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WO2020196474A1 - 抗体－ピロロベンゾジアゼピン誘導体コンジュゲート - Google Patents

抗体－ピロロベンゾジアゼピン誘導体コンジュゲート Download PDF

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Publication number
WO2020196474A1
WO2020196474A1 PCT/JP2020/012883 JP2020012883W WO2020196474A1 WO 2020196474 A1 WO2020196474 A1 WO 2020196474A1 JP 2020012883 W JP2020012883 W JP 2020012883W WO 2020196474 A1 WO2020196474 A1 WO 2020196474A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
antibody
amino acid
seq
acid sequence
drug conjugate
Prior art date
Application number
PCT/JP2020/012883
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
戸田　成洋
悠介 太田
史尚 土居
目黒　正規
早川　市郎
真二 蘆田
剛 益田
隆 中田
Original Assignee
第一三共株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 第一三共株式会社 filed Critical 第一三共株式会社
Priority to KR1020217033847A priority Critical patent/KR20210143237A/ko
Priority to EP20777744.2A priority patent/EP3950061A4/en
Priority to US17/442,605 priority patent/US20220168440A1/en
Priority to JP2021509430A priority patent/JP7627655B2/ja
Priority to CN202080024397.1A priority patent/CN113631229A/zh
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    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
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    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Definitions

  • the present invention relates to an antibody-drug conjugate useful as an antitumor drug, in which an antibody capable of targeting tumor cells and a pirorobenzodiazepine derivative are bound via a linker structural portion.
  • ADC Antibody-Drug Conjugate
  • ADC is used in cancer treatment and the like. For example, it binds to an antigen expressed on the surface of cancer cells, and the binding causes the antigen to be intracellular.
  • a drug having cytotoxic activity is bound to an antibody that can be converted.
  • the ADC can be expected to accumulate the drug in the cancer cell and kill the cancer cell by being able to efficiently deliver the drug to the cancer cell.
  • One of the useful drugs used in ADC is pirorobenzodiazepine (PBD).
  • PBD exhibits cytotoxicity by binding to the PuGPu sequence of the DNA groove. Anthramycin, a naturally occurring PBD, was first discovered in 1965, and since then, various naturally occurring PBDs and their analogs have been discovered (Non-Patent Documents 1 to 4).
  • the general structural formula of PBD is as follows
  • CLDN6 Human CLDN6 (Claudin-6, hereinafter referred to as hCLDN6) is a member of the Claudin (CLDN) family of proteins and is a 4-transmembrane protein consisting of 220 amino acid residues. It has long been suggested that hCLDN6 is overexpressed in some cancers and is an attractive cancer therapeutic target (Non-Patent Documents 7-9). In addition, since CLDN family proteins are taken up into cells by endocytosis and family proteins with short turnover times have been reported (Non-Patent Document 10), they are considered to be suitable targets for antibody-drug conjugates (ADCs). Be done.
  • ADCs antibody-drug conjugates
  • Patent Documents 16 and 17 monoclonal antibodies that specifically recognize hCLDN6 have been discovered (Patent Documents 16 and 17), and tubulin polymerization inhibitors have been added to CLDN6-specific monoclonal antibodies.
  • Monomethylauristatin E (MMAE) and Maytansinoid (DM1) -conjugated ADCs have been reported (Non-Patent Document 11).
  • an antibody that recognizes multiple CLDN families binds pirorobenzodiazepine (PBD), which has a strong cell-killing effect, to an antibody that recognizes CLDN6 and CLDN9 (Patent Document 18) because it may expand the scope of treatment.
  • PBD pirorobenzodiazepine
  • the ADC used is also disclosed (Patent Document 19).
  • the strength of their activity is still insufficient, and there is an unsatisfied medical need for hCLDN6 as a therapeutic target.
  • the present invention provides a novel antibody-pyrorobenzodiazepine (PBD) derivative conjugate and a novel pirorobenzodiazepine (PBD) derivative.
  • PBD novel antibody-pyrorobenzodiazepine
  • PBD novel pirorobenzodiazepine
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition containing the antibody-PBD derivative conjugate having antitumor activity. Furthermore, the present invention provides a method for treating cancer using the antibody-PBD derivative conjugate.
  • the present inventors have found that a novel antibody-pyrorobenzodiazepine (PBD) derivative conjugate has strong antitumor activity. It was also found that the absolute configuration of the hydroxyl group at the 11'position of the pyrrolodiazepine derivative in the conjugate is the S configuration.
  • the present invention has been completed based on the above findings. That is, the present invention relates to the following.
  • m 1 indicates an integer of 1 or 2
  • D is one of the following groups
  • the asterisk * indicates that it is bound to L
  • L is a linker that links D with a sugar chain that binds to a sugar chain (N297 sugar chain) that binds to Asn297 of Ab.
  • N297 glycans may be remodeled
  • Ab indicates an antibody or a functional fragment of the antibody.
  • B is a 1,4-phenyl group, a 2,5-pyridyl group, a 3,6-pyridyl group, a 2,5-pyrimidyl group or a 2,5-thienyl group.
  • Show, Z 2 has the following structural formula
  • Show, Z 3 has the following structural formula
  • N297 sugar chain is either N297- (Fuc) MSG1, N297- (Fuc) MSG2 or a mixture thereof, or N297- (Fuc) SG having a structure represented by the following formula.
  • the antibody-drug conjugate according to any one of [1] to [5];
  • L (PEG) in the N297 sugar chain indicates *-(CH 2 CH 2 -O) n 5 --CH 2 CH 2 -NH-.
  • n 5 indicates that it is an integer of 2 to 5
  • the amino group at the right end is the non-reducing end on the 1-3 chain side or / and the 1-6 chain side of the ⁇ -Man branched chain of the N297 sugar chain. It is bonded to the carboxylic acid at the 2-position of sialic acid via an amide bond, and the leftmost asterisk * is bonded to the nitrogen atom at the 1- or 3-position on the triazole ring of Z 1 in L. Shown.
  • N297 sugar chain is N297- (Fuc) MSG1, N297- (Fuc) MSG2 or a mixture thereof, or N297- (Fuc) SG having a structure represented by the following formula.
  • the wavy line indicates that it is bound to the antibody Asn297
  • L (PEG) in the N297 sugar chain indicates that it is *-(CH 2 CH 2 -O) 3- CH 2 CH 2 -NH-.
  • the amino group at the right end is via an amide bond with the carboxylic acid at the 2-position of the non-reducing terminal sialic acid on the 1-3 chain side or / and the 1-6 chain side of the ⁇ -Man branched chain of the N297 sugar chain.
  • the asterisk * at the left end indicates that it is bound to the nitrogen atom at the 1st or 3rd position on the triazole ring in the above structural formula).
  • N297 sugar chain is N297- (Fuc) MSG1, N297- (Fuc) MSG2 or a mixture thereof, or N297- (Fuc) SG having a structure represented by the following formula.
  • the wavy line indicates that it is bound to the antibody Asn297
  • L (PEG) in the N297 sugar chain indicates that it is *-(CH 2 CH 2 -O) 3- CH 2 CH 2 -NH-.
  • the amino group at the right end is via an amide bond with the carboxylic acid at the 2-position of the non-reducing terminal sialic acid on the 1-3 chain side or / and the 1-6 chain side of the ⁇ -Man branched chain of the N297 sugar chain.
  • the asterisk * at the left end indicates that it is bound to the nitrogen atom at the 1st or 3rd position on the triazole ring in the above structural formula).
  • N297 sugar chain is N297- (Fuc) MSG1, N297- (Fuc) MSG2 or a mixture thereof, or N297- (Fuc) SG having a structure represented by the following formula.
  • the wavy line indicates that it is bound to the antibody Asn297
  • L (PEG) in the N297 sugar chain indicates that it is *-(CH 2 CH 2 -O) 3- CH 2 CH 2 -NH-.
  • the amino group at the right end is via an amide bond with the carboxylic acid at the 2-position of the non-reducing terminal sialic acid on the 1-3 chain side or / and the 1-6 chain side of the ⁇ -Man branched chain of the N297 sugar chain.
  • the asterisk * at the left end indicates that it is bound to the nitrogen atom at the 1st or 3rd position on the triazole ring in the above structural formula).
  • N297 sugar chain is N297- (Fuc) MSG1, N297- (Fuc) MSG2 or a mixture thereof, or N297- (Fuc) SG having a structure represented by the following formula.
  • the wavy line indicates that it is bound to the antibody Asn297
  • L (PEG) in the N297 sugar chain indicates that it is *-(CH 2 CH 2 -O) 3- CH 2 CH 2 -NH-.
  • the amino group at the right end is via an amide bond with the carboxylic acid at the 2-position of the non-reducing terminal sialic acid on the 1-3 chain side or / and the 1-6 chain side of the ⁇ -Man branched chain of the N297 sugar chain.
  • the asterisk * at the left end indicates that it is bound to the nitrogen atom at the 1st or 3rd position on the triazole ring in the above formula).
  • Antibodies are anti-CLDN6 antibody, anti-CLDN9 antibody, anti-CLDN6 / CLDN9 antibody, anti-HER2 antibody, anti-HER3 antibody, anti-DLL3 antibody, anti-FAP antibody, anti-CDH11 antibody, anti-A33 antibody, anti-CanAg antibody, anti-CD19.
  • the antibody-drug conjugate according to any one of [1] to [14], which is an antibody, an anti-5T4 antibody, an anti-LRRC15 antibody, an anti-DR5 antibody, an anti-CDH3 antibody, an anti-PDPN antibody, or an anti-CD123 antibody.
  • Antibody-drug conjugate (A) From CDRH1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9, CDRH2 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10, CDRH3 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5.
  • CDRL1, CDRL2 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6, the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7, or CDRL3 consisting of an amino acid sequence in which one or two amino acids are substituted in the amino acid sequence, or (B) From CDRH1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15, CDRH2 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16, CDRH3 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12.
  • CDRL1, CDRL2 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13, and CDRL3 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 14.
  • CDRL1, CDRL2 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6, CDRL3 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7 or the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8, or (B) From CDRH1 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 15, CDRH2 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 16, CDRH3 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 17, and the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 12.
  • CDRL1, CDRL2 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13, and CDRL3 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 14.
  • a heavy chain variable region consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of the following (a) to (e), and a light chain variable region consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of (f) to (k).
  • C The amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 62,
  • D Amino acid sequences having at least 95% or more homology to the sequences of framework regions other than each CDR sequence in the sequences of (a) to (c).
  • (E) Amino acid sequences in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the sequences of framework regions other than each CDR sequence in the sequences of (a) to (c).
  • (F) The amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 38, (G) The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 42, (H) The amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 46, (I) The amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 50, (J) Amino acid sequences having at least 95% or more homology to the sequences of framework regions other than each CDR sequence in the sequences of (f) to (i), and (K) An amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the sequence of the framework region other than each CDR sequence in the sequences of (f) to (i).
  • (C) A heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 54 and a light chain variable region consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 46.
  • (D) A heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 58, a light chain variable region consisting of the light chain variable region consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 50, and a light chain variable region.
  • (E) A heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 62 and a light chain variable region consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 46.
  • (C) A heavy chain consisting of the amino acid sequences set forth in amino acid numbers 20 to 471 of SEQ ID NO: 52 and a light chain consisting of the amino acid sequences set forth in amino acid numbers 21 to 234 of SEQ ID NO: 44.
  • (D) A heavy chain consisting of the amino acid sequences of amino acid numbers 20 to 471 of SEQ ID NO: 56, a light chain consisting of the amino acid sequences of amino acid numbers 21 to 234 of SEQ ID NO: 48
  • (E) A heavy chain consisting of the amino acid sequences set forth in amino acid numbers 20 to 471 of SEQ ID NO: 60 and a light chain consisting of the amino acid sequences set forth in amino acid numbers 21 to 234 of SEQ ID NO: 44.
  • the antibody competes with the antibody according to any one of [17] to [21] and [25] in binding to CLDN6 and / or CLDN9, or [17] to [21]. And the antibody-drug conjugate according to [16] that binds to a site on CLDN6 and / or CLDN9 recognized by the antibody according to any one of [25].
  • ADCC antibody-dependent cellular cytotoxicity
  • CDC complement-dependent cellular cytotoxicity
  • the heavy chain constant region of the antibody is the heavy chain constant region of human IgG1, and the leucines at positions 234 and 235 indicated by the EU Index are replaced with alanine in the heavy chain constant region, [29].
  • Drug conjugate is a humanized monoclonal antibody comprising a heavy chain consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 65 and a light chain consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 64.
  • a humanized monoclonal antibody comprising a heavy chain consisting of the amino acid sequences set forth in amino acid numbers 20 to 469 of SEQ ID NO: 75 and a light chain consisting of the amino acid sequences of amino acid numbers 21 to 234 of SEQ ID NO: 73.
  • the antibody-drug conjugate according to any one of [27], [29], [30] and [32].
  • the antibody is N-linked glycosylation, O-linked glycosylation, N-terminal processing, C-terminal processing, deamidation, aspartic acid isomerization, methionine oxidation, methionine at N-terminal.
  • Step i) Treat the antibody obtained in step i) with a hydrolase to produce (Fuc ⁇ 1,6) GlcNAc-antibody, and iii) A sugar chain donor molecule obtained by introducing a PEG linker having an azide group into the carbonyl group of the carboxylic acid at the 2-position of sialic acid in MSG (9) or SG (10) and oxazolylating the reducing end, and a sugar transfer.
  • a pharmaceutical composition comprising the antibody-drug conjugate according to any one of [1] to [39] and [42] to [45], a salt thereof, or a hydrate thereof. object.
  • a pharmaceutical composition comprising the antibody-drug conjugate according to any one of [1] to [39] and [42] to [45], a salt thereof, or a hydrate thereof, and at least.
  • a pharmaceutical composition comprising administering one antitumor agent to an individual simultaneously, separately or continuously.
  • novel antibody-pyrorobenzodiazepine (PBD) derivative conjugate provided by the present invention has excellent antitumor activity and safety, and is therefore useful as an antitumor agent.
  • the PBD derivative of the present invention has antitumor activity and is useful as a drug for the conjugate.
  • the antibody of the present invention recognizes or binds to an antigen expressed in tumor cells, it is useful as an antibody for the conjugate.
  • FIG. 1 It is a schematic representation of the antibody-drug conjugate (molecule of (I)) of the present invention.
  • A) is drug D
  • (b) is linker L
  • (c) is N 3- L (PEG)-
  • (d) is N297 sugar chain (where the white oval is NeuAc (Sia), white six The square represents Man, the filled hexagon represents GlcNAc, the white rhombus represents Gal, and the white inverted triangle represents Fuc).
  • the alkyne structure in the azide group (black teardrop type) in (c) and the spacer (white semicircle) in (b) react to form a triazole ring.
  • the Y-shape represents antibody Ab.
  • the N297 sugar chain is displayed as N297- (Fuc) MSG for convenience, and a PEG linker (N 3- L (PEG)-) having an azide group only in one branched chain of each N297 sugar chain is used.
  • N297- (Fuc) MSG for convenience
  • PEG linker N 3- L (PEG)-
  • N297- (Fuc) SG shows an embodiment in which it has bound sialic acid and does not have sialic acid at the non-reducing end of the other branched chain
  • N297- (Fuc) SG by adopting N297- (Fuc) SG, the non-reducing end of both branched chains is used.
  • It may also have an embodiment having sialic acid to which a PEG linker having an azide group is bound. Unless otherwise stated, such labeling methods apply throughout this specification.
  • FIG. 3A shows the process of producing a uniform (Fuc ⁇ 1,6) GlcNAc-antibody (II) by treating the heterogeneous N297 sugar chain of (IV) with a hydrolase such as EndoS.
  • Figure 3B shows GlcNAc of the N297 sugar chain of antibody (II) by transferring the sugar chain of the MSG type sugar chain donor molecule to GlcNAc using a glycosyltransferase such as EndoS D233Q / Q303L mutant.
  • (III) shows the process of producing the MSG-type sugar chain remodeling antibody.
  • the MSG-type sugar chain donor molecule used here is a sialic acid at the non-reducing end of MSG modified with a PEG linker having an azide group, and the MSG-type N297 sugar chain remodeling antibody produced is also shown in the figure. As explained in 2B, the non-reducing terminal sialic acid is similarly modified.
  • MSG is displayed as a donor molecule for convenience, but by using SG (10) as a sugar chain donor, the sugar chain remodeling antibody of (III) is attached to both non-reducing ends of the N297 sugar chain.
  • a sugar chain remodeling antibody to which a linker molecule having an azide group is bound is synthesized.
  • anti-HER2-antibody-drug conjugate ADC7 or Trastuzumab-Tesirine on subcutaneously transplanted human breast cancer strain JIMT-1 cells is shown. It shows the effect of anti-CLDN6 antibody-drug conjugate ADC8 or anti-CLDN6 antibody (H1L1) -Tesirine on OV-90 cells, which are subcutaneously transplanted human ovarian cancer lines.
  • anti-CLDN6 antibody-drug conjugate ADC8 or anti-CLDN6 antibody (H1L1) -Tesirine on subcutaneously transplanted human ovarian cancer strain NIH: OVCAR-3 cells is shown.
  • the amino acid sequence of CDRL3 (SEQ ID NO: 8) of the humanized B1 antibody light chain L4 is shown.
  • the amino acid sequences of CDRH1 to 3 of the B1 antibody heavy chain (SEQ ID NOs: 9 to 11) are shown.
  • the amino acid sequences of CDRL1 to 3 of the C7 antibody light chain (SEQ ID NOs: 12 to 14) are shown.
  • the amino acid sequences of CDRH1 to 3 of the C7 antibody heavy chain SEQ ID NOs: 15 to 17 are shown.
  • the underline in the amino acid sequence indicates the CDR sequence.
  • the nucleotide sequence of the cDNA encoding the variable region of the B1 antibody heavy chain (SEQ ID NO: 20) and the amino acid sequence of the variable region of the B1 antibody heavy chain (SEQ ID NO: 21) are shown.
  • the underline in the amino acid sequence indicates the CDR sequence.
  • the nucleotide sequence of cDNA encoding the variable region of the C7 antibody light chain (SEQ ID NO: 22) and the amino acid sequence of the variable region of the C7 antibody light chain (SEQ ID NO: 23) are shown.
  • the underline in the amino acid sequence indicates the CDR sequence.
  • the nucleotide sequence of cDNA encoding the variable region of the C7 antibody heavy chain (SEQ ID NO: 24) and the amino acid sequence of the variable region of the C7 antibody heavy chain (SEQ ID NO: 25) are shown.
  • the underline in the amino acid sequence indicates the CDR sequence.
  • the amino acid sequence of chB1 light chain (SEQ ID NO: 28) and the DNA fragment containing the DNA sequence encoding the amino acid sequence of chB1 light chain (SEQ ID NO: 29) are shown.
  • the underline in the amino acid sequence indicates the CDR sequence.
  • the amino acid sequence of the variable region of chB1 light chain (SEQ ID NO: 30) and the nucleotide sequence encoding the variable region of chB1 light chain (SEQ ID NO: 31) are shown.
  • the underline in the amino acid sequence indicates the CDR sequence.
  • the amino acid sequence of the chB1 heavy chain (SEQ ID NO: 32) and the nucleotide sequence encoding the chB1 heavy chain (SEQ ID NO: 33) are shown.
  • the underline in the amino acid sequence indicates the CDR sequence.
  • the amino acid sequence of the variable region of the chB1 heavy chain (SEQ ID NO: 34) and the nucleotide sequence encoding the variable region of the chB1 heavy chain (SEQ ID NO: 35) are shown.
  • the underline in the amino acid sequence indicates the CDR sequence.
  • the amino acid sequence of the humanized antibody light chain hL1 (SEQ ID NO: 36) and the nucleotide sequence encoding the humanized antibody light chain hL1 (SEQ ID NO: 37) are shown.
  • the underline in the amino acid sequence indicates the CDR sequence.
  • the amino acid sequence of the variable region of the humanized antibody light chain hL1 (SEQ ID NO: 38) and the nucleotide sequence encoding the variable region of the humanized antibody light chain hL1 (SEQ ID NO: 39) are shown.
  • the underline in the amino acid sequence indicates the CDR sequence.
  • the amino acid sequence of the humanized antibody light chain hL2 (SEQ ID NO: 40) and the nucleotide sequence encoding the humanized antibody light chain hL2 (SEQ ID NO: 41) are shown.
  • the underline in the amino acid sequence indicates the CDR sequence.
  • the amino acid sequence of the variable region of the humanized antibody light chain hL2 (SEQ ID NO: 42) and the nucleotide sequence encoding the variable region of the humanized antibody light chain hL2 (SEQ ID NO: 43) are shown.
  • the amino acid sequence of the humanized antibody light chain hL3 (SEQ ID NO: 44) and the nucleotide sequence encoding the humanized antibody light chain hL3 (SEQ ID NO: 45) are shown.
  • the underline in the amino acid sequence indicates the CDR sequence.
  • the amino acid sequence of the variable region of the humanized antibody light chain hL3 (SEQ ID NO: 46) and the nucleotide sequence encoding the variable region of the humanized antibody light chain hL3 (SEQ ID NO: 47) are shown.
  • the underline in the amino acid sequence indicates the CDR sequence.
  • the amino acid sequence of the humanized antibody light chain hL4 (SEQ ID NO: 48) and the nucleotide sequence encoding the humanized antibody light chain hL4 (SEQ ID NO: 49) are shown.
  • the underline in the amino acid sequence indicates the CDR sequence.
  • the amino acid sequence of the variable region of the humanized antibody light chain hL4 (SEQ ID NO: 50) and the nucleotide sequence encoding the variable region of the humanized antibody light chain hL4 (SEQ ID NO: 51) are shown.
  • the underline in the amino acid sequence indicates the CDR sequence.
  • the amino acid sequence of the humanized antibody heavy chain hH1 (SEQ ID NO: 52) and the nucleotide sequence encoding the humanized antibody heavy chain hH1 (SEQ ID NO: 53) are shown.
  • the underline in the amino acid sequence indicates the CDR sequence.
  • the amino acid sequence of the variable region of the humanized antibody heavy chain hH1 (SEQ ID NO: 54) and the nucleotide sequence encoding the variable region of the humanized antibody heavy chain hH1 (SEQ ID NO: 55) are shown.
  • the underline in the amino acid sequence indicates the CDR sequence.
  • the amino acid sequence of the humanized antibody heavy chain hH2 (SEQ ID NO: 56) and the nucleotide sequence encoding the humanized antibody heavy chain hH2 (SEQ ID NO: 57) are shown.
  • the underline in the amino acid sequence indicates the CDR sequence.
  • the amino acid sequence of the variable region of the humanized antibody heavy chain hH2 (SEQ ID NO: 58) and the nucleotide sequence encoding the variable region of the humanized antibody heavy chain hH2 (SEQ ID NO: 59) are shown.
  • the amino acid sequence of the humanized antibody heavy chain hH3 (SEQ ID NO: 60) and the nucleotide sequence encoding the humanized antibody heavy chain hH3 (SEQ ID NO: 61) are shown.
  • the underline in the amino acid sequence indicates the CDR sequence.
  • the amino acid sequence of the variable region of the humanized antibody heavy chain hH3 (SEQ ID NO: 62) and the nucleotide sequence encoding the variable region of the humanized antibody heavy chain hH3 (SEQ ID NO: 63) are shown.
  • the underline in the amino acid sequence indicates the CDR sequence.
  • the binding potential of B1 antibody and C7 antibody to human CLDN6 and family molecules CLDN3, CLDN4, and CLDN9 by flow cytometry is shown.
  • the antibody internalization activity ability of B1 antibody and C7 antibody by Mab-ZAP is shown.
  • the ability of the humanized anti-CLDN6 antibodies H1L1, H2L2, H1L3, H2L4, and H3L3 to bind to CLDN6 and family molecules by flow cytometry is shown.
  • the amino acid sequence of the trastuzumab light chain (SEQ ID NO: 64) and the amino acid sequence of the heavy chain (SEQ ID NO: 65) are shown.
  • the amino acid sequence of the light chain (SEQ ID NO: 73) and the amino acid sequence of the heavy chain (SEQ ID NO: 75) of the Trastuzumab mutant are shown.
  • “ ⁇ ” Indicates the same amino acid residue as chB1_H, and the place where the amino acid residue is described indicates the substituted amino acid residue.
  • “ ⁇ ” Indicates the same amino acid residue as chB1_L, and the place where the amino acid residue is described indicates the substituted amino acid residue.
  • anti-HER2-antibody-drug conjugate ADC14 The effect of anti-HER2-antibody-drug conjugate ADC14 on JIMT-1 cells, which is a subcutaneously transplanted human breast cancer strain, is shown.
  • the antibody-drug conjugate of the present invention is an antitumor drug in which an antitumor compound is bound to an antibody capable of recognizing or binding to an antigen expressed in tumor cells via a linker structural portion.
  • the antibody-drug conjugate of the present invention has the following formula
  • m 1 is an integer of 1 or 2 (preferably 1), D is the drug, L is the linker linking the N297 sugar chain to D, Ab is the antibody or functional fragment of the antibody, and the N297 sugar chain is the antibody.
  • the sugar chain that binds to the side chain of Asn297 is shown.
  • the N297 sugar chain may be a remodeled sugar chain.
  • the drug D of the present invention is preferably an antitumor compound.
  • a part or all of the linker of the antibody-drug conjugate of the present invention is cleaved in the tumor cell and the antitumor compound portion is released to exhibit an antitumor effect.
  • the drug or PBD derivative in the antibody-drug conjugate of the present invention is, for example, any one selected from the following group.
  • the absolute configuration of the hydroxyl group at the 11'position is the S configuration.
  • the linker L of the present invention is a linker that links the N297 sugar chain and D.
  • the asterisk * indicates that it is bound to the nitrogen atom at the N10'position of drug D
  • Lb indicates the spacer that binds La to the N297 sugar chain or the remodeled N297 sugar chain.
  • B represents a phenyl group or a heteroaryl group, preferably a 1,4-phenyl group, a 2,5-pyridyl group, a 3,6-pyridyl group, a 2,5-pyrimidyl group, or a 2,5-thienyl group. Yes, more preferably a 1,4-phenyl group.
  • Lp indicates a linker consisting of an amino acid sequence that can be cleaved in vivo or in a target cell.
  • Lp is cleaved by the action of enzymes such as esterase and peptidase, for example.
  • Lp is a peptide residue composed of 2 to 7 (preferably 2 to 4) amino acids. That is, it is composed of oligopeptide residues in which 2 to 7 amino acids are peptide-bonded.
  • the bond between the C-terminal of Lp and -NH- is cleaved by an enzyme such as esterase.
  • the amino acids constituting Lp are not particularly limited, but are, for example, L- or D-amino acids, preferably L-amino acids.
  • L-amino acids amino acids having a structure such as ⁇ -alanine, ⁇ -aminocaproic acid, and ⁇ -aminobutyric acid may be used, and further, unnatural amino acids such as N-methylated amino acids may be used. There may be.
  • the amino acid sequence of Lp is not particularly limited, but the constituent amino acids include glycine (Gly; G), valine (Val; V), alanine (Ala; A), phenylalanine (Phe; F), and glutamic acid (Glu; E). , Isoleucine (Ile; I), Proline (Pro; P), Citrulin (Cit), Leucin (Leu; L), Serine (Ser; S), Lysine (Lys; K), Aspartic acid (Asp; D), etc. Can be mentioned. Of these, glycine (Gly; G), valine (Val; V), alanine (Ala; A), and citrulline (Cit) are preferable. These amino acids may overlap and have an amino acid sequence containing an arbitrarily selected amino acid. In addition, the pattern of drug release can be controlled by the type of amino acid.
  • linker Lp As a specific example of the linker Lp, -GGVA-, -GG- (D-) VA-, -VA-, -GGFG-, -GGPI-, -GGVCit-, -GGVK-, -GG (D-) PI-, -GGPL-, -EGGVA, -PI-, -GGF-, -DGGF-, (D-) D-GGF-, -EGGF-, -SGGF-, -KGGF-, -DGGFG-, -GGFGG-, -DDGGFG-, -KDGGFG-,- GGFGGGF- Can be mentioned.
  • the above "(D-) V” means D-valine
  • (D-) P” means D-proline
  • (D-) D” means D-aspartic acid.
  • the linker Lp is preferably as follows. -GGVA-, -GG- (D-) VA-, -VA-, -GGFG-, -GGPI-, -GGVCit-, -GGVK-, -GG (D-) PI-, -GGPL-
  • the linker Lp is more preferably as follows. -GGVA-, -GGVCit-, -VA-
  • n 2 is an integer of 1 to 3 (preferably 1 or 2)
  • n 3 is an integer of 1 to 5 (preferably an integer of 2 to 4, more preferably 2 or 4 -
  • the spacer of Lb is not particularly limited, and examples thereof include a spacer represented by the following equation.
  • Lb-1, Lb-2 or Lb-3 in the structure is a mixture of either one or both of these two types of structures.
  • B is a 1,4-phenyl group
  • Lp indicates one of the following groups, -GGVA-, -GG- (D-) VA-, -VA-, -GGFG-, -GGPI-, -GGVCit-, -GGVK-, -GG (D-) PI-
  • Z 2 is the structural formula shown below in Lb above:
  • B is a 1,4-phenyl group.
  • the free drug of the antibody-drug conjugate of the present invention is one selected from the following group.
  • the free drug of the present invention is produced by cleaving the linker L portion after the antibody-drug conjugate of the present invention is transferred into the tumor cell.
  • the free drug was confirmed to have an antitumor cell effect.
  • the “gene” means a nucleotide or a nucleotide sequence containing a nucleotide sequence encoding an amino acid of a protein, or a complementary strand thereof, and for example, a nucleotide sequence or a nucleotide sequence containing a nucleotide sequence encoding an amino acid of a protein.
  • the complementary strands such as polynucleotides, oligonucleotides, DNAs, mRNAs, cDNAs, and RNAs are included in the meaning of "gene”.
  • Examples of the “CLDN6 gene” of the present invention include DNA, mRNA, cDNA, cRNA and the like containing a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the CLDN6 protein.
  • “nucleotide”, “polynucleotide” or “nucleotide sequence” and “nucleic acid” are synonymous, and for example, DNA, RNA, probe, oligonucleotide, polynucleotide, primer and the like are also “nucleotide” or “nucleotide sequence”. Is included in the meaning of.
