KR101066465B1 - 호모아이소플라베논 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는염증성 질환 또는 알레르기 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 호모아이소플라베논(homoisoflavanone)의 신규한 용도에 관한 것으로서 보다 상세하게는 화학식 1로 표시되는 호모아이소플라베논 또는 이의 염을 포함하는 염증성 질환 또는 알레르기 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 염증 발생시 생성되는 활성산소군, COX-2, 전-염증성 싸이토카인과 류코트리엔 B4 생성 및 비만세포의 탈과립을 억제하고, 동물실험에서 귀 부종 및 과각질화가 억제되는 등 염증성 질환에 효과적이고, 류코트리엔 C4, 히스타민 생성 억제, T 림프구 증식 억제 등 알레르기 질환에 효과적이므로 이들의 예방 및 치료의 목적으로 사용할 수 있다.

호모아이소플라베논, 항-염증, 항-알레르기, 치료

Description

호모아이소플라베논 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 또는 알레르기 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for preventing and treating inflammatory disease or allergic disease comprising homoisoflavanone or salt thereof as an active ingredient}

본 발명은 호모아이소플라베논(homoisoflavanone)의 신규한 용도에 관한 것으로서 보다 상세하게는 화학식 1로 표시되는 호모아이소플라베논 또는 이의 염을 포함하는 염증성 질환 또는 알레르기 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

호모아이소플라베논(homoisoflavanone)은 약난초(Cremastra appendiculata Makino)에서 유래된 물질로, chick embryo에서 혈관생성의 억제 효과를 나타내는 보고가 있고, cdc2의 발현을 억제함으로써 cell cycle arrest를 억제한다는 보고가 있으나, 이 제제의 효능 측면에서는 아직 구체적인 성과는 얻지 못한 상태이다.

염증 반응은 손상이나 박테리아, 곰팡이, 바이러스 등 외부물질의 자극에 의 해 각종 염증 매개인자 및 면역세포에 의한 효소 활성화, 염증매개물질 분비, 체액 침윤, 세포 이동, 조직 파괴 등 일련의 복합적인 생리적 반응이 일어나는 것을 말하며, 이로 인해 홍반, 부종, 발열, 통증 등과 같은 증상이 수반된다. 염증반응은 외부 감염원을 제거하고 손상된 조직을 재생하여 생명체 기능회복작용을 하지만, 항원이 제거되지 않거나 내부물질이 원인이 되는 등 염증반응이 과도하거나 지속적으로 일어나면 오히려 점막손상, 조직 파괴 등이 일어나고, 암, 자가 면역질환, 염증성 피부질환, 염증성 장질환, 관절염 등의 질환을 초래하기도 한다.

현재까지는 상기와 같은 염증성 질환의 치료를 위해서 주로 항히스타민제, 비타민 연고, 항염증제, 면역억제제, 부신피질호르몬제가 사용되어 왔다. 그러나 이러한 약물은 그 효과가 일시적인 경우가 대부분이고 부작용이 심한 경우도 많아 염증성 질환의 치료 효과가 있는 새로운 물질의 개발이 요구되고 있다. 그 예로 MERCK에서 개발되고 있는 ML-3000(licofelone)은 COX-1,2와 5-LOX의 발현을 억제하는 이중 저해제(dual inhibitor)로써, 항염증효과, 진통제, 감각과민, 이질통, 해열제, 심근경색증, 골관절염 억제효과, 위장관 부작용을 완화한다는 보고가 있다 (Kulkarni S et al., 2007; 7(3) 251-63, current topics in medicinal chemistry). 여러 식물에 있는 퀘르세틴(quercetin)은 항히스타민 작용 저해, 심장병 암예방, 항염증작용, 암유발 (전립선암, 난소암, 유방암, 위암 등) 감소, 중금속 해독 등 여러 가지 작용을 가지고 있다.

한편, 알레르기 질환이란 외부 물질(알레르겐)에 대해 개체의 면역 기전이 보통보다도 과민한 반응을 나타낼 때 유발되는 질환을 말한다. 이와 같은 알레르기 질환은 기온, 습도 등의 기후변화, 풍토, 환경오염, 직업 등에 따라 발생빈도가 높은 면역성 질환이지만 아직까지 근본적인 치료제가 개발되어 있지 못한 실정이다.

현재까지 개발되어 온 항알레르기 제제는 발작의 발단이 되는 염증 세포가 생산하는 여러 화학 전달물질들을 신호전달상의 여러 경로를 저해하는 것이 대부분이었다. 즉, 비만세포가 여러 종류의 알레르겐에 의해 탈과립되면 비만세포 내 과립에 저장되어 있던 히스타민, 헤파린 및 단백질 분해 효소 등의 화학 물질들을 유리되어 즉각적인 알레르기 반응 및 염증반응이 일어난다. 알레르기 질환의 증상을 완화시키는 치료제로는 거의 대부분이 상기와 같은 화학 물질을 저해하는 항히스타민제가 사용되고 있으며 심한 경우 스테로이드 제제가 병용 투여되고 있다. 그러나, 상기와 같은 합성 제품들은 완전한 치료를 기대할 수 없으며 장기간 사용시 그 효과가 떨어지고 전신성 부작용이 심하게 일어나는 단점이 있다.

이에 본 발명자들은 호모아이소플라베논의 생리적 기능에 대해서 연구하던 중 이들이 염증 반응이나 알레르기 반응의 억제와 같은 새로운 기능을 한다는 점을 발견하여 호모아이소플라베논을 포함하는 염증성 질환 또는 알레르기 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 호모아이소플라베논의 신규한 용도를 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 호모아이소플라베논 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 호모아이소플라베논 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 알레르기 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

이하 본 발명의 내용을 보다 상세히 설명하기로 한다.

본 발명의 약학적 조성물은 호모아이소플라베논 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 호모아이소플라베논은 각각 하기 화학식 1의 구조를 가지며, 천연으로부터 분리 정제하거나, 상업적으로 구입하여 사용하거나 또는 당 업계에 공지된 화학적 합성법으로 제조할 수 있다.

(상기 식에서 R은 H, OH 또는 OC_nH_{2n +1}(n은 1 내지 6임)이다.)

