扫描分子计数法是日本特愿2010-044714中由本申请的申请人提出的新型光分析技术。
为了解决上述的问题，本发明提出以下的方案。
本发明的第一方案的核酸分子的检测方法具有：制备工序、缔合工序、和计算工序。
前述制备工序制备包含核酸探针和生物样品的样品溶液，所述核酸探针与分析对象的核酸分子特异地杂交。
前述缔合工序使所述制备工序中制备的样品溶液中的核酸分子与前述核酸探针缔合。
前述计算工序，在前述缔合工序后计算所述制备工序中制备的样品溶液中的、包含前述核酸探针的缔合体的分子数。
进一步，本发明的第一方案的核酸分子的检测方法具有：移动光检测区域的位置的工序、检测荧光的工序、逐个检测缔合体的工序、计数工序以及去除工序。
前述移动光检测区域的位置的工序，移动前述计算工序中的前述样品溶液内的共聚焦显微镜或多光子显微镜的光学系统的光检测区域的位置；前述检测荧光的工序一边在前述样品溶液内部移动前述光学系统的光检测区域的位置，一边检测该光检测区域中的由前述缔合体发出的荧光。
前述逐个检测缔合体的工序由所述检测到的光逐个检测来自每个缔合体的光信号而逐个检测缔合体。
前述计数工序将前述逐个检测到的缔合体的个数进行计数而计数前述光检测区域的位置的移动中所检测到的前述粒子的个数。
前述去除工序在前述计算工序之前从前述样品溶液中去除蛋白质。或者前述去除工序在前述制备工序之前从前述生物样品中去除蛋白质。本发明的第二方案的核酸分子的检测方法具有在前述缔合工序之后、前述计算工序之前从前述样品溶液中去除蛋白质的工序。
本发明的第三方案的核酸分子的检测方法如下进行从前述样品溶液或前述生物样品的蛋白质的去除：使该样品溶液或该生物样品中的核酸分子吸附于无机支撑体之后，使吸附的核酸从无机支撑体中脱附。
根据本发明的第四方案，前述生物样品在从生物中采集之后进行了蛋白水解酶处理。
根据本发明的第五方案，前述核酸探针被荧光物质标记。
根据本发明的第六方案，前述核酸探针被荧光物质标记。在前述制备工序中，前述样品溶液中进一步包含荧光性双链核酸结合物质。标记了前述核酸探针的荧光物质和前述荧光性双链核酸结合物质中的任一者为作为荧光共振能量转移现象中的能量供体的荧光物质，另一者为作为前述荧光共振能量转移现象中的能量受体的物质。在前述计算工序中，从包含前述核酸探针的缔合体发出的荧光为标记了前述核酸探针的荧光物质与前述荧光性双链核酸结合物质之间发生的荧光共振能量转移现象而发出的荧光。
根据本发明的第七方案，前述核酸探针是作为能量供体的荧光物质与作为能量受体的物质按照在单独存在的状态下发生荧光共振能量转移、且在与其他单链核酸分子形成缔合体的状态下不发生荧光共振能量转移的方式结合而成的。从包含该核酸探针的缔合体发出的荧光是由所述作为能量供体的荧光物质发出的荧光。
根据本发明的第八方案，在前述移动光检测区域的位置的工序中，前述光检测区域的位置以规定的速度移动。
根据本发明的第九方案，在前述移动光检测区域的位置的工序中，前述光检测区域的位置以比前述缔合体的扩散移动速度快的速度移动。
本发明的第十方案的核酸分子的检测方法，在由前述检测到的光逐个检测来自每个缔合体的光信号而逐个检测缔合体的工序中，根据检测到的按照时间顺序的光信号的形状，检测出一个缔合体进入了前述光检测区域。根据本发明的第十一方案，前述样品溶液包含选自表面活性剂、甲酰胺、二甲基亚砜和尿素所组成的组的一种以上。
本发明的第十二方案的核酸分子的检测方法，如下进行前述缔合工序：通过将前述制备工序中制备的样品溶液的温度设为70℃以上而使所述样品溶液中的核酸分子变性后，按0.05℃/秒以上的降温速度降低所述样品溶液的液温，由此使该样品溶液中的核酸分子缔合。
根据本发明的第十三方案，前述核酸探针由选自DNA、RNA和核酸类似物所组成的组的2个以上的分子结合而构成。
发明的效果
上述的核酸分子的检测方法中应用的扫描分子计数法不实施计算荧光强度波动之类的统计学处理。因此，即使当样品中仅存在极微量的作为分析对象的核酸分子时，通过上述的核酸分子的检测方法也能够检测。
上述的核酸分子的检测方法中，在通过扫描分子计数法检测核酸探针与生物样品中的作为分析对象的核酸分子的缔合体之前，从样品溶液中去除来源于生物样品的蛋白质。因此，通过扫描分子计数法能够精度良好地检测分析对象的核酸分子。
附图说明
图1A是本发明的实施方式的用于扫描分子计数法的光分析装置内部结构的示意图。
图1B是图1A的光分析装置的共焦体积(共聚焦显微镜的观察区域)的示意图。
图1C是改变图1A的光分析装置的镜子7的方向，在样品溶液内部移动光检测区域的位置的机构的示意图。
图2A是说明用于扫描分子计数法的基于光分析技术的光检测原理的示意图。
图2B是用于扫描分子计数法的通过光分析技术测量的光强度的时间变化的示意图。
图3A是观测对象粒子一边进行布朗运动一边横穿光检测区域时的示意图。
图3B为表示图3A的情况的光子计数(光强度)的时间变化的例子的图。
图4A是以比观测对象粒子的扩散移动速度更快的速度移动样品溶液内部的光检测区域的位置、从而观测对象粒子横穿光检测区域时的示意图。
图4B为表示图4A的情况的光子计数(光强度)的时间变化的例子的图。
图5是以流程图的形式显示根据通过扫描分子计数法测量的光子计数(光强度)的时间变化进行粒子的计数的处理次序的图。
图6A是说明根据通过扫描分子计数法测量的光子计数(光强度)的时间变化进行粒子计数的处理次序中的、检测信号的信号处理工序的例子的图。
图6B是说明在根据通过扫描分子计数法测量的光子计数(光强度)的时间变化进行粒子计数的处理次序中的、检测信号的信号处理工序的例子的图。
图7是显示通过扫描分子计数法测量的光子计数数据的实测例(柱状图)、将数据平滑化后获得的曲线(虚线)、和峰存在区域所拟合的高斯函数(实线)的图。在图中，标注“噪音”的信号是由噪音或异物产生的信号，可以无视。
图8是表示本发明的试验例1的各样品溶液中被计数的峰数的值的图。
图9为表示本发明的实施例1的各样品溶液中的、样品溶液中的缔合体的浓度与被计数到的峰数的值的关系的图。
图10为表示本发明的实施例2的各样品溶液中被计数到的峰数的值的图。
具体实施方式
首先，对于扫描分子计数法进行说明。扫描分子计数法一边通过微小区域扫描样品溶液内部，一边在当分散在样品溶液中随机运动的发出光的粒子(以下，称为“发光粒子”。)横穿微小区域内部时，检测微小区域中的发光粒子所发出的光。即，扫描分子计数法为一个一个逐个检测样品溶液中的发光粒子，能够获得与发光粒子的计数、样品溶液中的发光粒子的浓度或数密度相关的信息的技术。扫描分子计数法与FIDA等光分析技术同样地，检测所需的样品可以是微量(例如，数十μL左右)。另外，扫描分子计数法的测定时间短，并且与FIDA等光分析技术的情况相比，对于更低浓度或数密度的发光粒子，可以定量检测其浓度或数密度等特性。
发光粒子是指作为观察对象的粒子与发光探针结合或缔合的粒子。“发光探针”是指具有与观测对象粒子结合或缔合的性质并且发光的物质(通常为分子或它们的聚集体)。发光粒子典型地为荧光性粒子，但也可以为通过磷光、化学发光、生物发光、光散射等发出光的粒子。本实施方式的核酸分子的检测方法中应用的核酸探针与发光探针相当。
本发明的实施方式中，共聚焦显微镜或多光子显微镜的光学系统的“光检测区域”是指在这些显微镜中检测到光的微小区域。当从物镜提供照明光时，相当于该照明光聚光的区域。需要说明的是，在共聚焦显微镜中，上述区域尤其根据物镜与小孔(pinhole)之间的位置关系而确定。
边在样品溶液内部移动光检测区域的位置边逐次地进行光的检测。即，一边利用光检测区域扫描样品溶液内部一边逐次进行光的检测。于是，当移动的光检测区域包括了与随机运动的粒子结合或缔合的发光探针时，检测到来自发光探针的光。以此检测到一个粒子的存在。根据实验方式，也存在如下情况：发光探针与希望检测的粒子暂时结合后，在进行光的检测时与粒子解离。并且，逐次检测的光中，逐个检测来自发光探针的光信号。由此每次一个地逐个逐次地检测(与发光探针结合的)粒子的存在，获得与粒子在溶液内的状态相关的各种信息。具体而言，例如，在上述构成中可以构成为：计数逐个检测到的粒子，从而计数在光检测区域的位置移动中检测到的粒子的个数(粒子的计数)。根据上述的构成，通过组合粒子的个数与光检测区域的位置的移动量，能够获得与样品溶液中的粒子的数密度或浓度相关的信息。特别是通过任意手法(例如以规定速度移动光检测区域的位置等确定光检测区域的位置移动轨迹的总体积的手法)，能够具体计算粒子的数密度或浓度。当然，并不是直接确定绝对数密度值或浓度值，可以构成为计算相对于多个样品溶液、或者相对于成为浓度或数密度基准的标准样品溶液的相对的数密度或浓度之比。另外，扫描分子计数法采用改变光学系统的光路而移动光检测区域的位置的构成。因此，光检测区域的移动快速且实质上不在样品溶液中产生机械振动或流体力学的作用，因此，能够在作为检测对象的粒子处于不受力学作用的影响且稳定的状态下进行光测量(样品溶液中一旦发生振动或流动，粒子的物理性质就可能发生变化)。并且，由于使样品溶液流动的构成不是必需的，因此能够用与FCS、FIDA等情况下同样微量(1～数十μL左右)的样品溶液进行测量和分析。
