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KR101066465B1 - Pharmaceutical composition for preventing and treating inflammatory disease or allergic disease comprising homoisoflavanone or salt thereof as an active ingredient - Google Patents

Pharmaceutical composition for preventing and treating inflammatory disease or allergic disease comprising homoisoflavanone or salt thereof as an active ingredient Download PDF

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KR101066465B1
KR101066465B1 KR1020080086418A KR20080086418A KR101066465B1 KR 101066465 B1 KR101066465 B1 KR 101066465B1 KR 1020080086418 A KR1020080086418 A KR 1020080086418A KR 20080086418 A KR20080086418 A KR 20080086418A KR 101066465 B1 KR101066465 B1 KR 101066465B1
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homoisoflavenone
inflammatory
cells
allergic
dermatitis
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김태윤
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가톨릭대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 호모아이소플라베논(homoisoflavanone)의 신규한 용도에 관한 것으로서 보다 상세하게는 화학식 1로 표시되는 호모아이소플라베논 또는 이의 염을 포함하는 염증성 질환 또는 알레르기 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 염증 발생시 생성되는 활성산소군, COX-2, 전-염증성 싸이토카인과 류코트리엔 B4 생성 및 비만세포의 탈과립을 억제하고, 동물실험에서 귀 부종 및 과각질화가 억제되는 등 염증성 질환에 효과적이고, 류코트리엔 C4, 히스타민 생성 억제, T 림프구 증식 억제 등 알레르기 질환에 효과적이므로 이들의 예방 및 치료의 목적으로 사용할 수 있다.The present invention relates to a novel use of homoisoflavanone (homoisoflavanone) in more detail in the pharmaceutical composition for the prevention and treatment of inflammatory diseases or allergic diseases comprising homoisoflavenone represented by the formula (1) or salts thereof It is about. The composition of the present invention is effective in inflammatory diseases such as inhibiting the generation of free radicals, COX-2, pro-inflammatory cytokines and leukotriene B4 and degranulation of mast cells and suppressing ear edema and hyperkeratosis in animal experiments. It is effective in allergic diseases such as leukotriene C4, histamine production inhibition, T lymphocyte proliferation inhibition, and can be used for the purpose of prevention and treatment thereof.

호모아이소플라베논, 항-염증, 항-알레르기, 치료 Homoisoflavenone, anti-inflammatory, anti-allergic, treatment

Description

호모아이소플라베논 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 또는 알레르기 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for preventing and treating inflammatory disease or allergic disease comprising homoisoflavanone or salt thereof as an active ingredient}Pharmaceutical composition for preventing and treating inflammatory disease or allergic disease comprising homoisoflavanone or salt according as an active ingredient

본 발명은 호모아이소플라베논(homoisoflavanone)의 신규한 용도에 관한 것으로서 보다 상세하게는 화학식 1로 표시되는 호모아이소플라베논 또는 이의 염을 포함하는 염증성 질환 또는 알레르기 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a novel use of homoisoflavanone (homoisoflavanone) in more detail in the pharmaceutical composition for the prevention and treatment of inflammatory diseases or allergic diseases comprising homoisoflavenone represented by the formula (1) or salts thereof It is about.

호모아이소플라베논(homoisoflavanone)은 약난초(Cremastra appendiculata Makino)에서 유래된 물질로, chick embryo에서 혈관생성의 억제 효과를 나타내는 보고가 있고, cdc2의 발현을 억제함으로써 cell cycle arrest를 억제한다는 보고가 있으나, 이 제제의 효능 측면에서는 아직 구체적인 성과는 얻지 못한 상태이다. Queer isometric Playa Vernon (homoisoflavanone) about orchids (Cremastra appendiculata Makino ), a substance derived from Makino , has been reported to inhibit angiogenesis in chick embryos and to inhibit cell cycle arrest by inhibiting the expression of cdc2, but has not yet obtained specific results in terms of efficacy of this preparation. It is a state.

염증 반응은 손상이나 박테리아, 곰팡이, 바이러스 등 외부물질의 자극에 의 해 각종 염증 매개인자 및 면역세포에 의한 효소 활성화, 염증매개물질 분비, 체액 침윤, 세포 이동, 조직 파괴 등 일련의 복합적인 생리적 반응이 일어나는 것을 말하며, 이로 인해 홍반, 부종, 발열, 통증 등과 같은 증상이 수반된다. 염증반응은 외부 감염원을 제거하고 손상된 조직을 재생하여 생명체 기능회복작용을 하지만, 항원이 제거되지 않거나 내부물질이 원인이 되는 등 염증반응이 과도하거나 지속적으로 일어나면 오히려 점막손상, 조직 파괴 등이 일어나고, 암, 자가 면역질환, 염증성 피부질환, 염증성 장질환, 관절염 등의 질환을 초래하기도 한다. The inflammatory response is a series of complex physiological reactions such as enzyme activation by various inflammatory mediators and immune cells, secretion of inflammatory mediators, fluid infiltration, cell migration, and tissue destruction by damage or stimulation of external substances such as bacteria, fungi, and viruses. This is what happens, and this is accompanied by symptoms such as erythema, edema, fever and pain. Inflammatory reactions restore the function of life by removing external infectious agents and regenerating damaged tissues.However, when inflammatory reactions occur excessively or continuously such as antigens are not removed or internal substances are caused, mucosal damage and tissue destruction occur. It can also lead to diseases such as cancer, autoimmune diseases, inflammatory skin diseases, inflammatory bowel diseases and arthritis.

현재까지는 상기와 같은 염증성 질환의 치료를 위해서 주로 항히스타민제, 비타민 연고, 항염증제, 면역억제제, 부신피질호르몬제가 사용되어 왔다. 그러나 이러한 약물은 그 효과가 일시적인 경우가 대부분이고 부작용이 심한 경우도 많아 염증성 질환의 치료 효과가 있는 새로운 물질의 개발이 요구되고 있다. 그 예로 MERCK에서 개발되고 있는 ML-3000(licofelone)은 COX-1,2와 5-LOX의 발현을 억제하는 이중 저해제(dual inhibitor)로써, 항염증효과, 진통제, 감각과민, 이질통, 해열제, 심근경색증, 골관절염 억제효과, 위장관 부작용을 완화한다는 보고가 있다 (Kulkarni S et al., 2007; 7(3) 251-63, current topics in medicinal chemistry). 여러 식물에 있는 퀘르세틴(quercetin)은 항히스타민 작용 저해, 심장병 암예방, 항염증작용, 암유발 (전립선암, 난소암, 유방암, 위암 등) 감소, 중금속 해독 등 여러 가지 작용을 가지고 있다. Until now, antihistamines, vitamin ointments, anti-inflammatory agents, immunosuppressants, and corticosteroids have been mainly used for the treatment of such inflammatory diseases. However, these drugs have a temporary effect and most often have severe side effects. Therefore, there is a need for the development of new substances that are effective in treating inflammatory diseases. For example, ML-3000 (licofelone), developed by MERCK, is a dual inhibitor that inhibits the expression of COX-1,2 and 5-LOX.Anti-inflammatory, analgesic, sensory hypersensitivity, allodynia, antipyretic, myocardium It has been reported to alleviate infarction, osteoarthritis, and gastrointestinal side effects (Kulkarni S et al., 2007; 7 (3) 251-63, current topics in medicinal chemistry). Quercetin, found in many plants, has several effects, including inhibition of antihistamines, prevention of heart disease, anti-inflammatory effects, reduction of cancer induction (prostate cancer, ovarian cancer, breast cancer, gastric cancer, etc.) and detoxification of heavy metals.

한편, 알레르기 질환이란 외부 물질(알레르겐)에 대해 개체의 면역 기전이 보통보다도 과민한 반응을 나타낼 때 유발되는 질환을 말한다. 이와 같은 알레르기 질환은 기온, 습도 등의 기후변화, 풍토, 환경오염, 직업 등에 따라 발생빈도가 높은 면역성 질환이지만 아직까지 근본적인 치료제가 개발되어 있지 못한 실정이다.On the other hand, an allergic disease refers to a disease caused when an individual's immune mechanism reacts to a foreign substance (allergen) more than usual. Such allergic diseases are immune diseases with high incidence due to climate change, climate, environmental pollution, occupation such as temperature and humidity, but fundamental therapeutics have not been developed yet.

현재까지 개발되어 온 항알레르기 제제는 발작의 발단이 되는 염증 세포가 생산하는 여러 화학 전달물질들을 신호전달상의 여러 경로를 저해하는 것이 대부분이었다. 즉, 비만세포가 여러 종류의 알레르겐에 의해 탈과립되면 비만세포 내 과립에 저장되어 있던 히스타민, 헤파린 및 단백질 분해 효소 등의 화학 물질들을 유리되어 즉각적인 알레르기 반응 및 염증반응이 일어난다. 알레르기 질환의 증상을 완화시키는 치료제로는 거의 대부분이 상기와 같은 화학 물질을 저해하는 항히스타민제가 사용되고 있으며 심한 경우 스테로이드 제제가 병용 투여되고 있다. 그러나, 상기와 같은 합성 제품들은 완전한 치료를 기대할 수 없으며 장기간 사용시 그 효과가 떨어지고 전신성 부작용이 심하게 일어나는 단점이 있다.Anti-allergic agents, which have been developed until now, have mostly inhibited various chemical signaling pathways produced by inflammatory cells that trigger seizures. That is, when the mast cells are degranulated by various allergens, chemical substances such as histamine, heparin, and proteolytic enzymes stored in granules in the mast cells are released, and an immediate allergic and inflammatory reaction occurs. As a therapeutic agent for alleviating the symptoms of allergic diseases, antihistamines that inhibit most of the above chemicals are used, and in severe cases, steroid agents are co-administered. However, such synthetic products can not be expected to be a complete treatment, and the long-term use has the disadvantage that the effect is poor and systemic side effects are severe.

이에 본 발명자들은 호모아이소플라베논의 생리적 기능에 대해서 연구하던 중 이들이 염증 반응이나 알레르기 반응의 억제와 같은 새로운 기능을 한다는 점을 발견하여 호모아이소플라베논을 포함하는 염증성 질환 또는 알레르기 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors have studied new physiological functions of homoisoflavinone and found that they have new functions such as suppression of inflammatory or allergic reactions. Therefore, the present inventors have prevented and treated inflammatory or allergic diseases including homoisoflavonenone. The present invention was completed by developing a pharmaceutical composition.

따라서, 본 발명의 목적은 호모아이소플라베논의 신규한 용도를 제공하는 것이다.It is therefore an object of the present invention to provide novel uses of homoisoflavenones.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 호모아이소플라베논 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing and treating inflammatory diseases comprising homoisoflavenone or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 호모아이소플라베논 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 알레르기 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.In order to achieve the another object of the present invention, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing and treating allergic diseases comprising homoisoflavenone or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.

이하 본 발명의 내용을 보다 상세히 설명하기로 한다.Hereinafter, the content of the present invention will be described in more detail.

본 발명의 약학적 조성물은 호모아이소플라베논 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 것을 특징으로 한다.The pharmaceutical composition of the present invention is characterized in that it comprises homoisoflavenone or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명의 호모아이소플라베논은 각각 하기 화학식 1의 구조를 가지며, 천연으로부터 분리 정제하거나, 상업적으로 구입하여 사용하거나 또는 당 업계에 공지된 화학적 합성법으로 제조할 수 있다.The homoisoflavenones of the present invention each have a structure represented by the following Chemical Formula 1, and may be separated and purified from nature, used commercially, or manufactured by chemical synthesis methods known in the art.

Figure 112008062529758-pat00001
Figure 112008062529758-pat00001

(상기 식에서 R은 H, OH 또는 OCnH2n +1(n은 1 내지 6임)이다.)(Wherein R is H, OH or OC n H 2n +1 where n is 1 to 6).

바람직하게, 호모아이소플라베논은 약난초로부터 분리/정제될 수 있다. 본 발명에 따른 호모아이소플라베논은 유기용매 추출 및 크로마토그래피 등의 당업계에서 통상적으로 사용되는 공지의 방법에 의해 추출될 수 있다. Preferably, homoisoflavenone may be isolated / purified from herbal orchid. Homoisoflavenone according to the present invention can be extracted by known methods commonly used in the art, such as organic solvent extraction and chromatography.

본 발명의 일 실시예에서는 자외선 조사에 의해 유도된 세포내 활성 산소군 에 대해 호모아이소플라베논의 억제효과를 살펴보았다. 그 결과, 자외선 조사에 의해 발생한 활성 산소군이 호모아이소플라베논을 처리하는 경우 감소하였고, 이에 호모아이소플라베논이 항산화효과를 가지고 있음을 알 수 있었다 (실시예 1 참조).In one embodiment of the present invention, the inhibitory effect of homoisoflavenone on the intracellular reactive oxygen group induced by ultraviolet irradiation was examined. As a result, it was found that the active oxygen group generated by UV irradiation decreased when the homoisoflavenone was treated, and thus, the homoisoflavenone had an antioxidant effect (see Example 1).