바람직하게, 호모아이소플라베논은 약난초로부터 분리/정제될 수 있다. 본 발명에 따른 호모아이소플라베논은 유기용매 추출 및 크로마토그래피 등의 당업계에서 통상적으로 사용되는 공지의 방법에 의해 추출될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 자외선 조사에 의해 유도된 세포내 활성 산소군 에 대해 호모아이소플라베논의 억제효과를 살펴보았다. 그 결과, 자외선 조사에 의해 발생한 활성 산소군이 호모아이소플라베논을 처리하는 경우 감소하였고, 이에 호모아이소플라베논이 항산화효과를 가지고 있음을 알 수 있었다 (실시예 1 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는 자외선에 의한 COX-2 발현, 자외선에 의한 전-염증성 사이토카인인 IL-6, IL-8 및 TNF-α의 발현에 대해 호모아이소플라베논의 억제효과를 살펴보았다. 그 결과, 호모아이소플라베논이 자외선의 조사에 의해 발현이 증가된 COX-2, 전-염증성 사이토카인인 IL-6, IL-8 및 TNF-α, 이에 호모아이소플라베논이 자외선 조사에 의한 염증 반응을 억제하는 효과를 가지고 있음을 알 수 있었다 (실시예 2, 3 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는 동물모델에서 자외선에 의한 염증반응 및 피부손상, 자외선에 의한 COX-2 발현, 자외선에 의한 전-염증성 사이토카인인 IL-6 및 TNF-α의 발현을 살펴보았다. 그 결과, 호모아이소플라베논이 자외선에 의한 염증반응을 완화하였으며, 발현이 증가된 COX-2, 전-염증성 사이토카인인 IL-6 및 TNF-α, 이에 호모아이소플라베논이 in vivo 상에서도 자외선 조사에 의한 염증 반응 억제하는 효과를 가지고 있음을 알 수 있었다 (실시예 4, 5 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는 비만세포주에서 포볼 12-미르스테이트 13-아세테이트와 A23187에 의한 전-염증성 인자인 루코트리엔과 사이토카인인 IL-6, IL-8 의 발현과 COX-2 발현 기작에 대해 호모아이소플라베논의 억제효과를 살펴보았다. 그 결과, 호모아이소플라베논이 포볼 12-미르스테이트 13-아세테이트와 A23187에 의해 발현이 증가된 COX-2, 핵막으로 이동된 5-LOX, 인산화된 cPLA₂, 루코트리엔 B4와 C4 그리고 전-염증성 사이토카인인 IL-6, IL-8 의 발현을 억제시켰다. 이에 호모아이소플라베논에 의해 염증 반응을 억제하는 효과를 가지고 있음을 알 수 있었다 (실시예 6, 7 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는 포볼 12-미르스테이트 13-아세테이트와 A23187에 의한 비만세포의 탈과립(degranulation)에 대해 호모아이소플라베논의 억제효과를 살펴보았다. 그 결과, 호모아이소플라베논이 포볼 12-미르스테이트 13-아세테이트와 A23187에 의한 탈과립을 억제하고 또한 항원(IgE)에 의한 비만세포의 탈과립을 억제시켰다. 이에 호모아이소플라베논은 염증 반응을 억제하는 효과를 가지고 있음을 알 수 있었다 (실시예 8 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는 혼합림프구반응을 통해 호모아이소플라베논에 의한 T cell 증식억제 효과를 살펴보았다. 그 결과, 호모아이소플라베논의 첨가시 0.25 μg/ml 이상의 농도에서 농도의존적으로 T 세포의 증식을 효과적으로 억제함을 알 수 있었다(실시예 9 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는 자외선 조사나 크로톤 오일로 유도시킨 피부 염증 반응에 대한 호모아이소플라베논의 효과를 살펴보았다. 그 결과, 호모아이소플라베논의 농도에 비례하여 귀부종과 피부 염증 반응의 억제효과가 있었으며 그 정도가 50% 이상임을 알 수 있었다. (실시예 10 참조).

따라서, 본 발명은 호모아이소플라베논 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 호모아이소플라베논은 그 자체 또는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기에서 ‘약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 말하며, 상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하다. 상기 유리산은 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탄산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한, 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.

본 발명에 따른 화합물이 적용될 수 있는 염증성 질환은, 이에 제한되지는 않으나, 염증성 피부질환, 크론씨 질환(Crohn's desease) 및 궤양성 대장염과 같은 염증성 장 질환, 복막염, 골수염, 봉소염, 뇌막염, 뇌염, 췌장염, 외상 유발 쇼크, 기관지 천식, 알레르기성 비염, 낭포성 섬유증, 뇌졸중, 급성 기관지염, 만성 기관지염, 급성 세기관지염, 만성 세기관지염, 골관절염, 통풍, 척추관절병증, 강직성 척추염, 라이터 증후군, 건선성 관절병증, 장질환 척추염, 연소자성 관절병증, 연소자성 강직성 척추염, 반응성 관절병증, 감염성 관절염, 후-감염성 관절염, 임균성 관절염, 결핵성 관절염, 바이러스성 관절염, 진균성 관절염, 매독성 관절염, 라임 병, '혈관염 증후군'과 관련된 관절염, 결절성 다발동맥염, 과민성 혈관염, 루게닉 육아종증, 류마티스성 다발성근육통, 관절 세포 동맥염, 칼슘 결정 침착 관절병증, 가성 통풍, 비-관절 류마티즘, 점액낭염, 건초염, 상과염(테니스 엘보), 신경병증성 관절 질환(charco and joint), 출혈성 관절증(hemarthrosic), 알레르기 자반병, 비후성 골관절병증, 다중심성 세망조직구종, 수르코일로시스(surcoilosis), 혈색소증, 겸상 적혈구증 및 기타 혈색소병증, 고지단백혈증, 저감마글로불린혈증, 가족성 지중해열, 베하트 병, 전신성 홍반성 루푸스, 재귀열, 건선, 다발성 경화증, 패혈증, 패혈성 쇼크, 다장기 기능장애 증후군, 급성 호흡곤란 증후군, 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease), 류마치스성 관절염(rheumatoid arthritis), 급성 폐손상(acute lung injury) 및 기관지 폐 형성장애(broncho-pulmonary dysplasia) 등을 포함한다.

아울러, 상기 염증성 피부질환은 이에 한정되지는 않으나, 피부 염증, 급· 만성 습진, 접촉성 피부염, 아토피성 피부염, 지루성 피부염, 만성단순태선, 간찰진, 박탈 피부염, 구진상 두드러기, 편평태선, 급만성태선양 피부염, 자극성 피부염, 유건선, 장미색 비강진, 지방층염, 일광 피부염, 박탈성 피부염, 비만세포증, 건선 및 여드름 등이 포함한다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 호모아이소플라베논 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염을 단독으로 함유하거나 또는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다.

약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

본 발명의 피부질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 약학적 조성물은 경피 투여될 수 있다. 상기에서 ‘경피 투여'란 본 발명의 약학적 조성물을 세포 또는 피부에 투여하여 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 함유된 활성성분이 피부 내로 전달되도록 하는 것을 말하다. 예컨대, 본 발명의 약학적 조성물을 주사형 제형으로 제조하여 이를 30 게이지의 가는 주사 바늘로 피부를 가볍게 단자(prick)하는 방법, 또는 피부에 직접적으로 도포하는 방법으로 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.

경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포 함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042, Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기재되어 있다.

본 발명의 호모아이소플라베논의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 호모아이소플라베논의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1 ㎏ 당 약 0.001 ㎍ 내지 1,000 mg, 가장 바람직하게는 0.01 ㎍ 내지 100 mg일 수 있다. 그러나 상기 호모아이소플라베논의 용량은 약학적 조성물의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 호모아이소플라베논을 염증성 질환의 예방 또는 치료제로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.

한편, 본 발명의 호모아이소플라베논 및 이의 염은 알레르기 질환을 예방 또는 치료하는 효과를 가지고 있다. 이에 본 발명은 호모아이소플라베논 및 이의 염을 포함하는 알레르기 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기에서 “알레르기 질환”이란 인체의 어떤 물질에 대한 과민증, 즉 외부로부터 들어온 물질에 대해 신체 면역계가 과도한 반응을 일으켜서 유발되는 질환을 말한다. 상기 알레르기 질환의 예로는 이에 한정되지는 않으나 알레르기 피부염, 아토피 피부염, 알레르기성 비염, 알레르기성 천식, 아나필락틱 쇼크(anaphylatic shock) 및 알레르기성 결막염 등이 포함될 수 있다. 상기 알레르기성 피부염으로는 아토피 피부염, 접촉성 알레르기 피부염 및 알레르기성 두드러기, 약진 등이 포함될 수 있다.