  • polypeptide polypeptide
  • peptide and “protein” are used without distinction.
  • “CLDN6” is used interchangeably with the CLDN6 protein.
  • the "cell” also includes cells in an individual animal and cultured cells.
  • cytodamaging activity means causing pathological changes in cells in some way, and is not limited to direct trauma, but also breaks DNA, forms dimers of bases, and forms chromosomes. It refers to causing any structural or functional damage to cells such as cleavage, damage to cell division devices, and decreased activity of various enzymes.
  • the "functional fragment of an antibody” is also called an "antigen-binding fragment of an antibody” and means a partial fragment of an antibody having an antigen-binding activity, Fab, F (ab') 2 , Fv, scFv, diabody, linear antibody, multispecific antibody formed from antibody fragment, etc.
  • Fab' which is a monovalent fragment of the variable region of the antibody obtained by treating F (ab') 2 under reducing conditions, is also included in the antigen-binding fragment of the antibody.
  • it is not limited to these molecules as long as it has the ability to bind to an antigen.
  • these antigen-binding fragments include not only full-length molecules of antibody proteins treated with an appropriate enzyme, but also proteins produced in an appropriate host cell using a genetically modified antibody gene. Is done.
  • the functional fragment of the present invention retains asparagine (Asn297) modified by a well-conserved N-linked sugar chain in the Fc region of the IgG heavy chain and the amino acids around it, and has the ability to bind to an antigen. Contains functional fragments that are
  • the "epitope” means a partial peptide or partial three-dimensional structure (for example, a partial peptide or partial three-dimensional structure of CLDN6) of an antigen to which a specific antibody (for example, an anti-CLDN6 antibody) binds.
  • the epitope of the partial peptide eg, partial peptide of CLDN6 can be determined by methods well known to those skilled in the art, such as immunoassays.
  • CDR in the present invention means a complementarity determining region (CDR). It is known that the heavy chain and the light chain of the antibody molecule each have three CDRs. CDRs, also called hypervariable regions, are sites within the variable regions of the heavy and light chains of antibodies that have particularly high variability in the primary structure, and are the polypeptide chains of the heavy and light chains. In the primary structure, each is separated into three places.
  • the CDR of the antibody is referred to as CDRH1, CDRH2, and CDRH3 from the amino-terminal side of the heavy chain amino acid sequence
  • CDRL1 from the amino-terminal side of the light chain amino acid sequence.
  • CDRL2 CDRL3.
  • hybridizing under stringent conditions means hybridizing at 68 ° C. in a commercially available hybridization solution ExpressHyb Hybridization Solution (Clontech), or using a filter on which DNA is fixed. After hybridization at 68 ° C. in the presence of 7-1.0 M NaCl, a 0.1-2-fold concentration SSC solution (1-fold concentration SSC consists of 150 mM NaCl and 15 mM sodium citrate) was used. Hybridization under conditions that can be identified by washing at 68 ° C or equivalent.
  • “1 to several” means 1 to 10, 1 to 9, 1 to 8, 1 to 7, 1 to 6, 1 to 5, 1 to 4, 1 to 1. Means 3 or 1-2 pieces.
  • antibodies that recognize or bind to CLDN6 or CLDN6 and CLDN9 may be labeled as "anti-CLDN6 antibody” and "anti-CLDN6 / CLDN9 antibody”, respectively.
  • Such antibodies include chimeric antibodies, humanized antibodies, human antibodies and the like.
  • Antibodies that recognize or bind to CLDN6 and CLDN9 may be labeled as "anti-CLDN6 antibodies”.
  • the antibody used in the antibody-drug conjugate of the present invention means an immunoglobulin and is a molecule containing an antigen-binding site that immunospecifically binds to an antigen.
  • the antibody of the present invention may be in any class of IgG, IgE, IgM, IgD, IgA and IgY, but IgG is preferable. Further, the subclass may be any of IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 and IgA2, but IgG1, IgG2 and IgG4 are preferable.
  • the effector function can be adjusted by substituting a part of amino acid residues in the constant region (see WO88 / 07089, WO94 / 28027, WO94 / 29351).
  • the effector function can be adjusted by substituting a part of the amino acid residue in the constant region.
  • IgG1 mutant having reduced or attenuated effector function include IgG1 LALA (IgG1-L234A, L235A), IgG1 LAGA (IgG1-L235A, G237A), and the like, preferably IgG1 LALA.
  • the L234A and L235A are ranked 234th and 235th specified by the EU index (Proc.Natl.Acad.Sci.USA, Vol.63, No.1 (May15,1969), pp.78-85).
  • Leucine substitution for alanine, G237A indicates substitution of glycine at position 237 for alanine, as identified by the EU index.
  • the antibody of the present invention may be derived from any species, but preferably humans, rats, mice and rabbits can be exemplified. If it is derived from a species other than human, it is preferably chimeric or humanized using well-known techniques.
  • the antibody of the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, but a monoclonal antibody is preferable.
  • Monoclonal antibodies include non-human animal-derived monoclonal antibodies such as rat antibodies, mouse antibodies, rabbit antibodies, chimeric antibodies, humanized antibodies, human antibodies, functional fragments thereof, or modifications thereof.
  • the antibody of the present invention is preferably an antibody that can target tumor cells, that is, an antibody that binds to an antigen expressed on the surface of tumor cells. Since the antibody-drug conjugate of the present invention binds a compound exhibiting an antitumor effect, it is preferable, but not essential, that the antibody itself has an antitumor effect. For the purpose of specifically and selectively exerting the cytotoxicity of an antitumor compound in tumor cells, it is important and preferable that the antibody has the property of being internalized and transferred into the tumor cells. Upon internalization of the antibody, the antibody-drug conjugate can also translocate into the cell.
  • the antitumor activity of an antibody refers to cytotoxic activity and anticellular effect on tumor cells. Antitumor activity can be confirmed using a known in vitro or in vivo evaluation system. The internalization ability of an antibody can be measured by a known evaluation system. Examples of such antibodies include antibodies against tumor-related antigens, such as anti-CLDN6 antibody, anti-CLDN9 antibody, anti-CLDN6 / CLDN9 antibody, anti-HER2 antibody, anti-HER3 antibody, anti-DLL3 (Delta like protein3) antibody, and anti-A33 antibody.
  • tumor-related antigens such as anti-CLDN6 antibody, anti-CLDN9 antibody, anti-CLDN6 / CLDN9 antibody, anti-HER2 antibody, anti-HER3 antibody, anti-DLL3 (Delta like protein3) antibody, and anti-A33 antibody.
  • Anti-CanAg antibody anti-CD19 antibody, anti-CD20 antibody, anti-CD22 antibody, anti-CD25 antibody, anti-CD30 antibody, anti-CD33 antibody, anti-CD37 antibody, anti-CD56 antibody, anti-CD70 antibody, anti-CD98 antibody, anti-B7-H3 (CD276)
  • Antibody anti-TROP2 antibody, anti-CEA antibody, anti-Cripto antibody, anti-EphA2 antibody, anti-FGFR2 antibody (WO201315206 etc.), anti-G250 antibody, anti-MUC1 antibody (WO2011012309 etc.), anti-GPNMB antibody, anti-Integrin antibody, anti-PSMA antibody , Anti-Tenascin-C antibody, Anti-SLC44A4 antibody, Anti-Mesothelin antibody, Anti-EGFR antibody, Anti-5T4 (oncofetal antigen 5T4; also TPBG and trophoblast glycoprotein) antibody, Anti-LRRC15 (Leucine-rich repeat-containing protein 15) antibody,
  • the antibody of the present invention is preferably an anti-CLDN6 antibody, an anti-CLDN6 / CLDN9 antibody, an anti-HER2 antibody, an anti-CD98 antibody, an anti-TROP2 antibody, and more preferably an anti-CLDN6 antibody or an anti-HER2 antibody (for example, Trastuzumab, Trastuzumab mutation). Body).
  • the anti-CLDN6 antibody used in the present invention will be described below.
  • CLDN6 and CLDN9 CLDN6 is a 220-amino acid transmembrane protein belonging to the Claudin family, which has an N-terminal and a C-terminal inside the cell.
  • the amino acid sequence and DNA sequence of human CLDN6 are published on public databases, and can be referred to by accession numbers such as NP_067018 (SEQ ID NO: 1) and NM_021195 (SEQ ID NO: 2 (both NCBI)).
  • accession numbers such as NP_067018 (SEQ ID NO: 1) and NM_021195 (SEQ ID NO: 2 (both NCBI)).
  • the extracellular region consists of the extracellular domain (EC1) consisting of amino acid numbers 29 to 81 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, and amino acid numbers 138 to 160.
  • CLDN9 is a 4-transmembrane protein consisting of 217 amino acids belonging to the Claudin family, and has an N-terminal and a C-terminal inside the cell. CLDN9 has a high degree of homology with CLDN6.
  • accession numbers such as NP_066192 (SEQ ID NO: 3) and NM_020982 (SEQ ID NO: 4) (both NCBI).
  • Anti-CLDN6 antibody As an example of the anti-CLDN6 antibody of the present invention, it consists of two extracellular regions, the amino acid sequence 29 to 81 from the N-terminal of CLDN6 shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, and the amino acid sequence 138 to 160. Anti-CLDN6 antibodies that recognize higher-order structures and have endogenous activity can be mentioned.
  • the anti-CLDN6 antibody of the present invention is an antibody capable of targeting tumor cells, that is, it has a property of being able to recognize tumor cells, a property of being able to bind to tumor cells, and a property of being taken up and internalized in tumor cells. Therefore, the anti-CLDN6 antibody of the present invention and a compound having antitumor activity can be bound via a linker to form an antibody-drug conjugate.
  • the anti-CLDN6 antibody of the present invention may have antitumor activity.
  • the anti-CLDN6 antibody of the present invention has the following characteristics (a) and (b); (A) Recognize or combine the CLDN family.
  • the antibodies of the invention recognize the CLDN family. In other words, the antibodies of the invention bind to the CLDN family.
  • the antibody of the present invention preferably binds to CLDN6, and more preferably specifically to CLDN6.
  • the antibodies of the invention may recognize or bind to CLDN9.
  • "specific recognition" that is, “specific binding” means a binding that is not a non-specific adsorption.
  • a dissociation constant hereinafter referred to as “KD” can be given.
  • the KD value of the suitable antibody of the present invention for CLDN6 and / or CLDN9 is 1 ⁇ 10 -5 M or less, 5 ⁇ 10 -6 M or less, 2 ⁇ 10 -6 M or less, or 1 ⁇ 10 -6 M or less, more preferable. Is 5 ⁇ 10 -7 M or less, 2 ⁇ 10 -7 M or less, or 1 ⁇ 10 -7 M or less.
  • the binding between the antigen and the antibody in the present invention can be measured or determined by an ELISA method, an RIA method, a Surface Plasmon Resonance (hereinafter referred to as “SPR”) analysis method, or the like.
  • SPR Surface Plasmon Resonance
  • the binding between the antigen and the antibody expressed on the cell surface can be measured by a flow sertometry method or the like.
  • the anti-CLDN6 monoclonal antibody of the present invention can be obtained by a method using a hybridoma or the like.
  • Examples of anti-CLDN6 monoclonal antibodies include mouse anti-CLDN6 antibodies B1 and C7.
  • the "B1” may be referred to as “B1 antibody” and the "C7” may be referred to as "C7 antibody”.
  • the nucleotide sequence of the heavy chain variable region of the B1 antibody is shown in SEQ ID NO: 20 in the sequence listing, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 21.
  • the nucleotide sequence of the light chain variable region of the B1 antibody is shown in SEQ ID NO: 18 in the sequence listing, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 19.
  • the CDRH1 amino acid sequence of the B1 antibody is in SEQ ID NO: 9
  • the CDRH2 amino acid sequence is in SEQ ID NO: 10
  • the CDRH3 amino acid sequence is in SEQ ID NO: 11
  • the CDRL1 amino acid sequence is in SEQ ID NO: 5
  • the CDRL2 amino acid sequence is in SEQ ID NO: In 6
  • the amino acid sequence of CDRL3 is shown in SEQ ID NO: 7.
  • the nucleotide sequence of the heavy chain variable region of the C7 antibody is shown in SEQ ID NO: 24 in the sequence listing, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 25.
  • the nucleotide sequence of the light chain variable region of the C7 antibody is shown in SEQ ID NO: 22 in the sequence listing, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 23.
  • the CDRH1 amino acid sequence of the C7 antibody is on SEQ ID NO: 15
  • the CDRH2 amino acid sequence is on SEQ ID NO: 16
  • the CDRH3 amino acid sequence is on SEQ ID NO: 17
  • the CDRL1 amino acid sequence is on SEQ ID NO: 12
  • the CDRL2 amino acid sequence is on SEQ ID NO: 12. 13
  • the amino acid sequence of CDRL3 is set forth in SEQ ID NO: 14.
  • Examples of the anti-CLDN6 antibody of the present invention include an antibody that binds to the same epitope as the B1 antibody or C7 antibody. If the antibody binds to a partial peptide or partial three-dimensional structure to which the B1 antibody or C7 antibody binds, it can be determined that the antibody binds to the same epitope as the B1 antibody or C7 antibody.
  • the specific epitope of the specific epitope It can be determined that the antibody binds to the same epitope as the anti-CLDN6 antibody, even if the sequence or structure has not been determined. When it is confirmed that the epitopes are the same, it is strongly expected that the antibody has the same antigen-binding ability, biological activity and / or internalization activity as the B1 antibody or C7 antibody.
  • the antibody of the present invention includes a genetically modified antibody artificially modified for the purpose of reducing heterologous antigenicity to humans, for example, a chimeric antibody, a humanized antibody ( Humanized) antibody, human antibody and the like are also included. These antibodies can be produced using known methods.
  • Chimeric antibody Examples of the chimeric antibody include an antibody in which the variable region and the constant region of the antibody are different from each other, for example, a chimeric antibody in which the variable region of a mouse or rat-derived antibody is bonded to a human-derived constant region.
  • the chimeric antibody derived from the mouse anti-human CLDN6 antibody B1 antibody exemplified as the chimeric antibody of the present invention is a heavy chain containing a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21 and a light chain variable shown in SEQ ID NO: 19.
  • An antibody comprising a light chain comprising a region which may have a constant region of any human origin.
  • chB1 chimeric antibody derived from the mouse anti-human CLDN6 antibody B1 antibody
  • the amino acid sequence of the chB1 antibody includes a heavy chain having an amino acid sequence consisting of the 20th to 471st amino acid residues of SEQ ID NO: 32 in the sequence listing and a light chain having an amino acid sequence consisting of 21 to 234 of SEQ ID NO: 28 in the sequence listing. Examples include antibodies.
  • the amino acid sequence consisting of the 1st to 19th amino acid residues is a signal sequence
  • the amino acid sequence consisting of the 20th to 141st amino acid residues is a heavy chain. It is a variable region
  • the amino acid sequence consisting of residues 142 to 471 is a heavy chain constant region.
  • the amino acid sequence consisting of the 1st to 20th amino acid residues is the signal sequence
  • the amino acid sequence consisting of the 21st to 127th amino acid residues is the light chain.
  • the amino acid sequence consisting of amino acid residues 128 to 234 is the light chain constant region.
  • the amino acid sequences of the heavy and light chain variable regions of the chB1 antibody are set forth in SEQ ID NO: 34 and SEQ ID NO: 30 of the Sequence Listing.
  • the heavy chain amino acid sequence of the chB1 antibody is encoded by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 33 of the Sequence Listing.
  • the nucleotide sequence consisting of the 1st to 57th nucleotides of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 33 of the sequence listing encodes the signal sequence of the chB1 antibody heavy chain, and 58 to 58 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 33 of the sequence listing.
  • the nucleotide sequence consisting of the 423rd nucleotide encodes the heavy chain variable region of the chB1 antibody
  • the nucleotide sequence consisting of the 424th to 1413th nucleotides of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 33 of the sequence listing is the heavy chain determination of the chB1 antibody. It codes a normal area.
  • the nucleotide sequence of the heavy chain variable region of the chB1 antibody is shown in SEQ ID NO: 35 of the sequence listing.
  • the light chain amino acid sequence of the chB1 antibody is encoded by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 29 of the Sequence Listing.
  • the nucleotide sequence consisting of the 26th to 85th nucleotides of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 29 of the sequence listing encodes the signal sequence of the chB1 antibody light chain, and 86 to 86 to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 29 of the sequence listing.
  • the nucleotide sequence consisting of the 406th nucleotide encodes the light chain variable region of the chB1 antibody
  • the nucleotide sequence consisting of the 407th to 727th nucleotides of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 29 of the sequence listing is the light chain constant of the chB1 antibody. It codes a normal area.
  • the nucleotide sequence of the light chain variable region of the chB1 antibody is shown in SEQ ID NO: 31 of the Sequence Listing.
  • Humanized antibody As a humanized antibody, an antibody in which only the complementarity determining region (CDR) is incorporated into a human-derived antibody (see Nature (1986) 321, p.522-525), CDR transplantation
  • CDR complementarity determining region
  • the amino acid residues of some frameworks were also transplanted into the human antibody (WO90 / 07861), and the amino acid sequences of some CDRs were obtained while maintaining the binding ability to the antigen.
  • Modified antibodies (WO2012 / 075581, WO2011 / 084496, US2018 / 0501692) can be mentioned.
  • the amino acid sequence of the CDR can be determined by a known method such as Kabat definition, Chothia definition, Abm definition, IMGT, etc., but the CDR in the present invention may be defined by any method.
  • the humanized antibody derived from the B1 antibody or C1 antibody is not limited to a specific humanized antibody as long as it retains the CDR sequences of all six types of B1 antibody or C1 antibody and has CLDN6 binding activity, and further 1 Specific as long as a humanized antibody variant in which the amino acid sequence of ⁇ several (preferably 1-2, more preferably 1) has been modified also recognizes the CLDN6 protein or has the CLDN6 protein binding activity of the antibody. Not limited to humanized antibodies.
  • Examples of the anti-CLDN6 humanized antibody of the present invention or a functional fragment thereof include, for example.
  • CDRH1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 in the sequence listing or an amino acid sequence in which 1 to several (preferably 1 to 2) amino acids of the amino acid sequence are substituted.
  • CDRH2 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 in the sequence listing or an amino acid sequence in which 1 to several (preferably 1 to 2) amino acids of the amino acid sequence are substituted
  • a heavy chain having a variable region containing CDRH3 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 of the sequence listing or an amino acid sequence in which 1 to several (preferably 1 to 2) amino acids of the amino acid sequence are substituted.
  • CDRL1 which consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing or an amino acid sequence in which one to several (preferably one or two) amino acids of the amino acid sequence are substituted.
  • CDRL2 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing or an amino acid sequence in which 1 to several (preferably 1 to 2) amino acids of the amino acid sequence are substituted, and Includes a light chain having a variable region comprising CDRL3 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 of the Sequence Listing or an amino acid sequence in which one to several (preferably one or two) amino acids of the amino acid sequence are substituted.
  • Examples thereof include an antibody that recognizes the CLDN6 protein of the present invention or retains the CLDN6 protein binding activity of the antibody, or a functional fragment of the antibody.
  • Examples of the amino acid substitution of CDR in the anti-CLDN6 humanized antibody or a functional fragment thereof include preferably one to several (preferably one or two) amino acid substitutions of the above CDRL3 in the sequence listing.
  • the CDRL3 shown in SEQ ID NO: 8 of the sequence listing in which the amino acids Nos. 4 and 5 of SEQ ID NO: 7 are substituted can be exemplified.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 54 in the sequence listing As the heavy chain variable region of the humanized antibody having CDRH, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 54 in the sequence listing, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 58 in the sequence listing, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 62 in the sequence listing.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 38 of the sequence listing As the light chain variable region of the humanized antibody having the above-mentioned CDRL, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 38 of the sequence listing, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 42 of the sequence listing, and SEQ ID NO: 46 of the sequence listing are shown.
  • the amino acid sequence and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 50 in the sequence listing can be exemplified.
  • a humanized antibody comprising a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 54 of the Sequence Listing and a light chain variable region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 38 of the Sequence Listing.
  • a humanized antibody comprising a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 58 of the Sequence Listing and a light chain variable region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 42 of the Sequence Listing.
  • a humanized antibody comprising a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 62 of the sequence listing and a light chain variable region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 46 of the sequence listing can be preferably exemplified. ..
  • humanized antibody As a full-length sequence of a humanized antibody comprising the combination of the heavy chain variable region and the light chain variable region, It comprises a heavy chain consisting of the amino acid sequences shown in amino acid numbers 20 to 471 of SEQ ID NO: 52 in the sequence listing and a light chain consisting of the amino acid sequences shown in amino acid numbers 21 to 234 of SEQ ID NO: 36 in the sequence listing.
  • Humanized antibody (H1L1) It comprises a heavy chain consisting of the amino acid sequences shown in amino acid numbers 20 to 471 of SEQ ID NO: 56 in the sequence listing and a light chain consisting of the amino acid sequences shown in amino acid numbers 21 to 234 of SEQ ID NO: 40 in the sequence listing.
  • Humanized antibody (H2L2), It comprises a heavy chain consisting of the amino acid sequences shown in amino acid numbers 20 to 471 of SEQ ID NO: 52 in the sequence listing and a light chain consisting of the amino acid sequences shown in amino acid numbers 21 to 234 of SEQ ID NO: 44 in the sequence listing.
  • Humanized antibody (H1L3) It comprises a heavy chain consisting of the amino acid sequences shown in amino acid numbers 20 to 471 of SEQ ID NO: 56 in the sequence listing and a light chain consisting of the amino acid sequences shown in amino acid numbers 21 to 234 of SEQ ID NO: 48 in the sequence listing.
  • Humanized antibody or It comprises a heavy chain consisting of the amino acid sequences shown in amino acid numbers 20 to 471 of SEQ ID NO: 60 in the sequence listing and a light chain consisting of the amino acid sequences shown in amino acid numbers 21 to 234 of SEQ ID NO: 44 in the sequence listing.
  • a humanized antibody (H3L3) can be exemplified.
  • the amino acid sequence consisting of the 1st to 19th amino acid residues is a signal sequence, and from the 20th to 141st amino acid residues.
  • the amino acid sequence consisting of is a heavy chain variable region, and the amino acid sequence consisting of the 142nd to 471st amino acid residues is a heavy chain constant region.
  • the amino acid sequence consisting of the 1st to 20th amino acid residues is the signal sequence, and the 21st to 127th amino acid residues.
  • the amino acid sequence consisting of the light chain variable region is the light chain variable region, and the amino acid sequence consisting of the 128th to 234th amino acid residues is the light chain constant region.
  • one or two amino acids may be deleted from the carboxyl terminal of the heavy chain of the humanized antibodies H1L1, H2L2, H1L3, H2L4, and H3L3, and the deletion product is also included in the present invention.
  • the heavy chain of the deleted product include a heavy chain containing the amino acid sequences described in amino acid numbers 20 to 470 of SEQ ID NOs: 52, 56 and 60 in the sequence listing.
  • the deletion It comprises a heavy chain consisting of the amino acid sequences shown in amino acid numbers 20 to 470 of SEQ ID NO: 52 in the sequence listing and a light chain consisting of the amino acid sequences shown in amino acid numbers 21 to 234 of SEQ ID NO: 36 in the sequence listing.
  • Humanized antibody (H1L1), It comprises a heavy chain consisting of the amino acid sequences shown in amino acid numbers 20 to 470 of SEQ ID NO: 56 in the sequence listing and a light chain consisting of the amino acid sequences shown in amino acid numbers 21 to 234 of SEQ ID NO: 40 in the sequence listing.
  • Humanized antibody (H2L2) It comprises a heavy chain consisting of the amino acid sequences shown in amino acid numbers 20 to 470 of SEQ ID NO: 52 in the sequence listing and a light chain consisting of the amino acid sequences shown in amino acid numbers 21 to 234 of SEQ ID NO: 44 in the sequence listing.
  • Humanized antibody (H1L3), It comprises a heavy chain consisting of the amino acid sequences shown in amino acid numbers 20 to 470 of SEQ ID NO: 56 in the sequence listing and a light chain consisting of the amino acid sequences shown in amino acid numbers 21 to 234 of SEQ ID NO: 48 in the sequence listing.
  • a humanized antibody (H3L3) can be exemplified.
  • the nucleotide sequence encoding the heavy chain amino acid sequence of the humanized antibody H1L1 is SEQ ID NO: 53, and the nucleotide sequence encoding the light chain amino acid sequence is SEQ ID NO: 37.
  • the nucleotide sequence encoding the heavy chain amino acid sequence of the humanized antibody H2L2 is SEQ ID NO: 57, and the nucleotide sequence encoding the light chain amino acid sequence is SEQ ID NO: 41.
  • the nucleotide sequence encoding the heavy chain amino acid sequence of the humanized antibody H1L3 is SEQ ID NO: 53, and the nucleotide sequence encoding the light chain amino acid sequence is SEQ ID NO: 45.
  • the nucleotide sequence encoding the heavy chain amino acid sequence of the humanized antibody H2L4 is SEQ ID NO: 57, and the nucleotide sequence encoding the light chain amino acid sequence is SEQ ID NO: 49.
  • the nucleotide sequence encoding the heavy chain amino acid sequence of the humanized antibody H3L3 is the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 61, and the nucleotide sequence encoding the light chain amino acid sequence is the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 45.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the heavy chain variable region of the humanized antibody H1L1 is SEQ ID NO: 55, and the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the light chain variable region is SEQ ID NO: 39.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the heavy chain variable region of the humanized antibody H2L2 is SEQ ID NO: 59, and the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the light chain variable region is SEQ ID NO: 43.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the heavy chain variable region of the humanized antibody H1L3 is SEQ ID NO: 55, and the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the light chain variable region is SEQ ID NO: 47.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the heavy chain variable region of the humanized antibody H2L4 is SEQ ID NO: 59, and the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the light chain variable region is SEQ ID NO: 51.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the heavy chain variable region of the humanized antibody H3L3 is the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 63
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the light chain variable region is the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 47.
  • the nucleotide sequence consisting of the 1st to 57th nucleotides of each of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 53, 57, and 61 in the sequence listing encodes the signal sequence of the humanized antibody heavy chain, and is the 58th to 423rd.
  • nucleotide sequence consisting of nucleotides encodes the amino acid sequence of the humanized antibody heavy chain variable region
  • nucleotide sequence consisting of nucleotides of the 424th to 1413th base sequences encodes the antibody heavy chain constant region
  • nucleotide sequence consisting of the 1st to 60th nucleotides of each of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 37, 41, 45 and 49 in the sequence listing encodes the signal sequence of the humanized antibody light chain, 61 to 381.
  • nucleotide sequence consisting of the th nucleotide encodes the amino acid sequence of the humanized antibody light chain variable region
  • nucleotide sequence consisting of the 382nd to 702nd nucleotides encodes the antibody light chain constant region
  • an antibody preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 97% or more, and most preferably 99% or more is also included in the antibody of the present invention as long as it has binding activity to CLDN6.
  • it has a CDR having the same amino acid sequence as the CDR of the antibody comprising the combination of the heavy chain variable region and the light chain variable region or the antibody comprising the combination of the heavy chain and the light chain.
  • the identity or homology of the amino acid sequence excluding the amino acid sequence of the CDR of the antibody is 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 97% or more, and most preferably 99%.
  • the above-mentioned antibody is also included in the antibody of the present invention as long as it has the binding activity to CLDN6.
  • an antibody having the same biological activity as each of the above antibodies can be selected. It is possible to do.
  • a conservative amino acid substitution is preferable (WO2013154206).
  • Conservative amino acid substitutions are substitutions that occur within a group of amino acids associated with the amino acid side chain. Such amino acid substitution is preferably carried out within a range that does not deteriorate the characteristics of the substance having the original amino acid sequence.
  • the homology between the two amino acid sequences is Blast algorithm version 2.2.2 (Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A.Schaaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997). ), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402) can be determined by using the default parameters.
  • the Blast algorithm can also be used by accessing www.ncbi.nlm.nih.gov/blast on the Internet.
  • Human antibody Examples of the antibody of the present invention include a human antibody that binds to CLDN6 and / or CLDN9.
  • Anti-CLDN6 and / or CLDN9 human antibody means a human antibody having only the gene sequence of an antibody derived from a human chromosome.
  • Anti-CLDN6 human antibodies can be obtained by known methods (Nature Genetics (1997) 16, p.133-143, Nucl.Acids Res. (1998) 26, p.3447-3448, Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects, vol.10, p.69-73, Kluwer Academic Publishers, 1999., Proc. Natl.
  • the anti-HER2 antibody used in the present invention will be described below.
  • the anti-HER2 antibody of the present invention has the following properties; (1) An anti-HER2 antibody characterized by having the following characteristics; (A) It specifically binds to HER2. (B) It has an activity to be internalized in HER2-expressing cells by binding to HER2. (2) The antibody according to (1) above that binds to the extracellular domain of HER2. (3) The antibody according to (1) or (2) above, wherein the antibody is a monoclonal antibody. (4) The antibody according to any one of (1) to (3) above, which has antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) activity and / or complement-dependent cellular cytotoxicity (CDC) activity.
  • ADCC antibody-dependent cellular cytotoxicity
  • CDC complement-dependent cellular cytotoxicity
  • the antibody according to any one of (1) to (4) above which is a mouse monoclonal antibody, a chimeric monoclonal antibody or a humanized monoclonal antibody.
  • antibody The antibody according to (6) above, wherein the heavy chain constant region is the heavy chain constant region of human IgG1, and leucine at positions 234 and 235 indicated by the EU Index is replaced with alanine.
  • An antibody comprising a heavy chain consisting of the amino acid sequences set forth in amino acid numbers 20 to 469 of SEQ ID NO: 75 and a light chain consisting of the amino acid sequences of amino acid numbers 21 to 234 of SEQ ID NO: 73.
  • the antibody according to any one of 1) to (3), (5) to (7) and (9).
  • (11) The antibody according to any one of (1) to (10) above, wherein one or two amino acids are deleted at the heavy chain carboxyl terminal.
  • the antibody according to any one of (5), (8) and (11). (13) The above (1) to the above, which comprises a heavy chain consisting of the amino acid sequences set forth in amino acid numbers 20 to 468 of SEQ ID NO: 75 and a light chain consisting of the amino acid sequences set forth in amino acid numbers 21 to 234 of SEQ ID NO: 73.
  • An antibody obtained by a method for producing the antibody which comprises a step of collecting the antibody of.