본 발명의 다른 실시예에서는 자외선에 의한 COX-2 발현, 자외선에 의한 전-염증성 사이토카인인 IL-6, IL-8 및 TNF-α의 발현에 대해 호모아이소플라베논의 억제효과를 살펴보았다. 그 결과, 호모아이소플라베논이 자외선의 조사에 의해 발현이 증가된 COX-2, 전-염증성 사이토카인인 IL-6, IL-8 및 TNF-α, 이에 호모아이소플라베논이 자외선 조사에 의한 염증 반응을 억제하는 효과를 가지고 있음을 알 수 있었다 (실시예 2, 3 참조).In another embodiment of the present invention, the inhibitory effect of homoisoflavenone on COX-2 expression by UV light and expression of IL-6, IL-8 and TNF-α, which are pro-inflammatory cytokines by UV light, was examined. As a result, COX-2 and IL-6, IL-8 and TNF-α, which are pre-inflammatory cytokines, whose homoisoflavinone increased expression by irradiation of ultraviolet rays, the homoisoflavinone was irritated by UV irradiation. It was found to have an effect of inhibiting the reaction (see Examples 2 and 3).

본 발명의 또 다른 실시예에서는 동물모델에서 자외선에 의한 염증반응 및 피부손상, 자외선에 의한 COX-2 발현, 자외선에 의한 전-염증성 사이토카인인 IL-6 및 TNF-α의 발현을 살펴보았다. 그 결과, 호모아이소플라베논이 자외선에 의한 염증반응을 완화하였으며, 발현이 증가된 COX-2, 전-염증성 사이토카인인 IL-6 및 TNF-α, 이에 호모아이소플라베논이 in vivo 상에서도 자외선 조사에 의한 염증 반응 억제하는 효과를 가지고 있음을 알 수 있었다 (실시예 4, 5 참조).In another embodiment of the present invention, the inflammatory response and skin damage caused by ultraviolet light, COX-2 expression by ultraviolet light, and expression of IL-6 and TNF-α, which are pro-inflammatory cytokines by ultraviolet light, were examined. As a result, homoisoflavinone alleviated the inflammatory response caused by UV rays, and the expression of COX-2 and IL-6 and TNF-α, a pro-inflammatory cytokine with increased expression, was also irradiated with UV in vivo. It can be seen that it has an effect of inhibiting the inflammatory response by (see Examples 4 and 5).

본 발명의 또 다른 실시예에서는 비만세포주에서 포볼 12-미르스테이트 13-아세테이트와 A23187에 의한 전-염증성 인자인 루코트리엔과 사이토카인인 IL-6, IL-8 의 발현과 COX-2 발현 기작에 대해 호모아이소플라베논의 억제효과를 살펴보았다. 그 결과, 호모아이소플라베논이 포볼 12-미르스테이트 13-아세테이트와 A23187에 의해 발현이 증가된 COX-2, 핵막으로 이동된 5-LOX, 인산화된 cPLA2, 루코트리엔 B4와 C4 그리고 전-염증성 사이토카인인 IL-6, IL-8 의 발현을 억제시켰다. 이에 호모아이소플라베논에 의해 염증 반응을 억제하는 효과를 가지고 있음을 알 수 있었다 (실시예 6, 7 참조).In another embodiment of the present invention, the expression of the pro-inflammatory factors leukotriene and the cytokines IL-6 and IL-8 and COX-2 expression in mast cell lines by the pobol 12-myrstate 13-acetate and A23187. We investigated the inhibitory effect of homoisoflavenone on the mechanism. As a result, homoisoflavenone increased COX-2 expression by Fourbol 12- Mirstate 13-acetate and A23187, 5-LOX migrated into the nuclear membrane, phosphorylated cPLA 2 , leukotriene B4 and C4 and trans Inhibited expression of inflammatory cytokines IL-6 and IL-8. As a result, it was found that homoisoflavinone has an effect of inhibiting the inflammatory response (see Examples 6 and 7).

본 발명의 또 다른 실시예에서는 포볼 12-미르스테이트 13-아세테이트와 A23187에 의한 비만세포의 탈과립(degranulation)에 대해 호모아이소플라베논의 억제효과를 살펴보았다. 그 결과, 호모아이소플라베논이 포볼 12-미르스테이트 13-아세테이트와 A23187에 의한 탈과립을 억제하고 또한 항원(IgE)에 의한 비만세포의 탈과립을 억제시켰다. 이에 호모아이소플라베논은 염증 반응을 억제하는 효과를 가지고 있음을 알 수 있었다 (실시예 8 참조).In another embodiment of the present invention, the inhibitory effect of homoisoflavenone on the degranulation of mast cells by Fourbol 12-Mirstate 13-acetate and A23187 was examined. As a result, homoisoflavenone inhibited degranulation by Fourbol 12-Mirstate 13-acetate and A23187 and also suppressed degranulation of mast cells by antigen (IgE). The homoisoflavenone was found to have an effect of inhibiting the inflammatory response (see Example 8).

본 발명의 또 다른 실시예에서는 혼합림프구반응을 통해 호모아이소플라베논에 의한 T cell 증식억제 효과를 살펴보았다. 그 결과, 호모아이소플라베논의 첨가시 0.25 μg/ml 이상의 농도에서 농도의존적으로 T 세포의 증식을 효과적으로 억제함을 알 수 있었다(실시예 9 참조). In another embodiment of the present invention was examined the effect of inhibiting T cell proliferation by homoisoflavinone through mixed lymphocyte reaction. As a result, it was found that the addition of homoisoflavenone effectively inhibited the proliferation of T cells at a concentration of 0.25 μg / ml or more (see Example 9).

본 발명의 또 다른 실시예에서는 자외선 조사나 크로톤 오일로 유도시킨 피부 염증 반응에 대한 호모아이소플라베논의 효과를 살펴보았다. 그 결과, 호모아이소플라베논의 농도에 비례하여 귀부종과 피부 염증 반응의 억제효과가 있었으며 그 정도가 50% 이상임을 알 수 있었다. (실시예 10 참조).In another embodiment of the present invention, the effects of homoisoflavenone on the skin inflammatory response induced by UV irradiation or croton oil. As a result, it was found that there was an inhibitory effect of ear edema and skin inflammatory response in proportion to the concentration of homoisoflavenone, which was more than 50%. (See Example 10).

따라서, 본 발명은 호모아이소플라베논 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.Accordingly, the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of inflammatory diseases, including homoisoflavenone or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명에 따른 호모아이소플라베논은 그 자체 또는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기에서 ‘약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 말하며, 상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하다. 상기 유리산은 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탄산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한, 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다. The homoisoflavenones according to the invention can be used on their own or in the form of pharmaceutically acceptable salts. As used herein, 'pharmaceutically acceptable' refers to a physiologically acceptable and normally does not cause an allergic or similar reaction when administered to a human, and as the salt, a pharmaceutically acceptable free acid Acid addition salts formed by The free acid may be an organic acid or an inorganic acid. The organic acid is not limited thereto, citric acid, acetic acid, lactic acid, tartaric acid, maleic acid, fumaric acid, formic acid, propionic acid, oxalic acid, trifluoroacetic acid, benzoic acid, gluconic acid, metasulfonic acid, glycolic acid, succinic acid, 4-toluenesulfonic acid, Glutaric acid and aspartic acid. In addition, the inorganic acid includes, but is not limited to, hydrochloric acid, bromic acid, sulfuric acid and phosphoric acid.

본 발명에 따른 화합물이 적용될 수 있는 염증성 질환은, 이에 제한되지는 않으나, 염증성 피부질환, 크론씨 질환(Crohn's desease) 및 궤양성 대장염과 같은 염증성 장 질환, 복막염, 골수염, 봉소염, 뇌막염, 뇌염, 췌장염, 외상 유발 쇼크, 기관지 천식, 알레르기성 비염, 낭포성 섬유증, 뇌졸중, 급성 기관지염, 만성 기관지염, 급성 세기관지염, 만성 세기관지염, 골관절염, 통풍, 척추관절병증, 강직성 척추염, 라이터 증후군, 건선성 관절병증, 장질환 척추염, 연소자성 관절병증, 연소자성 강직성 척추염, 반응성 관절병증, 감염성 관절염, 후-감염성 관절염, 임균성 관절염, 결핵성 관절염, 바이러스성 관절염, 진균성 관절염, 매독성 관절염, 라임 병, '혈관염 증후군'과 관련된 관절염, 결절성 다발동맥염, 과민성 혈관염, 루게닉 육아종증, 류마티스성 다발성근육통, 관절 세포 동맥염, 칼슘 결정 침착 관절병증, 가성 통풍, 비-관절 류마티즘, 점액낭염, 건초염, 상과염(테니스 엘보), 신경병증성 관절 질환(charco and joint), 출혈성 관절증(hemarthrosic), 알레르기 자반병, 비후성 골관절병증, 다중심성 세망조직구종, 수르코일로시스(surcoilosis), 혈색소증, 겸상 적혈구증 및 기타 혈색소병증, 고지단백혈증, 저감마글로불린혈증, 가족성 지중해열, 베하트 병, 전신성 홍반성 루푸스, 재귀열, 건선, 다발성 경화증, 패혈증, 패혈성 쇼크, 다장기 기능장애 증후군, 급성 호흡곤란 증후군, 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease), 류마치스성 관절염(rheumatoid arthritis), 급성 폐손상(acute lung injury) 및 기관지 폐 형성장애(broncho-pulmonary dysplasia) 등을 포함한다.Inflammatory diseases to which the compounds according to the present invention can be applied include, but are not limited to, inflammatory skin diseases, Crohn's desease and inflammatory bowel diseases such as ulcerative colitis, peritonitis, osteomyelitis, roditis, meningitis, encephalitis, pancreatitis. , Trauma-induced shock, bronchial asthma, allergic rhinitis, cystic fibrosis, stroke, acute bronchitis, chronic bronchitis, acute bronchiolitis, chronic bronchiolitis, osteoarthritis, gout, spondyloarthropathy, ankylosing spondylitis, lighter syndrome, psoriatic arthrosis, intestine Diseases spondylitis, juvenile arthritis, juvenile ankylosing spondylitis, reactive arthritis, infectious arthritis, post-infectious arthritis, gonococcal arthritis, tuberculosis arthritis, viral arthritis, fungal arthritis, syphilis arthritis, Lyme disease, 'angioarthritis syndrome' Associated with arthritis, nodular polyarteritis, irritable vasculitis, lugeogenic granulomatosis, rheumatoid multiple Myalgia, articular cell arteritis, calcium crystalline arthritis, pseudogout, non-articular rheumatoid, bursitis, hay fever, epicondylitis (tennis elbow), neuropathic joint disease (charco and joint), hemarthrosic, allergic purpura , Hypertrophic osteoarthritis, multicardiac reticulocytoma, surcoilosis, hemochromatosis, sickle cell disease and other hemoglobinopathies, hyperlipoproteinemia, hypomagglobulinemia, familial Mediterranean fever, Behcet's disease, systemic lupus erythematosus Recurrent fever, psoriasis, multiple sclerosis, sepsis, septic shock, multiple organ dysfunction syndrome, acute respiratory distress syndrome, chronic obstructive pulmonary disease, rheumatoid arthritis, acute lung injury injury and broncho-pulmonary dysplasia.

아울러, 상기 염증성 피부질환은 이에 한정되지는 않으나, 피부 염증, 급· 만성 습진, 접촉성 피부염, 아토피성 피부염, 지루성 피부염, 만성단순태선, 간찰진, 박탈 피부염, 구진상 두드러기, 편평태선, 급만성태선양 피부염, 자극성 피부염, 유건선, 장미색 비강진, 지방층염, 일광 피부염, 박탈성 피부염, 비만세포증, 건선 및 여드름 등이 포함한다.In addition, the inflammatory skin disease is not limited to this, but skin inflammation, acute and chronic eczema, contact dermatitis, atopic dermatitis, seborrheic dermatitis, chronic simple thyroid gland, interrogation, deprivation dermatitis, papular urticaria, squamous gland, acute rash Schizophrenic dermatitis, irritant dermatitis, psoriasis, rosaceous nasal mucus, fat stratitis, sun dermatitis, deprived dermatitis, mastocytosis, psoriasis and acne.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 호모아이소플라베논 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염을 단독으로 함유하거나 또는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다. The pharmaceutical composition according to the present invention may contain homoisoflavenone alone or a pharmaceutically acceptable salt thereof or may further contain one or more pharmaceutically acceptable carriers, excipients or diluents.

약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995). Pharmaceutically acceptable carriers may further include, for example, carriers for oral administration or carriers for parenteral administration. Carriers for oral administration may include lactose, starch, cellulose derivatives, magnesium stearate, stearic acid and the like. In addition, carriers for parenteral administration may include water, suitable oils, saline, aqueous glucose and glycols, and the like, and may further include stabilizers and preservatives. Suitable stabilizers include antioxidants such as sodium hydrogen sulfite, sodium sulfite or ascorbic acid. Suitable preservatives include benzalkonium chloride, methyl- or propyl-paraben and chlorobutanol. Other pharmaceutically acceptable carriers can be found in Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1995).

본 발명의 피부질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 약학적 조성물은 경피 투여될 수 있다. 상기에서 ‘경피 투여'란 본 발명의 약학적 조성물을 세포 또는 피부에 투여하여 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 함유된 활성성분이 피부 내로 전달되도록 하는 것을 말하다. 예컨대, 본 발명의 약학적 조성물을 주사형 제형으로 제조하여 이를 30 게이지의 가는 주사 바늘로 피부를 가볍게 단자(prick)하는 방법, 또는 피부에 직접적으로 도포하는 방법으로 투여될 수 있다.The pharmaceutical composition for preventing or treating skin diseases of the present invention can be administered to any mammal, including humans. For example, it can be administered orally or parenterally. Parenteral administration methods include, but are not limited to, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intradural, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, intestinal, topical, sublingual or rectal administration. Can be. Preferably the pharmaceutical composition of the present invention may be administered transdermally. As used herein, the term 'transdermal administration' refers to the administration of the pharmaceutical composition of the present invention to cells or skin so that the active ingredient contained in the pharmaceutical composition for preventing or treating inflammatory diseases is delivered into the skin. For example, the pharmaceutical composition of the present invention can be prepared in an injectable formulation and administered by lightly pricking the skin with a 30 gauge thin needle or by applying it directly to the skin.

