KR101088885B1 - 바이오프로브, 그 제조방법, 상기를 사용한 분석 장치 및 분석 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 기판; 및 상기 기판의 표면에 부착된 무기 나노입자를 포함하는 바이오프로브, 그 제조방법, 상기를 사용한 분석 장치 및 분석 방법에 관한 것이다. 본 발명의 바이오프로브에서는 기판에 도입된 무기 나노입자가 항체 등과 같은 표적지향성 물질이 결합될 수 있는 링커로서의 역할을 수행하면서, 기판 자체의 비표면적을 증가시켜 검출하려는 표적 물질이 기판과 접촉할 수 있는 비표면적을 증가시킬 수 있으며, 이에 따라 각종 바이오분자 또는 기타 화학물질의 검출, 정량 또는 분석 등에 효과적으로 이용될 수 있다.

바이오프로브, 표적지향성 물질, 금 나노입자, 아민기, 티올기

Description

바이오프로브, 그 제조방법, 상기를 사용한 분석 장치 및 분석 방법{Bioprobes, preparation method thereof, analysis apparatus and method using the same}

본 발명은 바이오프로브, 그 제조 방법, 상기를 사용한 분석 장치 및 분석 방법에 관한 것이다.

나노기술(NT; Nano Technology)은 물질을 원자 또는 분자 수준에서 조절 및 제어하는 기술로서 신물질이나 신소자의 창출에 적합하기 때문에, 그 응용분야가 전자, 재료, 통신, 기계, 의약, 농업, 에너지 및 환경 분야 등 매우 다양하다.

이와 같은 나노기술은 현재 다양하게 발전하고 있으며, 크게 세 가지 분야로 분류되어 있다. 첫째, 나노소재로 극미세한 크기의 새로운 물질과 재료를 합성하는 기술에 관한 것이다. 둘째, 나노소자인데 나노크기의 재료들을 조합하거나 배열하여 일정한 기능을 발휘하는 장치를 제조하는 기술에 관한 것이다. 셋째, 나노기술을 생명공학 분야에 응용하는 나노-바이오 기술에 관한 것이다.

나노-바이오 기술에서 나노입자는, 나노스케일에서 도출되는 독특한 특성 및 각종 유기/무기 화합물을 사용하여 기능화가 용이하다는 특색으로 인해, 각종 질병과 관련된 바이오분자의 검출, 정량 및 분리 등에 다양하게 적용되고 있다.

예를 들면, 한국공개특허 제2008-0011856호는 각종 생체 분자와 특이적으로 결합하는 단일가닥핵산 및 상기 단일가닥핵산과 복합체를 형성할 수 있는 금 나노입자 등을 사용하여, 표적 물질을 분석하는 방법을 개시하고 있다. 금 나노입자는 수용상 등의 매질에서 잘 분산되어 있을 때는 적색을 띄게 되지만, 입자가 모여서 집합체가 되었을 때는 보라색으로 변하게 되는데, 상기 기술에서는 이와 같은 원리를 이용하여 금 나노 입자 표면에 단일가닥 핵산을 붙이고, 생체 분자를 반응시킴으로써, 금 나노 입자들의 집합을 유발시켜 용액의 색 변화를 통하여 분석효과를 가져 올 수 있게 한다.

또한, 한국공개특허 제2008-0060841호는 금 나노입자가 분산되어 결합된 기질을 인 시투를 제조하여, 금 나노입자를 기질 상에 3차원적으로 분포시킨 다음, 이러한 3차원적인 분포에 의해 고정화되는 생분자, 특히 단백질의 고밀도화 고정화를 가능하게 하는 기술을 개시하고 있다.

그러나, 상기 기술에서는 금 나노입자가 고분자 매질 내에 분산된 상태로 존재하기 때문에, 항체 등과 같은 표적 지향성 물질의 고정이 불가능하며, 이에 따라 검출할 수 있는 표적 물질의 종류가 제한된다는 단점을 가지고 있다.

본 발명은, 다양한 표적 물질, 예를 들면 매우 작은 사이즈를 가지는 표적 물질이 아주 소량으로 존재하는 경우에도, 정밀한 검출, 정량 및 분리 등이 가능한 바이오프로브, 그 제조 방법, 상기를 사용한 분석 장치 및 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 상기 과제를 해결하기 위한 수단으로서, 기판; 및 상기 기판의 표면에 부착된 무기 나노입자를 포함하는 바이오프로브를 제공한다.

본 발명은 상기 과제를 해결하기 위한 다른 수단으로서, 기판 및 작용기 함유 화합물을 접촉시켜, 기판 상에 작용기를 도입하는 제 1 단계; 및

작용기가 도입된 기판 및 무기 나노입자를 접촉시켜, 기판 상에 상기 무기 나노입자를 결합시키는 제 2 단계를 포함하는 바이오프로브의 제조 방법을 제공한다.

본 발명은 상기 과제를 해결하기 위한 또 다른 수단으로서, 본 발명에 따른 바이오프로브; 및 상기 바이오프로브로부터 발산되는 신호를 검출할 수 있는 측정 장치를 포함하는 분석 장치를 제공한다.

본 발명은 상기 과제를 해결하기 위한 또 다른 수단으로서, (1) 본 발명에 따른 바이오프로브를 분석 대상 시료와 접촉시키는 단계; 및

(2) 상기 단계 (1)을 거친 바이오프로브로부터 발산되는 신호를 검출하는 단계를 포함하는 분석 방법을 제공한다.