상기 알레르기 질환의 예방 및 치료용 조성물의 유효성분, 제형, 유효량 등에 대해서는 염증성 질환에 대한 상기 기재를 이용하여 당업자가 적절하게 변형, 수정, 보완하여 이해될 수 있다.

따라서, 본 발명은 호모아이소플라베논 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 또는 알레르기 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 염증 발생시 생성되는 활성산소군, COX-2, 전-염증성 싸이토카인의 생성 및 비만세포의 탈과립을 억제하고, 동물실험에서도 귀 부종 및 과각질화가 억제하는 등 염증성 질환에 효과적이고, 류코트리엔 B4와 C4, 히스타민 생성 억제, T 림프구 증식 억제 등 알레르기 질환에 효과적이므로 이들의 예방 및 치료의 목적으로 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

자외선 조사에 의해 유도된 세포내 활성산소군(intracelluar ROS)에 대한 억제 효과

<1-1> 호모아이소플라베논의 세포내 활성산소군 억제 효과

인간각질형성세포(Human keratinocyte cell line)인 HaCaT 세포(독일 Cancer Research의 N. Fusenig 교수로부터 기증받음)를 60 mm의 배양접시에 5 x 10⁵ 개수의 세포(100 mm의 배양접시의 경우 1 x 10⁶ 개수의 세포)가 되도록 접종한 후, 우태아 혈청(FBS, fetal bovine serum)이 10 % 포함된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지에서 24시간 배양하였다.

배양 후 화학식 1의 호모아이소플라베논(homoisoflavanone)(R은 OCH₃임)을 1 μg/ml 농도로 1 시간 처리한 후 인산 완충액(PBS, Phosphate buffered saline)을 이용하여 세포를 3회 수세하였다. 활성산소군(ROS, reactive oxygen species)을 유발하기 위하여 자외선 램프 (FSX 24 T12/UVB/HO, pansol^TM USA )를 이용하여 100 J/m² 의 자외선을 조사하였다. 자외선 조사 직후, 세포를 다시 인산 완충액으로 수세하고 우태아 혈청이 1% 포함된 DMEM 배지에 호모아이소플라베논을 전처리 농도와 같게 처리하여 4 시간 더 배양하였다. 여기에 DCFH-DA(2,7-dichlorofliuorescin diacetate)를 25 μM의 농도로 HBSS(hank's balanceed salt solution, BioWhittaker, CAMBREX, 미국) 완충액에서 30 분간 처리한 후 인산 완충액으로 3회 수세하였다.

이렇게 처리한 세포를 형광현미경(Carl ZEISS, 미국)을 이용하여 자외선에 의해 유도된 ROS를 측정하였으며 실험 그룹은 다음과 같이 나누었다: 무처리군 - 자외선 및 호모아이소플라베논 모두 처리하지 않음; 실험군 A - 자외선은 처리하지 않고 호모아이소플라베논만 처리; 대조군 - 자외선만 처리함; 실험군 B - 각각 자외선 및 호모아이소플라베논 처리.

그 결과, 도 1 에서 보듯이, 자외선 조사 전 호모아이소플라베논을 처리한 경우(실험군 B, U+H) 자외선만을 조사한 경우(대조군, UVB 20mJ/cm²)에 비해 세포내 ROS 발생이 현저히 감소하여 호모아이소플라베논이 자외선에 의해 유도된 ROS를 억제하는 효과가 있음을 알 수 있었다. 따라서, 이러한 자외선에 의해 유도된 ROS를 억제하는 효과로 볼 때 본 발명의 호모아이소플라베논 화합물이 항산화효과를 가지고 있음을 알 수 있었다.

< 실시예 2>

자외선에 의한 COX -2 발현의 억제 효과 확인

<2-1> 호모아이소플라베논의 자외선에 의한 COX -2 발현 억제 효과

인간각질형성세포에서의 자외선에 의한 COX-2 발현에 대한 호모아이소플라베논의 효과를 알아보기 위하여 HaCaT 세포를 60 mm의 배양접시에 5 x 10⁵ 개수의 세포가 되도록 접종한 후, 우태아 혈청이 10 % 포함된 DMEM 배지에서 24 시간 배양하였다.

배양 후 우태아 혈청이 1% 포함된 DMEM 배지에서 24 시간동안 배양하여 기아상태(starvation) 만들었다. 그 후 호모아이소플라베논을 1 μg/ml 농도로 1 시간 처리한 후 인산 완충액을 이용하여 세포를 3회 수세한 다음 COX-2를 유발하기 위하여 100 J/m² 의 자외선을 조사하였다. 자외선 조사 직후, 세포를 다시 인산 완충액으로 수세하고 우태아 혈청이 1% 포함된 DMEM 배지에 호모아이소플라베논을 전처리 농도와 같게 처리하여 16 시간 더 배양하였다.

이렇게 배양된 세포에서의 COX-2 발현 정도를 알기 위하여 웨스턴 블럿(western blotting)을 다음과 같은 방법으로 실시하였다. 각각의 조건으로 처리된 시험그룹의 세포를 2 mM EDTA, 137 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM 바나듐산 나트륨(sodium vanadate), 10 mM NaF, 1 mM PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride), 1% 트리톤 X-100, 10% 글리세롤 및 프로테아제 억제제 칵테일(a protease inhibitor cocktail)이 들어있는 RIPA 완충액로 용해하여 10% 아크릴아마 이드 겔(acrylamide gel)을 이용하여 SDS-PAGE 전기영동으로 단백질을 분리하였다. 이를 나일론 멤브레인에 옮긴 후 염소 항-COX-2 항체(goat anti COX-2 antibody, santacruz, 미국)와 이차 항체인 항-염소 IgG-HRP 결합 항체(anti-goat IgG Horse Radish Peroxidase conjugation antibody, 1;10000, zymed)를 이용하여 원하는 단백질을 분리하였다. 이를 ECL (Amersham, 미국)을 이용하여 검출한 후 영상분석기인 RAS 3000 Imaging system (FUJI film, 일본)으로 형상화하였다.

그 결과, 도 2A에서 보듯이, 대조군(자외선만 처리)에서는 자외선 조사에 의해 COX-2 발현이 증가하고, 호모아이소플라베논을 처리한 후 이렇게 증가된 COX-2 발현이 감소함을 확인할 수 있었다.

<2-2> COX -2 발현 억제 기작 확인

인간각질형성세포에서 자외선 조사에 의해 유도되는 COX-2 발현을 호모아이소플라베논이 억제함에 있어 어떠한 세포내 경로를 조절하여 COX-2 발현을 억제하는지 알아보기 위해 MAPK 신호전달과정(signaling)과 전사(transcription factor) 조절인자인 NF-kB 신호전달과정(signaling)을 조사해 보았다.