본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다. The pharmaceutical composition of the present invention may be formulated into a preparation for oral or parenteral administration according to the route of administration as described above.

경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포 함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.In the case of preparations for oral administration, the compositions of the present invention may be formulated using methods known in the art as powders, granules, tablets, pills, dragees, capsules, solutions, gels, syrups, slurries, suspensions and the like. Can be. For example, oral formulations can be obtained by tablets or dragees by combining the active ingredients with solid excipients, milling them, adding suitable auxiliaries and then processing them into granule mixtures. Examples of suitable excipients include saccharides, including lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol and maltitol, and starches, including corn starch, wheat starch, rice starch and potato starch, cellulose; Fillers such as cellulose, gelatin, polyvinylpyrrolidone, and the like, including methyl cellulose, sodium carboxymethylcellulose, hydroxypropylmethyl-cellulose, and the like. In addition, crosslinked polyvinylpyrrolidone, agar, alginic acid or sodium alginate and the like may optionally be added as a disintegrant. Furthermore, the pharmaceutical composition of the present invention may further include an anticoagulant, a lubricant, a humectant, a perfume, an emulsifier, a preservative, and the like.

비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042, Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기재되어 있다.Formulations for parenteral administration may be formulated by methods known in the art in the form of injections, creams, lotions, external ointments, oils, humectants, gels, aerosols and nasal inhalants. These formulations are described in Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042, Chapter 87: Blaug, Seymour, a prescription generally known in all pharmaceutical chemistries.

본 발명의 호모아이소플라베논의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 호모아이소플라베논의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1 ㎏ 당 약 0.001 ㎍ 내지 1,000 mg, 가장 바람직하게는 0.01 ㎍ 내지 100 mg일 수 있다. 그러나 상기 호모아이소플라베논의 용량은 약학적 조성물의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 호모아이소플라베논을 염증성 질환의 예방 또는 치료제로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다. The total effective amount of the homoisoflavenone of the present invention may be administered to a patient in a single dose, and may be administered by a fractionated treatment protocol that is administered in multiple doses for a long time. have. The pharmaceutical composition of the present invention may vary the content of the active ingredient depending on the extent of the disease. Preferably the preferred total dose of homoisoflavenone of the present invention may be from about 0.001 μg to 1,000 mg, most preferably 0.01 μg to 100 mg per kg of patient body weight per day. However, the dose of homoisoflavenone is effectively administered to the patient in consideration of various factors such as the age, weight, health condition, sex, severity of the disease, diet and excretion rate, as well as the route and frequency of treatment of the pharmaceutical composition. Since the amount is determined, one of ordinary skill in the art will be able to determine an appropriate effective dosage for the specific use of the homoisoflavenone as a prophylactic or therapeutic agent for inflammatory diseases. The pharmaceutical composition according to the present invention is not particularly limited to its formulation, route of administration and method of administration as long as the effect of the present invention is shown.

한편, 본 발명의 호모아이소플라베논 및 이의 염은 알레르기 질환을 예방 또는 치료하는 효과를 가지고 있다. 이에 본 발명은 호모아이소플라베논 및 이의 염을 포함하는 알레르기 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.On the other hand, homoisoflavinone and salts thereof of the present invention have the effect of preventing or treating allergic diseases. Accordingly, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing and treating allergic diseases, including homoisoflavenone and salts thereof.

상기에서 “알레르기 질환”이란 인체의 어떤 물질에 대한 과민증, 즉 외부로부터 들어온 물질에 대해 신체 면역계가 과도한 반응을 일으켜서 유발되는 질환을 말한다. 상기 알레르기 질환의 예로는 이에 한정되지는 않으나 알레르기 피부염, 아토피 피부염, 알레르기성 비염, 알레르기성 천식, 아나필락틱 쇼크(anaphylatic shock) 및 알레르기성 결막염 등이 포함될 수 있다. 상기 알레르기성 피부염으로는 아토피 피부염, 접촉성 알레르기 피부염 및 알레르기성 두드러기, 약진 등이 포함될 수 있다.The term “allergic disease” refers to a disease caused by hypersensitivity of the body's immune system to a substance that is sensitized to a substance of the human body, that is, a substance from outside. Examples of the allergic disease include, but are not limited to, allergic dermatitis, atopic dermatitis, allergic rhinitis, allergic asthma, anaphylatic shock and allergic conjunctivitis. The allergic dermatitis may include atopic dermatitis, contact allergic dermatitis and allergic urticaria, weakness and the like.

상기 알레르기 질환의 예방 및 치료용 조성물의 유효성분, 제형, 유효량 등에 대해서는 염증성 질환에 대한 상기 기재를 이용하여 당업자가 적절하게 변형, 수정, 보완하여 이해될 수 있다.Effective ingredients, formulations, effective amounts, etc. of the composition for the prevention and treatment of allergic diseases may be understood by those skilled in the art by appropriately modifying, modifying, and supplementing the above description of inflammatory diseases.

따라서, 본 발명은 호모아이소플라베논 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 또는 알레르기 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 염증 발생시 생성되는 활성산소군, COX-2, 전-염증성 싸이토카인의 생성 및 비만세포의 탈과립을 억제하고, 동물실험에서도 귀 부종 및 과각질화가 억제하는 등 염증성 질환에 효과적이고, 류코트리엔 B4와 C4, 히스타민 생성 억제, T 림프구 증식 억제 등 알레르기 질환에 효과적이므로 이들의 예방 및 치료의 목적으로 사용할 수 있다.Accordingly, the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of inflammatory diseases or allergic diseases comprising homoisoflavenone or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient. The composition of the present invention is effective in inflammatory diseases such as inhibiting the generation of free radicals, COX-2, pro-inflammatory cytokines and degranulation of mast cells and inhibiting ear edema and hyperkeratosis in animal experiments. Since it is effective in allergic diseases such as leukotriene B4 and C4, inhibiting histamine production, inhibiting T lymphocyte proliferation, it can be used for the purpose of preventing and treating them.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.However, the following examples are illustrative of the present invention, and the present invention is not limited to the following examples.

<< 실시예Example 1>  1>

자외선 조사에 의해 유도된 Induced by ultraviolet irradiation 세포내Intracellular 활성산소군(intracelluar ROS)에To free radicals (intracelluar ROS) 대한 억제 효과 Inhibitory effect

<1-1> <1-1> 호모아이소플라베논의Homoisoflavinone 세포내Intracellular 활성산소군 억제 효과 Reactive Oxygen Group Inhibitory Effect

인간각질형성세포(Human keratinocyte cell line)인 HaCaT 세포(독일 Cancer Research의 N. Fusenig 교수로부터 기증받음)를 60 mm의 배양접시에 5 x 105 개수의 세포(100 mm의 배양접시의 경우 1 x 106 개수의 세포)가 되도록 접종한 후, 우태아 혈청(FBS, fetal bovine serum)이 10 % 포함된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지에서 24시간 배양하였다. HaCaT cells (Human keratinocyte cell line) (donated by Professor N. Fusenig of Cancer Research, Germany) were 5 x 10 5 cells in a 60 mm dish (1 x for a 100 mm dish) 10 6 cells were inoculated, and then cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) for 24 hours.

배양 후 화학식 1의 호모아이소플라베논(homoisoflavanone)(R은 OCH3임)을 1 μg/ml 농도로 1 시간 처리한 후 인산 완충액(PBS, Phosphate buffered saline)을 이용하여 세포를 3회 수세하였다. 활성산소군(ROS, reactive oxygen species)을 유발하기 위하여 자외선 램프 (FSX 24 T12/UVB/HO, pansolTM USA )를 이용하여 100 J/m2 의 자외선을 조사하였다. 자외선 조사 직후, 세포를 다시 인산 완충액으로 수세하고 우태아 혈청이 1% 포함된 DMEM 배지에 호모아이소플라베논을 전처리 농도와 같게 처리하여 4 시간 더 배양하였다. 여기에 DCFH-DA(2,7-dichlorofliuorescin diacetate)를 25 μM의 농도로 HBSS(hank's balanceed salt solution, BioWhittaker, CAMBREX, 미국) 완충액에서 30 분간 처리한 후 인산 완충액으로 3회 수세하였다.After incubation, the cells were washed three times with phosphate buffer (PBS, Phosphate buffered saline) after treatment for 1 hour with homoisoflavanone (R is OCH 3 ) at 1 μg / ml. UV lamps (FSX 24 T12 / UVB / HO, pansol TM ) to induce reactive oxygen species (ROS) USA) was irradiated with ultraviolet light of 100 J / m 2 . Immediately after UV irradiation, the cells were washed again with phosphate buffer and incubated for 4 hours by treating homoisoflavenone with pretreatment concentration in DMEM medium containing 1% fetal calf serum. Here, DCFH-DA (2,7-dichlorofliuorescin diacetate) was treated with HBSS (hank's balanceed salt solution, BioWhittaker, CAMBREX, USA) buffer at a concentration of 25 μM for 30 minutes and washed three times with phosphate buffer.

이렇게 처리한 세포를 형광현미경(Carl ZEISS, 미국)을 이용하여 자외선에 의해 유도된 ROS를 측정하였으며 실험 그룹은 다음과 같이 나누었다: 무처리군 - 자외선 및 호모아이소플라베논 모두 처리하지 않음; 실험군 A - 자외선은 처리하지 않고 호모아이소플라베논만 처리; 대조군 - 자외선만 처리함; 실험군 B - 각각 자외선 및 호모아이소플라베논 처리.The cells thus treated were measured for UV-induced ROS using a fluorescence microscope (Carl ZEISS, USA), and the experimental group was divided into the following groups: no treatment group-neither UV nor homoisoflavenone; Experimental group A-treated only with homoisoflavenone without UV treatment; Control group-only UV treatment; Experimental Group B-UV and Homoisoflavenone Treatment, respectively.

그 결과, 도 1 에서 보듯이, 자외선 조사 전 호모아이소플라베논을 처리한 경우(실험군 B, U+H) 자외선만을 조사한 경우(대조군, UVB 20mJ/cm2)에 비해 세포내 ROS 발생이 현저히 감소하여 호모아이소플라베논이 자외선에 의해 유도된 ROS를 억제하는 효과가 있음을 알 수 있었다. 따라서, 이러한 자외선에 의해 유도된 ROS를 억제하는 효과로 볼 때 본 발명의 호모아이소플라베논 화합물이 항산화효과를 가지고 있음을 알 수 있었다.As a result, as shown in Fig. 1, the generation of intracellular ROS is significantly reduced compared to the case of irradiation with only ultraviolet light (control group, UVB 20mJ / cm 2 ) when homoisoflavenone was treated before the ultraviolet irradiation (experimental group B, U + H). It was found that homoisoflavenone has an effect of inhibiting ROS induced by ultraviolet rays. Therefore, it can be seen that the homoisoflavenone compound of the present invention has an antioxidant effect in view of the effect of inhibiting ROS induced by ultraviolet rays.

<< 실시예Example 2> 2>

자외선에 의한 By ultraviolet COXCOX -2 발현의 억제 효과 확인The inhibitory effect of -2 expression

<2-1> <2-1> 호모아이소플라베논의Homoisoflavinone 자외선에 의한  By ultraviolet COXCOX -2 발현 억제 효과-2 expression inhibition effect

인간각질형성세포에서의 자외선에 의한 COX-2 발현에 대한 호모아이소플라베논의 효과를 알아보기 위하여 HaCaT 세포를 60 mm의 배양접시에 5 x 105 개수의 세포가 되도록 접종한 후, 우태아 혈청이 10 % 포함된 DMEM 배지에서 24 시간 배양하였다. In order to examine the effect of homoisoflavenone on the expression of COX-2 by UV in human keratinocytes, HaCaT cells were inoculated with 5 x 10 5 cells in a 60 mm culture dish, followed by fetal calf serum. This was incubated for 24 hours in DMEM medium containing 10%.

배양 후 우태아 혈청이 1% 포함된 DMEM 배지에서 24 시간동안 배양하여 기아상태(starvation) 만들었다. 그 후 호모아이소플라베논을 1 μg/ml 농도로 1 시간 처리한 후 인산 완충액을 이용하여 세포를 3회 수세한 다음 COX-2를 유발하기 위하여 100 J/m2 의 자외선을 조사하였다. 자외선 조사 직후, 세포를 다시 인산 완충액으로 수세하고 우태아 혈청이 1% 포함된 DMEM 배지에 호모아이소플라베논을 전처리 농도와 같게 처리하여 16 시간 더 배양하였다.After culturing, starvation was made by incubating for 24 hours in DMEM medium containing 1% fetal calf serum. After treating homoisoflavenone at a concentration of 1 μg / ml for 1 hour, the cells were washed three times with phosphate buffer, and then irradiated with 100 J / m 2 UV to induce COX-2. Immediately after UV irradiation, the cells were washed again with phosphate buffer and incubated for 16 hours by treating homoisoflavenone with pretreatment concentration in DMEM medium containing 1% fetal calf serum.

