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KR101002443B1 - Ｒｓ7 항체 - Google Patents

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KR101002443B1
KR101002443B1 KR1020047013664A KR20047013664A KR101002443B1 KR 101002443 B1 KR101002443 B1 KR 101002443B1 KR 1020047013664 A KR1020047013664 A KR 1020047013664A KR 20047013664 A KR20047013664 A KR 20047013664A KR 101002443 B1 KR101002443 B1 KR 101002443B1
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humanized
diagnostic
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세렌그램 고비던
젱싱 큐
한스 제이. 한센
데이비드 엠. 골든베르그
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이뮤노메딕스, 인코오포레이티드
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Abstract

본 발명은 단가(monovalent) 및 다가(multivalent), 단특이성(monospecific) 결합단백질, 및 다가, 다중특성(multispecific) 결합단백질에 관한 것이다. 상기 결합 단백질의 한 실시형태는 각 결합부위가 표적 항원 또는 표적 항원의 에피토프(epitope)와 결합하는 하나 이상의 결합부위를 갖는다. 상기 결합 단백질의 다른 실시형태는 각 결합부위가 표적 항원위 상이한 에피토프에 친화력을 갖거나, 표적 항원 또는 합텐(hapten)에 친화력을 갖는 두개 이상의 결합부위를 갖는다. 게다가, 본 발명은 숙주(host)에서 상기 기능성 결합단백질(functional binding protein)의 발현에 유용한 재조합 벡터(recombinant vector)에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 RS7로 제작된 종양관련 항원 결합단백질에 관한 것이다. 게다가, 본 발명은 인간화 RS7 항원 결합단백질, 및 진단 및 치료에서 상기 결합단백질의 용도에 관한 것이다.
RS7 항체* 결합단백질 * 항원 * 치료 * 진단 * 종양

Description

ＲＳ7 항체{RS7 antibodies}
본 발명은 단가(monovalent) 및 다가(multivalent), 단특이성(monospecific) 결합단백질, 및 다가, 다중특성(multispecific) 결합단백질에 관한 것이다. 상기 결합 단백질의 한 실시형태는 각 결합부위가 표적 항원 또는 표적 항원의 에피토프(epitope)와 결합하는 하나 이상의 결합부위를 갖는다. 상기 결합 단백질의 다른 실시형태는 각 결합부위가 표적 항원위 상이한 에피토프에 친화력을 갖거나, 표적 항원 또는 합텐(hapten)에 친화력을 갖는 두개 이상의 결합부위를 갖는다. 게다가, 본 발명은 숙주(host)에서 상기 기능성 결합단백질(functional binding protein)의 발현에 유용한 재조합 벡터(recombinant vector)에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 RS7로 제작된 종양관련 항원 결합단백질에 관한 것이다. 게다가, 본 발명은 인간화 RS7 항원 결합단백질, 및 진단 및 치료에서 상기 결합단백질의 용도에 관한 것이다.
인공의(man-made) 결합단백질, 특히 단클론(monoclonal) 항체 및 변형(engineered) 항체 또는 항체 단편들은 널리 시험되어 왔으며, 암, 자기면역성 질병, 전염성 질병, 염증성 질병 및 심장혈관성 질병을 포함하는 다양한 인간질병의 관측 및 치료에 유용한 것으로 나타났다(Filpula and McGuire,Exp.Opin.Ther.Patents(1999)9 :231~245). 예를들어, 방사성 동위원소로 라벨화된 항체들은 당업계에서 사용하여 관측기를 사용하는 환자들에게 주입한 후 종양을 관찰하는 것을 시험하였다. 항체 또는 항체유도 제제의 임상적 유용성은 주로 특이 표적 항원에 결합하는 능력에 의존한다. 선택성은 특히 진단 또는 치료제제가 몸에서 정상조직에 유독하다면 인간질병의 관측 및 치료하는 동안 표적부위에 동위원소, 약물, 독소, 사이토킨, 호르몬, 성장인장, 효소, 컨쥬게이트(conjugate), 방사성핵종(radionuclide) 또는 금속류와 같은 진단제 또는 치료제의 운반에 중요하다.
항체 시스템의 잠재적 한계는 Goldenberg, The American Journal of Medicine(1993)94:298~299에 기재되었다. 관측 및 치료기술에서 중요한 파라미터는 표적 세포가 존재하는 부위에서 특이적으로 국부적인 주입된 약의 함량, 및 특이적 결합 항체의 농도에 대한 주위 정상조직에서 존재하는 방사능 농도인 섭취율이다. 항체를 혈류내로 주입할 경우, 수 많은 구획(compartment)를 지나 신진대사되어 분비된다. 항체는 체내를 지날 경우 표적세포 항원에 위치하고 결합할 수 있어야 한다. 항원 표적화를 조절하는 인자들은 병리적 조직의 위치, 크기, 항원밀도, 항원 접근성(accessibility), 세포성분, 및 표적항체의 약물생체반응학(pharmacokinetics)을 포함한다. 항체에 의해 종양 표적화에 특이적으로 영향을 주는 다른 인자들은 종양 및 다른 조직에서 표적항원의 발현, 및 방사선라벨화된 항체(radiolabelled antibody)의 느린 혈액 청소율(blood-clearance)의 결과인 골수독성(bone marrow toxicity)을 포함한다. 표적 종양세포에 의해 증대된 표적 항체 의 양은 종양내(intratumoral) 압력 뿐만 아니라, 혈관형성(vascularization) 및 종양의 항체 침투한계에 의해 영향을 받는다. 간, 신장 또는 골수와 같은 비표적화 장기에 의한 비특이적 섭취는 종종 골수의 방사선조사가 약물 한계 독성을 야기하는 방사선면역치료법(radioimmunotherapy)의 기술에 다른 잠재적 한계가 있다.
직접적 표적화로 언급된 하나의 제안된 접근은 진단 또는 치료 방사성 동위원소를 나르는 항체와 표적 특이성 항원으로 제작된 기술이다. 종양의 상황에서, 직접 표적접근은 항원을 지나 표적 종양을 인지하는 방사성 라벨화된 항(anti)-종양 단특이성 항체를 사용한다. 상기 기술은 환자에게 라벨화된 단특이성 항체를 주입하고 항체를 표적 종양에 집중시키도록 하여 진단 또는 치료 효과를 얻도록 하는 것을 포함한다. 상기 접근은 이외 포유류 질병의 진단 또는 치료에 사용될 수 있다.
"친화력 증가시스템(affinity enhancement system)"으로 언급되는 다른 제안된 방안은 진단 또는 치료 방사성 동위원소를 나르는 항체에 의한 종양 표적화의 결점들을 극복하도록 제작된 기술이다(US 5,256,395(1993), Barbet et al., Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals(1999)14 : 153~1666). 상기 AES는 방사성라벨화된 합텐 및 표적 종양과 방사성 합텐을 모두 인지하는 항-종양/항-합텐 이특이성 결합단백질을 사용한다. 또한, 높은 원자가의 합텐 및 높은 특이성을 갖는 결합 단백질은 상기 과정에 사용될 수 있다. 상기 기술은 환자에게 결합단백질을 주입하고 표적종양에 집중하도록 하는 것을 포함한다. 비결합된 단백질을 혈류에서 제거하기 위한 충분한 시간 후, 방사성라벨화된 합텐을 투여한다. 합텐을 표적세포의 부위에 위치된 항체-항원 복합체에 결합하여 진단 또는 치료적 이익을 얻는다. 비결합된 합텐은 몸을 청소한다. Barbet는 후자가 종양표면에 결합될 경우 이가(bivalent) 합텐이 이특이성 합체에 가교될 수 있는 가능성을 언급한다. 그 결과로써, 방사성라벨화된 복합체는 점점 안정화되고 오랜시간동안 종양에 머무른다. 상기 시스템은 포유류 질병을 진단 또는 치료하는데 사용될 수 있다.
직접적 표적 시스템에 유용한 다가, 단특이성 결합단백질의 생산 및 친화력 증가시스템에 유용한 다가, 다중특성 결합 단백질의 생산의 필요성이 남아있다. 특히, 표적 항원에 증가된 섭취, 혈액내 감소된 농도, 및 정상 조직 및 세포의 독성 약물로부터의 최적 보호를 나타내는 결합 단백질의 필요성이 남아있다.
따라서, 본 발명의 목적은 인간 비-소형-세포 폐암(human non-small-cell lung carcinoma)에 대하여 상승되는 쥐과 MAbRS7-3G11에 의해 상피(epithelial) 당단백질(glycoprotein)-1(EGP-1)로 정의되는 종양관련 항원을 인지하는 단특이성 단클론 항체 및 이의 단편를 제공하는 것이다. RS7 항원은 폐종양 및 분화항원에 대한 3차 국제 IASLC 워크샵의 제안에 이어 EGP-1(epithelial glycoprotein-1)로 제작되어 왔다. EGP-1과 관련된 적어도 하나의 에피토프(epitope)는 문헌에서 선택적으로 TROP2로 언급된다. 바람직한 실시형태에서 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 Stein(이하) 및 기타 초기 연구에 의해 공개된 쥐과 RS7 항체로 동일한 에피토프에 결합한다. 선택적으로, 항체 또는 단편은 Stein에 의해 공개된 쥐과 RS7 항체가 결합하는 에피토프와는 다른 에피토프를 결합할 수 있다. 바람직한 실시형태에서 항-EGP-1, 또는 항-TROP2 항체 또는 이의 단편은 키메라(chimeric), 인간화된 또는 전체적 인간 RS7 항체 또는 이의 단편이다.
예를 들면, 본 발명에서 의도는 인간화된 항체 또는 이의 단편, 여기서 인간화된 RS7 MAb의 경쇄 가변부위의 상보성 결정부위(Complementarity Determining Region, CDRs)는 KASQDVSIAVA의 아미노산 서열로 이루어진 CDR1; SASYRYT의 아미노산 서열로 이루어진 CDR2; 및 QQHYITPLT의 아미노산 서열로 이루어진 CDR3;로 이루어진다. 본 발명의 다른 실시형태는 인간화된 항체 또는 이의 단편이고, 여기서 인간화된 RS7 MAb의 중쇄의 가변부위의 CDRs는 NYGMN의 아미노산 서열로 이루어진 CDR1; WINTYTGEPTYTDDFKG의 아미노산 서열로 이루어진 CDR2; 및 GGFGSSYWYFDV의 아미노산 서열로 이루어진 CDR3;로 이루어진다. 또한, 바람직하게 인간화된 항체 또는 이의 단편은 쥐과 RS7 MAb 및 인간 항체의 경쇄 및 중쇄의 가변부위의 구조부위(FR)로 이루어지고, 여기서 인간화된 쥐과 RS7 MAb의 경쇄의 가변부위의 CDRs는 KASQDVSIAVA의 아미노산 서열로 이루어진 CDR1; SASYRYT의 아미노산 서열로 이루어진 CDR2; 및 QQHYITPLT의 아미노산 서열로 이루어진 CDR3;로 이루어지며; 인간화된 쥐과 RS7 MAb의 중쇄의 가변부위의 CDRs는 NYGMN의 아미노산 서열로 이루어진 CDR1; WINTYTGEPTYTDDFKG의 아미노산 서열로 이루어진 CDR2; 및 GGFGSSYWYFDV의 아미노산 서열로 이루어진 CDR3로 이루어진다. 더 바람직하게는 인간화된 항체 또는 이의 단편은 인간 항체의 경쇄 및 중쇄의 불변부위의 FRs을 더 함유한다.
바람직한 실시형태에서, 인간화된 RS7 항체 또는 단편은 RS7 쥐과 항체에서 대응되는 위치에 발견된 아미노산 잔기에 의해 치환된 적어도 하나이상의 아미노산을 함유하는 경쇄 및/또는 중쇄의 FR로 이루어진다. 예를 들면, 치환된 아미노산의 적어도 하나 이상은 바람직하게 도 3B의 쥐과 중쇄의 가변부위의 잔기 38, 46, 68 및 91로 이루어진 군에서 선택된 위치에 있거나, 치환된 아미노산의 적어도 하나이상을 바람직하게 도 3A의 쥐과 경쇄의 가변부위의 잔기 20, 85 및 100으로 이루어진 군에서 선택된 위치에 있다.
또한, 본 발명에서 기재된 것은 적어도 2개 이상의 항-EGP-1 MAb 또는 이의 단편으로 이루어진 항체융합(fusion) 단백질 또는 이의 단편이며, 여기서 MAb 또는 이의 단편은 본 발명의 항-EGP-1 MAb 또는 이의 단편에서 선택된다. 관련된 혈관에서, 항체융합단백질 또는 이의 단편은 본 발명에서 항-EGP 항체 또는 이의 단편이외에, 본 발명의 항-EGP-1 항체중의 일차 항-EGP-1 MAb 또는 이의 단편, 및 적어도 하나의 이차 MAb 또는 이의 단편으로 이루어진다. 예를 들면, 이차 항체 또는 이의 단편은 암 관련 항체 또는 이의 단편일 수 있다. 다른 바람직한 실시형태는 2개의 다른 에피토프-결합 항-EGP-1 항체 또는 이의 단편으로 이루어진 융합단백질 또는 단편이다.
본 발명의 한 목적은 RS7에 하나이상의 에피토프를 인지하거나 RS7 항원 및 합텐 분자에 친화력을 갖는 다중특성 항체 및 이의 단편을 제공하는 것이다. 후자 결합 단백질은 표적 항원을 예비표적하는데 유용하다. 따라서, 진단제제, 치료제제 또는 이의 조합을 표적에 전달하는 방법은 (ⅰ) 목적물에 다가, 다중특성 MAb, 또는 이의 단편을 투여하는 단계; (ⅱ) 목적물의 혈류를 청소하도록 비결합 단백질의 양에 충분한 시간을 기다리는 단계; 및 (ⅲ) 항체의 결합부위에 결합하는 진단제제, 치료제제 또는 이의 조합으로 이루어진 상기 목적 운반체 분자를 투여하는 단계;로 기재된다.
본 발명의 다른 목적은 진단제 또는 치료제를 EGP-1 항원으로 발현하는 표적된 질병에 전달하는 방법을 제공하는 것이다. 예를들어, 표적에 진단제 또는 치료제, 또는 이의 조합을 전달하는 방법은 (ⅰ) 하나 이상의 치료제 및/또는 진단제에 결합된 항-EGP-1 항체 또는 이의 단편으로 이루어진 조성을 제공하는 단계; 및 (ⅱ) 상기 조성의 대상에게 투여하는 단계;로 기재된다. 바람직하게, 진단제 또는 치료제는 동위원소, 약물, 독소, 면역조절자, 호르몬, 효소, 성장인자, 방사성 핵종, 금속, 조영제(contrast agent), 및 검출제(detecting agent)로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명의 다른 실시형태에서 표적에 진단제제, 치료제제 또는 이의 조합을 전달하는 방법은 (ⅰ) EGP-1 표적 항원에 친화력을 갖는 하나이상의 합텐 결합부위 및 합텐분자에 친화력을 갖는 하나이상의 합텐 결합부위로 이루어진 다가, 다중특성 항체 또는 단편을 목적물에 투여하는 단계, (ⅱ) 비결합 항체 또는 이의 단편의 함량를 목적 혈류를 청소하도록 충분한 시간을 기다리는 단계, 및 (ⅲ) 진단성 제제, 치료성 제제 또는 이의 조합으로 이루어진 목적 합텐을 투여하는 단계;로 이루어진다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 항체 중 하나의 항-EGP-1 MAb 또는 이의 단편, 또는 항체융합단백질 또는 이의 단편으로 이루어진 암세포 표적 진단성 또는 치료 컨쥬게이트를 제공하는 것이며, 여기서 항-EGP-1 항체 또는 이의 단편은 하나 이상의 진단제 또는 치료제와 결합한다. 적당한 치료제는 세포분열 저지성물질(antimitotic), 알킬화제(alkylating), 대사길항물질( antimetabolite), 혈관형성억제제(antiangiogenic), 세포사멸제(apoptotic), 알킬로이드 항생물질(alkyloid antibiotic), 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 제약학적 성질을 갖는 약물이다. 또한, 바람직하게는 질소머스타드(nitrogen mustard), 에틸렌이민(ethylenimine) 유도체, 알킬 설포네이트, 니트로소 우레아(nitrosourea), 트리아젠(triazene), 엽산 유사체(folic acid analog), 안트라사이클린(antracycline), 탁산(taxane), COX-2 억제제, 타이로신 키나제(tyrosine kinase) 억제제, 피리미딘(pyrimidine) 유사체, 푸린(purine) 유사체, 항생 물질(antibiotic), 효소, 에피포도필로톡신(epipodophyllotoxin), 백금 배위 착물(platinum coordination complex), 빈카알칼로이드(vinca alkaloid), 치환 요소, 메틸 하이드라진 유도체, 부신피질(adrenocortical) 억제제, 길항제(antagonist), 엔도스타틴(endostatin), 탁솔(taxol), 캄토테신(Camptothecin), 독소루비신(doxorubicin), 독소루비신 유사체, 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 치료제이다. 바람직하게, 진단제는 바람직하게 25~4000keV의 광활성(photoactive) 방사성핵종 및 조영제로 이루어진 군에서 선택된다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명의 항-EGP-1 MAb 또는 이의 단편; 상기 MAb 또는 단편 중 두 개 이상을 함유하는 항체융합단백질 또는 이의 단편; 여기서 기재된 항-EGP-1 MAb 또는 이의 단편이외에, 본 발명의 항-EGP-1 MAb 또는 이의 단편의 MAb 또는 단편을 함유하는 일차 항-EGP-1 MAb 또는 이의 단편을 하나 이상 함유하고 이차 MAb 또는 단편을 하나 이상 함유하는 항체융합단백질; 또는 여기서 기재된 MAb 또는 이의 단편 이외에, 여기서 기재된 항체 중 어느 하나의 상기 MAb 또는 이의 단편으로 이루어진 일차 MAb 또는 이의 단편을 하나 이상 함유하고, 이차 MAb 또는 이의 단편을 하나 이상 함유하는 항체융합단백질;을 함유하는 핵산 인코딩 MAb 또는 단편으로 이루어진 DNA 서열에서 상기 이차 MAb는 EGP-2, MUC 1-4, A33,CSAp, CEA, Le(y), Tn, Tag-72, PSMA, PSA, EGFR, HER2/neu, AFP, HCG, HCG-베타, 페리틴(ferritin), PAP, PLAP, EGP-2, 히스톤(histone), 사이토케라틴(cytokeratin), 테나신(Tenascin), CanAg, 신장암(kidney cancer) G 250, VGFR1, VGFR2, PAM4-항원, 암유전자(oncogene)산물, 또는 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 항원과 반응한다. 이차 MAb는 혈관 내피세포 성장인자(VEGF:Vascular Endothelial Growth Factor) 및 PIGF (placenta growth factor;태반성장인자)과 같은 종양관련 혈관내피세포 항원과 대신 반응할 수 있다. 이차 항체의 선택은 종양세포 형태에 의존한다. 예를들면, 항-PSMA 또는 항-PSA 항체는 전립선암, 항-CEA 또는 가슴, 난소, 폐 및 결장암의 항-MUCl, MUC2, MUC3 및 MUC4 항체, 결장 및 머리 및 목암의 EGFR, 결장 및 난소암의 항-CSAp 항체, 및 가슴, 난소 및 기타 암의 항-HER/neu를 치료 또는 진단하는데 사용될 수 있다. 이는 구체적인 예로 주어진 것이며, 이로써 한정되는 것은 아니다. 또한, DNA서열을 함유하는 발현벡터 및 숙주세포는 본 발명의 실시형태로 바람직하다.
또한, 여기에서 제공되는 것은 악성종양(malignancy)을 진단 및 치료하는 방법이다. 예를들면, 암을 진단하거나 치료하는 방법은 (ⅰ) EGP-1표적 항원에 친화력을 갖는 하나이상의 항원-결합 부위 및 합텐 분자에 친화력을 갖는 하나이상의 합텐 결합부위로 이루어진 다가, 다중특성 항체 또는 단편을 필요에 목적물에 투여하는 단계; (ⅱ) 목적물의 혈류를 청소하도록 비결합 단백질의 양에 충분한 시간을 기다리는 단계; 및 (ⅲ) 상기 항체의 결합부위와 결합하는 진단제제, 치료제제 또는 이의 조합으로 이루어진 목적물 합텐을 투여하는 단계;로 이루어진다.
또한, 악성종양의 진단 및 치료하는 방법은 항-EGP-1 융합단백질 또는 이의 단편, 또는 EGP-1 MAb 또는 이의 단편으로 이루어진 치료 컨쥬게이트의 치료적으로 효과적인 함량을 투여하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 EGP-1 MAb 또는 이의 단편 또는 항체 융합단백질 또는 이의 단편은 약학적으로 적절한 부형제(excipient)에 적어도 1종 이상의 치료제에 결합된다. 또한, 관련 혈관에서 자체 항-EGP-1 융합단백질 및 이의 단편을 함유하는 자체 항-EGP-1 항체 및 이의 단편을 악성종양의 치료에 사용할 수 있다. 자체 항-EGP-1 항체는 악성종양의 시험관 진단에 사용될 수 있으며, 예를들어 AES와 같은 예비표적화 기술을 포함하지 않는다면 생체내 진단이 아니라 면역분석법(immunoassay) 또는 면역조직화학 법(Immunohistochemistry)과 사용할 수 있다. 그러나, 라벨화된 EGP-1 항체는 악성종양의 생체내 진단 및 치료에 사용할 수 있다. 예를들면, 여기서 기재된 것은 목적물에서 (ⅰ) 항-EGP-1 MAb 또는 이의 단편, 또는 항체융합단백질 또는 이의 단편을 함유하는 조성의 치료적으로 효과적인 함량을 대상에 투여하는 단계; (ⅱ) 약학적으로 적절한 부형제에 EGP-1 MAb 또는 이의 단편, 또는 항체융합단백질 또는 이의 단편을 제형화하는 단계;로 이루어진 암세포 치료의 방법이다. 또한, 본 발명에서 유사하게 접합된 MAb 또는 이의 단편, 또는 융합단백질 또는 이의 단편을 진단 및 치료에 고안할 수 있다.
도 1은 경합 결합분석(competitive binding assay)에서 mRS7, cAb-Vκ#23(cRS7), 및 cAb-Vκ#1의 비교를 나타낸 것이다. 경합 Ab의 농도변화는 바이오티닐레이트(biotinylated)된 mRS7 항체의 일정함량의 결합 경합하는데 사용되었다. 그 결과는 Vκ#1 경쇄가 RS7 항원에 결합하지 않음을 나타낸다.
도 2는 (A) 5'RACE로 클론화된 RS7Vκ 및 (B) RT-PCR로 클론화된 RS7 VH 을 인코딩한 DNA 아미노산 서열을 나타낸다. 추정 CDR 부위는 밑줄친 것을 나타낸다. 뉴클레오타이드 잔사는 순차적으로 숫자를 매긴다. Kabat Ig의 분자숫자매김은 아미노산 잔사에 사용된다. (B)에서 문자(위)의 잔사 숫자매김은 선행 잔사 더하기 문자의 숫자이고, 즉 N52 이은 T의 숫자는 52A; 182 이은 N, N, 및 L의 숫자는 각각 82A, 82B, 및 82C이다.
도 3은 (A) 인간 SA- A'cl, 쥐과 RS7, 및 hRS7 Vκ 사슬 및 (B) 인간 RF-TS3, 쥐과 RS7, 및 hRS7 VH 사슬의 아미노산 서열 정열을 나타낸다. (A)에서 점 (dot)은 SA- A'cl에서 대응하는 잔사와 동등한 RS7에서 잔사를 나타낸다. 대시(dash)는 정렬을 보조하기 위해 도입된 사이를 나타낸다. 박스는 CDR부위를 나타낸다. hRS7에서 N- 및 C-말단 잔기(밑줄)는 사용된 스테이징(staging)벡터로 고정된다. 따라서, RS7의 대응 말단 잔사는 인간서열의 것과 비교되지 않는다. Kabat의 숫자매김이 사용된다. (B)에서 점은 RF-TS3에서 대응하는 잔사와 동등한 RS7에서 잔사를 나타낸다. 대시(dash)는 정렬을 보조하기 위해 도입된 사이를 나타낸다. 박스는 CDR부위를 나타낸다. hRS7에서 N- 및 C-말단 잔기(밑줄)은 사용된 스테이징(staging)벡터로 고정된다. 따라서, RS7의 대응 말단 잔사는 인간 VH 서열의 것과 비교되지 않는다.
도 4는 (A) 인간화된 RS7 Vκ 및 (B) 인간화된 RS7 VH 의 DNA 및 아미노산 서열을 나타낸다. 아미노산 서열의 굵고 밑줄 친 부분은 Kabat의 숫자매김에 의해 정의된 CDR부분을 나타낸다.
도 5는 (A) 인간화된 RS7 Vκ 의 경쇄 cDNA 및 아미노산 서열 및 (B) 인간화된 RS7 VH의 중쇄 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다. 아미노산 서열의 밑줄 부분은 분비(secretion)에 리더 펩티드 서열을 나타낸다. "*"는 중지코돈(codon)을 나타낸다.
도 6은 경합결합 분석에서 mRS7, cRS7, 및 hRS7의 비교를 나타낸다. 경합 Abs의 농도변화는 96-웰 ELISA판에서 입힌 Ag에 바이오티닐레이트 RS7의 일정함량의 결합과 경합하는데 사용되었다. hRS7은 RS7 및 cRS7의 것과 비교하는 차단활성 (blocking activity)을 나타낸다.