在逐个地检测上述的粒子的工序中，由逐次被检测的光信号判定与1个粒子结合的发光探针是否进入光检测区域，这可以根据按照时间顺序检测到的光信号的形状而进行。需要说明的是，本实施方式中，“与1个粒子结合的发光探针”包含以下的情况：
˙1个发光探针与1个粒子结合的情况。
˙多个发光探针与1个粒子结合的情况。
˙根据实验方式的、与1个粒子结合后从粒子上解离的发光探针的情况。
本实施方式中，典型的构成可以是：当检测到具有比规定阈值大的强度的光信号时，检测出与1个粒子结合的发光探针进入了光检测区域。
此外，在上述移动光检测区域的位置的工序中，可以根据与粒子结合的发光探针的特性或样品溶液中的数密度或浓度，恰当改变在样品溶液内部的光检测区域的位置的移动速度。如本领域技术人员所理解的，与粒子结合的发光探针被检测到的光的样态，可能会根据其特性或样品溶液中的数密度或浓度而改变。特别是，光检测区域的移动速度快时，由与1个粒子结合的发光探针得到的光量降低。因此，为了能够精度良好或灵敏度良好地测量来自与1个粒子结合的发光探针的光，优选适当地改变光检测区域的移动速度。
进一步，在上述移动光检测区域的位置的工序中，恰当的是将样品溶液内部的光检测区域的位置的移动速度设定为高于与作为检测对象的粒子结合的发光探针(即，本实施方式的核酸分子的检测方法中，包含核酸探针的缔合体)的扩散移动速度(由于布朗运动造成的粒子的平均移动速度)。如上述说明，通过扫描分子计数法，当光检测区域通过与1个粒子结合的发光探针的所在位置时，检测由该发光探针发出的光而逐个检测发光探针。然而，当与粒子结合的发光探针在溶液中由于布朗运动而随机移动，在光检测区域中出入多次时，由于多次检测到来自1个发光探针的(表明存在希望检测的粒子的)光信号，因此，难以将检测到的光信号与1个希望检测的粒子的存在对应起来。因此，如上述，光检测区域的移动速度被设定为高于与粒子结合的发光探针的扩散移动速度。具体而言，移动速度设定为以高于包含核酸探针的缔合体的扩散移动速度的速度进行移动。由此，能够使与1个粒子结合的发光探针对应于1个光信号(表示粒子的存在的光信号)。需要说明的是，扩散移动速度随与粒子结合的发光探针而改变，所以如上所述优选根据与粒子结合的发光探针的特性(特别是扩散常数)，恰当地改变光检测区域的移动速度。
可以以任意方式，实现用于移动光检测区域的位置的光学系统的光路改变。
例如，可以构成为利用激光扫描型光学显微镜中使用的检流计镜(galvanometermirror)改变光路，使光检测区域的位置发生变化。光检测区域的位置的移动轨迹也可以任意地设定。例如，光检测区域的位置的移动轨迹可选自圆形、椭圆形、矩形、直线和曲线。
扫描分子计数法的光检测机理，与FIDA等光分析技术的情况相同，采取对来自共聚焦显微镜或多光子显微镜的光检测区域的光进行检测的构成。因此，扫描分子计数法中使用的样品溶液的量与FIDA等光分析技术同样地也可以是微量。然而，扫描分子计数法中，不实施计算荧光强度的波动这样的统计学处理。因此，扫描分子计数法的光分析技术可以适用于粒子的数密度或浓度比FIDA等光分析技术所需要的水平大幅地低的样品溶液。
此外，扫描分子计数法由于逐个检测分散或溶解在溶液中的各个粒子，因此利用该信息，能够定量进行粒子计数、计算样品溶液中的粒子的浓度或数密度而获得与浓度或数密度相关的信息。即，扫描分子计数法使通过光检测区域的粒子与检测到的光信号一一对应而一个一个检测粒子。因此，能够计数分散在溶液中随机运动的粒子，与以前相比，可以精度良好地决定样品溶液中的粒子的浓度或数密度。实际上，根据逐个检测与目标粒子结合的状态的发光探针等并计数其数目、确定粒子浓度的方法、即上述的目标粒子的检测方法，即使试样溶液中的与目标粒子结合的发光探针的浓度是比通过荧光分光光度计或酶标仪测量的荧光强度能够确定的浓度更低的浓度，也能够检测目标粒子。
进一步，改变光学系统的光路、利用光检测区域扫描样品溶液内部的方式，不对样品溶液产生机械振动或流体力学作用，在使样品溶液内部均一的状态或样品溶液机械上稳定的状态下进行观察。因此，例如，与样品中发生流动的情况相比较，定量检测结果的可靠性提高。这是因为，引起流动时通常难以引起均匀的流速，并且装置结构复杂化。另外因为，引起流动时，必要的样品量大幅地增大，并且由流动导致的流体力学的作用，溶液中的粒子、发光探针或结合体或者其他的物质存在变质或变性的可能性。此外，能够在对样品溶液中作为检测对象的粒子(在本实施方式中，包含核酸探针的缔合体等)无力学作用影响或人为影响的状态下进行测量。
＜用于扫描分子计数法的光分析装置的构成＞
在基本的组成中，如图1A中示意性的示例，可以通过由能够实施FCS、FIDA等的共聚焦显微镜的光学系统和光检测器组合而构成的光分析装置实施扫描分子计数法。如图1A所示，光分析装置1是由光学系统2～17、和用于控制光学系统的各部分的动作并获得、分析数据的计算机18构成的。光分析装置1的光学系统可以与通常的共聚焦显微镜的光学系统同样。该光学系统中，自光源2发射的在单模光纤3内传播的激光(Ex)在光纤的射出端以固有的NA规定的角度发射为发散的光，通过准直仪4成为平行光。该平行光在分色镜5、反射镜6、7处发生反射，入射至物镜8。在物镜8的上方，典型地配置分注了1～数十μL的样品溶液的样品容器或排列有孔10的微孔板9。自物镜8射出的激光在样品容器或孔10内的样品溶液中聚集为焦点，形成光强度强的区域(激发区域)。样品溶液中分散或溶解有作为观测对象物的粒子、和与前述粒子结合的发光探针。典型地分散或溶解有带有荧光色素等发光标记的分子。与发光探针结合或缔合的粒子(实验的方式中，与粒子暂时结合后与粒子解离的发光探针)进入激发区域时，发光探针就在其中被激发而发出光。发出的光(Em)通过物镜8、分色镜5，在镜子11处反射，在聚光镜12处聚光，通过小孔13，透过二次滤片14。光(Em)透过二次滤片14时，仅选择特定的波长带宽的光成分。接着，仅选择特定的波长带宽的光成分的光被导入至多模光纤15，到达光检测器16。到达光检测器16的光在转变为按照时间顺序的电信号后，输入到计算机18中，以后面说明的方式进行用于光分析的处理。在上述的构成中，小孔13配置于与物镜8的焦点位置共轭的位置上。由此，仅自图1B中示意地所示的激光的焦点区域即激发区域内发出的光通过小孔13，而来自激发区域以外的光被阻挡。图1B所例示的激光的焦点区域通常是具有1～10fL程度的实际体积的、位于本光分析装置中的光检测区域，被称为共焦体积。激光的焦点区域典型地光强度呈现以区域的中心为顶点的高斯型分布或洛伦兹型分布。进一步，激光的焦点区域的实际体积是以光强度为1／e2的面为界面的略椭球体的体积。
另外，扫描分子计数法中，检测到来自1个粒子与发光探针的结合体或来自发光探针的光，例如，来自一个或数个荧光色素分子的微弱光。因此，光检测器16优选使用能够光子计数的超高灵敏度的光检测器。此外，在显微镜的平台(图中未显示)中，可以设计用于移动微孔板9的水平方向位置的平台位置变化装置17a。该平台位置变化装置17a用于变更为了观察粒子等的孔10。可以通过计算机18控制平台位置变化装置17a的动作。通过上述构成，即使被检体为多个，也可以实现快速的测量。
进一步，上述的光分析装置的光学系统设置有改变光学系统的光路通过光检测区域扫描样品溶液内部的机构。即，在样品溶液内设置有用于移动焦点区域(即，光检测区域)的位置的机构。上述用于移动光检测区域的位置的机构，例如如图1C示意性示例的，可以利用改变反射镜7的方向的镜转向器17。上述镜转向器17可以与装备在普通的激光扫描型显微镜中的检流计镜装置相同。另外，为了实现预期的光检测区域的位置移动模式，镜转向器17是在计算机18的控制下，与光检测器16的光检测协调驱动的。光检测区域的位置的移动轨迹可任意地选自圆形、椭圆形、矩形、直线、曲线或它们的组合。另外，也可以构成为在计算机18的程序中选择各种移动模式。需要说明的是，图中没有显示但也可以构成为通过上下移动物镜8而使光检测区域的位置沿上下方向移动。如上所述，不移动样品溶液通过改变光学系统的光路而移动光检测区域的位置的构成，使样品溶液内部实质上不发生机械的振动或流体力学的作用。因此，能够排除对于观测对象物的力学作用的影响，实现稳定的测量。
当粒子与发光探针的结合体或发光探针通过吸收多光子而发光时，上述光学系统作为多光子显微镜使用。在此情况下，仅在激发光的焦点区域(光检测区域)中发出光，因此可以去除小孔13。此外，当粒子与发光探针的结合体或发光探针通过化学发光或生物发光现象而不依赖激发光发光时，可以省略用于产生激发光的光学系统2～5。当粒子与发光探针的结合体或发光探针通过磷光或散射发光时，直接使用上述共聚焦显微镜的光学系统。进一步，在光分析装置1中，如图示，也可以设置有多个激发光源2。另外，在光分析装置1中，可以构成为根据用于激发粒子与发光探针的结合体或发光探针的光的波长，选择恰当的激发光的波长。同样地，光检测器16可以设置多个。另外，光检测器16可以构成为，当样品中包含波长不同的多种粒子与发光探针的结合体或发光探针时，可以根据波长分别检测来自它们的光。
＜扫描分子计数法的光分析技术的原理＞