  • Trastuzumab mutant an antibody in which leucine at positions 234 and 235 indicated by the EU Index of the heavy chain constant region (SEQ ID NO: 65) of trastuzumab is replaced with alanine is referred to as a Trastuzumab mutant.
  • the anti-HER2 antibody of the present invention Trastuzumab mutant 2 can be mentioned.
  • the heavy chain amino acid sequence of Trastuzumab mutant 2 is set forth in SEQ ID NO: 77, and the light chain amino acid sequence is set forth in SEQ ID NO: 76.
  • the antibody of the present invention also includes a modified version of the antibody.
  • the modified product means an antibody of the present invention that has been chemically or biologically modified.
  • Chemical modifications include the binding of chemical moieties to the amino acid backbone, chemical modifications of N-linked or O-linked carbohydrate chains, and the like.
  • Biological modifications are post-translational modifications (eg, N- or O-linked glycosylation, N-terminal or C-terminal processing, deamidation, aspartic acid isomerization, methionine oxidation). It also includes those with a methionine residue added to the N-terminal by expression using a prokaryotic host cell.
  • those labeled to enable the detection or isolation of the antibody or antigen of the present invention for example, an enzyme-labeled substance, a fluorescent-labeled substance, and an affinity-labeled substance are also included in the meaning of such modified substances.
  • Such a modified version of the antibody of the present invention is useful for improving the stability and retention of the antibody in blood, reducing the antigenicity, detecting or isolating the antibody or the antigen, and the like.
  • antibody-dependent cellular cytotoxicity can be enhanced by regulating the sugar chain modification bound to the antibody of the present invention (glycosylation, defucose, etc.).
  • WO1999 / 54342, WO2000 / 61739, WO2002 / 31140, WO2007133855, WO2013120066 and the like are known as techniques for regulating the sugar chain modification of an antibody, but the technique is not limited thereto.
  • the antibody of the present invention also includes an antibody in which the sugar chain modification has been adjusted. Such modifications may be made at any position in the antibody or functional fragment thereof, or at any desired position, with the same or two or more different modifications at one or more positions. May be good.
  • the "modified antibody fragment” also includes the "fragment of the modified antibody” in its meaning.
  • an antibody gene When an antibody gene is once isolated and then introduced into an appropriate host to prepare an antibody, a combination of an appropriate host and an expression vector can be used.
  • Specific examples of the antibody gene include a combination of a gene encoding the heavy chain sequence and the like of the antibody described in the present specification and a gene encoding the light chain sequence and the like.
  • the heavy chain sequence gene and the like and the light chain sequence gene and the like When transforming a host cell, the heavy chain sequence gene and the like and the light chain sequence gene and the like can be inserted into the same expression vector, or can be inserted into different expression vectors. It is possible.
  • animal cells, plant cells, and eukaryotic microorganisms can be used.
  • animal cells include mammalian cells, for example, monkey cells, COS cells (Cell (1981) 23, p.175-182, ATCC CRL-1650), mouse fibroblasts NIH3T3 (ATCC No. CRL-1658).
  • Chinese hamster ovary cells CHO cells, ATCC CCL-61) dihydrofolate reductase deficient strain (Proc.Natl.Acad.Sci.USA (1980) 77, p.4126-4220), FreeStyle 293F cells (Invitrogen) )
  • prokaryotic cells for example, Escherichia coli and Bacillus subtilis can be mentioned.
  • Antibodies can be obtained by introducing the antibody gene of interest into these cells by transformation and culturing the transformed cells in vitro.
  • the yield may differ depending on the sequence of the antibody, and it is possible to select an antibody having the same binding activity that is easy to produce as a drug by using the yield as an index. Therefore, the antibody of the present invention is characterized by including a step of culturing the transformed host cell and a step of collecting a target antibody or a functional fragment of the antibody from the culture obtained in the step. The antibody obtained by the method for producing the antibody is also included.
  • the antibody gene is preferably a polynucleotide containing the polynucleotide according to any one of (a) to (e) below.
  • a combination of polynucleotides encoding (B) Encodes a heavy chain amino acid sequence containing CDRH1 to CDRH3 of any one of B1 or C7 antibody, chB1 antibody, and humanized antibody H1L1, H2L2, H1L3, H2L4, H3L3, Trastuzumab and its variants.
  • Combination of polynucleotide and polynucleotide encoding light chain amino acid sequence containing CDRL1 to CDRL3 (c) B1 or C7 antibody, chB1 antibody, and humanized antibodies H1L1, H2L2, H1L3, H2L4, H3L3, Trastuzumab and their variants
  • a combination of a polynucleotide encoding a heavy chain amino acid sequence containing the amino acid sequence of the heavy chain variable region of any one of the antibodies and a polynucleotide encoding a light chain amino acid sequence containing the amino acid sequence of the light chain variable region (d) ( The amino acid sequence of an antibody that hybridizes under stringent conditions with a nucleotide consisting of a nucleotide complementary to the nucleotide according to any one of a) to (c) and binds to CDLN6 or HER2 is encoded.
  • the present invention includes a nucleotide encoding the antibody of the present invention or a functional fragment thereof or a modified product thereof, a recombinant vector into which the gene is inserted, and a cell into which the gene or the vector has been introduced.
  • the present invention also relates to a method for producing an antibody or a functional fragment thereof or a modified product thereof, which comprises a step of culturing the cells and a step of recovering the antibody or the functional fragment thereof or a modified product thereof from the culture. Including.
  • the antibody according to the present invention also includes the modified antibody and a functional fragment of the antibody, and is aidated with a deletion substance lacking one or two amino acids at the heavy chain carboxyl terminal.
  • the deletion product for example, a heavy chain in which the proline residue at the carboxyl terminal site is amidated
  • the deletion of the carboxyl end of the heavy chain of the antibody according to the present invention is not limited to the above types.
  • the two heavy chains constituting the antibody according to the present invention may be any one of the heavy chains selected from the group consisting of the full length and the above-mentioned deletion products, or a combination of the two. It may be a thing.
  • the amount ratio of each deletion substance can be affected by the type of cultured mammalian cells producing the antibody according to the present invention and the culture conditions, but the main component of the antibody according to the present invention is carboxyl on both of the two heavy chains.
  • the case where one amino acid residue at the end is deleted can be mentioned.
  • the obtained antibody can be purified uniformly.
  • the separation and purification method used for ordinary proteins may be used.
  • the antibody can be separated and purified by appropriately selecting and combining column chromatography, filter filtration, ultrafiltration, salting out, dialysis, polyacrylamide gel electrophoresis for preparation, isoelectric focusing, and the like (Strategies).
  • Protein Purification and characterization A Laboratory Course Manual, Daniel R. Marshak et al. Eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996); Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996); Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane However, it is not limited to these.
  • a hydrolase is used to excise the heterogeneous sugar chain added to the protein (antibody, etc.) leaving only the terminal GlcNAc, and then the uniform protein added with GlcNAc.
  • Prepare the portion hereinafter referred to as "acceptor”
  • an arbitrary sugar chain prepared separately is prepared (hereinafter referred to as “donor”), and the acceptor and the donor are ligated using a glycosyltransferase. This makes it possible to synthesize a uniform glycoprotein having an arbitrary sugar chain structure.
  • the "sugar chain” means a structural unit in which two or more monosaccharides are bound by a glycosidic bond.
  • Specific monosaccharides and sugar chains may be labeled as abbreviations, for example, "GlcNAc-" and "MSG-”.
  • the oxygen atom or nitrogen atom belonging to the glycosidic bond with another structural unit at the reducing end is the abbreviation representing the sugar chain, unless otherwise specified. Displayed as not included.
  • a monosaccharide as a basic unit of a sugar chain is, for convenience, in its ring structure, which is bonded to an oxygen atom constituting a ring and belongs to a hydroxyl group (or a glycosidic bond), unless otherwise specified.
  • the carbon atom directly bonded to the oxygen atom is expressed as the 1st position (2nd position only in sialic acid).
  • the name of the example compound is given as the whole chemical structure, and this rule does not necessarily apply.
  • the partial structure when linked to a sugar chain in the side chain of an amino acid is expressed in parentheses, for example, "(SG-) Asn". Shall be.
  • the antibody-drug conjugate of the present invention has the following formula.
  • antibody Ab or a functional fragment thereof is bound to L from the N297 sugar chain or the remodeled N297 sugar chain, and preferably is bound to L from the remodeled N297 sugar chain of Ab. There is.
  • the sugar chain of Ab in the present invention is an N-linked sugar chain or an O-linked sugar chain, and is preferably an N-linked sugar chain.
  • the N-linked sugar chain is bound to the amino acid side chain of the antibody by N-glycosidic bond and the O-linked sugar chain is bound to the amino acid side chain of the antibody by O-glycosidic bond.
  • IgG has an N-linked sugar chain well conserved at the 297th asparagine residue (hereinafter referred to as "Asn297 or N297") in the Fc region of the heavy chain, and contributes to the activity and kinetics of the antibody molecule. It is known to do (Biotechnol.Prog., 2012,28, 608-622, Anal.Chem., 2013,85,715-736).
  • each amino acid is specified by the Eu number (Eu INDEX).
  • Eu INDEX Eu INDEX
  • Asn297 to which an N-linked sugar chain is added in the Fc region corresponds to the 297th position in the Eu number, and even if the actual amino acid position fluctuates due to molecular fragmentation or region deletion, the Eu number Amino acids are uniquely specified by displaying with.
  • the antibody or a functional fragment thereof is bound to L from a sugar chain (hereinafter referred to as "N297 sugar chain”) that binds to the side chain of Asn297, which is more preferable.
  • N297 sugar chain a sugar chain that binds to the side chain of Asn297, which is more preferable.
  • SGP is an abbreviation for Sialyl GlycoPeptide and is a representative of N-linked complex sugar chains. From the yolk of a chicken egg, SGP can be isolated and purified, for example, according to the method described in WO2011 / 0278681. In addition, SGP refined products are commercially available (Tokyo Kasei Co., Ltd., Fushimi Pharmaceutical Co., Ltd.) and can be purchased. Disialooctasaccharide (Tokyo Kasei Co., Ltd.), which consists of only a sugar chain (hereinafter, “SG (10)”) lacking one GlcNAc at the reducing end in the sugar chain portion of SG, is commercially available.
  • the sugar chain structure in which only one of the ⁇ -Man branched chains of SG (10) lacks sialic acid at the non-reducing end is called MSG (9), and the 1-3 sugar chains of the branched chain are called MSG (9).
  • MSG1 the sugar chain structure in which only one of the ⁇ -Man branched chains of SG (10) lacks sialic acid at the non-reducing end
  • MSG9 the sugar chain structure in which only one of the ⁇ -Man branched chains of SG (10) lacks sialic acid at the non-reducing end
  • MSG (9) the sugar chain structure in which only one of the ⁇ -Man branched chains of SG (10) lacks sialic acid at the non-reducing end
  • MSG (9) the sugar chain structure in which only one of the ⁇ -Man branched chains of SG (10) lacks sialic acid at the non-reducing end
  • MSG9 the sugar chain structure in which only one of the ⁇ -Man branched chains of SG (10) lacks sialic
  • the remodeled N297 sugar chain of the present invention is N297- (Fuc) MSG1, N297- (Fuc) MSG2 or a mixture of N297- (Fuc) MSG1 and N297- (Fuc) MSG2, or N297- (Fuc) SG.
  • Yes preferably N297- (Fuc) MSG1, N297- (Fuc) MSG2 or N297- (Fuc) SG, and more preferably N297- (Fuc) MSG1 or N297- (Fuc) MSG2.
  • N297- (Fuc) MSG1 is represented by the following structural formula or sequence formula.
  • L (PEG) indicates *-(CH 2 CH 2 -O) n 5 --CH 2 CH 2 -NH-, and the amino group at the right end is the 1-3 chain side of the ⁇ -Man branched chain of the N297 sugar chain. It is bonded to the carboxylic acid at the 2-position of sialic acid at the non-reducing end via an amide bond, and the asterisk * at the left end is the 1-position on the 1,2,3-triazole ring of Lb in the linker L or It indicates that it is bonded to the nitrogen atom at the 3-position, and n 5 is an integer of 2 to 10, preferably an integer of 2 to 5.
  • N297- (Fuc) MSG2 is represented by the following structural formula or sequence formula.
  • L (PEG) indicates *-(CH 2 CH 2 -O) n 5 --CH 2 CH 2 -NH-, and the amino group at the right end is the 1-6 chain side of the ⁇ -Man branched chain of the N297 sugar chain. It is bonded to the carboxylic acid at the 2-position of sialic acid at the non-reducing end via an amide bond, and the asterisk * at the left end is the 1-position or 3 on the 1,2,3-triazole ring of Lb in the linker L. It indicates that it is bonded to the nitrogen atom at the position, and n 5 is an integer of 2 to 10, preferably an integer of 2 to 5.
  • N297- (Fuc) SG is represented by the following structural formula or sequence formula.
  • the wavy line indicates that it is bound to the antibody Asn297.
  • L (PEG) indicates *-(CH 2 CH 2 -O) n 5 --CH 2 CH 2 -NH-, and the amino group at the right end is the 1-3 chain side of the ⁇ -Man branched chain of the N297 sugar chain. It is bound to the carboxylic acid at the 2-position of sialic acid at both non-reducing ends on the 1-6 chain side via an amide bond, and the leftmost asterisk * is 1,2,3- of Lb in the linker L. It indicates that it is bonded to the nitrogen atom at the 1st or 3rd position on the triazole ring, and n 5 is an integer of 2 to 10, preferably an integer of 2 to 5.
  • N297 sugar chain of the antibody in the antibody-drug conjugate of the present invention is N297- (Fuc) MSG1 or N297- (Fuc) MSG2 or a mixture thereof
  • the antibody is a dimer and therefore the antibody-drug conjugate.
  • ADC5 is the case where the N297 sugar chain is N297- (Fuc) MSG1.
  • N297 sugar chain of the antibody in the antibody-drug conjugate of the present invention is N297- (Fuc) SG
  • the N297 sugar chain is preferably N297- (Fuc) MSG1 or N297- (Fuc) MSG2 or N297- (Fuc) SG, and more preferably N297- (Fuc) MSG1 or N297- (Fuc) MSG2. , Most preferably N297- (Fuc) MSG1.
  • N297 sugar chain of the antibody in the antibody-drug conjugate of the present invention is N297- (Fuc) MSG1 or N297- (Fuc) MSG2 or N297- (Fuc) SG, a uniform quality ADC can be obtained. ..
  • the present invention provides a method for producing a sugar chain remodeling antibody or a functional fragment of the antibody, which comprises the following steps i) to iii). i) A step of culturing the above-mentioned host cells (for example, animal cells (CHO cells, etc.)) and collecting the desired antibody from the obtained culture. ii) Step i) Treat the antibody obtained in step i) with a hydrolase to produce an antibody ((Fuc ⁇ 1,6) GlcNAc-antibody) whose N297 sugar chain is (Fuc ⁇ 1,6) GlcNAc (Fig. 3A).
  • the reaction solution is further purified by a step including purification with a hydroxyapatite column to purify the (Fuc ⁇ 1,6) GlcNAc-antibody, and iii)
  • a PEG linker- (N 3- L (PEG)) having an azide group is introduced into the carbonyl group of the carboxylic acid at the 2-position of sialic acid in MSG (9) or SG (10), and the reducing end is oxazoline.
  • the present invention also includes a sugar chain remodeling antibody obtained by such a production method, a functional fragment thereof, or a modified product thereof.
  • the production intermediate of the antibody-drug conjugate has an alkyne structure that reacts with an azide group such as DBCO (Dibenzocyclooctyne) (see Example 2-1 and Compound 3-14). Therefore, the MSG1, MSG2 or SG type sugar chain remodeling antibody or the antibody in which the PEG linker having an azide group is introduced into the sialic acid of the sugar chain obtained in the steps i) to iii) of the production intermediate is introduced.
  • the antibody-drug conjugate of the present invention can be produced by reacting with the functional fragment of.
  • glcNAc- (Fuc ⁇ 1,6) GlcNAc) with fucose added at the reducing end is derived from an antibody produced in animal cells, and the sugar chain on the non-reducing end side is the MSG described above. (MSG1, MSG2) or those remodeled into a sugar chain structure similar to SG are preferable.
  • the carboxylic acid bonded to the 2-position of sialic acid at the non-reducing end is used to bind to L (PEG).
  • Such a sugar chain remodeling antibody having MSG (MSG1, MSG2) or SG type N297 sugar chain can be produced by the method shown in FIG.
  • the N297 sugar chain has an N-linked sugar chain structure with fucose added as a basic structure.
  • EndoS As the enzyme used for the hydrolysis reaction of the N297 sugar chain, EndoS or a mutant enzyme retaining its hydrolysis activity can be used.
  • a sugar chain donor molecule having MSG (MSG1, MSG2) is adopted as the sugar chain.
  • MSG1, MSG2 a sugar chain donor molecule having MSG
  • Such a sugar chain is prepared in Example 3 using commercially available monosialo-Asn free (1S2G / 1G2S-10NC-Asn, GlyTech Research Institute Co., Ltd., hereinafter referred to as "(MSG-) Asn") as a raw material.
  • (MSG-) Asn1 or (MSG2-) Asn can be used separately according to the described method, or can be used as a mixture without separation.
  • a sugar chain donor molecule having SG (10) as a sugar chain is used for this glycosylation reaction.
  • an SG (10) sugar chain for example, one obtained from SGP by hydrolysis or the like may be used, and an SG (10) sugar such as commercially available disialo octasaccharide (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) may be used. Chains may be used.
  • the MSG (MSG1, MSG2) or SG-type sugar chain contained in the donor molecule has a PEG linker (N 3- L (PEG)) containing an azide group at the 2-position of its sialic acid.
  • GlcNAc at the reducing end of MSG (MSG1, MSG2) or SG type sugar chain contained in the donor molecule is, for example, oxazolined by 2-chloro-1,3-dimethyl-1H-benzimidazole-3-ium-chloride treatment. It is preferable to use one that has been activated in a similar manner (J. Org. Chem., 2009, 74 (5), 2210-2212).
  • EndoS D233Q is a variant in which the hydrolysis reaction is suppressed by substituting with Gln.
  • the glycosyl rearrangement reaction using EndoS D233Q is described in WO2013 / 120066 and the like.
  • a modified enzyme such as EndoS D233Q / Q303L in which a mutation is further added to EndoS D233Q may be used.
  • the purification operation of an antibody after sugar chain remodeling (sugar hydrolysis and sugar chain transfer reaction) of the antibody is aimed at separation from the low molecular weight compound and enzyme used in the reaction, and such purification is usually performed.
  • Gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography and the like are used, but additional purification with a hydroxyapatite column may be performed.
  • the present invention provides a method for producing an antibody-drug conjugate, which comprises a step of purifying an intermediate from a reaction solution after sugar hydrolysis of an antibody, and further a step of purifying with a hydroxyapatite column.
  • sugar chain remodeling reports JACS. 2012, 134, 12308-12318., Angelw. Chem.
  • the reaction solution obtained by treating the antibody with a hydrolase was prepared as protein A. It is only purified by a column (affinity chromatography column), but this purification method cannot completely remove hydrolases (EndoS, etc.), and residual enzymes affect the next glycosyltransferase reaction. Turned out to give.
  • the reaction solution obtained by treating the antibody with a hydrolase was purified in the order of protein A column and hydroxyapatite column (CHT column, Bio-Rad Laboratories, Inc.) to obtain the residual enzyme. The reaction efficiency of the next sugar chain transfer reaction was improved without any effect.
  • the antibody-drug conjugate of the present invention is most preferably one antibody-drug conjugate selected from the following group.
  • Antibodies Ab are anti-CLDN6 antibody, anti-CLDN9 antibody, anti-CLDN6 / CLDN9 antibody, anti-HER2 antibody, anti-HER3 antibody, anti-DLL3 antibody, anti-A33 antibody, anti-CanAg antibody, anti-CD19 antibody, anti-CD20 antibody, anti-CD22 antibody, Anti-CD25 antibody, anti-CD30 antibody, anti-CD33 antibody, anti-CD37 antibody, anti-CD56 antibody, anti-CD70 antibody, anti-CD98 antibody, anti-B7-H3 antibody, anti-TROP2 antibody, anti-CEA antibody, anti-Cripto antibody, anti-EphA2 antibody, Anti-FGFR2 antibody (WO201315206 etc.), anti-G250 antibody, anti-MUC1 antibody (WO2011012309 etc.), anti-GPNMB antibody, anti-Integrin antibody, anti-PSMA antibody, anti-Ten
  • N297 sugar chain is either N297- (Fuc) MSG1, N297- (Fuc) MSG2 or a mixture thereof, or N297- (Fuc) SG (preferably N297- (Fuc) MSG1).
  • L (PEG) indicates that it is *-(CH 2 CH 2 -O) 3- CH 2 CH 2 -NH-, and the amino group at the right end is 1-3 of the ⁇ -Man branched chain of the N297 sugar chain.
  • the antibody-drug conjugate of the present invention includes optical isomers derived from stereoisomers or asymmetric carbon atoms, geometric isomers, tautomers or d-forms, l-forms, etc.
  • Optical isomers such as atrop isomers may be present, but all of these isomers, optical isomers and mixtures thereof are included in the present invention.
  • the antibody-drug conjugate of the present invention is useful as a drug because it exhibits strong tumor activity (in vivo antitumor activity, in vitro anticellular activity), good pharmacokinetics and physical properties, and is highly safe.
  • the number of drug bonds to one antibody molecule is an important factor affecting its efficacy and safety.
  • the production of an antibody-drug conjugate is carried out by defining reaction conditions such as the amount of raw materials and reagents to be reacted so that the number of drug bonds is constant. What is a chemical reaction of a low molecular weight compound? Differently, it is usually obtained as a mixture of different numbers of drugs bound together.
  • the number of drug bonds to one antibody molecule can be specified as an average value, that is, the average number of drug bonds (DAR: Drug to Antibody Ratio).
  • the number of pirorobenzodiazepine derivatives bound to the antibody molecule is controllable, and the average number of drug bindings (DAR) per antibody can be in the range of 1 to 10, but preferably from 1. Eight, more preferably 1 to 5.
  • DAR drug bindings
  • the number of drug bindings m 2 per antibody molecule in the antibody drug conjugate is 1 or 2. It is an integer.
  • the sugar chain is an N297 sugar chain and the sugar chain is a mixture of N297- (Fuc) MSG1, N297- (Fuc) MSG2 or N297- (Fuc) MSG1 and N297- (Fuc) MSG2, m 2 is 1.
  • the DAR is in the range of 1-3 (preferably in the range of 1.0 to 2.5, more preferably in the range of 1.2 to 2.2 or 1.6 to 2.2).
  • m 2 is 2 and DAR is in the range of 3 to 5 (preferably in the range of 3.2 to 4.8, more preferably in the range of 3.5 to 4.2). Is.
  • a person skilled in the art can design a reaction that binds a required number of drugs to an antibody from the description of Examples of the present application, and can obtain an antibody in which the number of bindings of a pirorobenzodiazepine derivative is controlled.
  • the antibody-drug conjugate, free drug or production intermediate of the present invention has a basic group such as an amino group
  • it can be a pharmaceutically acceptable salt if desired.
  • Such salts include, for example, hydrohalogenates such as hydrochlorides and hydroiodide; inorganic acid salts such as nitrates, perchlorates, sulfates and phosphates; methanesulfonates, trifluoromethanesulfones.
  • Lower alkane sulfonates such as acid salts and ethane sulfonates; Allyl sulfonates such as benzene sulfonates and p-toluene sulfonates; formic acid, acetic acid, apple acid, fumarate, succinate, citrate Organic acid salts such as acid salts, tartrates, oxalates and maleates; and amino acid salts such as ornithate, glutamate and asparaginate can be mentioned.
  • salts include, for example, alkali metal salts such as sodium salt, potassium salt and lithium salt; alkaline earth metal salts such as calcium salt and magnesium salt; inorganic salts such as ammonium salt; dibenzylamine salt.
  • Morphorine salt phenylglycine alkyl ester salt, ethylenediamine salt, N-methylglucamine salt, diethylamine salt, triethylamine salt, cyclohexylamine salt, dicyclohexylamine salt, N, N'-dibenzylethylenediamine salt, diethanolamine salt, N-benzyl
  • organic amine salts such as -N- (2-phenylethoxy) amine salt, piperazine salt, tetramethylammonium salt, and tris (hydroxymethyl) aminomethane salt.
  • the antibody-drug conjugate, free drug or production intermediate of the present invention may exist as a hydrate by absorbing water in the air or the like.
  • the solvate of the present invention is not particularly limited as long as it is pharmaceutically acceptable, but specifically, a hydrate, an ethanol solvate, a 2-propanol solvate and the like are preferable.
  • a nitrogen atom when present in the antibody-drug conjugate, free drug or production intermediate of the present invention, it may be an N-oxide compound, and these solvates and N-oxide compound are also the present invention. Is included in the range of.
  • the present invention also includes compounds labeled with various radioactive or non-radioactive isotopes.
  • An unnatural proportion of an atomic isotope may also be contained in one or more of the atoms constituting the antibody-drug conjugate, free drug or production intermediate of the present invention.
  • Examples of the atomic isotope include deuterium ( 2 H), tritium ( 3 H), iodine-125 ( 125 I) and carbon-14 ( 14 C).
  • the compounds of the present invention can also be radiolabeled with radioisotopes such as tritium ( 3 H), iodine-125 ( 125 I) or carbon-14 ( 14 C).
  • Radiolabeled compounds are useful as therapeutic or prophylactic agents, research reagents such as assay reagents, and diagnostic agents such as in vivo diagnostic imaging agents. All isotopic variants of the antibody-drug conjugates of the present invention, whether radioactive or not, are within the scope of the present invention.
  • Method R Preparation of antibody
  • a sugar chain remodeling antibody can be produced by the method shown in FIG. 3 according to the method described in, for example, WO2013 / 120066.
  • R-1 step Hydrolysis of glycosidic bond between GlcNAc ⁇ 1-4GlcNAc of chitobiose structure at the reducing end
  • This step binds to asparagine at amino acid sequence 297 of the antibody using a known enzymatic reaction.
  • This is a step of cleaving a bound sugar chain (N297 bound sugar chain) to prepare a sugar chain cleaving antibody.
  • a hydrolase such as EndoS enzyme at 0 ° C to 40 ° C in a buffer solution (50 mM phosphate buffer solution, etc.) of the target antibody (20 mg / ml).
  • the reaction time is 10 minutes to 72 hours, preferably 1 to 6 hours.
  • For the wild-type EndoS enzyme use 0.1 to 10 mg, preferably 0.1 to 3 mg, with respect to 100 mg of the antibody.
  • a GlcNAc antibody in which the sugar chain between GlcNAc ⁇ 1 and 4GlcNAc was hydrolyzed (Fuc ⁇ 1, 6) can be produced by performing affinity chromatography purification and / or hyrodoxyapatite column purification described later. ..
  • R-2 step Sugar chain transfer reaction
  • This step is an MSG (MSG1, MSG2) or SG-type sugar chain oxazoline compound having an azide group-containing PEG linker against the above-mentioned (Fuc ⁇ 1, 6) GlcNAc antibody using an enzymatic reaction.
  • azido sugar chain oxazoline compound The above sugar chain cleavage antibody reacts with an azide sugar chain oxazoline in a buffer solution (phosphate buffer solution, etc.) from 0 ° C to 40 ° C in the presence of a catalytic amount of glycosyltransferase such as EndoS (D233Q / Q303L).
  • the sugar chain transfer reaction is carried out.
  • the reaction time is 10 minutes to 72 hours, preferably 1 to 6 hours.
  • EndoS enzyme D233Q / Q303L
  • purified sugar chain remodeling antibody can be obtained by performing affinity chromatography purification and hyrodoxyapatite column purification.
  • the azido sugar chain oxazoline can be prepared according to the method described in Examples 3 to 5.
  • a PEG linker containing an azide group (N 3- L (N 3- L (N 3- L (N 3- L (N PEG))) N 3- (CH 2 CH 2 -O) n 5- CH 2 CH 2 -NH 2 can be introduced. That is, the carboxylic acid at the 2-position of sialic acid and the amino group at the right end of N 3- (CH 2 CH 2- O) n 5- CH 2 CH 2- NH 2 form an amide bond by a known condensation reaction.
  • MSG, MSG1 or MSG2 can be obtained by hydrolyzing the (MSG-) Asn or the separated and purified (MSG1-) Asn or (MSG2-) Asn (Example 56) with a hydrolase such as EndoM. Can be done.
  • the concentration of the aqueous antibody solution, the concentration measurement, and the buffer exchange can be performed according to the following common operations A to C.
  • Common operation A Concentration of aqueous antibody solution
  • the antibody and the antibody-drug conjugate solution described below were concentrated by centrifugation (centrifuge for 5 to 20 minutes).
  • Method S Conjugation
  • the above-mentioned sugar chain remodeling antibody and production intermediate (2) are bound by a SPAAC reaction (strain-promoted alkyne azide cycloaddition: JACS. 2004, 126, 15046-15047) to form an antibody.
  • SPAAC reaction strain-promoted alkyne azide cycloaddition: JACS. 2004, 126, 15046-15047
  • a buffer solution of antibody Ab sodium acetate solution, sodium phosphate solution, sodium borate solution, etc. or a mixture thereof
  • compound (2) in a suitable solvent (dimethylsulfoxide (DMSO), dimethylformamide (DMF), dimethylacetamide
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • DMF dimethylformamide
  • the SPAAC reaction proceeds by mixing a solution dissolved in (DMA), N-methyl-2-pyridone (NMP), propylene glycol (PG), etc. or a mixture thereof).
  • the compound (2) is 2 mol to excess mol, preferably 1 mol to 30 mol, and the ratio of the organic solvent is preferably 1 to 200% v / v with respect to the buffer solution of the antibody with respect to 1 mol of the antibody.
  • the reaction temperature is 0 ° C. to 37 ° C., preferably 10 ° C. to 25 ° C.
  • the reaction time is 1 to 150 hours, preferably 6 hours to 100 hours.
  • the antibody-drug conjugate is subjected to buffer exchange, purification, antibody concentration, and measurement of the average number of drug bindings per antibody molecule by the common operations A to C described above and the common operations D to F described later, and the antibody-drug conjugate is measured.
  • the gate compound (ADC) can be identified.