도 7은 인간화된 RS7 Vκ 의 경쇄 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다. 아미노산 서열의 밑줄 부분은 분비(secretion)에 리더 펩티드 서열을 나타낸다. "*"는 중지코돈(codon)을 나타낸다. 또한, 리신(lysine) 잔사도 밑줄표시된다.
도 8은 인간화된 중쇄 RS7 Vκ의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다. 아미노산 서열의 밑줄 부분은 분비(secretion)에 리더 펩티드 서열을 나타낸다. "*"는 중지코돈(codon)을 나타낸다. 또한, 리신(lysine) 잔사도 밑줄표시된다.
도 9는 IMP-R4,IMP-R5 및 IMP-R8 잔사부분의 구조를 나타낸다.
도 10은 MDA-MB-468 종양 모델에서 방사선요오드화(radioiodinated) hRS7에 의한 약량 측정(dosimetry)의 바(bar)그래프이다.
도 11은 누드 쥐들에서 유방암 이종이식(xenograft)의 종양성장에 방사선면역치료법(Radioimmunotherapy)의 효과를 설명하는 그래프 시리즈이다.
도 12는 누드 쥐들에서 유방암 이종이식(xenograft)의 방사선면역치료법 치료 후 독성을 평가하는 그래프 시리즈이다.
도 13은 상대적 평균 종양부피(mean tumor volume;MTV)를 설명하는 그래프이다.
다르게 구체화되지 않는다면, "a" 또는 "an"은 "하나 이상"을 의미한다.
RS7 항체(전기의 RS7-3G11로 제작)은 폐로부터 인간 편상세포암종(squamous cell carcinoma)의 원박막(crude membrane) 제조에 대하여 상승된 쥐과 IgG1 이다. 전체적으로 예가 되는 Stein et al., CancerRes. 50 : 1330 (1990)을 보라. RS7 항체는 종양관련 항원을 인지하고, 인간 비소형(nonsmall) 세포 폐암종에 대하여 상승된 쥐과 MAb RS7-3G11에 의해 정의되었다. Stein et al. 은 RS7 항체가 클러스터 13으로 특정된 46-48kDa 당단백질을 인지한다고 기재한다 (Stein etal., Int. J. Cancer Supp. 8: 98-102(1994)). 또한, Basu etal., Int. J. Cancer 52: 472-479 (1995)을 보자. 항원은 폐종양 및 분화 항원에 대한 3차 international IASLC 워크샵의 제안에 따라 EGP-1(상피 당단백질-1; epithelial glycoprotein-1)로 제작되어왔다. 예를들어, DeLeij etal., Int. J. Cancer Supp., 8: 60-63 (1994)을 보자. 따라서, 여기에서 보는 바와 같이 RS7 및 EGP-1항원이 같은 것이다. 또한, EGP-1 항원은 문헌에서 TROP2로 언급되지만, EGP-1 및 TROP2 모두의 다중 에피토프일 수 있다.
유세포분석법(flow cytometry) 및 면역조직화학적 염색(immunohistochemical staining) 연구에서는 RS7 MAb가 정상적인 인간 조직에 한정된 결합으로 종양형태의 다양성에 항원을 검출하는 것을 나타낸다(Stein etal., (1990), supra). RS7 항체는 순식간에 흡수될 수 있는 EGP-1 당단백질과 반응한다. EGP-1은 폐, 위, 방광( Urinary Bladder), 가슴, 난소, 자궁(uterus), 및 전립선의 악성종양과 같은 종양에 의해 우선적으로 발현된다. 동물모델에서 방사성라벨화된(radiolabeled) 쥐과 RS7 Mab를 사용한 병소부위(localization) 및 치료연구는 종양 표적화 및 치료 효율성을 설명하였다(Stein etal., (1990), supra. Stein et al.,(1991), supra).
최근 연구에서는 폐, 가슴, 방광, 난소, 자궁, 위 및 전립선의 종양에서 강한 RS7 염색을 설명하였다. 전체적으로 참조예가 되는 Stein etal., Int. J. Cancer 55 : 938 (1993)을 보자. 게다가, 상기 연구에서 폐암 경우는 편평세포암종 및 선암종(adenocarcinomas)으로 이루어졌다. 모든 세포형태들은 RS7 항체가 폐의 비소형 세포 폐암종의 조직학 분류사이에서 구별되지 않는 것을 나타내도록 강하게 염색되었다.
위에서 설명한 바와 같이, RS7 MAb는 표적세포에 급속히 흡수된다(Stein et al. (1993), supra). RS7 MAb의 흡수율 상수는 면역성독소(immunotoxine) 생산물에 유용함을 설명하는 다른 2개의 급속히 흡수하는 Mab들의 흡수율 상수사이이 중간이다. 면역성독소 컨쥬게이트의 흡수는 항-종양활성에 절대적으로 요구됨을 잘 설명된다(Pastan et aL, Cell 47. 641 (1986) ). 또한, 약물 이뮤노컨쥬게이트(immunoconjugate)의 흡수는 항종양 효율성에서 주요 인자로서 설명되어졌다(Yang etal., Proc.Nat'l Acad. Sci. USA 85 : 1189 (1988) ). 따라서, RS7 항원은 치료제제의 흡수를 요구하는 면역치료의 형태에 중요한 표적일 수 있다.
따라서, RS7 MAb의 연구는 항체가 임상학적 진단 및 치료적용에 후보가 되는 여러 중요한 물성들을 나타냄을 가르킨다. RS7 항체는 진단 및 치료에 유용한 표적을 제공하기 때문에, RS7 항원의 에피토프를 인지하는 Mab를 얻는 것이 바람직하다. 게다가, 키메라, 인간화 및 인간 RS7 항체의 유용성은 임상학적 시료에서 RS7 항체를 관측하는데 바람직하고 인간에 생체내 적용에 필수적인 이중결정 효소 결합 면역 흡착 분석법(enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA))의 발전에 필수적이다.
마무리에서 본 발명은 진단 및 치료적 방법에 사용될 수 있고 RS7 항원을 결합하는 키메라, 인간화 및 인간 RS7 항체 및 이의 단편을 기재한다. 인간화된 항체 및 항체 단편들은 가미국출원 명칭 "항-CD20 항체 및 이의 융합단백질 및 사용방법", Attorney Docket No. 18733/1073, U. S. Provisional No. 60/356,132, U. S. Provisional Application No. 60/416,232 and Attorney Docket No.18733/1155; 클래스 3 항- 암배아 항원항체(carcinoembryonic antigen antibody: anti-CEA 항체)인 미국출원 제 5,874, 540에 공개된 것과 같은 hMN-14 항체; 미국출원 제 10/166,166에 기재된 Mu-9 항체; 미국가출원 제 60/399,707에 기재된 AFP-항체; 가 미국출원 명칭 "단클론 항체 cPAM4", Attorney Docket No. 18733/1102; 미국 가출원 제 60/360,229에 기재된 것과 같은 RS7 항체; 및 미국 특허 제 5,789,554 및 6,187,287 및 미국출원 제 09/741,843 및 09/988,013에 기재된 CD22 항체에 기재된다. 여기에 기재된 키메라 항체(chimeric antibody)는 한종, 바람직하게는 설치류동물(rodent) 항체로부터 유도된 상보성 결정부위(CDRs)를 포함하는 가변부위를 함유하는 재조합 단백질이고, 항체분자의 불변 도메인은 인간항체의 것으로부터 유래된다. 수의학적 적용에서 키메라 항체의 상수도메인은 다르 종의 것으로부터 유도될 수 있다. 인간화 항체는 한 종, 즉 설치류동물 항체로부터의 CDRs는 인간 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인에 설치류동물 항체의 중쇄 및 가변 사슬로부터 전이된 재조합 단백질이다.
바람직한 실시형태에서 RS7 항체는 인간화된다. 비-인간 단클론 항체는 외인성 단백질(foreign protein)로서 인간 숙주에 의해 인지될 수 있으며, 반복된 주입은 해로운 과민증(hypersensitivity) 반응을 이끌 수 있기 때문에, 쥐 RS7 서열의 인간화는 환자들이 경험할 수 있는 역면역반응을 감소할 수 있다. 쥐과계 단클론 항체에서, 이는 종종 인간 항-쥐 항체(human anti-mouse antibody;HAMA) 반응으로 언급된다. 본 발명의 다른 실시형태는 subhuman 영장류 항-EGP-1항체, 쥐 단클론 항-EGP-1항체(수의학적 적용에 한정), 키메라 항- EGP-1항체, 인간 항- EGP-1항체, 및 인간화 항- EGP-1항체인 항 EGF-1 항체 또는 이의 단편들이다. 바람직하게, 인간화 RS7 항체 또는 이의 단편의 구조부위에서 몇몇 인간 잔사들은 쥐류 대응물(counterpart)로 대체된다. 또한, 2개의 다른 인간 항체의 골결 서열의 조합은 VH에 사용된다. 항체 분자의 상수 도메인은 인간항체의 것으로부터 유도된다.
본 발명의 다른 바람직한 실시형태는 인간 RS7 항체이다. 인간 항체는 항원 경쟁에 대응하여 특정 인간 항체를 생산하도록 변형된 유전자이식(transgenic) 쥐들로부터 얻어진 항체이다. 상기 기술에서, 인간 중쇄 및 경쇄 자취의 원소들은 내생적인 중쇄 및 경쇄자취의 표적 분열을 함유하는 배아줄기세포(embryonic stem cell)라인으로부터 유도된 쥐류 변형으로 주입된다. 유전자이식 쥐들은 인간 항원에 인간 항체 특이성을 합성할 수 있으며, 쥐들은 인간 항체-분비 하이브리도마(hybridomas)를 생산하는데 사용될 수 있다. 유전자이식 쥐들로부터 인간항체를 얻는 방법은 Green etal., Nature Genet. 7: 13 (1994), Lonberg etal., Nature 368 : 856 (1994), 및 Taylor etal., Int. Immun. 6 : 579 (1994)에 의해 기재된다. 또한, 전체 인간항체는 당업계에서 모두 알려진 파지 디스플레이 기술(phage display technology)과 같은 유전적 또는 염색체 이입(chromosomal transfection)방법에 의해 설계될 수 있다. 예를들어 비면역된 도너로부터 면역글로브린 가변 도메인 유전 레퍼토리로부터 생체내 인간 항체 및 이의 단편의 생산에 대한 McCafferty etal., Nature 348: 552-553 (1990)을 보라. 상기 기술에서 항체 가변 도메인 유전자들은 사상 박테리오파지(filamentous bacteriophage)의 주요 또는 소수 피막 단백질 유전자 속으로 클론화되고, 파지 입자(phage particle)의 표면에 기능적 항체 단편으로 표시된다. 사상 입자는 파지 게놈의 짧은 단-가닥 DNA복제물(single-stranded DNA copy)을 함유하기 때문에, 항체의 기능성 성질을 기초로 선택은 상기 물성을 나타내는 유전자 인코딩 항체의 선택에 결과이다. 상기 방법에서 파지는 B 세포의 몇 물성으로 의태화한다. 파지 디스플레이는 다양한 형태로 수행될 수 있으며, Johnson and Chiswell, Current Opinion in Structural Biology 3: 5564-571 (1993)을 보라.
본 발명의 항체 및 이의 단편들은 바람직하게 폐의 인간 편평상피암으로부터 원박막의 제조에 대하여 상승된다. 또한, 바람직하게는 RS7 항체 및 이의 단편은 인간 난소 종양세포라인으로부터 생육가능한 세포의 막제조에 대하여 증가된다. 더 바람직하게는, RS7 항원은 다양한 Colo 316 세포에 의해 제공된다. 관련 혈관에서 RS7 항체는 RS7 항원의 실질적인 제조를 사용하여 얻을 수 있다. 실질적으로 순수 단백질은 자연적으로 단백질과 관련된 세포 성분이 오염되지 않는데 필수적인 단백질이다. 여기에서 기재된 바와 같이, RS7 항체표현은 또한 키메라, 인간 및 인간화 RS7 항체를 포함한다.
키메라, 인간화 및 인간 RS7 항체의 제조
특정 항원에 단클론 항체는 당업자들에게 알려진 방법에 의해 얻어질 수 있다. 예를 들어, Kohler and Milstein, Nature 256 : 495 (1975), 및 Coligan et al. (eds. ), CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, VOL. 1, pages 2.5. 1-2.6. 7 (John Wiley & Sons 1991) (하기에서 "Coligan")을 보라. 간략하게, RS7과 같은 RS7 항원 MAbs는 RS7항원으로 이루어지고 세럼 시료를 제거함으로써 항체 생산의 존재를 확인하고, 비장을 제거하여 B-림프구(lymphocyte)를 얻고 상기 B-림프구를 골수종(myeloma) 세포와 융합하여 하이브리도마를 생산하고, 상기 하이브리도마를 클론하여 RS7 항원에 항체를 생산하는 양성 클론을 선택하고, RS7 항원에 항체를 생산하는 클론을 배양하고, 하이브리도마 배양으로부터 RS7 항체를 분리함으로써 얻을 수 있다.
면역원에 항체의 초기증가 후, 항체는 배열되고 실질적으로 재조합 기술에 의해 제조될 수 있다. 쥐과 항체 및 항체 단편의 인간화 및 키메라화는 당업자들에게 공지되어 있다. 예를 들면, 인간화 단클론 항체는 인간 가변 도메인에 쥐류 면역글로브린의 중쇄 및 경쇄 가변사슬로부터 쥐과 상보성 결정부위로 전이하고, 쥐류 대조물의 구조 부위에서 인간 잔사로 대체함으로써 생산된다. 인간화 단클론 항체에서 유도된 항체 성분의 사용은 쥐과 불변부위의 면역원성과 관련된 잠재적 문제점들을 제거한다.
본 발명의 인간항체, 즉 인간 EGP-1 MAbs 또는 항-EGP-2, MUC1-4, CEA, CC49, CSAp, PSMA, PSA, EGFR, A33 및 HER2/neu Mabs와 같은 다른 인간 항체는 인간화, 키메라 또는 인간 RS7 항체과 조합치료에 유전자이식 비인간 동물로부터 얻을 수 있다. 전체적으로 예가 되는 Mendez etal., Nature Genetics, 15: 146-156 (1997); 미국특허 제 5,633,425호를 보자. 또한, 조합치료에 사용될 수 있는 본 발명의 인간항체는 Le(y), Tn, Tag-72, AFP, HCG, HCG-베타, 페리틴(ferritin), PAP, EGP-2, 히스톤, 사이토케라틴, 테나신(Tenascin), CanAg, 신장암 G 250, VGFR1, VGFR2, 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 항원과 반응할 수 있다. 예를 들면, 인간 항체는 인간 면역글로불린 유전자좌를 갖는 유전자이식 쥐로부터 회복될 수 있다. 쥐 체액성 면역시스템은 내생적 면역글로불린 유전자를 비활성화하고 인간 면역글로불린 유전자좌를 도입함으로써 인간화된다. 인간 면역글로불린 유전자좌는 매우 복잡하고 인간 게놈의 거의 0.2%를 차지하는 다수의 구별된 단편들로 이루어진다. 유전자이식 쥐는 항체의 적절한 레퍼토리를 생산하는 것을 확인하기 위해, 인간 중쇄 및 경쇄 유전자좌의 다수를 쥐 게놈으로 도입하여야한다. 이는 생식세포주(germline) 배열에서 인간 중쇄 또는 경쇄 면역글로불린 유전자좌를 함유하는 효모인조염색체(yeast artificial chromosome, YAC)형성으로 단계과정으로 수행한다. 각각 삽입은 크기적으로 대략 1Mb이기 때문에 YAC 설계는 면역글로불린 유전자좌의 겹칩 단편의 동족 재조합을 요구한다. 중쇄 유전자좌를 함유하는 하나와 경쇄 유전자좌를 함유하는 하나인 2개의 YAC는 쥐 배아줄기세포와 효모 spheroblast를 함유하는 YAC의 용융을 통해 쥐속으로 개별적으로 도입된다. 다음, 배아줄기세포 클론은 쥐 배반포 기배아(blastocyst)로 마이크로주입된다. 키메라 숫컷 결과는 그들의 생식세포주를 통해 YAC로 전달되는 능력으로 선별하고 쥐류 항체생성에 부족한 쥐와 생식한다. 인간 중쇄 유전자좌를 함유하는 하나와 인간 경쇄 유전자좌를 함유하는 하나인 2종의 유전자이식 변형을 사육하는 것은 면역화에 대응하는 인간 항체를 생산하는 자손들을 제조한다.
예를들어, 쥐류 면역글로불린 가변 도메인을 클로닝하는 일반적인 기술은, 전체적으로 예가 되는 Orlandi et al., Proc. Nat 7 Acad. Sci. USA 86.-3833 (1989)에 기재되어 있다. 인간화 MAb를 생산하는 기술은, 예를들어 전체적으로 예가되는 Carteret al., Proc. Nat'I Acad. Sci. USA 89 : 4285(1992), Singer etal., J. Immun.150 : 2844(1992), Mountain et al.Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 10 : 1 (1992), 및 Coligan at pages 10.19. 1-10.19.11에 기재되어 있다.
일반적으로 RS7 항체의 가변 경쇄(Vk) 및 가변 중쇄(VH)서열은 RT-PCR, 5'-RACE, 및 cDNA 라이브러리 스크리닝과 같은 분자 클로닝과정의 변화에 의해 얻을 수 있다. 구체적으로, MAb RS7의 VH 및 Vk은 각각 RT-PCR 및 5'-RACE에 의해 하이브리도마 세포로부터 PCR 증폭에 의해 클론화하였다. 확실성을 확인하기 위해, 클론화된 VL 및 VH 유전자는, 예가 되는 Orlandi et al., (Proc. Nat 7 Acad. Sci. USA 86.-3833)에 기재된 키메라 Ab으로써 세포배양에서 발현될 수 있다. V 유전자서열에 기초하여 인간화된 RS7 항체는 예로 되는 Leung etal.(Mol. Immunol., 32: 1413 (1995) )에 의해 기재된 것과 같은 제작하고 설계할 수 있다. cDNA는 일반적인 분자 클로닝 기술(Sambrook etal., Molecular Cloning, A laboratory manual,2 dEd (1989) )에 의한 쥐과 또는 키메라 RS7 항체를 생산하는 공지의 하이브리도마 라인 또는 유전자전이 세포라인으로부터 제조될 수 있다. 바람직한 실시형태에서 RS7 하이브리도마 라인이 사용된다. mAb에 VK 서열은 예로 되는 프라이머 VK1BACK 및 VKIFOR (Orlandi etaL, 1989) 또는 Leung et al. (BioTechniques, 15: 286 (1993) )에 기재된 확장 프라이머 세트를 사용하여 증폭할 수 있으며, VH서열은 예로 되는 프라이머 쌍 VK1BACK/VKIFOR(Orlandi etaL, 1989) 또는 Leung et al. (BioTechniques, 15: 286 (1993))에 기재된 쥐과 IgG의 불변부위에 프라이머 어닐링(annealing)을 사용하여 증폭할 수 있다. 첫 가닥(strand) cDNA 생산체 10㎕, 1OX PCR 완충용액 10㎕[500mM KC1, 100 mM 트리스-HCl(pH 8.3), 15mM MgCl2, 및 0.01% (w/v) 젤라틴](Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT), 250μM 각 dNTP, 200nM 프라이머, 및 5 units Taq DNA 폴리메라아제(Perkin Elmer Cetus)을 PCR 30순환에 도입할 수 있다. 바람직하게 각 PCR 순환은 94℃에서 1분동안 변성, 50℃에서 1.5분동안 어닐링하고 72℃에서 1.5분동안 중합하는 것으로 이루어진다. 증폭된 Vk 및 VH 단편은 2% 아가로오즈(BioRad, Richmond, CA)에 정제될 수 있다. 유사하게, 인간화된 V 유전자들은 긴 올리고뉴클레오타이드 주형(template) 합성 및 Leung et al.(Mol. Immunol., 32: 1413 (1995))에 기재된 PCR증폭의 조합에 의해 설계될 수 있다.
VK에 PCR 생산체들은 Ig 프로모터, 단 펩티드서열 및 알맞은 제한부위를 함유하는 pBR327계 스테이징 벡터(staging vector), VKpBR을 스테이징 벡터로 VkPCR 생산체의 결찰(ligation)을 촉진하도록 서브클론(subclone)할 수 있다. VH의 PCR 생산체는 pBluescript-계 VHpBS과 같은 유사한 스테이징 벡터로 서브클 론될 수 있다. 각 PCR 생산체를 함유하는 개별적인 클론들은 예를들어 전체적으로 예가되는 Sanger et al. (Proc. Natl. Acad.Sci., USA, 74: 5463 (1977))의 방법으로 연속될 수 있다.
여기에서 기재된 DNA 서열은 자연적으로 발생하거나 유도된 모든 대립형질(alleles), 돌연변이 및 이의 변종을 포함하는 것으로 간주된다.
프로모터 및 단 펩티드서열과 함께 Vk 및 VH를 함유하는 발현 카세트는 HindⅢ-BamHI 단편과 같은 이중 제한 소화로 각각 VKpBR 및 VHpBS로부터 삭제될 수 있다. Vk 및 VH 발현 카세트는 각각 pKh 및 pGlg(Leung et al. , Hybridoma, 13: 469 (1994))와 같은 적절한 발현 벡터로 결찰될 수 있다. 발현벡터는 골수종 Sp2/0-Agl4 (ATCC, VA), 하이그로마이신(hygromycin) 제한에서 선택된 콜로니 및 예를들어 하기에 기재된 ELISA 분석에 의해 키메라 또는 인간화 RS7 MAb의 생산에 모니터된 상청액 유체인 적절한 세포속으로 감염시킬 수 있다. 교대로, Vk 및 VH 카세트는 각각 XbaI/BamHI 및 XhoI/BamHI로서 삭제되는 VKpBR2 및 VHpBS2인 변형 스테이징 벡터에서 집합될 수 있으며, Gilles et aL (J. Immunol. Methods 125: 191 (1989)에 기재된 pdHL2과 같은 단 발현벡터속으로 서브클론되고, 또한 Sp2/0-Agl4 세포에서의 발현에 대한 Losman et al., Cancer, 80: 2660 (1997)에 나타나 있다. 본 발명에서 유용한 다른 벡터들은 Barnes et al., Cytotechnology 32: 109-123 (2000)에 기재된 GS 벡터이며, 이는 바람직하게 NS0세포라인 및 CHO 세포에서 발현된다. 다른 적절한 포유류 발현시스템은 Werner etal., Arzneim.-Forsch./Drug Res. 48(11), Nr. 8,870-880 (1998)에 기재된다.
ELISA에 의한 항체 분비 클론의 코-트랜스펙션(co-tranfection) 및 분석은 하기와 같이 수행될 수 있다. 전체적으로 예가되는 Co etal.,J Immunol., 148: 1149 (1992)에 따른 전기 충격법(electroporation) (BioRad, Richmond, CA)에 의해 10㎍ VKpKh (경쇄발현 벡터) 및 20㎍ VHpGIg(중쇄발현 벡터)를 5 X 106 SP2/0 골수종세포의 이입(transfection)에 사용될 수 있다. 이어지는 이입에서 세포는 37℃ 5% CO2에서 완전한 HSFM 배지(Life Technologies, Inc. , Grand Island, NY)의 96-웰 구멍판에서 성장될 수 있다. 선택과정은 2일 후, 하이그로마이신(hygromycin) 선택매질이 첨가에 의해 하이그로마이신 500단위/㎖의 최종농도에서 초기화될 수 있다. 전형적으로 콜로니는 후-전기충격법 2~3주에 나타낸다. 다음, 배양은 분석으로 증대될 수 있다.
적절한 숙주세포는 미생물 또는 포유류 숙주세포를 포함한다. 바람직한 숙주는 MAb의 생산에 발전되는 PER.C6 및 다른 융합단백질인 인간세포라인이다. 따라서, 본 발명의 바람직한 실시형태는 DNA 서열 인코딩 및 항-EGP-1 MAb로 이루어진 숙주세포, 컨쥬게이트, 융합단백질 또는 이의 단편이다. PER C6 세포(WO97/00326)은 인간 포스포글리세레이트 키나아제(PGK; human phosphoglycerate kinase)프로모터의 조절하 Adserotype 5 (Ad5)E1A-및 ElB-코딩 서열(Ad5 nucleotides 459-3510)을 함유하는 플라스미드(plamid)를 사용하여 프라이머리 인간 embryonic retina 세포의 이입에 의해 일반화되었다. E1A-및 ElB는 각각 아데노바이러스(adenovirus) 초기유전자 활성 단백질 1A 및 1B이다. 방법 및 조성은 특히 당화에 의한 후-전환적으로 변형되는 인간재조합 단백질의 안정한 발현을 일반화하는데 사용된다. 여러 특징들은 PER.C6가 인간 세포라인을 특정화하고 우수한 실험실 실습에 따라 발전한 것과 같은 재조합 단백질 생산에 숙주로서 특히 우용하다. 게다가, PER.C6은 인간 또는 동물 유도 단백질의 정의된 세럼-프리 배지(serum-free medium)가 없는 현탁배양(suspension culture)으로 배양시킬 수 있으며, 상기 성장은 약 35시간의 2배로 롤러 병, 쉐이커 플라스크, 스피너 플라스크(spinner flask), 및 바이오리액터(bioreactor)와 융화된다. 최종적으로, E1A의 존재는 CMV 증가제(enhancer)/프로모터의 조절하 유전너자의 발현 규칙성을 야기시키고, E13의 존재는 재조합 형질 전환 유전자(transgene)의 발현을 통해 향상된 p53-의존 세포사멸(apoptosis)을 제거한다. 한 실시형태에서 세포는 종래 포유류 세포라인보다 2~200-홀드 이상의 재조합 단백질 및/또는 단백질 물질을 생산할 수 있다.