본 발명의 바이오프로브에서는 기판에 도입된 무기 나노입자가 항체 등과 같은 표적지향성 물질이 결합될 수 있는 링커로서의 역할을 수행하면서, 기판 자체의 비표면적을 증가시켜 검출하려는 표적 물질이 기판과 접촉할 수 있는 비표면적을 증가시킬 수 있으며, 이에 따라 각종 바이오분자 또는 기타 화학물질의 검출, 정량 또는 분석 등에 효과적으로 이용될 수 있다.

본 발명은, 기판; 및 상기 기판의 표면에 부착된 무기 나노입자를 포함하는 바이오프로브에 관한 것이다.

이하, 본 발명의 바이오프로브를 상세히 설명한다.

본 발명의 바이오프로브는 소정 기판 상에 부착된 무기 나노입자를 포함한다. 본 발명의 바이오프로브에서 상기 무기 나노입자는 항체 등의 표적지향성 물 질이 결합될 수 있는 링커(linker)의 역할을 수행할 수 있고, 동시에 기판의 거칠기(roughness)를 증가시켜, 전체적인 비표면적(surface area)을 상승시킬 수 있다. 이에 따라, 예를 들면, 본 발명의 바이오프로브에 표적지향성 물질을 결합시켜, 각종 바이오분석(bioassay)에 적용하게 될 경우, 매우 작은 사이즈를 가지는 표적 물질(바이오분자, 세포, 또는 기타 화학물질)을 아주 소량으로 포함하는 시료로부터도, 정밀한 검출 및 분리 등이 가능하다.

본 발명에서 사용할 수 있는 기판의 종류는, 이 분야에서 일반적으로 사용되고 있는 것이라면 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 유리, 실리콘 기판, 석영, 금속 및 고분자 필름(ex. 시클로올레핀 중합체, 폴리(알킬 (메타)아크릴레이트), 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스터, 폴리아미노산, 폴리 에틸렌이민 또는 폴리 아크릴산 등) 등의 일종 또는 이종 이상을 사용할 수 있다. 본 발명에서는 보다 바람직하게는 상기 기판으로서, 유리 기판, 실리콘 기판 또는 전술한 각 기판에 실리콘 처리를 수행한 기판(ex. siliconized glass slide) 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 바이오프로브는 위와 같은 기판 상에 결합되어 있는 무기 나노입자를 포함한다. 상기 무기 나노입자는 기판에 각종 표적지향성 물질(ex. 항체)이 도입될 수 있는 링커(linker)로서의 역할을 수행할 수 있고, 또한, 기판의 표면 거칠기(surface roughness)를 증가시키는 역할을 한다. 이에 따라, 상기 무기 나노입자가 부착된 본 발명의 바이오프로브는 그 평균 조도(average roughness)가 10 nm 내지 1 ㎛인 것이 바람직하다. 상기에서 사용한 용어 『평균 조도』는 바이오 프로브의 단면 프로파일의 중심선으로부터 상기 단면 프로파일까지의 평균 높이를 의미하며, 이와 같은 평균 조도는, 예를 들면, AFM(atomic force microscope)과 같은 SPM(scanning probe microscope) 기기를 사용하여 측정할 수 있다. 본 발명에서 상기 평균 조도가 10 nm 미만이면, 기판의 표면적 증가 효과가 저하되어 바이오 분자 또는 기타 화학물질의 검출 부위가 방해될 우려가 있고, 1 ㎛를 초과하면, 바이오 분자 또는 검출 물질이 포함된 시료의 흐름에 방해가 되어 검출 효율이 감소될 우려가 있다.

본 발명의 바이오프로브에서는 또한, 상기 무기 나노입자가 기판의 단위 면적(㎛² ) 당 10 내지 50개의 양으로 존재하는 것이 바람직하다. 상기 단위면적 당 개수가 10개 미만이면, 무기 나노입자와 결합될 표적지향성 물질의 수가 감소하여, 검출 효과가 저하될 우려가 있고, 50 개를 초과하면, 비표면적 감소하는 등의 이유로 바이오프로브의 성능이 역시 저하될 우려가 있다.

한편, 본 발명에서 사용하는 용어 「무기 나노입자」는 나노스케일을 가지고, 전부 또는 주성분이 무기물로 구성된 입자를 의미한다. 이와 같은 무기 나노입자의 종류는, 기판의 표면에 노출된 상태로 결합되어, 표적지향성 물질이 결합할 수 있는 영역을 제공할 수 있는 것이라면, 그 구체적인 종류는 특별히 한정되지 않는다. 본 발명에서는 예를 들면, 상기 무기 나노입자로서 , 금속 나노입자 또는 자성 나노입자를 사용할 수 있다. 상기에서 금속 나노입자의 종류로는 금(Au) 나 노입자, 백금(Pt) 나노입자, 은(Ag) 나노입자 또는 구리(Cu) 나노입자 등을 들 수 있고, 자성 나노입자의 예로는 금속 물질, 자성 물질 또는 자성 합금을 들 수 있다. 또한, 상기에서 금속 물질의 예로는 상기 금속 나노입자와 동일한 종류를 들 수 있고, 자성 물질의 예로는 Co, Mn, Fe, Ni, Gd, Mo, MM'₂O₄ 및 M_xM_y(상기에서 M 및 M'은 각각 독립적으로 Co, Fe, Ni, Mn, Zn, Gd 또는 Cr을 나타내고, x 및 y은 각각 식 「0 < x ≤ 3」 및 「0 < y ≤ 5」를 만족한다.)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 들 수 있으며, 자성 합금의 예로는 CoCu, CoPt, FePt, CoSm, NiFe 및 NiFeCo로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 무기 나노입자는 평균입경이 1 nm 내지 100 nm, 바람직하게는 1 nm 내지 50 nm, 보다 바람직하게는 1 nm 내지 20 nm의 범위에 있을 수 있다. 상기 평균입경이 1 nm 미만이면, 표적지향성 물질 등의 결합 효율 또는 비표면적 증가 효과 등이 저하될 우려가 있고, 100 nm를 초과하면, 표면적 등이 오히려 저하하는 등 바이오프로브의 성능이 저하될 우려가 있다.