MAPKs는 세포내 염증 반응(inflammation)이나 세포사멸(apoptosis) 및 암화(carcinogenesis) 등의 과정에 주로 관련되며, 자외선 조사에 의해 유도되는 세포 손상과도 관련되어 있다(Peus D, Vasa RA, Beyerle A, Meves A, Krautmacher C, Pittelkow MR. UVB activates ERK1/2 and p38 signaling pathways via reactive oxygen species in cultured keratinocytes. J Invest Dermatol 1999;112:7516). 또한 전사인자인 NF-kB도 세포 염증반응 등과 관련되어 발현되는 COX-2를 포함한 각종 세포내 인자들을 조절하는 역할을 하고 있다(Paik J, Lee JY, Hwang D. Signaling pathways for TNFa-induced COX-2 expression: mediation through MAP kinases and NFkB, and inhibition by certain nonsteroidal anti-inflammatory drugs. Adv Exp Med Biol 2002; 507: 503-508.).

이에 호모아이소플라베논에 의해 조절되는 COX-2 발현에 영향을 미치는 세포내 인자를 알아보기 위해 자외선 조사 전 호모아이소플라베논 1 μg/ml 농도로 처리한 후 자외선 조사 45 분 후 각각 토끼 항-p-cytosolic phospholipase A2 (cPLA₂) 항체, 토끼 항-cPLA₂ 항체, 토끼 항-ERK 항체, 토끼 항-p-ERK 항체, 토끼 항-p38 항체, 토끼 항-p-p38 항체(cell signaling)와 2차 항체로 항-토끼 IgG-HRP 결합 항체(zymed)를 이용한 것을 제외하고 상기 실시예 2-1과 동일하게 하여 웨스턴 블럿을 수행하였다. 이 때, 양성대조군으로 본 발명의 호모아이소플라베논 대신 각각 p38 inhibitor인 SB203580 1μM (A.G scientific, inc.) 및 MEK 1 inhibitor인 PD98059 (A.G scientific, inc.) 10μM을 처리한 군을 함께 사용하였다.

그 결과, 도 2B(cPLA₂), 2C(p38) 및 2D(ERK)에서 보듯이 cPLA₂, p38 그리고 ERK의 인산화(phosphorylation)가 호모아이소플라베논에 의해 억제됨을 확인할 수 있었다.

<2-3> COX -2 발현 억제 기작 확인

전사조절 인자인 NF-kB의 활성화 유무를 알아보기 위하여 인간 각질 세포주인 HaCaT 세포를 이용하여 면역 염색(immunocytochemistry staining)을 다음과 같은 방법으로 실시하였다.

14 mm의 배양 슬라이드에 세포를 접종한 후, 우태아 혈청이 10 % 포함된 DMEM 배지에서 24 시간 배양하였다. 배양 후 우태아 혈청이 1% 포함된 DMEM 배지에서 24 시간 배양하여 기아상태로 만들었다. 그 후 호모아이소플라베논을 1 μg/ml 농도로 1 시간 처리한 후 인산 완충액을 이용하여 세포를 3회 수세한 다음 100 J/m² 의 자외선을 조사하였다. 자외선 조사 직후, 세포를 다시 인산 완충액으로 수세하고 우태아 혈청이 1% 포함된 DMEM 배지에 호모아이소플라베논을 전처리 농도와 같게 처리하여 4 시간 더 배양한 후 세포를 메탄올로 5 분간 고정하고, 면역 염색을 실시하였다.

이렇게 고정된 세포를 10% 정상 염소 혈청(normal goat serum)을 이용하여 블로킹(blocking)한 후 인산 완충액으로 3회 수세하였다. 여기에 토끼 항NF-kB 항 체(santacruz, 미국)와 Alexa 488이 부착된 항-토끼 IgG 이차 항체(invitrogen, 미국)를 이용하여 NF-kB를 형광 염색한 후 hoechst(Sigma St. Louis, MO)로 대비 염색(counter staining)하였다.

그 결과, 도 2E에서 보듯이, NF-kB는 자외선 조사에 의해 활성화되어 핵내로 이동한 것에 비해 자외선 조사전 호모아이소플라베논을 처리한 실험군 B에서는 아무것도 처리하지 않은 무처리군 또는 호모아이소플라베논만 처리한 실험군 A과 같이 NF-kB가 세포질내에 존재하는 것으로 보아 자외선 조사에 의해 유도되는 NF-kB의 핵 내 이동을 호모아이소플라베논가 억제함을 알 수 있었다.

< 실시예 3>

자외선 조사에 의해 유도되는 전-염증성 사이토카인( pro - inflammatory cytokine ) 증가에 대한 호모아이소플라베논의 억제 효과

자외선을 조사하면 피부조직에서 IL-6(interleukin-6), IL-8 및 TNF-α(tumor necrosis factor-α) 등의 사이토카인이 증가되어 염증반응을 매개한다. 이러한 작용에 대한 호모아이소플라베논의 효과를 알아보고자 인간 각질세포주를 이용하여 아래와 같이 실험하였다.

HaCaT 세포를 100 mm의 배양접시에 1 x 10⁶ 개수의 세포가 되도록 접종한 후, 우태아 혈청이 10% 포함된 DMEM 배지에서 24 시간 배양하였다. 배양 후 우태아 혈청이 1% 포함된 DMEM 배지에서 24 시간동안 배양하여 기아상태로 만들었다. 그 후 호모아이소플라베논을 1 μg/ml 농도로 1 시간 처리한 후 인산 완충액을 이용하여 세포를 3회 수세한 다음 사이토카인(cytokine)을 유발하기 위하여 100 J/m² 의 자외선을 조사하였다. 자외선 조사 직후, 세포를 다시 인산 완충액으로 수세하고 우태아 혈청이 1% 포함된 DMEM 배지에 호모아이소플라베논을 전처리 농도와 같게 처리하여 2 또는 5 시간 더 배양하였다.

배양 후 염증반응에 영향을 주는 전-염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)의 억제 정도를 측정하기 위하여 자외선 조사에 의하여 피부에서 주로 유도되는 IL-6, IL-8 및 TNF-α의 mRNA 발현정도를 RT-PCR로 알아보았다.

각 실험군의 세포에서 트리졸(trizol, Invitrogen, USA)을 이용하여 RNA를 추출한 후, 이를 주형으로 PCR(PTC-225 peltier thermal cycler, MJ Reserch USA)을 실시하여 각 실험군의 cDNA를 제조하였다. 만들어진 각각의 cDNA를 주형으로 상용의 IL-6, IL-8 및 TNF-α 프라이머 및 실시간 PCR(Roter Gene 6000 series, Corbett Reserch, Aus)을 이용하여 IL-6, IL-8 그리고 TNF-α의 mRNA 발현정도를 측정하였다. 세포내 전-염증성 사이토카인의 mRNA 발현정도는 무처리군에 대비하여 그 발현 정도를 나타내었다.

그 결과, 도 3에서 보듯이, 실험 결과, 인간 각질세포에 자외선을 조사하는 경우(대조군) 전-염증성 사이토카인인 IL-6(인간 IL-6, hIL-6), IL-8(인간 IL-8, hIL-8) 및 TNF-α(인간 TNF-α, hTNF-α)의 발현이 증가됨을 확인할 수 있었다. 이에 반하여 호모아이소플라베논을 처리한 실험군 B에서는 이를 처리하지 않은 대조군에 비해 IL-6, IL-8 및 TNF-α의 발현이 감소함을 알 수 있었다. 따라서, 상기 결과로부터, 호모아이소플라베논이 자외선 조사에 의해 증가된 IL-6, IL-8 및 TNF-α의 발현을 현저히 감소시킴을 알 수 있었다.