키메라 또는 인간화 중쇄 분비에 양성적인 이입세포 클론은 ELISA 분석으로 확인될 수 있다. 간략하게, 이입세포 배양으로부터의 상청액 시료(~100㎕)는 염소 항-인간 GAH-IgG, F(ab')2 단편-특정항체(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)으로 예비코트된 ELISA 구멍판에 3배로 부가한다. 플레이트를 상온에서 1시간동안 배양한다. 비결한된 단백질을 세척 완충용액(0.05% 폴리소르베이트(polysorbate) 20)으로 3회 세척하여 제거한다. GAH-IgG, Fc단편-특성 항체(Jackson ImmunoResearch)와 접합된 Horseradish peroxidase(HRP)을 웰에 부가한다(항체 저장희석액 100㎕ × 104, 비접합된 항체와 보충되어 1.0㎍/㎖의 최종농도로 된다). 1시간의 배양에 이어서, 플레이트를 전형적으로 3회 세척한다. 반응용액(100㎕, 오르소페닐렌-디아민(OPD) 167㎍(Sigma, St. Louis, MO)을 함유한다)을 웰에 부가한다. 색깔은 30분동안 어둡게 발전한다. 반응을 자동화 ELISA판독기(Bio-Tek instruments, Winooski, VT)의 490nm에서 흡수력을 측정하기 전에 각 웰에 4N HCl용액 50㎕을 첨가하여 멈추었다. 결합 키메라 항체는 부적절한 키메라 항체 표준(obtainable from Scotgen, Ltd. , Edinburg, Scotland)과 상대적으로 결정된다.
항체들은 하기와 같이 세포배양 배지로부터 분리될 수 있다. 이입세포 배양은 세럼-프리 배지에 적응된다. 키메라항체의 생산에서 세포는 HSFM을 사용하여 롤러 병에서 500㎖ 배양으로 성장된다. 배양균을 원심분리하고 상청액을 0.2μ 박막으로 여과하였다. 여과된 배지를 1㎖/분의 유속에서 단백질 A컬럼(1×3㎝)으로 통과시킨다. 다음, 수지를 PBS 10 컬럼부피로 세척하고, 단백질 A-결합 항체를 10mM EDTA를 함유하는 0.1M 글리신 완충용액(pH 3.5)로 컬럼으로 용출한다. 1.0㎖분획을 10㎕ 3M 트리스(pH 8.6)을 함유하는 튜브로 수집하고, 단백질 농도는 280/260㎚에서 흡광도로 결정한다. 피크분획을 모여서 PBS에 대하여 투석하고, 예를들어 Centricon 30(Amicon, Beverly,MA)로 항체를 농축하였다. 항체농도를 ELISA로 결정하고, 농도를 PBS로 1㎎/㎖로 조절한다. 아자이드나트륨(Sodium Azide) 0.01%(w/v)를 방부제로서 시료에 부가한다.
RS7 항체를 제조하는데 사용되는 프라이머의 뉴클레오타이드 서열을 하기 실시예 2에 나타낸다. 바람직한 실시형태에서 인간화 RS7 항체 또는 항체 단편들은 쥐과 RS7 MAb의 상보성 결정부위(CDRs) 및 인간항체의 경쇄 및 중쇄 가변 부위의 구조부위, 및 인간항체의 경쇄 및 중쇄 불변부위로 이루어지며, 인간화 RS7 경쇄 가변부위의 CDRs는 KASQDVSIAVA의 아미노산 서열로 이루어진 CDR1; SASYRYT의 아미노산 서열로 이루어진 CDR2; 및 QQHYITPLT의 아미노산 서열로 이루어진 CDR3;로 이루어지고, 인간화 RS7 MAb의 중쇄 가변부위의 CDRs는 NYGMN의 아미노산 서열로 이루어진 CDR1; WINTYTGEPTYTDDFKG의 아미노산 서열로 이루어진 CDR2; 및 GGFGSSYWYFDV의 아미노산 서열로 이루어진 CDR3;로 이루어진다. 또한, 바람직하게 인간화 항체의 경쇄 및 중쇄 가변부위의 FR들은 쥐과 RS7 MAb의 FR에 대응되는 것으로 치환된 적어도 하나 이상의 아미노산으로 이루어진다.
RS7 Mab는 잘 설립된 기술의 변화에 의해 하이브리도마 배양으로부터 분리되고 정제될 수 있다. 이러한 분리기술은 단백질-A Sepharose의 친화성 크로마토그래피, 크기배제 크로마토그래피 및 이온교환 크로마토그래피를 포함한다. 예를들어, Baines etal.,"Purification of Immunoglobulin G (IgG), "in METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, VOL. 10, pages 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992)을 보 라.
RS7 MAb는 당업자들에게 잘 알려진 기술의 변화로 특징화할 수 있다. 예를들어 RS7 항원에 결합하는 RS7 MAb의 능력을 면역형광 분석법, 유세포 분석기(Flow Cytometry) 또는 웨스턴 분석을 사용하여 입증할 수 있다.
RS7 항체 단편의 생산
본 발명은 RS7 및 hRS7 항체의 단편의 사용을 고안한다. 특성 에피토프를 인지하는 항체 단편들은 공지의 기술에 의해 일반화될 수 있다. 항체 단편은 F (ab')2, Fab', Fab, Fv, sFv 등의 항체의 항원결합 부분이다. 한정되는 것은 아니지만, 다른 항체 단편들은 항체분자의 펩신 소화에 의해 생산될 수 있는 F (ab')2 단편 및 F (ab')2 단편의 이황화물 다리를 감소함으로써 일반화할 수 있는 Fab'단편을 포함한다. 예를 들어, 상기 방법들은 Goldenberg, U. S. patent Nos. 4,036, 945 및 4,331, 647에 기재되어 있으며, 전체적으로 예로 함유된다. 또한, Nisonoff et al., Arch Biochem. Biophys. 89 : 230(1960) ; Porter,Biochem. J 73 : 119 (1959), Edelman etal., in METHODS IN ENZYMOLOGY VOL. 1, page 422 (Academic Press 1967), 및 Coligan at pages 2.8. 1-2.8. 10 및 2.10.-2. 10.4을 보자. 선택적으로, Fab' 발현 라이브러리는 원하는 특이성으로 단클론 Fab' 단편의 빠르고 용이한 동정으로 설계((Huse etal., 1989, Science, 246:1274-1281)될 수 있다.
단 사슬 Fv 분자(scFv)는 VL 도메인 및 VH 도메인으로 이루어진다. VL 도메 인 및 VH 도메인은 표적 결합부위를 형성하는데 관련한다. 상기 두 도메인은 펩티드 링커(L)에 의해 공유적으로 더 결합된다. scFv 분자는 VL 도메인이 scFv 분자의 N-말단 부분이라면 VL-L-VH, 또는 VH 도메인이 scFv 분자의 N-말단 부분이라면 VH-L-VL로 나타낸다. ScFv 분자를 만들고 적절한 펩티드 링커를 제작하는 방법은 미국특허 제 4,704,692, 미국특허 제 4,946,778, R. Raag and M. Whitlow,"Single ChainFvs." FASEB Vol 9: 73-80 (1995) and R. E. Bird and B. W. Walker,"Single Chain Antibody Variable Regions,"TIBTECH, Vol 9: 132-137 (1991)에 기재되어 있다. 상기 자료들은 예로 배합된다.
항체 단편은 전체 길이 항체의 단백질 가수분해의 가수분해 또는 단편의 DNA 코딩의 다른 숙주 또는 E.coil에서 발현함으로써 제조될 수 있다. 항체단편은 종래의 방법으로 전체 길이 항체의 펩신 또는 파파인(papain) 소화에 의해 얻을 수 있다. 예를들어, 항체단편은 펩신과 항체의 효소적 분할에 의해 F (ab')2로 표시되는 5S 단편을 제공하도록 생산될 수 있다. 상기 단편은 티올 환원제, 선택적으로 이황화물 결합의 분할의 결과인 설프히드릴(Sulfhydryl)기의 방지제를 사용하여 더 분활하여 3.5S Fab' 단가 단편을 생산한다. 선택저으로, 파파인을 사용한 효소적 분할은 2개의 단가 Fab 단편 및 Fc 단편을 직접적으로 생산한다. 상기 방법은 예를들어 Goldenberg, 미국특허 제 4,036, 945 및 제 4,331, 647호에 기재되어있으며, 전체가 예로 배합된다. 또한, Nisonoff et al., Arch Biochem. Biophys. 89 :230 (1960); Porter,Biochem. J. 73: 119 (1959),Edelman etal., in METHODS IN ENZYMOLOGY VOL. 1, page 422 (Academic Press 1967), and Coligan at pages 2.8. 1- 2.8. 10 and 2.10.-2. 10.4을 보자.
항체단편의 다른 형태는 단 상보성 결정부위(CDR)의 펩티드 코딩이다. CDR은 항체가 결합하는 에피토프에 구조적으로 상보적인 항체의 가변부위의 단편이고, 가변부위의 나머지보다 더 가변된다. 따라서, CDR은 종종 아주 다양한 부위(hypervariable region)로 언급된다. 가변부위는 세개의 CDR로 이루어진다. CDR 펩티드는 대상의 항체의 유전자 인코딩 CDR을 설계함으로써 얻을 수 있다. 상기 유전자들은 예를들면 항체-생산세포의 RNA로부터 가변부위를 합성하는 폴리머라제 사슬반응을 사용함으로써 제조된다. 예를들어, Larrick et al., Methods : A Companion to Methods in Enzymology 2: 106(1991) ; Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies,"in MONOCLONAL ANTIBODIES: PRODUCTION, ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION, Ritteret al. (eds. ), pages 166-179 (Cambridge University Press 1995); and Ward et al.,"Genetic Manipulation and Expression of Antibodies,"in MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND APPLICATIONS, Birchet al., (eds. ), pages 137-185 (Wiley-Liss, Inc. 1995)을 보자.
단가 경-중쇄 단편을 형성하기는 중쇄의 분리, 단편의 분할 또는 기타 효소적, 화학적, 또는 유전적 기술과 같은 분할 항체의 다른 방법들은 손상되지 않은 항체에 의해 인지되는 항원에 결합하는 단편이라면 사용될 수 있다.
키메라, 인간화 및 인간 RS7 항체 융합단백질의 생산
항체 융합단백질 및 이의 단편들은 글루타알데하이드(glutaraldehyde) 연결에서 기능기 사이의 보다 특이적 연결까지 종래 과정의 변화에 의해 제조될 수 있다. 항체 및/또는 항체 단편들은 항체 또는 단편에 아민, 카르복실기, 페닐, 티올 또는 수산기 등의 하나이상의 기능기를 통해 직접적으로 또는 연결부분을 통해 다른 것과 공유적으로 결합되는 것이 바람직하다. 글루타알데하이드에 부가하는 디이소시아네이트, 디이소티오시아네이트, 비스(하이드록시석신이미드) 에스테르, 카르보디이미드, 말레이미드하이드록시석신이미드 에스테르와 같은 다양한 종래의 링커들이 사용될 수 있다.
키메라, 인간화 및 인간 RS7 항체융합단백질을 생산하는 간단한 방법은 항체융합단백질을 형성하는 글루타알데하이드의 존재하에서 항체 또는 단편을 혼합하는 것이다. 초기 시프염기(schiff base) 연결은 2차아민에 보로하이드라이드(borohydride) 환원에 의해 안정화될 수 있다. 디이소티오시아네이트 또는 카르보디이미드는 비-부위-특이성 링커로서 글루타알데하이드 대신에 사용될 수 있다. 항체융합단백질은 융합단백질이 RS7 항언의 적어도 2개 이상의 에피토프에 결합되는 부위로 이루어져 있으므로, MAb보다 결합 특이성이 크다고 기대된다. 따라서, 항체융합단백질은 치료에서 RS7 항원 결합 단백질의 바람직한 형태이다.
본 문맥에서 항체융합단백질은 적어도 2개 이상의 키메라, 인간화 또는 인간 RS7 MAb, 또는 이의 단편으로 이루어져 있으며, 여기서 2개 이상의 MAb 또는 단편은 RS7 항원의 다른 에피토프 또는 RS7 에피토프 및 전체적으로 다른 항원의 에피토프와 결합한다. 예를들어, 이특이성 RS7 항체융합단백질은 CEA 항체 또는 이의 단편, 및 RS7 MAb 또는 이의 단편으로 이루어질 수 있다. 상기 이특이성 RS7 MAb 항체융합단백질은 예를들어 상기 CEA로부터 F(ab')2 단편을 얻음으로써 제조될 수 있다. 항체 F(ab')2 단편의 사슬간 이황화물 다리는 경-중쇄 연결을 피하는 것에 주의하면서 Fab'-SH 단편을 형성하기 위해 시스테인으로 서서히 환원된다. SH 기는 비스-말레이미드 링커(1,1'-(methylenedi-4, 1-phenylene)bis-malemide)의 과량으로 활성화된다. RS7 MAb는 Fab'-SH로 전환되고, 다음 활성화된 CEA Fab'-SH 단편과 반응하여 이특이성 RS7 항체융합단백질을 얻는다.
다특이성(polyspecific) RS7항체융합단백질은 RS7항원결합 부분을 이특이성 키메라, 인간화 또는 인간 RS7 항체융합단백질에 부가함으로써 얻을 수 있다. 예를들면, 이특이성 항체융합단백질은 전기에 기재된 비스-말레이미드 활성과정을 사용하여 3차 RS7 항원 MAb 또는 단편에 이특이성 융합단백질을 결합하는데 사용하기 위해 하나이상의 설피드릴기를 도입하도록 2-이미도티올란과 반응할 수 있다. 항원 성분들을 생산하는 상기 기술들은 당업계에 공지된 것이다. 예를들면, 전체적으로 자료가 되는 미국특허 제 4,925,648를 보라.
이특이성 항체는 이황물 분할 및 전체 IgG 또는 바람직하게는 F(ab)'2 단편의 혼합물, 하나이상의 특이성을 갖는 항체를 생산하는 폴리오마스(polyomas)를 형성하는 하나이상의 하이브리도마의 용융의 재형성과 같은 종래 방법의 변형 및 유전적 변형으로 제조할 수 있다. 이특이성 항체융합단백질은 다른 항체의 환원 분할의 결과로 Fab'단편의 산화적 분할에 의해 제조되어왔다. 이는 각 원 에피토프에 Fab'특이성부분을 함유하는 이특이성 항체 융합단백질을 포함하는 F(ab)'2 단편의 혼합물을 생산하는 디황화물 연결의 산화적 개선에 이어, Fab' 단편의 혼합물을 형성하는 환원적 분할, 2개의 다른 항체의 펩신 소화에 의해 생산되는 2개의 다른 F(ab)'2 단편을 혼합함으로써 유리하게 수행된다. 항체융합단백질의 제조에 일반적인 기술은 예를들어 Nisonoffet al., Arch Biochem. Biophys. 93 : 470(1961), Hammering et al.,J. Exp. Med. 128 : 1461 (1968), 및 U. S. patent No. 4,331, 647에 발견될 수 있다. 본 발명에서 고안은 본 발명의 항- EGP-1 MAb 또는 이의 단편이외에, 적어도 하나이상의 첫 항-EGP-1 MAb 또는 이의 단편, 및 적어도 하나 이상의 두번째 MAb 및 이의 단편들로 이루어진 항체융합단백질 또는 이의 단편이다.
보다 선택적인 연결은 말레이미드하이드록시석신이미드 에스테르와 같은 이종 이기능성(heterobifuctional) 링커를 사용함으로써 이루어질 수 있다. 항체 또는 단편과 에스테르의 반응은 항체 또는 단편에 아민기를 유도할 것이며, 유도체는 설피딜기(또는 큰 단편 또는 Traut's Reagent에 의해 부가되는 설피드릴기와 순수한 항체)가 없는 항체 Fab 단편과 반응할 수 있다. 상기 링커는 동일한 항체에서 기와 가교되지 않으며 연결 선택성을 향상시킨다.
항원결합부위로부터 떨어진 부위에서 항체 또는 단편을 연결하는데 유리하다. 이는 상기에서 언급한 바와 같이 부착된 사슬간 설피드릴기를 연결함으로써 수행될 수 있다. 다른 방법은 적어도 하나이상의 자유 아민 작용을 갖는 다른 항체와 산화된 탄수화물 부분을 갖는 항체와 반응하는 것을 포함한다. 이는 초기 시프염기 연결의 결과이며, 바람직하게는 보로하이드라이드 환원에 의해 2차 아민으로 환원함으로써 안정화되어 최종 조성을 형성한다. 작은 분자에서 상기 부위-특이성 연결은 미국특허 제 4,671.958에 기재되며 큰 분자는 미국특허 4,699,784호에 가수된다.
길이(예를들어 15- 또는 18-잔사 링커)에서 12아미노산 이상의 링커와 ScFvs는 동일 사슬에서 VH 및 VL 도메인사이에서 상호반응하고, 일반적으로 단량체, 이합체(diabody로 지칭) 및 고 질량 다중체(multimer)소량의 혼합물을 형성한다(Kortt et al., Eur. J. Biochem. (1994) 221: 151-157). 그러나, 5이하의 아미노산 잔기와 ScFvs는 동일 사슬에서 VH 및 VL 도메인의 분자내 결합을 방해하고, 다른 사슬에서 VH 및 VL 도메인과 결합하도록 한다. 3- 및 12-잔기사이의 링커는 우세하게 이합체를 형성한다(Atwell etal., Protein Engineering (1999) 12: 597-604). 0 및 2 잔기사이이의 링커와 트리머릭(trimeric, triabodies라 지칭), 테트라머릭(tetraabodies라 지칭) 또는 높은 ScFvs의 올리고머 구조가 형성되지만; 올리고머화의 정확한 패턴은 링커길이에 부가되는 V-도메인의 배향뿐만 아니라, 조성에 의존하는 것으로 나타난다. 예를들어, 항-노이라미니다아제(neuraminidase) 항체 NC10의 scFvs는 우세적으로 0-잔기 링커와 트리머(VH에서 VL배향) 또는 테트라머(VL 에서 VH배향)을 우세적으로 형성되었다(Dolezal etal., Protein Engineering (2000) 13: 565-574). 1- 및 2-잔기 링커와 NC10으로부터 설계된 ScFvs에서 VH에서 VL배향은 우세적으로 이합체를 형성하며(Atwell etal., Protein Engineering (1999); 반대로 VL에서 VH배향은 테트라머, 트리머, 이합체 및 고 질량다중체의 혼합물을 형성하였다(Dolezal etal., Protein Engineering (2000) 13: 565-574). VH에서 VL배향에서 항-CD19 항체 HD37로부터 설계된 scFvs에서 0잔기 링커는 오직 트리머를 형성하고, 1-잔기 링커는 오직 테트라머를 형성하였다(Le Gall et al., FEBS Letters (1999) 453: 164-168).
또한, 본 발명의 RS7 항체 및 이의 단편은 항원-특이성 이합체, triabodies, 및 tetrabodies를 생산하는데 사용될 수 있으며, 다가가 아니라 단특이성이다. 2종 이상의 ScFvs 분자의 비-공유 관련은 기능적 이합체, triabodies, 및 tetrabodies를 형성할 수 있다. 단특이성 이합체는 동일한 scFv의 동종이중체(homodimer)이며, 각 scFv는 동일 항체의 VL 도메인에 단 링커에 의해 결합된 선택된 항체로부터 VH 도메인으로 이루어진다. 이합체는 2개의 Fv 결합부위를 산출하는 2개의 scFv의 비-공유성 조합에의해 형성된 이가 다이머이다. triabody는 3개 결합부위를 산출하는 3개의 scFv의 비-공유성 조합에의해 형성된 3가 트리머의 형성에 기인하며, 테트라바디(tetrabody)는 4개 결합부위를 산출하는 4개의 scFv의 4가 4중체이다. 여러 단특이성 이합체는 VHI-링커-VL로 이루어진 재조합 유전자 구조를 함유하는 발현벡터를 사용하여 제조되어 왔다. Holliger etal., Proc.Natl.Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993); Atwell etal., Molecular Immunology 33: 1301-1302 (1996); Holliger etal., Nature Biotechnology 15: 632-631 (1997);Helfrich et al., Int. J : Cancer 76; 232-239(1998); kipriyanov et al., Int. J. Cancer 77:763-772(1998); Holiger et al., Cancer Reserch 59:2909-2916(1999)을 보라. ScFv에 기초하여 다가, 단특이성 결합 단백질의 생산하는 방법은 미국 5837242(1998), 제 5844094(1998) 및 WO 98/44001(1998)에 기재된다. 현 발명의 바람직한 실시형태는 EGP-1 표적항원에 친화력을 갖는 하나이상의 항원결합 부위 및 합텐분자에 친화력을 갖는 하나이상이 합텐결합부위로 이루어진 다가, 다중특성 항체 및 이의 단편이다.
항체결합 친화력 결정
mRS7, cRS7 및 hRS7 항체의 비교적인 결합 친화력은 직접적인 방사면역측정법(radioimmunoassay)으로 결정될 수 있다. RS7은 클로라민(chloramines)-T 방법을 사용하여 131I 및 125I을 사용하여 라벨화될 수 있다(예를들어, 예가 되는 Greenwood et al., Biochem. J., 89: 123 (1963)을 보라). 요오드화된 항체의 특이성 활성은 전형적으로 10μCi/㎍로 조절된다. 비라벨화된 및 라벨화된 항체는 반응배지(1% horse 세럼 및 100㎍/㎖ 겐타마이신(gentamicin)로 추가된 HSFM)을 사용하여 적절한 농도로 희석된다. 라벨화된 및 비라벨화된 항체의 적절한 농도는 100㎕의 전체 부피에서 반응튜브에 함께 부가된다. ME180 세포(인간 자궁경부종양(cervical carcinoma) 세포라인)의 배양은 시료화되고, 시료농도를 결정한다. 배양을 원심분 리하고 수집된 세포를 반응배지에서 한번 세척하고, 반응배지에서 재현탁에 이어 약 107cell/㎖의 최종농도를 갖는다. 모든 과정은 4℃에서 차가운 상태에서 시행된다. 세포 현탁액 100㎕을 반응 튜브에 부가한다. 반응을 4℃에서 2시간동안 반응 튜브의 주기적으로 서서히 흔듬으로 세포를 재현탁(resuspend)한다. 반응기간에 이어 세척완충용액(1% BSA를 함유하는 PBS)를 각 튜브에 부가한다. 현탁액을 원심분리하고 세포 펠렛을 다른 세척완충용액 5ml로 2번 세척하였다. 원심분리에 이어 세포펠렛에 남아있는 방사능의 잔존량을 감마 카운터(Minaxi, Packard Instruments, Sterling, Va.)에서 결정한다.
발현벡터
발현 벡터는 숙주세포에서 발현되는 유전자로 이루어진 DNA 분자이다. 전형적으로, 유전자 발현은 구성적 또는 유도성 프로모터, 조직-특이성 조절인자 및 증가제를 포함하는 조절 원소의 조절하에서 이루어진다. 상기 유전자는 조절 원소에 "실행가능하도록 연결된" 것이다. 프로모터는 구조적 유전자의 전사하도록 하는 DNA 서열이다. 구조적 유전자는 특이성 폴리펩타이드의 아미노산 특징의 서열속으로 복사되는 메신저 RNA(mRNA)속으로 전사되는 DNA 서열이다. 전형적으로, 프로모터는 구조적 유전자의 전사 시작부위에 가까운 유전자의 5'부위에 위치한다. 프로모터가 유도성 프로모터이라면, 전사속도는 유도물질에 대응하여 증가한다. 반대로, 전사속도는 프로모터가 구조적 프로모터이라면, 유도물질에 의해 조절되지 않 는다. 증가제(enhancer)는 전사 시작부위에 상대적인 증가제의 거리 또는 배향에 상관없이 전사의 효율성이 증가할 수 있는 DNA 조절원소이다.
분리된 DNA 분자는 생물의 유전적 DNA에 통합(integrate)되지 않은 DNA 단편이다. 예를들어, 클론화 RS7 항원유전자는 포유류 세포의 유전적 DNA로부터 분리된 DNA 단편이다. 분리된 DNA 분자의 다른 예는 생물의 유전적 DNA에 통합되지 않은 화학적으로 합성된 DNA 분자이다. 상보적 DNA(cDNA)는 효소 역전사에 의해 mRNA 주형으로부터 형성되는 단가닥(single strand) DNA 분자이다. 전형적으로, mRNA의 부분에 상보적인 프라이머는 역전사의 초기에 도입된다. 또한, 당업계에서는 cDNA 표현을 상기 단가닥 DNA 분자 및 이의 상보적 DNA 가닥으로 이루어진 이중 가닥 DNA로 언급하는데 사용한다.