본 발명에서는 또한 상기 무기 나노입자가 아민기 및 티올기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 관능기를 매개로 기판의 표면에 결합되어 있을 수 있다. 이와 같이 무기 나노입자가 소정 관능기를 매개로 기판 상에 노출된 상태로 직접 결합되어 있음으로 해서, 기판의 비표면적을 증가시키고, 표적지향성 분자와의 결합을 위한 사이트를 제공할 수 있다. 이와 같은 관능기를 기판에 도입하는 방법은 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면, 상기 기판이 유리, 실리콘 기판 또는 실리콘 처리된 기판 등일 경우에, 전술한 관능기를 포함하는 통상의 실란 화합물로 본 발명의 기판을 처리함으로써 도입할 수 있다.

본 발명의 바이오프로브는 또한 상기 무기 나노입자에 결합된 표적지향성 물질을 추가로 포함할 수 있다. 이 경우, 본 발명의 바이오프로브에 포함되는 무기 나노입자는 상기 표적지향성 물질을 기판과 연결하는 링커로서의 역할을 수행할 수 있다.

본 발명에서 사용하는 용어 「표적지향성 물질」이란 검출하고자 하는 특정 성분과 특이적으로 결합할 수 있는 바이오분자 또는 기타 화학물질 등을 의미하는 것으로서, 그 예에는 항원, 항체, RNA, DNA, 합텐(hapten), 아비딘(avidin), 스트렙타비딘(streptavidin), 뉴트라비딘(neutravidin), 프로테인 A, 프로테인 G, 렉틴(lectin), 셀렉틴(selectin), 방사선동위원소 표지 물질, 앱타머(aptamer) 및 종양 마커(tumor marker)와 특이적으로 결합할 수 있는 물질 등의 일종 또는 이종 이상이 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 표적지향성 물질의 구체예 중, 종양 마커와 특이적으로 결합할 수 있는 물질은 본 발명의 바이오프로브가 종양과 관련된 다양한 질병, 예를 들어 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 결장암 및 자궁경부암 등의 진단에 적용될 경우에 유용하게 이용될 수 있다. 상기에서 사용하는 용어 「종양 마커」는 정상 세포에서는 거의 또는 전혀 생산되지 않는 반 면, 종양 세포에서는 특이적으로 발현 또는 분비되는 특정 물질을 의미한다. 그러한 종양 마커와 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 본 발명의 바이오프로브에 도입할 경우, 종양의 진단에 유용하게 이용할 수 있다. 당업계에는 다양한 종양 마커뿐만 아니라 이들과 특이적으로 결합할 수 있는 물질이 공지되어 있다.

종양 마커가 항원인 경우에는 상기 항원과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 본 발명에 따른 바이오프로브에 도입할 수 있으며, 그 예로는 상기 항원과 특이적으로 결합할 수 있는 수용체 또는 항체를 들 수 있다. 본 발명에서 이용 가능한 항원 및 이와 특이적으로 결합할 수 있는 수용체 또는 항체의 예로는 EGF (epidermal growth factor)와 anti-EGFR(ex. cetuximab), 시냅토타그민의 C2(synaptotagmin의 C2)와 포스파티딜세린, 아넥신 V(annexin V)와 포스파티딜세린, 인테그린(integrin)과 이의 수용체, VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor)와 이의 수용체, 안지오포이에틴(angiopoietin)과 Tie2 수용체, 소마토스타틴(somatostatin)과 이의 수용체 또는 바소인테스티날 펩타이드(vasointestinal peptide), 암성 태아성 항원(carcinoembryonic antigen - 대장암 표지 항원)과 허셉틴(Genentech, USA), HER2/neu 항원(HER2/neu antigen - 유방암 표지 항원)과 허셉틴, 전립선 특이 항원 (prostate-specific membrane antigen - 전립선암 표지 항원)과 리툭산(IDCE/Genentech, USA) 이의 수용체 등이 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.

종양 마커가 「수용체」인 대표적인 예로는 난소암 세포에서 발현되는 폴산 수용체가 있다. 상기 수용체와 특이적으로 결합할 수 있는 물질(폴산 수용체의 경 우에는 폴산)이 본 발명에 따른 바이오프로브에 도입될 수 있으며, 그 예로는 상기 수용체와 특이적으로 결합할 수 있는 항원 또는 항체를 들 수 있다.