  • A280 indicates the absorbance of the antibody-drug conjugate aqueous solution at 280 nm
  • ⁇ 280 indicates the molar extinction coefficient of the antibody-drug conjugate at 280 nm
  • C (mol ⁇ L- 1 ) indicates the antibody-drug conjugate of the antibody-drug conjugate.
  • the values applied to this example using the above formula are described below.
  • absorbance A280 the measured value of the UV absorbance of the antibody-drug conjugate aqueous solution at 280 nm was used.
  • the molar mass MW (g ⁇ mol- 1 ) uses the calculated estimated value of the antibody molecular weight obtained from the amino acid sequence of the antibody as an approximation of the molar mass of the antibody-drug conjugate.
  • the optical path length l (cm) was measured at 1 cm.
  • the molar extinction coefficient ⁇ 280 of the antibody drug conjugate can be determined by the following formula (IV).
  • ⁇ Ab and 280 indicate the molar extinction coefficient of the antibody at 280 nm
  • ⁇ DL and 280 indicate the molar extinction coefficient of the drug at 280 nm
  • 280 240400 (calculated estimate)
  • ⁇ DL and 280 those calculated from the measured values obtained by UV measurement each time were used. That is, the absorbance of the solution in which the conjugate precursor (drug) was dissolved at a certain molar concentration was measured, and the value obtained by applying Lambert-Beer's law, formula (I) was used.
  • the average number of drug bonds per antibody molecule in an antibody-drug conjugate can be determined by high performance liquid chromatography (HPLC) analysis using the following method.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • HPLC analysis HPLC analysis is performed under the following measurement conditions.
  • HPLC System Agilent 1290 HPLC System (Agilent Technologies) Detector: Ultraviolet absorptiometer (measurement wavelength: 280 nm, 329 nm)
  • Detector Ultraviolet absorptiometer (measurement wavelength: 280 nm, 329 nm)
  • Column BEH Phenyl (2.1 x 50 mm, 1.7 ⁇ m, Waters Acquity) Column temperature: 75 ° C
  • Mobile phase A 0.1% trifluoroacetic acid (TFA), 15% isopropyl alcohol aqueous solution
  • Mobile phase B 0.075% TFA, 15% isopropyl alcohol acetonitrile solution
  • Gradient program 14% -36% (0 minutes-15 minutes) ), 36% -80% (15-17 minutes), 80% -14% (17 minutes-17.1 minutes), 14% -14% (17.1 minutes-23 minutes)
  • Sample injection volume 5 ⁇ L
  • the molar extinction coefficient (280 nm) of the L chain and the H chain in each antibody is determined by a known calculation method (Protein Science, 1995, vol.4, 2411-2423) for the amino acids of the L chain and the H chain of each antibody. Values estimated from the sequence can be used. In the case of Trastuzumab, 81290 was used as the estimated value as the molar extinction coefficient of the H chain according to its amino acid sequence.
  • the CLDN6 antibody has an H-chain molar extinction coefficient of 77280
  • the TROP2 antibody has an H-chain molar extinction coefficient of 68990
  • the CD98 antibody has an H-chain molar extinction coefficient of 78500
  • the LPS antibody has H.
  • the molar extinction coefficient of the chain is 77470
  • the molar extinction coefficient of the H chain in the case of the Trastuzumab variant is 81488, and the molar extinction coefficient of the drug linker (280 nm) is the measured molar extinction of the conjugate precursor compound (1).
  • the coefficient (280 nm) was used.
  • [F-3-3] Calculate the ratio (%) of each chain peak area to the total peak area correction value according to the following formula.
  • the antibody-drug conjugate of the present invention exhibits cytotoxic activity against cancer cells, it can be used as a medicine, particularly as a therapeutic agent and / or a preventive agent for cancer.
  • the types of cancer to which the anti-CLDN6 antibody-drug conjugate of the present invention is applied include lung cancer (non-small cell lung cancer, small cell lung cancer, etc.), renal cancer, urinary tract epithelial cancer, colon cancer, and prostate. , Polymorphic glioblastoma, ovarian cancer (superficial epithelial tumor, interstitial tumor, germ cell tumor, etc.), pancreatic cancer, breast cancer, melanoma, liver cancer, bladder cancer, gastric cancer, esophageal cancer Anti-HER2 antibody-drug conjugates are applied to, uterine body cancer, testicular cancer (semi-norma, non-seminoma), cervical cancer, placental chorionic villus cancer, brain tumor, head and neck cancer and their metastatic morphology.
  • lung cancer non-small cell lung cancer, small cell lung cancer, etc.
  • renal cancer urinary tract epithelial cancer
  • colon cancer colon cancer
  • prostate prostate.
  • Types of cancer include lung cancer, urinary tract epithelial cancer, colon cancer, prostate cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, breast cancer, bladder cancer, gastric cancer, gastrointestinal stromal tumor, cervical cancer, Esophageal cancer, squamous cell carcinoma, peritoneal cancer, liver cancer, hepatocellular carcinoma, colon cancer, rectal cancer, colon rectal cancer, endometrial cancer, uterine cancer, salivary adenocarcinoma, kidney Cancer, genital cancer, thyroid cancer, penis cancer, and their metastatic morphology can be mentioned, but proteins that can be recognized by antibodies in antibody-drug conjugates in cancer cells to be treated.
  • the cancer cells expressing the above are not limited to these.
  • the antibody-drug conjugate of the present invention can be suitably administered to mammals, but is more preferably human.
  • the substance used in the pharmaceutical composition containing the antibody-drug conjugate of the present invention can be appropriately selected and applied from pharmaceutical additives and others usually used in this field in terms of dose and concentration. ..
  • the antibody-drug conjugate of the present invention can be administered as a pharmaceutical composition containing one or more pharmaceutically compatible components.
  • the pharmaceutical composition typically comprises one or more pharmaceutical carriers, such as sterilized liquids (eg, water and oil (eg, oils, animals, plants, or synthetically derived oils (eg, sesame oil)). , Soybean oil, mineral oil, sesame oil, etc.)))).
  • Water is a more representative carrier when the pharmaceutical composition is administered intravenously.
  • Salt aqueous solution, dextrose aqueous solution and glycerol aqueous solution. can also be used as a liquid carrier, especially for injectable solutions. Suitable pharmaceutical excipients are known in the art.
  • composition is also a trace amount of wetting agent, if desired.
  • it may include an emulsifier, or a pH buffering agent.
  • suitable pharmaceutical carriers are described in "Remington's Pharmaceutical Sciences” by EW Martin, the formulation of which corresponds to the mode of administration.
  • Methods of introduction include, but are not limited to, intradermal, intramuscular, intraperitoneal, intravenous, and subcutaneous routes. Administration can be, for example, by injection or bolus injection. In certain preferred embodiments, administration of the ligand drug conjugate is by infusion. Parenteral administration is the preferred route of administration.
  • the pharmaceutical composition is formulated according to a habitual procedure as a pharmaceutical composition suitable for intravenous administration to humans.
  • the composition for intravenous administration is a solution in sterile isotonic aqueous buffer.
  • the medication may also include a solubilizer and a local anesthetic (eg, lignokine) to relieve pain at the injection site.
  • the ingredients are combined separately or in unit dosage forms (eg, as a lyophilized powder or anhydrous concentrate in a sealed, sealed container such as an ampoule or sachet indicating the amount of activator.
  • the drug can be administered by infusion, for example, in an infusion bottle containing sterile pharmaceutical grade water or saline.
  • an ampoule of lyophilized or saline solution for injection can be provided, for example, such that the above ingredients can be mixed prior to administration.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be a pharmaceutical composition containing only the antibody-drug conjugate of the present invention, or a pharmaceutical composition containing the antibody-drug conjugate and at least one other cancer therapeutic agent. It may be.
  • the antibody-drug conjugate of the present invention can also be administered together with other cancer therapeutic agents, whereby the anti-cancer effect can be enhanced.
  • Other anti-cancer agents used for this purpose may be administered to the individual individually or continuously at the same time as the antibody-drug conjugate, or may be administered at different dosing intervals. May be good.
  • Such cancer therapeutic agents include abraxane, carboplatin, cisplatin, gemcitabine, irinotecan (CPT-11), paclitaxel, pemetrexed, sorafenib, vinblastin or the agents described in WO2003 / 038043 pamphlet, as well as LH-RH analogs (Lupro Relin, gocerelin, etc.), estramustin phosphate, estrogen antagonists (tamoxifen, laroxyfen, etc.), aromatase inhibitors (anastrozole, letrozole, exemestane, etc.), etc., but have antitumor activity. If it is a drug, it is not limited.
  • Such a pharmaceutical composition may be formulated as a lyophilized preparation or a liquid preparation as a preparation having a selected composition and a required purity.
  • a pharmaceutical composition When formulated as a lyophilized formulation, it may be a formulation containing suitable formulation additives used in the art.
  • a liquid preparation can be formulated as a liquid preparation containing various preparation additives used in this field.
  • the antibody-drug conjugate contained in the pharmaceutical composition of the present invention has an affinity for the antigen of the antibody-drug conjugate, that is, a dissociation constant for the antigen ( In terms of Kd value), the higher the affinity (lower Kd value), the more effective the drug can be exerted even with a small dose. Therefore, in determining the dose of the antibody-drug conjugate, the dose can be set based on the status of affinity between the antibody-drug conjugate and the antigen.
  • the antibody-drug conjugate of the present invention is administered to humans, for example, about 0.001 to 100 mg / kg may be administered once or multiple times at intervals of 1 to 180 days.
  • the antibody of the present invention or a functional fragment of the antibody can also be used as a medicine.
  • the above description of "antibody-drug conjugate” relating to ⁇ pharmaceutical> can be appropriately read as the description relating to "antibody or functional fragment of the antibody”.
  • the free drug (new PBD derivative compound) of the present invention can also be used as a medicine.
  • the above description of "antibody-drug conjugate” relating to ⁇ pharmaceutical> can be appropriately read as the description relating to "free drug (new PBD derivative compound), salt thereof, or hydrate thereof”. ..
  • Reference example 1 Trastuzumab Tesirine Step 1: Conjugation of antibody and drug linker In 5 mM ethylenediamine tetraacetate-phosphate buffered saline (pH 6.5) solution (9.91 mg / mL, 0.70 mL) of Trastuzumab (Reference Example 3) at 20 ° C. Aqueous dipotassium acid acid solution (1.0 M, 0.0112 mL) and tris (2-carboxyethyl) phosphate hydrochloride aqueous solution (10 mM, 0.0086 mL) were added, and the mixture was reacted at 20 ° C. for 60 minutes and at room temperature for 30 minutes.
  • Reference example 2 Anti-CLDN6 (H1L1) antibody Tesirine Step 1: Conjugation of antibody and drug linker to 5 mM ethylenediaminetetraacetate-phosphate buffered saline (pH 6.5) solution (9.87 mg / mL, 0.45 mL) of anti-CLDN6 (H1L1) antibody at 20 ° C. Aqueous dipotassium phosphate solution (1.0 M, 0.0072 mL) and tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride aqueous solution (10 mM, 0.0041 mL) were added, and the mixture was reacted at 20 ° C. for 90 minutes.
  • Reference example 3 Anti-HER2 antibody Trastuzumab Anti-HER2 antibody was made with reference to US5821337. The amino acid sequences of the light and heavy chains of Trastuzumab are shown in SEQ ID NO: 64 and SEQ ID NO: 65.
  • Anti-LPS antibody h # 1G5-H1L1 Anti-LPS antibody was prepared with reference to WO2015 / 046505. The amino acid sequences of the light and heavy chains of h # 1G5-H1L1 are shown in SEQ ID NO: 66 and SEQ ID NO: 67.
  • Reference example 5 Anti-TROP2 antibody hRS7
  • the anti-TROP2 antibody was prepared with reference to WO2003 / 074566 and WO2015 / 098099 (Reference Example 1).
  • the amino acid sequences of the light and heavy chains of hRS7 are shown in SEQ ID NO: 68 and SEQ ID NO: 69.
  • Anti-CD98 antibody hM23-H1L1 The anti-CD98 antibody was prepared with reference to WO2015 / 146132. The amino acid sequences of the light and heavy chains of hM23-H1L1 are shown in SEQ ID NO: 70 and SEQ ID NO: 71.
  • Step 1 Benzyl (6S) -6- (hydroxymethyl) -5-azaspiro [2.4] heptane-5-carboxylate (1-2) Lithium borohydride (4.30 g) in a solution of 5-benzyl 6-methyl (6S) -5-azaspiro [2.4] heptane-5,6-dicarboxylate (1-1) (104 mmol, WO2012087596) in tetrahydrofuran (500 mL). , 178 mmol) was added little by little at 0 ° C. After stirring at 0 ° C. for 30 minutes, the mixture was stirred at room temperature for 2 hours.
  • Step 2 Benzyl (6S) -6-( ⁇ [tert-butyl (dimethyl) silyl] oxy ⁇ methyl) -5-azaspiro [2.4] heptane-5-carboxylate (1-3) Tert-Butyldimethylsilyl chloride (24.2 g, 160 mmol) in a solution of compound (1-2) (27.9 g, 107 mmol) and imidazole (14.5 g, 214 mmol) obtained in step 1 above in dichloromethane (300 mL) at room temperature. ) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 18 hours.
  • the reaction solution was washed with saturated aqueous citric acid solution, saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution and saturated brine, dried over anhydrous sodium sulfate, and evaporated under reduced pressure.
  • Step 3 (6S) -6-( ⁇ [tert-butyl (dimethyl) silyl] oxy ⁇ methyl) -5-azaspiro [2.4] heptane (1-4)
  • a 7.5% palladium carbon catalyst (54% water content, 5.00 g) was added at room temperature, and hydrogen was added at room temperature.
  • the mixture was stirred in an atmosphere for 6 hours.
  • the reaction solution was filtered through Celite, and the filtrate was evaporated under reduced pressure to give the desired product (1-4) (21.3 g, quantitative).
  • Step 4 [(6S) -6-( ⁇ [tert-butyl (dimethyl) silyl] oxy ⁇ methyl) -5-azaspiro [2.4] hept-5-yl] (5-methoxy-2-nitro-4- ⁇ [Tri (propan-2-yl) silyl] oxy ⁇ phenyl) metanone (1-5) 5-Methoxy-2-nitro-4- ⁇ tri (propane-2-yl) silyl] oxy ⁇ benzoic acid (52.2 g, 141 mmol, US20150283262) and 1-hydroxybenzotriazole monohydrate (23.8 g, 155 mmol) N, N'-dicyclohexylcarbodiimide (35.0 g, 170 mmol) was added to a solution of dichloromethane (500 mL) under ice-cooling.
  • dichloromethane 500 mL
  • the reaction mixture was stirred at room temperature. After the disappearance of the carboxylic acid, a solution of the compound (1-4) (34.1 g, 141 mmol) obtained in the above step 3 and triethylamine (29.4 mL, 212 mmol) in dichloromethane (100 mL) was slowly added dropwise at -60 ° C. The reaction solution was stirred at room temperature overnight, saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution was added to the reaction mixture, and the reaction mixture was extracted with chloroform. The organic layer was washed with water and saturated brine and dried over anhydrous magnesium sulfate.
  • Step 5 (2-Amino-5-methoxy-4- ⁇ [tri (propane-2-yl) silyl] oxy ⁇ phenyl) [(6S) -6-( ⁇ [tert-butyl (dimethyl) silyl] oxy ⁇ Methyl) -5-azaspiro [2.4] hepto-5-yl] methanone (1-6) 7.5% palladium carbon (10.0 g) was added to a solution of the compound (1-5) (55.0 g, 92.8 mmol) obtained in step 4 above in ethanol (300 mL) under a nitrogen atmosphere. The nitrogen balloon was immediately replaced with a hydrogen balloon, and the reaction mixture was vigorously stirred at room temperature under a hydrogen atmosphere.
  • Step 6 N-[(prop-2-en-1-yloxy) carbonyl] -L-valyl-N- [4-( ⁇ [(2- ⁇ [(6S))-6-( ⁇ [tert-butyl ( ⁇ [tert-butyl ( Dimethyl) Cyril] Oxy ⁇ Methyl) -5-azaspiro [2.4] Hept-5-yl] Carbon ⁇ -4-methoxy-5- ⁇ [Tri (Propan-2-yl) Cyril] Oxy ⁇ Phenyl) Carbamoyl] Oxy ⁇ Methyl) phenyl] -L-alanine amide (1-7) Triphosgene (4.22 g, 4.22 g,) in a THF (300 mL) solution of compound (1-6) (18.6 g, 33.0 mmol) and triethylamine (6.26 mL, 45.2 mmol) obtained in step 5 above on an ethanol-ice bath.
  • Step 7 N-[(prop-2-en-1-yloxy) carbonyl] -L-valyl-N- [4-( ⁇ [(2- ⁇ [(6S) -6- (hydroxymethyl) -5- (hydroxymethyl) -5- Azaspiro [2.4] hept-5-yl] carbonyl ⁇ -4-methoxy-5- ⁇ [tri (propan-2-yl) silyl] oxy ⁇ phenyl) carbamoyl] oxy ⁇ methyl) phenyl] -L-alanine amide
  • Acetic acid 200 mL was added to a solution of the compound (1-7) (23.5 g, 24.3 mmol) obtained in step 6 above in tetrahydrofuran (50 mL), methanol (50 mL) and water (44 mL) at room temperature.
  • Step 8 N-[(prop-2-en-1-yloxy) carbonyl] -L-valyl-N- ⁇ 4-[( ⁇ [(11'S, 11a'S) -11'-hydroxy-7'-methoxy-5 '-Oxo-8'- ⁇ [tri (propane-2-yl) silyl] oxy ⁇ -11', 11a'-dihydro-1'H-spiro [cyclopropane-1,2'-pyrolo [2,1- c] [1,4] benzodiazepine] -10'(5'H) -yl] carbonyl ⁇ oxy) methyl] phenyl ⁇ -L-alanine amide (1-9) Oxalyl chloride (2.17 mL, 25.3 mmol) was slowly added dropwise to a solution of dimethyl sulfoxide (3.75 mL, 52.8 mmol) in dichloromethane (300 mL) at ⁇ 78 ° C.
  • Step 9 N-[(prop-2-en-1-yloxy) carbonyl] -L-valyl-N- ⁇ 4-[( ⁇ [(11'S, 11a'S) -11'- ⁇ [tert-butyl (dimethyl)) Cyril] oxy ⁇ -7'-methoxy-5'-oxo-8'- ⁇ [tri (propane-2-yl) silyl] oxy ⁇ -11', 11a'-dihydro-1'H-spiro [cyclopropane- 1,2'-Piroro [2,1-c] [1,4] benzodiazepine] -10'(5'H) -yl] carbonyl ⁇ oxy) methyl] phenyl ⁇ -L-alanine amide (1-10) In a solution of compound (1-9) (12.0 g, 14.1 mmol) and 2,6-lutidine (6.58 mL, 56.5 mmol) obtained in step 8 above in dichloromethane (200
  • Step 10 N-[(prop-2-en-1-yloxy) carbonyl] -L-valyl-N- ⁇ 4-[( ⁇ [(11'S, 11a'S) -11'- ⁇ [tert-butyl (dimethyl)) Cyril] oxy ⁇ -8'-hydroxy-7'-methoxy-5'-oxo-11', 11a'-dihydro-1'H-spiro [cyclopropane-1,2'-pyrolo [2,1-c] [1,4] Benzodiazepine] -10'(5'H) -yl] carbonyl ⁇ oxy) methyl] phenyl ⁇ -L-alaninamide (1-11) Lithium acetate (0.611 g, 9.26 mmol) was added to a solution of the compound (1-10) (8.12 g, 8.42 mmol) obtained in step 9 above in N, N-dimethylformamide (90 mL) and water (2 mL).
  • the absolute configuration of the 11'position was analyzed from the correlation (figure below) obtained from the selective 1D ROESY spectrum of compound (1-11). Since there is a correlation between 1' ⁇ -H and 11'-H, 3' ⁇ -H and 11'-H, and 1' ⁇ -H and 3' ⁇ -H, the absolute configuration at the 11'position was found to be an S arrangement.
  • the absolute configuration at the 11'position of compound (5-9), compound (5-10) and drug linker 3 (compound (5-11)) obtained by the same synthetic method is the S configuration. ..
  • Step 1 N- [4- (11,12-didehydrodibenzo [b, f] azocine-5 (6H) -yl) -4-oxobutanoyl] glycylglycine (2-2) 1- ⁇ [4- (11,12-didehydro) in a solution of glycylglycine (0.328 g, 2.49 mmol), N, N-diisopropylethylamine (0.433 mL, 2.49 mmol) in N, N-dimethylformamide (20 mL).
  • Example 2 [Example 2-1: Drug linker 1]
  • Step 1 (2R, 11aS) -2- ⁇ [tert-butyl (dimethyl) silyl] oxy ⁇ -8-hydroxy-7-methoxy-10- ⁇ [2- (trimethylsilyl) ethoxy] methyl ⁇ -2,3- Dihydro-1H-Piroro [2,1-c] [1,4] Benzodiazepine-5,11 (10H, 11aH) -dione (3-2) (2R, 11aS) -8- (benzyloxy) -2- ⁇ [tert-butyl (dimethyl) silyl] oxy ⁇ -7-methoxy-10- ⁇ [2- (trimethylsilyl) ethoxy] methyl ⁇ -2,3- Dihydro-1H-pyrrolo [2,1-c] [1,4] benzodiazepine-5,11 (10H, 11aH) -dione (3-1) (25.5 g, 41.6 mmol, WO2016149546) in tetrahydrofuran (150 m
  • Step 2 (2R, 11aS) -8-[(5-Bromopentyl) oxy] -2- ⁇ [tert-butyl (dimethyl) silyl] oxy ⁇ -7-methoxy-10- ⁇ [2- (trimethylsilyl) ethoxy ] Methyl ⁇ -2,3-dihydro-1H-Piroro [2,1-c] [1,4] Benzodiazepine-5,11 (10H, 11aH) -dione (3-3) In a solution of compound (3-2) (10.8 g, 20.7 mmol) obtained in step 1 above in N, N-dimethylformamide (30 mL), 1,5-dibromopentane (23.8 g, 103 mmol), potassium carbonate ( 3.43 g, 24.8 mmol) was added at room temperature.
  • Step 3 (2R, 11aS) -8-[(5-bromopentyl) oxy] -2-hydroxy-7-methoxy-10- ⁇ [2- (trimethylsilyl) ethoxy] methyl ⁇ -2,3-dihydro-1H -Piroro [2,1-c] [1,4] Benzodiazepine-5,11 (10H, 11aH) -Dion (3-4)
  • tetrahydrofuran 40 mL
  • 1 mol / L tetrabutylammonium fluoride tetrahydrofuran solution (28.0 mL, 28.0 mmol) at 0 ° C.
  • Step 4 (11aS) -8-[(5-Bromopentyl) oxy] -7-methoxy-10- ⁇ [2- (trimethylsilyl) ethoxy] methyl ⁇ -1H-pyrrolo [2,1-c] [1, 4] Benzodiazepine-2,5,11 (3H, 10H, 11aH) -trion (3-5) Saturated sodium hydrogen carbonate of the compound (3-4) (11.3 g, 20.2 mmol), tetrabutylammonium bromide (0.325 g, 1.01 mmol), and potassium bromide (0.240 g, 2.02 mmol) obtained in step 3 above.
  • sodium hypochlorite pentahydrate (0.300 g, 4.03 mmol) was added at 0 ° C., and the mixture was stirred at 0 ° C. for 15 minutes, and the disappearance of the raw materials was confirmed by TLC.
  • Step 5 (11aS) -8-[(5-bromopentyl) oxy] -7-methoxy-5,11-dioxo-10- ⁇ [2- (trimethylsilyl) ethoxy] methyl ⁇ -5,10,11,11a -Tetrahydro-1H-Piroro [2,1-c] [1,4] Benzodiazepine-2-yltrifluoromethanesulfonate (3-6) To a solution of compound (3-5) (9.74 g, 17.5 mmol) obtained in step 4 above in dichloromethane (160 mL), 2,6-lutidine (8.17 mL, 70.1 mmol) was added at -40 ° C, and- The mixture was stirred at 40 ° C.
  • Step 6 (11aS) -8-[(5-bromopentyl) oxy] -7-methoxy-2- (4-methoxyphenyl) -10- ⁇ [2- (trimethylsilyl) ethoxy] methyl ⁇ -1H-piroro [ 2,1-c] [1,4]
  • Compound (3-6) (2.00 g, 2.91 mmol), 4-methoxyphenylboronic acid (0.884 g, 5.82 mmol), tetrakis (triphenylphosphine) palladium (0) (0.336 g, obtained in step 5 above).
  • Step 7 (11aS) -8-[(5-Bromopentyl) oxy] -7-methoxy-2- (4-methoxyphenyl) -1,11a-dihydro-5H-pyrrolo [2,1-c] [1 , 4] Benzodiazepine-5-one (3-8)
  • the compound (3-7) (0.789 g, 1.22 mmol) obtained in step 6 above was dissolved in ethanol (10 mL) and tetrahydrofuran (10 mL), and a 2.0 M lithium borohydride tetrahydrofuran solution (6.11 mL, 12.2 mmol) was dissolved. ) was added at 0 ° C., and the mixture was stirred at 0 ° C.
  • Step 8 (11aS) -8-[(5-bromopentyl) oxy] -7-methoxy-2- (4-methoxyphenyl) -1,10,11,11a-tetrahydro-5H-pyrrolo [2,1- c] [1,4]
  • Benzodiazepine-5-one (3-9)
  • Sodium triacetoxyborohydride (0.421 g, 1.99 mmol) was added to a solution of compound (3-8) (0.496 g, 0.992 mmol) obtained in step 7 above in dichloromethane (20 mL) at 0 ° C. After stirring at room temperature for 2 hours, a saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution was added, and the mixture was extracted with chloroform.
  • Step 9 Prop-2-en-1-yl (11aS) -8-[(5-bromopentyl) oxy] -7-methoxy-2- (4-methoxyphenyl) -5-oxo-11,11a-dihydro -1H-Piroro [2,1-c] [1,4]
  • Benzodiazepine-10 (5H) -carboxylate (3-10) Pyridine (0.102 mL 1.27 mmol) and allyl chlorolate (0.374 mL, 3.54 mmol) were added to a solution of the compound (3-9) (0.426 g, 0.849 mmol) obtained in step 8 above in dichloromethane (30 mL). The mixture was added at ° C.
  • Step 10 N-[(prop-2-en-1-yloxy) carbonyl] -L-valyl-N- ⁇ 4-[( ⁇ [(11'S, 11a'S) -11'- ⁇ [tert-butyl (dimethyl)) Cyril] oxy ⁇ -7'-methoxy-8'- ⁇ [5-( ⁇ (11aS) -7-methoxy-2- (4-methoxyphenyl) -5-oxo-10-[(prop-2-ene-) 1-Iloxy) carbonyl] -5,10,11,11a-tetrahydro-1H-pyrrolo [2,1-c] [1,4] benzodiazepine-8-yl ⁇ oxy) pentyl] oxy ⁇ -5'-oxo- 11', 11a'-dihydro-1'H-spiro [cyclopropane-1,2'-pyrrolo [2,1-c] [1,4] benzodiazepine] -10'(5'H
  • Step 11 N-[(prop-2-en-1-yloxy) carbonyl] -L-valyl-N- ⁇ 4-[( ⁇ [(11'S, 11a'S) -11'-hydroxy-7'-methoxy-8 '- ⁇ [5-( ⁇ (11aS) -7-methoxy-2- (4-methoxyphenyl) -5-oxo-10-[(prop-2-en-1-yloxy) carbonyl] -5,10, 11,11a-tetrahydro-1H-pyrrolo [2,1-c] [1,4] benzodiazepine-8-yl ⁇ oxy) pentyl] oxy ⁇ -5'-oxo-11', 11a'-dihydro-1'H -Spiro [cyclopropane-1,2'-pyrrolo [2,1-c] [1,4] benzodiazepine] -10'(5'H) -yl] carbonyl ⁇ oxy) methyl] phenyl ⁇ -
  • Step 12 L-Valyl-N- ⁇ 4-[( ⁇ [(11'S, 11a'S) -11'-hydroxy-7'-methoxy-8'-[(5- ⁇ [(11aS) -7-methoxy-2 -(4-Methoxyphenyl) -5-oxo-5,10,11,11a-tetrahydro-1H-pyrrolo [2,1-c] [1,4] benzodiazepine-8-yl] oxy ⁇ pentyl) oxy]- 5'-oxo-11', 11a'-dihydro-1'H-spiro [cyclopropane-1,2'-pyrolo [2,1-c] [1,4] benzodiazepine] -10'(5'H) -Il] carbonyl ⁇ oxy) methyl] phenyl ⁇ -L-alanine amide (3-13) Pyrrolidine (0.0579 mL, 0.700 mmol), tetrakis (tripheny
  • Step 13 N- [4- (11,12-didehydrodibenzo [b, f] azosin-5 (6H) -yl) -4-oxobutanoyl] glycylglycyl-L-valyl-N- ⁇ 4-[( ⁇ [(11'S, 11a'S) -11'-hydroxy-7'-methoxy-8'-[(5- ⁇ [(11aS) -7-methoxy-2- (4-methoxyphenyl) -5-oxo-5, 10,11,11a-Tetrahydro-1H-Piroro [2,1-c] [1,4] Benzodiazepine-8-yl] Oxy ⁇ Pentyl) Oxy] -5'-oxo-11', 11a'-dihydro-1 'H-spiro [cyclopropane-1,2'-pyrolo [2,1-c] [1,4] benzodiazepine] -10'(5
  • Step 1 (2R, 11aS) -8- (3-bromopropoxy) -2- ⁇ [tert-butyl (dimethyl) silyl] oxy ⁇ -7-methoxy-10- ⁇ [2- (trimethylsilyl) ethoxy] methyl ⁇ -2,3-dihydro-1H-Piroro [2,1-c] [1,4] Benzodiazepine-5,11 (10H, 11aH) -dione (4-1)
  • Example 2-1 The compound (3-2) (5.06 g, 9.67 mmol) and 1,3-dibromopropane (4.93 mL, 48.4 mmol) obtained in Step 1 were used in the same manner as in Example 2-1 Step 2.
  • the target product (4-1) (4.85 g, 78%) was obtained.