클로닝 벡터는 숙주세포에서 자발적으로 복제능력을 갖는 플라스미드, 코스미드 또는 박테리오페이지와 같은 DNA분자이다. 전형적으로 클로닝 벡터는 클로닝벡터로 변형된 세포의 동정 및 선택의 용도에 적절한 표식 유전자 뿐만 아니라, 외인 DNA 서열이 벡터의 필수적 생물학 기능의 손실없이 결정 경향에 삽입될 수 있는 제한 엔도뉴클레아제(endonuclease) 인식부위의 하나 또는 작은 수를 함유한다. 재조합 숙주는 클로닝 벡터 또는 발현 벡터를 함유하는 전핵 또는 진핵세포일 수 있다. 또한, 상기 용어는 숙주세포의 염색체 또는 게놈에서 클론화된 유전자를 함유하도록 유전적으로 변형된 진핵 또는 전핵세포를 포함한다. 발현 용어는 유전자 생성체의 생합성을 언급한다. 예를들어, 구조적 유전자의 경우에서 발현은 mRNA로 구조적 유전자의 전사 및 하나 이상의 폴리펩타이드로 mRNA의 전환을 포함한다.
치료 및 진단용 인간화, 인간 및 키메라 RS7 항체용도
본 발명에서 고안은 EGP-1 MAb 또는 이의 단편, 또는 항체융합단백질 또는 이의 단편으로 이루어진 치료적 컨쥬게이트의 치료적으로 효과적인 양을 목적물에 처리하는 것으로 이루어진 목적물에서 악성종양을 진단 또는 처리하는 방법이며, 여기서 EGP-1 MAb 또는 이의 단편, 또는 항체융합단백질 또는 이의 단편은 적어도 하나 이상의 치료제에 결합되고 약학적으로 적당한 부형제에 나타낸다. 또한, 다른 항원-결합부분과 비접합된(자체) EGP-1 MAb 또는 용융은 EGP-1으로 발현하는 암세포에 치료제로서 적당할 수 있다. 상기 비접합된 항체는 다양한 연속 및 스케줄과 함께 화학요법(chemotherapy), 방사선요법(radiotherapy) 및/또는 면역요법과 같은 다른 치료 양상과 조합하여 주어질 수 있다. 또한, 바람직하게는 목적물에 EGP-1에 하나이상의 결합부위 및 하나이상의 합텐 결합부위로 이루어진 다가, 다중특성 항체 또는 이의 단편을 투여하는 단계; 목적물의 혈관을 청소하도록 비결합 단백질의 함량에 충분한 시간을 기다리는 단계; 및 진단제, 치료제 및 이의 조합으로 이루어진 운반체 분자를 목적물에 투여하는 단계;로 이루어진 다가, 다중 항체 또는 이의 단편의 결합부위에 결합하는 암 진단 또는 암치료용 방법이다. 바람직한 실시형태에서 암은 폐, 유방, 머리 및 목, 난소, 전립선, 방광 또는 결장암이다.
단클론 항체(MAbs)의 생산을 위한 하이브리도마 기술은 암세포를 발견하거나 죽이는 능력을 갖는 분자 프로브의 생산방법을 제공한다. 방사선라벨화된 MAbs를 이용한 종양 영상기술은 많은 악성종양에서 암 공격을 묘사하는데 사용되어 왔다. 실험적인 동물 및 인간에서, 항체는 암배아 항원(carcinoembryonic antigen)으로 발현하는 다양한 종양에서 암배아항원의 방사면역검출법(radioimmunodetection)에 사용되어 왔으며, 또한 다른 표적 항체와 함께 흑색종, 결장암 및 유방암과 같은 종양에 사용되어 왔다. Goldenberg et al., Cancer Res. 40 : 2984 (1980); Hwang et al.,Cancer Res. 45 : 4150 (1985); Zalcberg et al., J.Nat'l Cancer Inst. 71 : 801 (1983); Colcher et al., Cancer Res. 43 : 736 (1983); (Larson et al.,J. Nucl. Med. 24 : 123 (1983); DeLand etal., Cancer Res. 40 : 3046 (1980); Epenetos etal., Lancet 2 : 999 (1982).
생체 밖에서 MAbs 용도는 잘 알려져 있다. 예를들어 Carlsson etal.,BiolTechnology 7(6) : 567 (1989)을 보라. 예를들면, MAbs는 생검(biopsy)시료로부터 조직내 종양관련 항원의 존재를 관측하는데 사용될 수 있다. 또한, MAbs는 방사면역검출법, 효소 연결 면역흡착제 분석 및 형광 면역분석법과 같은 기술을 사용하여 임상학적 유액 시료에서 종양관련 항원의 함량을 측정하는데 사용될 수 있다.
종양-표적 MAbs 및 독소의 컨쥬게이트는 생체내 암 세포를 선택적으로 죽이는데 사용될 수 있다(Spalding,BiolTechnology 9 (8) : 701 (1991) ; Goldenberg, ScientificAmerican Science & Medicine 1 (1) : 64 (1994) ). 예를들어, 실험적 동물모델에서 치료적 연구는 세포독성(cytotoxic) 방사성핵종을 이동하는 항체의 항-종양 활성을 설명하였다((Goldenberget al., Cancer Res. 41 : 4354(1981), Cheung et aL,JNat'l Cancer Inst. 77.-739 (1986), and Senekowitsch et al., J. Nucl. Med. 30 : 531 (1989) ). 또한, 전체적으로 예로 되는 Steinet al., Antibody Immunoconj. Radiopharm. 4 : 703 (1991)를 보라. 게다가, 상기 몇 MAbs와 상 I 치료적 시도는 림프종(lymphoma), 흑색종 및 다른 악성종양의 치료에 시작되어왔다. 예를들어 DeNardo et al., Int.J : Cancer Suppl. 3 : 96 (1988), and Goldenberget al., J Clin. Oncol. 9 : 548 (1991)을 보라.
인간화, 키메라 및 전체 인간 항체 및 이의 단편은 치료방법 및 진단방법의 용도로 적당하다. 따라서, 본 발명에서 고안된 것은 (i) 항-EGP-1 항체로 이루어진 조성을 제공하는 단계 및 (2) 진단성 또는 치료성 항체 컨쥬게이트를 목적물에 투여하는 단계;로 이루어진 표적에 진단제 또는 치료제, 또는 이의 조합을 전달하는 방법이다. 바람직하게, 본 발명의 키메라, 인간화 및 전체 인간 RS7 항체 및 이의 조합은 악성종양 치료용 방법에 사용된다.
또한, 여기에 기재된 것은 암세포에 결합하는 항-EGP-1 단클론 항체 또는 이의 단편, 또는 항체융합단백질 또는 이의 단편으로 이루어진 항체성분을 함유하는 암세포 표적 진단 또는 치료 컨쥬게이트이고, 항체 조성은 하나 이상의 진단제 또는 하나 이상의 치료제에 결합된다. 바람직하게, 진단 컨쥬게이트는 하나 이상의 광활성 진단제 또는 MRI 조영제(contrast agent)로 이루어진다. 더 바람직하게는, 진단제는 60~4000keV 에너지의 방사능 수준이다.
치료용 조성은 하나이상의 자체 또는 접합된 인간화, 키메라 또는 인간 RS7 항체 단독, 또는 본 발명의 다른 자체 또는 접합된 인간화, 키메라 또는 인간 RS7 항체, 또한 여기서 공개되지 않은 다른 자체 또는 접합된 인간화, 키메라 또는 인간 항체의 조합을 함유한다. 또한, 본 발명은 항-EGP-1 항체에 접합되지 않은 면역조절자(Immunomodulator)과 같은 치료제 또는 진단제와 접합되거나 항체 자체의 처리를 고안한다. 동일하거나 상이한 에피토프 또는 항원에 항체 자체 또는 접합된 항체는 본 발명의 하나이상의 항체와 조합될 수 있다.
따라서, 본 발명은 항체 자체 또는 항체단편으로서 항-EGP-1 항체 및 이의 단편 단독 처리, 또는 다중 치료로서 처리하는 것을 고안한다. 바람직하게, 항체는 인간화, 키메라 또는 전체 인간 RS7 항체 또는 이의 단편이다. 본 발명의 다중 치료는 항체 자체, 융합단백질이 형태 또는 이뮤노컨쥬게이트(immunoconjugate)의 형태로서 다른 항체의 처리에 부가되는 항-EGP-1 항체 자체와 면역치료를 포함한다. 예를들어, 인간화, 키메라 또는 전체 인간 RS7 항체는 다른 인간화, 키메라 RS7 또는 다른 항체 자체, 또는 인간화, 키메라 RS7 또는 동위원소에 접합된 다른 항체, 하나이상의 화학요법제제, 사이토킨, 독소 또는 이의조합과 조합될 수 있다. 예를들어, 본 발명은 항-EGP-2, CEA, CSAp, MUC1-4, EGFR, HER2/neu, PSA, CC49 (항-Tag 72 항체) 및 PSMA 항체와 같은 기타 고체 종양/암종 관련 항체 조합 전 또는 후의 자체 또는 접합된 EGP-1 또는 RS7항체의 처리를 고안한다. 상기 고체종양 항체는 그 중에서도 약물, 효소, 호르몬, 독소, 동위원소 또는 면역조절자에 자체 또는 접합되어 있다. 또한, 본 발명에서 인간화된 융합단백질, 키메라 또는 전체 인간 RS7항체 및 독소가 사용될 수 있다. 많은 다양한 항체 조합은 치료제 또는 면역조절자과 부분적으로 접합되고 부분적으로 자체이거나 항체 차제로서 설계될 수 있다. 선택적으로, 상이한 항체 자체 조합은 사이토킨 약물 또는 방사능을 갖는 다른 치료제와 조합하는 것을 처리하는데 적용될 수 있다. 또한, 상기 항체의 조합은 당업계에서 알려진 것으로 안티센스(antisense) 올리고뉴클레오타이드와 제조될 수 있다. 치료 컨쥬게이트는 올리고뉴클레오타이드, 특히 B-세포 악성종양의 암유전자 및 암유전자 산물에 대하여 바람직하게 지배되는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 함유한다. 예를들어, 전체적으로 예로 되는 미국 5,734,033에서 기재된 bcl-2 발현을 억제하는 안티센스 분자는 항체융합단백질의 치료제 부분을 형성하도록 접합되거나 본 발명의 인간화 RS7 항체와 처리된다.
단특이성 결합 단백질은 표적 RS7 양성 종양에 직접적으로 진단 또는 치료제제에 결합되어 있다. 단특이성 분자는 표적화된 항원에 선택적으로 결합하고, 분자에 결합부위의 수는 증가하며, 표적세포의 친화력은 증가되고 원하는 위치에서 체제시간(residence time)이 더 길어진 것으로 관측된다. 게다가, 분자에 결합된 비-항원은 급속히 몸에서 제거되고 정상 조직의 노출이 최소화된다. 다중특성 결합 단백질의 사용은 진단 또는 치료제제의 실질적 특이성 배달에 RS7 양성종양을 예비표적화하는 것이다. 제제는 펩티드를 함유하는 히스타민 석시닐 글리실(HSG)에 의해 운반된다. 679로 제작된 쥐과 단클론 항체(IgG1, K)은 트리-펩티드 부분, HSG를 함유하는 분자에 높은 친화성을 갖도록 결합한다(Morel etal, Molecular immunology, 27,995-1000, 1990). 679 Mab는 HSG 및 표적 항원에 결합하는 hRS7과 이특이성 결합 단백질을 형성할 수 있다. 선택적인 합텐도 사용될 수 있다. 상기 결합 단백질은 선택적으로 원하는 위치에서 체제시간이 길어지고 친화력이 증가되도록 표적화된 항원에 결합한다. 게다가, 다이어바디(diabody)에 결합된 비-항원은 재빨리 몸 에서 제거되고 정상조직의 노출이 최소화된다.
RS7 항체 및 이의 단편들은 암과 같은 포유류 질병을 치료하는데 사용될 수 있다. 암은 제한되지 않지만, 폐, 유방, 방광, 난소, 전립선 및 결장암을 포함한다.
본 발명에 의한 진단용 또는 치료용으로 표적에 진단성 또는 치료성 제제를 전달하는 것은 진단성 또는 치료성 제제와 항-EGP-1 항체 또는 이의 단편을 제공하고, 결합 단백질을 필요에 목표물에 투여하는 단계를 포함한다. 진단은 공지기술로 결합 단백질을 관측하는 단계를 요구한다.
진단성 또는 치료성 제제와 본 발명의 항체 및 이의 단편의 처리는 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 피하, 늑막내, 척수수초내, 도뇨관을 통한 관류, 또는 병소내(intralesional) 주입에 의해 포유류에서 영향을 줄 수 있다. 주입에 의해 결합 단백질을 처리하는 경우, 처리는 연속적인 주입, 또는 단(single) 또는 여러 개의 boluses에 의해 이루어질 수 있다. 20~800㎎/㎡ 범위의 약용량이 가능하고, 치료에 100~500㎎/㎡ 범위의 약용량이 바람직하고, 0.5~100㎎/환자와 같이 낮은 약용량이 진단 영상에 추천되었다. 상기 약용량은 임상학적 상황 및 환자 인내력에 따라 상이한 빈도에서 반복될 수 있다.
진단성 또는 치료성 제제를 갖는 항체는 생리적 pH 및 농도에서 약학적으로 적용가능한 주입 운반체, 바람직하게는 포스페이트-완충 살린(PBS)에서 인간 또는 포유류 치료 및 진단성 용도에 키트로써 제공될 수 있다. 바람직하게 제조는 인간에 사용하고자 한다면 필수적으로 무균적일 것이다. 상기 키트의 선택적 성분으로 는 안정제, 완충용액, 라벨링 시약, 방사성동위원소, 상자성 화합물, 향상된 클리어런스용 2차 항체, 및 종래의 주사기, 컬럼, 바이알 등을 포함한다.
자체 항체 치료
치료적으로 자체 키메라, 인간화 및 전체 인간 RS7 항체 또는 이의 단편의 효과적인 함량은 약학적으로 적용가능한 부형제에 나타낼 수 있다. 또한, 자체 키메라, 인간화 및 전체 인간 RS7 항체의 효율성은 동시적으로 또는 연속적으로 처리하고 RS7 항체 또는 이의 단편과 전기의 약용량 요법에 따라 하나이상의 항체 자체를, 약물, 독소, 면역활성화합물, 호르몬, 성장인자, 효소 또는 치료적 방사성핵종과 같은 치료제제와 접합된 하나이상의 키메라, 인간화 및 전체 인간 RS7 항체의 이뮤노컨쥬게이트, 또는 약물, 독소, 면역활성화합물, 호르몬, 성장인자, 효소 또는 치료적 방사성핵종을 함유하는 하나 이상의 치료제제와 함께 부가함으로써 향상시킬 수 있다.
바람직한 실시형태에서 본 발명의 RS7 항체 자체 또는 컨쥬게이트는 적어도 하나 이상의 암 약물과 조합된다. 상기 조합 치료는 약물의 효과를 향상시키고 필요하는 약물 약용량을 낮춘다. 예를들어, IC50 값은 폐암세포 라인 Dox-RS7 및 2P-Dox-RS7, Calu3, 및 각각 MDA468 및 T47D인 2개의 유방암 세포라인에서 결정되었다. Calu3 및 T47D 세포는 EGP-1 항원에 양성적이고 CEA 항원에 음성적이며, MDA468은 EGP-1 및 CEA 모두에서 양성적이다. 그 결과는 Dox-RS7의 IC50 값은 0.04㎍/㎖이고, 2P-Dox-RS7에서는 0.023㎍/㎖임을 나타낸다. 따라서, 2P-Dox와 같은 특정 약물에 본 발명의 자체, 인간, 인간화 또는 키메라 항-EGP-1 항체 또는 이의 단편을 접합하는 것은 다약재(multidrug) 내성을 극복하는데 도와준다. 또한, 이는 항체를 특정약물과 조합할 경우 가능하다.
RS7 이뮤노컨쥬게이트
또한, 본 발명은 인간화된, 키메라 및 인간 RS7 항체 및 이의 단편을 치료용으로 사용하는 것을 고안한다. 면역치료법의 목적은 비표적 조직에 노출을 최소화하는 반면, 방사능, 독소, 사이토킨, 효소 또는 호르몬의 세포독성 약물 또는 약제를 표적 세포에 전달하는 것이다. 본 발명의 RS7 항원 결합 단백질은 폐, 유방, 방광, 난소, 자궁, 위 및 전립선 등의 다양한 종양 치료에 사용될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항체 융합단백질 및 이의 단편 중 어느것은 하나이상의 치료성 또는 진단성 제제와 접합될 수 있다. 일반적으로 한 치료성 또는 진단성 제제는 동일한 항체 또는 항체단편에 부착될 수 있는 하나이상의 치료성 제제 또는 진단성 제제가 아니라 각각의 항체 또는 항체 단편에 부착된다. Fc가 없다면(예를들어, 이뮤노컨쥬게이트의 항체성분으로 사용된 항체가 항체단편일 경우), 전체길이 항체 또는 항체단편의 경쇄가변부위로 탄수화물을 도입할 가능성이 있다. 예를들어, 전체적으로 예로 되는 Leung etal.,R Immunol. 154 : 5919 (1995); Hansen et al., U. S. Patent No. 5,443, 953 (1995), Leung etal., U. S. patent No. 6,254, 868를 보라. 변형된 탄수화물 부분은 치료성 또는 진단성 제제에 부착되어 사용된다.
항체 탄수화물 부분을 매개로 항체 성분에 단백질을 접합하는 방법은 당업자들에게 공지된 기술이다. 예를 들어, 전체적으로 예로 배합되는 Shih et al., Int. J. Cancer41 : 832 (1988); Shih et al., Int.R Cancer46 : 1101 (1990); and Shih et al., U. S. Patent No. 5,057, 313을 보라. 일반적인 방법은 하나이상의 자유 아민 기능을 갖고 다수의 펩티드를 주는 운반체 폴리머와 산화된 탄수화물 부분을 갖는 항체 성분을 반응하는 것을 포함한다. 상기 반응은 2차아민을 환원하여 최종 컨쥬게이트를 형성함으로써 안정화될 수 있는 초기 쉬프 염기(이민) 연결의 결과한다. 또한, 항체에 DTPA (Mx-DTPA 등), DOTA, TETA, 또는 NOTA와 같은 킬레이트 화합물을 부착할 수 있다.
본 발명의 항체 융합단백질은 2종 이상의 항체 또는 이의 단편으로 이루어지고, 상기 융합단백질을 이루는 각 항체 또는 단편들은 치료성 제제 또는 진단성 제제를 함유할 수 있다. 게다가, 하나 이상의 항체 융합단백질의 항체 또는 단편은 하나이상의 치료성 및 진단성 제제를 부착할 수 있다. 게다가, 치료성 제제는 동일할 필요가 없으며 상이한 치료성 제제일 수 있고, 예를들어 동일 융합단백질에 약물 및 방사성동위원소를 부착할 수 있다. 특히, IgG는 131I 로 방사선라벨화할 수 있으며, 약물에 부착할 수 있다. 131I 는 IgG의 티로신으로 배할될 수 있으며, 약물은 IgG 리신의 엡실론 아미노기에 부착될 수 있다. 또한, 치료성 및 진단성 제제 모두는 환원된 SH기에 부착될 수 있으며, 탄수화물 측쇄에 부착될 수 있다.
매우 다양한 진단 및 치료 시약이 본 발명의 항체에 유리하게 접합될 수 있다. 여기에서 기재된 치료제는 상기에서 언급한 바와 같이 항체 자체와 개별적으로 처리하는데 유용한 제제이다. 예를들어, 치료제는 빈카알칼로이드(vinca alkaloid), 안트라사이클린(anthracycline), 에피도필로톡신(epidophyllotoxin), 탁산, 대사길항물질(antimetabolite), 알킬화제, 항생물질, 치환 요소, 효소, Cox-2 억제제, 세포분열 저지성물질(antimitotic), 및 세포사멸제(apoptotic) 제제와 같은, 바람직하게는 독소루비신, 독소루비신 유사체, 메토트레사트(methotrexate), 탁솔, CPT-11, 캄토데칸(camptothecan), 및 항암제제, 메틸 하이드라진 유도체, 부신피질 억제제, 길항제, 엔도스타틴(endostatin), 탁솔과 같은 기타 분류들과 같은 화학요법 제제를 포함한다. 이뮤노컨쥬게이트 및 항체 융합단백질의 제조에 유용한 암 화학요법 제제는 질소머스타드, 에틸렌이민 유도체, 알킬 설포네이트, 니트로소우레아(nitrosoureas), 트라아젠, 엽산 유사체, COX-2 억제제, 피리미딘 유사체, 푸린 유사체, 백금 배위 착물, 호르몬, EGF-수용체 타이로신 키나제, BCR ABL 타이로신 키나제 또는 VEGF-수용체 타이로신 키나제 등을 억제하는 타이로신 키나제 억제제를 포함한다. 적절한 화학요법 제제는 REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES,19th Ed. (Mack Publishing Co. 1995), 및 GOODMAN ANDGILMAN'S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS, 7th Ed.(MacMillan Publishing Co. 1985)에 기재되어 있으며, 이의 교정본도 마찬가지이다. 실험적 약물과 같은 기타 적절한 화학요법제제는 당업계에 공지되어 있다.
또한, 슈도모나스 외독소(pseudomonas exotoxin)와 같은 독소는 본 발명의 RS7 및 hRS7의 이뮤노컨쥬게이트의 치료제를 형성하도록 복합될 수 있다. 상기 컨쥬게이트 또는 기타 융합단백질의 제조에 도입되는 기타 독소는 리신, 아브린(abrin), 리보뉴클레아제(RNase), DNase I, 포도상구균 장독성(staphylococcal enterotoxin)-A, 포크위드 항 바이러스(pokeweed antiviral) 단백질, 겔로닌(gelonin), 디프테린(diphtherin) 독소, 슈도모나스 외독소, 슈도모나스 내독소를 함유한다. 예를들어, Pastan etal., Cell 47 : 641 (1986), 및 Goldenberg, CA-ACancer Journalfor Clinicians 44 : 43 (1994)를 보라. 본 발명에서 사용에 적절한 부가적인 독소는 당업계에서 공지된 것이며, 전체적으로 예가 되는 미국특허 제 6,077,499호에 공개된다.
사이토킨과 같은 면역조절자은 EGP-1, RS7, 및 hRS7 이뮤노컨쥬게이트의 치료성 제제부분을 형성하도록 접합되거나 본 발명의 키메라, 인간화 또는 인간 RS7 항체 또는 이의 단편에 비컨쥬게이되도록 처리할 수 있다. 여기에서 사용된 "면역조절자"은 사이토킨, 줄기세포 성장인자, 종양괴사 인자와 같은 림포톡신, 및 인터루킨(인커루킨-1(IL-1), IL-2, IL-3, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, 및 IL-21), 콜로니 자극인자(granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF) 및 granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF)), 인터페론(interferons)(인터페론-α,β, 및 γ), SI 인자로 제작된 줄기세포 성장인자, 에리트로포이에틴(erythropoietin) 및 트롬보포이에틴, 또는 이의조합과 같은 조혈성(hematopoietic) 인자들을 포함한다. 적절한 면역조절자 부분의 구체적인 예는 IL-2, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, IL-21, interferon-γ, TNF-α 등을 포함한다. 선택적으로, 목적물은 EGP-1 또는 RS7 자체 항원을 받을 수 있으며, 자체 RS7 항체의 조절 후 또는 전에 처리될 수 있는 처리 사이토킨을 받을 수 있다. 또한, RS7 항체는 면역조절자에 접합될 수 있다. 또한, 면역조절자은 상이한 항원에 결합하는 하나 이상의 항체로 이루어진 이중(hybrid) 항체에 접합될 수 있다.
치료성 또는 진단성 제제는 이황화물 결합 형성을 통하여 환원 항체 성분의 경첩부위(hinge region)에서 부착될 수 있다. 선택적으로, 펩티드는 N-석시닐3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트(SPDP)과 같은 이종이기능성(heterobifuctional) 가교기를 사용하여 항체 성분에 부착할 수 있다(Yu et al., Int.R Cancer 56 : 244 (1994). 상기 컨쥬게이션의 일반적인 방법은 당업계에 공지된 것이다. 예를들어, Wong, CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSS-LINKING (CRC Press 1991); Upeslacis etal.,"Modification of Antibodies by ChemicalMethods,"in MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND APPLICATIONS, Birchet al. (eds. ), pages 187-230 (Wiley-Liss, Inc. 1995); Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies, "in MONOCLONAL ANTIBODIES: PRODUCTION, ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION, Ritter et aL (eds. ), pages 60-84 (Cambridge University Press 1995)을 보라. 선택적으로, 치료성 또는 진단성 제제는 항체의 Fc 부위에서 탄수화물 부위을 통하여 접합될 수 있다. 탄수화물기는 티올기에 결합된 동일한 펩티드의 부하를 증가시키는데 사용될 수 있거나, 탄수화물 부분은 상이한 펩티드를 결합하는데 사용될 수 있다.