FIDA等分光分析技术与以前的生物化学分析技术相比，其优点是必需的样品量非常少，并且可以快速实施检查。然而，在FIDA等分光分析技术中，原理上根据荧光强度波动计算观测对象粒子的浓度或特性。因此，为了获得良好精度的检测结果，要求样品溶液中的观测对象粒子的浓度或数密度是如下水平：在荧光强度测量中，在光检测区域CV内总是存在一个左右的观测对象粒子，在测量时间内总是检测到显著的光强度(光子计数)。如果当观测对象粒子的浓度或数密度低于上述时，(例如，当观测对象粒子的水平是仅偶尔进入光检测区域CV内的水平时)，在一部分测量时间内不出现显著的光强度(光子计数)，因而难以以良好的精度计算光强度的波动。此外，在观测对象粒子的浓度比测量中通常在光检测区域内部存在一个左右的观测对象粒子时大幅降低的情况下，光强度波动的运算易受背景的影响，为了获得对运算而言为充分量的显著的光强度数据，测量时间延长。与此相对，即使当观测对象粒子的浓度比FIDA等分光分析技术要求的水平低时，用扫描分子计数法也能够检测观测对象粒子的数密度或浓度等特性。
扫描分子计数法的光分析技术中，所进行的处理直接了当地说，是用于移动光检测区域的位置的机构(镜偏向器17)所驱动的光路的改变。如图2中示意地描述，一边在样品溶液内部移动光检测区域CV的位置，即一边利用光检测区域CV扫描样品溶液内部，一边实施光检测。
如此一来，例如如图2A所示，在光检测区域CV移动期间(图中，时间t0～t2)，当通过存在有1个粒子(图中，发光探针结合有荧光色素)的区域时(t1)，检测到如图2B所述的显著的光强度(Em)。如此，实施上述的光检测区域CV的位置的移动和光检测，通过一个一个地检测在此期间出现的图2B所例示的显著的光强度，逐个检测出发光探针所结合的粒子。通过将逐个检测到的前述粒子的个数进行计数，能够得到与存在于所测量的区域内的粒子的个数或者浓度或数密度相关的信息。在前述扫描分子计数法的光分析技术原理中，不进行诸如荧光强度波动的计算这类统计学的运算处理，而是一个一个地检测粒子，即使对于应观察的粒子的浓度低而用FIDA等不能进行足够精度分析的样品溶液，也可以获得与粒子的浓度或数密度相关的信息。
另外，通过扫描分子计数法这类对样品溶液中的粒子逐个检测、计数的方法，与由通过荧光分光光度计或酶标仪测量的荧光强度来检测被荧光标记的粒子的浓度时相比，能够检测至更低的浓度。当通过荧光分光光度计或酶标仪来检测某些被荧光标记的粒子的浓度时，通常假设荧光强度与被荧光标记的粒子的浓度成比例。然而此时，当被荧光标记的粒子的浓度变得非常低时，噪音信号量相对于被荧光标记的粒子发出的光的信号量而言变大(S/N比恶化)，被荧光标记的粒子的浓度与光信号量之间的比例关系瓦解，所确定的浓度值的精度恶化。另一方面，扫描分子计数法在由检测到的光信号检测对应于各个粒子的信号的工序中，从检测结果中去除了噪音信号，只将对应于各个粒子的信号进行计数而计算浓度。因此，与假设荧光强度与被荧光标记的粒子的浓度成比例而检测浓度时相比较，扫描分子计数法能够检测至更低的浓度。
另外，当1个观测对象粒子结合有多个发光探针时，通过扫描分子计数法这类对样品溶液中的粒子逐个检测、计数的方法，与传统的在假定荧光强度与被荧光标记的粒子的浓度成比例的条件下确定浓度的方法相比，粒子浓度高一侧的粒子浓度的测量精度提高。在向样品溶液添加1个观测对象粒子结合有多个发光探针的量的发光探针时，观测对象粒子的浓度升高时，相对而言与粒子结合的发光探针的个数降低。在此情况下，由于每1个观测对象粒子的荧光强度降低，因此，被荧光标记的粒子的浓度与光量之间的比例关系瓦解，所确定的浓度值的精度恶化。另一方面，扫描分子计数法在由检测到的光信号检测对应于各个粒子的信号的工序中，每个粒子的荧光强度降低的影响变少，由粒子数计算浓度。因此，与假设荧光强度与被荧光标记的粒子的浓度成比例而检测浓度时相比较，扫描分子计数法能够检测至更高的浓度。
＜通过扫描分子计数法的样品溶液的光强度的测定＞
就扫描分子计数法的光分析中的光强度的测定而言，除了在检测中驱动镜转向器17，在样品溶液内部移动光检测区域的位置(扫描样品溶液内部)以外，可以以与FCS或FIDA中的光强度检测工序相同的方式实施光强度检测。操作处理中，典型地按照以下的次序进行。即，在微孔板9的孔10中注入样品溶液而载置于显微镜的平台上。之后，使用者对计算机18输入测定开始的指示。输入了指示的计算机18按照存储装置(没有图示)所记录的程序，开始样品溶液内的光检测区域中的激发光的照射以及光强度的测量。该程序包括：在样品溶液内将用于移动光检测区域的位置的光路进行变更的程序、和在光检测区域的位置的移动中由光检测区域检测光的程序。在前述测量中，在根据计算机18程序的处理操作的控制下，镜偏向器17驱动镜7(检电镜)，在孔10内进行光检测区域的位置的移动。与此同时，光检测器16将逐次检测到的光转换为电信号，传送给计算机18。计算机18以任意方式由送达的光信号生成按照时间顺序的光强度数据并进行保存。需要说明的是，典型地光检测器16为能够检测到单光子到达的超高灵敏度光检测器。光的检测是在规定时间内逐次地隔着规定的单位时间(BINTIME)进行的光子计数。例如，光的检测通过测量每10μ秒到达光检测器的光子的个数的方式而进行。另外，按照时间顺序的光强度的数据也可以为按照时间顺序的光子计数数据。
光强度测量中的光检测区域的位置移动速度可以是任意设定的适合例如实验或分析目的的规定速度。当根据所检测到的观测对象粒子的数量获得与其数密度或浓度相关的信息时，光检测区域所通过的区域的大小或体积是必需的，因此以移动距离受掌握的方式实施光检测区域的位置移动。需要说明的是，测量中的经过时间与光检测区域的位置的移动距离成比例时，测定结果的解释变得容易。因此，移动速度优选为基本恒定的速度但不限定于此。
此外，对于光检测区域的位置移动的速度，为了由测量的按照时间顺序的光强度数据逐个检测观测对象粒子，或以良好的精度定量实施观测对象粒子数的计数，优选将前述移动速度设定为比观测对象粒子的随机运动，即由布朗运动造成的移动速度更快的值。观测对象粒子更严密地讲，是指粒子与发光探针的结合体或者与粒子结合后分解并游离的发光探针。
扫描分子计数法的光分析技术的观测对象粒子是分散或溶解在溶液中的自由地随机运动的粒子，由于布朗运动观察对象粒子的位置随时间而移动。因此，光检测区域的位置的移动速度比粒子的由布朗运动导致的移动慢时，如图3A示意地描述，粒子在区域内随机地移动。由此，光强度如图3B所示随机地变化，难以确定与各个观测对象粒子对应的显著的光强度的变化。需要说明的是，如前述，光检测区域的激发光强度以区域的中心为顶点向外侧降低。
因此，合适的是，如图4A描述，设定为粒子略直线地横穿光检测区域。由此，在按照时间顺序的光强度数据中，如图4B所例示，对应于各个粒子的光强度变化的曲线几乎一致，为了容易地确定各个观测对象粒子与光强度的对应，光检测区域的位置的移动速度设定为比粒子的布朗运动的平均移动速度(扩散移动速度)快。需要说明的是，粒子略直线地通过光检测区域的情况下，光强度变化的曲线与激发光强度分布几乎相同。
具体而言，由于布朗运动，具有扩散系数D的观测对象粒子(更严密的是，粒子与发光探针的结合体，或与粒子结合后再分解的游离发光探针)经过半径Wo的光检测区域(共焦体积)时所需的时间Δt是由均方位移的关系式
(2Wo)2＝6D/Δt…(1)
推断出
Δt＝(2Wo)2/6D…(2)
因此，观测对象粒子由于布朗运动造成的移动的速度(扩散移动速度)Vdif大约是
Vdif＝2Wo/Δt＝3D/Wo…(3)
在本文中，参考前述Vdif，光检测区域的位置的移动速度可以设定为比之更快的值。例如，当预计观测对象粒子的扩散系数是D＝2.0×10-10m2/s左右时，Wo就是0.62μm左右、Vdif则是1.0×10-3m/s，因此，光检测区域的位置的移动速度可以设定为约10倍的15mm/s。此外，当观测对象粒子的扩散系数未知时，为了找到使在光检测区域的位置移动速度的各种设定下的光强度变化曲线成为预期曲线(典型的是与激发光强度分布几乎相同)的条件，可以重复进行预备实验，确定适当的光检测区域的位置的移动速度。
＜通过扫描分子计数法的光强度的分析＞
经上述处理获得样品溶液的按照时间顺序的光强度数据时，可以在计算机18中，通过存储在存储装置中的程序进行处理，如下所述实施光强度的分析。
(i)一个观测对象粒子的检测
在按照时间顺序的光强度数据中，当一个观测对象粒子通过光检测区域时的轨迹是如图4A所示几乎直线状时，与该粒子相对应的光强度变化如图6A示意性地所述，具有反映光检测区域(由光学系统确定的光检测区域)的光强度分布的曲线(通常略呈钟形)。因此，在观测对象粒子的一检测手法中，对于光强度设定阈值Io。当超过该阈值的光强度所持续的时间宽度Δτ在规定的范围内时，判定该光强度的曲线与一个粒子通过了光检测区域对应。另外，超过前述阈值的光强度所持续的时间宽度Δτ在规定的范围内时，也可以构成为检测到一个观测对象粒子。光强度对应的阈值Io以及时间宽度Δτ对应的规定范围是根据观测对象粒子与发光探针的结合体(或者与粒子结合后再分解而游离的发光探针)所发出的光的强度规定的曲线决定的；所述观测对象粒子对于光检测区域以规定的速度相对地移动。曲线的具体的值可以在实验中任意地确定。或者，曲线的具体的值可以根据观测对象粒子与发光探针的结合体(或者与粒子结合后分解而游离的发光探针)的特性而选择地决定。