  • Step 2 (2R, 11aS) -8- (3-bromopropoxy) -2-hydroxy-7-methoxy-10- ⁇ [2- (trimethylsilyl) ethoxy] methyl ⁇ -2,3-dihydro-1H-pyrrolo [ 2,1-c] [1,4]
  • Benzodiazepine-5,11 (10H, 11aH) -dione (4-2) The compound (4-1) (4.85 g, 7.54 mmol) obtained in the above step 1 was reacted in the same manner as in Example 2-1 step 3 to produce the target product (4-2) (4.05 g, quantitative).
  • Step 3 (11aS) -8- (3-bromopropoxy) -7-methoxy-10- ⁇ [2- (trimethylsilyl) ethoxy] methyl ⁇ -1H-pyrrolo [2,1-c] [1,4] benzodiazepine -2, 5, 11 (3H, 10H, 11aH)-Trion (4-3)
  • the compound (4-2) (7.54 mmol) obtained in the above step 2 was reacted in the same manner as in Example 2-1 step 4 to obtain the target product (4-3) (3.73 g, 93%). ..
  • Step 4 (11aS) -8- (3-bromopropoxy) -7-methoxy-5,11-dioxo-10- ⁇ [2- (trimethylsilyl) ethoxy] methyl ⁇ -5,10,11,11a-tetrahydro- 1H-Piroro [2,1-c] [1,4]
  • Benzodiazepine-2-yltrifluoromethanesulfonate (4-4) The compound (4-3) (3.73 g, 7.08 mmol) obtained in the above step 3 was reacted in the same manner as in Step 2-1 of Example 2-1 to produce the target product (4-4) (3.27 g, 70%).
  • Step 5 (11aS) -8- (3-bromopropoxy) -7-methoxy-2- (4-methoxyphenyl-10- ⁇ [2- (trimethylsilyl) ethoxy] methyl ⁇ -1H-pyrrolo [2,1- c] [1,4] Benzodiazepine-5,11 (10H, 11aH) -dione (4-5)
  • the compound (4-4) (3.27 g, 4.96 mmol) obtained in the above step 4 was reacted in the same manner as in Step 2-1 Step 6 to produce the target product (4-5) (2.49 g, 81%).
  • Step 6 (11aS) -8- (3-bromopropoxy) -7-methoxy-2- (4-methoxyphenyl) -1,11a-dihydro-5H-pyrrolo [2,1-c] [1,4] Benzodiazepine-5-on (4-6)
  • the compound (4-5) (2.49 g, 4.04 mmol) obtained in step 5 above was reacted in the same manner as in step 7 of Example 2-1 to produce the target product (4-6) (1.59 g, 84%).
  • Step 7 (11aS) -8- (3-bromopropoxy) -7-methoxy-2- (4-methoxyphenyl) -1,10,11,11a-tetrahydro-5H-pyrrolo [2,1-c] [ 1,4] Benzodiazepine-5-one (4-7)
  • the compound (4-6) (1.59 g, 3.38 mmol) obtained in the above step 6 was reacted in the same manner as in Step 2-1 of Example 2-1 to produce the target product (4-7) (1.39 g, 87%).
  • Step 8 Prop-2-en-1-yl (11aS) -8- (3-bromopropoxy) -7-methoxy-2- (4-methoxyphenyl) -5-oxo-11, 11a-dihydro-1H- Piroro [2,1-c] [1,4]
  • Benzodiazepine-10 (5H) -carboxylate (4-8)
  • the compound (4-7) (1.40 g, 2.95 mmol) obtained in the above step 7 was reacted in the same manner as in Step 2-1 Step 9 to produce the target product (4-8) (0.885 g, 54%).
  • Step 9 N- ⁇ [(prop-2-en-1-yl) oxy] carbonyl ⁇ -L-valyl-N- [4-( ⁇ [(11'S, 11'aS) -11'- ⁇ [tert- Butyl (dimethyl) silyl] oxy ⁇ -7'-methoxy-8'-(3- ⁇ [(11aS) -7-methoxy-2- (4-methoxyphenyl) -5-oxo-10- ⁇ [(prop-) 2-En-1-yl) oxy] carbonyl ⁇ -5,10,11,11a-tetrahydro-1H-pyrrolo [2,1-c] [1,4] benzodiazepine-8-yl] oxy ⁇ propoxy) -5 '-Oxo-11', 11'a-dihydro-1'H, 3'H-spiro [cyclopropane-1,2'-pyrrolo [2,1-c] [1,4] benzodiazepine] -10'( 5'H
  • Step 10 N- ⁇ [(prop-2-en-1-yl) oxy] carbonyl ⁇ -L-valyl-N- [4-( ⁇ [(11'S, 11'aS) -11'-hydroxy-7'-Methoxy-8'-(3- ⁇ [(11aS) -7-methoxy-2- (4-methoxyphenyl) -5-oxo-10- ⁇ [(prop-2-en-1-yl) oxy] carbonyl ⁇ -5,10,11,11a-tetrahydro-1H-pyrrolo [2,1-c] [1,4] benzodiazepine-8-yl] oxy ⁇ propoxy) -5'-oxo-11', 11'a- Dihydro-1'H, 3'H-spiro [cyclopropane-1,2'-pyrrolo [2,1-c] [1,4] benzodiazepine] -10'(5'H) -carbonyl] oxy ⁇ methyl) Phenyl] -L-
  • Step 11 L-Valyl-N- [4-( ⁇ [(11'S, 11'aS) -11'-hydroxy-7'-methoxy-8'-(3- ⁇ [(11aS) -7-methoxy-2 -(4-Methoxyphenyl) -5-oxo-5,10,11,11a-tetrahydro-1H-piroro [2,1-c] [1,4] benzodiazepine-8-yl] oxy ⁇ propoxy) -5'-Oxo-11',11'a-dihydro-1'H,3'H-spiro[cyclopropane-1,2'-piroro [2,1-c] [1,4] benzodiazepine] -10'(5) 'H) -carbonyl] oxy ⁇ methyl) phenyl] -L-alanine amide (4-11)
  • the compound (4-10) (0.0571 mmol) obtained in the above step 10 was reacted in the same manner as in Example 2-1 step 12
  • Step 12 N- [4- (11,12-didehydrodibenzo [b, f] azosin-5 (6H) -yl) -4-oxobutanoyl] glycylglycyl-L-valyl-N- [4-( ⁇ [(11'S, 11'aS) -11'-Hydroxy-7'-Methoxy-8'-(3- ⁇ [(11aS) -7-Methoxy-2- (4-Methoxyphenyl) -5-oxo-5, 10,11,11a-Tetrahydro-1H-Piroro [2,1-c] [1,4] benzodiazepine-8-yl] oxy ⁇ propoxy) -5'-oxo-11', 11'a-dihydro-1' H, 3'H-spiro [cyclopropane-1,2'-piroro [2,1-c] [1,4] benzodiazepine] -10'(5'H)
  • Step 1 Dimethyl (6S, 6'S) -5,5'- ⁇ 1,5-pentanediylbis [oxy (5-methoxy-2-nitrobenzene-4,1-diyl) carbonyl] ⁇ bis (5-azaspiro [2.4] ] Heptane-6-carboxylate) (5-2) 4,4'-[1,5-pentanediylbis (oxy)] bis (5-methoxy-2-nitrobenzoic acid) (5-1) (5.41 g, 10.9 mmol, Journal of Medicinal Chemistry 2004, 47, 1161 ), Oxalyl chloride (5.63 mL, 65.7 mmol) was added to a solution of dichloromethane (50 mL) at 0 ° C., and N, N-dimethylformamide (0.0844 mL, 1.09 mmol) was added dropwise.
  • the reaction solution was heated to room temperature and stirred for 2 hours.
  • the residue obtained by distillation under reduced pressure was dissolved in dichloromethane (100 mL), and methyl (6S) -5-azaspiro [2.4] heptane-6-carboxylate hydrochloride (4.28 g, 24.1 mmol, Tetrahedron Letters 2012. 53. 3847) and triethylamine (6.07 mL, 43.8 mmol) were added dropwise to a dichloromethane solution (100 mL) at -40 ° C under a nitrogen atmosphere. The reaction solution was heated to 0 ° C. and stirred for 2 hours.
  • Step 2 ⁇ 1,5-pentanediylbis [oxy (5-methoxy-2-nitrobenzene-4,1-diyl)] ⁇ bis ⁇ [(6S) -6- (hydroxymethyl) -5-azaspiro [2.4] Hept-5-yl] Metanon ⁇ (5-3)
  • Lithium hydride (714 mg, 32.8 mmol) was added to a solution of compound (5-2) (8.40 g, 10.9 mmol) obtained in step 1 above in tetrahydrofuran (100 mL), and the mixture was stirred at 0 ° C. for 30 minutes. Then, the temperature was raised to room temperature and the mixture was stirred for 1 hour.
  • Step 3 Pentane-1,5-diylbis [oxy (5-methoxy-2-nitrobenzene-4,1-diyl) carbonyl (6S) -5-azaspiro [2.4] heptane-5,6-diylmethanediyl] diazetate ( 5-4)
  • the compound (5-3) (7.70 g, 10.8 mmol) obtained in the above step 2 was dissolved in pyridine (20 mL) and acetic anhydride (10 mL, 105.9 mmol) and stirred at room temperature. Distillation under reduced pressure gave the desired product (5-4) (8.38 g, 97%).
  • Step 4 1,5-pentanediylbis [oxy (2-amino-5-methoxybenzene-4,1-diyl) carbonyl (6S) -5-azaspiro [2.4] heptane-5,6-diylmethanediyl] di Acetate (5-5) After adding 5% palladium carbon (54% water content, 1.00 g) to the N, N-dimethylformamide (100 mL) solution of the compound (5-4) (8.28 g, 10.4 mmol) obtained in step 3 above. , The reaction solution was vigorously stirred at room temperature for 6 hours under a hydrogen atmosphere.
  • Step 5 ⁇ (6S) -5- [4-( ⁇ 5- [4-( ⁇ (6S) -6-[(acetyloxy) methyl] -5-azaspiro [2.4] hept-5-yl ⁇ carbonyl)) -5-Amino-2-methoxyphenoxy] Pentyl ⁇ Oxy) -5-Methoxy-2- ⁇ [(Prop-2-en-1-yloxy) Carbonyl] Amino ⁇ Benzoyl] -5-Azaspiro [2.4] Hept-6 -Il ⁇ Methylacetate (monoallyloxycarbonyl) (5-6) Pyridine (1.10 mL, 13.7 mmol) was added to a solution of compound (5-5) (5.05 g, 6.85 mmol) obtained in step 4 above in dichloromethane (100 mL), and chloroformic acid was added at -78 ° C under a nitrogen atmosphere.
  • Step 6 N-[(2-propen-1-yloxy) carbonyl] -L-valyl-N- ⁇ 4-[( ⁇ [2-( ⁇ (6S) -6-[(acetyloxy) methyl] -5] -Azaspiro [2.4] hept-5-yl ⁇ carbonyl) -5-( ⁇ 5- [4-( ⁇ (6S) -6-[(acetyloxy) methyl] -5-Azaspiro [2.4] hept-5-yl ⁇ ⁇ Carbonyl) -2-methoxy-5- ⁇ [(2-propen-1-yloxy) carbonyl] amino ⁇ phenoxy] pentyl ⁇ oxy) -4-methoxyphenyl] carbamoyl ⁇ oxy) methyl] phenyl ⁇ -L-alanine amide (5-7) The monoallyloxycarbonyl compound (5-6) (2.00 g, 2.44 mmol) obtained in step 5 above and N-[(prop-2-en-1-
  • Step 7 N-[(2-propen-1-yloxy) carbonyl] -L-valyl-N- [4-( ⁇ [(2- ⁇ [(6S) -6- (hydroxymethyl) -5-azaspiro] 2.4] Hept-5-yl] carbonyl ⁇ -5- ⁇ [5-(4- ⁇ [(6S) -6- (hydroxymethyl) -5-azaspiro [2.4] hept-5-yl] carbonyl ⁇ -2- Methoxy-5- ⁇ [(2-propen-1-yloxy) carbonyl] amino ⁇ phenoxy) pentyl] oxy ⁇ -4-methoxyphenyl) carbamoyl] oxy ⁇ methyl) phenyl] -L-alanine amide (5-8) Potassium carbonate (1.49 g, 10.8 mmol) was added to a solution of compound (5-7) (2.64 g, 2.16 mmol) obtained in step 6 above in methanol (10 mL), and the mixture was stirred
  • Step 8 N-[(2-propen-1-yloxy) carbonyl] -L-valyl-N- ⁇ 4-[( ⁇ [(11'S, 11a'S) -11'-hydroxy-8'- ⁇ [5-( ⁇ (11'S, 11a'S) -11'-hydroxy-7'-methoxy-5'-oxo-10'-[(2-propen-1-yloxy) carbonyl] -5', 10', 11', 11a'- Tetrahydro-1'H-spiro [cyclopropane-1,2'-pyrrolo [2,1-c] [1,4] benzodiazepine] -8'-yl ⁇ oxy) pentyl] oxy ⁇ -7'-methoxy-5 '-Oxo-11', 11a'-dihydro-1'H-spiro [cyclopropane-1,2'-pyrrolo [2,1-c] [1,4] benzodiazepine] -10'(5'H)- Il
  • Step 9 L-Valyl-N- ⁇ 4-[( ⁇ [(11'S, 11a'S) -11'-Hydroxy-7'-Methoxy-8'-[(5- ⁇ [(11a'S) -7'-Methoxy- 5'-oxo-5', 11a'-dihydro-1'H-spiro [cyclopropane-1,2'-piroro [2,1-c] [1,4] benzodiazepine] -8'-yl] oxy ⁇ Pentyl) Oxy] -5'-oxo-11', 11a'-dihydro-1'H-spiro [cyclopropane-1,2'-pyroro [2,1-c] [1,4] benzodiazepine] -10'(5'H) -yl] carbonyl ⁇ oxy) methyl] phenyl ⁇ -L-alanine amide (5-10) The compound (5-9) (2.05 g, 1.80 mmol) obtained in
  • Step 10 N- [4- (11,12-didehydrodibenzo [b, f] azosin-5 (6H) -yl) -4-oxobutanoyl] glycylglycyl-L-valyl-N- ⁇ 4-[( ⁇ [(11'S, 11a'S) -11'-hydroxy-7'-methoxy-8'-[(5- ⁇ [(11a'S) -7'-methoxy-5'-oxo-5', 11a'-dihydro-1 'H-spiro [cyclopropane-1,2'-pyrolo [2,1-c] [1,4] benzodiazepine] -8'-yl] oxy ⁇ pentyl) oxy] -5'-oxo-11', 11a '-Dihydro-1'H-spiro [cyclopropane-1,2'-piroro [2,1-c] [1,4] benzodiazepine
  • Step 1 Methyl (6S) -5- [4- (benzyloxy) -5-methoxy-2-nitrobenzoyl] -5-azaspiro [2.4] heptane-6-carboxylate (6-2) 4- (benzyloxy) -5-methoxy-2-nitrobenzoic acid (6-1) (6.07 g, 20.0 mmol, Tetrahedron 1995, 51, 5617), N, N-dimethylformamide (1.08 mL, 13.9 mmol) Oxalyl chloride (3.43 mL, 40.0 mmol) was added dropwise to a solution of dichloromethane (100 mL) under ice-cooling over 5 minutes.
  • the reaction solution was stirred at room temperature for 5 hours and then distilled off under reduced pressure.
  • the obtained residue was dissolved in dichloromethane (20 mL) and distilled off under reduced pressure. After repeating this operation three times, the residue was suspended in dichloromethane (5 mL), excess diethyl ether and hexane were added thereto, and the mixture was filtered and dried under reduced pressure to obtain crude acid chloride.
  • the obtained acid chloride was dissolved in dichloromethane, cooled to -40 ° C (dry ice-acetonitrile bath), and methyl (6S) -5-azaspiro [2.4] heptane-6-carboxylate hydrochloride (4.22 g, 22.0 mmol).
  • Step 2 (11a'S) -8'-(benzyloxy) -7'-methoxy-1'H-spiro [cyclopropane-1,2'-pyrolo [2,1-c] [1,4] benzodiazepine]- 5', 11'(10'H, 11a'H)-Zeon (6-3)
  • Rane-nickel (7.00 g) was added to a solution of the compound (6-2) (6.55 g, 16.0 mmol) obtained in the above step 1 in ethanol (150 mL) and tetrahydrofuran (150 mL) under a nitrogen atmosphere. Hydrazine monohydrate (7 mL) was added to the reaction mixture, and the temperature was gradually raised to 50 ° C.
  • Step 3 (11a'S) -8'-(benzyloxy) -7'-methoxy-10'- ⁇ [2- (trimethylsilyl) ethoxy] methyl ⁇ -1'H-spiro [cyclopropane-1,2'-piroro [2,1-c] [1,4] Benzodiazepine] -5', 11'(10'H, 11a'H) -dione (6-4) A 2.6 mol / L normal butyllithium normal hexane solution (12.0 mL, 31.8) in a tetrahydrofuran (150 mL) solution of the compound (6-3) (10.0 g, 26.4 mmol) obtained in step 2 above at -40 ° C.
  • Step 4 (11a'S) -8'-Hydroxy-7'-Methoxy-10'- ⁇ [2- (Trimethylsilyl) ethoxy] Methyl ⁇ -1'H-Spiro [Cyclopropane-1,2'-Piroro [2, 1-c] [1,4] Benzodiazepine] -5', 11'(10'H, 11a'H) -dione (6-5)
  • a 5% palladium carbon catalyst (5.00 g) in a solution of the compound (6-4) (18.7 g, 36.8 mmol) obtained in step 3 above in a solution of terrorahydrofuran (50 mL) and ethanol (100 mL) under a nitrogen atmosphere.
  • Python 5% palladium carbon catalyst
  • Step 5 (11a'S) -8'-[(5-bromopentyl) oxy] -7'-methoxy-10'- ⁇ [2- (trimethylsilyl) ethoxy] methyl ⁇ -1'H-spiro [cyclopropane-1] , 2'-Piroro [2,1-c] [1,4] Benzodiazepine] -5', 11'(10'H, 11a'H) -dione (6-6)
  • the compound (6-5) (2.77 g, 6.62 mmol) obtained in the above step 4 was reacted in the same manner as in Step 2 of Example 2-1 to produce the target product (6-6) (3.31 g, 88%).
  • Step 6 (11a'S) -8'-[(5-bromopentyl) oxy] -7'-methoxy-1', 11a'-dihydro-5'H-spiro [cyclopropane-1,2'-pyrolo [2] , 1-c] [1,4] Benzodiazepine] -5'-on (6-7)
  • the compound (6-6) (3.31 g, 5.83 mmol) obtained in step 5 above was reacted in the same manner as in step 7 of Example 2-1 to produce the target product (6-7) (1.11 g, 45%).
  • Step 7 (11a'S) -8'-[(5-bromopentyl) oxy] -7'-methoxy-1', 10', 11', 11a'-tetrahydro-5'H-spiro [cyclopropane-1, 2'-Piroro [2,1-c] [1,4] Benzodiazepine] -5'-on (6-8)
  • the compound (6-7) (2.56 g, 6.08 mmol) obtained in the above step 6 was reacted in the same manner as in Step 2-1 of Example 2-1 to produce the target product (6-8) (1.15 g, 45%).
  • Step 8 Prop-2-en-1-yl (11a'S) -8'-[(5-bromopentyl) oxy] -7'-methoxy-5'-oxo-11', 11a'-dihydro-1'H -Spiro [Cyclopropane-1,2'-Piroro [2,1-c] [1,4] Benzodiazepine] -10'(5'H) -carboxylate (6-9)
  • the compound (6-8) (1.15 g, 2.72 mmol) obtained in the above step 7 was reacted in the same manner as in Step 2-1 Step 9 to produce the target product (6-9) (1.14 g, 82%).
  • Step 9 N-[(prop-2-en-1-yloxy) carbonyl] -L-valyl-N- ⁇ 4-[( ⁇ [(11'S, 11a'S) -11'- ⁇ [tert-butyl (dimethyl)) Cyril] oxy ⁇ -7'-methoxy-8'- ⁇ [5-( ⁇ (11a'S) -7'-methoxy-5'-oxo-10'-[(prop-2-en-1-yloxy) carbonyl] -5', 10', 11', 11a'-tetrahydro-1'H-spiro [cyclopropane-1,2'-pyroro [2,1-c] [1,4] benzodiazepine] -8'-yl ⁇ Oxy) Pentyl] Oxy ⁇ -5'-oxo-11', 11a'-dihydro-1'H-spiro [cyclopropane-1,2'-pyrolo [2,1-c] [1,4] benz
  • Step 10 N-[(prop-2-en-1-yloxy) carbonyl] -L-valyl-N- ⁇ 4-[( ⁇ [(11'S, 11a'S) -11'-hydroxy-7'-methoxy-8 '- ⁇ [5-( ⁇ (11a'S) -7'-methoxy-5'-oxo-10'-[(prop-2-en-1-yloxy) carbonyl] -5', 10', 11', 11a '-Tetrahydro-1'H-spiro [cyclopropane-1,2'-pyrrolo [2,1-c] [1,4] benzodiazepine] -8'-yl ⁇ oxy) pentyl] oxy ⁇ -5'-oxo -11', 11a'-dihydro-1'H-spiro [cyclopropane-1,2'-pyrrolo [2,1-c] [1,4] benzodiazepine] -10'(5'H) -yl] carbon
  • Step 11 L-Valyl-N- ⁇ 4-[( ⁇ [(11'S, 11a'S) -11'-Hydroxy-7'-Methoxy-8'-[(5- ⁇ [(11a'S) -7'-Methoxy- 5'-oxo-5', 10', 11', 11a'-tetrahydro-1'H-spiro [cyclopropane-1,2'-pyroro [2,1-c] [1,4] benzodiazepine] -8 '-Il] Oxy ⁇ Pentyl) Oxy] -5'-Oxo-11', 11a'-dihydro-1'H-spiro [Cyclopropane-1,2'-Piroro [2,1-c] [1,4 ] Benzodiazepine] -10'(5'H) -yl] carbonyl ⁇ oxy) methyl] phenyl ⁇ -L-alanine amide (6-12) The compound (6-11) (0.3
  • Step 12 N- [4- (11,12-didehydrodibenzo [b, f] azosin-5 (6H) -yl) -4-oxobutanoyl] glycylglycyl-L-valyl-N- ⁇ 4-[( ⁇ [(11'S, 11a'S) -11'-hydroxy-7'-methoxy-8'-[(5- ⁇ [(11a'S) -7'-methoxy-5'-oxo-5', 10', 11', 11a'-tetrahydro-1'H-spiro [cyclopropane-1,2'-pyrolo [2,1-c] [1,4] benzodiazepine] -8'-yl] oxy ⁇ pentyl) oxy] -5'- Oxo-11', 11a'-dihydro-1'H-spiro [cyclopropane-1,2'-piroro [2,1-c] [1,4] benz
  • Step 1 (MSG1-) Asn Commercially available monosialo-Asn free (1S2G / 1G2S-10NC-Asn, manufactured by GlyTech Laboratory Co., Ltd.) (called “(MSG-) Asn”) (500 mg) is separated by reverse phase HPLC under the following conditions. The cells were purified and separated into (MSG1-) Asn (retention time around 15 to 19 min) eluted as the 1st main peak and (MSG2-) Asn (retention time around 21 to 26 min) eluted as the 2nd main peak.
  • a 0.1% formic acid aqueous solution is used as an eluent
  • an ELS-PDA trigger preparative system manufactured by JASCO Corporation
  • Inertsil ODS-3 (10um, 30 ⁇ x250mm, manufactured by GL Science Co., Ltd.) is used for the column.
  • the flow velocity was set to 30 mL / min.
  • the first peak UV-detected (210 nm) during elution was fractionated and lyophilized to give the desired product (238 mg).
  • a 0.1% trifluoroacetic acid aqueous solution was used as an eluent, an ELS-PDA trigger preparative system (manufactured by JASCO Corporation) was used for the apparatus, and Inertsil ODS-3 (manufactured by GL Science Co., Ltd.) was used for the column.
  • the peak of the target product detected by UV (210 nm) during elution was separated and lyophilized to obtain the target product (117 mg).
  • Step 3 [N 3- PEG (3)]-MSG1 11-Azide-3,6,9-trioxaundecane-1-amine (0.108 mL, 0.541 mmol) and MSG1 (117 mg, 0.068) obtained in step 2 above were placed in a 5 ml sampling tube (Ina Optica Co., Ltd.). An aqueous solution (1.2 mL) of mmol) was added, the mixture was stirred for 1 hour, and then lyophilized.
  • a small centrifuge (Hitachi Koki, CF16RX) was used to settle the solid matter and remove the supernatant. Further, diethyl ether (10 ml) was added, and after centrifugation, decantation was performed. Subsequently, acetonitrile (10 mL) was added, and after centrifugation, the decantation operation was repeated twice, and then dried under reduced pressure to obtain a crude product. The obtained solid product was purified by reverse phase HPLC under the same conditions as in Step 2 above to obtain the target product (94.2 mg).
  • Step 4 [N 3- PEG (3)]-MSG1-Ox
  • a 5 mL sampling tube manufactured by Ina Optica Co., Ltd.
  • An aqueous solution (520 ⁇ l) of tripotassium phosphate (165 mg, 0.78 mmol) was added to the reaction solution after ice-cooling, and the mixture was stirred under ice-cooling for 3 hours.
  • the obtained reaction solution was ultrafiltered using Amicon Ultra (Ultracell 30K, manufactured by Merck Millipore) to remove solid matter.
  • the passing liquid was purified by gel filtration chromatography.
  • Purif-Rp2 (manufactured by Shoko Scientific) is used for the device, HiPrep 26/10 Desalting (manufactured by GE Healthcare) is used for the column, 0.03% -NH 3 aqueous solution is used for the mobile phase, and the flow velocity is adjusted.
  • the fractionation volume was 10 mL at 10 mL / min.
  • Step 1 Preparation of (MSG-) Asn Commercially available 1S2G / 1G2S-10NC-Asn-Fmoc (manufactured by GlyTech Co., Ltd.) (called “Fmoc- (MSG-) Asn") (1000 mg) was dissolved in ethanol / water (1/1) (10 mL), 1N aqueous sodium hydroxide solution (1.75 mL, 4 eq) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 3 hours. After completion of the reaction, the reaction solution was ultrafiltered using Amicon Ultra (30K, manufactured by Millipore) to remove solids, and 1N hydrochloric acid (832 ⁇ l, 1.9 equivalents) was added to the obtained passing solution.
  • Amicon Ultra (30K, manufactured by Millipore
  • the solvent was removed using a high-speed concentrator V-10 (manufactured by Biotage). Acetonitrile was added, and the solvent was removed using a high-speed concentrator V-10 (manufactured by Biotage), followed by reverse phase HPLC separation and purification.
  • the eluent was 0.1% trifluoroacetic acid aqueous solution and 0.1% trifluoroacetic acid acetonitrile solution, Purif-Rp2 (manufactured by Shoko Scientific) was used for the device, and Inertsil ODS-3 (manufactured by GL Science) was used for the column. It was used. Fractions containing the object UV-detected (220 nm) during elution were combined and lyophilized.
  • Step 2 Synthesis of MSG
  • the compound (840 mg) obtained in Step 1 was dissolved in a 200 mM phosphate buffer solution (pH 6.25) (6000 ⁇ L), and EndoM (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., 1 U / mL)).
  • Aqueous solution 200 ⁇ L was added and incubated at 28 ° C. for 26 hours. Since the reaction was not completed, an aqueous solution of EndoM (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., 1 U / mL) (50 ⁇ L) was added, and the mixture was incubated at 28 ° C. for 2 hours and then left at room temperature until the reaction was completed.
  • reaction solution was ultrafiltered using Amicon Ultra (30K, manufactured by Millipore). Trifluoroacetic acid (80 ⁇ l) was added to the obtained passing solution, and reverse phase HPLC separation and purification was performed.
  • the eluent was 0.1% trifluoroacetic acid aqueous solution and 0.1% trifluoroacetic acid acetonitrile solution, Purif-Rp2 (manufactured by Shoko Scientific) was used for the device, and Inertsil ODS-3 (GL Science) was used for the column. Made) was used. Fractions containing the object UV-detected (220 nm) during elution were combined and lyophilized.
  • Step 3 Synthesis of [N 3- PEG (3)]-MSG Using the compound (120 mg) obtained in Step 2 above, the target product (88.6 mg) was used in the same manner as in Step 3 of Example 3.
  • Got ESI-MS Calcd for C 73 H 124 N 8 O 51 : [M + 2H] 2+ 965.37, Found 965.37
  • Step 4 [N 3- PEG (3)]-synthesis of MSG-Ox Using the synthesized compound (100 mg) obtained in Step 3 above, the target product (88 mg) was used in the same manner as in Step 4 of Example 3. ) was obtained.
  • Step 1 [N 3- PEG (3)] 2- SG (10) 11-Azide-3,6,9-trioxaundecane-1-amine (0.096 mL, 0.485 mmol), disialooctasaccharide (50 mg, 0.24 mmol) in a 5 ml sampling tube (Ina Optica Co., Ltd.) (0.5 mL) was added, and the mixture was stirred for 1 hour and then lyophilized.
  • N of O- (7-azabenzotriazole-1-yl) -N, N, N', N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate 92 mg, 0.24 mmol
  • N-Dimethylformamide solution (0.6 mL) and diisopropylethylamine (0.042 mL, 0.24 mmol) were added, and the mixture was stirred at 37 ° C. for 4 hours. After completion of the reaction, the reaction solution was transferred to a centrifuge tube (50 ml) to which diethyl ether (20 ml) had been added in advance. A small centrifuge (Hitachi Koki, CF16RX) was used to settle the solid matter and remove the supernatant. Diethyl ether (20 ml) was added and decanted.
  • Step 2 [N 3- PEG (3)] 2- SG (10) -Ox In a 5 mL sampling tube (manufactured by Ina Optica Co., Ltd.), the compound (40 mg) synthesized in step 1 above, 2-chloro-1,3-dimethyl-1H-benzimidazol-3-ium-chloride (manufactured by Fushimi Pharmaceutical Co., Ltd.) , 17.9 mg, 0.083 mmol) was added (200 ⁇ l). An aqueous solution (200 ⁇ l) of tripotassium phosphate (52.6 mg, 0.25 mmol) was added to the reaction solution after ice-cooling, and the mixture was stirred under ice-cooling for 2 hours.