상술한 바와 같이 항체는 본 발명에 있어서 특히 바람직한 조직 특이적 결합 물질이며, 본 발명에 있어서 항체는 다클론항체(polyclonal antibody), 단일클론항체(monoclonal antibody) 및 항체 단편을 포함한다. 항체는 특정 대상과만 선택적이고 안정적으로 결합하는 성질을 갖고 있으며, 항체의 Fc 영역에 있는 리신의 -NH2, 시스테인의 -SH, 아스파라긴산 및 글루탐산의 -COOH는 항체가 본 발명의 바이오프로브의 무기 나노입자에 결합하는데 유용하게 이용될 수 있다.

이러한 항체는 상업적으로 입수하거나 이 분야에서 공지된 방법에 따라 제조할 수 있다.

한편, 상기 「핵산」은 전술한 항원, 항원, 수용체 또는 이의 일부분을 코딩하는 RNA 및 DNA를 포함한다. 핵산은 상보적인 서열 간에 염기쌍(base pair)을 형성하는 특징을 갖고 있기 때문에 특정 염기서열을 갖는 핵산은 상기 염기서열에 상보적인 염기서열을 갖는 핵산을 이용하여 검출할 수 있다. 상기 효소, 항원, 항원 또는 수용체를 코딩하는 핵산과 상보적인 염기서열을 갖는 핵산을 본 발명에 따른 바이오프로브에 이용할 수 있다.

핵산은 5’- 및 3’- 말단에 -NH₂, -SH 또는 -COOH 등의 작용기를 가지고, 상기 작용기는 본 발명의 무기 나노입자로의 핵산의 도입에 유용하게 이용될 수 있다.

이러한 핵산은 당업계에 공지된 표준 방법, 예를 들면 자동 DNA 합성기(예, 바이오써치, 어플라이드 바이오시스템스 등으로부터 구입할 수 있는 것)를 사용하여 합성할 수 있다. 예로서, 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오타이드는 문헌(Stein et al. Nucl. Acids Res. 1988, vol.16, p.3209)에 기술된 방법에 의해 합성할 수 있다. 메틸포스포네이트 올리고뉴클레오타이드는 조절된 유리 중합체 지지체를 사용하여 제조할 수 있다(Sarin et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1988, vol.85, p.7448).

이상과 같은 본 발명의 바이오프로브를 제조하는 방법은 특별히 한정되지 않는다. 상기 바이오프로브는 예를 들면, 기판 및 작용기 함유 화합물을 접촉시켜, 기판 상에 작용기를 도입하는 제 1 단계; 및

작용기가 도입된 기판 및 무기 나노입자를 접촉시켜, 기판 상에 상기 무기 나노입자를 결합시키는 제 2 단계를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다.

상기 바이오프로브의 제조 방법의 제 1 단계는 바이오프로브에 포함되는 기판 상에 무기 나노입자가 흡착될 수 있는 영역을 제공하기 위하여, 기판을 작용기 함유 화합물과 접촉시키는 단계이다.

상기에서 사용되는 작용기 함유 화합물의 구체적인 종류는, 기판 상에 도입하고자 하는 작용기의 종류 및 기판의 재질 등을 고려하여, 자유롭게 선택될 수 있으며, 당업계에서는 이와 같은 화합물이 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 유리, 실리콘 기판 또는 실리콘화된 각종 기판 상에 아미노기를 도입하고자 할 경우에는, 아미노알킬트리알콕시 실란(ex. 아미노프로필트리메톡시 실란 또는 아미노프로필트리에톡시 실란 등) 등의 실란계 화합물을 사용하면 된다. 또한, 본 발명에서, 예를 들어, 기판 상에 티올기를 도입하고자 하는 경우에는, 머캅토알킬 트리알콕시 실란(ex. 3-머캅토프로필 트리메톡시실란 또는 3-머캅토프로필 트리에톡시실란 등) 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기와 같은 작용기 함유 화합물을 기판과 접촉시켜, 작용기를 도입하는 방법 역시 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면, 물 등의 적절한 용매 내에 상기 작용기 화합물을 분산시킨 후에, 적정한 조건에서 기판을 침지시키는 방법 등을 사용할 수 있다.

상기 바이오프로브의 제조 방법의 제 2 단계는 제 1 단계의 처리를 통해 작용기가 도입된 기판을 무기 나노입자와 접촉시켜 상기 무기 나노입자를 기판에 도입하는 단계이다.

이 때 사용될 수 있는 무기 나노입자의 종류는 전술한 바와 같으며, 이와 같은 무기 나노입자는 이 분야에서 공지된 각종 방법으로 합성될 수 있다. 예를 들어, 상기 무기 나노입자로서 금 나노입자 등의 금속 나노입자를 사용하고자 할 경우에는, 상기 나노입자를 환원법 등을 통하여 제조할 수 있으며, 또한 자성 나노입자를 사용하고자 할 경우에는, 상기 나노입자는 일반적인 열분해법(thermal decomposition) 등을 제조할 수 있다.

상기에서 환원법에 적용될 수 있는 전구체의 예로는 소듐 테트라클로로아우레이트, 소듐 테트라브로모아우레이트, 테트라클로로아우르산, 테트라브로모아우르산, 포타슘 테트라클로로아우레이트, 포타슘 테트라브로모아우레이트, 테트라클로로아우르산 수화물 또는 테트라브로모아우르산 수화물 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 환원법은 이 분야에서 공지되어 있는 각종의 환원제를 사용하여 수행될 수도 있는데, 이와 같은 환원제의 예로는 아스코르브산 등을 들 수 있다.