게다가, 방사선라벨화된 항체, 이뮤노컨쥬게이트 또는 이의 단편은 진단성 영상에 유용한 γ-방출 방사선동위원소 또는 양전자-방출체로 이루어질 수 있다. 특히 25~4000keV에너지 범위에서 적절한 방사선동위원소는 131I, 123I, 124 I, 86Y, 62Cu, 64Cu, 67Ga, 68Ga, 99mTc, 94m Tc, 18F, 11C, 13N, 15O, 75Br 등을 포함한다. 예를들어, 전체적으로 예가 되고, 영상목적으로 18F, 68Ga, 94mTc과 같은 양전자 방출체를 공개한 U. S. Patent Application entitled "Labeling Targeting Agents with Gallium-68"-Inventors G. L. Griffiths and W. J. McBride, (U. S. Provisional Application No. 60/342,104)을 보라. 바람직하게는, 진단성 및 치료성 방사성핵종의 에너지 범위는 25~4000keV이다. 기타 다른 유용한 방사성 핵종은 90Y, 111In, 125 I, 3H, 35S, 14C, 186Re, 188Re, 189 Re, 177Lu, 67CU, 212Bi, 213Bi, 211At, 198Au, 224Ac, 126I, 133I, 77Br, 113mIn, 95Ru, 97Ru, 103 Ru, 105Ru, 107Hg, 203Hg, 94mTc, 121mTe, 122mTe, 125mTe, 165Tm, 167Tm, 168Tm, 111Ag, 197Pt, 109 Pd, 32P, 33P, 47Sc, 153Sm, 177Lu, 105Rh, 142Pr, 143Pr, 161Tb, 166Ho, 199Au, 57CO, 58Co, 51 Cr, 59Fe, 58F, 75Se, 201Tl, 225Ac, 76Br, 86Y, 169Yb, 166Dy, 212Pb, 및 223Ra을 포함한다.
예를들면, 61.5시간의 반감기 및 베타입자 및 감마선의 풍족한 공급 때문에 방사성면역치료법에 하나이상의 방사선동위원소를 고려한 67Cu는 킬레이팅제인 p-브로모아세트아미도-벤질-테트라에틸아민테트라아세트산(TETA;p-bromoacetamido- benzyl-tetraethylamine tetra acetic acid)을 사용하여 RS7 항원결합 단백질에 접합될 수 있다. 선택적으로, 베타 입자를 방출하는 90Y는 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA; diethylenetriaminepentaacetic acid)을 사용하여 RS7 항원결합 단백질에 연결될 수 있다. 게다가, 131I로 RS7 MAb의 직접적인 방사선동위원소로 표식하는 방법은 Stein et al. (1991), supra, and the patent by Govindan et al., WO 9911294A1 entitled "Stable Radioiodine Conjugates and Methods for Their Synthesis, "에 기재되어 있다.
열적 중성자 활성치료법에 붕소 단백질 가수분해-부하된 운반체를 갖는 본 발명의 RS7 항체 또는 이의 단편을 유사한 방식으로 영향을 미칠것이다. 그러나, 중성자 방사를 수행하기 전에 비-표적화 RS7 이뮤노컨쥬게이트를 제거할 때까지 기다리는 것에 유리할 것이다. 클리어린스는 RS7 항체에 결합하는 항체를 사용하여 가속화될 수 있다. 일반적인 원칙 기재의 미국특허 제 4,624,846을 보라. 예를들면, 카보레인과 같은 붕소 가수분해된 것은 RS7 항체에 부착될 수 있다. 카르보레인을 당업계에서 공지된 것과 같이 팬던트 측쇄의 카르복실기와 제조될 수 있다. 아미노덱스트란(aminodextran)과 같은 운반체에 카보레인의 부착은 카르보레인의 카르복실기의 활성 및 운반체에 아민의 농축에 의해 수행될 수 있다. 다음, 중간체 컨쥬게이트는 RS7 항체에 접합된다. RS7 항체컨쥬게이트 처리 후, 붕소 가수분해는 열적 중성자 방사에 의해 활성화되고, 고 독성, 단범위 효과를 생산하는 α-방출에 의해 붕괴하는 방사능 원소로 전환된다.
게다가, 본 발명은 물질에서 암을 진단하는 방법을 포함한다. 진단은 진단 컨쥬게이트의 효과적인 함량을 투여함으로써 수행될 수 있으며, 약학적으로 적절한 부형제를 부가하고 상기 라벨을 검출할 수 있다. 방사능 및 비방사능 제제는 진단제로써 사용될 수 있다. 예를들어, 비-방사능 진단제는 자기공명 영상, 단층촬영영상, 또는 초음파에 적절한 조영제이다. 예를들어, 본 발명의 항체와 사용될 경우, 자기영상 제제는 2-벤질-DTPA 및 이의 모노메틸 및 시클로헥실 유사체를 포함하는 금속-킬레이트 조합과 복합체화된 망간, 철 및 가돌리늄(Gadolinium) 등과 같은 비-방사능 금속을 포함한다. 전체적으로 예가 되는 미국출원 제 09/921,290을 보라.
따라서, 목적물에서 악성종양을 진단하는 방법은 (ⅰ) 자체 항-EGP-1 MAb 또는 이의 단편, 또는 자체 항체 융합단백질 또는 이의 단편으로 이루어진 조성으로 시편에 시험관 진단분석을 수행하는 단계으로 이루어진다. 예를들면, 시험관에서 RT-PCR 및 면역분석 진단방법은 유용한 진단/관측법으로써 조직, 혈액 및 기타 체내유액에서 EGP-1의 미세량의 존재를 검출하는데 사용될 수 있다. 면역조직화학은 세포 또는 조직에서 EGP-1의 존재를 검출하는데 사용될 수 있다. 바람직하게는, 진단되는 악성종양은 암이다. 보다 바람직하게는, 암은 폐, 전립선, 난소, 유방, 결장 및 방광으로 이루어진 군에서 선택된다.
선택적으로, DTPA, DOTA, TETA, 또는 NOTA, 또는 적절한 펩티드와 같은 킬레이트는 형광분자와 같은 검출 라벨 또는 중금속 또는 방사선핵종과 같은 세포독성제제에 접합될 수 있다. 예를들면, 치료적으로 유용한 이뮤노컨쥬게이트는 항체융 합단백질에 광활성제제 또는 염료를 접합함으로써 얻을 수 있다. 형광색소와 같은 형광조성 및 다른 색원체(chromogen), 또는 가시광선에 민감한 포르피린과 같은 염료들은 관측에 사용되어 왔으며, 병변에 적절한 빛을 도입함으로써 병변을 처리하는데 사용되어 왔다. 치료에서, 이는 광방사, 광치료, 또는 광활성치료법(photodynamic therapy)로 지칭되어 왔다(Jori etal. (eds. ), PHOTODYNAMIC THERAPY OF TUMORS AND OTHER DISEASES (Libreria Progetto 1985); van den Bergh, Chem. Britain 22: 430 (1986) ). 게다가, 단클론 항체들은 광치료를 수행하는데 광활성 염색과 결합되어 왔다. Mewet al., J. Immunol. 130 : 1473 (1983);idem., CancerRes. 45 :4380 (1985);Oseroff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 : 8744 (1986);idem., Photochem.Photobiol. 46 : 83 (1987); Hasan et al., Prog. Clin.BioL Res. 288 : 471 (1989); Tatsuta etal., LasersSurg. Med. 9 : 422 (1989); Pelegrin et al., Cancer 67 : 2529 (1991). 그러나, 상기의 종래 연구들은 내시경수술 적용의 사용, 특히 항체 단편 또는 서브단편을 사용하는 것을 포함하지 않았다. 따라서, 본 발명은 광활성제제 또는 염료로 이루어진 이뮤노컨쥬게이트의 치료적 용도를 고안한다.
MRI 조영제, 상자성 이온 및 초음파 증가제와 같은 조영제를 본 발명에서 고안한다. 예를들면, 본 발명에서 가돌리늄 이온, 란타늄 이온, 망간 이온 또는 기타 유사라벨, CT 조영제, 및 초음파 조영제가 사용에 적절하다. 바람직한 실시형태에서, 초음파 증가제는 인간화된 RS7 IgG 또는 이의 단편으로 이루어진 리포좀이다. 또한, 바람직하게는 리포좀이 가스충전된다.
치료목적에서 본 발명의 RS7항체 및 이의단편들은 치료적으로 효과적인 양으로 환자에게 투여된다. 투여 함량이 생리학적으로 중요하다면 항체는 "치료적으로 효과적인 함량"에서 처리된다고 한다. 이의 존재가 수령환자의 생리학에서 관측별화를 초래한다면, 제제는 생리학적으로 중요하다.
시험관 진단
본 발명은 RS7항체의 존재하에서 시험관 생물학 시료를 스크린하기 위해, RS7 및 hRS7 항체 및 이의 단편을 포함하여 RS7 항체를 사용하는 것을 고안한다. 상기 면역분석에서, RS7 항체는 하기에서 기재하는 바와 같이 액상에서 사용되거나 고상 운반체에 결합되어 사용될 수 있다. 또한, 전체적으로 예로 되는 Stein et aL (1993), supra, 및 Stein et al., CancerRes. 49 : 32 (1989)을 보라.
생물학적 시료가 RS7 항체를 함유하는지를 결정하는 스크린 방법 중 한 예는 방사성면역분석(RIA)이다. 예를들어, RIA의 한 형태에서 시험의 물질을 방사선라벨화된 RS7 항원의 존재하에서 RS7 항원 MAb와 혼합한다. 상기 방법에서 시험 물질의 농도는 MAb에 결합된 라벨화된 RS7 항원의 함량에 따라 반비례할 것이며, 자유 라벨화된 RS7 항원의 함량에 직접적으로 관련될 것이다. 다른 적절한 스크린 방법은 당업자들에게 명백할 것이다.
선택적으로, 시험관 분석은 RS7 항원결합 단백질이 고상 운반체에 결합되는 동안 수행될 수 있다. 예를들어, MAb는 폴리머-코티드(coated) 비드, 플레이트 또는 튜브와 같은 비용해성 지지체에 MAb를 결합하기 위해 아미노덱스트란과 같은 폴리머에 부착할 수 있다.
기타 적절한 시험관 분석은 당업계의 당업자들에게 명백할 것이다. 기타 조건과 마찬가지로 관측가능한 라벨화된 RS7 항원결합 단백질 및 RS7항원의 특이 농도, 배양농도 및 배양시간은 시료에서 RS7 항원의 농도, 시료특성 등의 다양한 인자에 따라 변화할 수 있다. RS7 항원결합 단백질의 결합활성은 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다. 당업자들은 일상적인 실험을 도입하여 각 결정에서 효과적이고 최적의 분석조건을 결정할 것이다.
세척, 교반, 흔듬, 여과 등의 기타 과정들은 특정상황에서 관습적으로 또는 필요에 따라 분석에 첨가될 수 있다.
생물학 시료에서 RS7 항원의 존재는 효소결합 면역흡착분석법(ELISA)을 사용하여 결정될 수 있다. 직접적인 경합 ELISA에서, 깨끗하거나 준 순수한 항원 제조는 시험화된 유액 또는 세포성 추출액에서 불용해되는 고체 지지체에 달려 있으며, 검출가능한 라벨화된 용해성 항체의 양은 고상 항원 및 라벨화된 항체사이에서 형성되는 두 복합체의 검출 및/또는 정량을 수행하는데 부가된다.
반대로, "two-site ELISA" 또는 "sandwich assay"으로 알려져 있는 이중결정 ELISA는 소량 항원이 요구되고, 분석은 항원의 과도한 정제를 요구하지 않는다. 따라서, 이중결정(double-determinant) ELISA는 임상학적 시료에서 항원의 관측에 직접적인 경합 ELISA에 바람직하다. 예를들어, 생검시편에서 c-myc 발암 단백(oncoprotein)의 정량에 이중결정 ELISA의 사용을 보라. Fieldet al., Oncogene 4.-1463 (1989); Spandidos etal.,AntiCancer Res. 9. 821 (1989).
이중결정 ELISA에서, 비라벨화된 MAb 또는 항체단편("포착항체"(capture antibody))는 고체 지지체에 결합되고, 시험 시료는 포착항체에 접촉되고, 측정가능한 라벨화된 용해성 항체(또는 항체단편)의 양은 항체, 항원 및 라벨화된 항체사이에 형성된 3급 복합체의 검출 및/또는 정량이 가능하도록 부가된다. 항체 단편은 F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab 등과 같은 항체의 부분이다. 본 문맥에서 항체 단편은 RS7항원의 에피토프에 결합하는 RS7 MAb의 부분이다. 또한, "항체단편" 용어는 복합체를 형성하는 특이 항원에 결합함으써 항체와 같이 행동하는 합성적 또는 유전적 단백질을 포함한다. 예를들면, 항체 단편은 경쇄 가변부위로 이루어진 분리된 단편, 중쇄 및 경쇄 가변부위로 이루어진 Fv 단편, 및 경쇄 및 중쇄 가변부분이 펩티드 링커에 의해 결합되는 재조합 단쇄 폴리펩티드 분자를 포함한다. 항체융합단백질은 실질적으로 적어도 2개 이상의 단특이성 항체 또는 항체단편으로 이루어진 다특이성 항체조성이며, 적어도 2개이상의 항체 또는 항체단편은 RS7 항원의 다른 에피토프에 결합한다. 또한, RS7 융합단백질은 진단성 또는 치료성 제제와 항체융합단백질의 컨쥬게이트를 포함한다. 용어 RS7 항체는 인간화, 키메라, 인간 및 쥐과 항체, 이의 항체단편, 이뮤노컨쥬게이트 및 이의 단편, 및 항체 융합단백질 및 이의 단편을 포함한다.
이중결정 ELISA의 수행방법은 공지된 것이다. 예를들어, Field etal., supra, Spandidos etal., supra, and Moore etal.,"Twin-Site ELISAsfor fos and myc Oncoproteins Using the AMPAK System, "in METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, VOL. 10, pages 273-281 (The Humana Press, Inc. 1992)을 보라. 구체적인 예를들면 이중결정 ELISA을 사용한 RS7 항원의 관측방법에서 생검시료의 미세한 잘게썬 조직을 감압동결하고, 500㎕용액 당 10~20㎎ 조직농도(습시료 중량)에서 1% nonidet-p40(NP40), 0.6㎕/㎖ aprotinin, 0.2mM 페닐메틸 설포닐 플로라이드(phenyl methyl sulphonyl fluoride), 0.1㎍/㎖ 류펩틴(leupeptin) 및 1 mM EDTA을 함유하는 라이시스 완충용액(100mM NaCl, 50mM Tris-HCl, pH 7.4)에 재현탁하였다. 현탁액을 얼음에 60분동안 배양한 다음, 대략 6~10초간으로 초음파처리하였다. 불용성 물질은 원심분리로 제거한다.
용해성 추출물을 포착 항체로써 흡수된 RS7 항원 MAb를 함유하는 구멍판에 부가한다. 포착된 RS7 항원은 알카라인 포스페이타제와 결합된 두번째 RS7 항원 MAb에 의해 인지된다. 추출물에 RS7의 양에 비례적인 결합된 포스파타아제의 함량은 p-니트로페닐포스페이트와 같은 색원체 기질을 사용하여 색적으로 측정된다.
선택적으로, RS7 항원의 이중결정 ELISA은 horse radish peroxidase를 사용하여 시행할 수 있다. 시료제조 및 이중결정 ELISA의 기타 변형은 일반적인 실험으로 당업계에서 공지된 것이다.
이중결정 ELISA에서 용해성 항체 또는 이의 단편은 포착항체에 의해 인지되는 에피토프와 구별되는 RS7 에피토프와 결합해야만 한다. 예를들어, 용해성 항체는 RS7 MAb일 수 있으며, 포착항체는 MR23일 수 있다. 선택적으로, 용해성 항체는 MR23일 수 있고, 포착항체는 RS7 MAb일 수 있다.
이중결정 ELISA은 생검시료에서 RS7항원이 존재하는지를 확인하는데 시행될 수 있다. 선택적으로, 분석은 체액의 임상학적 시료에서 존재하는 RS7 항원의 함량을 정량하는데 사용될 수 있다. 정량분석은 정제된 RS7 항원의 희석액을 함유함으로써 시행될 수 있다. RS7 항원의 정제 방법은 하기에 설명한다.
또한, 본 발명의 RS7 MAbs 및 이의 단편은 분석키트의 제조에 적합하다. 상기 키트는 바이알, 튜브 등의 하나이상의 담체수단에서 각 담체는 면역분석의 구별된 원소로 이루어진 것에서 받음으로써 구별되는 담체수단으로 이루어질 수 있다.
예를들어, 고상 지지체에 면역화된 포착 항체를 함유하는 담체수단, 및 용액에 측정가능한 라벨화된 항체를 함유하는 담체수단일 수 있다. 게다가, 담체수단은 RS7 항원의 연속 희석액으로 이루어진 표준용액을 함유할 수 있다. RS7 항원의 표준용액은 가로에 RS7 항원농도 및 세로에 검출신호로된 표준곡선을 제조하는데 사용될 수 있다. RS7 항원을 함유하는 시로료부터 얻어진 결과는 생물학적 시료에서 RS7 항원농도가 되느 점이 삽입될 수 있다.
또한, 본 발명의 RS7 항체 및 이의 단편은 조직학적 시료로부터 제조된 조직시편에서 RS7 항원의 존재를 검출하는데 사용될 수 있다. 검출자체는 검사조직에서 RS7 항원의 존재를 결정하고, RS7 항원의 분포를 결정하는데 사용될 수 있다. 검출자체는 조직시편을 냉각하기 위해 측정가능하게 라벨화된 RS7 항원 결합단백질을 적용함으로써 수행될 수 있다. 연구는 RS7 항원이 파라핀-엠비디드(embedded) 시편에서 보존되지 않음을 나타낸다. Stein etal. (1993), supra. 검출자체의 일반적인 기술은 당업가에게 공지된 것이다. 예를들어, Ponder, "Cell Marking Techniques and Their Application, "in MAMMALIAN DEVELOPMENT: A PRACTICAL APPROACH 113-38 Monk (ed. ) (IRL Press 1987), and Coligan at pages 5.8. 1-5.8. 8. Also, see Stein et al. (1989), supra, and Stein et al. (1993), supra.
RS7 항체 및 이의 단편은 방사선동위원소, 효소, 형광라벨, 화학발광 라벨, 생물발광 라벨 또는 상자성 라벨과 같은 적절한 검출제제로 측정가능하게 라벨화할 수 있다. 검출가능하게 라벨화된 RS7 항원결합 단백질을 만들고 검출하는 방법은 당업계에 공지된 기술이고, 하기에서 보다 설명한다.
표식 부분은 감마카운터 또는 섬광(scintillation) 카운터의 사용과 같은 수단 또는 오토라이오그래피(autoradiography)에 의해 검출된다. 바람직한 실시형태에서, 진단성 컨쥬게이트는 감마, 베타 또는 양성자 방출 동위원소이다. 본 발명에서 표식부분은 미리결정된 조건하에서 신호를 생성하는 분자를 언급한다. 표식부분의 예로는 방사선동위원소, 효소, 형과라벨, 화학발광 라벨, 생물발광 라벨 및 상자성 라벨을 포함한다. 여기에서 사용된 것과 같이, 진단성 또는 치료성 제제는 진단 및 치료용으로 유용한 컨쥬게이트를 생산하는 항체부분에 접합된 분자 또는 원자이다. 진단성 또는 치료성 제제의 예는 약물, 독소, 킬레이터, 염료, 염색체, 붕소화합물 및 표식 부분을 포함한다. 본 발명의 목적에 특히 바람직한 동위원소는 3H, 131I , 31S, 14C이고, 바람직하게는 125I이다. 다른 방사성핵종의 예는 90Y, 111In, 99mTc, 186Re, 188Re, 177Lu, 67Cu, 212 Bi, 213Bi, 및 211At이다. 또한, 부가적인 방사선핵종은 진단성 및 치료성 제제로 사용된다. 적절한 진단성 영상 동위원소는 일반적으로 25~4000keV범위이며, 적절한 치료성 방사선핵종은 60~700keV범위이다.
또한, 본 발명의 RS7 항체 및 단편은 형광화합물로 라벨화될 수 있다. 형광적으로 라벨화된 MAb의 존재는 적절한 빛 파장에 RS7 항원결합 단백질을 노출시키고, 결과 형광을 검출함으로써 결정된다. 형광 라베링 화합물은 플루오르세인(fluorescein) 이소시아네이트, 로다민(rhodamine), 파이코에리테린(phycoerytherin), 파이코시아닌(phycocyanin), 알로파이코시아닌(allophycocyanin), o-프탈데하이드 및 플루오르스카민(fluorescamine)을 포함한다. 형광적으로 라벨화된 RS7 항원 결합단백질은 특히 유세포검사 분석(flow cytometry analysis)에 유용하다.
선택적으로, RS7 항체 및 이의 단편은 화학발광 화합물에 RS7 항원결합 단백질을 연결함으로써 측정가능하게 라벨화될 수 있다. 화학발광태그 MAb의 존재는 화학반응의 과정동안 나타나는 발광의 존재를 관측함으로써 결정된다. 화학발광 라벨링 화합물의 예는 루미놀, 이소루미놀, 방향족 아크리디늄(acridinium) 에스테르, 이미다졸, 아크리디늄 염 및 옥살레이트 에스테르를 포함한다.
유사하게, 생물발광 화합물은 본 발명의 RS7 항체 및 이의 단편을 라벨화하는데 사용될 수 있다. 생물발광은 촉매 단백질이 화학발광 반응의 효율성을 증가시키는 생물적 시스템에서 발견되는 화학발광의 형태이다. 라벨링에 유용한 생물발광 화합물은 루시페린, 루시페라제(luciferase) 및 에쿼린(aequorin)을 포함한다.
선택적으로, RS7 항체 및 이의 단편은 효소에 RS7 항체를 연결함으로써 측정가능하게 라벨화될 수 있다. RS7 항체-효소 컨쥬게이트가 적절한 기질의 존재에서 배양될 경우, 효소부분은 분광학적, 형광적 또는 시각적 수단에 의해 관측될 수 있 는 화학부분을 생산하는 기질과 반응한다. RS7 항체를 검출가능도록 라벨화 하는데 사용될 수 있는 효소의 예는 말산 탈수소효소(malate dehydrogenase), 포도상구균 핵산(staphylococcal nuclease), 델타-V-스테로이드 이성질화효소(delta-V-steroid isomerase), 효모알콜 탈수소효소(yeast alcohol dehydrogenase), α-글리세로포스페이트 탈수소효소(glycerophosphate dehydrogenase), 트리오제 포스페이트 이성질화효소(triose phosphate isomerase), horseradish peroxidase, 알카린 포스페이트(alkaline phosphatase), 아스파라기나아제(asparaginase), 글루코스산화효소(glucose oxidase), β-갈락토시다아제(galactosidase), 리보뉴클레아제(ribonuclease), 우레아제(urease), 카탈라아제(catalase), 글르코스-6-포스페이트 탈수소효소(phosphate dehydrogenase), 글루코아밀라아제(glucoamylase) 및 아세틸클로린에스테라아제(acetylcholinesterase)을 포함한다.
또한, RS7 항체, 융합단백질 및 이의 단편은 생체내 진단의 목적을 위해 상자성 이온으로 라벨화될 수 있다. 특히, 자기공명 영상에 유용한 조영제는 Gd, Mn, Dy 또는 Fe 이온으로 이루어진다. 또한, RS7 항체 및 이의 단편은 초음파 조영제/증가제에 접합될 수 있다. 예를들어, 초음파조영제는 인간화된 RS7 IgG 또는 이의 단편으로 이루어진 리포좀이다. 또한, 바람직하게 초음파 조영제는 가스 충전된 리포좀이다.
관련된 혈관에서 이특이성 항체는 조영제에 접합될 수 있다. 예를들어, 이특이성 항체는 초음파영상에 사용되는 하나이상의 영상 증가제로 이루어진다. 바람직한 실시형태에서, 조영제는 리포좀이다. 바람직하게, 리포좀은 리포좀의 외 표면에 공유적으로 부착된 이가 DTPA-펩티드로 이루어진다. 더 바람직하게는, 리포좀은 가스 충전된다.
본 발명에서 도입될 수 있는 기타 적절한 라벨은 당업자에게 공지된 것이다. RS7항체에 표식 부분의 결합은 공지된 표준기술을 사용하여 시행될 수 있다. 전형적인 방법론은 Kennedyetal., Clin. Chim. Acta 70: 1 (1976), Schursetal., Clin. Chim. Acta 81 : 1 (1977), Shih etal., Int'l J. Cancer 46: 1101 (1990),Stein et al. (1990), supra, and Stein etal. (1993), supra. Also, see generally, Coligan에 기재된다.
전기의 시험관 및 자체 검출방법은 진단 또는 병리학적 조건의 스테이징을 도와주는데 사용될 수 있다. 예를들어, 상기 방법은 폐, 유방, 방광, 난소, 자궁, 위 및 전립선의 종양을 포함한 RS7 항원을 발현하는 종양을 검출하는데 사용될 수 있다.
생체내 진단
또한, 본 발명은 생체내 진단에 RS7 항체의 사용을 고안한다. 방사선라벨화된 MAb와 진단영상의 방법은 공지된 것이다. 예를들어, 항체는 감마 방출 방사성동위원소로 라벨화되고 환자에 도입된다. 감마 카메라는 감마-방출 방사성동위원소의 위치 및 분포를 검출하는데 사용된다. 예를들어, Srivastava (ed. ), RADIOLABELED MONOCLONAL ANTIBODIES FOR IMAGING AND THERAPY (Plenum Press 1988), Chase, "Medical Applications of Radioisotopes," in REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES,18th Edition, Gennaro etal. (eds. ), pp. 624-652 (Mack Publishing Co. , 1990), and Brown, "Clinical Use of Monoclonal Antibodies, "in BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY 227-49, Pezzuto etal. (eds. ) (Chapman & Hall 1993).을 보라.