이렇게 배양된 세포에서의 COX-2 발현 정도를 알기 위하여 웨스턴 블럿(western blotting)을 다음과 같은 방법으로 실시하였다. 각각의 조건으로 처리된 시험그룹의 세포를 2 mM EDTA, 137 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM 바나듐산 나트륨(sodium vanadate), 10 mM NaF, 1 mM PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride), 1% 트리톤 X-100, 10% 글리세롤 및 프로테아제 억제제 칵테일(a protease inhibitor cocktail)이 들어있는 RIPA 완충액로 용해하여 10% 아크릴아마 이드 겔(acrylamide gel)을 이용하여 SDS-PAGE 전기영동으로 단백질을 분리하였다. 이를 나일론 멤브레인에 옮긴 후 염소 항-COX-2 항체(goat anti COX-2 antibody, santacruz, 미국)와 이차 항체인 항-염소 IgG-HRP 결합 항체(anti-goat IgG Horse Radish Peroxidase conjugation antibody, 1;10000, zymed)를 이용하여 원하는 단백질을 분리하였다. 이를 ECL (Amersham, 미국)을 이용하여 검출한 후 영상분석기인 RAS 3000 Imaging system (FUJI film, 일본)으로 형상화하였다.In order to know the expression level of COX-2 in the cultured cells, western blotting was performed by the following method. The cells of the test group treated with each condition were treated with 2 mM EDTA, 137 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM sodium vanadate, 10 mM NaF, and 1 mM PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride) The protein was dissolved in RIPA buffer containing 1% Triton X-100, 10% Glycerol and a protease inhibitor cocktail and subjected to SDS-PAGE electrophoresis using a 10% acrylamide gel. Separated. It was transferred to a nylon membrane, followed by goat anti-COX-2 antibody (goat anti COX-2 antibody, santacruz, USA) and a secondary antibody, anti-goat IgG Horse Radish Peroxidase conjugation antibody, 1; 10000, zymed) was used to isolate the desired protein. This was detected using ECL (Amersham, USA) and then imaged using an image analyzer RAS 3000 Imaging system (FUJI film, Japan).

그 결과, 도 2A에서 보듯이, 대조군(자외선만 처리)에서는 자외선 조사에 의해 COX-2 발현이 증가하고, 호모아이소플라베논을 처리한 후 이렇게 증가된 COX-2 발현이 감소함을 확인할 수 있었다. As a result, as shown in Figure 2A, in the control group (ultraviolet-only treatment) it was confirmed that COX-2 expression is increased by ultraviolet irradiation, and this increased COX-2 expression decreases after treatment with homoisoflavenone. .

<2-2> <2-2> COXCOX -2 발현 억제 기작 확인-2 confirm the mechanism of suppression of expression

인간각질형성세포에서 자외선 조사에 의해 유도되는 COX-2 발현을 호모아이소플라베논이 억제함에 있어 어떠한 세포내 경로를 조절하여 COX-2 발현을 억제하는지 알아보기 위해 MAPK 신호전달과정(signaling)과 전사(transcription factor) 조절인자인 NF-kB 신호전달과정(signaling)을 조사해 보았다.MAPK signaling and transcription to determine which intracellular pathways inhibit COX-2 expression in homoisoflavinone inhibition of COX-2 expression induced by UV irradiation in human keratinocytes. We investigated the transcription factor NF-kB signaling.

MAPKs는 세포내 염증 반응(inflammation)이나 세포사멸(apoptosis) 및 암화(carcinogenesis) 등의 과정에 주로 관련되며, 자외선 조사에 의해 유도되는 세포 손상과도 관련되어 있다(Peus D, Vasa RA, Beyerle A, Meves A, Krautmacher C, Pittelkow MR. UVB activates ERK1/2 and p38 signaling pathways via reactive oxygen species in cultured keratinocytes. J Invest Dermatol 1999;112:7516). 또한 전사인자인 NF-kB도 세포 염증반응 등과 관련되어 발현되는 COX-2를 포함한 각종 세포내 인자들을 조절하는 역할을 하고 있다(Paik J, Lee JY, Hwang D. Signaling pathways for TNFa-induced COX-2 expression: mediation through MAP kinases and NFkB, and inhibition by certain nonsteroidal anti-inflammatory drugs. Adv Exp Med Biol 2002; 507: 503-508.). MAPKs are mainly involved in the processes of intraflammation, apoptosis and carcinogenesis, as well as cell damage induced by UV irradiation (Peus D, Vasa RA, Beyerle A). , Meves A, Krautmacher C, Pittelkow MR.UVB activates ERK1 / 2 and p38 signaling pathways via reactive oxygen species in cultured keratinocytes. J Invest Dermatol 1999; 112: 7516). The transcription factor NF-kB also plays a role in regulating various intracellular factors, including COX-2, which is expressed in response to cellular inflammatory responses (Paik J, Lee JY, Hwang D. Signaling pathways for TNFa-induced COX-). 2 expression:. mediation through MAP kinases and NFkB, and inhibition by certain nonsteroidal anti-inflammatory drugs Adv Exp Med Biol 2002; 507: 503-508.).

이에 호모아이소플라베논에 의해 조절되는 COX-2 발현에 영향을 미치는 세포내 인자를 알아보기 위해 자외선 조사 전 호모아이소플라베논 1 μg/ml 농도로 처리한 후 자외선 조사 45 분 후 각각 토끼 항-p-cytosolic phospholipase A2 (cPLA2) 항체, 토끼 항-cPLA2 항체, 토끼 항-ERK 항체, 토끼 항-p-ERK 항체, 토끼 항-p38 항체, 토끼 항-p-p38 항체(cell signaling)와 2차 항체로 항-토끼 IgG-HRP 결합 항체(zymed)를 이용한 것을 제외하고 상기 실시예 2-1과 동일하게 하여 웨스턴 블럿을 수행하였다. 이 때, 양성대조군으로 본 발명의 호모아이소플라베논 대신 각각 p38 inhibitor인 SB203580 1μM (A.G scientific, inc.) 및 MEK 1 inhibitor인 PD98059 (A.G scientific, inc.) 10μM을 처리한 군을 함께 사용하였다.To investigate the intracellular factors affecting the expression of COX-2 regulated by homoisoflavenone, rabbit anti-p was treated at 1 μg / ml concentration of homoisoflavenone before UV irradiation and 45 minutes after UV irradiation. -cytosolic phospholipase A2 (cPLA 2 ) antibody, rabbit anti-cPLA 2 Anti-rabbit IgG-HRP binding antibodies (zymed) can be used as antibodies, rabbit anti-ERK antibodies, rabbit anti-p-ERK antibodies, rabbit anti-p38 antibodies, rabbit anti-p-p38 antibodies (cell signaling) and secondary antibodies. Western blot was performed in the same manner as in Example 2-1 except for using. In this case, the group treated with p38 inhibitor SB203580 1μM (AG scientific, inc.) And MEK 1 inhibitor PD98059 (AG scientific, inc.) 10μM were used instead of the homoisoflavenone of the present invention as a positive control group.

그 결과, 도 2B(cPLA2), 2C(p38) 및 2D(ERK)에서 보듯이 cPLA2, p38 그리고 ERK의 인산화(phosphorylation)가 호모아이소플라베논에 의해 억제됨을 확인할 수 있었다.As a result, as shown in Figure 2B (cPLA 2 ), 2C (p38) and 2D (ERK) it was confirmed that the phosphorylation (phosphorylation) of cPLA 2 , p38 and ERK is inhibited by homoisoflavenone.

<2-3> <2-3> COXCOX -2 발현 억제 기작 확인-2 confirm the mechanism of suppression of expression

전사조절 인자인 NF-kB의 활성화 유무를 알아보기 위하여 인간 각질 세포주인 HaCaT 세포를 이용하여 면역 염색(immunocytochemistry staining)을 다음과 같은 방법으로 실시하였다.In order to examine the activation of the transcriptional regulator NF-kB, immunostaining (chemistry) was performed using HaCaT cells, a human keratinocyte line, in the following manner.

14 mm의 배양 슬라이드에 세포를 접종한 후, 우태아 혈청이 10 % 포함된 DMEM 배지에서 24 시간 배양하였다. 배양 후 우태아 혈청이 1% 포함된 DMEM 배지에서 24 시간 배양하여 기아상태로 만들었다. 그 후 호모아이소플라베논을 1 μg/ml 농도로 1 시간 처리한 후 인산 완충액을 이용하여 세포를 3회 수세한 다음 100 J/m2 의 자외선을 조사하였다. 자외선 조사 직후, 세포를 다시 인산 완충액으로 수세하고 우태아 혈청이 1% 포함된 DMEM 배지에 호모아이소플라베논을 전처리 농도와 같게 처리하여 4 시간 더 배양한 후 세포를 메탄올로 5 분간 고정하고, 면역 염색을 실시하였다. Cells were seeded on 14 mm culture slides, and then cultured for 24 hours in DMEM medium containing 10% fetal calf serum. After incubation, the cells were incubated for 24 hours in DMEM medium containing 1% fetal calf serum. Thereafter, the homoisoflavenone was treated at 1 μg / ml for 1 hour, and the cells were washed three times with phosphate buffer, and then irradiated with 100 J / m 2 UV. Immediately after UV irradiation, the cells were washed again with phosphate buffer and treated with homoisoflavenone at the same concentration as pretreatment in DMEM medium containing 1% fetal bovine serum, followed by incubation for 4 hours, and the cells were fixed with methanol for 5 minutes. Staining was performed.

이렇게 고정된 세포를 10% 정상 염소 혈청(normal goat serum)을 이용하여 블로킹(blocking)한 후 인산 완충액으로 3회 수세하였다. 여기에 토끼 항NF-kB 항 체(santacruz, 미국)와 Alexa 488이 부착된 항-토끼 IgG 이차 항체(invitrogen, 미국)를 이용하여 NF-kB를 형광 염색한 후 hoechst(Sigma St. Louis, MO)로 대비 염색(counter staining)하였다.The fixed cells were blocked with 10% normal goat serum and then washed three times with phosphate buffer. Herein, fluorescent staining of NF-kB was performed using a rabbit anti-NF-kB antibody (santacruz, USA) and an anti-rabbit IgG secondary antibody (invitrogen, USA) attached with Alexa 488, followed by hoechst (Sigma St. Louis, MO). Counter staining.

그 결과, 도 2E에서 보듯이, NF-kB는 자외선 조사에 의해 활성화되어 핵내로 이동한 것에 비해 자외선 조사전 호모아이소플라베논을 처리한 실험군 B에서는 아무것도 처리하지 않은 무처리군 또는 호모아이소플라베논만 처리한 실험군 A과 같이 NF-kB가 세포질내에 존재하는 것으로 보아 자외선 조사에 의해 유도되는 NF-kB의 핵 내 이동을 호모아이소플라베논가 억제함을 알 수 있었다.As a result, as shown in Fig. 2E, NF-kB was activated by ultraviolet irradiation and moved into the nucleus, whereas in experimental group B treated with homoisoflavinone before ultraviolet irradiation, nothing was treated or homoisoflavoneone was not treated. NF-kB was present in the cytoplasm, as in experimental group A, which was treated only, indicating that homoisoflavinone inhibited nuclear migration of NF-kB induced by ultraviolet irradiation.

<< 실시예Example 3> 3>

자외선 조사에 의해 유도되는 전-염증성 사이토카인(Pro-inflammatory cytokines induced by UV irradiation ( propro -- inflammatoryinflammatory cytokinecytokine ) 증가에 대한 For increase) 호모아이소플라베논의Homoisoflavinone 억제 효과 Inhibitory effect

자외선을 조사하면 피부조직에서 IL-6(interleukin-6), IL-8 및 TNF-α(tumor necrosis factor-α) 등의 사이토카인이 증가되어 염증반응을 매개한다. 이러한 작용에 대한 호모아이소플라베논의 효과를 알아보고자 인간 각질세포주를 이용하여 아래와 같이 실험하였다.Irradiation with ultraviolet light increases cytokines such as IL-6 (interleukin-6), IL-8, and TNF-α (tumor necrosis factor-α), which mediate inflammatory responses. To investigate the effect of homoisoflavenone on this action, human keratinocyte lines were tested as follows.

HaCaT 세포를 100 mm의 배양접시에 1 x 106 개수의 세포가 되도록 접종한 후, 우태아 혈청이 10% 포함된 DMEM 배지에서 24 시간 배양하였다. 배양 후 우태아 혈청이 1% 포함된 DMEM 배지에서 24 시간동안 배양하여 기아상태로 만들었다. 그 후 호모아이소플라베논을 1 μg/ml 농도로 1 시간 처리한 후 인산 완충액을 이용하여 세포를 3회 수세한 다음 사이토카인(cytokine)을 유발하기 위하여 100 J/m2 의 자외선을 조사하였다. 자외선 조사 직후, 세포를 다시 인산 완충액으로 수세하고 우태아 혈청이 1% 포함된 DMEM 배지에 호모아이소플라베논을 전처리 농도와 같게 처리하여 2 또는 5 시간 더 배양하였다. HaCaT cells were seeded to 1 x 10 6 cells in a 100 mm culture dish, and then cultured in DMEM medium containing 10% fetal calf serum for 24 hours. After incubation, incubated in DMEM medium containing 1% fetal bovine serum for 24 hours to make starvation. Thereafter, homoisoflavinone was treated at 1 μg / ml for 1 hour, and the cells were washed three times with phosphate buffer, and then irradiated with 100 J / m 2 ultraviolet rays to induce cytokines. Immediately after UV irradiation, the cells were washed again with phosphate buffer and incubated for 2 or 5 hours by treating homoisoflavenone with pretreatment concentration in DMEM medium containing 1% fetal calf serum.