此外，作为检测观测对象粒子的其他方法，光检测区域的光强度分布假定为高斯分布：
I＝A·exp(-2t2/a2)…(4)，
时，可以使用以下的手法。此时，对显著的光强度曲线(可以明确判断为非背景的曲线)，根据式(4)拟合计算的强度A和宽度a落入规定范围内时，该光强度曲线可判断为对应一个观测对象粒子通过了光检测区域，可以视为检测到一个观测对象粒子。需要说明的是，当强度A和宽度a落在规定范围之外时，该光强度的曲线在分析中视为噪音或异物而可以无视。
(ii)观测对象粒子的计数
观测对象粒子的计数，可以是通过任意方法计数通过上述观测对象粒子的检测方法检测到的粒子的个数。然而，当粒子的个数较大时，可以通过例如图5和图6B所示例的处理来进行观测对象粒子的计数。
如图5和图6B所示，在根据按照时间顺序的光强度(光子计数)数据计数粒子数的方法的一个例子中，在通过上述说明的光强度测定、即用光检测区域扫描样品溶液内部和进行光子计数，获得按照时间顺序的光信号数据(光子计数数据)后(步骤100)，对前述按照时间顺序的光信号数据(图6B最上部分“检测结果(未处理)”)，进行SMOOTHING(平滑化)处理(步骤110，图6B中上部分“SMOOTHING”)。粒子和发光探针的结合体或发光探针发出的光是概率性发出的，所以在微小的时间内存在数据值产生欠缺的可能性。然而，通过前述平滑化处理，可以无视前述数据值的欠缺。平滑化处理可以通过例如移动平均法(movingaveragemethod)进行。需要说明的是，根据获得光信号数据时的光检测区域的位置移动速度(扫描速度)、BINTIME，可以恰当地设定实施平滑化处理时的参数。需要说明的是，前述的参数是指例如移动平均法中一次平均的数据点数或移动平均的次数等。
然后，为了在平滑化处理后的按照时间顺序的光信号数据中检测存在显著信号的时间区域(峰存在区域)，对平滑化处理后的按照时间顺序的光信号数据对时间进行一阶微分值运算(步骤120)。按照时间顺序的光信号数据的时间微分值，如图6B中下部分的“时间微分”所示信号值变化时间点处的值的变化变大，因此通过参考所述时间微分值可以有利地确定显著的信号(峰信号)的起点和终点。
之后，在按照时间顺序的光信号数据中，逐次检测显著的信号(峰信号)，判断检测到的峰信号是否是与观测对象粒子相对应的信号。
具体而言，首先，在按照时间顺序光信号数据的按照时间顺序的时间微分值数据上，逐次地参考时间微分值。接着，搜索并确定一个峰信号的起点和终点，决定峰存在区域(步骤130)。一旦决定了一个峰存在区域，就对该峰存在区域中平滑化的按照时间顺序的光信号数据进行钟形函数拟合(图6B下部分的“钟形函数拟合”)，计算钟形函数的峰强度Imax、峰宽度(半高全宽(fullwidthhalfmaximum))w、拟合中的相关系数(最小二乘法的相关系数)等参数(步骤140)。需要说明的是，拟合的钟形函数典型的是高斯函数。此外，拟合的钟形函数也可以是洛伦兹型函数。然后，判断计算的钟形函数的参数是否落在一个粒子与发光探针的结合体或发光探针通过光检测区域时检测到的光信号所描述的钟形曲线参数的规定范围内(步骤150)。即，该判定中判断峰强度、峰宽度、相关系数是否分别在规定范围内等。这样，如图7左侧所示，计算的钟形函数的参数被判断为落在与一个粒子和发光探针的结合体或者与发光探针对应的光信号规定的范围内时，则该信号判定为与一个观测对象粒子对应的信号。由此，检测到一个观测对象粒子，计数为一个粒子(粒子数的计数增加。工序160)。另一方面，如图7右侧所示，将计算的钟形函数的参数没有落在规定范围内的峰信号作为噪音而无视。
上述步骤130～160处理中的峰信号的搜索和判断是对按照时间顺序的光信号数据的全部区域重复实施的，每检测到一个观测对象粒子，就作为粒子而计数。因此，在结束对按照时间顺序的光信号数据全部区域的峰信号搜索后(步骤170)，将所获得的粒子计数值作为在按照时间顺序的光信号数据中检测到的观测对象粒子的个数。
(iii)观测对象粒子的数密度或浓度的确定
完成了观测对象粒子的计数后，使用获得按照时间顺序的光信号数据的过程中光检测区域所通过的区域的总体积，确定观测对象粒子的数密度或浓度。然而，光检测区域的实际体积依赖于激发光或检测光的波长、透镜的开口数、光学系统的调整状态而改变，因而一般难以从设计值计算。因此，计算光检测区域所通过的区域的总体积也不简单。在本文中，典型的是，也可以为如下构成：在与所要检查的样品溶液的测定相同的条件下，对已知浓度的溶液(参照溶液)进行上文说明的光强度测定、粒子的检测和计数，根据检测到的粒子的个数和参照溶液的粒子的浓度，确定光检测区域所通过的区域的总体积，即确定观测对象粒子的检测数和浓度之间的关系。
参照溶液的粒子优选可以是与观测对象粒子所形成的粒子与发光探针的结合体(或与观测对象粒子结合后再游离的发光探针)具有相同发光特性的发光标记(荧光色素等)。具体而言，例如，对于粒子浓度为C的参照溶液，其粒子的检测数为N时，光检测区域通过的区域总体积Vt则根据
Vt＝N/C…(5)
获得。此外可以构成为，准备多个不同浓度的溶液作为参照溶液，分别对其实施测定，将计算的Vt的平均值作为光检测区域所通过区域的总体积Vt使用。因此，一旦获得Vt，则粒子的计数结果为n的样品溶液的粒子的数密度c就根据
c＝n/Vt…(6)
而获得。需要说明的是，可以不通过上述方法，而利用任意方法获得光检测区域的体积、光检测区域所通过区域的总体积。例如，可以利用FCS、FIDA等获得总体积。此外也可以如此构成：在本实施方式的光分析装置中，对于规定的光检测区域的移动模式，将各种标准粒子的浓度C和粒子数N之间的关系(式(5))的信息预先存储在计算机18的存储装置中，装置的使用者在实施光分析时可以恰当利用存储的关系信息。
＜核酸分子的检测方法＞
本实施方式的核酸分子的检测方法为如下方法：以具有特定的碱基序列的核酸分子作为分析对象，使用与该核酸分子特异地结合的核酸探针，使该核酸探针与分析对象的核酸分子(以下，有时称为靶核酸分子。)杂交，根据所形成的缔合体的量检测分析对象的核酸分子。进一步，在本实施方式中，通过上述扫描分子计数法测定、检测缔合体。扫描分子计数法是能够在分子处于离散状态下按粒测定每一个具有荧光的粒子的检测方法，因此能够检测pM数量级以下的较低浓度的核酸分子。因此，通过本实施方式的核酸分子的检测方法，即使当样品溶液中的靶核酸分子的浓度非常低时，也能够高灵敏度地计数所形成的缔合体。
本实施方式中，“核酸探针与靶核酸分子特异地结合”是指该核酸探针相比于其他的单链核酸分子优先地与该靶核酸分子杂交。具体而言，该靶核酸分子为单链核酸分子的情况下，意味着相比于其他的单链核酸分子，优先地与该单链核酸分子进行杂交。另外，该靶核酸分子为双链核酸分子的情况下，意味着优先地与构成该靶核酸分子的两条单链核酸分子中的一者进行杂交。因此，核酸探针可以具有与靶核酸分子的碱基序列完全互补的碱基序列，也可以具有含错配的碱基序列。
本实施方式使用与靶核酸分子特异地杂交的核酸探针。使靶核酸分子与核酸探针杂交而检测形成的缔合体，由此与生物样品中所含的其他的核酸分子相区别而能够检测靶核酸分子。生物样品中存在有靶核酸分子的情况下，从该生物样品与核酸探针混合而成的样品溶液中，检测出包含该核酸探针的缔合体。另一方面，该生物样品中不存在靶核酸分子的情况下，从该样品溶液中检测不到包含该核酸探针的缔合体。
需要说明的是，本实施方式中使用的核酸探针可以为由DNA组成的寡核苷酸。另外，核酸探针可以为由RNA组成的寡核苷酸。另外，核酸探针可以为由DNA和RNA组成的嵌合寡核苷酸。另外，核酸探针可以为包含部分或全部核酸类似物的物质；所述核酸类似物能够与天然的核酸碱基同样地形成核苷酸链或碱基对。核酸类似物可列举DNA或RNA这类天然类型核苷酸(天然存在的核苷酸)的侧链等被氨基等官能团修饰的物质、用蛋白质或低分子化合物等标记的物质等。更具体而言，作为核酸类似物，可列举出例如：交联核酸(BNA,Bridgednucleicacid)、天然型核苷酸的4’位氧原子被硫原子取代的核苷酸、天然型核糖核苷酸的2’位羟基被甲氧基取代的核苷酸或己糖醇核酸(HNA,HexitolNucleicAcid)、肽核酸(PNA)等。另外，作为分析对象的核酸可以是DNA。另外，作为分析对象的核酸可以是RNA。另外，作为分析对象的核酸可以为cDNA这类人工扩增的DNA。
在本实施方式中，通过使核酸探针单独存在的状态下、和与其他单链核酸分子形成缔合体的状态下的荧光强度不同，可以在扫描分子计数法中，区别检测由核酸探针及其他的单链核酸分子形成的缔合体、以及没有形成缔合体的核酸探针。
另外，本实施方式可以使用分子信标探针作为核酸探针。分子信标探针是在单链核酸分子的状态下形成分子内结构的寡核苷酸，是在FRET中作为能量供体的荧光物质和作为能量受体的物质(荧光物质、猝灭物质)按照在单链核酸分子的状态下产生FRET、在与其他单链核酸分子杂交形成缔合体的状态下不产生FRET的方式结合而成的探针。从形成缔合体的核酸探针中能够检测到由作为能量供体的荧光物质发出的荧光。与此相对，从单独存在的核酸探针中，检测不到由作为能量供体的荧光物质发出的荧光，或所述荧光是减弱的。因此，通过检测由作为能量供体的荧光物质发出的荧光，可以与单独存在的核酸探针区别地检测包含核酸探针的缔合体。