진단성 영상에서 방사성동위원소는 매개 기능기를 사용하여 RS7 항체에 직접적 또는 간접적으로 결합될 수 있다. 유용한 매개 기능기는 에틸렌디아민테트라아세트산 및 디에틸렌트리아민펜타아세트산과 같은 킬레이터를 포함한다. 예를들어, Shih etal., supra, and U. S. patent No. 5, 057, 313을 보라.
환자에 전달되는 방사성 약물은 최소 반감기, 체내에서 최소 머무름, 검출 및 정확한 측정을 하는 동위원소의 최소정량의 최상 조합으로 동위원소의 선택을 통해 가능한 낮은 수준에서 유지된다. RS7 항체에 결할될 수 있고 진단성 영상에 적절한 방사성동위원소의 예는 99mTc 및 111In이다.
약학적으로 적절한 부형제
치료적용에서 RS7 항체의 반응존속을 조절하는데 부가적 약학적 방법이 도입될 수 있다. 조절방출 조제는 RS7 항체를 복합화하거나 흡수하는 고분자의 사용으로 제조될 수 있다. 예를들어, 생체 적합성 고분자(biocompatible polymer)는 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트)의 매트릭스 및 스테아르산 이합체 및 세바식산(Sebacic Acid)의 폴리안하이드라이드(polyanhydride) 공중합체의 매트릭스를 포함 한다. Sherwood et al., BiolTechnology 10: 1446 (1992). 상기 매트릭스로부터 RS7 항체의 방출속도는 RS7 항체의 분자량, 매트릭스내 RS7 항체의 함량 및 분산입자의 크기에 의존한다. Saltzman et al., Biophys. J. 55: 163(1989) ; Sherwood etal., supra. 기타 고체약물들은 REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES,18th ed. (1990)에 기재된다.
물질에 전달되는 인간화된, 키메라 및 인간 RS7은 항체 단독, 이뮤노컨쥬게이트, 융합단백질로 이루어질 수 있거나, 하나 이상의 부가적인 성분 또는 이들의 조합으로 이루어질 수 있다.
본 발명의 이뮤노컨쥬게이트, 항체 자체, 융합단백질 및 이의 단편은 약학적으로 유용한 조성을 제조하는 공지된 방법으로 형성될 수 있으며, 이뮤노컨쥬게이트 또는 항체 자체는 약학적으로 적절한 부형제와 혼합하여 조합된다. 무균 포스페이트-완충용액 살린은 약학적으로 적절한 부형제의 한 예이다. 기타 적절한 부형제는 당업계에 공지된 것이다. 예를들어, Ansel etal., PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS,5th Edition (Lea & Febiger 1990), and Gennaro (ed. ), REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th Edition (Mack Publishing Company 1990), 및 이의 교정본을 보라.
본 발명의 이뮤노컨쥬게이트 또는 항체 자체는 순간주사(Bolus Injection) 및 연속 주입으로 정맥 투여에 할 수 있다. 주입 형성은 부가된 부형제와 엠플 또는 다약물 담체에서 단위 약물형태로 나타날 수 있다. 조성은 오일 도는 수용성 약물에서 현탁액, 용액 또는 에멀젼 등의 형태로 취급될 수 있으며, 현탁, 안정화 및/또는 분산제제와 같은 formulatory 제제를 함유한다. 선택적으로, 활성성분은 사용전에 무균 발열성 없는 물(sterile pyrogen-free water)와 같은 적절한 매개와 분말형태에 있을 수 있다.
부가적인 약학적 방법은 진단성 또는 치료성 컨쥬게이트 또는 항체 자체의 활동존속을 조절하는데 도입될 수 있다. 조절 방출조제는 이뮤노컨쥬게이트 또는 항체 자체를 복합화하거나 흡수하는 고분자의 사용으로 제조될 수 있다. 예를들어, 생체 적합성 고분자(biocompatible polymer)는 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트)의 매트릭스 및 스테아르산 및 세바식 산(Sebacic Acid)의 폴리안하이드라이드(polyanhydride) 공중합체의 매트릭스를 포함한다. Sherwood et al., BiolTechnology 10: 1446 (1992). 상기 매트릭스로부터 RS7 항체의 방출속도는 RS7 항체의 분자량, 매트릭스내 RS7 항체의 함량 및 분산입자의 크기에 의존한다. Saltzman et al., Biophys. J. 55: 163(1989) ; Sherwood etal., supra. 기타 고형 약물형태는 PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS,5th Edition (Lea & Febiger 1990), and Gennaro (ed. ), REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES,18th Edition (Mack Publishing Company 1990), 및 이의 교정본에 기재된다.
이뮤노컨쥬게이트, 항체융합단백질, 항체 자체 및 이의 단편은 포유류에 피하적으로 또는 기타 비경구적 방법으로 처리할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 항-EGP-1 항체 또는 이의 단편은 약물당 10~2000㎎의 투약으로 처리된다. 게다가, 투여는 연속 주입 또는 단 또는 다 순간주사로 될 수 있다. 일반적으로, 인간에 투여된 이뮤노컨쥬게이트, 융합단백질 또는 항체 자체는 환자의 나이, 몸무게, 신장, 성, 일반적인 의학조건, 및 전기의 의학기록과 같은 인자에 따라 변화될 것이다. 전형적으로, 저 또는 고 투여가 환경적 지시로써 처리되지만, 단 순가주입으로 약 1㎎/㎏~20㎎/㎏의 범위에서 이뮤노컨쥬게이트, 항체융합단백질, 또는 항체 자체의 투여로 수령을 제공하는 것이 바람직하다. 상기 투여는 예를들어 4~10주에 한번, 바람직하게는 8주에 한번, 더 바람직하게는 4주에 한번으로 필요에 따라 반복될 수 있다. 또한, 여러 달 동안 격주와 같이 덜 빈번하게 주입될 수 있다. 투여는 약물 및 스케줄의 적절한 조절로 다양한 비경구적 방법으로 주어질 수 있다.
본 발명의 RS7 항체는 약학적으로 유용한 조성을 제조하는 공지의 방법에 따라 형성될 수 있으며, RS7 항체는 약학적으로 수용가능한 담체와 혼합물에 조합된다. 처리가 수령 환자에 의해 참을 수 있다면, 조성은 약학적으로 수용가능한 담체가 된다. 무균 포스페이트-완충 살린(Sterile phosphate-buffered saline)은 약학적으로 수용가능한 담체의 한 예이다. 기타 적절한 담체는 당업계에서 공지된 것이다. 예를들어, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES,18th Ed. (1990)을 보라.
치료의 목적으로 이뮤노컨쥬게이트, 융합단백질 또는 항체자체는 치료적으로 효과적인 함량에서 포유류에 처리된다. 본 발명에서 적절한 대상은 비인간 동물 대상 또한 고안되지만, 일상적으로 인간이다. 항체 제조는 처리된 함량이 생리학적으로 중요하다면, "치료적으로 효과적인 함량"에서 처리된다. 제제는 수령 포유류의 생리학에서 검출가능한 변화를 초래한다면, 생리학적으로 중요하다. 본 발명의 조성 및 과정을 만드는 다양한 변화 및 변형은 당업계에서 명백한 것이다. 따라서, 본 발명은 부가되는 청구범위내에서 상기 변화 및 변형을 포함하는 것이다.
전기의 모든 공개자료, 특허 및 특허출원들의 공개는 각각 예로 개별적으로 배합되었다면, 동일범주에서 전체가 예로 명백하게 배합된다.
하기의 실시예는 본 발명의 실시형태를 설명하는 것이며, 청구범위를 제한하는 것으로 사용되어서는 안된다.
실시예 1. 키메라 RS7 항체의 설계
RSVk 및 VH 유전자의 분자 클로닝
전체 세포질 RNA 및 mRNA는 RS7 생산 하이브리도마 세포로부터 제조되었다. 유전자 인코딩 Vk 및 VH 서열은 RT-PCR 및 5'-RACE에 의해 클론화되었으며, 서열은 DNA 서열에 의해 결정되었다. 다중 독립적 클론은 PCR 반응으로부터 초래하는 가능한 에러를 제거하도록 서열화하였다. 서열분석은 2개의 Vk(#1 및 #23) 및 하나 VH(RS7VH) 전사의 존재를 나타내었다. 인간 불변 부위 도메인을 함유하는 2개의 키메라 Abs(cAbs)인 Vk와 추정 쥐과 Vk의 각 조합이 생성되었으며, 전사에 의해 Sp2/0에서 발현되었다. cAb-생산 클론은 ELISA에 의해 이입된 세포 클론의 세포배양 상층액을 스크린함으로써 동정하였다. 양성 클론은 증대하였으며, cAb는 세포배양 상층액으로부터 정제하였다. Ag-결합 분석은 단지 Vk#23 및 VH, cAb-VK#23로 이루어진 cAb가 인간 편평상피암종(cervical carcinoma) 세포(ATCC Rockville, MD)인 ME180의 천연박막 분획으로 덮힌 구멍판에 결합되어 있음을 나타낸다(도1). Vk#1 및 VH, cAb-Vk#1의 조합으로 cAb는 Ag-덮힌 웰에 결합됨을 나타내지 않았다. 따라서, 면역반응성 cAb(Vk#23)은 cRS7로 제작되었다. 최종 PCR 생산체로서 클론화된 쥐 VH 및 기능적 Vk(#23) 서열은 각각 RS7Vk(도 2A) 및 RS7VH(도 2B)로 제작되었다.
RS7 Abs의 결합활성 분석
경합 ELISA 결합분석은 변형된 cRS7의 결합친화력을 평가하는데 사용되었다. 간략하게, 바이오티닐레이트화한(biotinylated) 쥐 RS7의 일정량을 Abs(RS7 또는 cRS7) 시험의 농도변화(0.01~100㎍/㎖)로 혼합하고, Ag-덮힌 구멍판에 부가하고, 상온에서 1시간동안 배양하였다. 세척후, 스트렙타비딘(streptavidin) 접합된 HRP을 부가하고 1시간동안 상온에서 배양하였다. Ag-결합 바이오티닐레이트화한 RS7에 결합된 스트렙타비딘 접합된 HRP 양은 4mM 오르소-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드 및 0.04% H2O2를 함유하는 기질 용액의 부가 후, OD490을 판독함으로써 나타내었다. 경합 Ag-덮힌 분석의 상기 형태에 의해 cRS7 및 쥐 RS7는 항원 덮힘 웰에 바이오티닐레이트화한 쥐 RS7의 결합에 동등하게 경쟁하였으며, 이는 얻어진 Vk 및 VH의 확실성을 확인하였다(도 1).
실시에 2. hRS7 항체 설계 방법
hRS7 V 유전자의 서열 제작
Kabat 데이터베이스에서 인간 Vk 및 VH서열을 조사함으로써, RS7 Vk 및 VH의 FR을 각각 인간 SA-lA'cl Vk 및 RF-TS3 VH에 높은 정도의 서열 호몰로지(homology)를 나타냄을 발견하였다. 예외 하나는 RS7VH의 FR4이고, NEWM VH의 것과 가장 놓은 서열 호몰로지를 나타내었다. 따라서, 인간 SA-lA'cl 골격서열은 RS7Vk의 CDR을 혼성하는 골격으로 사용되었으며(도 3A), RF-TS3 및 NEWM 골격서열의 조합은 RS7VH에 사용되었다(도 4). 인간항체골격의 시작과 비유할 경우, CDR 부위의 각 사슬 박에서 수많은 아미노산 변화가 있다. 추정 CDR 과 측면에 있는 쥐 FRs많은 아미노산 잔기는 Qu, Z. , Losman, M. J. , Eliassen, K. C. , Hansen, H. J. , Goldenberg, D. M. , and Leung, S. O. (1999) Humanizationof Immu31, an alpha-fetoprotein-specific antibody. Clin. Cancer Res. 5,3095s-3100s 에서 설립된 틀을 기초로 재형상화된 hRS7 Fv에서 유지되었다. 상기 잔기는 RS7Vk의 S20, D60, V85, 및 A100, 및 RS7VH 의 K38, K46, A78, 및 F91이다 (Figure 3A 및 3B).
hRS7 V 서열의 설계
Leung et al. Leung, S. O. , Shevitz, J. , Pellegrini, M. C. , Dion, A. S. , Shih, L. B., Goldenberg, D. M. , and Hansen, H. J. (1994) Chimerization of LL2, a rapidly internalizing antibody specific for B cell lymphoma. Hybridoma, 13: 469-476)에 기재된 바와 같은 변형 방법을 도 4에서 설명한 바와 같이 올리고뉴클레오타이드 합성 및 PCR의 조합을 사용하여 hRS7의 제작된 VL 및 VH 유전자를 설계하는데 사용하였다. hRS7 VH 도메인의 설계에서 2개의 긴 올리고 뉴클레오타이드, hRS7VHA (176-mer) 및 hRS7VHB (168-mer)은 자동화된 DNA 합성기(Applied Biosystem)에서 합성되었다.
hRS7VHA는 hRS7VHA 도메인의 nt 23~198을 나타낸다.
Figure 112004039686000-pct00001
hRS7VHB는 상보적인 nt 174~340의 hRS7VH 도메인의 마이너스 가닥을 나타낸다.
Figure 112004039686000-pct00002
hRS7VHA 및 B의 3'-말단 서열(23 nt 잔기)은 서로 상보적이다. 아래 정의된 PCR 조건하에서, hRS7VHA 및 B의 3'-말단은 긴 올리고뉴클레오타이드의 나머지로 측면으로 접합된 짧은 이중 가닥 DNA를 형성하도록 어닐링되었다. 각 어닐링된 말단은 단사 DNA의 전사에 프라이머로 제공되고, hRS7VH의 nt 23~340으로 이루어진 이중 가닥 DNA를 초래한다. 상기 DNA는 2개의 짧은 올리고뉴클레오타이트, hRS7VHBACK 및 hRS7VHFOR의 존재하에서 전체 길이 hRS7VH를 형성하도록 증대화되었다.
hRS7VHBACK 5'-GTGGTGCTGC AGCAATCTGG GTCTGAGTTG
AAGAAGCC-3'
hRS7VHFOR 5'-TGAGGAGACG GTGACCAGGG ACCCTTGGCC
CCAGACAT-3'
hRS7VHA 및 B의 최소량(경험적으로 결정됨)은 lOx PCR 완충용액 (500mM KCl, 100mM Tris.HCl 완충용액, pH 8.3, 15mM MgCl2) 10㎕, 2μ㏖ hRS7VHBACK 및 hRS7VHFOR, 및 2.5단위 Taq DNA 폴리머라아제(Perkin Elmer Cetus, Norwalk, Ct)의 존재하에서 증대되었다. 상기 반응혼합물은 94℃에서 1분동안 변성, 45℃에서 1분동안 어닐링 및 72℃에서 1.5분동안 중합으로 이루어진 PCR 반응의 3 순환을 적용하였다. hRS7VH의 이중가닥-PCR 증대된 생산물을 젤-정제, PstI 및 BstEII로 제한-소화, 및 중쇄 스테징 벡터, VHpBS2의 상보적 PstI/BstEII으로 클론하였다.
인간화된 Vk 서열의 전체 길이 DNA설계하는데, 전기에서 설명한 바와 같이 hRS7VKA (156-mer) 및 hRS7VKB (155-mer)이 합성되었다. hRS7VKA 및 B는 2개의 짧은 올리고뉴클레오타이드 hRS7VKBACK 및 hRS7VKFOR에 의해 증대되었다.
HRS7VKA는 hRS7Vk 도메인의 nt 20~175를 나타낸다.
5'-CTCCATCCTC CCTGTCTGCA TCTGTAGGAG ACAGAGTCAG CATCACCTGC
AAGGCCAGTC AGGATGTGAG TATTGCTGTA GCCTGGTATC AGCAGAAACC
AGGGAAAGCC CCTAAGCTCC TGATCTACTC GGCATCCTAC CGGTACACTG GAGTCC-3'
hRS7VKB는 hRS7Vk 도메인 상보적 마이너스 가닥 nt 155~320을 나타낸다.
5'-CCTTGGTCCC AGCACCGAAC GTGAGCGGAG TAATATAATG
TTGCTGACAG TAATAAACTG CAAAATCTTC AGGTTGCAGA CTGCTGATGG
TGAGAGTGAA ATCTGTCCCA GATCCACTGC CACTGAACCT ATCAGGGACT
CCAGTGTACC GGTAG-3'
hRS7VKBACK 5'-GACATTCAGC TGACCCAGTC TCCATCCTCC
CTGTCTG-3'
hRS7VKFOR 5'-ACGTTAGATC TCCACCTTGG TCCCAGCACC G-3'
hRS7VK의 겔-정제된 PCR생성물은 PvuⅡ 및 BglⅢ로 제한-소화되었으며, 경쇄 스테이징 벡터, VKpBR2의 상보성 PvuⅠ/BcⅡ자리로 클론화하였다. 최종 발현 벡터 hRS7pdHL2는 각각 pdHL2으로 hRS7VK 및 VH의 XbaI-BamHI 및 XhoI/BamHI단편을 연속적으로 서브클로닝하여 설계하였다.
hRS7 항체의 이입 및 발현
hRS7의 발현벡터의 대략 30㎍을 SalI로 분해하여 직선화(linearize)하였으며, 전기 충격법(electroporation)(450V 및 25μF)에 의해 Sp2/0-Agl4으로 이입하였다. 이입된 세포를 2일동안 96웰 플레이트에 방치하고, 다음 최종농도 0.025μM에서 배지속으로 MTX를 부가하여 약물-내성으로 선택하였다. MTX-내성 콜로니를 2~3주동안 웰에 침전시켰다. 선택에서 남은 콜로니로부터의 상청액을 ELISA 분석으로 인간 Ab 분비에 스크린하였다. 간략하게, 100㎕ 상청액을 GAH-IgG, F(ab')2 단편-특이성 Ab로 예비코트된 구멍판속으로 부가하고, 1시간동안 상온에서 배양하였다. 비결합된 단백질을 세척 완충용액(0.05% 폴리소르베이트를 함유하는 PBS)로 3회 세척하여 제거하였다. HRP-접합된 GAH-IgG, Fc 단편-특이성 Ab을 웰에 부가하였다. 다음, 1시간동안 배양하고 플레이트를 세척하였다. 결합된 HRP-접합된 Ab는 4 mM OPD 및 0.04% H202를 함유하는 기질용액의 부가 후, A490㎚판독하여 드러났다. 양성 세포 클론은 증대되었으며, hRS7 IgG는 단백질 A 컬럼의 친화성 크로마토그래피로 세포배양 상청액으로부터 정제하였다.
인간화된 RS7 항체의 결합활성
플레이트에 덮혀있는 ME180 세포박막 추출액을 사용한 ELISA 경합 결합분석을 (Stein et al. , Int. J. Cancer 55: 938-946 (1993) )에 기재된 바와 같이, hRS7의 면역반응성(immunoreactivity)을 관측하는데 사용되었다. ME180 세포박막 분획을 초음파처리 및 원심분리로 제조하였다. 천연 박막추출물을 원심분리로 96-웰 PVC 판에 덮고, 0.1% 클루타알레하이드로 고정하였다. mRS7, cRS7 또는 hRS7의 다양한 농도로 혼합된 바이오티닐레이트화한 쥐 RS7의 일정량을 덮힌 판 박막에 부가하고, 1~2시간동안 상온에서 배양하였다. 세척 후, HRP-접합된 스르렙타비딘을 부가하고 상온에서 1시간동안 배양하였다. 박막-결합 바이오티닐레이트화된 mRS7 에 결합된 HRP-접합된된 스트렙타비딘(streptavidin_의 양은 4mM OPD 및 0.04% H202을 함유하는 기질용액의 부가 후, A490㎚판독하여 드러났다. 도 6의 경합분석에서 나타낸 바와 같이, mRS7 및 cRS7의 것과 결합 활성이 비교되는 것으로 나타내는, RS7의 결합친화력을 확인하는 hRS7 IgG는 인간화에서 유지되었다.
실시예 3. 잔류라벨(residualizing label)을 사용한 인간화된 RS7의 방사성요오드화(radioiodination)
잔류 부분(IMP-R4, IMP-R5 또는 IMP-R8)을 방사성요오드화하고, (Govindan SV, et al., Bioconjugate Chem 1999;10;231~240)에 기재된 방식을 따라 이황화물-환원 hRS7에 결합하였다. 도 9을 보라. 125I을 사용한 방사성요오드 라벨링을 잔류하는 것에서, 125I-IMP-Rx-hRS7(여기서, x는 4, 5 또는 8)을 제조하기 위해, 87.1% (3.38mCi/㎎), 34.3% (0.97 mCi/㎎), 및 76.6%(2.93 mCi/㎎)의 전체 수율 및 특이활성은 각각 IMP-R4, IMP-R5 및 IMP-R8을 사용하여 얻었다. 131I-IMP-R4 전체를 사용한 131I 라벨링에서서 하기 결과를 얻었다. 131I의 20.4mCi를 사용하여 IMP-R4의 35.7n㏖, DTT-환원 hRS7의 3.22㎎, 전체수율(3.80mCi/㎎) 60%을 얻었다. 131I의 30.34 mCi를 사용한 다른 수단으로 IMP-R4 및 환원된 hRS7은 69.7%(3.88mCi/㎎) 수율을 얻었다. 131I의 13.97mCi를 사용한 3차 수단은 71.8% 배합을 나타내었다 (4.42mCi/㎎). 131I의 13.6mCi 및 비-특이성 인간화 항체, hLL2를 사용한 131I-IMP-R4라벨링은 64.4%(3.67mCi/㎎) 수율을 초래한다.
실시예 4. 유방암 동물모델에서 임상전(preclinical) 실험
종양 표적화 연구에서, 종양을 ~2.3×107 배양된 MDA-MB-468세포의 피하 주입으로 5~8주의 늙은 암컷 쥐에 번식시키고, 종양크기 0.1~0.2㎤에 될 때 한달 후 동물에 사용되었다. 쥐에 ~10μCi의 125I-[IMP-Rx]-hRS7(여기서, x = 4,5 또는 8), 및 20-25μCi의 131I-MAb(CT 방법)의 혼합물로 주입하였다. 따라서, 각 실험은 125I/131I로 결합된-라벨 실험하였다. 다양한 장기에서 생분포 및 혈액을 결정하였으며, 그램당 주입된 약물 %로 표현하였다. 125I로 131I의 후방산란 교정은 125 I 생분포를 결정하는데 하였다.
치료연구에서 다양한 형상의 종양 성장패턴은 종양의 안정성장(Steady Growth)의 최적 방법을 결정하는데 연구되었다. 표적실험에 유용한 방법은 종양성장 8주 후 최적이고, 동물의 30~50%는 종양 성장 윤곽에 기반되어 사용될 수 있다고 결론지어졌다. 치료연구에서, 131I-IMPR4-hRS7으로 주입된 종양함유 동물은 제제를 관측되고, 방사성 요오드화 물질 131I-hRS7과 비교하였다. 기준 체중을 체중 및 종양부피의 주기적으로 측정으로 비교하였다. 종양이 3㎤에 이르렀을 때 동물을 죽 였다. 모든 동물실험들은 IACUC-승인 프로토콜에 따라 수행되었다.
생체내 동물 생분포(biodistribution)
상기 실험은 NIH Swiss 누드 쥐에서 성장된 종양에서 듀얼-라벨화 hRS7 조제(125I-IMP-Rx-hRS7(여기서, x는 4, 5 또는 8), 각 제제는 라벨 131I-hRS7과 혼합하였다)를 사용하여 수행하였다. 표 1A , 1B 및 1C는 잔류 라벨을 사용하여 우세한 시행을 나타내는 생분포를 설명한다. 예를들어, 7일 종양의 그램 당 주입된 약물 %는 각각 125I-IMP-R4-hRS7, 125I-IMP-R5-hRS7 및 125I-IMP-R8-hRS7에서 41.6±3.0%, 32.2±11.6% 및 24.7±8.5%이고, 각 듀얼-라벨화된 실험에서 동일시간에 라벨화된 131I-hRS7는 5.9±0.9%, 6.2±2.1% 및 6.7±2.3%이었다. 동일시간에 종양-대-비종양은 131I-hRS7과 비유하여 125I-IMP-R4-hRS7으로 1.7-to-7.6-fold, 125I-IMP-R5-hRS7으로 1.7-to-6.0-fold 및 125I-IMP-R8-hRS7으로 2.0-to-4.8-fold 정도로 높았다.
Figure 112004039686000-pct00003
Figure 112004039686000-pct00004
Figure 112004039686000-pct00005

131I을 대신하여 125I을 사용한 생분포도를 기반으로, 약량측정(dosimetry) 산출은 Siegel, JA and Stabin, MG (Journal of Nuclear Medicine 1994; 35: 152-156)의 방법을 사용하여 수행하였다. 표 2는 잔류 및 종래 방사성요오드라벨을 비 교한 것이고, 도 10은 그래프적으로 결과를 나타낸다. 모든 잔류 제제는 종양에 전단된 약물 및 종양-대-비종양 비율의 관계로 최적으로 수행됨을 나타낸 것이며; 131I-IMP-R4-hRS7은 방사화학적 수율 및 동일제제에 얻어진 특성활성의 관점에서 치료실험에 유리하게 선택되었다.