또한, 상기 열분해법에서 사용할 수 있는 나노입자 전구체의 구체적인 종류 역시 특별히 한정되지 않으며, 그 예로는 금속과 -CO, -NO, -C₅H₅, 알콕사이드(alkoxide) 또는 기타 공지의 리간드가 결합된 금속화합물을 들 수 있고, 구체적으로는 아이언펜타카르보닐 (iron pentacarbonyl, Fe(CO)₅), 페로센(ferrocene), 또는 망간카르보닐(Mn₂(CO)₁₀) 등의 금속 카르보닐 계열의 화합물; 또는 철 아세틸아세토네이트 (Fe(acac)₃) 등의 금속 아세틸아세토네이트 계열의 화합물 등의 각종 유기금속화합물을 사용할 수 있다. 또한 나노입자 전구체로는 금속과 Cl^-, 또는 NO₃ ^- 등의 공지된 음이온과 결합된 금속이온을 포함한 금속염을 사용할 수 있으며, 그 예로는 삼클로로화철(FeCl₃), 이클로로화철(FeCl₂) 또는 철 나이트레이트 (Fe(NO₃)₃)등을 들 수 있다. 만약, 합금 나노입자 및 복합 나노입자 등을 합성하고자 하는 경우에는 상기에서 언급한 2종 이상의 금속의 전구체의 혼합물을 사용하면 된다.

상기와 같은 환원법 또는 열분해법은, 예를 들면, 공지의 각종 용매 내에서 수행될 수도 있는데, 이러한 용매의 예로는 에테르계 화합물, 헤테로고리화합물, 방향족화합물, 술폭사이드화합물, 아마이드화합물, 알코올, 탄화수소 및/또는 물 등을 들 수 있다. 구체적으로 상기 용매는 옥틸 에테르(octyl ether), 부틸 에테르(butyl ether), 헥실 에테르(hexyl ether), 또는 데실 에테르(decyl ether)와 같은 에테르계 화합물; 피리딘, 또는 테트라하이드로퓨란(THF)과 같은 헤테로고리화합물; 톨루엔, 자일렌, 메시틸렌, 또는 벤젠과 같은 방향족화합물: 디메틸술폭사이드(DMSO)와 같은 술폭사이드화합물; 디메틸포름아마이드(DMF)와 같은 아마이드화합물; 옥틸알코올, 또는 데칸올과 같은 알코올; 펜탄, 헥산, 헵탄, 옥탄, 데칸, 도데칸, 테트라데칸, 또는 헥사데칸과 같은 탄화수소, 또는 물을 사용할 수 있다.

본 발명의 제조 방법에서 상기와 같은 무기 나노입자를 기판에 부착시키는 방법은 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면, 물 등의 적절한 용매 내에 무기 나노입자 등을 분산시킨 후에, 적절한 조건에서 기판을 침지시키는 방법 등을 사용할 수 있다. 이와 같은 과정을 거치게 되면, 예를 들면, 기판 상에 존재하는 작용기 및 무기 나노입자와의 전하밀도(electric charge density)의 차이에 의해, 무기 나노입자가 효과적으로 기판에 부착될 수 있다.

본 발명의 바이오프로부의 제조 방법에서는 또한, 상기 단계에 이어서, 무기 나노입자가 결합된 기판을 표적지향성 물질과 접촉시키는 단계를 추가로 수행할 수 있다. 이에 사용되는 표적지향성 물질의 구체적인 종류는 전술한 바와 같다. 이 때, 상기 단계에서 기판 및 물질을 접촉시켜, 표적지향성 물질을 기판의 무기 나노입자에 도입하는 방법, 역시 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면, PBS 등의 적절한 용매를 매개로 상기 기판 및 물질을 접촉시키는 방법을 사용하면 된다.

본 발명은 또한, 전술한 본 발명에 따른 바이오프로브; 및 상기 바이오프로브로부터 발산되는 신호를 검출할 수 있는 측정 장치를 포함하는 분석 장치에 관한 것이다.

전술한 바와 같이, 본 발명의 바이오프로브에서는 기판에 도입된 무기 나노입자가 항체 등과 같은 표적지향성 물질이 결합될 수 있는 링커로서의 역할을 수행하면서, 기판 자체의 비표면적을 증가시켜 검출하려는 표적 물질이 기판과 접촉할 수 있는 비표면적을 증가시키는 역할을 수행하여, 각종 바이오분자(ex. 종양 세포, 단백질, 항원, 항체, 기타 생체 고분자 등) 또는 기타 화학물질의 검출, 정량 또는 분석을 위한 장치에 효과적으로 적용될 수 있다.

본 발명의 분석 장치에 포함될 수 있는 측정 장치의 종류는 특별히 한정되지 않고, 이 분야에서 공지되어 있는 일반적인 장치를 사용할 수 있다. 예를 들면, 본 발명에서는 바이오프로브로부터 발산되는 형광 신호 등을 검출하여, 이를 통해 광학적 영상을 구현할 수 있는 장치를 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용할 수 있는 분석 장치의 구체적인 예로는, 자기공명영상 장치(MRI), 형광 현미경(epifluorescence microscope), 광학 분광계(optical spectrometry), CCD(Charge Coupled Device) 또는 CIS(CMOS Image Sensor) 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 분석 장치는 또한, 상기 바이오프로브 및 측정 장치 등이 수납될 수 있는 하우징 등의 일반적인 구성을 추가로 포함할 수 있다.

상기와 같은 본 발명의 분석 장치를 사용하여, 표적 물질을 검출, 정량 또는 분리하는 방법은 특별히 한정되지 않는다.