< 실시예 4>

동물모델에서의 포볼 12- 미리스테이트 13-아세테이트에 의해 유도된 귀부종에 대한 호모아이소플라베논( homoisoflavanone)의 효과

인간각질형성세포인 HaCaT 세포를 이용한 시험관 세포내 실험을 동물모델에서 확인하기 위하여 털이 없는 생쥐(hairless mouse, SKH-1)를 이용하여 다음과 같이 실험을 실시하였으며 실험군은 아래과 같다: 무처리군 - 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(phorbol 12-myristate 13-acetate, TPA) 처리하지 않고 아세톤(acetone)만 처리; 실험군 A - 1 μg/ 10 μl 호모아이소플라베논 또는 50 μg/ 10 μl 덱사메타손(dexamethasone)을 처리; 대조군 - ;100 μM 포볼 12-미리스테이 트 13-아세테이트를 처리; 실험군 B -1 μg/10 μl 호모아이소플라베논 또는 50 μg/10 μl 덱사메타손과 100 μM 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트를 처리.

포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트를 처리하기 1 시간 전에 1 μg/ 10 μl 호모아이소플라베논 또는 50 μg/ 10 μl 덱사메타손을 5 μl씩 귀 앞뒤에 도포하였다. 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트를 도포한 뒤 6 시간 후에 귀 두께와 8 mm로 생검(biopsy) 한 후 귀의 무게를 쟀다.

그 결과, 도 4A 및 4B 에서 보듯이, 대조군의 생쥐(TPA)의 경우 귀의 두께와 무게가 증가했으나 호모아이소플라베논 또는 덱사메타손을 도포한 후 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트를 도포한 생쥐(실험군 B, TPA+HIF or TPA+DE)의 귀의 두께와 무게는 감소되어 있었다.

또한 전반적인 피부 조직내 변화를 살펴보기 위하여 헤마토실린-에오신(hematoxylin-eosin) 염색을 실시한 결과, 도 4C에서 보듯이 무처리군의 생쥐의 경우(TPA) 표피(epidermis)의 과각질화(hyperplasia)가 많이 일어나고 염증세포 침투가 늘어나 있던 반면 호모아이소플라베논 또는 덱사메타손을 도포한 후 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트를 처리한 생쥐(실험군 B, TPA+HIF or TPA+DE)에는 현저히 표피의 과각질화가 감소되어 있었다.

이러한 결과로 보아 호모아이소플라베논은 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트에 의해 발생한 피부 염증을 시중에 사용하고 있는 덱사메타손과 같이 효과적으로 방어할 수 있을 거라 생각되었다.

< 실시예 5>

동물모델에서의 아라키돈산(arachidonic acid)에 의해 유도된 귀부종에 대한 호모아이소플라베논의 효과

balb/c 마우스를 이용하여 다음과 같이 실험을 실시하였으며 실험군은 아래과 같다: 무처리군 - 아라키돈산(arachidonic acid)을 처리하지 않고 아세톤(acetone)만 처리 ; 대조군 - 아라키돈산을 처리; 실험군 A - 1 μg/ 10 μl 호모아이소플라베논 또는 50 μg/ 10 μl 덱사메타손과 100 mg/ml 10 μl 아라키돈산을 처리.

아라키돈산을 처리하기 1 시간 전에 1 μg/ 10 μl 호모아이소플라베논 또는 50 μg/ 10 μl 덱사메타손을 5 μl씩 귀 앞뒤에 도포하였다. 100 mg/ml 10 μl 아라키도닉 에시드를 도포한 뒤 1 시간 후에 귀두께와 8 mm로 생검한 후 귀의 무게를 측정했다.

그 결과, 도 5A 및 5B에서 보듯이, 대조군의 생쥐(AA)의 경우 귀의 두께와 무게가 증가했으나 호모아이소플라베논 또는 덱사메타손을 도포한 후 아라키돈산을 도포한 생쥐(실험군 A, AA+HIF or AA+DE)의 귀의 두께와 무게는 감소되어 있었다.

이러한 결과로 보아 호모아이소플라베논은 아라키도닉 에시드에 의해 발생한 피부 염증을 시중에 사용하고 있는 덱사메타손과 같이 효과적으로 방어 할 수 있을 거라 생각되었다.

< 실시예 6>

비만세포에서의 포볼 12- 미리스테이트 13-아세테이트와 A23187에 의하여 유도된 염증인자에 대한 호모아이소플라베논의 효과

<6-1> 호모아이소플라베논의 포볼 12- 미리스테이트 13-아세테이트와 A23187에 의한 루코트리엔( leukotriene )의 방출 억제 효과

인간 비만세포는 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트와 A23187에 의하여 탈과립(degranulation)현상이 일어나 비만세포가 원래부터 가지고 있는 히스타민이나 세로토닌 뿐만 아니라 새로 합성된 전염증성 사이토카인, 프로스타글란딘, 루코트리엔(leukotriene) 등과 같은 염증인자들을 방출시킨다. 실시예 4, 5에서 보듯이 호모아이소플라베논이 항-염증효과가 있는 것을 확인하였기 때문에 비만세포에서의 항-염증효과를 다시 확인하였다.

HMC-1에서 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트와 A23187에 의하여 유도된 루코트리엔의 방출에 대한 호모아이소플라베논의 효과를 알아보기 위하여 HMC-1 세포를 100 mm의 배양접시에 1 x 10⁶ 개수의 세포가 되도록 접종한 후, 우태아 혈청이 10 % 포함된 IMDM(Iscove's modified Dulbecco's medium, GIBCO) 배지에서 48 시간 배양하였다. 그 후 호모아이소플라베논을 2 μg/ml, 비교약물인 미졸라스틴(mizolastine) 10 μg/ml 농도로 1 시간 처리한 후 루코트리엔의 방출을 유발하기 위하여 50 nM 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트와 1 μM A23187을 처리하여 21 시간 더 배양하였다. 상층액을 모아서 방출되는 루코트리엔 B4와 C4의 양을 루코트리엔 B4, C4 enzyme immunoassay kit(sapphire bioscience, 호주)로 측정하였다.

그 결과, 도 6A에서 보듯이, 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트와 A23187에 의하여 유도된 루코트리엔 B4의 방출이 호모아이소플라베논에 의하여 70%억제되었고, 미졸라스틴에 의하여 20% 억제되었으며 호모아이소플라베논과 미졸라스틴 단독만 처리한 경우는 아무것도 처리하지 않은 군과 별다른 차이가 없었다. 도 6B에서는 루코트리엔 C4의 방출은 호모아이소플라베논과 미졸라스틴 둘 다 90%이상 억제되는 것을 확인하였다.

<6-2> 호모아이소플라베논의 포볼 12- 미리스테이트 13-아세테이트와 A23187 에 의한 전-염증성 사이토카인의 방출 억제 효과

HMC-1에서 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트와 A23187에 의하여 유도된 루코트리엔의 방출에 대한 호모아이소플라베논의 효과를 알아보기 위하여 HMC-1 세포를 60 mm의 배양접시에 5 x 10⁵ 개수의 세포가 되도록 접종한 후, 우태아 혈청이 10 % 포함된 IMDM 배지에서 48 시간 배양하였다. 그 후 호모아이소플라베논을 2 μg/ml 농도로 1 시간 처리한 후 전-염증성 사이토카인의 방출을 유발하기 위하여 50 nM 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트와 1 μM A23187을 처리하여 5 시간 더 배양하였다.