Figure 112004039686000-pct00006
누드 쥐에서 MDA-MB-468 인간 유방종양 이종이식의 치료
최대내성용량(maximum tolerated dose;MTD) : 약량측정(dosimetry)결과(표-2, 군-1)로부터, 혈액에 1500cGy의 방사선 약물을 생산하는 131I-IMP-R4-hRS7 및 131I-hRS7의 mCi량은 각각 0.231mCi 및 0.285mCi을 산출되었다. MTD의 실험적인 결정은 Swiss 누드 쥐에서 각 제제의 증가되는 약물을 사용하여 수행하였다. 131I-IMP-R4-hRS7에서 동물의 기는 200, 225, 250, 275, 300 및 325μCi로 처리되었으 며; 250μCi 약용군에서 다섯마리 중 하나는 4주에 죽었으며, 반면, 300μCi 약용군에서 4마리 중 3마리가 2~4주사이에 죽었다. 5주에서 275 및 325μCi 약용군에서 동물생존은 기대되지 않았지만, 우리는 MTD가 처리된 약물의 231μCi(약량측정 결과로부터 산출) 및 250μCi이다고 결론지었다. 131I-hRS7('CT'-계 방사성요오드화)에서 동물군들에게 250, 280, 310, 340, 370 및 400μCi를 주입하였으며; 2~3주사이에 340μCi 약용군의 여섯동물 중 여섯, 370μCi 약용군의 여섯동물 중 셋, 및 400μCi 약용군의 여섯동물 중 넷이 죽었다. 상기의 결과에서 MTD는 280~310μCi 범위로 추정하였다.
치료연구-1
상기 첫 치료실험에서, 131I-hRS7의 것과 131I-IMPR-4-hRS7의 효율성을 비교(CT method)하기 위해, 각 제제는 최대내성용량 ~70%에서 사용되었다. 잔류제제의 175μCi의 한 약용량은 종래의 방사성요오드화제의 200μCi보다 보다 효율적인 것으로 여겨진다. 본 실험에서 비처리된 대조군을 포함하여 10 또는 11마리 동물을 군당 사용되었으며, 3개의 군 모두 종양크기를 시작분포가 매우 유사하도록 무작위로하였다. 치료전(일-2) 세개의 군에서 평균 종양부피는 0.312±0.181, 0.308± 0.203, 및 0.303±0.212이었다.
본 실험에서 49일에 중간 결과를 하기 도 11에 기재한다. 도 11에서 위 패널은 각 군의 개별 동물에서 종양부피(㎤)을 나타내고, 및 바닥 패널은 2개 형에서 평균 종양부피를 나타낸다. 비처리군에서 셋이 죽었다. 종양성장 인자는 49일 까지 평균종양부피(MTV)의 면적하 곡선(AUC) student-t test에 따라 종래의 라벨 및 비처리군에 비유하여 잔류 라벨군이 더 중요하다. 49일에 131I-IMP-R4-hRS7으로 치료로 MTV때문에, AUC에서 중요도(p값)은 하기와 같으며, 치료전(일-2) 종양부피 차이의 상대적 p값으로 괄효에 주어진다. 비처리군에 대하여 0.05(0.78); l3lI-hRS7 (CT)에 대하여 0.03(0.98); 비처리군에 대하여 l3lI-hRS7 (CT):0.14(0.81)이다. 49일에 종래 및 잔류 방사성요오드기 사이에 평균종양 부피에서 연속적인 차이가 있으며, 후자 군이 연속된 감소를 나타낸다. 8주 후-치료에서 완전한 경감이 l3lI-IMP-R4-hRS7로 처리된 11마리 쥐 중 5마리에서 관측되었으며, MTV는 시작값의 20%이다. 비처리된 군에서 8주에서 MTV 및 l3lI-hRS7-처리된 쥐는 각각 l3lI-hRS7기에서 11마리 쥐 중 하나의 완전한 경감과 함께 시작값의 280% 및 163%이었다.
치료는 우수히 내성적이었다. 날짜-2에서 IMP-R4의 평균 체중은 21.93± 2.03이고, 49일에서는 23.68±1.81이었으며; 'CT'군에서 평균 체중은 날자-2 및 49일에 각각 21.77±2.21 및 23.90±2.64이었다. 혈액세포 카운트에 의해 결정되어진 처리군의 마이엘로 독성(myelotoxicity)은 도 12에 나타내었다. 간략하게 131I-IMP-R4-hRS7으로 제제 섭취후 일주일에 도달하였을 때 WBC, 임파구(lymphocyte) 및 중 성구(neutrophil) 각각 34%, 7% 및 61%의 최하점이었다. 5주까지 이는 각각 대조수준의 74%, 58% 및 92%로 회복되었으며, 49일에 조절수준의 45%, 36% 및 51%로 잔존하였으며; 제제 섭취후 일주일에 도달하였을 때 WBC, 임파구(lymphocyte) 및 중성구(neutrophil) 각각 41%, 13% 및 67%의 최하점이었다. 5주까지 대조수준의 85%, 67% 및 103%로 회복되었으며, 49일에 대조수준의 42%, 32% 및 49%에서 잔존하였다.
치료연구-2
MDA-MB-468 종양모델에서 131 I-IMP-R4-hRS7을 사용한 RAIT 특이성
131I-IMP-R4-hRS7의 효율성은 131I-IMP-R4로 라벨화된 비-특이성 조절 인간화 항체, hLL2 (anti-CD-22 MAb)의 것과 비교하였다. 본 실험에서 각 제제의 175μCi를 처리하였다. 이는 131I-IMP-R4-hRS7의 최대내성용량이 ~70%로 나타낸다. 본 실험에서 비처리군을 포함하여 한 군당 7~8마리 동물이었으며, 군은 치료실험-1과 같이 시작 종양부피 분포에 의하여 무작위로 하였다. 세개의 군(치료전 MTV;100)에서 상대적 평균 종양부피(MTV)를 나타내는 도 13은 성장조절 특이성을 나타낸다.
실시예 5. Y-90 인간화된 RS7 mAb 및 인간화된 RS7 mAb자체로 유방암 환자의 치료
가슴에 재발 선암의 기록을 갖는 56세의 여성들은 자궁경관 림프절(cervical lymph node)이 존재하고 폐전이는 남아이었다. 그녀는 화학요법 및 호르몬치료 후 2회 재발한다. 그녀는 2주간격으로 100mg 항체의 단백질 약용량에 20mCi Y-90을 각 약물에서 Y-90-접합된 인간화 RS7 mAb을 2회 주입받았다. 치료 후 4주, 그녀의 백혈구 세포 및 혈소판수는 대략 50%까지 감소하였지만, 치료후 9주까지 회복되었다. 12주 후-치료의 재수행에서 단층촬영으로 측정된 폐 및 결절질병에서 ca 30%는 감소한다. 따라서, 그녀는 인간화된 RS7자체를 순간적인 경질 및 오한을 제외하고는 혈액수치 또는 혈액화학에 불리한 영향없이 각각 3시간에 걸쳐 4주간격으로 주입받았다. 각 주입에서 항체 약물 자체는 400㎎/㎡이었다. 대략 8주 후, 단층촬영에 의한 재상영은 질병부위에서 대략 20% 추가적인 감소가 있음을 나타낸다. 이어서 관찰 3달 후, 그녀의 질병은 안정한(추가적 또는 진행적 성장의 관측이 없음)상태를 나타낸다.
이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 RS7로 제작된 종양관련 항원 결합단백질에 관한 것으로, 본 발명의 인간화 RS7 항원 결합단백질은 인간 및 포유류의 악성종양 등의 진단 및 치료에 유용히 사용된다.
<110> IMMUNOMEDICS, INC. <120> RS7 ANTIBODIES <130> 018733/1164 <140> PCT/GB03/00885 <141> 2003-03-03 <150> 60/360,229 <151> 2002-03-01 <160> 28 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 324 <212> DNA <213> Mus sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(324) <400> 1 gac att cag ctg acc cag tct cac aaa ttc atg tcc aca tca gta gga 48 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 gac agg gtc agc atc acc tgc aag gcc agt cag gat gtg agt att gct 96 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Ala 20 25 30 gta gcc tgg tat caa cag aaa cca gga caa tct cct aaa cta ctg att 144 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tac tcg gca tcc tac cgg tac act gga gtc cct gat cgc ttc act ggc 192 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 agt gga tct ggg acg gat ttc act ttc acc atc agc agt gtg cag gct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala 65 70 75 80 gaa gac ctg gca gtt tat tac tgt cag caa cat tat att act ccg ctc 288 Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Leu 85 90 95 acg ttc ggt gct ggg acc aag ctg gag ctg aaa cgg 324 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 100 105 <210> 2 <211> 108 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 2 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 100 105 <210> 3 <211> 360 <212> DNA <213> Mus sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(360) <400> 3 gtg aag ctg cag gag tca gga cct gag ctg aag aag cct gga gag aca 48 Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr 1 5 10 15 gtc aag atc tcc tgc aag gct tct gga tat acc ttc aca aac tat gga 96 Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly 20 25 30 atg aac tgg gtg aag cag gct cca gga aag ggt tta aag tgg atg ggc 144 Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met Gly 35 40 45 tgg ata aac acc tac act gga gag cca aca tat act gat gac ttc aag 192 Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Asp Asp Phe Lys 50 55 60 gga cgg ttt gcc ttc tct ttg gaa acc tct gcc acc act gcc tat ttg 240 Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Thr Thr Ala Tyr Leu 65 70 75 80 cag atc aac aac ctc aaa agt gag gac atg gct aca tat ttc tgt gca 288 Gln Ile Asn Asn Leu Lys Ser Glu Asp Met Ala Thr Tyr Phe Cys Ala 85 90 95 aga ggg ggg ttc ggt agt agc tac tgg tac ttc gat gtc tgg ggc caa 336 Arg Gly Gly Phe Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln 100 105 110 ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca 360 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 4 <211> 120 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 4 Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr 1 5 10 15 Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly 20 25 30 Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met Gly 35 40 45 Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Asp Asp Phe Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Thr Thr Ala Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Ile Asn Asn Leu Lys Ser Glu Asp Met Ala Thr Tyr Phe Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Gly Phe Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 5 <211> 106 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 <210> 6 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala Ser 1 5 10 15 Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Ala 20 25 30 Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly 35 40 45 Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe Thr 50 55 60 Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Glu Asp Ser Asn Gly Tyr Lys Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Ser Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 7 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Humanized hRS7Vk sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(324) <400> 7 gac atc cag ctg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta gga 48 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gac aga gtc agc atc acc tgc aag gcc agt cag gat gtg agt att gct 96 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Ala 20 25 30 gta gcc tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa gcc cct aag ctc ctg atc 144 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tac tcg gca tcc tac cgg tac act gga gtc cct gat agg ttc agt ggc 192 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agt ctg caa cct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 gaa gat ttt gca gtt tat tac tgt cag caa cat tat att act ccg ctc 288 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Leu 85 90 95 acg ttc ggt gct ggg acc aag gtg gag atc aaa cgt 324 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 8 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 8 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 9 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Humanized hRS7VH sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(363) <400> 9 cag gtc caa ctg cag caa tct ggg tct gag ttg aag aag cct ggg gcc 48 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aag gtt tcc tgc aag gct tct gga tac acc ttc aca aac tat 96 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 gga atg aac tgg gtg aag cag gcc cct gga caa ggg ctt aaa tgg atg 144 Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 ggc tgg ata aac acc tac act gga gag cca aca tat act gat gac ttc 192 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Asp Asp Phe 50 55 60 aag gga cgg ttt gcc ttc tcc ttg gac acc tct gtc agc acg gca tat 240 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 ctc cag atc agc agc cta aag gct gac gac act gcc gtg tat ttc tgt 288 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 gca aga ggg ggg ttc ggt agt agc tac tgg tac ttc gat gtc tgg ggc 336 Ala Arg Gly Gly Phe Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly 100 105 110 caa ggg tcc ctg gtc acc gtc tcc tca 363 Gln Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 10 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 10 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Phe Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 11 <211> 702 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Humanized hRS7k sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(699) <400> 11 atg gga tgg agc tgt atc atc ctc ttc ttg gta gca aca gct aca ggt 48 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 gtc cac tcc gac atc cag ctg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca 96 Val His Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala 20 25 30 tct gta gga gac aga gtc agc atc acc tgc aag gcc agt cag gat gtg 144 Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val 35 40 45 agt att gct gta gcc tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa gcc cct aag 192 Ser Ile Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 50 55 60 ctc ctg atc tac tcg gca tcc tac cgg tac act gga gtc cct gat agg 240 Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg 65 70 75 80 ttc agt ggc agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agt 288 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser 85 90 95 ctg caa cct gaa gat ttt gca gtt tat tac tgt cag caa cat tat att 336 Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ile 100 105 110 act ccg ctc acg ttc ggt gct ggg acc aag gtg gag atc aaa cgt act 384 Thr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 115 120 125 gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca tct gat gag cag ttg 432 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 130 135 140 aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc tat ccc 480 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 145 150 155 160 aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc caa tcg ggt 528 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 165 170 175 aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac agc aag gac agc acc tac 576 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 180 185 190 agc ctc agc agc acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac gag aaa cac 624 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 195 200 205 aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg agc tcg ccc gtc 672 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 210 215 220 aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt t ag 702 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 12 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 12 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala 20 25 30 Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val 35 40 45 Ser Ile Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 50 55 60 Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg 65 70 75 80 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser 85 90 95 Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ile 100 105 110 Thr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 115 120 125 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 130 135 140 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 145 150 155 160 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 165 170 175 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 180 185 190 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 195 200 205 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 210 215 220 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 13 <211> 1410 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Humanized hRS7H sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(1407) <400> 13 atg gga tgg agc tgt atc atc ctc ttc ttg gta gca aca gct aca ggt 48 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 gtc cac tcc gtc caa ctg cag caa tct ggg tct gag ttg aag aag cct 96 Val His Ser Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro 20 25 30 ggg gcc tca gtg aag gtt tcc tgc aag gct tct gga tac acc ttc aca 144 Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 35 40 45 aac tat gga atg aac tgg gtg aag cag gcc cct gga caa ggg ctt aaa 192 Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys 50 55 60 tgg atg ggc tgg ata aac acc tac act gga gag cca aca tat act gat 240 Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Asp 65 70 75 80 gac ttc aag gga cgg ttt gcc ttc tcc ttg gac acc tct gtc agc acg 288 Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr 85 90 95 gca tat ctc cag atc agc agc cta aag gct gac gac act gcc gtg tat 336 Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr 100 105 110 ttc tgt gca aga ggg ggg ttc ggt agt agc tac tgg tac ttc gat gtc 384 Phe Cys Ala Arg Gly Gly Phe Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val 115 120 125 tgg ggc caa ggg tcc ctg gtc acc gtc tcc tca gcc tcc acc aag ggc 432 Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 130 135 140 cca tcg gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag agc acc tct ggg ggc 480 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 145 150 155 160 aca gcg gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa ccg gtg 528 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 165 170 175 acg gtg tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac acc ttc 576 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 180 185 190 ccg gct gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc agc agc gtg gtg 624 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 195 200 205 acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc tac atc tgc aac gtg 672 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val 210 215 220 aat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag aga gtt gag ccc aaa 720 Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys 225 230 235 240 tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc 768 Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 245 250 255 ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc 816 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 260 265 270 ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg 864 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 275 280 285 agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg 912 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 290 295 300 gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc 960 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 305 310 315 320 acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg 1008 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 325 330 335 aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc 1056 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 340 345 350 ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca 1104 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 355 360 365 cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gag gag atg acc aag aac cag 1152 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 370 375 380 gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc 1200 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 385 390 395 400 gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg 1248 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 405 410 415 cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tat agc aag ctc 1296 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 420 425 430 acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc 1344 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 435 440 445 gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc 1392 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 450 455 460 ctg tct ccg ggt aaa tga 1410 Leu Ser Pro Gly Lys 465 <210> 14 <211> 469 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 14 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro 20 25 30 Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 35 40 45 Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys 50 55 60 Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Asp 65 70 75 80 Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr 85 90 95 Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr 100 105 110 Phe Cys Ala Arg Gly Gly Phe Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val 115 120 125 Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 130 135 140 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 145 150 155 160 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 165 170 175 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 180 185 190 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 195 200 205 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val 210 215 220 Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys 225 230 235 240 Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 245 250 255 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 260 265 270 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 275 280 285 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 290 295 300 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 305 310 315 320 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 325 330 335 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 340 345 350 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 355 360 365 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 370 375 380 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 385 390 395 400 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 405 410 415 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 420 425 430 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 435 440 445 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 450 455 460 Leu Ser Pro Gly Lys 465 <210> 15 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 15 Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Ala Val Ala 1 5 10 <210> 16 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 16 Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr 1 5 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 17 Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Leu Thr 1 5 <210> 18 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 18 Asn Tyr Gly Met Asn 1 5 <210> 19 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 19 Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Asp Asp Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 20 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 20 Gly Gly Phe Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val 1 5 10 <210> 21 <211> 176 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 21 ggtctgagtt gaagaagcct ggggcctcag tgaaggtttc ctgcaaggct tctggataca 60 ccttcacaaa ctatggaatg aactgggtga agcaggcccc tggacaaggg cttaaatgga 120 tgggctggat aaacacctac actggagagc caacatatac tgatgacttc aaggga 176 <210> 22 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 22 acccttggcc ccagacatcg aagtaccagt agctactacc gaacccccct cttgcacaga 60 aatacacggc agtgtcgtca gcctttaggc tgctgatctg gagatatgcc gtgctgacag 120 aggtgtccaa ggagaaggca aaccgtccct tgaagtcatc agtatatg 168 <210> 23 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 23 gtggtgctgc agcaatctgg gtctgagttg aagaagcc 38 <210> 24 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 24 tgaggagacg gtgaccaggg acccttggcc ccagacat 38 <210> 25 <211> 156 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 25 ctccatcctc cctgtctgca tctgtaggag acagagtcag catcacctgc aaggccagtc 60 aggatgtgag tattgctgta gcctggtatc agcagaaacc agggaaagcc cctaagctcc 120 tgatctactc ggcatcctac cggtacactg gagtcc 156 <210> 26 <211> 155 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 26 ccttggtccc agcaccgaac gtgagcggag taatataatg ttgctgacag taataaactg 60 caaaatcttc aggttgcaga ctgctgatgg tgagagtgaa atctgtccca gatccactgc 120 cactgaacct atcagggact ccagtgtacc ggtag 155 <210> 27 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 27 gacattcagc tgacccagtc tccatcctcc ctgtctg 37 <210> 28 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 28 acgttagatc tccaccttgg tcccagcacc g 31

Claims (124)

  1. EGP-1 당단백질(glycoprotein)에 결합하는 인간화 RS7 항체 또는 이의 단편으로서, 상기 인간화 RS7 항체의 경쇄 가변영역의 상보성 결정 부위(complementarity determining region; CDR)가 아미노산 서열 KASQDVSIAVA(서열번호 15)로 이루어진 CDR1; 아미노산 서열 SASYRYT(서열번호 16)로 이루어진 CDR2; 및 아미노산 서열 QQHYITPLT(서열번호 17)로 이루어진 CDR3를 포함하고, 상기 인간화 RS7 항체의 중쇄 가변부위의 CDR이 아미노산 서열 NYGMN(서열번호 18)로 이루어진 CDR1; 아미노산 서열 WINTYTGEPTYTDDFKG(서열번호 19)로 이루어진 CDR2; 및 아미노산 서열 GGFGSSYWYFDV(서열번호 20)로 이루어진 CDR3를 포함하며, 상기 단편이 인간화 RS7 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는 인간화 RS7 항체 또는 이의 단편.
  2. 삭제
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  8. 제 1항에 있어서, 인간 항체의 경쇄 및 중쇄 불변부위의 구조 부위를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 RS7 항체 또는 이의 단편.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 인간화 항체의 경쇄 또는 중쇄 가변부위의 구조 부위는 쥐 RS7 단클론 항체 내의 대응하는 위치에서 발견된 아미노산 잔기에 의하여 치환된 하나 이상의 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 RS7 항체 또는 이의 단편.
  10. 제 9항에 있어서, 치환된 아미노산 잔기 중 하나 이상은 서열번호 4의 쥐 중쇄 가변 부위의 아미노산 잔기 38, 46, 68 및 91로 이루어진 군으로부터 선택된 위치임을 특징으로 하는 인간화 RS7 항체 또는 이의 단편.
  11. 제 9항에 있어서, 치환된 아미노산 잔기 중 하나 이상은 서열번호 2의 쥐 경쇄 가변 부위의 아미노산 잔기 20, 85 및 100으로 이루어진 군으로부터 선택된 위치임을 특징으로 하는 인간화 RS7 항체 또는 이의 단편.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 제 1항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 단편은 서열번호 7의 hRS7VK 뉴클레오타이드 서열 및 서열번호 9의 hRS7VH 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 RS7 항체 또는 이의 단편.
  15. 암세포에 결합하는 제 1항, 제 8항 내지 제 11항 및 제 14항 중 어느 한 항의 인간화 RS7 항체 또는 이의 단편을 포함하는 항체 성분을 포함하는 암세포 표적 진단 컨쥬게이트(conjugate)로서, 상기 항체 성분은 하나 이상의 진단제에 결합되고, 상기 단편은 인간화 RS7 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는 암세포 표적 진단 컨쥬게이트.
  16. 제 15항에 있어서, 상기 진단제는 하나 이상의 광활성(photoactive) 진단제를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 컨쥬게이트.
  17. 제 15항에 있어서, 상기 진단제는 25 내지 4,000 keV의 에너지를 갖는 방사성 라벨임을 특징으로 하는 진단 컨쥬게이트.
  18. 제 17항에 있어서, 상기 방사성 라벨은 감마-, 베타- 또는 양전자(positron)-방출 동위원소임을 특징으로 하는 진단 컨쥬게이트.
  19. 제 18항에 있어서, 상기 방사성 라벨은 125I, 131I, 123I, 124I, 86Y, 186Re, 188Re, 62Cu, 64Cu, 111In, 67Ga, 68Ga, 99mTc, 94mTc, 18F, 11C, 13N, 15O, 177Lu 및 76Br로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 진단 컨쥬게이트.
  20. 제 15항에 있어서, 상기 진단제는 조영제(contrast agent)임을 특징으로 하는 진단 컨쥬게이트.
  21. 제 20항에 있어서, 상기 조영제는 상자성(paramagnetic) 이온임을 특징으로 하는 진단 컨쥬게이트.
  22. 제 20항에 있어서, 상기 조영제는 초음파 증가제(enhancing agent)임을 특징으로 하는 진단 컨쥬게이트.
  23. 제 22항에 있어서, 상기 초음파 증가제는 인간화 RS7IgG 또는 이의 단편으로 이루어진 리포좀임을 특징으로 하는 진단 컨쥬게이트.
  24. 제 23항에 있어서, 상기 리포좀은 가스 충전된 것임을 특징으로 하는 진단 컨쥬게이트.
  25. 제 21항에 있어서, 상기 상자성(paramagnetic) 이온은 망간, 철 또는 가돌리늄(gadolinium)을 포함하는 금속인 것을 특징으로 하는 진단 컨쥬게이트.
  26. 암세포에 결합하는 제 1항, 제 8항 내지 제 11항 및 제 14항 중 어느 한 항의 인간화 RS7 항체 또는 이의 단편을 포함하는 항체 성분을 포함하는 암세포 표적 치료 컨쥬게이트로서, 상기 항체 성분은 하나 이상의 치료제에 결합되고, 상기 단편은 인간화 RS7 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는 암세포 표적 치료 컨쥬게이트.
  27. 제 26항에 있어서, 상기 치료제는 방사성 라벨, 면역조절자(immunomodulator), 호르몬, 효소, 광활성 치료제, 세포독성제(cytotoxic agent) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 치료 컨쥬게이트.
  28. 제 27항에 있어서, 상기 세포독성제는 약물 또는 독소임을 특징으로 하는 치료 컨쥬게이트.
  29. 제 28항에 있어서, 상기 약물은 세포분열 저지성물질(antimitotic), 알킬화제(alkylating), 대사길항물질(antimetabolite), 혈관형성억제제(antiangiogenic), 세포사멸제(apoptotic), 알킬로이드 항생물질(alkyloid antibiotic), 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 제약학적인 특성을 갖는 것을 특징으로 하는 치료 컨쥬게이트.
  30. 제 28항에 있어서, 상기 약물은 질소머스타드(nitrogen mustard), 에틸렌이민(ethylenimine) 유도체, 알킬 설포네이트, 니트로소 우레아(nitrosourea), 트리아젠(triazene), 엽산 유사체(folic acid analog), 안트라사이클린(antracycline), 탁산(taxane), COX-2 억제제, 피리미딘(pyrimidine) 유사체, 푸린(purine) 유사체, 항생 물질(antibiotic), 효소, 에피포도필로톡신(epipodophyllotoxin), 백금 배위 착물(platinum coordination complex), 빈카알칼로이드(vinca alkaloid), 치환 요소, 메틸 하이드라진 유도체, 부신피질(adrenocortical) 억제제, 길항제(antagonist), 엔도스타틴(endostatin), 탁솔(taxol), 캄토테신(Camptothecin), 독소루비신(doxorubicin), 독소루비신 유사체, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 치료 컨쥬게이트.
  31. 제 28항에 있어서, 상기 독소는 리신, 아브린(abrin), 알파톡신(alpha toxin), 사포린(saporin), 리보뉴클레아제(RNase), DNase I, 포도상구균 장독성(staphylococcal enterotoxin)-A, 포크위드 항 바이러스(pokeweed antiviral) 단백질, 겔로닌(gelonin), 디프테린(diphtherin) 독소, 슈도모나스 외독소, 및 슈도모나스 내독소로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 치료 컨쥬게이트.