本实施方式中，作为核酸探针使用的分子信标探针可列举出：具有能够与靶核酸分子杂交的碱基序列、且在3’末端侧区域和5’末端侧区域具有彼此互补的碱基序列的寡核苷酸。本实施方式的分子信标探针优选：3’末端侧结合有作为能量供体的荧光物质或作为能量受体的物质，5’末端侧结合有剩余的另一种，并且3’末端侧区域和5’末端侧具有彼此互补的碱基序列，这些碱基序列形成碱基对，由此形成分子内结构(所谓的茎-环结构)。需要说明的是，分子信标探针的形成分子内碱基对的彼此互补的区域可以夹着与靶核酸分子互补的碱基序列形成的区域而存在。例如，3’末端侧的区域和5’末端侧的区域可以分别包含3’末端或5’末端。另外，3’末端侧的区域和5’末端侧的区域可以分别不含3’末端或5’末端。此外，形成碱基对的区域的碱基数或碱基序列所形成的碱基对的稳定性可以是以下程度：比与靶核酸分子的缔合体的稳定性更低，且在检测条件下能够形成碱基对。
需要说明的是，荧光物质只要是由特定波长的光照射就发出荧光的物质即可，没有特殊的限制，可以从用于FCS或FIDA等的荧光色素中恰当的选择使用。另外，可以通过常规方法实施荧光物质对核酸探针的标记。
另外，通过利用被与荧光性双链核酸结合物质之间产生FRET的荧光物质标记的核酸探针，可以区别检测包含核酸探针的缔合体与单独存在的核酸探针。即，荧光性双链核酸结合物质和标记核酸探针的荧光物质中的任一者作为FRET的能量供体，另一者作为所述FRET的能量受体。自单独存在的第1核酸探针等核酸探针中，检测到由标记所述核酸探针的荧光物质发出的荧光。与此相对，缔合体中由于结合了荧光性双链核酸结合物质，自缔合体中检测到基于FRET而发出的荧光，其结果是可以与单独存在的核酸探针区别检测。
作为与双链结构特异地结合的荧光性双链核酸结合物质，可列举出荧光性嵌入剂或结合了荧光物质的沟结合剂等。此外，当进入缔合体的碱基对之间的荧光性嵌入剂的量过多时，检测自FRET发出的荧光时的背景变得太高，存在影响检测精度的可能性。因此，优选将核酸探针设计成在缔合体中形成双链的区域为400bp以下。
此外，本实施方式也可以使用两条以上核酸探针检测靶核酸分子。例如，设计成两条核酸探针以相对于靶核酸分子相邻的状态特异地杂交。特异地杂交的两条核酸探针中，一条核酸探针用荧光物质标记，另一条核酸探针用与标记前者的核酸探针的荧光物质之间产生FRET的荧光物质或猝灭物质进行标记。通过将两条核酸探针分别进行标记，能够将包含核酸探针的缔合体与单独存在的核酸探针区别而进行检测。即，两条核酸探针相邻地杂交在靶核酸分子上，所以由这3者形成的缔合体引起FRET。因此，通过检测自该FRET发出的荧光，能够检测包含核酸探针的缔合体。
本实施方式的核酸分子的检测方法具体而言，具有下述的工序(a)～(c)，进一步具有在下述工序(c)之前从下述样品溶液中去除蛋白质的工序，或者在下述工序(a)之前从下述生物样品中去除蛋白质的工序：
(a)制备包含核酸探针和生物样品的样品溶液的工序，所述核酸探针与靶核酸分子(分析对象的核酸分子)特异地杂交。
(b)使前述工序(a)中制备的样品溶液中的核酸分子与前述核酸探针缔合的工序。
(c)在前述工序(b)之后，计算前述工序(a)中制备的样品溶液中的、包含前述核酸探针的缔合体的分子数的工序。
首先，工序(a)制备包含核酸探针和生物样品的样品溶液。具体而言，将核酸探针和生物样品添加到合适的溶剂中，制备样品溶液。该溶剂只要是以下的溶剂就没有特别的限制，可以从本技术领域中常用的缓冲液中适宜地选择。即，溶剂只要不阻碍核酸探针形成缔合体、以及通过扫描分子计数法检测缔合体即可。该缓冲液可以是例如PBS(磷酸盐缓冲生理盐水，pH7.4)等磷酸缓冲液或Tris缓冲液等。
在包含核酸探针的缔合体的检测中，当使用特异地结合双链结构的荧光性双链核酸结合物质时，与核酸探针等同样地在样品溶液中添加荧光性双链核酸结合物质。
作为供于本实施方式中的生物样品，可列举出从生物采集的组织片等。具体而言，可列举出：血液、淋巴液、骨髓液、腹水、渗出液、羊水、喀痰、唾液、精液、胆汁、胰液、尿等体液，从生物采集的组织片、粪便、肠管洗液、肺洗液、支气管洗液或者膀胱洗涤液等。另外，生物样品也可以是对细胞进行分离回收而得的细胞成分。具体而言，可列举出：从生物采集之后，通过离心分离处理、色谱法等分离回收的细胞成分、分解组织片的结缔组织而使细胞分散而成的溶液、将组织片分散之后分离回收的细胞成分等。作为该细胞成分，可列举出从血液分离回收的血浆、血清等。另外，生物样品可以为将从生物采集的组织片进行石蜡包埋之后，将制作的石蜡块或其切片进行脱石蜡而得到的样品。需要说明的是，从生物的采集、离心分离处理、色谱法、石蜡包埋以及脱石蜡可以通过常规方法进行。
生物样品也可以预先进行蛋白水解酶处理。作为该蛋白水解酶，可列举出例如蛋白酶K等。需要说明的是，通常作为前处理进行蛋白水解酶处理的情况下，在酶反应后进行该酶的失活处理。例如，在蛋白酶K的情况下，通常在50～60℃下进行30分钟～数小时的酶反应之后，在70℃下进行5～15分钟的失活处理。然而，本实施方式中可以省略该失活处理。
其次，工序(b)中，使工序(a)中制备的样品溶液中的核酸分子缔合。当样品溶液中的核酸分子是双链核酸分子时，优选在缔合前使其变性。在本实施方式中，“使核酸分子变性”是指使碱基对解离。例如，使单链核酸分子中彼此互补的碱基序列所形成的碱基对解离，解开分子内结构成为单链结构，或使双链核酸分子成为单链核酸分子。此外，当核酸探针是包含PNA等核酸类似物的寡核苷酸时，即使核酸分子是双链核酸分子，即使不进行特别的变性处理，有时也可以形成包含该核酸探针的缔合体。
在本实施方式中，由于对荧光物质的影响较小，优选通过高温处理进行变性(热变性)或通过低盐浓度处理进行变性。特别是，由于操作简单，优选进行热变性。具体而言，热变性是通过高温处理该样品溶液，可以使所述样品溶液中的核酸分子变性。通常，DNA能够在90℃下通过数秒至2分钟程度保温而变性。另外，通常RNA能够在70℃下通过数秒至2分钟程度保温而变性。然而，对于使核酸分子变性的温度，根据靶核酸分子的碱基的长度等，变性的温度千差万別，只要能够变性，则不限于上述温度。另一方面，通过低盐浓度处理进行的变性可以是例如利用纯水等稀释将该样品溶液的盐浓度调整至足够低，从而进行。
本实施方式中，在根据需要变性后，使前述样品溶液中的核酸分子缔合。当进行热变性时，在高温处理后，使该样品溶液的温度降至核酸探针能够与靶核酸分子特异地杂交的温度，能够使该样品溶液中的核酸分子恰当地缔合。另外，当通过低盐浓度处理进行变性时，通过添加盐溶液等，使该样品溶液的盐浓度升高至核酸探针能够与靶核酸分子特异地杂交的浓度，能够使该样品溶液中的核酸分子恰当地缔合。
需要说明的是，可以根据由靶核酸分子与核酸探针组成的缔合体的熔解曲线，求出核酸探针能够与靶核酸分子特异地杂交的温度。可以例如，使仅含有核酸探针和靶核酸分子的溶液的温度从高温向低温变化，测定该溶液的吸光度或荧光强度来求出熔解曲线。根据所获得的熔解曲线，从变性的核酸探针和靶核酸分子开始形成缔合体的温度至几乎全部成为缔合体的温度这一范围内的温度，都可以作为核酸探针能够与靶核酸分子特异地杂交的温度。也可以用使溶液中的盐浓度自低浓度向高浓度变化来代替温度，同样地确定熔解曲线，求出核酸探针能够与靶核酸分子特异地杂交的浓度。
通常可以用Tm值(熔解温度)，代替核酸探针能够与靶核酸分子特异地杂交的温度。例如，利用普遍使用的引物/探针设计软件等，根据核酸探针的碱基序列信息，能够计算与靶核酸分子杂交的区域的Tm值(双链DNA的50%解离为单链DNA的温度)。在本实施方式中，优选使样品溶液的温度降低至核酸探针中的具有与靶核酸分子互补的碱基序列的区域的Tm值±3℃的温度左右。
此外，为了抑制非特异地杂交，在形成缔合体时，优选使样品溶液的温度较缓慢地下降。例如，使样品溶液温度为70℃以上而使核酸分子变性后，可以按0.05℃/秒以上的降温速度，降低所述样品溶液的液温。
此外，为了抑制非特异地杂交，优选在工序(c)之前预先在样品溶液中添加表面活性剂、甲酰胺、二甲亚砜或尿素等。这些化合物可以只添加一种，也可以组合添加2种以上。通过预先添加这些化合物，可以在较低温度环境下也不易发生非特异地杂交。这些化合物也可以在工序(a)中制备样品溶液时包含于样品溶液中。另外，这些化合物可以在工序(b)之后、工序(c)之前添加至样品溶液中。
在通过扫描分子计数法的测定中，以生物样品中所含的具有自身荧光的蛋白质为代表的各种各样的杂质成为非特异的信号的产生或阻挡透过的光路等障碍的原因。本实施方式中，在去除了来源于生物样品的蛋白质的状态下进行工序(c)中的通过扫描分子计数法的测定，所以来源于生物样品的杂质的影响被显著地抑制，能够精度良好地检测低浓度的靶核酸分子。
来源于生物样品的蛋白质的去除可以在工序(c)中的通过扫描分子计数法的测定之前进行。例如，本实施方式中，可以在工序(a)中将从生物采集后进行了蛋白质的去除处理的生物样品与核酸探针混合而制备样品溶液。另外可以在工序(a)之后、工序(b)之前，对样品溶液进行蛋白质的去除处理。另外，也可以在工序(b)之后、工序(c)之前，对于样品溶液进行蛋白质的去除处理。本实施方式能够削减样品制备的麻烦、时间，所以在以下的情况下，优选对样品溶液进行蛋白质的去除处理，更优选在工序(a)之后、工序(b)之前对样品溶液进行蛋白质的去除处理；