배양 후 염증반응에 영향을 주는 전-염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)의 억제 정도를 측정하기 위하여 자외선 조사에 의하여 피부에서 주로 유도되는 IL-6, IL-8 및 TNF-α의 mRNA 발현정도를 RT-PCR로 알아보았다. MRNA level of IL-6, IL-8 and TNF-α induced mainly in the skin by UV irradiation to measure the degree of inhibition of pro-inflammatory cytokine affecting the inflammatory response after culture Was determined by RT-PCR.

각 실험군의 세포에서 트리졸(trizol, Invitrogen, USA)을 이용하여 RNA를 추출한 후, 이를 주형으로 PCR(PTC-225 peltier thermal cycler, MJ Reserch USA)을 실시하여 각 실험군의 cDNA를 제조하였다. 만들어진 각각의 cDNA를 주형으로 상용의 IL-6, IL-8 및 TNF-α 프라이머 및 실시간 PCR(Roter Gene 6000 series, Corbett Reserch, Aus)을 이용하여 IL-6, IL-8 그리고 TNF-α의 mRNA 발현정도를 측정하였다. 세포내 전-염증성 사이토카인의 mRNA 발현정도는 무처리군에 대비하여 그 발현 정도를 나타내었다.RNA was extracted from the cells of each experimental group using trizol (trizol, Invitrogen, USA), and PCR (PTC-225 peltier thermal cycler, MJ Reserch USA) was used as a template to prepare cDNA of each experimental group. Using each of the cDNAs as a template, commercial IL-6, IL-8 and TNF-α primers and real-time PCR (Roter Gene 6000 series, Corbett Reserch, Aus) were used to determine IL-6, IL-8 and TNF-α. mRNA expression level was measured. The mRNA expression level of intracellular pro-inflammatory cytokines was expressed in comparison to the untreated group.

그 결과, 도 3에서 보듯이, 실험 결과, 인간 각질세포에 자외선을 조사하는 경우(대조군) 전-염증성 사이토카인인 IL-6(인간 IL-6, hIL-6), IL-8(인간 IL-8, hIL-8) 및 TNF-α(인간 TNF-α, hTNF-α)의 발현이 증가됨을 확인할 수 있었다. 이에 반하여 호모아이소플라베논을 처리한 실험군 B에서는 이를 처리하지 않은 대조군에 비해 IL-6, IL-8 및 TNF-α의 발현이 감소함을 알 수 있었다. 따라서, 상기 결과로부터, 호모아이소플라베논이 자외선 조사에 의해 증가된 IL-6, IL-8 및 TNF-α의 발현을 현저히 감소시킴을 알 수 있었다.As a result, as shown in FIG. 3, the experimental results show that when the human keratinocytes are irradiated with ultraviolet light (control), IL-6 (human IL-6, hIL-6), a pro-inflammatory cytokine, IL-8 (human IL). -8, hIL-8) and TNF-α (human TNF-α, hTNF-α) was confirmed to increase the expression. On the contrary, in the experimental group B treated with homoisoflavenone, the expression of IL-6, IL-8 and TNF-α was decreased compared to the control group not treated with homoisoflavone. Therefore, it can be seen from the above results that homoisoflavinone significantly reduced the expression of IL-6, IL-8 and TNF-α increased by ultraviolet irradiation.

<< 실시예Example 4> 4>

동물모델에서의 포볼 12-Four-Ball in Animal Models 12- 미리스테이트Myristate 13-아세테이트에 의해 유도된  Induced by 13-acetate 귀부종에On ear edema 대한 호모아이소플라베논( For homoisoflavonen homoisoflavanone)의homoisoflavanone) 효과 effect

인간각질형성세포인 HaCaT 세포를 이용한 시험관 세포내 실험을 동물모델에서 확인하기 위하여 털이 없는 생쥐(hairless mouse, SKH-1)를 이용하여 다음과 같이 실험을 실시하였으며 실험군은 아래과 같다: 무처리군 - 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(phorbol 12-myristate 13-acetate, TPA) 처리하지 않고 아세톤(acetone)만 처리; 실험군 A - 1 μg/ 10 μl 호모아이소플라베논 또는 50 μg/ 10 μl 덱사메타손(dexamethasone)을 처리; 대조군 - ;100 μM 포볼 12-미리스테이 트 13-아세테이트를 처리; 실험군 B -1 μg/10 μl 호모아이소플라베논 또는 50 μg/10 μl 덱사메타손과 100 μM 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트를 처리.In order to confirm in vitro cell experiments using HaCaT cells, which are human keratinocytes, hairless mice (SKH-1) were used as the following experiments. Treatment with only acetone without treatment with phorbol 12-myristate 13-acetate (TPA); Experimental group A-1 treated with 1 μg / 10 μl homoisoflavenone or 50 μg / 10 μl dexamethasone; Control-treated with 100 μM four-ball 12-myristate 13-acetate; Experimental group B-1 μg / 10 μl homoisoflavenone or 50 μg / 10 μl dexamethasone and 100 μM four-ball 12-myristate 13-acetate.

포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트를 처리하기 1 시간 전에 1 μg/ 10 μl 호모아이소플라베논 또는 50 μg/ 10 μl 덱사메타손을 5 μl씩 귀 앞뒤에 도포하였다. 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트를 도포한 뒤 6 시간 후에 귀 두께와 8 mm로 생검(biopsy) 한 후 귀의 무게를 쟀다.1 μg / 10 μl homoisoflavenone or 50 μg / 10 μl dexamethasone was applied before and after the ear 1 hour prior to treatment with Fourbolt 12-myristate 13-acetate. Six hours after application of Fourbolt 12-myristate 13-acetate, the biopsy was performed at ear thickness and 8 mm, and the ears were weighed.

그 결과, 도 4A 및 4B 에서 보듯이, 대조군의 생쥐(TPA)의 경우 귀의 두께와 무게가 증가했으나 호모아이소플라베논 또는 덱사메타손을 도포한 후 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트를 도포한 생쥐(실험군 B, TPA+HIF or TPA+DE)의 귀의 두께와 무게는 감소되어 있었다.As a result, as shown in Figs. 4A and 4B, in the control mice (TPA), the thickness and weight of the ears increased, but the mice coated with Poball 12-myristate 13-acetate after the application of homoisoflavenone or dexamethasone (experimental group) B, TPA + HIF or TPA + DE) ear thickness and weight were reduced.

또한 전반적인 피부 조직내 변화를 살펴보기 위하여 헤마토실린-에오신(hematoxylin-eosin) 염색을 실시한 결과, 도 4C에서 보듯이 무처리군의 생쥐의 경우(TPA) 표피(epidermis)의 과각질화(hyperplasia)가 많이 일어나고 염증세포 침투가 늘어나 있던 반면 호모아이소플라베논 또는 덱사메타손을 도포한 후 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트를 처리한 생쥐(실험군 B, TPA+HIF or TPA+DE)에는 현저히 표피의 과각질화가 감소되어 있었다.In addition, hematoxylin-eosin staining was performed to examine the changes in the overall skin tissue. As shown in FIG. 4C, hyperplasia of the epidermis was observed in the untreated group of mice (TPA). Increased and inflammatory cell infiltration increased, whereas mice treated with PoBol 12-myristate 13-acetate after applying homoisoflavenone or dexamethasone (Experimental B, TPA + HIF or TPA + DE) were significantly hyperkeratinized in the epidermis. Was reduced.

이러한 결과로 보아 호모아이소플라베논은 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트에 의해 발생한 피부 염증을 시중에 사용하고 있는 덱사메타손과 같이 효과적으로 방어할 수 있을 거라 생각되었다.These results suggest that homoisoflavenone could effectively protect against skin inflammation caused by PoBol 12-myristate 13-acetate as well as dexamethasone on the market.

<< 실시예Example 5> 5>

동물모델에서의 In animal models 아라키돈산(arachidonic acid)에In arachidonic acid 의해 유도된  Induced by 귀부종에On ear edema 대한  About 호모아이소플라베논의Homoisoflavinone 효과 effect

balb/c 마우스를 이용하여 다음과 같이 실험을 실시하였으며 실험군은 아래과 같다: 무처리군 - 아라키돈산(arachidonic acid)을 처리하지 않고 아세톤(acetone)만 처리 ; 대조군 - 아라키돈산을 처리; 실험군 A - 1 μg/ 10 μl 호모아이소플라베논 또는 50 μg/ 10 μl 덱사메타손과 100 mg/ml 10 μl 아라키돈산을 처리.The experiment was carried out using balb / c mice as follows. The experimental group was as follows: untreated group-only treated with acetone without arachidonic acid; Control group-treated with arachidonic acid; Experimental Group A-treated with 1 μg / 10 μl homoisoflavenone or 50 μg / 10 μl dexamethasone and 100 mg / ml 10 μl arachidonic acid.

아라키돈산을 처리하기 1 시간 전에 1 μg/ 10 μl 호모아이소플라베논 또는 50 μg/ 10 μl 덱사메타손을 5 μl씩 귀 앞뒤에 도포하였다. 100 mg/ml 10 μl 아라키도닉 에시드를 도포한 뒤 1 시간 후에 귀두께와 8 mm로 생검한 후 귀의 무게를 측정했다.1 μg / 10 μl homoisoflavenone or 50 μg / 10 μl dexamethasone was applied 5 μl before and after 1 hour before arachidonic acid treatment. One hour after application of 100 mg / ml 10 μl arachidonic acid biopsy at ear thickness and 8 mm, ear weights were measured.

그 결과, 도 5A 및 5B에서 보듯이, 대조군의 생쥐(AA)의 경우 귀의 두께와 무게가 증가했으나 호모아이소플라베논 또는 덱사메타손을 도포한 후 아라키돈산을 도포한 생쥐(실험군 A, AA+HIF or AA+DE)의 귀의 두께와 무게는 감소되어 있었다.As a result, as shown in Figures 5A and 5B, in the case of the control mice (AA), the thickness and weight of the ears increased, but the mice coated with arachidonic acid after the application of homoisoflavenone or dexamethasone (experimental group A, AA + HIF or AA + DE) ear thickness and weight were reduced.

이러한 결과로 보아 호모아이소플라베논은 아라키도닉 에시드에 의해 발생한 피부 염증을 시중에 사용하고 있는 덱사메타손과 같이 효과적으로 방어 할 수 있을 거라 생각되었다.These results suggest that homoisoflavenone could effectively protect against skin irritation caused by arachidonic acid as well as dexamethasone on the market.

<< 실시예Example 6> 6>

비만세포에서의 포볼 12-Four-Ball in Mast Cells 12- 미리스테이트Myristate 13-아세테이트와 A23187에 의하여 유도된  13-acetate and induced by A23187 염증인자에On inflammation factor 대한 호모아이소플라베논의 효과 Effect of Homoisoflavenone on

<6-1> <6-1> 호모아이소플라베논의Homoisoflavinone 포볼 12- Four-Ball 12- 미리스테이트Myristate 13-아세테이트와 A23187에 의한 루코트리엔( Leukotriene with 13-acetate and A23187 ( leukotrieneleukotriene )의 방출 억제 효과) Release inhibition effect

인간 비만세포는 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트와 A23187에 의하여 탈과립(degranulation)현상이 일어나 비만세포가 원래부터 가지고 있는 히스타민이나 세로토닌 뿐만 아니라 새로 합성된 전염증성 사이토카인, 프로스타글란딘, 루코트리엔(leukotriene) 등과 같은 염증인자들을 방출시킨다. 실시예 4, 5에서 보듯이 호모아이소플라베논이 항-염증효과가 있는 것을 확인하였기 때문에 비만세포에서의 항-염증효과를 다시 확인하였다.Human mast cells are degranulated by Fourbolt 12-myristate 13-acetate and A23187, resulting in the newly synthesized proinflammatory cytokines, prostaglandins, and rucotrienes, as well as histamine and serotonin that mast cells originally had. release inflammatory factors such as leukotriene. As shown in Examples 4 and 5, homoisoflavinone was confirmed to have an anti-inflammatory effect, and thus, the anti-inflammatory effect on mast cells was confirmed again.

HMC-1에서 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트와 A23187에 의하여 유도된 루코트리엔의 방출에 대한 호모아이소플라베논의 효과를 알아보기 위하여 HMC-1 세포를 100 mm의 배양접시에 1 x 106 개수의 세포가 되도록 접종한 후, 우태아 혈청이 10 % 포함된 IMDM(Iscove's modified Dulbecco's medium, GIBCO) 배지에서 48 시간 배양하였다. 그 후 호모아이소플라베논을 2 μg/ml, 비교약물인 미졸라스틴(mizolastine) 10 μg/ml 농도로 1 시간 처리한 후 루코트리엔의 방출을 유발하기 위하여 50 nM 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트와 1 μM A23187을 처리하여 21 시간 더 배양하였다. 상층액을 모아서 방출되는 루코트리엔 B4와 C4의 양을 루코트리엔 B4, C4 enzyme immunoassay kit(sapphire bioscience, 호주)로 측정하였다. To determine the effect of homoisoflavenone on the release of phobol 12-myristate 13-acetate and A23187-induced leukotrienes in HMC-1, HMC-1 cells were plated in a 100 mm culture dish at 1 × 10. After inoculating 6 cells, the cells were cultured in IMDM (Iscove's modified Dulbecco's medium, GIBCO) medium containing 10% fetal calf serum for 48 hours. After treatment with homoisoflavenone at 2 μg / ml and 10 μg / ml of the comparator mizolastine for 1 hour, 50 nM pobol 12-myristate 13 was used to induce the release of leukotrienes. Incubate for another 21 hours with acetate and 1 μM A23187. The amount of leukotrienes B4 and C4 released by collecting the supernatant was measured by leukotrienes B4 and C4 enzyme immunoassay kit (sapphire bioscience, Australia).