  • tripotassium phosphate 52.6 mg, 0.25 mmol
  • the obtained reaction solution was ultrafiltered using Amicon Ultra (Ultracell 30K, manufactured by Merck Millipore) to remove solid matter.
  • the passing liquid was purified by gel filtration chromatography.
  • Purif-Rp2 (manufactured by Shoko Scientific) is used for the device, HiPrep 26/10 Desalting (manufactured by GE Healthcare) is used for the column, 0.03% NH3 aqueous solution is used for the mobile phase, and the flow velocity is adjusted.
  • the fractionation volume was 10 mL at 10 mL / min.
  • Example 6 Mouse anti-CLDN6 antibody B1-producing hybridoma (218B1) and mouse anti-CLDN6 antibody C7-producing hybridoma (218C7) 6-1. Acquisition of mouse immunity and hybridoma 1-1) Preparation of cells for mouse immunization 2 ⁇ 10 6 or 5 ⁇ 10 6 NOR-P1 cells (human pancreatic cancer cell line, RIKEN RCB-2139) were used as RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute-). 1640) Collected after culturing in 10% FBS (fetal bovine serum) (+) medium (10 ml or 20 ml) for 5 days, washed twice with PBS (phosphate buffered saline), and re-sprayed in PBS (300 ⁇ l). It became cloudy.
  • FBS fetal bovine serum
  • PBS phosphate buffered saline
  • NOR-P1 cells (2 x 10 6 cells) were immunized intraperitoneally at intervals of about 1 week. Approximately 2 weeks after the 5th immunization, NOR-P1 cells (5 x 10 6 cells) were immunized into the abdominal cavity. About 3 weeks after the 6th immunization, NOR-P1 cells (2 x 10 6 cells) were immunized into the abdominal cavity. At the 8th to 10th times, 2 ⁇ 10 6 NOR-P1 cells were immunized into the abdominal cavity at intervals of about 2 weeks.
  • the cell suspension is centrifuged (1500 rpm, 5 minutes) to gently loosen the cells of the obtained precipitated fraction, and then RPMI1640 containing HAT medium (10% Low IgG FBS, HAT Media Supplement, 5% BriClone). Medium; 200 ml) was loosely suspended.
  • HAT medium 10% Low IgG FBS, HAT Media Supplement, 5% BriClone. Medium; 200 ml was loosely suspended.
  • the suspension was dispensed into 96-well culture plates at 200 ⁇ l / well and cultured in an incubator at 37 ° C. and 5% CO 2 for 6 days.
  • hybridoma screening probe DT3C a recombinant complex protein
  • This DT3C is a protein in which the catalytic region of diphtheria toxin (DT) and the antibody binding region of streptococcal protein G are genetically engineered.
  • DT3C specifically binds to the Fc portion of the antibody, and when taken up into cells, it induces cell death by inhibiting protein synthesis.
  • DT3C specifically binds to the Fc portion of the antibody, and when taken up into cells, it induces cell death by inhibiting protein synthesis.
  • Biotin / PBS solution was added, incubated for 30 minutes on a shaker, washed twice with 100 mM glycine / PBS solution (25 ml), and then washed once with PBS (10 ml).
  • the washed cells were resuspended in 200 ⁇ l lysis buffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7.4, 1% DDM, Protease inhibitor, Complete EDTA free (Roche) 1 tablet / 50 ml) and 30 at 4 ° C. Processed for minutes.
  • a cell lysate was prepared by centrifugation (13000 rpm, 20 minutes, 4 ° C.).
  • Protein G Sepharose (Protein G Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare)) was replaced with a lysis buffer, and Protein G Sepharose / lysis buffer (50% slurry; 30 ⁇ l) was added to the cell lysate at 4 ° C. After rotating in 30 minutes, the supernatant was collected by centrifugation at 4 ° C. for 1 minute. To this supernatant was added 218B1 antibody or 218C7 antibody (about 3 ⁇ g), rotated at 4 ° C. for 30 minutes, then Protein G Sepharose / dissolution buffer (50% slurry; 60 ⁇ l) was added, and the mixture was rotated at 4 ° C. for 1 hour.
  • Protein G Sepharose was washed 6 times with lysis buffer (1 ml) and then resuspended in 1 ⁇ SDS sample buffer (BioRad). After treating the suspension at 100 ° C. for 5 minutes, the solution was recovered and used as a sample for SDS-PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis).
  • SDS-PAGE and Western blotting The SDS-PAGE sample prepared by 2-1) is SuperSep. After stacking at 50 mV for 30 minutes using Ace 5-20% (Wako), the mixture was run at 200 mV for 1 hour, and then blotting from the gel to the membrane at 12 mV for 47 minutes. The membrane was washed with PBS-T (PBS ( ⁇ ) ⁇ 0.02% Tween 20) and then blocked for 1 hour. The membrane was washed 3 times with PBS-T for 5 minutes and then reacted with Streptavidin-horseradish peroxidase conjugate (GE Healthcare; 2000-fold diluted with PBS-T) for 1 hour.
  • PBS-T PBS ( ⁇ ) ⁇ 0.02% Tween 20
  • the band of interest was detected using the enhanced chemiluminecscence (ECL) method.
  • ECL enhanced chemiluminecscence
  • Protein G Sepharose / lysis buffer (50% slurry; 180 ⁇ l) was added to the cell lysate, rotated at 4 ° C for 30 minutes, and then centrifuged at 4 ° C for 1 minute to collect the supernatant.
  • 218B1 antibody about 9 ⁇ g
  • Protein G Sepharose / lysis buffer (50% slurry; 180 ⁇ l) was added, and the mixture was rotated at 4 ° C for 1 hour.
  • Protein G Sepharose was washed 6 times with lysis buffer (1 ml) and then resuspended in 1 ⁇ SDS sample buffer. After treating the suspension at 100 ° C.
  • the solution was collected and used as a sample for SDS-PAGE.
  • SDS-PAGE was performed in the same manner as in 2-2), and the electrophoresis gel was stained with CBB. A portion corresponding to 18 kDa was cut out from the electrophoresis gel and subjected to mass spectrometry. As a result of mass spectrometry, the gel piece was found to contain Claudin-6.
  • the buffer replacement step after purification by rProtein A affinity chromatography was carried out at 4-6 ° C.
  • the culture supernatant was applied to a column packed with MabSelectSuRe (GE Healthcare Bioscience) equilibrated with PBS. After all the culture medium was contained in the column, the column was washed with PBS having a column volume of 2 times or more. It was then eluted with 2M arginine hydrochloride solution (pH 4.0) to collect antibody-containing fractions. The fraction was liquid-substituted with PBS (-) by dialysis (Thermo Scientific, Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette).
  • Example 7 In vitro evaluation of mouse anti-CLDN6 antibodies
  • B1 and C7 7-1 Evaluation of binding ability of mouse anti-CLDN6 antibody by flow cytometry
  • the binding potential of human CLDN6 and family molecules CLDN3, CLDN4, CLDN9 of the mouse anti-CLDN6 antibody prepared in Example 6 was evaluated by flow cytometry.
  • Lipofectamine 2000 of human CLDN3 / pCMV6-Entry, human CLDN4 / pCMV6-Entry, human CLDN6 / pCMV-Entry, human CLDN9 / pCMV6-Entry, or pCMV6-Entry purchased from Origene into 293T cells (Thermo Fisher Scientific HCL4517).
  • mouse anti-CLDN6 antibodies B1 and C7 were evaluated using the anti-mouse IgG reagent Mab-ZAP (ADVANCED TARGETING SYSTEMS) to which a toxin (saporin) that inhibits protein synthesis was bound. did.
  • Mab-ZAP is taken up into cells depending on the intracellular activity of mouse anti-CLDN6 antibody, and saporin that inhibits protein synthesis is released into cells, thereby suppressing cell proliferation.
  • JEG-3 (ATCC HTB-36), a human chorionic villus cancer strain of human CLDN6-positive cells, NIH: OVCAR-3 (ATCC HTB-161), a human ovarian cancer strain of human CLDN6-positive cells, or human CLDN6 negative BxPC-3 (ATCC CRL-1687), a human pancreatic cancer strain of cells, was seeded on a 96-well cell culture microplate at 2x10 3 cells / well and cultured overnight at 37 ° C. and 5% CO 2. did.
  • Mab-ZAP final concentration: 0.5 nM
  • AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG which does not bind toxin, so that the final concentration of mouse anti-CLDN6 antibody or mouse IgG1 antibody (R & D Systems) is 1 nM.
  • a mixed solution mixed with Fc ⁇ Fragment Specific (Jackson ImmunoResearch) (final concentration: 0.5 nM) was added, and the mixture was cultured under the conditions of 37 ° C. and 5% CO2 for 5 days. The number of viable cells was measured by quantification of ATP activity using the CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega).
  • the cell growth inhibitory effect of the addition of the anti-CLDN6 antibody was determined by the relative survival rate with the value of the well without the mixed solution added as 100%.
  • Figure 41 shows the results.
  • Mouse anti-CLDN6 antibodies (B1, C7) showed a cell growth inhibitory effect on human CLDN6-positive cell lines JEG-3 and NIH: OVCAR-3.
  • no cell growth inhibitory effect was observed on the human CLDN6-negative cell line BxPC-3.
  • the mouse IgG1 antibody did not show a cell growth inhibitory effect on any cell line.
  • the prepared anti-CLDN6 antibody (B1, C7) has an internalizing activity and is considered to be suitable as an antibody for antibody-drug conjugate.
  • Example 8 Determining the nucleotide sequence of cDNA encoding the variable regions of mouse anti-CLDN6 antibodies
  • B1 and C7 8-1 Determination of nucleotide sequence of cDNA encoding variable region of B1 antibody
  • 8-1-1 Preparation of total RNA of B1 antibody-producing hybridoma
  • total RNA was prepared from the B1 antibody-producing hybridoma using TRIzol Reagent (Ambion).
  • 8-1-2 Amplification and sequence determination of cDNA encoding the light chain variable region of B1 antibody by 5'-RACE PCR Amplification of the cDNA encoding the light chain variable region was prepared in Example 8-1-1.
  • the nucleotide sequence of the cDNA encoding the variable region of the light chain of the determined B1 antibody is shown in SEQ ID NO: 18, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 19.
  • 8-1-3 Amplification of cDNA encoding the heavy chain variable region and determination of sequence of B1 antibody by 5'-RACE PCR Amplification of cDNA encoding the heavy chain variable region was prepared in Example 8-1-1. The total RNA was about 1 ⁇ g and SMARTer RACE 5'/3'Kit (Clontech) was used.
  • Example 8-2 Determination of nucleotide sequence of cDNA encoding variable region of C7 antibody The procedure was the same as in Example 8-1.
  • the nucleotide sequence of the cDNA encoding the variable region of the light chain of the determined C7 antibody is shown in SEQ ID NO: 22, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 23.
  • the nucleotide sequence of the cDNA encoding the variable region of the heavy chain is shown in SEQ ID NO: 24, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 25.
  • Example 9 Preparation of chimeric anti-CLDN6 antibody chB1 9-1: Construction of expression vector for chimeric anti-CLDN6 antibody chB1 9-1-1: Construction of chimerized and humanized light chain expression vector pCMA-LK A restriction enzyme for plasmid pcDNA3.3-TOPO / LacZ (Invitrogen) In-Fusion HD PCR cloning kit containing a fragment of about 5.4 kb obtained by digestion with XbaI and PmeI and a DNA sequence encoding the human light chain signal sequence and the human kappa chain constant region shown in SEQ ID NO: 26. (Clontech) was used for binding to prepare pcDNA3.3 / LK.
  • PCMA-LK was constructed by removing the neomycin expression unit from pcDNA3.3 / LK.
  • 9-1-2 Chimerization and humanization Construction of IgG1LALA type heavy chain expression vector pCMA-G1LALA
  • a DNA fragment containing the human heavy chain signal sequence shown in SEQ ID NO: 27 and the DNA sequence encoding the human IgG1 LALA constant region was bound using an In-Fusion HD PCR cloning kit (Clontech) to construct pCMA-G1LALA. ..
  • 9-1-3 Construction of chimeric chB1 heavy chain expression vector
  • the DNA fragments shown in nucleotide numbers 36 to 440 of the nucleotide sequence of chB1 heavy chain shown in SEQ ID NO: 33 were synthesized (GENEART).
  • a chB1 heavy chain expression vector was constructed by inserting a synthesized DNA fragment into a site where pCMA-G1LALA was cleaved with the restriction enzyme BlpI using an In-Fusion HD PCR cloning kit (Clontech).
  • the amino acid sequence of the chB1 heavy chain is shown in SEQ ID NO: 32.
  • chB1 The obtained chimeric anti-CLDN6 antibody was named "chB1".
  • 9-2-2 Purification of chimeric antibody chB1 The antibody was purified from the culture supernatant obtained in Example 9-2-1 in a one-step step of rProtein A affinity chromatography. After applying the culture supernatant to a column (manufactured by GE Healthcare Bioscience) filled with MabSelectSuRe equilibrated with PBS, the column was washed with PBS having at least twice the column volume.
  • Example 10 Preparation of humanized anti-CLDN6 antibody 10-1: Humanized design of anti-CLDN6 antibody 10-1-1: Molecular modeling of the variable region of the chimeric antibody chB1 Molecular modeling of the variable region of chB1 is a method known as homology modeling (Methods in Enzymology, 203, 121-). 153, (1991)) was used. A structure (PDB ID: 1XIW) registered in the Protein Data Bank (Nuc. Acid Res. 35, D301-D303 (2007)), which has high sequence identity for the variable regions of the heavy and light chains of chB1. A commercially available protein three-dimensional structure analysis program BioLuminate (manufactured by Schrodinger) was used as a template.
  • BioLuminate manufactured by Schrodinger
  • the heavy chain full length amino acid sequence of hH1 is set forth in SEQ ID NO: 52.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52 is set forth in SEQ ID NO: 53.
  • the heavy chain full length amino acid sequence of hH2 is set forth in SEQ ID NO: 56.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 56 is set forth in SEQ ID NO: 57.
  • the heavy chain full length amino acid sequence of hH3 is set forth in SEQ ID NO: 60.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60 is set forth in SEQ ID NO: 61.
  • the light chain full length amino acid sequence of hL1 is set forth in SEQ ID NO: 36.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36 is set forth in SEQ ID NO: 37.
  • the light chain full length amino acid sequence of hL2 is set forth in SEQ ID NO: 40.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40 is set forth in SEQ ID NO: 41.
  • the light chain full length amino acid sequence of hL3 is set forth in SEQ ID NO: 44.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44 is set forth in SEQ ID NO: 45.
  • the light chain full length amino acid sequence of hL4 is set forth in SEQ ID NO: 48.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 48 is set forth in SEQ ID NO: 49.
  • H1L1 antibody An antibody consisting of hH1 and hL1 is referred to as “H1L1 antibody” or “H1L1”.
  • Antibodies consisting of hH2 and hL2 are referred to as “H2L2 antibodies” or “H2L2”.
  • An antibody consisting of hH1 and hL3 is referred to as “H1L3 antibody” or “H1L3”.
  • Antibodies consisting of hH2 and hL4 are referred to as “H2L4 antibody” or "H2L4".
  • An antibody consisting of hH3 and hL3 is referred to as "H3L3 antibody” or "H3L3”.
  • 10-5 Preparation of humanized anti-CLDN6 antibody
  • 10-5-1 Construction of humanized heavy chain expression vector
  • 10-5-1-1 Construction of hH1 expression vector Nucleotide number of hH1 nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 53 The DNA fragments shown in 36 to 440 were synthesized (GENEART). The hH1 expression vector was constructed in the same manner as in Example 9-1-3.
  • 10-5-1-2 Construction of hH2 expression vector The DNA fragments shown in nucleotide numbers 36 to 440 of the nucleotide sequence of hH2 shown in SEQ ID NO: 57 were synthesized (GENEART). An hH2 expression vector was constructed in the same manner as in Example 9-1-3.
  • 10-5-1-3 Construction of hH3 expression vector The DNA fragments shown in nucleotide numbers 36 to 440 of the nucleotide sequence of hH2 shown in SEQ ID NO: 61 were synthesized (GENEART). The hH3 expression vector was constructed in the same manner as in Example 9-1-3. 10-5-2: Construction of humanized light chain expression vector 10-5-2-1: Construction of hL1 expression vector The DNA fragments shown in nucleotide numbers 37 to 402 of the nucleotide sequence of hL1 shown in SEQ ID NO: 37 were synthesized. (GENEART).
  • An hL1 expression vector was constructed by inserting a synthesized DNA fragment into a site where pCMA-LK was cut with the restriction enzyme BsiWI using an In-Fusion HD PCR cloning kit (Clontech).
  • 10-5-2-2 Construction of hL2 expression vector The DNA fragment shown in nucleotide numbers 37 to 402 of the nucleotide sequence of hL2 shown in SEQ ID NO: 41 was synthesized (GENEART).
  • An hL2 expression vector was constructed in the same manner as in Example 10-5-2-1.
  • 10-5-2-3 Construction of hL3 expression vector The DNA fragment shown in nucleotide numbers 37 to 402 of the nucleotide sequence of hL3 shown in SEQ ID NO: 45 was synthesized (GENEART). An hL3 expression vector was constructed in the same manner as in Example 10-5-2-1.
  • 10-5-2-4 Construction of hL4 expression vector The DNA fragment shown in nucleotide numbers 37 to 402 of the nucleotide sequence of hL4 shown in SEQ ID NO: 49 was synthesized (GENEART). An hL4 expression vector was constructed in the same manner as in Example 10-5-2-1.
  • 10-5-3 Preparation of humanized antibody 10-5-3-1: Production of humanized antibody H1L1, H2L2, H1L3, H2L4, and H3L3 Production was carried out in the same manner as in Example 9-2-1. H1L1, H2L2, H1L3, H2L4, and H3L3 were produced by the combination of the heavy chain expression vector and the light chain expression vector corresponding to the combination of the heavy chain and the light chain shown in Example 10-4. 10-5-3-2: 2 step purification of humanized antibodies H1L1, H2L2, H1L3, H2L4, and H3L3 The culture supernatant obtained in Example 10-5-3-1 was subjected to rProtein A affinity chromatography and ceramic hydroxyapatite.
  • the antibody was concentrated with Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20 (molecular weight cut off UF10K, Sartorius) to adjust the IgG concentration to 50 mg / mL. Finally, it was filtered with a Minisart-Plus filter (Sartorius) to prepare a purified sample.
  • VIVASPIN20 molecular weight cut off UF10K, Sartorius
  • Example 11 Evaluation of binding ability of humanized anti-CLDN6 antibody by flow cytometry The binding ability of the humanized anti-CLDN6 antibody prepared in Example 10 to human CLDN6 and family molecules CLDN3, CLDN4, and CLDN9 was evaluated by flow cytometry. 293T cells transiently transgeniced in the same manner as in Example 7-1 were used. To cells into which the human CLDN6 or human CLDN9 gene has been introduced, humanized anti-CLDN6 antibodies H1L1, H2L2, H1L3, H2L4, and H3L3, or human IgG1 control antibody (CALBIOCHEM) are added at final concentrations of 100 nM, 20 nM, 4 nM, 0.8 nM. Suspended and allowed to stand at 4 ° C.
  • CACHEM human IgG1 control antibody
  • Humanized anti-CLDN6 antibodies H1L1, H2L2, H1L3, H2L4, and H3L3 were added to cells into which the human CLDN3, human CLDN4 gene, or empty vector had been introduced, suspended at a final concentration of 100 nM, and allowed to stand at 4 ° C for 30 minutes. I put it.
  • FITC AffiniPureF (ab') washed with Dulbecco's phosphate buffered saline (Sigma-Aldrich) (hereinafter referred to as 5% FBS-containing PBS) containing 5% fetal bovine serum (Hyclone) and then diluted 150-fold with 5% FBS-containing PBS.
  • Example 12 Preparation of Trastuzumab mutant 12-1: Construction of heavy chain expression vector of Trastuzumab-LALA Synthesis of DNA fragments shown in nucleotide numbers 36 to 434 of the heavy chain nucleotide sequence of Trastuzumab-LALA shown in SEQ ID NO: 74. (GENEART). An expression vector was constructed in the same manner as in Example 9-1-3. The amino acid sequence of the heavy chain of Trastuzumab-LALA is shown in SEQ ID NO: 75.
  • Trastuzumab mutant Trastuzumab-LALA was purified from the culture supernatant obtained in Example 12-3 in the same manner as in Example 9-2-2. However, buffer substitution was performed with 50 mM phosphate buffer solution (pH 6.0) instead of PBS ( ⁇ ).
  • Step 1 (Fuc ⁇ 1, 6) Preparation of GlcNAc-Trastuzumab 22 mg / mL (25 mM histidine solution (pH 6.0), 5% sorbitol solution) (45.5 mL) of the Trastuzumab solution prepared in Reference Example 3 was used in common operation C. Then, the buffer solution was exchanged with 50 mM phosphate buffer solution (pH 6.0) in two steps.
  • a washing solution (20 mM phosphate buffer (pH 7.0), 0.5 M sodium chloride solution) was flowed at 15 CV.
  • an elution buffer (ImmunoPure IgG Eution buffer, manufactured by PIERCE) was flowed through 6 CV.
  • the eluate was immediately neutralized with 1M Tris buffer (pH 9.0).
  • Fractions detected by UV (280 nm) during elution were confirmed using a microspectrophotometer Xpose (manufactured by Trinean) and an Experion electrophoresis station (manufactured by BIO-RAD).
  • the fraction containing the desired product was exchanged with 5 mM phosphate buffer 50 mM 2-morpholinoethan sulfonic acid (MES) solution (pH 6.8).
  • MES 2-morpholinoethan sulfonic acid
  • solution A and solution B 5 mM phosphate buffer 50 mM-morpholinoetan sulfonic acid (MES) solution (pH 6.8), 2 M sodium chloride solution) were used for elution.
  • a washing solution 500 mM phosphate buffer (pH 6.5) was flowed at 5 CV.
  • the buffer solution containing the target substance was exchanged using common operation C to obtain a 25.5 mg / mL (Fuc ⁇ 1, 6) GlcNAc-Trastuzumab solution (50 mM phosphate buffer solution (pH 6.0)) (35 mL). It was.
  • Step 2 Preparation of Trastuzumab [SG- (N 3 ) 2 ] 2 23.9 mg / mL (Fuc ⁇ 1, 6) GlcNAc-Trastuzumab solution (50 mM phosphate buffer (pH 6.0)) obtained in Step 1 above ( 3.37 mL), 50 mM phosphate buffer (pH 6.0) solution (0.258 mL) of the compound (12.9 mg) synthesized in Example 5 step 2, 4.90 mg / mL EndoS D233Q / Q303L solution (PBS) (0.328 mL) was added and incubated at 30 ° C. for 4.5 hours. The above operation was performed for 2 lots.
  • Step 1 Trastuzumab [MSG-N 3 ] 2
  • the following operations were performed for 5 lots.
  • Example 13 The compound (20 mg / mL, 15.0 mL) obtained in step 1 was used, and the compound (25.5 mg) obtained in step 4 of Example 4 was used as a sugar chain donor at 30 ° C. Incubate for 3 hours in the same manner as in Step 13 of Example 13. A total of 5 lots was obtained to obtain 2 solutions of 14.4 mg / mL Trastuzumab [MSG-N 3 ] (phosphate buffered saline (pH 6.0)) (93.5 mL).
  • Step 1 Trastuzumab [MSG1-N 3 ] 2
  • Example 13 Using the compound obtained in Step 1 (25.5 mL, 7.8 mL) and Example 3 using the compound obtained in Step 4 (25.5 mg) as a sugar chain donor, at 30 ° C. After incubating for 3 hours, the same operation as in Step 13 of Example 13 was carried out. A total of 2 lots was obtained to obtain 2 solutions of 10.6 mg / mL Trastuzumab [MSG1-N 3 ] (phosphate buffered saline (pH 6.0)) (31 mL).
  • Step 1 (Fuc ⁇ 1, 6) GlcNAc-anti-CLDN6 antibody (H1L1) Anti-CLDN6 antibody (H1L1) solution prepared in Example 10 ca. Using 37.7 mg / mL (25 mM histidine solution (pH 6.0), 5% sorbitol solution) (2.5 mL), the same operation as in Step 1 of Example 13 was performed, and 19.2 mg / mL (Fuc ⁇ 1, Fuc ⁇ 1, 6) A GlcNAc-anti-CLDN6 antibody (H1L1) solution (50 mM phosphate buffer (pH 6.0)) (4.8 mL) was obtained.
  • Step 2 Anti-CLDN6 antibody (H1L1)-[MSG1-N 3 ] 2
  • Example 15 using the 19.2 mg / mL (Fuc ⁇ 1,6) GlcNAc-anti-CLDN6 (H1L1) antibody solution (50 mM phosphate buffer (pH 6.0)) (4.8 mL) obtained in step 1 above.
  • 10.2 mg / mL anti-CLDN6 antibody (H1L1)-[MSG1-N 3 ] 2 solutions phosphate buffered saline (pH 6.0)) (7.2 mL) were added. Obtained.
  • Example 17 Glycan conversion 5 (CLDN6-MSG1 (H2L2)) Step 1: (Fuc ⁇ 1,6) GlcNAc-anti-CLDN6 antibody (H2L2) Anti-CLDN6 antibody (H2L2) solution prepared in Example 10 ca. Using 20 mg / mL (25 mM histidine solution (pH 6.0), 5% sorbitol solution) (6 mL), the same procedure as in Step 1 of Example 13 was carried out, and 21.84 mg / mL (Fuc ⁇ 1, 6) GlcNAc- An anti-CLDN6 antibody (H2L2) solution (50 mM phosphate buffer (pH 6.0)) (5.7 mL) was obtained.
  • Step 2 Anti-CLDN6 antibody (H2L2)-[MSG1-N 3 ] 2
  • Example 15 using the 21.8 mg / mL (Fuc ⁇ 1,6) GlcNAc-anti-CLDN6 (H2L2) antibody solution (50 mM phosphate buffer (pH 6.0)) (5.7 mL) obtained in step 1 above.
  • 10.2 mg / mL anti-CLDN6 antibody (H2L2)-[MSG1-N 3 ] 2 solutions phosphate buffered saline (pH 6.0) (11.1 mL) were added. Obtained.
  • Example 18 Glycan conversion 6 (CLDN6-MSG1 (H1L3)) Step 1: (Fuc ⁇ 1, 6) GlcNAc-anti-CLDN6 antibody (H1L3) Anti-CLDN6 antibody (H1L3) solution prepared in Example 10 ca. Using 39.4 mg / mL (25 mM histidine solution (pH 6.0), 5% sorbitol solution) (3 mL), the same procedure as in Step 1 of Example 13 was carried out, and 39.2 mg / mL (Fuc ⁇ 1, 6) GlcNAc. -Anti-CLDN6 antibody (H1L3) solution (50 mM phosphate buffer (pH 6.0)) (4.5 mL) was obtained.
  • Step 2 Anti-CLDN6 antibody (H1L3)-[MSG1-N 3 ] 2
  • Example 15 using the 39.2 mg / mL (Fuc ⁇ 1,6) GlcNAc-anti-CLDN6 (H1L3) antibody solution (50 mM phosphate buffer (pH 6.0)) (4.5 mL) obtained in step 1 above.
  • 9.83 mg / mL anti-CLDN6 antibody (H1L3)-[MSG1-N 3 ] 2 solutions phosphate buffered saline (pH 6.0)) (7.2 mL) were added. Obtained.
  • Example 19 Glycan conversion 7 (CD98-MSG1) Step 1: (Fuc ⁇ 1, 6) GlcNAc-anti-CD98 antibody Anti-CD98 antibody solution prepared in Reference Example 6 ca. Using 20 mg / mL (25 mM histidine solution (pH 6.0), 5% sorbitol solution) (6 mL), the same procedure as in Step 1 of Example 13 was carried out, and 21.7 mg / mL (Fuc ⁇ 1, 6) GlcNAc- An anti-CD98 antibody solution (50 mM phosphate buffer (pH 6.0)) (4.7 mL) was obtained.
  • Step 2 Anti-CD98 antibody- [MSG1-N 3 ] 2 Using the 21.7 mg / mL (Fuc ⁇ 1,6) GlcNAc-anti-CD98 antibody solution (50 mM phosphate buffer (pH 6.0)) (4.7 mL) obtained in Step 1 above, Example 15 Step 1 and By performing the same operation, 10.1 mg / mL anti-CD98 antibody- [MSG1-N 3 ] 2 solutions (phosphate buffered saline (pH 6.0)) (7.6 mL) were obtained.
  • Example 20 Glycan conversion 8 (TROP2-MSG1) Step 1: (Fuc ⁇ 1, 6) GlcNAc-anti-Trop2 antibody Anti-Trop2 antibody solution prepared in Reference Example 5 ca. Using 20 mg / mL (25 mM histidine solution (pH 6.0), 5% sorbitol solution) (6 mL), the same procedure as in Step 1 of Example 13 was carried out, and 21.69 mg / mL (Fuc ⁇ 1, 6) GlcNAc- An anti-Trop2 antibody solution (50 mM phosphate buffer (pH 6.0)) (3.3 mL) was obtained.
  • Step 2 Anti-Trop2 antibody- [MSG1-N 3 ] 2 Using the 21.69 mg / mL (Fuc ⁇ 1,6) GlcNAc-anti-Trop2 antibody solution (50 mM phosphate buffer (pH 6.0)) (3.35 mL) obtained in step 1 above, the same as in step 1 of Example 15. To obtain 10.3 mg / mL anti-Trop2 antibody- [MSG1-N 3 ] 2 solutions (phosphate buffered saline (pH 6.0)) (6.4 mL).
  • Example 21 Sugar chain conversion 9 (LPS-MSG1) Step 1: (Fuc ⁇ 1, 6) GlcNAc-anti-LPS antibody Anti-LPS antibody solution prepared in Reference Example 4 ca. Using 17 mg / mL (25 mM histidine solution (pH 6.0), 5% sorbitol solution) (6.6 mL), the same procedure as in Step 1 of Example 13 was performed, and 21.03 mg / mL (Fuc ⁇ 1, 6) was performed. A GlcNAc-anti-LPS antibody solution (50 mM phosphate buffer (pH 6.0)) (5.4 mL) was obtained.