배양 후 염증 반응에 영향을 주는 전-염증성 사이토카인의 억제 정도를 측정하기 위하여 자외선 조사에 의하여 피부에서 주로 유도되는 IL-6, IL-8의 mRNA 발현정도를 RT-PCR로 알아보았다.

각 실험군의 세포에서 트리졸을 이용하여 RNA를 추출한 후, 이를 주형으로 PCR을 실시하여 각 실험군의 cDNA를 제조하였다. 만들어진 각각의 cDNA를 주형으로 상용의 IL-6, IL-8 프라이머 및 실시간 PCR을 이용하여 IL-6, IL-8의 mRNA 발현정도를 측정하였다. 세포내 전-염증성 사이토카인의 mRNA 발현정도는 무처리군에 대비하여 그 발현 정도를 나타내었다.

그 결과, 도 6C 및 6D에서 보듯이, 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트와 A23187에 의하여 유도된 IL-6, IL-8의 방출이 호모아이소플라베논에 의하여 50%억제되었다.

호모아이소플라베논은 전-염증성 인자인 루코트리엔 B4의 방출 억제 및 IL-6, IL-8의 mRNA 발현 억제 효과뿐만 아니라 항-알레르기성 인자인 루코트리엔 C4의 방출 억제효과도 있어서 항-염증 효과뿐만 아니라 항-알레르기 효과도 있을 것으로 생각되었다.

< 실시예 7>

비만세포에서의 포볼 12- 미리스테이트 13-아세테이트와 A23187에 의하여 유도된 COX -2 발현 기작에 대한 호모아이소플라베논의 효과

<7-1> 호모아이소플라베논의 포볼 12- 미리스테이트 13-아세테이트와 A23187에 의한 COX -2 발현 억제 효과

인간 비만 세포에서의 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트와 A23187에 유도된 COX-2 발현에 대한 호모아이소플라베논의 효과를 알아보기 위하여 HMC-1 세포를 100 mm의 배양접시에 1 x 10⁶ 개수의 세포가 되도록 접종한 후, 우태아 혈청이 10 % 포함된 IMDM 배지에서 48 시간 배양하였다. 그 후 호모아이소플라베논 2 μg/ml, 비교약물인 셀레콕시브(celecoxib)를 60 μM 농도로 1 시간 처리한 후 COX-2를 유발하기 위하여 50 nM 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트와 1 μM A23187을 처리하여 21 시간 더 배양하였다. 이를 염소 항-COX-2 항체 (santacruz)와 2차 항체로 항-염소 IgG-HRP 결합 항체(zymed)를 이용한 것을 제외하고 상기 실시예 2-1과 동일하게 하여 웨스턴 블럿을 수행하였다.

그 결과, 도 7A에서 보듯이 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트와 A23187로 유도된 COX-2의 발현이 호모아이소플라베논에 의해서 80%, 셀레콕시브에 의해서 50% 억제되었으며 이는 시중에 사용되고 있는 셀레콕시브보다 더 좋은 효과가 있을 것으로 사료된다.

<7-2> 호모아이소플라베논의 포볼 12- 미리스테이트 13-아세테이트와 A23187에 의한 5- LOX 의 핵막으로의 이동 억제 효과

인간 비만 세포에서의 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트와 A23187에 유도된 5-LOX의 세포질에서 핵막쪽으로의 이동에 대한 호모아이소플라베논의 효과를 알아보기 위하여 HMC-1 세포를 100 mm의 배양접시에 1 x 10⁶ 개수의 세포가 되도록 접종한 후, 우태아 혈청이 10 % 포함된 IMDM 배지에서 48 시간 배양하였다. 그 후 호모아이소플라베논 2 μg/ml 농도로 1 시간 처리한 후 5-LOX의 핵막으로의 이동을 유도하기 위하여 50 nM 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트와 1 μM A23187을 처 리하여 5 시간 더 배양하였다.

이렇게 배양된 세포에서의 5-LOX의 핵막으로의 이동을 알기 위하여 핵막단백질을 먼저 분리해주었다. 각각의 조건으로 처리된 시험그룹의 세포를 10 mM Hepes/KOH, 0.1 mM EDTA, 10% NP-40, 10mM KCl, 1 mM DTT, 0.5 mM PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride) 그리고 프로테아제 억제제 칵테일(a protease inhibitor cocktail)이 들어있는 완충액으로 얼음위에서 10분 동안 용해시킨 뒤 원심분리를 하여, 상층액(세포질 단백질) 및 펠렛(pellet, 핵막단백질)을 분리하였다. 세포질 단백질은 -80도에 보관하고, 펠렛은 10 mM Hepes/KOH, 0.1 mM EDTA, 10% NP-40, 300 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.5 mM PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride) 그리고 프로테아제 억제제 칵테일(a protease inhibitor cocktail)이 들어있는 완충액으로 얼음위에서 30분 동안 흔들어주면서 용해시킨 뒤 원심분리를 하여 상층액(핵 단백질)을 분리하였다. 이렇게 분리한 세포질 단백질과 핵단백질을 8% 아크릴아마이드 겔(acrylamide gel)을 이용하여 SDS-PAGE 전기영동으로 단백질을 분리하였다. 이를 나일론 멤브레인에 옮긴 후 토끼 항-5-LOX 항체 (cayman)와 2차 항체로 항-토끼 IgG-HRP 결합 항체(zymed)를 이용한 것을 제외하고 상기 실시예 2-1과 동일하게 하여 웨스턴 블럿을 수행하였다.

그 결과, 도 7B에서 보듯이 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트와 A23187로 유도된 5-LOX의 핵막쪽으로의 이동이 호모아이소플라베논에 의해서 억제되었으며 이로 인하여 실시예 6에서와 같이 루코트리엔의 방출이 줄어들었음을 확인하였다.

<7-3> 호모아이소플라베논의 포볼 12- 미리스테이트 13-아세테이트와 A23187에 의한 COX -2 발현/ 5-LOX 핵막으로의 이동 기작 확인

인간 비만 세포에서 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트와 A23187에 의하여 세포내의 칼슘농도가 높아짐에 따라 cPLA₂가 세포질에서 핵내로 이동함으로써 아라키돈산이 방출되고 그 아라키돈산이 COX나 LOX같은 효소에 의해서 프로스타글란딘이나 루코트리엔이 방출되어 염증반응이 일어나거나 알레르기반응이 유도된다.

비만세포에서 cPLA₂의 인산화는 ERK의 인산화에 의한 것이라는 보고가 있어서 cPLA₂와 ERK의 인산화에 호모아이소플라베논이 어떤 효과가 있는지 확인하였다.