이와 같은 방법은 예를 들면, (1) 전술한 본 발명에 따른 바이오프로브를 분석 대상 시료와 접촉시키는 단계; 및 (2) 상기 단계 (1)을 거친 바이오프로브로부터 발산되는 신호를 검출하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 분석 방법에서 바이오프로브 및 분석 대상 시료를 접촉시키는 방법은 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 분석하고자 하는 표적 물질(ex. 암 세포, 세포, 단백질, 항원, 펩타이드, DNA, RNA 또는 바이러스 등)을 포함하는 혈장 등의 시료를, 바이오프로브 상의 표적지향성 물질 등이 상기 표적 물질과 결합할 수 있는 조건(예를 들면, 항원-항체 결합이 가능한 조건)에서 접촉시킬 수 있으며, 당업계에서는 이와 같은 조건 등이 널리 공지되어 있다.

또한, 본 발명의 방법에서 표적 물질을 포함하는 시료 및 바이오프로브를 접촉시킨 후에, 상기 바이오프로브(구체적으로는, 바이오프로브의 표적지향성 물질과 결합된 표적 물질 등)로부터 발산되는 신호를 측정하는 방법도 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 전술한 각종의 측정 장치의 일반적인 사용법을 적용하면 된다.

본 발명의 상기 분석 방법에서는 또한 전술한 단계 (1)이 분석대상 시료와 접촉된 바이오프로브를 형광 물질로 처리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

이와 같은, 단계는 바이오프로브에 결합된 표적 물질의 검출 효율을 보다 향상시키기 위하여 수행될 수 있는데, 이 때 사용될 수 있는 형광 물질의 예로는, Hoechst, FITC(Fluorescein-5-isothiocyanate), 피렌(pyrene), 프로피디움 요오드화물(Propidium iodide), RITC(Rhodamine isothiocyanate), DAPI, 로다민 B (Rhodamine B), 닐레드 (Nile red), 텍사스 레드 (Texas red), Fluoresceinamine, Alexa flour 488 , Alexa Fluor350, Oregon Green 488, Alexa Fluor 555, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 680, Cy 5.5, Cy 5 또는 Cy 3 등의 일종 또는 이종 이상을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명에서 상기와 같은 형광 물질로 바이오프로브(구체적으로는, 바이오프로브에 결합된 표적 물질)을 처리하는 방법은 특별히 한정되지 않고, 이 분야에서 공지되어 있는 일반적인 절차를 사용할 수 있다.

이하, 본 발명에 따른 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1.

첨부된 도 1에 나타난 바와 같은 과정을 거쳐, 실리콘 기판 상에 금 나노입자를 결합시키고, 상기 나노입자에 항체(Cetuximab)를 결합시켜 바이오프로브를 제 조하였다. 구체적인 과정은 하기와 같다.

금 나노입자 제조

금 나노입자는 환원제로서 NaOH(1M, 0.5 mL) 및 80 wt%의 테트라키스(히드록시메틸) 포스포니움 클로라이드(tetrakis(hydroxymethyl) phosphonium chloride)(12 ㎕, Sigma(제))의 존재 하에, 1.0 wt%의 테트라클로로아우레이트(III) 트리하이드레이트(tetrachlroloaurate(III) trihydrate(2 ml, Sigma(제))를 상온에서 7분간 환원시켜 제조하였다. 제조된 금 나노입자는 평균입경이 약 10 nm인 단분산 입자인 것을 투과전자현미경(TEM)을 통해 확인하였다(도 2, scale bar: 50 nm).

금 나노입자가 결합된 기판을 포함하는 바이오프로브의 제조

5 ml의 물에 3-아미노프로필트리메톡시실란(100 ㎕, Sigma(제))을 분산시킨 후에, 실리콘 처리된 유리슬라이드(siliconized glass slide, φ=12 mm)를 넣고, 80℃의 온도에서 24시간 동안 유지하여, 아민 작용기로 기능화된 기판을 제조하였다. 제조된 기판을 과량의 물 및 에탄올로 세척한 후에, 상기에서 제조된 금 나노입자가 분산된 물(7 × 1012 입자/ml, 5 ml)에 넣고, 가볍게 교반하면서 24 시간 동안 유지시켰다. 이어서, 기판에 결합되지 않은 금 나노입자를 충분한 물과 에탄올로 세척하여 표면에 금 나노입자가 결합된 기판을 제조하였다. 첨부된 도 3은 상기에서 제조된 기판의 FT-IR 스펙트럼을 나타낸다. 도 3에서 붉은 색 화살표로 표시된 부분은 각각 아민기의 N-H 결합의 스트레치(stretch)(3240 cm-1) 및 벤드(bend)(1650 cm-1)를 나타낸다. 첨부된 도 4는 금 나노입자가 결합되기 전의 아민기로 개질된 기판(aminated SGS) 및 상기 아민기에 금 나노입자가 결합되어 있는 기판(AuNP-SGS)의 UV-vis 흡수 스펙트럼을 나타낸다. 첨부된 도 4에 나타난 바와 같이, 금 나노입자가 결합된 기판(AuNP-SGS)의 흡수 스펙트럼은 기판 표면에 증착된 금 나노입자의 표면 플라즈마 효과(surface plasma effect)에 의해 금 나노입자가 결합되기 전의 기판(aminated SGS)와 변화를 보였으며, 520 nm의 최대흡수파장을 나타내었다. 구체적으로, 금 나노입자가 결합되기 전의 기판은 520 nm에서 흡수를 나타내지 않는 투명한 색이었으나, 금 나노입자가 결합된 기판(AuNP-SGS)는 붉은 와인색을 나타내었다. 첨부된 도 5는 또한 암시야 현미경(dark field microscope)(U-DCW, Olympus)를 사용하여 측정한 금 나노입자의 광산란 이미지를 나타낸다.