  • LPS-MSG1 Sugar chain conversion 9
  • Step 2 Anti-LPS antibody- [MSG1-N 3 ] 2 Using the 21.03 mg / mL (Fuc ⁇ 1,6) GlcNAc-anti-LPS antibody solution (50 mM phosphate buffer (pH 6.0)) (5.4 mL) obtained in step 1 above, the same as in step 1 of Example 15. By the operation, 9.89 mg / mL anti-LPS antibody- [MSG1-N 3 ] 2 solution (phosphate buffered saline (pH 6.0)) (7.9 mL) was obtained.
  • Example 22 Glycan conversion 10 (Trastuzumab mutant-MSG1) Step 1: (Fuc ⁇ 1, 6) GlcNAc-Trastuzumab mutant
  • a body solution 50 mM phosphate buffer (pH 6.0)
  • 6.1 mL was obtained.
  • Step 2 Trastuzumab mutant- [MSG1-N 3 ] 2 Using the 6.1 mg / ml (Fuc ⁇ 1,6) GlcNAc-Trastuzumab variant solution (50 mM phosphate buffer (pH 6.0)) (6.1 ml) obtained in step 1 above, the same as in step 1 of Example 15. 10.2 mg / ml Trastuzumab mutant- [MSG1-N 3 ] 2 solutions (phosphate buffered saline (pH 6.0)) (3.7 ml) were obtained by the above procedure.
  • ADCs 1, 2 and 5 described in Examples 23, 24 and 52 were synthesized by conjugating the antibody obtained in Step 1 of Example 14 with a drug linker as shown in the reaction formula below.
  • R depends on the drug linker used in each example.
  • Step 1 Conjugation of antibody and drug linker
  • Example 14 In a phosphate buffered saline (pH 6.0) solution (10.0 mg / mL, 1.00 mL) of the antibody obtained in Step 1, at room temperature. Dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of 1,2-propanediol (0.917 mL) and compound (6-13) obtained in Step 2-4 of Example 2-4 (0.0825 mL; 12 equivalents per antibody molecule) was added, and the mixture was reacted at room temperature for 2 days using a tube rotator (MTR-103, AS ONE Co., Ltd.). Purification procedure: The above solution was purified using common operation D to obtain 6.0 mL of a solution containing the target compound. Characteristic evaluation: The following characteristic values were obtained using common operations E and F. Antibody concentration: 1.33 mg / mL, antibody yield: 7.97 mg (80%), average number of drug bonds per molecule of antibody (n): 1.9
  • Step 1 Conjugation of antibody and drug linker
  • Example 14 In a phosphate buffered saline (pH 6.0) solution (9.88 mg / mL, 0.5500 mL) of the antibody obtained in Step 1 at room temperature.
  • Dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of 1,2-propanediol (0.459 mL) and compound (5-11) obtained in Step 10 of Example 2-3 (0.0408 mL; 12 equivalents per antibody molecule) was added, and the mixture was reacted at room temperature for 1 day using a tube rotator (MTR-103, AS ONE Co., Ltd.).
  • Purification operation The above solution was purified using common operation D to obtain 6.00 mL of a solution containing the target compound.
  • ADCs 3 and 4 described in Examples 25 and 26 were synthesized by conjugating the antibody obtained in Step 2 of Example 13 with a drug linker as shown in the reaction formula below.
  • R depends on the drug linker used in each example.
  • Step 1 Conjugation of antibody and drug linker
  • Example 13 In a phosphate buffered saline (pH 6.0) solution (10.0 mg / mL, 1.00 mL) of the antibody obtained in Step 2, at room temperature.
  • MTR-103 tube rotator
  • Purification procedure The above solution was purified using common operation D to obtain 4.50 mL of a solution containing the target compound. Characteristic evaluation: The following characteristic values were obtained using common operations E and F.
  • Step 1 Conjugation of antibody and drug linker
  • Example 13 In a phosphate buffered saline (pH 6.0) solution (10.0 mg / mL, 1.00 mL) of the antibody obtained in Step 2, at room temperature.
  • MTR-103 tube rotator
  • Purification procedure The above solution was purified using common operation D to obtain 10.5 mL of a solution containing the target compound. Characteristic evaluation: The following characteristic values were obtained using common operations E and F.
  • ADCs 5-7, 16-19 according to Examples 27, 28, 29, 53-56 are obtained by conjugating the antibody obtained in Step 1 of Example 15 with a drug linker as shown in the reaction formula below. Synthesized. In the formula, the R group depends on the drug linker used in each example.
  • Step 1 Conjugation of antibody and drug linker Example 15 In a phosphate buffered saline (pH 6.0) solution (10.0 mg / mL, 1.00 mL) of the antibody obtained in Step 1, at room temperature.
  • a phosphate buffered saline (pH 6.0) solution (10.0 mg / mL, 1.00 mL) of the antibody obtained in Step 1, at room temperature.
  • Example 28 ADC6 (The compound obtained in Step 28 of Example 28 has a triazole ring geometric isomer as shown by the above formula, and holds a drug linker having two types of structures shown as R above in a mixed manner.)
  • Step 1 Conjugation of antibody and drug linker
  • Example 15 In a phosphate buffered saline (pH 6.0) solution (10.0 mg / mL, 5.00 mL) of the antibody obtained in Step 1, at room temperature. Dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of 1,2-propanediol (4.59 mL) and compound (4-12) obtained in Example 2-2 Step 12 (0.413 mL; 12 equivalents per molecule of antibody) was added, and the mixture was reacted at room temperature for 48 hours using a tube rotator (MTR-103, AS ONE Co., Ltd.). Purification operation: The above solution was purified using common operation D to obtain 30.0 mL of a solution containing the target compound. Characteristic evaluation: The following characteristic values were obtained using common operations E and F. Antibody concentration: 1.30 mg / mL, antibody yield: 38.9 mg (78%), average number of drug bonds per molecule of antibody (n): 1.9
  • Step 1 Conjugation of antibody and drug linker Example 15 In a phosphate buffered saline (pH 6.0) solution (10.2 mg / mL, 1.00 mL) of the antibody obtained in Step 1, at room temperature.
  • a phosphate buffered saline (pH 6.0) solution (10.2 mg / mL, 1.00 mL) of the antibody obtained in Step 1, at room temperature.
  • the compound obtained in Step 30 of Example 30 has a triazole ring geometric isomer as shown in the above formula, and holds a drug linker having two types of structures shown as R above in a mixed manner.
  • Step 1 Conjugation of antibody and drug linker
  • Example 16 In a phosphate buffered saline (pH 6.0) solution (10.2 mg / mL, 2.50 mL) of the antibody obtained in Step 2, at room temperature. Dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of 1,2-propanediol (2.29 mL) and compound (3-14) obtained in Example 2-1 Step 13 (0.206 mL; 12 equivalents per antibody molecule) was added, and the mixture was reacted at room temperature for 48 hours using a tube rotator (MTR-103, AS ONE Co., Ltd.). Purification operation: The above solution was purified using common operation D to obtain 14.5 mL of a solution containing the target compound. Characteristic evaluation: The following characteristic values were obtained using common operations E and F. Antibody concentration: 1.54 mg / mL, antibody yield: 22.3 mg (89%), average number of drug bonds per molecule of antibody (n): 1.9
  • Example 31 Step 1 The compound obtained in Example 31 Step 1 has a triazole ring geometric isomer as shown in the above formula, and holds a drug linker having two types of structures shown as R above in a mixed manner.
  • Step 1 Conjugation of antibody and drug linker
  • Example 17 In a phosphate buffered saline (pH 6.0) solution (9.96 mg / mL, 2.50 mL) of the antibody obtained in Step 2, at room temperature. Dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of 1,2-propanediol (2.29 mL) and compound (3-14) obtained in Example 2-1 Step 13 (0.206 mL; 12 equivalents per antibody molecule) was added, and the mixture was reacted at room temperature for 48 hours using a tube rotator (MTR-103, AS ONE Co., Ltd.). Purification operation: The above solution was purified using common operation D to obtain 14.5 mL of a solution containing the target compound. Characteristic evaluation: The following characteristic values were obtained using common operations E and F. Antibody concentration: 1.52 mg / mL, antibody yield: 22.0 mg (88%), average number of drug bonds per molecule of antibody (n): 1.9
  • Example 32 Step 1 The compound obtained in Example 32 Step 1 has a triazole ring geometric isomer as shown in the above formula, and holds a drug linker having two types of structures shown as R above in a mixed manner.
  • Step 1 Conjugation of antibody and drug linker
  • Example 18 In a phosphate buffered saline (pH 6.0) solution (9.83 mg / mL, 2.50 mL) of the antibody obtained in Step 2, at room temperature. Dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of 1,2-propanediol (2.29 mL) and compound (3-14) obtained in Example 2-1 Step 13 (0.206 mL; 12 equivalents per antibody molecule) was added, and the mixture was reacted at room temperature for 48 hours using a tube rotator (MTR-103, AS ONE Co., Ltd.). Purification operation: The above solution was purified using common operation D to obtain 14.5 mL of a solution containing the target compound. Characteristic evaluation: The following characteristic values were obtained using common operations E and F. Antibody concentration: 1.45 mg / mL, antibody yield: 21.0 mg (84%), average number of drug bonds per molecule of antibody (n): 1.9
  • Example 33 Step 1 The compound obtained in Example 33 Step 1 has a triazole ring geometric isomer as shown in the above formula, and holds a drug linker having two types of structures shown as R above in a mixed manner.
  • Step 1 Conjugation of antibody and drug linker
  • Example 20 In a phosphate buffered saline (pH 6.0) solution (10 mg / mL, 1.00 mL) of the antibody obtained in Step 2, at room temperature 1, Add 2-propanediol (0.917 mL) and a dimethyl sulfoxide solution (0.0825 mL; 12 equivalents per antibody molecule) containing 10 mM of the compound (3-14) obtained in Example 2-1 Step 13. , Tube rotator (MTR-103, AS ONE Co., Ltd.) was used to react at room temperature for 2 days. Purification operation: The above solution was purified using common operation D to obtain 6.00 mL of a solution containing the target compound. Characteristic evaluation: The following characteristic values were obtained using common operations E and F. Antibody concentration: 1.47 mg / mL, antibody yield: 8.8 mg (88%), average number of drug bonds per molecule of antibody (n): 1.9
  • Example 34 Step 1 The compound obtained in Example 34 Step 1 has a triazole ring geometric isomer as shown by the above formula, and holds a drug linker having two types of structures shown as R above in a mixed manner.
  • Step 1 Conjugation of antibody and drug linker
  • a phosphate buffered saline (pH 6.0) solution (10.2 mg / mL, 1.00 mL) of the antibody obtained in Step 2, at room temperature.
  • Dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of 1,2-propanediol (0.917 mL) and the compound (3-14) obtained in Step 2-1 Step 13 of Example 2-1 (0.0825 mL; 12 equivalents per antibody molecule) was added, and the mixture was reacted at room temperature for 2 days using a tube rotator (MTR-103, AS ONE Co., Ltd.).
  • MTR-103 tube rotator
  • Step 1 Conjugation of antibody and drug linker
  • Example 21 In a phosphate buffered saline (pH 6.0) solution (9.89 mg / mL, 0.40 mL) of the antibody obtained in Step 2, at room temperature. Dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of 1,2-propanediol (0.367 mL) and compound (3-14) obtained in Example 2-1 Step 13 (0.0328 mL; 12 equivalents per antibody molecule) was added, and the mixture was reacted at room temperature for 2 days using a tube rotator (MTR-103, AS ONE Co., Ltd.). Purification procedure: The above solution was purified using common operation D to obtain 2.50 mL of the solution containing the target compound. Characteristic evaluation: The following characteristic values were obtained using common operations E and F. Antibody concentration: 1.16 mg / mL, antibody yield: 2.89 mg (72%), average number of drug bonds per molecule of antibody (n): 1.8
  • Step 1 Conjugation of antibody and drug linker Example 22 In a phosphate buffered saline (pH 6.0) solution (10.2 mg / mL, 0.40 mL) of the antibody obtained in Step 2, at room temperature. Phosphate buffered saline (pH 6.0) solution (0.40 mL) 1,2-propanediol (0.767 mL), dimethylformamide (0.20 mL), compound obtained in Example 2-1 Step 13.
  • Example 37 Evaluation of cell growth inhibition of antibody-drug conjugate (1)
  • NCI-N87 American Type Culture Collection; ATCC CRL-5822
  • a human gastric cancer strain of HER2 antigen-positive cells is prepared in RPMI1640 Medium (Thermo Fisher Scientific; RPMI medium) containing 10% fetal bovine serum (Hyclone). It was cultured.
  • HER2 antigen-negative cells MDA-MB-468 (ATCC HTB-132) were cultured in Leibovitz's L-15 Medium (Thermo Fisher Scientific; hereinafter, Leibovitz's medium) containing 10% fetal bovine serum (Hyclone).
  • NCI-N87 was prepared in RPMI medium and MDA-MB-468 cells were prepared in Leibovitz's medium at 2.5 ⁇ 10 4 Cells / mL, and 80 ⁇ L each was added to a 96-well cell culture microplate. After cell addition, NCI-N87 was cultured overnight at 37 ° C. under 5% CO 2 , and MDA-MB-468 was cultured overnight at 37 ° C. without setting the CO 2 concentration.
  • Viable cell rate (%) a ⁇ b ⁇ 100 a: Average value of luminescence of test substance-added wells b: The average IC 50 value of the luminescence of the medium-added well was calculated by the following formula.
  • IC 50 (nM) antilog ((50-d) ⁇ (LOG 10 (b)-LOG 10 (a)) ⁇ (dc) + LOG 10 (b)) a: Concentration of test substance a b: Concentration of test substance b c: Viable cell rate when the test substance at concentration a is added d: Viable cell rate when the test substance at concentration b is added a> b are two points with a viable cell rate of 50% in between.
  • Antibody-drug conjugates ADC5, ADC4, and ADC16 showed anti-cell effects with IC 50 ⁇ 0.001 (nM) on NCI-N87 cells.
  • the antibody-drug conjugates ADC2, ADC15, ADC3, ADC6, ADC17, and ADC18 showed an anti-cellular effect of 0.001 ⁇ IC 50 ⁇ 0.1 (nM). In addition, none of the antibody-drug conjugates showed an anti-cellular effect on MDA-MB-468 cells (IC 50 > 0.1 (nM)).
  • Example 38 Evaluation of inhibition of cell growth of antibody-drug conjugate (2) NCI-N87 (ATCC CRL-5822), a human gastric cancer strain of HER2 antigen-positive cells, was cultured in RPMI1640 Medium (Thermo Fisher Scientific; hereinafter referred to as RPMI medium) containing 10% fetal bovine serum (Hyclone). JIMT-1 (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH; DSMZ ACC 589), a human breast cancer strain of HER2-antigen-positive cells, contains Dulbecco's Modified Eagle Medium (Thermo Fisher Scientific; DMEM) containing 10% fetal bovine serum (Hyclone). It was cultured in medium).
  • RPMI1640 Medium containing 10% fetal bovine serum (Hyclone).
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • anti-HER2 antibody-drug conjugate ADC7 diluted in RPMI or DMEM medium to 400 nM, 80 nM, 16 nM, 3.2 nM, 0.64 nM, 0.13 nM, 0.026 nM, 0.0051 nM, 0.0010 nM,
  • 20 ⁇ L of anti-LPS antibody-drug conjugate ADC13 was added to the microplate.
  • 20 ⁇ L of RPMI medium or DMEM medium was added to the antibody-drug conjugate-free wells.
  • the cells were cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 for 6 days. After culturing, the microplate was removed from the incubator and allowed to stand at room temperature for 30 minutes.
  • Example 39 Evaluation of inhibition of cell growth of antibody-drug conjugate (3)
  • OV-90 (ATCC CRL-11732), a human ovarian cancer strain of CLDN6 antigen-positive cells, contains 15% fetal bovine serum (Hyclone) in Medium199 (Thermo Fisher Scientific) and MCDB 105 Medium (Sigma-Aldrich).
  • the cells were cultured in a 1: 1 mixed medium (hereinafter referred to as “medium”).
  • OV-90 cells were prepared in a medium at 1.9 ⁇ 10 4 Cells / mL, 80 ⁇ L was added to a microplate for culturing 96-well cells, and the cells were cultured overnight at 37 ° C. under 5% CO 2 .
  • Example 40 Anti-tumor test of antibody-drug conjugate (1)
  • Mice 4-5 week old female BALB / c nude mice (Charles River Japan) were acclimated under SPF conditions for 4-7 days prior to experimental use. The mice were fed a sterilized solid feed (FR-2, Funabashi Farms Co., Ltd) and fed with sterilized tap water (prepared by adding 5-15 ppm sodium hypochlorite solution).
  • Measurement / calculation formula In all studies, the major and minor diameters of the tumor were measured with an electronic digital caliper (CD-15CX, Mitutoyo Corp.) 2-3 times a week, and the tumor volume (mm 3 ) was calculated. .. The calculation formula is as shown below.
  • Tumor volume (mm 3 ) major axis (mm) x [minor axis (mm)] 2 x 1/2
  • the antibody-drug conjugate and antibody were all diluted with 10 mM-Acetate Buffer, 5% Sorbitol, pH 5.5 (Nacalai Tesque, Inc .; ABS buffer), and a liquid volume of 10 mL / kg was administered intravenously to the tail vein.
  • ABS buffer was similarly administered as a control group (Vehicle group).
  • NCI-N87 cells (ATCC CRL-5822) were suspended in physiological saline (Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.), and 1 ⁇ 10 7 cells were subcutaneously transplanted to the right side of a female nude mouse (Day 0) and randomly selected on Day 7. Grouping was carried out.
  • Anti-HER2-antibody-drug conjugate ADC2 was administered intravenously on Day 7 at a dose of 0.3 mg / kg and ADC1 on Day 7 at a dose of 1 mg / kg.
  • ABS buffer was similarly administered as a control group (Vehicle group). The results are shown in Fig. 4.
  • Anti-HER2 antibody-drug conjugates ADC2 and ADC1 were found to have a strong antitumor effect with tumor regression. No weight loss was observed in the mice treated with any of the anti-HER2-antibody-drug conjugates.
  • the tests are carried out by the method used in this evaluation example.
  • Example 41 Anti-tumor test of antibody-drug conjugate (2) NCI-N87 cells (ATCC CRL-5822) were suspended in Dulbecco's phosphate buffered saline (Sigma-Aldrich), and 1 ⁇ 10 7 cells were subcutaneously transplanted to the right side of a female nude mouse (Day 0) and randomly on Day 4. Grouping was carried out. Anti-HER2-antibody-drug conjugate ADC7, anti-HER2 antibody Trastuzumab (Reference Example 3), or anti-LPS antibody-drug conjugate ADC13 were all administered intravenously on Day 4 at a dose of 0.33 mg / kg. In addition, ABS buffer was similarly administered as a control group (Vehicle group).
  • Anti-HER2 antibody-drug conjugate ADC7 was found to have a strong antitumor effect with tumor regression.
  • anti-HER2 antibody Trastuzumab and anti-LPS antibody-drug conjugate ADC13 did not suppress tumor growth.
  • no weight loss was observed in mice due to antibody-drug conjugate ADC7, ADC13, or anti-HER2 antibody administration.
  • Example 42 Anti-tumor test of antibody-drug conjugate (3) KPL-4 cells (Kawasaki Medical School, Junichi Kurebayashi, British Journal of Cancer, (1999) 79 (5/6). 707-717) were suspended in Dulbecco's phosphate buffered saline (Sigma-Aldrich) and 1.5 ⁇ 10 7 cells were subcutaneously transplanted to the right side of the right body of female nude mice (Day 0) and randomly grouped on Day 14.
  • Anti-HER2-antibody-drug conjugate ADC7, anti-LPS antibody-drug conjugate ADC13, or Trastuzumab tesirine (Reference Example 1) was administered intravenously on Day 14 at a dose of 0.4 mg / kg.
  • ABS buffer was similarly administered as a control group (Vehicle group).
  • the results are shown in Fig. 6.
  • Anti-HER2 antibody-drug conjugate ADC7 was found to have a strong antitumor effect with tumor regression. On the other hand, no tumor regression was observed in ADC13 and Trastuzumab tesirine. In addition, no weight loss was observed in mice due to administration of ADC7 and Trastuzumab tesillin.
  • Example 43 Anti-tumor test of antibody-drug conjugate (4) JIMT-1 cells (DSMZ ACC 589) were suspended in physiological saline (Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.), 5 ⁇ 10 6 cells were subcutaneously transplanted to the right side of a female nude mouse (Day 0), and randomly on Day 10. Grouping was carried out. Anti-HER2-antibody-drug Conjuge ADC7 or Trastuzumab tesirine (Reference Example 1) was administered intravenously on Day 10 at a dose of 0.4 mg / kg. In addition, ABS buffer was similarly administered as a control group (Vehicle group). The results are shown in Fig. 7.
  • Anti-HER2 antibody-drug conjugate ADC7 was found to have a strong antitumor effect with tumor regression.
  • Trastuzumab tesirine showed an antitumor effect, but no tumor regression.
  • no weight loss was observed in mice due to administration of ADC7 and Trastuzumab tesirine.
  • Example 44 Anti-tumor study of antibody-drug conjugate (5) OV-90 cells (ATCC CRL-11732) were suspended in Matrigel (CORNING), 2.5 ⁇ 10 6 cells were subcutaneously transplanted to the right side of a female nude mouse (Day 0), and randomly grouped on Day 15. Carried out.
  • Anti-CLDN6 antibody-drug conjugate ADC8 or anti-CLDN6 antibody (H1L1) tesirine was administered intravenously on Day 15 at a dose of 0.33 mg / kg.
  • ABS buffer was similarly administered as a control group (Vehicle group). The results are shown in Fig. 8.
  • Anti-CLDN6 antibody-drug conjugate ADC8 was found to have a strong antitumor effect with tumor regression.
  • anti-CLDN6 antibody (H1L1) tesirine did not show tumor regression.
  • no weight loss was observed in mice due to administration of ADC8 and H1L1 tesirine.
  • Example 45 Anti-tumor test of antibody-drug conjugate (6)
  • OVCAR-3 cells ATCC HTB-161 were suspended in Matrigel (CORNING), 1 ⁇ 10 7 cells were subcutaneously transplanted to the right side of a female nude mouse (Day 0), and randomly grouped on Day 25. Carried out.
  • Anti-CLDN6 antibody-drug conjugate ADC8, or anti-CLDN6 antibody (H1L1) -tesylin was administered intravenously on Day 25 at a dose of 0.33 mg / kg.
  • ABS buffer was similarly administered as a control group (Vehicle group). The results are shown in Fig. 9.
  • Anti-CLDN6 antibody-drug conjugate ADC8 was found to have a strong antitumor effect with tumor regression.
  • H1L1-tesylin had an antitumor effect, but no tumor regression.
  • no weight loss was observed in mice due to administration of ADC8 and H1L1-tesylin.
  • Example 46 Anti-tumor study of antibody-drug conjugate (7) FaDu cells (ATCC HTB-43) were suspended in physiological saline (Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.), and 3 ⁇ 10 6 cells were subcutaneously transplanted to the right side of a female nude mouse (Day 0), and randomly grouped on Day 10. The division was carried out. Anti-TROP2 antibody-drug conjugate ADC11 or anti-LPS antibody-drug conjugate ADC13 was administered intravenously on Day 10 at a dose of 0.4 mg / kg. In addition, ABS buffer was similarly administered as a control group (Vehicle group). The results are shown in Fig. 10.
  • Anti-TROP2 antibody-drug conjugate ADC11 was found to have a strong antitumor effect with tumor regression.
  • the anti-LPS antibody-drug conjugate ADC13 did not suppress tumor growth.
  • no weight loss was observed in mice due to administration of ADC11 and ADC13.
  • Example 47 Anti-tumor test of anti-HER2-antibody-drug conjugate (8) The antitumor effect of the anti-HER2-antibody-drug conjugate was measured using the same laboratory animals and techniques as in Example 40. KPL-4 cells (Kawasaki Medical School, Junichi Kurebayashi) were suspended in Dulbecco's phosphate buffered saline (Sigma-Aldrich), and 1.5 ⁇ 10 7 cells were subcutaneously transplanted to the right side of a female nude mouse (Day0), Day14. Random grouping was carried out. Anti-HER2 antibody-drug conjugate ADC7 or anti-HER2 antibody-drug conjugate ADC14 was administered intravenously on Day 14 at a dose of 0.33 mg / kg.
  • ABS buffer was similarly administered as a control group (Vehicle group). The results are shown in Figure 47. Both ADC7 and ADC14 showed similar antitumor activity at 0.33 mg / kg dose. In addition, no weight loss was observed in mice due to administration of ADC7 and ADC14.
  • Example 48 Anti-tumor test of anti-HER2-antibody-drug conjugate (9) JIMT-1 cells (DSMZ ACC 589) were suspended in physiological saline (Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.), 5 ⁇ 10 6 cells were subcutaneously transplanted to the right side of a female nude mouse (Day 0), and randomly on Day 11. Grouping was carried out. ADC14 was administered intravenously on Day 11 at a dose of 0.4 mg / kg or 0.2 mg / kg. In addition, ABS buffer was similarly administered as a control group (Vehicle group). The results are shown in Figure 48. ADC14 showed a strong antitumor effect with tumor regression when 0.4 mg / kg was administered. In addition, no weight loss was observed in mice due to ADC14 administration at any of the doses.
  • Example 49 Anti-tumor test of anti-HER2-antibody-drug conjugate (3) CFPAC-1 cells (ATCC CRL-1918) were suspended in physiological saline (Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.), and 5 ⁇ 10 6 cells were subcutaneously transplanted to the right side of a female nude mouse (Day 0) and randomly selected on Day 10. Grouping was carried out. Anti-HER2-antibody-drug conjugate ADC7, ADC14 or anti-LPS antibody-drug conjugate ADC13 was administered intravenously on Day 10 at a dose of 0.4 mg / kg. In addition, ABS buffer was similarly administered as a control group (Vehicle group). The results are shown in Fig. 49. In mice treated with either ADC7 or ADC14, a strong antitumor effect with tumor regression was observed. In addition, no weight loss was observed in mice due to administration of ADC7 and ADC14 or ADC13.
  • Example 50 Drug 1 Free drugs (drug 1) from ADC7 to ADC1 were synthesized according to the scheme below.
  • Step 1 Prop-2-en-1-yl (2- ⁇ [(6S) -6-( ⁇ [tert-butyl (dimethyl) silyl] oxy ⁇ methyl) -5-azaspiro [2.4] hepto-5) -Il] carbonyl ⁇ -4-methoxy-5- ⁇ [tri (propane-2-yl) silyl] oxy ⁇ phenyl) carbamate (7-1)
  • Example 1-1 The compound (1-6) obtained in Step 5 was reacted with (4.59 g, 8.15 mmol) in the same manner as in Example 2-1 Step 9, and the target product (7-1) was reacted. (4.86 g, 92%) was obtained.
  • Step 2 Prop-2-en-1-yl (2- ⁇ [(6S) -6- (hydroxymethyl) -5-azaspiro [2.4] hept-5-yl] carbonyl ⁇ -4-methoxy-5 - ⁇ [Tri (Propane-2-yl) Cyril] Oxy ⁇ Phenyl) Carbamate (7-2)
  • the compound (7-1) (4.86 g, 7.51 mmol) obtained in the above step 1 was reacted in the same manner as in Step 1-1 of Example 1-1, and the target product (7-2) (3.42 g, 3.42 g) was reacted. 86%) was obtained.
  • Step 3 Prop-2-en-1-yl (11a'S) -11'-hydroxy-7'-methoxy-5'-oxo-8'- ⁇ [tri (propane-2-yl) silyl] oxy ⁇ -11 ', 11a'-Dihydro-1'H-Spiro [Cyclopropane-1,2'-Piroro [2,1-c] [1,4] Benzodiazepine] -10'(5'H) -carboxylate (7- 3)
  • the compound (7-2) (6.68 g, 12.5 mmol) obtained in the above step 2 was reacted in the same manner as in Step 1-1 of Example 1-1, and the target product (7-3) (6.44 g, 97%) was obtained.
  • Step 4 Prop-2-en-1-yl (11a'S) -11'- ⁇ [tert-butyl (dimethyl) silyl] oxy ⁇ -7'-methoxy-5'-oxo-8'- ⁇ [tri (propane) -2-Il) Cyril] Oxy ⁇ -11', 11a'-Dihydro-1'H-Spiro [Cyclopropane-1,2'-Piroro [2,1-c] [1,4] Benzodiazepine] -10'(5'H) -carboxylate (7-4)
  • the compound (7-3) (3.24 g, 6.10 mmol) obtained in the above step 3 was reacted in the same manner as in Example 1-1 step 9, and the target product (7-4) (3.86 g, 3.86 g) was reacted. 98%) was obtained.
  • Step 5 Prop-2-en-1-yl (11a'S) -11'- ⁇ [tert-butyl (dimethyl) silyl] oxy ⁇ -8'-hydroxy-7'-methoxy-5'-oxo-11', 11a'-dihydro-1'H-spiro [cyclopropane-1,2'-pyrolo [2,1-c] [1,4] benzodiazepine] -10'(5'H) -carboxylate (7-5)
  • the compound (7-4) (4.49 g, 6.96 mmol) obtained in the above step 4 was reacted in the same manner as in Step 1-1 of Example 1-1 to obtain the target product (7-5) (3.24 g, 95%) was obtained.