HMC-1에서의 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트와 A23187에 유도된 COX-2 발현에 대한 호모아이소플라베논의 효과를 알아보기 위하여 HMC-1 세포를 100 mm의 배양접시에 1 x 10⁶ 개수의 세포가 되도록 접종한 후, 우태아 혈청이 10 % 포함된 IMDM 배지에서 48 시간 배양하였다. 그 후 호모아이소플라베논 2 μg/ml, 비교약물인 셀레콕시브 60 uM 농도로 1 시간 처리한 후 50 nM 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트와 1 uM A23187을 처리하여 cPLA₂의 인산화는 4 시간, ERK의 인산화는 30 분간 더 배양하였다. 각각 토끼 항-p-cytosolic phospholipase A2 (cPLA₂) 항체, 토끼 항-cPLA₂ 항체, 토끼 항-ERK 항체, 토끼 항-p-ERK 항체 (cell signaling)와 2차 항체로 항-토끼 IgG-HRP 결합 항체(zymed)를 이용한 것을 제외하고 상기 실시예 2-1과 동일하게 하여 웨스턴 블럿을 수행하였다.

그 결과, 도 7C에서 보듯이 cPLA₂의 인산화가 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트와 A23187에 의해서 일어나는데 호모아이소플라베논에 의하여 아무것도 처리하지 않은 그룹과 같은 정도로 억제되지만, ERK의 인산화에는 영향이 없는 것을 보았다. 호모아이소플라베논은 ERK의 인산화는 억제하지 않고 cPLA₂의 인산화를 억제함으로써 COX-2의 발현과 5-LOX의 핵막으로의 이동을 억제함을 알 수 있었다.

< 실시예 8>

비만세포주에서의 포볼 12- 미리스테이트 13-아세테이트와 A23187에 의하여 유도된 탈과립에 대한 호모아이소플라베논(homoisoflavanone)의 효과

인간 비만 세포에서 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트와 A23187에 의하여 탈과립 현상이 일어나며 그로 인하여 히스타민, 세로토닌같은 물질이 밖으로 방출되어 알레르기반응을 유도한다. 도 6에서 전-염증성 사이토카인이 방출되는 것도 탈과립과 관련이 되어 있기에 호모아이소플라베논이 탈과립에도 영향을 미치는지 알아보았다.

HMC-1에서의 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트와 A23187에 유도된 COX-2 발현에 대한 호모아이소플라베논의 효과를 알아보기 위하여 HMC-1 세포를 6 웰 플레이트에 1 x 10⁵ 개수의 세포가 되도록 접종한 후, 우태아 혈청이 10 % 포함된 IMDM 배지에서 48 시간 배양하였다. 그 후 호모아이소플라베논을 2 μg/ml 농도로 1 시간 처리한 후 COX-2를 유발하기 위하여 50 nM 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트와 1 uM A23187을 처리하여 6 시간 더 배양하였다. 세포를 2.5% 글루타르알데하이드(glutaraldehyde)로 고정시킨다. 액체질소로 세포를 얼려서 PCR 뚜껑에 고정시켜 열을 가하여 세포를 플레이트로부터 떼어낸 뒤 60-80 μm로 자른 뒤 그리드(grid)에 부착시킨 뒤 투과전자현미경(TEM)을 이용하여 세포를 관찰하였다.

탈과립시 방출되는 히스타민을 측정하기 위하여 세포 상층액을 일정량 모은 다음 histamine enzymeassay kit(cayman, 미국)을 이용하여 제조사의 지침에 따라서 다음과 같이 측정하였다. 먼저 항-히스타민이 코팅되어 있는 곳에 모은 상층액을 유도체화반응을 시킨 후 histamine-AChE tracer와 같이 반응시켰다. 그리고 수세용액으로 5 회 이상 수세한 후 발색용액으로 60-90 분 발색시켜 414 nm에서 흡광도를 측정하였다.

아울러, 쥐(rat) 비만 세포에서 항원(antigen)에 의한 탈과립 현상에 호모아이소플라베논이 어떤 영향을 미치는지 알아보았다. 쥐 비만세포를 6 웰 플레이트에 5 x 10⁴ 개수의 세포가 되도록 접종한 후, 우태아 혈청이 15 % 포함된 MEM 배지에서 24 시간 배양하였다. 1 μg/ml DNP-IgE 을 16시간동안 반응시켜준 뒤 PBS로 수세하여 DNP-IgE를 제거해 준 뒤 15% MEM에서 6시간 배양시켰다. 호모아이소플라베논을 tyrode's 완충액에서 30분 동안 전처리하여 준 뒤 DNP-HSA(human serum albumin) 10 ng/ml을 처리하여 항원에 유도되는 신호를 전달시켜 탈과립을 유도시켰다. 30분 뒤 상층액은 따로 모아두고 펠렛은 0.5% triton X-100 500μl로 용해시켰다. 상층액과 펠렛을 용해시킨 샘플 70 μl와 0.1M 시트르산 나트륨(soduium citrate, PH 4.5)에 녹아 있는 8 mM 파라-니트로페닐 N-아세틸-β-D-글루코사미니드(p-nitrophenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide) 70μl와 90분 동안 37℃에서 배양시킨 뒤 0.2M 글리신(glycine, PH 10.7) 70 μl를 더 첨가하여 반응을 정지시킨 뒤 흡광도 405nm에서 측정하였다. 전체 효소 활성은 다음과 같은 수식으로 측정하였다.

방출양 = (상층액 blank) ÷ ((상층액+펠렛) blank) × 100%

그 결과, 도 8A에서 보듯이 포볼 12-미르스테이트 13-아세테이트에 의해서 세포 내 물질들이 빠져나간 것이 호모아이소플라베논에 의해서 세포 내 물질이 빠져나가는 것이 억제되는 것을 알 수 있었다. 또한, 도 8B에서 보듯이 세포 내 물질 중 히스타민 방출을 확인한 결과 호모아이소플라베논에 의하여 72%가 억제되는 것을 알 수 있었다. 또한, 도 8C에서 보듯이, 쥐 비만세포에서 항원에 의한 탈과립이 호모아이소플라베논에 의하여 농도의존적으로 억제되며 2 μg/ml에서는 50%가 억제되는 것을 알 수 있었다. 따라서, 호모아이소플라베논은 비만세포의 탈과립을 억제해주는 효과가 있으므로 이는 항-알레르기 효과가 있음을 알 수 있었다.

< 실시예 9>

혼합림프구반응( Mixed Lymphocyte Reaction : MLR )에 대한 호모아이소플라베논( homoisoflavanone )의 효과

호모아이소플라베논에 의한 T cell 증식억제를 확인하기 위하여 혼합림프구반응(Mixed Lymphocyte Reaction: MLR)을 수행하였다. 각각 다른 MHC 클래스(class)를 가진 계통의 마우스의 면역세포들을 혼합 배양하면 다른 MHC를 가진 세포를 각 T 세포들이 외부 항원으로 인식하여 증식하게 된다. 그 중 한 계통에서의 반응만을 보기 위하여 한 방향(one-way) 혼합림프구반응을 수행하였다. 먼저 Balb/C와 C57B/C 마우스의 비장을 적출하여 단일 세포화 하고 적혈구를 용해시켰다. Balb/C의 비장세포에 25Gy의 γ-선를 조사하여 Balb/C의 T 세포를 무력화 하고 U-bottom 96 웰 플레이트에 Balb/C와 C57B/C의 비장세포를 각각 5 X 10⁵, 2 X 10⁵ 개씩 혼합하였다. 이 때 호모아이소플라베논을 동시에 처리하여 5% CO₂, 37℃ 조건 의 배양기에서 56 시간 배양 후 ³[H]-티미딘(thymidine)을 0.5 씩 각 웰에 추가 하여 16 시간 추가 배양하였다. 배양이 끝난 후 필터 페이퍼(filter paper)에 각 웰의 세포를 모아 바이얼(vial)에 넣고 신틸레이션(scintillation) 용액을 2 ml 추가 후 β-계수기로 CPM(count per minutes)값을 측정하였다.