˙在工序(a)之后、工序(b)之前的情况。
˙在工序(b)之后、工序(c)之前的情况。
蛋白质的去除处理可以从该技术领域中公知的手法中适宜选择而使用。例如，使与核酸探针混合前的生物样品、工序(a)中制备的样品溶液、或者工序(b)后的样品溶液(以下，生物样品等)与无机支撑体接触，由此使生物样品等中所含的核酸分子吸附于该无机支撑体之后，使吸附的核酸分子从无机支撑体脱附，由此得到去除了蛋白质的生物样品等。
该无机支撑体可以使用能够吸附核酸分子的已知的无机支撑体。另外，对于该无机支撑体的形状没有特别的限定，既可以为粒子状也可以为膜状。作为该无机支撑体，例如有：二氧化硅凝胶、二氧化硅质氧化物、玻璃、硅藻土等含二氧化硅颗粒(珠)；尼龙、聚碳酸酯、聚丙烯酸酯、硝基纤维素等多孔膜等。使吸附的核酸分子从无机支撑体脱附的溶剂，可以适宜使用为了将核酸分子从这些公知的无机支撑体脱附而通常使用的溶剂。作为该用于脱附的溶剂，特别优选纯化水。需要说明的是，优选将吸附了核酸分子的无机支撑体使用适当的洗涤缓冲液进行洗涤之后，使核酸分子从该无机支撑体脱附。
本实施方式中，进行蛋白质的去除处理之前，也可以使生物样品等中所含的蛋白质变性。蛋白质的变性可以使用公知的手法而进行。例如，通过对生物样品等添加离液盐、有机溶剂、表面活性剂等通常用作蛋白质变性剂的化合物，能够使生物样品等中的蛋白质变性。对生物样品等添加离液盐、有机溶剂、表面活性剂等的情况下，既可以添加1种化合物，也可以添加2种以上的化合物。作为生物样品等中能够含有的离液盐，可列举出例如：盐酸胍、异硫氰酸胍、碘化钠、高氯酸钠以及三氯乙酸钠等。作为生物样品等中可以含有的表面活性剂，优选非离子性表面活性剂。作为该非离子性表面活性剂，例如有Tween80、CHAPS(3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐)、TritonX-100、Tween20等。作为生物样品等中可以含有的有机溶剂，优选苯酚。苯酚既可以为中性也可以为酸性。使用酸性的苯酚的情况下，能够选择地用水层提取RNA而不是DNA。
变性的蛋白质可以例如通过离心分离使变性蛋白质沉淀、只回收上清而去除。另外，添加氯仿利用涡流机等充分地搅拌混合之后进行离心分离，使变性蛋白质沉淀而只回收上清，相比于简单地进行离心分离的情况，能够更完全地去除变性蛋白质。也可以使得到的上清与前述无机支撑体进一步地接触，进一步进行蛋白质去除处理。
此外，生物样品为如血浆、血清等蛋白质含量比较少的生物样品的情况下，使用蛋白质去除剂使蛋白质聚集之后，利用固液分离处理回收液体成分，由此能够去除蛋白质。具体而言，对生物样品添加蛋白质去除剂之后，通过搅拌或静置使蛋白质聚集之后，进行离心分离处理而回收上清。作为蛋白质去除剂，例如可以使用离子交换树脂等对于蛋白质亲和性高的物质。
之后，本实施方式中，作为工序(c)，通过扫描分子计数法计算样品溶液中包含核酸探针的缔合体的分子数。具体而言，将形成了缔合体后的样品溶液设置在用于前述扫描分子计数法的光分析装置中，通过前述方法检测、分析自缔合体发出的荧光，由此计算缔合体的分子数。计算的缔合体的分子数为测定样品中所含的靶核酸分子的个数。即，通过检测该缔合体而能够检测靶核酸分子。
实施例
接着，以下示出实施例等，进一步详细说明本发明的实施方式，但本发明的实施方式不限于下列实施例等。
［试验例1］
试验例1中，使用人工合成的寡核苷酸作为单链的靶核酸分子和核酸探针，将它们添加至马全血或马血浆中制成样品，将该样品作为生物样品的模拟样品，通过扫描分子计数法检测该模拟生物样品中的靶核酸分子。
将测定中使用的靶核酸分子A和核酸探针A的碱基序列示于表1中。核酸探针A为分子信标探针。添加了下划线的碱基是在形成分子内结构时彼此杂交的区域。
[表1]
＜样品溶液的制备＞
试验例1中，将靶核酸分子A和核酸探针A在Tris缓冲液(10mMTris-HCl、1mMEDTA、100mMNaCl、pH8.0)中进行混合使其分别为50pM，由此制备50pM核酸探针溶液。另外，将靶核酸分子A和核酸探针A在前述Tris缓冲液中进行混合使其分别为5pM，由此制备5pM核酸探针溶液。将得到的核酸探针溶液进行95℃下10分钟、70℃下10分钟、60℃下10分钟、50℃下10分钟、20℃下10分钟的退火处理，形成由靶核酸分子A和核酸探针A组成的缔合体。
另一方面，使用核酸提取试剂盒(产品名：QIAampDNAMicrokit、QIAGEN公司制造)由50μl的马全血或50μl的马血浆制备核酸提取液。该核酸提取液相当于本发明的实施方式中的蛋白质去除处理后的生物样品。另外，利用核酸提取试剂盒处理前的马全血或马血浆相当于蛋白质去除处理前的生物样品。
向制备的核酸提取液中，分别添加各50μl的、退火处理后的50pM核酸探针溶液或5pM核酸探针溶液，制备样品溶液(样品制备(＋))。另外，向50μl的马全血和50μl的马血浆中分别添加各50μl的、退火处理后的50pM核酸探针溶液或5pM核酸探针溶液，制备样品溶液(样品制备(-))。进一步，作为对照，向50μl的前述Tris缓冲液中分别添加各50μl的、退火处理后的50pM核酸探针溶液或5pM核酸探针溶液，制备样品溶液(对照)。
＜通过扫描分子计数法计数＞
试验例1中，通过扫描分子计数法计数各样品溶液中的由靶核酸分子A和核酸探针A形成的缔合体的分子数。具体而言，在测量中，光分析装置使用具有共聚焦荧光显微镜的光学系统和光子计数系统的单分子荧光检测装置MF20(OlympusCorporation)，获得上述各样品溶液的按照时间顺序的光子计数数据。此时，使用543nm的激光作为激发光，在转动速度6,000rpm、300μW下照射。另外，检测光波长使用带通滤波器设为560～620nm。从雪崩光电二极管获得的信号的BINTIME为10μ秒，测定时间为2秒。
用Savinzky-Golay算法将由测定获得的按照时间顺序的数据进行平滑化以后，通过微分进行峰检测。从视为峰的区域中，提取可以拟合为高斯函数的区域作为信号。
将计数结果示于图8和表2中。图8中，各浓度表示各样品溶液中的靶核酸分子A的浓度。没有添加生物样品的样品溶液(对照)中计数的峰数为不受来源于生物样品的杂质造成的影响的、可靠性高的计数结果。添加了没有进行蛋白质去除处理的生物样品的样品溶液(样品制备(-))的情况下，在血液和血浆两者中，峰数显著地多于样品溶液(对照)，且与样品溶液中的靶核酸分子的个数无关。可以认为这是因为，由于生物样品中的杂质，在扫描分子计数法测定中产生了非特异的信号，峰增加。与此相对，添加了进行了蛋白质去除处理的生物样品的样品溶液(样品制备(＋))的情况下，计数了与没有添加生物样品的样品溶液(对照)相同程度的峰数。由这些结果可知，在扫描分子计数法测定中可能成为非特异的信号的产生原因的、来源于生物样品的杂质能够通过预先进行蛋白质去除处理而被去除，能够进行更精确的测定。
[表2]
[实施例1]
实施例1中，将使用被荧光标记的引物与非标记的引物通过PCR得到的PCR产物中的、由非标记的引物伸长的单链核酸分子作为靶核酸。将由被荧光标记的引物伸长的单链核酸分子作为核酸探针。以将它们添加至由石蜡包埋组织切片脱石蜡处理而得到的生物样品中的样品作为模拟生物样品，通过扫描分子计数法检测该模拟生物样品中的靶核酸分子。
＜靶核酸分子B和核酸探针B的制备＞
实施例1中，将质粒pUC19(TAKARABIOINC.制造)作为模板，使用TAMRA标记的寡核苷酸引物、没有被荧光物质标记的寡核苷酸引物以及PCR试剂盒(产品名：AmpliTaqGold、AppliedBiosystems公司制)，制备800bp的链长的PCR产物。使用WizardSVGelandPCRClean-UpSystem(Promega公司制造)从该PCR产物中去除未反应的寡核苷酸引物，使用电泳装置Bioanalyzer(Agilent公司制造)，通过电泳测定PCR产物的有无和浓度。使用Tris缓冲液(10mMTris-HCl、1mMEDTA、100mMNaCl、pH8.0)，制备该PCR产物的浓度分别调整为2pM、20pM或200pM的PCR产物溶液。需要说明的是，将构成该PCR产物的两条单链核酸分子中的、被荧光标记的核酸分子作为核酸探针B。另外，将没有被荧光标记的核酸分子作为靶核酸分子B。
＜样品溶液的制备＞
实施例1中，将大鼠肝脏和肾脏的4％福尔马林固定石蜡包埋组织切片通过二甲苯脱石蜡之后，添加蛋白酶K，56℃下进行10分钟酶反应处理。酶反应处理后的溶液作为蛋白酶K处理后生物样品溶液。
添加等量的蛋白酶K处理后生物样品溶液、各浓度的PCR产物溶液或者前述Tris缓冲液，分别制备PCR产物浓度为0、1、10和100pM的样品溶液(无蛋白质去除处理)。各样品溶液进一步在95℃下10分钟、55℃下10分钟之后维持室温，由此进行退火处理。