그 결과, 도 6A에서 보듯이, 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트와 A23187에 의하여 유도된 루코트리엔 B4의 방출이 호모아이소플라베논에 의하여 70%억제되었고, 미졸라스틴에 의하여 20% 억제되었으며 호모아이소플라베논과 미졸라스틴 단독만 처리한 경우는 아무것도 처리하지 않은 군과 별다른 차이가 없었다. 도 6B에서는 루코트리엔 C4의 방출은 호모아이소플라베논과 미졸라스틴 둘 다 90%이상 억제되는 것을 확인하였다. As a result, as shown in FIG. 6A, the release of leukotriene B4 induced by Fourbol 12-myristate 13-acetate and A23187 was 70% inhibited by homoisoflavenone and 20% inhibition by mizolastine. The homoisoflavinone and mizolastin alone treatments were not significantly different from the no treatment group. In Figure 6B it was confirmed that the release of rucotriene C4 is suppressed by more than 90% both homoisoflavenone and mizolastine.

<6-2> <6-2> 호모아이소플라베논의Homoisoflavinone 포볼 12- Four-Ball 12- 미리스테이트Myristate 13-아세테이트와 A23187 에 의한 전-염증성 사이토카인의 방출 억제 효과 Inhibitory Effect of 13-acetate and A23187 on Pro-inflammatory Cytokines

HMC-1에서 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트와 A23187에 의하여 유도된 루코트리엔의 방출에 대한 호모아이소플라베논의 효과를 알아보기 위하여 HMC-1 세포를 60 mm의 배양접시에 5 x 105 개수의 세포가 되도록 접종한 후, 우태아 혈청이 10 % 포함된 IMDM 배지에서 48 시간 배양하였다. 그 후 호모아이소플라베논을 2 μg/ml 농도로 1 시간 처리한 후 전-염증성 사이토카인의 방출을 유발하기 위하여 50 nM 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트와 1 μM A23187을 처리하여 5 시간 더 배양하였다. To determine the effect of homoisoflavenone on the release of phobol 12-myristate 13-acetate and A23187-induced leukotrienes in HMC-1, HMC-1 cells were treated with 5 x 10 in a 60 mm dish. After inoculating 5 cells, the cells were incubated for 48 hours in IMDM medium containing 10% fetal calf serum. After 1 hour treatment with homoisoflavenone at a concentration of 2 μg / ml, the cells were further incubated for 5 hours with 50 nM Fourbol 12-myristate 13-acetate and 1 μM A23187 to induce the release of pro-inflammatory cytokines. It was.

배양 후 염증 반응에 영향을 주는 전-염증성 사이토카인의 억제 정도를 측정하기 위하여 자외선 조사에 의하여 피부에서 주로 유도되는 IL-6, IL-8의 mRNA 발현정도를 RT-PCR로 알아보았다. In order to measure the degree of inhibition of pro-inflammatory cytokines affecting the inflammatory response after incubation, RT-PCR was used to determine the mRNA expression levels of IL-6 and IL-8 mainly induced in the skin by UV irradiation.

각 실험군의 세포에서 트리졸을 이용하여 RNA를 추출한 후, 이를 주형으로 PCR을 실시하여 각 실험군의 cDNA를 제조하였다. 만들어진 각각의 cDNA를 주형으로 상용의 IL-6, IL-8 프라이머 및 실시간 PCR을 이용하여 IL-6, IL-8의 mRNA 발현정도를 측정하였다. 세포내 전-염증성 사이토카인의 mRNA 발현정도는 무처리군에 대비하여 그 발현 정도를 나타내었다.RNA was extracted from the cells of each experimental group by using trizol, and PCR was performed as a template to prepare cDNA of each experimental group. MRNA levels of IL-6 and IL-8 were measured using commercially available IL-6, IL-8 primers, and real-time PCR. The mRNA expression level of intracellular pro-inflammatory cytokines was expressed in comparison to the untreated group.

그 결과, 도 6C 및 6D에서 보듯이, 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트와 A23187에 의하여 유도된 IL-6, IL-8의 방출이 호모아이소플라베논에 의하여 50%억제되었다. As a result, as shown in FIGS. 6C and 6D, release of IL-6 and IL-8 induced by Fourbolt 12-myristate 13-acetate and A23187 was 50% inhibited by homoisoflavenone.

호모아이소플라베논은 전-염증성 인자인 루코트리엔 B4의 방출 억제 및 IL-6, IL-8의 mRNA 발현 억제 효과뿐만 아니라 항-알레르기성 인자인 루코트리엔 C4의 방출 억제효과도 있어서 항-염증 효과뿐만 아니라 항-알레르기 효과도 있을 것으로 생각되었다.Homoisoflavenone inhibits the release of the pro-inflammatory factor rukotriene B4 and the mRNA expression of IL-6 and IL-8, as well as the anti-allergic factor rukotriene C4. It was thought that there would be anti-allergic effects as well as anti-inflammatory effects.

<< 실시예Example 7> 7>

비만세포에서의 포볼 12-Four-Ball in Mast Cells 12- 미리스테이트Myristate 13-아세테이트와 A23187에 의하여 유도된  13-acetate and induced by A23187 COXCOX -2 발현 기작에 대한 For -2 expression mechanism 호모아이소플라베논의Homoisoflavinone 효과 effect

<7-1> <7-1> 호모아이소플라베논의Homoisoflavinone 포볼 12- Four-Ball 12- 미리스테이트Myristate 13-아세테이트와 A23187에 의한  By 13-acetate and A23187 COXCOX -2 발현 억제 효과-2 expression inhibition effect

인간 비만 세포에서의 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트와 A23187에 유도된 COX-2 발현에 대한 호모아이소플라베논의 효과를 알아보기 위하여 HMC-1 세포를 100 mm의 배양접시에 1 x 106 개수의 세포가 되도록 접종한 후, 우태아 혈청이 10 % 포함된 IMDM 배지에서 48 시간 배양하였다. 그 후 호모아이소플라베논 2 μg/ml, 비교약물인 셀레콕시브(celecoxib)를 60 μM 농도로 1 시간 처리한 후 COX-2를 유발하기 위하여 50 nM 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트와 1 μM A23187을 처리하여 21 시간 더 배양하였다. 이를 염소 항-COX-2 항체 (santacruz)와 2차 항체로 항-염소 IgG-HRP 결합 항체(zymed)를 이용한 것을 제외하고 상기 실시예 2-1과 동일하게 하여 웨스턴 블럿을 수행하였다. To determine the effect of homoisoflavenone on pobol 12-myristate 13-acetate and A23187-induced COX-2 expression in human mast cells, HMC-1 cells were harvested in 1 x 10 6 cells in a 100 mm culture dish. Cells were inoculated so that the cells were incubated for 48 hours in IMDM medium containing 10% fetal bovine serum. Subsequently, 1 μg of homoisoflavenone and the comparative drug celecoxib at 60 μM for 1 hour were treated with 50 nM Fourbol 12-myristate 13-acetate and 1 μM to induce COX-2. A23187 was treated and incubated for another 21 hours. Western blot was performed in the same manner as in Example 2-1, except that anti-goat IgG-HRP binding antibody (zymed) was used as a goat anti-COX-2 antibody (santacruz) and a secondary antibody.

그 결과, 도 7A에서 보듯이 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트와 A23187로 유도된 COX-2의 발현이 호모아이소플라베논에 의해서 80%, 셀레콕시브에 의해서 50% 억제되었으며 이는 시중에 사용되고 있는 셀레콕시브보다 더 좋은 효과가 있을 것으로 사료된다.As a result, as shown in FIG. 7A, expression of COB-2 induced by Fourbolt 12-myristate 13-acetate and A23187 was suppressed by homoisoflavenone by 80% and by celecoxib by 50%. It is thought to have a better effect than celecoxib.

<7-2> <7-2> 호모아이소플라베논의Homoisoflavinone 포볼 12- Four-Ball 12- 미리스테이트Myristate 13-아세테이트와 A23187에 의한 5- 5- with 13-acetate and A23187 LOXLOX 의 핵막으로의 이동 억제 효과Effect of inhibiting migration to nuclear membrane

인간 비만 세포에서의 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트와 A23187에 유도된 5-LOX의 세포질에서 핵막쪽으로의 이동에 대한 호모아이소플라베논의 효과를 알아보기 위하여 HMC-1 세포를 100 mm의 배양접시에 1 x 106 개수의 세포가 되도록 접종한 후, 우태아 혈청이 10 % 포함된 IMDM 배지에서 48 시간 배양하였다. 그 후 호모아이소플라베논 2 μg/ml 농도로 1 시간 처리한 후 5-LOX의 핵막으로의 이동을 유도하기 위하여 50 nM 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트와 1 μM A23187을 처 리하여 5 시간 더 배양하였다. To investigate the effect of homoisoflavenone on the migration of pobol 12-myristate 13-acetate and A23187-induced 5-LOX cytoplasm to nuclear membrane in human mast cells, HMC-1 cells were plated at 100 mm. Inoculated to 1 x 10 6 cells, and then cultured for 48 hours in IMDM medium containing 10% fetal calf serum. After 1 hour treatment with 2 μg / ml homoisoflavenone concentration, 50 nM four-ball 12-myristate 13-acetate and 1 μM A23187 were further incubated for 5 hours to induce migration to 5-LOX nuclear membrane. It was.

이렇게 배양된 세포에서의 5-LOX의 핵막으로의 이동을 알기 위하여 핵막단백질을 먼저 분리해주었다. 각각의 조건으로 처리된 시험그룹의 세포를 10 mM Hepes/KOH, 0.1 mM EDTA, 10% NP-40, 10mM KCl, 1 mM DTT, 0.5 mM PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride) 그리고 프로테아제 억제제 칵테일(a protease inhibitor cocktail)이 들어있는 완충액으로 얼음위에서 10분 동안 용해시킨 뒤 원심분리를 하여, 상층액(세포질 단백질) 및 펠렛(pellet, 핵막단백질)을 분리하였다. 세포질 단백질은 -80도에 보관하고, 펠렛은 10 mM Hepes/KOH, 0.1 mM EDTA, 10% NP-40, 300 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.5 mM PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride) 그리고 프로테아제 억제제 칵테일(a protease inhibitor cocktail)이 들어있는 완충액으로 얼음위에서 30분 동안 흔들어주면서 용해시킨 뒤 원심분리를 하여 상층액(핵 단백질)을 분리하였다. 이렇게 분리한 세포질 단백질과 핵단백질을 8% 아크릴아마이드 겔(acrylamide gel)을 이용하여 SDS-PAGE 전기영동으로 단백질을 분리하였다. 이를 나일론 멤브레인에 옮긴 후 토끼 항-5-LOX 항체 (cayman)와 2차 항체로 항-토끼 IgG-HRP 결합 항체(zymed)를 이용한 것을 제외하고 상기 실시예 2-1과 동일하게 하여 웨스턴 블럿을 수행하였다. In order to know the migration of 5-LOX to the nuclear membrane in the cultured cells, the nuclear membrane protein was first isolated. Cells from each group treated with each condition were treated with 10 mM Hepes / KOH, 0.1 mM EDTA, 10% NP-40, 10 mM KCl, 1 mM DTT, 0.5 mM PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride) and a protease inhibitor cocktail. ) Was dissolved on ice for 10 minutes and then centrifuged to separate supernatant (cytoplasmic protein) and pellet (pellet, nuclear membrane protein). Cellular proteins are stored at -80 degrees and pellets are 10 mM Hepes / KOH, 0.1 mM EDTA, 10% NP-40, 300 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.5 mM PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride) and a protease inhibitor cocktail (a protease). The buffer containing the inhibitor cocktail was dissolved by shaking for 30 minutes on ice and centrifuged to separate the supernatant (nuclear protein). Proteins and nucleoproteins thus separated were separated by SDS-PAGE electrophoresis using 8% acrylamide gel. This was transferred to a nylon membrane, and Western blot was prepared in the same manner as in Example 2-1 except for using a rabbit anti-5-LOX antibody (cayman) and an anti-rabbit IgG-HRP binding antibody (zymed) as a secondary antibody. Was performed.

그 결과, 도 7B에서 보듯이 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트와 A23187로 유도된 5-LOX의 핵막쪽으로의 이동이 호모아이소플라베논에 의해서 억제되었으며 이로 인하여 실시예 6에서와 같이 루코트리엔의 방출이 줄어들었음을 확인하였다. As a result, as shown in FIG. 7B, the migration of four-LOX induced by Fourbolt 12-myristate 13-acetate and A23187 to the nuclear membrane was inhibited by homoisoflavenone, thereby rukotriene as in Example 6. It was confirmed that the emission of was reduced.

<7-3> <7-3> 호모아이소플라베논의Homoisoflavinone 포볼 12- Four-Ball 12- 미리스테이트Myristate 13-아세테이트와 A23187에 의한  By 13-acetate and A23187 COXCOX -2 발현/ 5-LOX 핵막으로의 이동 기작 확인-2 expression / Confirmation of migration mechanism to 5-LOX nuclear membrane

인간 비만 세포에서 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트와 A23187에 의하여 세포내의 칼슘농도가 높아짐에 따라 cPLA2가 세포질에서 핵내로 이동함으로써 아라키돈산이 방출되고 그 아라키돈산이 COX나 LOX같은 효소에 의해서 프로스타글란딘이나 루코트리엔이 방출되어 염증반응이 일어나거나 알레르기반응이 유도된다. As intracellular calcium levels increase in human mast cells by the pobol 12-myristate 13-acetate and A23187, cPLA 2 migrates from the cytoplasm to the nucleus, releasing arachidonic acid, and the arachidonic acid is released by enzymes such as COX or LOX. The release of cortiene causes inflammatory reactions or allergic reactions.