그 결과, 도 9에서 보듯이, 호모아이소플라베논의 첨가시 0.25 μg/ml 이상의 농도에서 농도의존적으로 T 세포의 증식을 효과적으로 억제함을 알 수 있었다.

< 실시예 10>

동물모델에서 여러 자극(자외선, 크로톤 오일)에 의해 유도된 귀부종에 대한 호모아이소플라베논( homoisoflavanone )의 효과

<10-1> 자외선 조사에 의해 유도된 귀부종에 대한 호모아이소플라베논의 효과

balb/c 마우스를 무처리군(자외선을 처리하지 않고 아세톤(acetone)만 처리); 대조군(자외선 7.5 KJ/m²를 조사) 및 실험군(0.6 또는 1 μg/ 10 μl 호모아이소플라베논를 처리하고, 자외선 7.5 KJ/m²를 조사)으로 나눈 다음 자외선 조사에 의해 유도된 귀 부종에 대한 효과를 확인하였다.

호모아이소플라베논의 처리시 자외선 7.5 KJ/m²를 조사하기 1 시간 전에 0.6 혹은 1 μg/ 10 μl 호모아이소플라베논을 5 μl씩 귀 앞뒤에 도포하였다. 자외선을 조사한 뒤 72 시간 후에 귀 두께를 측정했다.

그 결과, 도 10A 에서는 보듯이, 대조군의 생쥐(자외선 조사를 처리)의 경우 귀의 두께가 증가했으나 호모아이소플라베논을 도포한 후 자외선을 조사한 실험군의 생쥐의 경우 귀의 두께가 44%(0.6μg/ear), 52%(1μg/ear)로 농도의존적으로 감소되어 본 발명의 호모아이소플라베논이 귀의 부종을 감소시킴을 알 수 있었다.

<10-2> 크로톤 오일에 유도된 일시적인 귀부종에 대한 호모아이소플라베논의 효과

무모 (Hairless) 생쥐를 무처리군(크로톤 오일을 처리하지 않고 아세톤만 처리); 대조군(1.6% 크로톤 오일을 처리) 및; 실험군(1 μg/ 10 μl 호모아이소플라베논과 1.6% 크로톤 오일을 처리)으로 나눈 다음 크로톤 오일에 의해 유도된 귀 부종에 대한 효과를 확인하였다.

호모아이소플라베논의 처리시 1.6% 크로톤 오일을 처리하기 1 시간 전에 1 μg/ 10 μl 호모아이소플라베논을 5 μl씩 귀 앞뒤에 도포하였다. 크로톤 오일을 처리한 뒤 6 시간 후에 귀두께를 측정했다.

그 결과, 도 10B 에서는 보듯이, 대조군의 생쥐(크로톤 오일을 처리)의 경우 귀의 두께가 증가했으나 호모아이소플라베논을 도포한 후 1.6% 크로톤 오일을 처리한 생쥐 (croton oil+HIF)의 귀의 두께가 63% 감소되었다.

이러한 결과로 보아 호모아이소플라베논은 피부의 여러 자극에 의해 발생한 피부부종 및 염증을 완화시켜줌을 알 수 있었다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 호모아이소플라베논 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 또는 알레르기 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 염증 발생시 생성되는 활성산소군, COX-2, 전-염증성 싸이토카인의 생성을 억제하고, 동물실험에서도 귀 부종 및 과각질화를 억제함으로써 여러 염증성 질환에 효과적으로 이용될 수 있으며, 류코트리엔 C4, 히스타민 생성 억제, 비만세포의 탈과립, T 림프구 증식 억제 효과가 있어 알레르기 질환의 예방 및 치료의 목적으로 사용할 수 있다.

도 1은 화학식 1의 호모아이소플라베논의 세포내 활성산소군의 억제 효과를 나타낸 것이다(Con : 무처리군; HIF- 실험군 A; UVB 20mJ/cm² : 대조군; U+H : 실험군 B).

도 2는 호모아이소플라베논의 인간 각질세포에서의 COX-2 발현 억제 효과를 나타낸 것 및 PLA2 (b) MAPK(c,d) 및 NF-κB(e) 신호전달에 미치는 영향을 나타낸 것이다(pcPLA2 : 인산화된 PLA2, pERK : 인산화된 ERK, pp38 : 인산화된 P38).

도 3은 전-염증성 사이토카인인 IL-6, IL-8, TNF-α에 대해서 호모아이소플라베논의 억제효과를 나타낸 것이다

도 4는 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트에 의해 유도된 피부손상에서의 호모아이소플라베논과 덱사메타손의 억제효과를 나타낸 것이다.

도 5는 아라키도닉 에시드에 의해 유도된 피부손상에서의 호포아이소플라베논과 덱사메타손의 억제효과를 나타낸 것이다.

도 6은 호모아이소플라베논의 인간 비만세포에서 leukotriene 방출과 전-염증성 사이토카인인 IL-6, IL-8의 억제효과를 나타낸 것이다.

도 7은 호모아이소플라베논의 인간 비만세포에서 COX-2의 발현 (a)과 5-LOX의 translocation의 억제효과 (b) , cPLA₂ (c)의 인산화 억제효과 및 ERK(c)의 인산화 유지함을 나타낸 것이다.

도 8은 호모아이소플라베논의 비만세포주에서 탈과립 억제효과를 투과전자 현미경 관찰(a), 히스타민 방출(b) 헥소사미니다아제(hexosaminidase) 방출 (c) 변화로 나타낸 것이다.

도 9는 호모아이소플라베논의 쥐의 면역세포의 T 세포증식억제 효과를 나타낸 것이다.

도 10은 호모아이소플라베논의 자극성 피부염 (UVB (a), 크로톤 오일(b))에 대한 효과를 나타낸 것이다.

Claims (6)

1. 하기 화학식 1로 표시되는 호모아이소플라베논(homoisoflavanone) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 염증성 피부 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.

   <화학식 1>

   

   (상기 식에서 R은 OCH₃이다.)
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 상기 염증성 피부질환은 피부 염증, 급·만성 습진, 접촉성 피부염, 아토피성 피부염, 지루성 피부염, 만성단순태선, 간찰진, 박탈 피부염, 구진상 두드러기, 급만성태선양 피부염, 자극성 피부염, 박탈성 피부염, 비만세포증 및 건선으로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 조성물.
4. 하기 화학식 1로 표시되는 호모아이소플라베논(homoisoflavanone) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 알레르기성 피부염 예방 및 치료용 약학적 조성물.

   <화학식 1>

   

   (상기 식에서 R은 OCH₃이다.)
5. 삭제
6. 제4항에 있어서, 상기 알레르기성 피부염은 아토피 피부염, 접촉성 알레르기 피부염, 알레르기성 두드러기 및 약진으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 조성물.

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