另一方面，将蛋白酶K处理后生物样品溶液进一步在70℃下进行10分钟处理之后，分别添加等量的PCR产物溶液或前述Tris缓冲液，分别制备PCR产物浓度为0、1、10和100pM的样品溶液。对于各样品溶液，进一步，与样品溶液(无蛋白质去除处理)同样地进行退火处理。之后，使用核酸纯化试剂盒(产品名：MinElutePCRpurificationkit、QIAGEN公司制)，将前述退火处理后的样品溶液进行纯化，将得到的核酸提取液作为测定样品(有蛋白质去除处理1)。
另外，不进行70℃下10分钟的处理，添加等量的蛋白酶K处理后生物样品溶液、各浓度的PCR产物溶液或者前述Tris缓冲液，分别制备PCR产物浓度为0、1、10和100pM的样品溶液。对于各样品溶液，进一步与样品溶液(有蛋白质去除处理1)同样地进行退火处理之后，使用核酸纯化试剂盒进行纯化，将得到的核酸提取液作为测定样品(有蛋白质去除处理2)。
作为对照，添加等量的各浓度的PCR产物溶液与前述Tris缓冲液，分别制备PCR产物浓度为0、1、10和100pM的样品溶液(对照)。对于各样品溶液，进一步，与样品溶液(无蛋白质去除处理)同样地进行退火处理。
＜通过扫描分子计数法计数＞
实施例1中，与试验例1同样地，通过扫描分子计数法将上述的各样品溶液中存在的由靶核酸分子B和核酸探针B组成的缔合体的个数进行计数。
将计数结果示于图9和表3中。进一步，图9中，将各样品溶液中的靶核酸分子的浓度与计数的峰数的关系的近似直线示于表4。没有添加生物样品的样品溶液(对照)中计数的峰数为不受来源于生物样品的杂质造成的影响的、可靠性高的计数结果。样品溶液(无蛋白质去除处理)中，与样品溶液(对照)相比，表现出极端高的值。另外，样品溶液中的靶核酸分子的浓度与被检测的峰数的关系，与样品溶液(对照)相比较，显著地丧失直线性。另一方面，样品溶液(有蛋白质去除处理1)和样品溶液(有蛋白质去除处理2)均检测出与样品溶液(对照)几乎同等的峰数，表明均能够定量地精度良好地检测测定样品中的靶核酸分子。特别是可知，省略了蛋白酶K处理后的酶失活处理的样品溶液(有蛋白质去除处理2)与样品溶液(有蛋白质去除处理1)同样地能够精度良好地检测靶核酸分子，所以通过本发明的实施方式的核酸分子的检测方法，即便在省略了酶的失活处理等情况下，也能够通过扫描分子计数法测量。
[表3]
[表4]
[实施例2]
实施例2中，将使用被荧光标记的引物与非标记的引物通过PCR得到的PCR产物中的、由非标记的引物伸长的单链核酸分子作为靶核酸。将由被荧光标记的引物伸长的单链核酸分子作为核酸探针。以将它们添加至马血浆而成的样品作为模拟生物样品，通过扫描分子计数法检测该模拟生物样品中的靶核酸分子。
＜靶核酸分子C以及核酸探针C的制备＞
实施例2中，将质粒pUC19(TAKARABIOINC.制造)作为模板，使用ATTO647N标记的寡核苷酸引物、没有被荧光物质标记的寡核苷酸引物以及PCR试剂盒(产品名：AmpliTaqGold、AppliedBiosystems公司制)，制备800bp的链长的PCR产物。使用WizardSVGelandPCRClean-UpSystem(Promega公司制造)从该PCR产物中去除未反应的寡核苷酸引物，使用电泳装置Bioanalyzer(Agilent公司制造)，通过电泳测定PCR产物的有无和浓度。使用Tris缓冲液(10mMTris-HCl、1mMEDTA、100mMNaCl、pH8.0)，制备该PCR产物的浓度分别调整为2pM、20pM或200pM的PCR产物溶液。需要说明的是，将构成该PCR产物的两条单链核酸分子中的、被荧光标记的核酸分子作为核酸探针C。另外，将没有被荧光标记的核酸分子作为靶核酸分子C。
＜样品溶液的制备＞
实施例2中，向1.5ml的管中各添加等量的马血浆、与实施例1中制备的2pM、20pM或200pM的PCR产物溶液或者前述Tris缓冲液，分别制备2管PCR产物浓度为0、1、10和100pM的样品溶液100μl。
各2管制备的样品溶液中，向1管中加入蛋白质去除剂(产品名：BindPro(注册商标)、BiotechSupportGroup公司制)200μl，使之悬浮。向另一者中加入PBS(pH7.2)200μl使之悬浮。之后，将各样品溶液静置10分钟之后，16,000×g下进行5分钟离心分离处理，分取上清。
＜通过扫描分子计数法计数＞
实施例2中，使用633nm的激光作为激发光，将检测光波长使用带通滤波器设定为660～710nm，除此以外，与试验例1同样地，通过扫描分子计数法，将上述的各上清中存在的由靶核酸分子C和核酸探针C形成的缔合体的个数进行计数。
将计数结果示于图10和表5中。图10中，“没有去除”表示添加PBS代替蛋白质去除剂而成的样品溶液的结果(无蛋白质去除处理)。另外，图10中，“有去除”表示添加了蛋白质去除剂的样品溶液的结果(有蛋白质去除处理)。
另外，图10中，浓度表示各样品溶液中的靶核酸分子的浓度。结果，没有进行蛋白质去除处理的样品溶液中，峰数均显著地变多，且与靶核酸分子的浓度无关。与此相对，进行了蛋白质去除处理的样品溶液中，靶核酸分子的浓度为0pM的情况下，几乎检测不到峰，并且确认1～100pM下，峰数的增加依赖靶核酸分子的浓度。由这些结果可知，通过扫描分子计数法进行测定之前，通过进行来源于生物样品的蛋白质的去除处理，非特异的信号消失，能够精度良好地检测靶核酸分子。
[表5]
产业上的可利用性
根据上述核酸分子的检测方法，将样品溶液中仅以非常低浓度存在的来源于生物样品的核酸分子，使用与该核酸分子特异地杂交的核酸探针使之特异地发光，由此通过扫描分子计数法能够进行检测。因此，能够利用于检测生物样品中的核酸分子的临床检查等领域中。
附图标记说明
1光分析装置(共聚焦显微镜)
2光源
3单模光纤
4准直仪透镜
5分色镜
6、7、11反射镜
8物镜
9微孔板
10孔(样品溶液容器)
12聚光镜
13小孔
14二次滤片
15多模光纤
16光检测器
17镜转向器
17a平台位置变化装置
18计算机

Claims (12)

1.一种核酸分子的检测方法，具有以下工序：
制备包含核酸探针和生物样品的样品溶液的工序，所述核酸探针与分析对象的核酸分子特异地杂交；
使所述制备工序中制备的样品溶液中的核酸分子与所述核酸探针缔合的工序；和
在所述缔合工序后，计算所述制备工序中制备的样品溶液中的、包含所述核酸探针的缔合体的分子数的工序；
所述方法通过如下的工序而进行：
移动所述计算工序中的所述样品溶液内的共聚焦显微镜或多光子显微镜的光学系统的光检测区域的位置的工序；
一边在所述样品溶液内部移动所述光学系统的光检测区域的位置，一边检测所述光检测区域中的由所述缔合体发出的荧光的工序；
由所述检测到的光逐个检测来自每个缔合体的光信号而逐个检测缔合体的工序，其中根据检测到的单个缔合体的具有反映光检测区域的光强度分布的略呈钟形的曲线的、光强度的时间变化，检测出一个缔合体进入了所述光检测区域；和
将所述逐个检测到的缔合体的个数进行计数而计数所述光检测区域的位置的移动中所检测到的所述粒子的个数的工序；
所述方法具有：在所述计算工序之前从所述样品溶液中去除蛋白质的工序、或者在所述制备工序之前从所述生物样品中去除蛋白质的工序。
2.根据权利要求1所述的核酸分子的检测方法，其具有：在所述缔合工序之后、所述计算工序之前，从所述样品溶液中去除蛋白质的工序。
3.根据权利要求1所述的核酸分子的检测方法，其中，如下进行由所述样品溶液或所述生物样品的蛋白质的去除：使所述样品溶液或所述生物样品中的核酸分子吸附于无机支撑体之后，使吸附的核酸由无机支撑体脱附。
4.根据权利要求1所述的核酸分子的检测方法，其中，所述生物样品在由生物采集之后进行了蛋白水解酶处理。
5.根据权利要求1所述的核酸分子的检测方法，其中，所述核酸探针是被荧光物质标记的。
6.根据权利要求1所述的核酸分子的检测方法，其中，
所述核酸探针被荧光物质标记，
在所述制备工序中，所述样品溶液中进一步包含荧光性双链核酸结合物质；
标记了所述核酸探针的荧光物质和所述荧光性双链核酸结合物质的任一者为作为荧光共振能量转移现象的能量供体的荧光物质，另一者为作为所述荧光共振能量转移现象的能量受体的物质，在所述计算工序中，由包含所述核酸探针的缔合体发出的荧光为标记了所述核酸探针的荧光物质与所述荧光性双链核酸结合物质之间产生的荧光共振能量转移现象发出的荧光。
7.根据权利要求1所述的核酸分子的检测方法，其中，
所述核酸探针是作为能量供体的荧光物质与作为能量受体的物质按照在单独存在的状态下发生荧光共振能量转移、且在与其他单链核酸分子形成缔合体的状态下不发生荧光共振能量转移的方式结合而成的，
从包含所述核酸探针的缔合体发出的荧光是由所述作为能量供体的荧光物质发出的荧光。
8.根据权利要求1所述的核酸分子的检测方法，其中，在所述移动光检测区域的位置的工序中，所述光检测区域的位置以规定的速度移动。
9.根据权利要求1所述的核酸分子的检测方法，其中，在所述移动光检测区域的位置的工序中，以比所述缔合体的扩散移动速度更快的速度移动所述光检测区域的位置。
10.根据权利要求1所述的核酸分子的检测方法，其中，所述样品溶液包含选自表面活性剂、甲酰胺、二甲亚砜和尿素组成的组中的一种以上。
11.根据权利要求1所述的核酸分子的检测方法，其中，