금 나노입자에 표적 지향성 항체가 결합된 바이오프로브의 제조

상기에서 제조된 금 나노입자가 결합된 기판에 표적 지향성 항체를 도입하였다. 구체적으로는 1 mg의 CET(Cetuximab, Merck)가 용해된 PBS(Phosphate-buffered saline, 10 mM, pH 7.4, Gibco(제)) 1 ml 내에 상기에서 제조된 금 나노입자-결합 기판을 4 시간 동안 담구었다. 이어서, 과량의 PBS 용액으로 금 나노입자에 결합하지 않은 CET를 제거하여, 표적지향성 항체가 결합된 바이오프로브를 제조하였다. BAC 단백질 분석 키트(Pierce)를 사용하여, 결합된 CET의 양을 정량하 였다.

시험예 1. 표면 형태 분석

실시예의 각 단계에서의 기판의 표면 분석을 위하여, 나노스코프 IV 콘트롤러(Nanoscope IV controller)(Veeco(제))를 사용하였다(tapping mode, air, room temperature). 탭핑 모델의 AFM(tapping-model AFM)을 위하여, 직사각형의 AFM 실리콘 캔틸레버(RTESP - TAP300, Metrology Probe, Veeco(제))를 사용하였고, 스캔 속도, 캔틸레버의 접촉력 등에 의한 오차를 최소화하기 위하여, 기판(SGS), 금 나노입자 결합 기판(AuNP-SGS) 및 항체 결합 기판(CET-AuNP-SGS) 표면의 분석 시에 동일한 팁(tip) 및 스캔 속도를 사용하였다. 또한, 표면의 그레인 사이즈(grain size)의 히스토그램을 얻기 위하여 AFM 데이터 분석 소프트웨어를 사용하였고, 상기 프로그램을 사용하여 AFM으로부터 수집된 데이터를 전환하였다. 첨부된 도 6은 이상의 AFM 분석 결과를 나타낸다. 첨부된 도 6의 a는 금 나노입자 및 항체가 결합되지 않은 기판(SGS)의 표면 상태, b는 금 나노입자가 결합된 기판(AuNP-SGS)의 표면 상태, c는 항체가 결합된 기판(CET-AuNP-SGS)의 표면 상태를 각각 나타내고, 도 6d는 상기 각각의 기판의 그레인 사이즈 다이어그램을 나타낸다. 도 6a 내지 6c에 나타난 바와 같이, SGS의 경우, 기판 표면의 높이차가 거의 관측되지 않았으나, 기판에 금 나노입자 및 항체가 결합될 경우에, 표면 높이 변화 및 표면 거칠기(roughness)가 변화하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 그레인 사이즈 다이어그램(도 6d)으로부터도 확인되는 바와 같이, SGS의 경우, 표면 크기 분포가 약 0.6 nm 정도였으나, AuNP-SGS의 경우 약 11.4 nm, 그리고 항체가 결합된 경우에는 약 24.0 nm로 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

시험예 2. 바이오프로브의 검출능 확인

제조된 바이오프로브의 암세포 검출능을 형광 현미경(epifluorescence microscope)(BX-21, Olympus(제)) 및 광학 분광계(optical spectrometry)(LS-55, Perkin-Elmer)을 사용하여 확인하였다. 구체적으로는, 모델 세포(model cell)(MCF7, A431, 1 × 106 cells/ml)을 배양한 후에, 12-웰 플레이트(12-well plate)(NUNC, 22 mm diameter)에서 30분 동안 항체 결합 기판(CET-AuNP-SGS)로 처리하였다. 이어서, 0.2% FBS(0.2% fetal bovine serum) 및 0.02% 나트륨 아지드(0.02% sodium azide)를 포함하는 PBS로 3회 세척하고, 암실에서 Hoechst 33258(λexcitation=350 nm, λemission=461 nm)로 4℃에서 10분 동안 배양하였다. 이어서, 배양 웰을 과량의 PBS로 3회 세척하고, 형광 현미경을 사용하여, 상피암세포(epithelial cancer cell)에 대한 검출 효율을 확인하였다. 추가로, 간암세포(live cancer cell) 검출능은 분광계를 사용하여 측정하였다. 첨부된 도 7 및 도 8은 이상의 분석 결과를 나타내는 도면이다. 도 7a는 MCF7 및 A431 세포로 각각 처리된 CET-AuNP-SGS 및 AuNP-SGS의 형광 현미경 영상을 나타낸다. 도 7a로부터 CET-AuNP-SGS는 상피성 암세포(A431 cell)를 특이적으로 검출할 수 있다는 것을 확인할 수 있다(도 7a의 blue spot은 Hoechst 33258에 의해 형광 표지(fluorescent staining)된 세포핵(cell nucleus)을 나타낸다. scale bar=100㎛). 도 7b의 (i)는 MCF7로 처리된 CET-AuNP-SGS 및 AuNP-SGS로부터의 방출광의 형광 스펙트럼, (ii)는 350 nm 파장에서 여기 후의 A431 세포, (iii)은 MCF7 및 A431 세포로 각각 처리된 CET-AuNP-SGS(red) 및 AuNP-SGS(black)의 세포 밀도를 나타낸다. 도 7b로부터 MCF7 세포로 처리된 CET-AuNP-SGS에 비하여, A431 세포로 처리된 CET-AuNP-SGS가 약 54배 높은 세포 밀도를 나타내었다.