  32. 제 27항에 있어서, 상기 면역조절자는 사이토킨(cytokine), 줄기세포(stem cell) 성장인자, 림포톡신(lymphotoxin), 조혈 인자(hematopoietic factor), 콜로니 자극인자(colony stimulating factor; CSF), 인터페론(IFN), 에리트로포이에틴(erythropoietin), 트롬보포이에틴(thrombopoietin) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 치료 컨쥬게이트.
  33. 제 32항에 있어서, 상기 림포톡신은 종양괴사인자(tumor necrosis factor; TNF), 상기 조혈 인자는 인터루킨(IL), 상기 콜로니 자극인자는 과립구-콜로니 자극인자(G-CSF) 또는 과립구 마크로파지-콜로니 자극인자(GM-CSF), 상기 인터페론은 인터페론-α,-β 또는 -γ이며, 상기 줄기세포 성장인자는 "S1 인자"로 제작되는 것임을 특징으로 하는 치료 컨쥬게이트.
  34. 제 15항에 있어서, 상기 진단제는 60 내지 4000 keV의 에너지를 갖는 방사성핵종(radionuclide)인 것을 특징으로 하는 진단 컨쥬게이트.
  35. 제 32항에 있어서, 상기 면역조절자는 IL-1, IL-2, IL-3, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, IL-21, 인터페론-γ, TNF-α 또는 이들의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 치료 컨쥬게이트.
  36. 제 27항에 있어서, 상기 방사성 라벨은 60 내지 700 keV의 에너지를 가짐을 특징으로 하는 치료 컨쥬게이트.
  37. 제 27항에 있어서, 상기 방사성 라벨을 32P, 33P, 47Sc, 64 Cu, 67Cu, 67Ga, 86Y, 90Y, 111Ag, 111In, 125I, 131I, 142Pr, 153Sm, 161Tb, 166Dy, 166Ho, 177Lu, 186 Re, 188Re, 189Re, 212Pb, 212Bi, 213Bi, 211At, 223Ra 및 225 Ac, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 치료 컨쥬게이트.
  38. 제 27항에 있어서, 상기 광활성 치료제는 색원체(chromogen) 또는 염료(dye)임을 특징으로 하는 치료 컨쥬게이트.
  39. 제 1항, 제 8항 내지 제 11항 및 제 14항 중 어느 한 항의 인간화 RS7 항체 또는 이의 단편 및 합텐 분자에 대한 친화력을 가진 하나 이상의 합텐 결합부위를 포함하며, 상기 단편이 인간화 RS7 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는 다가(multivalent), 다중특이성 항체.
  40. 삭제
  41. 삭제
  42. 삭제
  43. 제 39항에 있어서, 진단제 또는 치료제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
  44. 제 1항의 인간화 RS7 항체 또는 이의 단편을 두 개 이상 포함하며, 상기 단편이 인간화 RS7 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는 항체 융합 단백질 또는 이의 단편.
  45. 제 1항의 하나 이상의 일차 인간화 RS7 항체 또는 그의 단편 및 제 1항의 인간화 RS7 항체 또는 그의 단편을 제외한 하나 이상의 이차 단클론 항체 또는 그의 단편을 포함하는 항체 융합 단백질 또는 그의 단편으로서, 상기 이차 단클론 항체는 CEA, CSAp, Tn, Le(y), MUC-1-4, Tag-72, EGFR, HER2/neu, PSMA, PSA, AFP, HCG, HCG-베타, 페리틴(ferritin), PAP, PLAP, EGP-2, 히스톤(histone), 사이토케라틴(cytokeratin), 테나신(tenascin), CanAg, 신장 암 G 250, VGFR1, VGFR2, VEGF, P1GF, 인슐린-형 성장인자, 암유전자(oncogene) 산물, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 항원에 반응하는 것을 특징으로 하는 항체 융합 단백질 또는 그의 단편.
  46. 제 45항에 있어서, 상기 이차 단클론 항체는 암(carcinoma)-관련 항체임을 특징으로 하는 항체 융합 단백질 또는 이의 단편.
  47. 제 46항에 있어서, 상기 암-관련 항체는 머리 및 목, 폐, 가슴, 난소, 위, 전립선, 결장으로 이루어진 군에서 선택된 암 또는 비뇨기 방광암에 대한 항원에 결합하는 것을 특징으로 하는 항체 융합 단백질 또는 이의 단편.
  48. 제 46항에 있어서, 상기 암-관련 항체는 CEA, CSAp, Tn, Le(y), MUC-1-4, Tag-72, EGFR, HER2/neu, PSMA, PSA, AFP, HCG, HCG-베타, 페리틴(ferritin), PAP, PLAP, EGP-2, 히스톤(histone), 사이토케라틴(cytokeratin), 테나신(tenascin), CanAg, 신장 암 G 250, VGFR1, VGFR2, VEGF, P1GF, 인슐린-형 성장인자, 암유전자(oncogene) 산물, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 항원에 반응하는 항체 또는 단편임을 특징으로 하는 항체 융합 단백질 또는 그의 단편.
  49. (a) 제 1항, 제 8항 내지 제 11항 및 제 14항 중 어느 한 항의 인간화 RS7 항체 또는 그의 단편;
    (b) 제 1항, 제 8항 내지 제 11항 및 제 14항 중 어느 한 항의 하나 이상의 일차 인간화 RS7 항체 또는 그의 단편, 및 제 1항, 제 8항 내지 제 11항 및 제 14항 중 어느 한 항의 인간화 RS7 항체 또는 그의 단편을 제외한 하나 이상의 이차 단클론 항체 또는 그의 단편을 포함하는 항체 융합 단백질 또는 그의 단편; 및
    (c) 제 1항, 제 8항 내지 제 11항 및 제 14항 중 어느 한 항의 하나 이상의 일차 인간화 RS7 항체 또는 그의 단편, 및 제 1항, 제 8항 내지 제 11항 및 제 14항 중 어느 한 항의 인간화 RS7 항체 또는 그의 단편을 제외한 하나 이상의 이차 단클론 항체 또는 그의 단편을 포함하며, 상기 단편은 인간화 RS7 항체와 동일한 에피토프에 결합하고, 상기 이차 단클론 항체는 CEA, CSAp, Tn, Le(y), MUC-1-4, Tag-72, EGFR, HER2/neu, PSMA, PSA, AFP, HCG, HCG-베타, 페리틴(ferritin), PAP, PLAP, EGP-2, 히스톤(histone), 사이토케라틴(cytokeratin), 테나신(tenascin), CanAg, 신장 암 G 250, VGFR1, VGFR2, VEGF, P1GF, 인슐린-형 성장인자, 암유전자(oncogene) 산물, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 항원에 반응하는 항체 또는 단편인 항체 융합 단백질 또는 그의 단편;
    으로 구성된 군으로부터 선택된 단클론 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 DNA 서열.
  50. 제 49항의 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터.
  51. 제 49항의 DNA 서열을 포함하는 숙주 세포.
  52. 진단제 또는 치료제, 또는 그들의 조합을 표적으로 운반하기 위한 조성물로서, 하나 이상의 진단제 또는 하나 이상의 치료제에 결합하는 제 1항, 제 8항 내지 제 11항 및 제 14항 중 어느 한 항의 인간화 RS7 항체 또는 이의 단편을 포함하며, 상기 단편이 인간화 RS7 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는 운반용 조성물.
  53. 제 52항에 있어서, 상기 진단제 또는 치료제는 동위원소, 약물, 독소, 면역조절자, 효소, 호르몬, 성장 인자, 방사성 핵종, 금속, 조영제 및 검출제로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 운반용 조성물.
  54. 제 53항에 있어서, 상기 진단제 또는 치료제는 사이토킨(cytokine), 줄기세포(stem cell) 성장인자, 림포톡신(lymphotoxin), 조혈 인자(hematopoietic factor), 콜로니 자극인자(colony stimulating factor; CSF), 인터페론(IFN), 에리트로포이에틴(erythropoietin), 트롬보포이에틴(thrombopoietin) 및 이들의 조합으로부터 선택된 면역조절자임을 특징으로 하는 운반용 조성물.
  55. 제 54항에 있어서, 상기 진단제 또는 치료제는 사이토킨임을 특징으로 하는 운반용 조성물.
  56. 제 53항에 있어서, 상기 진단제 또는 치료제는 동위원소임을 특징으로 하는 운반용 조성물.
  57. 제 56항에 있어서, 상기 동위원소는 25 내지 4,000 keV의 에너지 범위를 가지는 것을 특징으로 하는 운반용 조성물.
  58. 제 56항에 있어서, 상기 동위원소는 123I, 124I, 125I, 131I, 86Y, 90Y, 186Re, 188Re, 189Re, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 111In, 67Ga, 68Ga, 94mTc, 94Tc, 99mTc, 18F, 11C, 13N, 15O, 52Fe, 89Zr, 154-158Gd, 177Lu, 76Br, 225Ac, 212Bi, 213Bi, 211At, 32P, 33P, 47Sc, 111Ag, 142Pr, 153Sm, 161Tb, 166Ho, 166Dy, 212Pb, 223Ra로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 운반용 조성물.
  59. 제 53항에 있어서, 상기 약물은 세포독성 약물, 광역학(photodynamic) 약물, 형광색소 약물 및 면역조절자로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 운반용 조성물.
  60. 제 53항에 있어서, 상기 진단제 또는 치료제는 금속인 것을 특징으로 하는 운반용 조성물.
  61. 제 60항에 있어서, 상기 진단제는 MRI에 사용되는 상자성(paramagnetic) 이온임을 특징으로 하는 운반용 조성물.
  62. 제 53항에 있어서, 상기 조영제는 가돌리늄(gadolinium), 철 또는 망간임을 특징으로 하는 운반용 조성물.
  63. 제 53항에 있어서, 상기 검출제는 형광성 화합물, 화학발광 화합물, 생물발광 화합물로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 운반용 조성물.
  64. 제 63항에 있어서, 상기 검출제는 형광성 화합물임을 특징으로 하는 운반용 조성물.
  65. 제 64항에 있어서, 상기 형광성 화합물은 프루오르세인 이소티오시아네이트(fluoresceim isothiocyannate), 로다민(rhodamine), 파이코에리테린(phycoerytherin), 파이코시아닌(phycocyanin), 알로파이코시아닌(allophycocyanin), o-프탈데하이드(o-phthaldehyde) 및 플루오르스카민(fluorescamine)로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 운반용 조성물.
  66. 제 63항에 있어서, 상기 검출제는 화학발광 화합물임을 특징으로 하는 운반용 조성물.
  67. 제 63항에 있어서, 상기 화학발광 화합물은 루미놀(luminol), 이소루미놀(isoluminol), 방향족 아크리디늄(acridinium) 에스테르, 이미다졸(imidazole), 아크리디늄 염 및 옥살레이트(oxalate) 에스테르로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 운반용 조성물.
  68. 제 63항에 있어서, 상기 검출제는 생물발광성 화합물임을 특징으로 하는 운반용 조성물.
  69. 제 68항에 있어서, 상기 생물발광성 화합물은 루시페린(luciferin), 루시페라제(luciferase) 및 에쿼린(aequorin)으로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 운반용 조성물.
  70. 제 53항에 있어서, 상기 조영제는 초음파 증가제임을 특징으로 하는 운반용 조성물.
  71. 제 70항에 있어서, 상기 초음파 증가제는 인간화 RS7 IgG 또는 그의 단편을 포함하는 리포좀임을 특징으로 하는 운반용 조성물.
  72. 제 71항에 있어서, 상기 리포좀은 가스 충전된 것임을 특징으로 하는 운반용 조성물.
  73. 삭제
  74. (ⅰ) 제 39항에 의한 항체; 및
    (ⅱ) 진단제, 치료제, 또는 이들의 조합을 포함하며, 상기 항체의 결합 위치에 결합하는 합텐(hapten);
    을 포함하는, 진단제, 치료제 또는 이들의 조합을 표적으로 운반하는 운반용 조성물.
  75. 제 74항에 있어서, 상기 합텐은 상기 항체의 하나 이상의 결합 위치에 결합하는 것을 특징으로 하는 운반용 조성물.
  76. 제 74항에 있어서, 상기 진단제 또는 상기 치료제는 동위원소, 약물, 독소, 사이토킨, 효소, 호르몬, 성장인자, 컨쥬게이트, 방사성 핵종, 및 금속으로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 운반용 조성물.
  77. (ⅰ) 제 39항에 의한 항체; 및
    (ⅱ) 진단제, 치료제, 또는 이들의 조합을 포함하며, 상기 항체의 결합 위치에 결합하는 합텐(hapten);
    을 포함하는 암 진단용 또는 치료용 조성물.
  78. 제 77항에 있어서, 상기 암은 폐, 난소, 전립선, 결장, 위, 방광 및 유방암으로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 암 진단용 또는 치료용 조성물.
  79. 제 1항, 제 8항 내지 제 11항 및 제 14항 중 어느 한 항에 의한 단클론 항체로부터 선택된 두 개 이상의 단클론 항체 또는 그의 단편, 또는 제약학적 부형제로 제형화된 제 1항, 제 8항 내지 제 11항 및 제 14항 중 어느 한 항에 의한 하나 이상의 단클론 항체 또는 그의 단편을 포함하고, 상기 단편이 인간화 RS7 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는, 치료학적으로 효과적인 양의 항체 융합 단백질 또는 그의 단편을 포함하는 대상에서의 악성 종양 치료용 조성물.
  80. 제 1항, 제 8항 내지 제 11항 및 제 14항 중 어느 한 항의 인간화 RS7 항체 또는 그의 단편 또는 제 44항 내지 제 48항 중 어느 한 항의 항체 융합 단백질 또는 그의 단편을 포함하며, 상기 RS7 항체 또는 그의 단편 또는 항체 융합 단백질 또는 그의 단편은 제약학적 부형제로 제형화된 하나 이상의 치료제에 결합하고, 상기 단편은 인간화 RS7 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는, 치료학적으로 효과적인 양의 치료 컨쥬게이트를 포함하는 대상에서의 악성 종양 치료용 조성물.
  81. 제 80항에 있어서, 상기 치료제는 질소머스타드(nitrogen mustard), 에틸렌이민(ethylenimine) 유도체, 알킬 설포네이트(alkyl sulfonate), 니트로소우레아(nitrosourea), 트리아젠(triazen), 엽산(folic acid) 유사체, 안트라사이클린(anthracycline), 탁산(taxane), COX-2 저해제, 타이로신 키나제(tyrosine kinase) 억제제, 피리미딘(pyrimidine) 유사체, 푸린(purine) 유사체, 항생제, 효소, 에피포도필로톡신(epipodophyllotoxin), 백금 배위 착물(platinum coordination complex), 빈카 알카로이드(vinca alkaloid), 치환 요소(substituted urea), 메틸 하이드라진(methyl hydrazine) 유도체, 부신피질 억제제(adrenocortical suppressant), 길항제(antagonist), 엔도스타틴(endostatin), 탁솔(taxol), 캄토테신(camptothecin), 독소루비신(doxorubicin), 독소루비신 유사체, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 악성 종양 치료용 조성물.
  82. 제 80항에 있어서, 상기 치료제는 세포분열 저지성물질, 알킬화제, 대사길항물질, 혈관형성억제제(antiangiogenic agent), 세포사멸제(apoptotic agent), 알킬로이드 항생물질 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 제약학적인 특성을 갖는 약물임을 특징으로 하는 악성 종양 치료용 조성물.
  83. 제 80항에 있어서, 이차 단클론 항체 또는 그의 단편 또는 항체 융합 단백질 또는 그의 단편을 더 포함하며, 상기 이차 단클론 항체는 CEA, CSAp, Tn, Le(y), MUC-1-4, Tag-72, EGFR, HER2/neu, PSMA, PSA, AFP, HCG, HCG-베타, 페리틴, PAP, PLAP, EGP-2, 히스톤, 사이토케라틴, 테나신, CanAg, 신장 암 G 250, VGFR1, VGFR2, VEGF, P1GF, 인슐린-형 성장인자, 암유전자 산물, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 항원에 반응하는 것을 특징으로 하는 악성 종양 치료용 조성물.
  84. 제 83항에 있어서, 상기 이차 단클론 항체 또는 그의 단편 또는 항체 융합 단백질 또는 그의 단편은 자체 단클론 항체 또는 그의 단편임을 특징으로 하는 악성 종양 치료용 조성물.
  85. 제 83항에 있어서, 상기 이차 단클론 항체 또는 그의 단편 또는 항체 융합 단백질 또는 그의 단편은 CEA, AFP, HCG, CSAp, Tn, Le(y), MUC-1-4, Tag-72, EGFR, HER2/neu, PSMA, PSA, VEGF, P1GF, 인슐린-형 성장인자, 테나신(tenascin), 암유전자(oncogene) 산물, 사이토케라틴, 및 A33으로 구성된 군으로부터 선택된 항원과 반응하는 것임을 특징으로 하는 악성 종양 치료용 조성물.
  86. 제 85항에 있어서, 상기 이차 단클론 항체 또는 그의 단편 또는 항체 융합 단백질 또는 그의 단편은 치료제 또는 진단제와 컨쥬게이션됨을 특징으로 하는 악성 종양 치료용 조성물.
  87. 제 80항에 있어서, 제 1항, 제 8항 내지 제 11항 및 제 14항 중 어느 한 항의 이차 단클론 항체 또는 그의 단편을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 악성 종양 치료용 조성물.
  88. 제 80항에 있어서, 상기 인간화 RS7 항체 또는 그의 단편 또는 항체 융합 단백질 또는 그의 단편은 비경구적으로 투여되는 것임을 특징으로 하는 악성 종양 치료용 조성물.
  89. 제 88항에 있어서, 상기 인간화 RS7 항체 또는 그의 단편 또는 항체 융합 단백질 또는 그의 단편은 1회 복용당 10 내지 2000 밀리그램의 단백질 복용량으로 투여되는 것임을 특징으로 하는 악성 종양 치료용 조성물.
  90. 제 89항에 있어서, 상기 복용량으로 반복 투여되는 것임을 특징으로 하는 악성 종양 치료용 조성물.
  91. 삭제
  92. 제 80항에 있어서, 상기 인간화 RS7 항체 불변영역 및 힌지(hinge)영역은 인간 IgG1의 불변영역 및 힌지영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 악성 종양 치료용 조성물.
  93. 제 83항에 있어서, 상기 인간화 RS7 항체 또는 그의 단편 또는 항체 융합 단백질 또는 그의 단편은 이차 항체 또는 그의 단편이 상기 대상에 투여되기 전, 동시, 또는 후에 투여되는 것임을 특징으로 하는 악성 종양 치료용 조성물.
  94. 제 80항에 있어서, 상기 인간화 RS7 항체 또는 그의 단편의 일차 결합 위치는 다가(multivalent), 다중특이성 융합 단백질 또는 화학적 컨쥬게이트에 존재하며, 이차 결합 위치는 RS7이 아닌 종양 표지 물질과 반응하는 것을 특징으로 하는 악성 종양 치료용 조성물.
  95. 제 80항에 있어서, 상기 인간화 RS7 항체 또는 그의 단편 또는 항체 융합 단백질 또는 그의 단편은 하나 이상의 치료제가 투여되기 전, 동시, 또는 후에 투여되는 것을 특징으로 하는 악성 종양 치료용 조성물.
  96. 제 93에 있어서, 상기 이차 항체 또는 그의 단편은 하나 이상의 치료제 또는 진단제에 컨쥬게이션되는 것임을 특징으로 하는 악성 종양 치료용 조성물.
  97. 삭제
  98. 제 1항, 제 8항 내지 제 11항 및 제 14항 중 어느 한 항의 인간화 RS7 항체 또는 그의 단편, 또는 제 44항 내지 제 48항 중 어느 한 항의 항체 융합 단백질 또는 그의 단편을 포함하며, 상기 인간화 RS7 항체 또는 그의 단편 또는 항체 융합 단백질 또는 그의 단편은 하나 이상의 진단제에 결합하고 제약학적 부형제로 제형화되고, 상기 단편은 인간화 RS7 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는, 치료학적으로 효과적인 양의 치료 컨쥬게이트를 포함하는 대상에서의 악성 종양 진단용 조성물.
  99. (ⅰ) 제 1항, 제 8항 내지 제 11항 및 제 14항 중 어느 한 항의 자체 인간화 RS7 항체 또는 그의 단편 또는 제 44항 내지 제 48항 중 어느 한 항의 자체 항체 융합 단백질 또는 그의 단편을 포함하는 치료학적으로 효과적인 양; 및 (ⅱ) 제약학적 부형제로 상기 인간화 RS7 항체 또는 그의 단편 또는 항체 융합 단백질 또는 그의 단편을 제형화킨 것;
    을 포함하며, 상기 단편이 인간화 RS7 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는, 대상에서의 암 세포 치료용 조성물.
  100. 제 99항에 있어서, 상기 조성물은 이차 자체 항체 또는 그의 단편을 더 포함하며, 상기 이차 자체 항체는 CEA, CSAp, Tn, Le(y), MUC-1-4, Tag-72, EGFR, HER2/neu, PSMA, PSA, AFP, HCG, HCG-베타, 페리틴, PAP, PLAP, EGP-2, 히스톤, 사이토케라틴, 테나신, CanAg, 신장 암 G 250, VGFR1, VGFR2, VEGF, P1GF, 인슐린-형 성장인자, 암유전자 산물, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 항원에 반응하는 것을 특징으로 하는 암 세포 치료용 조성물.
  101. 제 99항에 있어서, 상기 조성물은 제 1항, 제 8항 내지 제 11항 및 제 14항 중 어느 한 항에 의한 이차 항체 또는 그의 단편을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 암 세포 치료용 조성물.
  102. 삭제
  103. 제 100항에 있어서, 상기 이차 항체 또는 그의 단편은 CEA, AFP, HCG, CSAp, Tn, Le(y), MUC-1-4, Tag-72, EGFR, HER2/neu, PSMA, PSA, VEGF, P1GF, 인슐린-형 성장인자, 테나신(tenascin), 암유전자(oncogene) 산물, 사이토케라틴, 및 A33으로 이루어진 군으로부터 선택된 항원과 반응하는 것을 특징으로 하는 암 세포 치료용 조성물.
  104. 삭제
  105. 제 99항에 있어서, 상기 자체 인간화 RS7 항체 또는 그의 단편 또는 자체 항체 융합 단백질 또는 그의 단편은 비경구적으로 투여되는 것임을 특징으로 하는 암 세포 치료용 조성물.
  106. 제 105항에 있어서, 상기 자체 인간화 RS7 항체 또는 그의 단편 또는 자체 항체 융합 단백질 또는 그의 단편은 1회 복용시 10 내지 2000 밀리그램의 단백질 복용량으로 투여되는 것임을 특징으로 하는 암 세포 치료용 조성물.
  107. 제 106항에 있어서, 상기 복용량으로 반복 투여되는 것임을 특징으로 하는 암 세포 치료용 조성물.
  108. 삭제
  109. 제 99항에 있어서, 상기 자체 인간화 RS7 항체의 불변영역 및 힌지(hinge)영역은 인간 IgG1의 불변영역 및 힌지영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 암 세포 치료용 조성물.
  110. 제 99항에 있어서, 상기 자체 인간화 RS7 항체 또는 그의 단편 또는 자체 항체 융합 단백질 또는 그의 단편은 악성종양에 의해 발현된 이차 종양 표지와 반응하는 이차 자체 항체 또는 그의 단편이 대상에 투여되기 전, 동시, 또는 후에 투여되는 것을 특징으로 하는 암 세포 치료용 조성물.
  111. 제 99항에 있어서, 상기 자체 인간화 RS7 항체는 치료제를 투여하기 전, 동시, 또는 후에 투여되는 것임을 특징으로 하는 암 세포 치료용 조성물.
  112. 삭제
  113. 제 1항, 제 8항 내지 제 11항 및 제 14항 중 어느 한 항의 자체 인간화 RS7 항체 또는 그의 단편 또는 제 44항 내지 제 48항 중 어느 한 항의 자체 항체 융합 단백질 또는 그의 단편을 포함하는 성분을 이용하여 대상으로부터 얻은 검체에 대하여 시험관 진단 분석을 수행하는 것을 포함하며, 상기 단편이 인간화 RS7 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는, 대상에서의 악성종양의 진단 방법.
  114. 제 113항에 있어서, 상기 악성종양은 암종(carcinoma)임을 특징으로 하는 방법.
  115. 제 114항에 있어서, 상기 암종은 머리 및 목, 폐, 전립선, 난소, 흉부, 결장, 위, 및 방광암의 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
  116. 제 113항에 있어서, 상기 시험관 진단 분석법은 면역분석법(immunoassay), RT-PCR 및 면역조직화학법(immunohistochemistry)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 방법.
  117. 제 116항에 있어서, 상기 시험관 진단 분석은 RT-PCR 또는 면역분석법(immunoassay)임을 특징으로 하는 방법.
  118. 제 117항에 있어서, 상기 검체는 체액 또는 조직임을 특징으로 하는 방법.
  119. 제 116항에 있어서, 상기 진단 분석법은 면역조직화학법(immunohistochemistry)임을 특징으로 하는 방법.
  120. 제 119항에 있어서, 상기 검체는 세포 또는 조직임을 특징으로 하는 방법.
  121. 삭제
  122. 삭제
  123. 삭제
  124. 제 39항에 의한 하나 이상의 항체를 포함하는 진단제, 치료제 또는 이들의 조합을 포함하며, 세포상에서 RS7 표적 항원을 표적화(targeting)하기 위한 조성물.
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