如下地进行所述缔合工序，
通过将所述制备工序中制备的样品溶液的温度设为70℃以上而使所述样品溶液中的核酸分子变性后，按0.05℃/秒以上的降温速度降低所述样品溶液的液温，由此使所述样品溶液中的核酸分子缔合。
12.根据权利要求1所述的核酸分子的检测方法，其中，所述核酸探针是由选自DNA、RNA和核酸类似物组成的组中的2个以上分子结合而构成的。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101865843A (zh) * 2010-05-04 2010-10-20 中国科学院深圳先进技术研究院 多组分生物标识物的检测设备和方法
CN101946180A (zh) * 2007-12-19 2011-01-12 神谷来克斯公司 单分子检测用扫描分析器和使用方法
CN102016075A (zh) * 2008-05-06 2011-04-13 凯杰有限公司 在反应中同时检测多个核酸序列

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH04337446A (ja) 1991-05-15 1992-11-25 Hitachi Ltd 微粒子計測方法、定量方法および微粒子計測装置
JP3575633B2 (ja) 1994-12-27 2004-10-13 株式会社島津製作所 核酸合成法
JP2965131B2 (ja) 1995-07-07 1999-10-18 東洋紡績株式会社 核酸結合用磁性担体およびそれを用いる核酸単離方法
EP0836090A1 (en) 1996-10-12 1998-04-15 Evotec BioSystems GmbH Method of analysis of samples by determination of the distribution of specific brightnesses of particles
US6214565B1 (en) * 1998-10-09 2001-04-10 The Regents Of The University Of California Assay for disease related conformation of a protein and isolating same
US6782297B2 (en) * 2001-05-24 2004-08-24 Eric Paul Tabor Methods and apparatus for data smoothing
JP4537053B2 (ja) * 2001-06-25 2010-09-01 ジョージア テック リサーチ コーポレーション 二重共鳴エネルギー転移核酸プローブ
AU2002318631B2 (en) * 2001-07-09 2007-08-02 Asahi Kasei Kabushiki Kaisha Method of purifying nucleic acid using nonwoven fabric and detection method
US20030092090A1 (en) * 2001-11-14 2003-05-15 Kiamars Hajizadeh Rapid prion-detection device, system, and test kit
JP2005098876A (ja) 2003-09-25 2005-04-14 Institute Of Physical & Chemical Research ２成分相互作用分析方法
US20050287616A1 (en) * 2004-06-29 2005-12-29 Gross Adam F Method of assaying denaturation of proteins
US20070099227A1 (en) * 2004-10-12 2007-05-03 Curry Bo U Significance analysis using data smoothing with shaped response functions
JP2006187221A (ja) 2005-01-04 2006-07-20 Toyobo Gene Analysis:Kk 全血試料の前処理方法及び核酸増幅方法
MX2007009124A (es) * 2005-01-31 2007-10-08 Univ Illinois Metodos y dispositivos para caracterizar particulas en medios transparentes y turbios.
JP4757103B2 (ja) 2005-06-13 2011-08-24 学校法人関西文理総合学園 試料中のウイルスを検出する方法およびシステム
US8067208B2 (en) * 2005-06-30 2011-11-29 Roche Molecular Systems, Inc. Probes and methods for hepatitis C virus typing using multidimensional probe analysis
JPWO2007010803A1 (ja) * 2005-07-15 2009-01-29 オリンパス株式会社 光測定装置
JP5473202B2 (ja) 2006-10-13 2014-04-16 滋賀県 試料中の蛍光性物質を検出する方法およびシステム
WO2008080417A1 (en) 2006-12-28 2008-07-10 Flult Biosystems Gmbh A method of determining characteristic properties of a sample containing particles
JP2008292371A (ja) 2007-05-25 2008-12-04 Institute Of Physical & Chemical Research 蛍光相関分光による複数成分相互作用の分析方法及び相互作用制御化合物のスクリーニング方法
EP2291539B1 (en) * 2008-06-25 2018-03-14 Okura, Michael Apparatus for melting curve analysis of nucleic acids in microarray format
JP2010044714A (ja) 2008-08-18 2010-02-25 Hataguchi Masahiro 業務管理システム及び業務管理方法
US9182395B2 (en) * 2008-12-25 2015-11-10 Universal Bio Research Co., Ltd. Method for pretreating specimen and method for assaying biological substance
KR101083420B1 (ko) * 2008-12-30 2011-11-14 한국과학기술연구원 유방암 진단용 빈쿨린 자가항체 및 이를 이용한 진단키트
JP5265408B2 (ja) * 2009-02-18 2013-08-14 オリンパス株式会社 相関分光分析方法及び相関分光分析装置
JP2011002415A (ja) * 2009-06-22 2011-01-06 Olympus Corp 蛍光相関分光装置
JP2011036150A (ja) * 2009-08-07 2011-02-24 Olympus Corp 標的核酸分子の定量方法及び標的核酸分子定量キット
WO2011108369A1 (ja) * 2010-03-01 2011-09-09 オリンパス株式会社 光分析装置、光分析方法並びに光分析用コンピュータプログラム
WO2012014778A1 (ja) * 2010-07-26 2012-02-02 オリンパス株式会社 発光プローブを用いて溶液中の希薄粒子を検出する方法
JP6009944B2 (ja) * 2011-01-26 2016-10-19 オリンパス株式会社 核酸分子の多型識別方法
WO2012102260A1 (ja) * 2011-01-26 2012-08-02 オリンパス株式会社 核酸分子の多型識別方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101946180A (zh) * 2007-12-19 2011-01-12 神谷来克斯公司 单分子检测用扫描分析器和使用方法
CN102016075A (zh) * 2008-05-06 2011-04-13 凯杰有限公司 在反应中同时检测多个核酸序列
CN101865843A (zh) * 2010-05-04 2010-10-20 中国科学院深圳先进技术研究院 多组分生物标识物的检测设备和方法

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