비만세포에서 cPLA2의 인산화는 ERK의 인산화에 의한 것이라는 보고가 있어서 cPLA2와 ERK의 인산화에 호모아이소플라베논이 어떤 효과가 있는지 확인하였다.Phosphorylation of cPLA 2 in mast cells was reported to be due to phosphorylation of ERK. Therefore, we confirmed the effect of homoisoflavenone on phosphorylation of cPLA 2 and ERK.

HMC-1에서의 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트와 A23187에 유도된 COX-2 발현에 대한 호모아이소플라베논의 효과를 알아보기 위하여 HMC-1 세포를 100 mm의 배양접시에 1 x 106 개수의 세포가 되도록 접종한 후, 우태아 혈청이 10 % 포함된 IMDM 배지에서 48 시간 배양하였다. 그 후 호모아이소플라베논 2 μg/ml, 비교약물인 셀레콕시브 60 uM 농도로 1 시간 처리한 후 50 nM 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트와 1 uM A23187을 처리하여 cPLA2의 인산화는 4 시간, ERK의 인산화는 30 분간 더 배양하였다. 각각 토끼 항-p-cytosolic phospholipase A2 (cPLA2) 항체, 토끼 항-cPLA2 항체, 토끼 항-ERK 항체, 토끼 항-p-ERK 항체 (cell signaling)와 2차 항체로 항-토끼 IgG-HRP 결합 항체(zymed)를 이용한 것을 제외하고 상기 실시예 2-1과 동일하게 하여 웨스턴 블럿을 수행하였다. To determine the effect of homoisoflavenone on pobol 12-myristate 13-acetate and A23187-induced COX-2 expression in HMC-1, HMC-1 cells were cultured in 1 x 10 6 cells in a 100 mm culture dish. Cells were inoculated so that the cells were incubated for 48 hours in IMDM medium containing 10% fetal bovine serum. Subsequently, 1 μg of homoisoflavenone at 2 μg / ml and 60 μM of celecoxib as a comparative drug was treated for 1 hour, followed by treatment with 50 nM of povol 12-myristate 13-acetate and 1 uM A23187 for 4 hours of phosphorylation of cPLA 2 . , Phosphorylation of ERK was further incubated for 30 minutes. Anti-rabbit IgG-HRP as rabbit anti-p-cytosolic phospholipase A2 (cPLA 2 ) antibody, rabbit anti-cPLA 2 antibody, rabbit anti-ERK antibody, rabbit anti-p-ERK antibody (cell signaling) and secondary antibody, respectively Western blot was performed in the same manner as in Example 2-1 except that a binding antibody (zymed) was used.

그 결과, 도 7C에서 보듯이 cPLA2의 인산화가 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트와 A23187에 의해서 일어나는데 호모아이소플라베논에 의하여 아무것도 처리하지 않은 그룹과 같은 정도로 억제되지만, ERK의 인산화에는 영향이 없는 것을 보았다. 호모아이소플라베논은 ERK의 인산화는 억제하지 않고 cPLA2의 인산화를 억제함으로써 COX-2의 발현과 5-LOX의 핵막으로의 이동을 억제함을 알 수 있었다. As a result, as shown in FIG. 7C, phosphorylation of cPLA 2 is caused by Phobol 12-myristate 13-acetate and A23187, which is inhibited to the same degree as the group treated nothing by homoisoflavenone, but does not affect the phosphorylation of ERK. I saw that. Homoisoflavenone inhibited the expression of COX-2 and the migration of 5-LOX to the nuclear membrane by inhibiting phosphorylation of cPLA 2 without inhibiting phosphorylation of ERK.

<< 실시예Example 8> 8>

비만세포주에서의In mast cell lines 포볼 12- Four-Ball 12- 미리스테이트Myristate 13-아세테이트와 A23187에 의하여 유도된 탈과립에 대한  For degranulation induced by 13-acetate and A23187 호모아이소플라베논(homoisoflavanone)의Of homoisoflavanone 효과 effect

인간 비만 세포에서 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트와 A23187에 의하여 탈과립 현상이 일어나며 그로 인하여 히스타민, 세로토닌같은 물질이 밖으로 방출되어 알레르기반응을 유도한다. 도 6에서 전-염증성 사이토카인이 방출되는 것도 탈과립과 관련이 되어 있기에 호모아이소플라베논이 탈과립에도 영향을 미치는지 알아보았다.In human mast cells, degranulation occurs by Fourbolt 12-myristate 13-acetate and A23187, which releases histamine and serotonin, causing allergic reactions. In Figure 6, the release of the pro-inflammatory cytokine is also related to degranulation, so it was examined whether homoisoflavinone also affected degranulation.

HMC-1에서의 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트와 A23187에 유도된 COX-2 발현에 대한 호모아이소플라베논의 효과를 알아보기 위하여 HMC-1 세포를 6 웰 플레이트에 1 x 105 개수의 세포가 되도록 접종한 후, 우태아 혈청이 10 % 포함된 IMDM 배지에서 48 시간 배양하였다. 그 후 호모아이소플라베논을 2 μg/ml 농도로 1 시간 처리한 후 COX-2를 유발하기 위하여 50 nM 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트와 1 uM A23187을 처리하여 6 시간 더 배양하였다. 세포를 2.5% 글루타르알데하이드(glutaraldehyde)로 고정시킨다. 액체질소로 세포를 얼려서 PCR 뚜껑에 고정시켜 열을 가하여 세포를 플레이트로부터 떼어낸 뒤 60-80 μm로 자른 뒤 그리드(grid)에 부착시킨 뒤 투과전자현미경(TEM)을 이용하여 세포를 관찰하였다. To determine the effect of homoisoflavenone on pobol 12-myristate 13-acetate and A23187-induced COX-2 expression in HMC-1, HMC-1 cells were placed in 6-well plates with 1 x 10 5 cells. After inoculation to be incubated for 48 hours in IMDM medium containing 10% fetal calf serum. Thereafter, the homoisoflavenone was treated with 2 μg / ml for 1 hour, and then incubated for 6 hours with 50 nM four-ball 12-myristate 13-acetate and 1 uM A23187 to induce COX-2. The cells are fixed with 2.5% glutaraldehyde. Cells were frozen in liquid nitrogen, fixed in PCR lids, and heated to remove cells from the plates, cut to 60-80 μm, attached to a grid, and observed using a transmission electron microscope (TEM).

탈과립시 방출되는 히스타민을 측정하기 위하여 세포 상층액을 일정량 모은 다음 histamine enzymeassay kit(cayman, 미국)을 이용하여 제조사의 지침에 따라서 다음과 같이 측정하였다. 먼저 항-히스타민이 코팅되어 있는 곳에 모은 상층액을 유도체화반응을 시킨 후 histamine-AChE tracer와 같이 반응시켰다. 그리고 수세용액으로 5 회 이상 수세한 후 발색용액으로 60-90 분 발색시켜 414 nm에서 흡광도를 측정하였다.In order to measure the histamine released during degranulation, a certain amount of cell supernatant was collected and then measured using the histamine enzymeassay kit (cayman, USA) according to the manufacturer's instructions. First, the supernatant collected where anti-histamine was coated was derivatized and reacted with histamine-AChE tracer. After washing with a washing solution five times or more, the color was developed for 60-90 minutes and the absorbance was measured at 414 nm.

아울러, 쥐(rat) 비만 세포에서 항원(antigen)에 의한 탈과립 현상에 호모아이소플라베논이 어떤 영향을 미치는지 알아보았다. 쥐 비만세포를 6 웰 플레이트에 5 x 104 개수의 세포가 되도록 접종한 후, 우태아 혈청이 15 % 포함된 MEM 배지에서 24 시간 배양하였다. 1 μg/ml DNP-IgE 을 16시간동안 반응시켜준 뒤 PBS로 수세하여 DNP-IgE를 제거해 준 뒤 15% MEM에서 6시간 배양시켰다. 호모아이소플라베논을 tyrode's 완충액에서 30분 동안 전처리하여 준 뒤 DNP-HSA(human serum albumin) 10 ng/ml을 처리하여 항원에 유도되는 신호를 전달시켜 탈과립을 유도시켰다. 30분 뒤 상층액은 따로 모아두고 펠렛은 0.5% triton X-100 500μl로 용해시켰다. 상층액과 펠렛을 용해시킨 샘플 70 μl와 0.1M 시트르산 나트륨(soduium citrate, PH 4.5)에 녹아 있는 8 mM 파라-니트로페닐 N-아세틸-β-D-글루코사미니드(p-nitrophenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide) 70μl와 90분 동안 37℃에서 배양시킨 뒤 0.2M 글리신(glycine, PH 10.7) 70 μl를 더 첨가하여 반응을 정지시킨 뒤 흡광도 405nm에서 측정하였다. 전체 효소 활성은 다음과 같은 수식으로 측정하였다. In addition, we examined the effect of homoisoflavenone on degranulation by antigen in rat mast cells. Rat mast cells were seeded in 6 well plates to give 5 × 10 4 cells, followed by incubation for 24 hours in MEM medium containing 15% fetal bovine serum. 1 μg / ml DNP-IgE was reacted for 16 hours, washed with PBS to remove DNP-IgE, and incubated in 15% MEM for 6 hours. Homoisoflavenone was pretreated in tyrode's buffer for 30 minutes and then treated with 10 ng / ml of DNP-HSA (human serum albumin) to deliver an antigen-induced signal to induce degranulation. After 30 minutes, the supernatant was collected and the pellet was dissolved in 500 μl of 0.5% triton X-100. 8 mM dissolved in 70 μl samples with 0.1M sodium citrate (soduium citrate, PH 4.5) was dissolved in the supernatant and pellet p-nitrophenyl N- acetyl -β-D- glucoside Sami Need (p -nitrophenyl N-acetyl- After incubating at 70 ° C. for 70 minutes with 70 μl of β-D-glucosaminide, 70 μl of 0.2 M glycine (PH 10.7) was added to stop the reaction, and the absorbance was measured at 405 nm. Total enzyme activity was measured by the following formula.

방출양 = (상층액 blank) ÷ ((상층액+펠렛) blank) × 100%Release amount = (supernatant blank) ÷ ((supernatant + pellet) blank) × 100%

그 결과, 도 8A에서 보듯이 포볼 12-미르스테이트 13-아세테이트에 의해서 세포 내 물질들이 빠져나간 것이 호모아이소플라베논에 의해서 세포 내 물질이 빠져나가는 것이 억제되는 것을 알 수 있었다. 또한, 도 8B에서 보듯이 세포 내 물질 중 히스타민 방출을 확인한 결과 호모아이소플라베논에 의하여 72%가 억제되는 것을 알 수 있었다. 또한, 도 8C에서 보듯이, 쥐 비만세포에서 항원에 의한 탈과립이 호모아이소플라베논에 의하여 농도의존적으로 억제되며 2 μg/ml에서는 50%가 억제되는 것을 알 수 있었다. 따라서, 호모아이소플라베논은 비만세포의 탈과립을 억제해주는 효과가 있으므로 이는 항-알레르기 효과가 있음을 알 수 있었다. As a result, as shown in FIG. 8A, it was found that the intracellular substances escaped by Fourbol 12-Mirstate 13-acetate inhibited the intracellular substances escaped by homoisoflavenone. In addition, as shown in FIG. 8B, the histamine release in the intracellular material was confirmed to be 72% inhibited by homoisoflavenone. In addition, as shown in Figure 8C, it was found that the degranulation by the antigen in the mouse mast cells is suppressed concentration-dependently by homoisoflavinone and 50% at 2 μg / ml. Therefore, homoisoflavinone was found to have an anti-allergic effect because it has an effect of inhibiting degranulation of mast cells.

<< 실시예Example 9> 9>

혼합림프구반응(Mixed lymphocyte reaction MixedMixed LymphocyteLymphocyte ReactionReaction :  : MLRMLR )에 대한 호모아이소플라베논(Homoisoflavenone () for homoisoflavanonehomoisoflavanone )의 효과) Effect

호모아이소플라베논에 의한 T cell 증식억제를 확인하기 위하여 혼합림프구반응(Mixed Lymphocyte Reaction: MLR)을 수행하였다. 각각 다른 MHC 클래스(class)를 가진 계통의 마우스의 면역세포들을 혼합 배양하면 다른 MHC를 가진 세포를 각 T 세포들이 외부 항원으로 인식하여 증식하게 된다. 그 중 한 계통에서의 반응만을 보기 위하여 한 방향(one-way) 혼합림프구반응을 수행하였다. 먼저 Balb/C와 C57B/C 마우스의 비장을 적출하여 단일 세포화 하고 적혈구를 용해시켰다. Balb/C의 비장세포에 25Gy의 γ-선를 조사하여 Balb/C의 T 세포를 무력화 하고 U-bottom 96 웰 플레이트에 Balb/C와 C57B/C의 비장세포를 각각 5 X 105, 2 X 105 개씩 혼합하였다. 이 때 호모아이소플라베논을 동시에 처리하여 5% CO2, 37℃ 조건 의 배양기에서 56 시간 배양 후 3[H]-티미딘(thymidine)을 0.5 씩 각 웰에 추가 하여 16 시간 추가 배양하였다. 배양이 끝난 후 필터 페이퍼(filter paper)에 각 웰의 세포를 모아 바이얼(vial)에 넣고 신틸레이션(scintillation) 용액을 2 ml 추가 후 β-계수기로 CPM(count per minutes)값을 측정하였다.Mixed Lymphocyte Reaction (MLR) was performed to confirm the inhibition of T cell proliferation by homoisoflavinone. When mixed and cultured with immune cells of mice of strains having different MHC classes, cells with different MHCs are recognized as external antigens and proliferated. One-way mixed lymphocyte reaction was performed to see only the reaction in one system. First, the spleens of Balb / C and C57B / C mice were extracted, single cellized, and lysed. Irradiate 25Gy γ-rays to Balb / C splenocytes to neutralize Balb / C T cells, and transfer the Balb / C and C57B / C splenocytes to U-bottom 96 well plates 5 X 10 5 and 2 X 10, respectively. 5 pieces each. At this time, homoisoflavinone was simultaneously treated and cultured for 56 hours in a 5% CO 2 , 37 ° C. incubator, and 3 [H] -thymidine was added to each well for 0.5 hours to incubate for 16 hours. After incubation, the cells of each well were collected in a filter paper, put in a vial, 2 ml of a scintillation solution was added, and CPM (count per minutes) value was measured with a β-counter.