도 1은 본 발명의 일 태양에 따른 실시예에서 조직특이적 결합성분이 결합된 바이오프로브를 제조하는 과정을 나타내는 모식도이다.

도 2는 본 발명의 실시예에서 합성된 금 나노입자의 투과전자현미경 사진이다.

도 3은 본 발명의 실시예에서 제조된 금 나노입자가 결합된 기판의 FT-IR 스펙트럼을 나타내는 도면이다.

도 4는 본 발명의 실시예에서 제조된 아민기로 개질된 기판 및 금 나노입자가 결합된 기판의 UV-vis 흡수 스펙트럼을 나타내는 도면이다.

도 5는 본 발명의 실시예에서 암시야 현미경을 사용하여 측정한 금 나노입자의 광산란 이미지를 나타낸다.

도 6은 본 발명의 실시예에서 제조된 바이오프로브의 AFM 분석 결과를 보여주는 도면이다.

도 7 및 8은 본 발명의 실시예에서 제조된 바이오프로브의 암세포 검출능 분석 결과를 나타내는 도면이다.

Claims (20)

1. 기판; 아민기 및 티올기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 작용기를 매개로 상기 기판의 표면에 결합되어 있는 무기 나노입자; 및 상기 무기 나노입자에 결합되어 있으며, 항원, 항체, RNA, DNA, 합텐, 아비딘, 스트렙타비딘, 뉴트라비딘, 프로테인 A, 프로테인 G, 렉틴, 셀렉틴, 방사선동위원소 표지 물질, 앱타머 및 종양 마커와 특이적으로 결합할 수 있는 물질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 표적지향성 물질을 포함하는 바이오프로브.
2. 제 1 항에 있어서, 기판이 유리, 실리콘 기판, 석영, 금속 또는 고분자 필름인 것을 특징으로 하는 바이오프로브.
3. 제 1 항에 있어서, 평균 조도가 10 nm 내지 1 ㎛인 것을 특징으로 하는 바이오프로브.
4. 제 1 항에 있어서, 무기 나노입자는 기판의 단위 면적당 10 내지 50개의 양으로 부착되어 있는 것을 특징으로 하는 바이오프로브.
5. 제 1 항에 있어서, 무기 나노입자는 금속 나노입자 또는 자성 나노입자인 것을 특징으로 하는 바이오프로브.
6. 제 5 항에 있어서, 금속 나노입자가 금 나노입자, 백금 나노입자, 은 나노입자 및 구리 나노입자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 바이오프로브.
7. 제 5 항에 있어서, 자성 나노입자가 금속 물질, 자성 물질 또는 자성 합금인 것을 특징으로 하는 바이오프로브.
8. 제 1 항에 있어서, 무기 나노입자는 평균입경이 1 nm 내지 100 nm인 것을 특징으로 하는 바이오프로브.
9. 삭제
10. 삭제
11. 삭제
12. 기판 및 작용기 함유 화합물을 접촉시켜, 기판 상에 아민기 및 티올기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 작용기를 도입하는 제 1 단계; 및 작용기가 도입된 기판 및 무기 나노입자를 접촉시켜, 기판 상에 상기 무기 나노입자를 결합시키는 제 2 단계 및 상기 무기 나노입자에 항원, 항체, RNA, DNA, 합텐, 아비딘, 스트렙타비딘, 뉴트라비딘, 프로테인 A, 프로테인 G, 렉틴, 셀렉틴, 방사선동위원소 표지 물질, 앱타머 및 종양 마커와 특이적으로 결합할 수 있는 물질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 표적지향성 물질을 결합시키는 제 3 단계를 포함하는 바이오프로브의 제조 방법.
13. 제 12 항에 있어서, 작용기 함유 화합물이 아미노알킬트리알콕시 실란 또는 머캅토알킬트리알콕시 실란인 것을 특징으로 하는 바이오프로브의 제조 방법.
14. 제 12 항에 있어서, 무기 나노입자가 환원법 또는 열분해법으로 제조되는 것을 특징으로 하는 바이오프로브의 제조 방법.
15. 삭제
16. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 바이오프로브; 및

    상기 바이오프로브로부터 발산되는 신호를 검출할 수 있는 측정 장치를 포함하는 분석 장치.
17. 제 16 항에 있어서, 측정 장치가 자기공명영상 장치, 형광 현미경, 광학 분광계, CCD 또는 CIS인 것을 특징으로 하는 분석 장치.
18. (1) 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 바이오프로브를 분석 대상 시료와 접촉시키는 단계; 및

    (2) 상기 단계 (1)을 거친 바이오프로브로부터 발산되는 신호를 검출하는 단계를 포함하는 분석 방법.
19. 제 18 항에 있어서, 분석 대상 시료는 암 세포, 세포, 단백질, 항원, 펩타이드, DNA, RNA 또는 바이러스를 포함하는 것을 특징으로 하는 분석 방법.
20. 제 18 항에 있어서, 단계 (1)이 분석대상 시료와 접촉된 바이오프로브를 형광 물질로 처리하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 분석 방법.

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