그 결과, 도 9에서 보듯이, 호모아이소플라베논의 첨가시 0.25 μg/ml 이상의 농도에서 농도의존적으로 T 세포의 증식을 효과적으로 억제함을 알 수 있었다. As a result, as shown in Figure 9, it was found that the addition of homoisoflavenone effectively inhibits the proliferation of T cells at a concentration-dependent concentration of 0.25 μg / ml or more.

<< 실시예Example 10> 10>

동물모델에서 여러 자극(자외선, Multiple stimuli in the animal model (ultraviolet, 크로톤Croton 오일)에 의해 유도된  Induced by oil) 귀부종에On ear edema 대한 호모아이소플라베논( For homoisoflavonen homoisoflavanonehomoisoflavanone )의 효과) Effect

<10-1> 자외선 조사에 의해 유도된 <10-1> induced by ultraviolet irradiation 귀부종에On ear edema 대한  About 호모아이소플라베논의Homoisoflavinone 효과 effect

balb/c 마우스를 무처리군(자외선을 처리하지 않고 아세톤(acetone)만 처리); 대조군(자외선 7.5 KJ/m2를 조사) 및 실험군(0.6 또는 1 μg/ 10 μl 호모아이소플라베논를 처리하고, 자외선 7.5 KJ/m2를 조사)으로 나눈 다음 자외선 조사에 의해 유도된 귀 부종에 대한 효과를 확인하였다. balb / c mice were treated in the untreated group (not treated with ultraviolet but only with acetone); After dividing the control group (irradiated with UV 7.5 KJ / m 2 ) and the experimental group (treated with 0.6 or 1 μg / 10 μl homoisoflavenone and irradiated with 7.5 KJ / m 2 UV), the ear edema induced by ultraviolet irradiation The effect was confirmed.

호모아이소플라베논의 처리시 자외선 7.5 KJ/m2를 조사하기 1 시간 전에 0.6 혹은 1 μg/ 10 μl 호모아이소플라베논을 5 μl씩 귀 앞뒤에 도포하였다. 자외선을 조사한 뒤 72 시간 후에 귀 두께를 측정했다.One hour before or after irradiation with 7.5 KJ / m 2 of ultraviolet light at the time of treatment of homoisoflavenone, 0.6 or 1 μg / 10 μl homoisoflavenone was applied to the front and rear of each ear. Ear thickness was measured 72 hours after irradiation with ultraviolet rays.

그 결과, 도 10A 에서는 보듯이, 대조군의 생쥐(자외선 조사를 처리)의 경우 귀의 두께가 증가했으나 호모아이소플라베논을 도포한 후 자외선을 조사한 실험군의 생쥐의 경우 귀의 두께가 44%(0.6μg/ear), 52%(1μg/ear)로 농도의존적으로 감소되어 본 발명의 호모아이소플라베논이 귀의 부종을 감소시킴을 알 수 있었다.As a result, as shown in Fig. 10A, the thickness of the ear was increased in the control mice (treated with ultraviolet radiation), but the thickness of the ears was 44% (0.6 μg / ear), 52% (1 μg / ear) concentration-dependently reduced was confirmed that the homoisoflavenone of the present invention reduces the edema of the ear.

<10-2> <10-2> 크로톤Croton 오일에 유도된 일시적인  Transient induced in oil 귀부종에On ear edema 대한  About 호모아이소플라베논의Homoisoflavinone 효과 effect

무모 (Hairless) 생쥐를 무처리군(크로톤 오일을 처리하지 않고 아세톤만 처리); 대조군(1.6% 크로톤 오일을 처리) 및; 실험군(1 μg/ 10 μl 호모아이소플라베논과 1.6% 크로톤 오일을 처리)으로 나눈 다음 크로톤 오일에 의해 유도된 귀 부종에 대한 효과를 확인하였다.Hairless mice were treated in the untreated group (not treated with croton oil but with acetone only); Control (treated with 1.6% croton oil) and; After dividing into experimental group (treated with 1 μg / 10 μl homoisoflavenone and 1.6% croton oil), the effect on ear edema induced by croton oil was confirmed.

호모아이소플라베논의 처리시 1.6% 크로톤 오일을 처리하기 1 시간 전에 1 μg/ 10 μl 호모아이소플라베논을 5 μl씩 귀 앞뒤에 도포하였다. 크로톤 오일을 처리한 뒤 6 시간 후에 귀두께를 측정했다.1 μg / 10 μl Homoisoflavenone was applied 5 μl before and after the ear 1 hour before treatment with 1.6% croton oil. Ear thickness was measured 6 hours after treatment with croton oil.

그 결과, 도 10B 에서는 보듯이, 대조군의 생쥐(크로톤 오일을 처리)의 경우 귀의 두께가 증가했으나 호모아이소플라베논을 도포한 후 1.6% 크로톤 오일을 처리한 생쥐 (croton oil+HIF)의 귀의 두께가 63% 감소되었다.As a result, as shown in Fig. 10B, the thickness of the ears increased in the control mice (croton oil treatment), but the thickness of the ears (croton oil + HIF) treated with 1.6% croton oil after applying homoisoflavenone Decreased 63%.

이러한 결과로 보아 호모아이소플라베논은 피부의 여러 자극에 의해 발생한 피부부종 및 염증을 완화시켜줌을 알 수 있었다.These results show that homoisoflavenone relieves skin edema and inflammation caused by various stimuli of the skin.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 호모아이소플라베논 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 또는 알레르기 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 염증 발생시 생성되는 활성산소군, COX-2, 전-염증성 싸이토카인의 생성을 억제하고, 동물실험에서도 귀 부종 및 과각질화를 억제함으로써 여러 염증성 질환에 효과적으로 이용될 수 있으며, 류코트리엔 C4, 히스타민 생성 억제, 비만세포의 탈과립, T 림프구 증식 억제 효과가 있어 알레르기 질환의 예방 및 치료의 목적으로 사용할 수 있다.As described above, the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of inflammatory diseases or allergic diseases comprising homoisoflavenone or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient. The composition of the present invention can be effectively used for various inflammatory diseases by inhibiting the production of reactive oxygen groups, COX-2, pro-inflammatory cytokines produced when inflammation occurs, and inhibiting ear edema and hyperkeratosis even in animal experiments, and leukotriene C4 Inhibition of histamine production, degranulation of mast cells, T lymphocyte proliferation inhibitory effect can be used for the prevention and treatment of allergic diseases.

도 1은 화학식 1의 호모아이소플라베논의 세포내 활성산소군의 억제 효과를 나타낸 것이다(Con : 무처리군; HIF- 실험군 A; UVB 20mJ/cm2 : 대조군; U+H : 실험군 B).Figure 1 shows the inhibitory effect of the intracellular active oxygen group of homoisoflavenone of the formula (Con: untreated group; HIF- experimental group A; UVB 20mJ / cm 2 : control group; U + H: experimental group B).

도 2는 호모아이소플라베논의 인간 각질세포에서의 COX-2 발현 억제 효과를 나타낸 것 및 PLA2 (b) MAPK(c,d) 및 NF-κB(e) 신호전달에 미치는 영향을 나타낸 것이다(pcPLA2 : 인산화된 PLA2, pERK : 인산화된 ERK, pp38 : 인산화된 P38). Figure 2 shows the effect of homoisoflavinone inhibiting COX-2 expression in human keratinocytes and PLA2 (b) MAPK (c, d) and NF-κB (e) signaling (pcPLA2) : Phosphorylated PLA2, pERK: phosphorylated ERK, pp38: phosphorylated P38).

도 3은 전-염증성 사이토카인인 IL-6, IL-8, TNF-α에 대해서 호모아이소플라베논의 억제효과를 나타낸 것이다Figure 3 shows the inhibitory effect of homoisoflavinone against the pro-inflammatory cytokines IL-6, IL-8, TNF-α

도 4는 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트에 의해 유도된 피부손상에서의 호모아이소플라베논과 덱사메타손의 억제효과를 나타낸 것이다.Figure 4 shows the inhibitory effect of homoisoflavenone and dexamethasone on skin damage induced by Fourbolt 12-myristate 13-acetate.

도 5는 아라키도닉 에시드에 의해 유도된 피부손상에서의 호포아이소플라베논과 덱사메타손의 억제효과를 나타낸 것이다.Figure 5 shows the inhibitory effect of phosphoflavone and dexamethasone on skin damage induced by arachidonic acid.

도 6은 호모아이소플라베논의 인간 비만세포에서 leukotriene 방출과 전-염증성 사이토카인인 IL-6, IL-8의 억제효과를 나타낸 것이다.Figure 6 shows the inhibitory effect of leukotriene release and pro-inflammatory cytokines IL-6 and IL-8 in human mast cells of homoisoflavenone.

도 7은 호모아이소플라베논의 인간 비만세포에서 COX-2의 발현 (a)과 5-LOX의 translocation의 억제효과 (b) , cPLA2 (c)의 인산화 억제효과 및 ERK(c)의 인산화 유지함을 나타낸 것이다.Figure 7 shows the inhibitory effect of COX-2 expression (a) and the translocation of 5-LOX in human mast cells of homoisoflavenone (b), phosphorylation inhibitory effect of cPLA 2 (c) and phosphorylation of ERK (c) It is shown.

도 8은 호모아이소플라베논의 비만세포주에서 탈과립 억제효과를 투과전자 현미경 관찰(a), 히스타민 방출(b) 헥소사미니다아제(hexosaminidase) 방출 (c) 변화로 나타낸 것이다.Figure 8 shows the degranulation inhibitory effect of homoisoflavenone in mast cell line by transmission electron microscopy (a), histamine release (b) hexosaminidase release (c) changes.

도 9는 호모아이소플라베논의 쥐의 면역세포의 T 세포증식억제 효과를 나타낸 것이다.Figure 9 shows the effect of suppressing T cell proliferation of immune cells of the mouse homoisoflavinone.

도 10은 호모아이소플라베논의 자극성 피부염 (UVB (a), 크로톤 오일(b))에 대한 효과를 나타낸 것이다. FIG. 10 shows the effects of homoisoflavenone on irritant dermatitis (UVB (a), croton oil (b)).

Claims (6)

하기 화학식 1로 표시되는 호모아이소플라베논(homoisoflavanone) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 염증성 피부 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.A pharmaceutical composition for preventing and treating inflammatory skin diseases comprising homoisoflavanone represented by the following Chemical Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient. <화학식 1><Formula 1>
Figure 712011003150146-pat00002
Figure 712011003150146-pat00002
 (상기 식에서 R은 OCH3이다.)(Wherein R is OCH 3 ) 삭제delete 제1항에 있어서, 상기 염증성 피부질환은 피부 염증, 급·만성 습진, 접촉성 피부염, 아토피성 피부염, 지루성 피부염, 만성단순태선, 간찰진, 박탈 피부염, 구진상 두드러기, 급만성태선양 피부염, 자극성 피부염, 박탈성 피부염, 비만세포증 및 건선으로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 조성물.The method of claim 1, wherein the inflammatory skin disease is skin inflammation, acute and chronic eczema, contact dermatitis, atopic dermatitis, seborrheic dermatitis, chronic simple tachycardia, interrogation, deprived dermatitis, papular urticaria, acute dermatitis, irritant A composition, characterized in that selected from the group consisting of dermatitis, deprived dermatitis, mastocytosis and psoriasis. 하기 화학식 1로 표시되는 호모아이소플라베논(homoisoflavanone) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 알레르기성 피부염 예방 및 치료용 약학적 조성물.A pharmaceutical composition for preventing and treating allergic dermatitis comprising a homoisoflavanone represented by the following Chemical Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient. <화학식 1><Formula 1>
Figure 712011003150146-pat00013
Figure 712011003150146-pat00013
 (상기 식에서 R은 OCH3이다.)(Wherein R is OCH 3 ) 삭제delete 제4항에 있어서, 상기 알레르기성 피부염은 아토피 피부염, 접촉성 알레르기 피부염, 알레르기성 두드러기 및 약진으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 조성물.The composition of claim 4, wherein the allergic dermatitis is selected from the group consisting of atopic dermatitis, contact allergic dermatitis, allergic urticaria and weakness.
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