  • Step 6 Prop-2-en-1-yl (11a'S) -11'- ⁇ [tert-butyl (dimethyl) silyl] oxy ⁇ -7'-methoxy-8'- ⁇ [5-( ⁇ (11aS)- 7-Methoxy-2- (4-methoxyphenyl) -5-oxo-10-[(prop-2-ene-1-yloxy) carbonyl] -5,10,11,11a-tetrahydro-1H-pyroro [2, 1-c] [1,4] Benzodiazepine-8-yl ⁇ oxy) Pentyl] Oxy ⁇ -5'-oxo-11', 11a'-dihydro-1'H-spiro [Cyclopropane-1,2'-Piroro [2,1-c] [1,4] Benzodiazepine] -10'(5'H) -carboxylate (7-6) The compound (7-5) (0.080 g, 0.164 mmol) obtained in step 5 above was
  • Step 7 Prop-2-en-1-yl (11a'S) -11'-hydroxy-7'-methoxy-8'- ⁇ [5-( ⁇ (11aS) -7-methoxy-2- (4-methoxyphenyl) ) -5-oxo-10-[(prop-2-en-1-yloxy) carbonyl] -5,10,11,11a-tetrahydro-1H-pyroro [2,1-c] [1,4] benzodiazepine- 8-yl ⁇ oxy) Pentyl] Oxy ⁇ -5'-oxo-11', 11a'-dihydro-1'H-spiro [cyclopropane-1,2'-pyrolo [2,1-c] [1,4] ] Benzodiazepine] -10'(5'H) -carboxylate (7-7)
  • the compound (7-6) 160 mg, 0.161 mmol
  • Step 8 (11a'S) -7'-Methoxy-8'-[(5- ⁇ [(11aS) -7-Methoxy-2- (4-methoxyphenyl) -5-oxo-5,10,11,11a-" Tetrahydro-1H-Piroro [2,1-c] [1,4] Benzodiazepine-8-yl] Oxy ⁇ Pentyl) Oxy] -1', 11a'-Dihydro-5'H-Spiro [Cyclopropane-1,2 '-Piroro [2,1-c] [1,4] Benzodiazepine] -5'-on (7-8)
  • the compound (7-7) (141 mg, 0.161 mmol) obtained in step 7 above was reacted in the same manner as in step 12 of Example 2-1 to produce the target product (7-8: drug 1) (109.8 mg, 109.8 mg,).
  • Example 51 Evaluation of inhibition of cell growth of drug 1 (4) RPMI1640 containing 10% bovine fetal serum (Hyclone) containing KPL-4 cells (Kawasaki Medical School, Junichi Kurebayashi, British Journal of Cancer, (1999) 79 (5/6). 707-717), which is a human breast cancer strain. It was prepared in Medium (Thermo Fisher Scientific; hereinafter, RPMI medium) to a concentration of 6.25 ⁇ 10 3 Cells / mL, and 80 ⁇ L was added to each of a 96-well cell culture microplate. After adding the cells, the cells were cultured overnight at 37 ° C. under 5% CO 2 .
  • RPMI1640 10% bovine fetal serum (Hyclone) containing KPL-4 cells (Kawasaki Medical School, Junichi Kurebayashi, British Journal of Cancer, (1999) 79 (5/6). 707-717), which is a human breast cancer strain. It was prepared in Medium (Thermo Fisher Scientific; hereinafter,
  • Example 37 After standing at room temperature for 10 minutes, the amount of light emitted was measured with a plate reader (PerkinElmer). The viable cell rate was calculated using the same formula as in Example 37. Drug 1 showed an anticellular effect of 0.01 ⁇ IC 50 ⁇ 0.02 (nM) on KPL-4 cells.
  • Step 1 Compound (8-1) Example 2-3 The compound (5-10) (0.10 g, 0.105 mmol) obtained in step 9 and azadibenzocyclooctinic acid (0.0351 g, 0.105 mmol) were used in the same manner as in Example 2-3 step 10.
  • the target product (8-1) (0.0702 g, 53%) was obtained.
  • Example 52-2 The compound obtained in step 1 has a triazole ring geometric isomer as shown in the above formula, and holds a drug linker having two types of structures shown as R above in a mixed manner. )
  • Step 1 Conjugation of antibody and drug linker
  • a phosphate buffered saline (pH 6.0) solution (9.88 mg / mL, 1.00 mL) of the antibody obtained in Step 1, at room temperature 1 , 2-Propanediol (0.917 mL), a dimethyl sulfoxide solution (0.0825 mL; 12 equivalents per molecule of antibody) containing 10 mM of the compound (8-1) obtained in Example 52-1 Step 1 was added.
  • the reaction was carried out at room temperature for 1 day using a tube rotator (MTR-103, AS ONE Co., Ltd.). Purification operation: The above solution was purified using common operation D to obtain 10.5 mL of a solution containing the target compound.
  • MTR-103 tube rotator
  • Step 1 Compound (9-1) 5-Aminovaleric acid (0.436 g, 3.72 mmol) was dissolved in N, N-dimethylformamide (10 mL) and 1- ⁇ [4- (11,12-didehydrodibenzo [b, f] azocine-5) (6H) -yl) -4-oxobutanoyl] oxy ⁇ pyrorodine-2,5-dione (1.36 g, 3.38 mmol) and triethylamine (0.937 mL, 6.76 mmol) were added at room temperature, and the mixture was stirred at room temperature for 1.5 hours. did. 1N Hydrochloric acid was added to the reaction solution, and the mixture was extracted with chloroform.
  • Step 2 Compound (9-2) The compound (9-1) (0.0176 g, 0.0368 mmol) obtained in the above step 1 was reacted in the same manner as in Step 2-1 of Example 2-1 to produce the target product (9-2) (0.00880 g, 18%).
  • Example 53-2 The compound obtained in step 1 has a triazole ring geometric isomer as shown by the above formula, and holds a drug linker having two types of structures shown as R above in a mixed manner. )
  • Step 1 Conjugation of antibody and drug linker
  • Example 15 In a phosphate buffered saline (pH 6.0) solution (10.0 mg / mL, 1.00 mL) of the antibody obtained in Step 1, at room temperature 1 , 2-Propanediol (0.917 mL), a dimethyl sulfoxide solution (0.0825 mL; 12 equivalents per molecule of antibody) containing 10 mM of the compound (9-2) obtained in Example 53-1 Step 2 was added. The reaction was carried out at room temperature for 2 days using a tube rotator (MTR-103, AS ONE Co., Ltd.). Purification procedure: The above solution was purified using common operation D to obtain 6.0 mL of a solution containing the target compound. Characteristic evaluation: The following characteristic values were obtained using common operations E and F. Antibody concentration: 1.53 mg / mL, antibody yield: 9.17 mg (92%), average number of drug bonds per molecule of antibody (n): 1.9
  • Step 1 Compound (10-2) In a solution of starting material (10-1) (3.00 g, 7.78 mmol, Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd.) in N, N-dimethylformamide (10 mL) at room temperature, 1,8-diazabicyclo [5.4.0] -7 -Undecene (1.16 mL, 7.78 mL) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 2 hours, and then 1- ⁇ [4- (11,12-didehydrodibenzo [b, f] azocin-5 (6H))-at room temperature.
  • Step 2 Compound (10-3)
  • the compound (10-2) (0.050 g, 0.0499 mmol) obtained in the above step 1 was reacted in the same manner as in Step 2-1 of Example 2-1 to produce the target product (10-3) (0.0590 g, 82%).
  • Example 54-2 The compound obtained in step 1 has a geometric isomer of a triazole ring as shown by the above formula, and holds a drug linker having two kinds of structures shown as R above in a mixed manner. )
  • Step 1 Conjugation of antibody and drug linker
  • Example 15 In a phosphate buffered saline (pH 6.0) solution (10.0 mg / mL, 1.00 mL) of the antibody obtained in Step 1, at room temperature 1 , 2-Propanediol (0.917 mL), a dimethyl sulfoxide solution (0.0825 mL; 12 equivalents per molecule of antibody) containing 10 mM of the compound (10-3) obtained in Example 54-1 Step 2 was added. , Tube rotator (MTR-103, AS ONE Co., Ltd.) was used to react at room temperature for 48 hours. Purification procedure: The above solution was purified using common operation D to obtain 6.0 mL of a solution containing the target compound. Characteristic evaluation: The following characteristic values were obtained using common operations E and F. Antibody concentration: 1.63 mg / mL, antibody yield: 9.80 mg (98%), average number of drug bonds per molecule of antibody (n): 1.8
  • Step 1 Compound (11-2)
  • Example 55-2 The compound obtained in step 1 has a geometric isomer of a triazole ring as shown in the above formula, and the obtained ADC is a mixture of a drug linker having two types of structures shown as R above. And hold.)
  • Step 1 Conjugation of antibody and drug linker
  • Example 15 In a phosphate buffered saline (pH 6.0) solution (10.0 mg / mL, 1.00 mL) of the antibody obtained in Step 1, at room temperature 1, Add a dimethyl sulfoxide solution (0.0825 mL; 12 equivalents per molecule of antibody) containing 10 mM of 2-propanediol (0.917 mL) and the compound (11-2) obtained in Example 55-1 Step 1 and tube. The reaction was carried out at room temperature for 48 hours using a rotator (MTR-103, AS ONE Co., Ltd.). Purification procedure: The above solution was purified using common operation D to obtain 6.0 mL of a solution containing the target compound. Characteristic evaluation: The following characteristic values were obtained using common operations E and F. Antibody concentration: 1.72 mg / mL, antibody yield: 10.3 mg (quantitative), average number of drug bonds per molecule of antibody (n): 1.9
  • Step 1 Compound (12-2) 11,12-Didehydro-5,6-dihydrodibenzo [a, e] [8] anuren-5-yl 4-nitrophenylcarbamate (12-1) (0.437 g, 1.14 mmol), N, N-diisopropylethylamine ( Glycylglycine (0.150 g, 1.14 mmol) and water (3 mL) were added to a 0.198 mL, 1.14 mmol) N, N-dimethylformamide (6 mL) solution at room temperature, and the mixture was stirred overnight at room temperature.
  • Step 2 Compound (8-3)
  • the compound (12-2) (0.0306 g, 0.0305 mmol) obtained in the above step 1 and the compound (4-11) obtained in Example 2-2 step 11 were used in the same manner as in Example 2-1 step 13.
  • the reaction was carried out to obtain the desired product (12-3) (0.0361 g, 87%).
  • Example 56-2 The compound obtained in step 1 has a triazole ring geometric isomer structure as shown by the above formula, and holds a drug linker having two types of structures shown as R above in a mixed manner. .
  • Step 1 Conjugation of antibody and drug linker
  • Example 15 In a phosphate buffered saline (pH 6.0) solution (10.0 mg / mL, 1.00 mL) of the antibody obtained in Step 1, at room temperature 1, Add a dimethyl sulfoxide solution (0.0825 mL; 12 equivalents per molecule of antibody) containing 10 mM of 2-propanediol (0.917 mL) and the compound (12-3) obtained in Example 56-1 Step 2 and tube. The reaction was carried out at room temperature for 3 days using a rotator (MTR-103, AS ONE Co., Ltd.). Purification operation: The above solution was purified using common operation D to obtain 6.00 mL of a solution containing the target compound. Characteristic evaluation: The following characteristic values were obtained using common operations E and F. Antibody concentration: 1.06 mg / mL, antibody yield: 6.35 mg (63%), average number of drug bonds per molecule of antibody (n): 1.2
  • antibody-drug conjugate By using the antibody-drug conjugate, antibody and / or PBD derivative of the present invention, various cancers can be treated or prevented.
  • SEQ ID NO: 1 Amino acid sequence of human CLDN6 SEQ ID NO: 2: Amino acid sequence of cDNA encoding human CLDN6 SEQ ID NO: 3: Amino acid sequence of human CLDN9 SEQ ID NO: 4: Amino acid sequence of human CLDN9 SEQ ID NO: 5: Amino acid sequence of CDRL1 of B1 antibody light chain SEQ ID NO: 6: Amino acid of B1 antibody light chain CDRL2 Amino acid SEQ ID NO: 7: Amino acid of B1 antibody light chain CDRL3 Amino acid SEQ ID NO: 8: Humanized B1 antibody light chain L4 CDRL3 Amino Acid SEQ ID NO: 9: B1 antibody heavy chain CDRH1 amino acid SEQ ID NO: 10: B1 antibody heavy chain CDRH2 amino acid SEQ ID NO: 11: B1 antibody heavy chain CDRH3 amino acid SEQ ID NO: 12: C7 antibody Light chain CDRL1 amino acid SEQ ID NO: 13: C7 antibody Light chain CDRL2 amino acid

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Abstract

新規な抗体－ピロロベンゾジアゼンピン(PBD)誘導体コンジュゲート、当該抗体－薬物コンジュゲートを用いた腫瘍に対する治療効果を有する医薬品、及び、当該抗体－薬物コンジュゲート又は医薬品を用いた腫瘍の治療方法。

Description

抗体－ピロロベンゾジアゼピン誘導体コンジュゲート
　本発明は、腫瘍細胞を標的にできる抗体とピロロベンゾジアゼピン誘導体とをリンカー構造部分を介して結合させた、抗腫瘍薬として有用な抗体－薬物コンジュゲートに関する。
　抗体－薬物コンジュゲート（Antibody－Drug　Conjugate；ADC）は、がん治療等において使用されており、例えば、がん細胞表面に発現している抗原に結合し、その結合によって抗原を細胞内に内在化できる抗体に、細胞傷害活性を有する薬物を結合させたものである。ADCは、がん細胞に効率的に薬物を送達できることによって、がん細胞内に薬物を蓄積させ、がん細胞を死滅させることが期待できる。
　ADCに用いられる薬物として有用なものの一つにピロロベンゾジアゼピン（PBD）が挙げられる。PBDはDNA小溝のPuGPu配列などに結合することによって細胞毒性を示す。天然由来のPBDであるanthramycinは1965年に初めて発見され、それ以降様々な天然由来、またその類縁体のPBDが発見された（非特許文献1～4）。
　PBDの一般的な構造式は下式
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
 で示される。PBDはそれぞれA，C環部において置換基の数、種類、部位において異なり、また、それぞれB，C環部の不飽和度が異なるものが知られている。
　PBDは二量体構造にすることにより、飛躍的に細胞毒性が向上することが知られており（非特許文献5、6）、二量体PBDをADC化したものも種々報告されている（特許文献1～15）。しかしながら、C2位においてスピロ環を有するPBD又はそのADCは知られていない。
　ヒトCLDN6（Claudin-6、以下hCLDN6と表記する）は、Claudin（CLDN）ファミリー蛋白質の一種で、220アミノ酸残基からなる4回膜貫通型の膜蛋白質である。以前より、hCLDN6は一部のがんにおいて過剰発現し、魅力的ながん治療標的であることが示唆されている（非特許文献7～9）。また、CLDNファミリー蛋白質はエンドサイトーシスで細胞内に取り込まれ、ターンオーバー時間が短いファミリー蛋白質も報告されていることから（非特許文献10）、抗体薬物複合体（ADC）の標的に適すると考えられる。
　このようながんとの関連性を示唆する情報から、これまでにhCLDN6を特異的に認識するモノクローナル抗体が発見され（特許文献16、17）、CLDN6特異的なモノクローナル抗体にチューブリン重合阻害薬のモノメチルオーリスタチンE（MMAE）やメイタンシノイド（DM1）を結合させたADCが報告されている（非特許文献11）。
　一方、複数のCLDNファミリーを認識する抗体は治療の適応範囲を広げられる可能性があるとしてCLDN6とCLDN9を認識する抗体（特許文献18）に強力な殺細胞効果を有するピロロベンゾジアゼピン（PBD）を結合させたADCも開示されている（特許文献19）。
　しかしながら、それらの活性の強さはまだ十分ではなく、hCLDN6を治療標的とする未充足医療ニーズが存在している。
国際公開第2013／173496号 国際公開第2014／130879号 国際公開第2017／004330号 国際公開第2017／004025号 国際公開第2017／020972号 国際公開第2016／036804号 国際公開第2015／095124号 国際公開第2015／052322号 国際公開第2015／052534号 国際公開第2016／115191号 国際公開第2015／052321号 国際公開第2015／031693号 国際公開第2011／130613号 国際公開第2005／040170号 国際公開第2017／137556号 国際公開第2009／087978号 国際公開第2011／057788号 国際公開第2015／069794号 国際公開第2017／096163号
Julia　Mantaj,et　al.,Angewandte　Chemie　Internationl　Edition　2016,55,2-29 Dyeison　Antonow.et　al.,　Chemical　Reviews　2010,111,　2815-2864 In　Antibiotics　III.　Springer　Verlag,　New　York,　pp.3-11 Accounts　of　Chemical　Research　1986,　19,　230 Journal　of　the　American　Chemical　Society　1992,114,　4939 Journal　of　Organic　Chemistry　1996,　61,　8141 BMC　Cancer,　2006,　6,　186. Histopatholody,　2012,　61,　1043-1056. Int　J　Cancer,　2014,　135,　2206-2214. J　Membrane　Biol,　2004,　199,　29-38. 14th　Annu　Meet　Cancer　Immunother(CIMT)(May　10-12,　Mainz)　2016,　Abst　185
　本発明は、新規な抗体－ピロロベンゾジアゼピン（PBD）誘導体コンジュゲート及び新規なピロロベンゾジアゼピン（PBD）誘導体を提供するものである。
　また、本発明は、抗腫瘍活性を有する前記抗体－PBD誘導体コンジュゲートを含有する医薬組成物を提供するものである。
　さらに、本発明は、前記抗体－PBD誘導体コンジュゲートを用いたがんの治療方法を提供するものである。
　本発明者らは、鋭意検討した結果、新規な抗体－ピロロベンゾジアゼピン（PBD）誘導体コンジュゲートが、強い抗腫瘍活性を有することを見出した。また、前記コンジュゲートにおけるピロロジアゼピン誘導体の11’位の水酸基の絶対立体配置がＳ配置であることを見出した。本発明は、前記知見を基に完成された。
　すなわち本願発明は、以下に関するものである。
　［1］次式；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
（式中、m1は1又は2の整数を示し、
　Dは、以下の群から選択されるいずれか一つであり、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
式中、アステリスク＊はLと結合していることを示し、
　Lは、AbのAsn297に結合する糖鎖（N297糖鎖）に結合する糖鎖とDを連結するリンカーであり、
　N297糖鎖はリモデリングされていてもよく、
　Abは、抗体又は該抗体の機能性断片であることを示す。）
で示される抗体－薬物コンジュゲート。
　［2］Lは、-Lb-La-Lp-NH-B-CH2-O(C=O)-＊で示され、
　ここで、式中、アステリスク＊はDと結合していることを示し、
　Bは、1，4-フェニル基、2, 5-ピリジル基、3，6-ピリジル基、2，5-ピリミジル基又は2，5-チエニル基であり、
　Lpは、以下の群；
-GGVA-、-GG-(D-)VA-、-VA-、-GGFG-、-GGPI-、-GGVCit-、-GGVK-、及び、-GGPL-、
から選択されるいずれか一つを示し、
　Laは、以下の群；
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-、-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-、
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-、
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-、
-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-、-CH2-OC(=O)-、及び、-OC(=O)-、
から選択されるいずれか一つを示し、ならびに、
　Lbは、次式で示され、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
 、又は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
　ここで、上記で示されるLbの構造式において、アステリスク＊はLaと結合していることを示し、波線はN297糖鎖又はリモデリングされたN297糖鎖と結合していることを示す、［1］に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
　［3］Lが、以下の群;
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GG-(D-)VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGPI-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVK-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGPL-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z2-OC(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-、及び
-Z3-CH2-OC(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-
から選択されるいずれか一つを示し、
　ここで、Bは、1，4－フェニル基を示し、
　Z1は、以下の構造式；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
を示し、
　Z2は、以下の構造式；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
 を示し、
　Z3は、以下の構造式；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
を示し、
　ここで、Z1、Z2及びZ3の構造式において、アステリスク＊は隣接するC(=O)、OC(=O)又はCH2と結合していることを示し、波線はN297糖鎖又はリモデリングされたN297糖鎖と結合していることを示す、［1］又は［2］に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
　［4］Lが、以下の群；
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、及び、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-
から選択されるいずれか一つを示し、
　ここで、Bは1，4－フェニル基であり、
　Z1は以下の構造式；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
を示し、
　ここで、上記Z1の構造式において、アステリスク＊はZ1に隣接するC(=O)と結合していることを示し、波線はN297糖鎖又はリモデリングされたN297糖鎖と結合していることを示す、請求項3に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
　［5］N297糖鎖が、リモデリングされた糖鎖である、［1］～［4］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート。
　［6］N297糖鎖が、次式で示される構造を有するN297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2もしくはそれらの混合物、又はN297-(Fuc)SGのいずれかであることを示す、［1］～［5］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
　上記式中、波線は抗体のAsn297に結合していることを示し、
　N297糖鎖中のL(PEG)は、＊-(CH2CH2-O)n5- CH2CH2-NH-を示し、
　ここで、n5は2～5の整数であることを示し、右端のアミノ基がN297糖鎖のβ-Manの分岐鎖の1-3鎖側又は／及び1-6鎖側の非還元末端のシアル酸の2位のカルボン酸とアミド結合を介して結合しており、左端のアステリスク＊は、LにおけるZ1のトリアゾール環上の1位又は3位の窒素原子と結合していることを示す。
　［7］n5が3である、［6］に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
　［8］次式；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000043
　（上記で示されるそれぞれの構造式において、m1は1又は2の整数であることを示し、
　Abは、抗体又は該抗体の機能性断片であり、
　N297糖鎖は次式で示される構造を有するN297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2もしくはそれらの混合物、又はN297-(Fuc)SGであり、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000044
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000045
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000046
　式中、波線は抗体のAsn297に結合していることを示し、
　N297糖鎖中のL(PEG)は、＊-(CH2CH2-O)3-CH2CH2-NH-であることを示し、
　ここで、右端のアミノ基がN297糖鎖のβ-Manの分岐鎖の1-3鎖側又は／及び1-6鎖側の非還元末端のシアル酸の2位のカルボン酸とアミド結合を介して結合しており、左端のアステリスク＊は、上記構造式中のトリアゾール環上の1位又は3位の窒素原子と結合していることを示す）で示される抗体薬物コンジュゲート。
　［9］次式；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000047
　（上記で示されるそれぞれの構造式において、m1は1又は2の整数であることを示し、
　Abは、抗体又は該抗体の機能性断片であり、
　N297糖鎖は次式で示される構造を有するN297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2もしくはそれらの混合物、又はN297-(Fuc)SGであり、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000048
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000049
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000050
　式中、波線は抗体のAsn297に結合していることを示し、
　N297糖鎖中のL(PEG)は、＊-(CH2CH2-O)3-CH2CH2-NH-であることを示し、
　ここで、右端のアミノ基がN297糖鎖のβ-Manの分岐鎖の1-3鎖側又は／及び1-6鎖側の非還元末端のシアル酸の2位のカルボン酸とアミド結合を介して結合しており、左端のアステリスク＊は、上記構造式中のトリアゾール環上の1位又は3位の窒素原子と結合していることを示す）で示される抗体薬物コンジュゲート。
　［10］次式；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000051
　（上記で示されるそれぞれの構造式において、m1は1又は2の整数であることを示し、
　Abは、抗体又は該抗体の機能性断片であり、
　N297糖鎖は次式で示される構造を有するN297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2もしくはそれらの混合物、又はN297-(Fuc)SGであり、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000052
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000053
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000054
　式中、波線は抗体のAsn297に結合していることを示し、
　N297糖鎖中のL(PEG)は、＊-(CH2CH2-O)3-CH2CH2-NH-であることを示し、
　ここで、右端のアミノ基がN297糖鎖のβ-Manの分岐鎖の1-3鎖側又は／及び1-6鎖側の非還元末端のシアル酸の2位のカルボン酸とアミド結合を介して結合しており、左端のアステリスク＊は、上記構造式中のトリアゾール環上の1位又は3位の窒素原子と結合していることを示す）で示される抗体薬物コンジュゲート。
　［11］次式；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000055
　（上記で示されるそれぞれの構造式において、m1は1又は2の整数であることを示し、
　Abは、抗体又は該抗体の機能性断片であり、
　N297糖鎖は次式で示される構造を有するN297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2もしくはそれらの混合物、又はN297-(Fuc)SGであり、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000056
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000057
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000058
　式中、波線は抗体のAsn297に結合していることを示し、
　N297糖鎖中のL(PEG)は、＊-(CH2CH2-O)3-CH2CH2-NH-であることを示し、
　ここで、右端のアミノ基はN297糖鎖のβ-Manの分岐鎖の1-3鎖側又は／及び1-6鎖側の非還元末端のシアル酸の2位のカルボン酸とアミド結合を介して結合しており、左端のアステリスク＊は、前記式中のトリアゾール環上の1位又は3位の窒素原子と結合していることを示す）で示される抗体薬物コンジュゲート。
　［12］内在化活性を有する抗体を含むことを特徴とする、［1］～［11］のいずれか一つに記載の抗体ー薬物コンジュゲート。
　［13］抗体が、腫瘍細胞に発現している抗原に結合し、腫瘍細胞内に取り込まれて内在化する性質を有する抗体である、［1］～［12］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート。
　［14］抗体が、抗腫瘍効果を有することを特徴とする、［1］～［13］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート。
　［15］抗体が、抗CLDN6抗体、抗CLDN9抗体、抗CLDN6/CLDN9抗体、抗HER2抗体、抗HER3抗体、抗DLL3抗体、抗FAP抗体、抗CDH11抗体、抗A33抗体、抗CanAg抗体、抗CD19抗体、抗CD20抗体、抗CD22抗体、抗CD25抗体、抗CD30抗体、抗CD33抗体、抗CD37抗体、抗CD56抗体、抗CD70抗体、抗CD98抗体、抗B7-H3抗体、抗TROP2抗体、抗CEA抗体、抗Cripto抗体、抗EphA2抗体、抗FGFR2抗体、抗G250抗体、抗MUC1抗体、抗GPNMB抗体、抗Integrin抗体、抗PSMA抗体、抗Tenascin－C抗体、抗SLC44A4抗体、抗Mesothelin抗体、抗EGFR抗体、抗5T4抗体、抗LRRC15抗体、抗DR5抗体、抗CDH3抗体、抗PDPN 抗体、又は抗CD123抗体である、［1］～［14］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート。
　［16］抗体が、CLDN6及び／又はCLDN9に特異的に結合することを特徴とする、［1］～［15］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート。
　［17］抗体が、以下の（a）又は（b）に記載のCDRH1、CDRH2及びCDRH3を含む重鎖、並びに、CDRL1、CDRL2及びCDRL3を含む軽鎖を含んでなる、［16］に記載の抗体－薬物コンジュゲート；
（a）配列番号9に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号10に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号11に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、並びに、配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号6に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号7に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において1又は2個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるCDRL3、又は、
（b）配列番号15に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号16に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号17に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、並びに、配列番号12に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号13に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号14に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3。
　［18］抗体が、以下の（a）又は（b）に記載のCDRH1、CDRH2及びCDRH3を含む重鎖、並びに、CDRL1、CDRL2及びCDRL3を含む軽鎖を含んでなる、［17］に記載の抗体－薬物コンジュゲート；
（a）配列番号9に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号10に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号11に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、及び、配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号6に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号7に記載のアミノ酸配列又は配列番号8に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3、又は、
（b）配列番号15に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号16に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号17に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、及び、配列番号12に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号13に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号14に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3。
　［19］抗体が、以下の（a）又は（b）に記載の重鎖可変領域、及び、軽鎖可変領域を含む、［16］～［18］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート；
（a）抗体が、配列番号21に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列番号19に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、又は、
（b）抗体が、配列番号25に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列番号23に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域。
　［20］以下の（a）～（e）からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び（f）～（k）からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、［16］～［19］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート；
（a）配列番号54に記載のアミノ酸配列、
（b）配列番号58に記載のアミノ酸配列、
（c）配列番号62に記載のアミノ酸配列、
（d）（a）～（c）の配列において各CDR配列以外のフレームワーク領域の配列に対して少なくとも95％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
（e）（a）～（c）の配列における各CDR配列以外のフレームワーク領域の配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列、
（f）配列番号38に記載のアミノ酸配列、
（g）配列番号42に記載のアミノ酸配列、
（h）配列番号46に記載のアミノ酸配列、
（i）配列番号50に記載のアミノ酸配列、
（j）（f）～（i）の配列において各CDR配列以外のフレームワーク領域の配列に対して少なくとも95％以上の相同性を有するアミノ酸配列、及び、
（k）（f）～（i）の配列における各CDR配列以外のフレームワーク領域の配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列。
　［21］抗体が、以下の（a）～（e）からなる群から選択される重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、［20］に記載の抗体－薬物コンジュゲート；
（a）配列番号54に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域および配列番号38に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
（b）配列番号58に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域および配列番号42に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
（c）配列番号54に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域および配列番号46に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
（d）配列番号58に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域および配列番号50に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域からなる軽鎖可変領域、及び、
（e）配列番号62に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域および配列番号46に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域。
　［22］抗体が、キメラ抗体である、［16］～［21］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート。
　［23］抗体が、ヒト化抗体である、［16］～［21］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート。
　［24］抗体が、ヒトIgG1、ヒトIgG2又はヒトIgG4の重鎖定常領域を含む、［16］～［23］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート。
　［25］以下の（a）～（e）からなる群から選択される重鎖及び軽鎖を含む、［23］又は［24］に記載の抗体－薬物コンジュゲート；
（a）配列番号52のアミノ酸番号20～471に記載のアミノ酸配列からなる重鎖および配列番号36のアミノ酸番号21～234に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（b）配列番号56のアミノ酸番号20～471に記載のアミノ酸配列からなる、重鎖および配列番号40のアミノ酸番号21～234に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（c）配列番号52のアミノ酸番号20～471に記載のアミノ酸配列からなる重鎖および配列番号44のアミノ酸番号21～234に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（d）配列番号56のアミノ酸番号20～471に記載のアミノ酸配列からなる重鎖および配列番号48のアミノ酸番号21～234に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、及び、
（e）配列番号60のアミノ酸番号20～471に記載のアミノ酸配列からなる重鎖および配列番号44のアミノ酸番号21～234に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖。
　［26］抗体が、［17］～［21］及び［25］のいずれか一つに記載の抗体と、CLDN6及び／又はCLDN9への結合において競合するか、又は、［17］～［21］及び［25］のいずれか一つに記載の抗体が認識するCLDN6及び／又はCLDN9上の部位に結合する、［16］に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
　［27］抗体が、HER2に特異的に結合する［1］～［15］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート。
　［28］抗体依存性細胞傷害（ADCC）活性及び／又は補体依存性細胞傷害（CDC）活性を有する［27］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート。
　［29］抗体の重鎖定常領域がヒトIgG1の重鎖定常領域であり、ADCC及び／又はCDC活性の低減をもたらす変異を含む、［27］に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
　［30］抗体の重鎖定常領域がヒトIgG1の重鎖定常領域であり、該重鎖定常領域においてEU Indexにより示される234位及び235位のロイシンがアラニンに置換されている、［29］に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
　［31］配列番号65に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号64に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を含んでなるヒト化モノクローナル抗体である［27］又は［28］に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
　［32］配列番号75のアミノ酸番号20～139に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号73のアミノ酸番号21～127に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗体である、［27］、［29］及び［30］のいずれかに一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート。
　［33］配列番号75のアミノ酸番号20～469に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号73のアミノ酸番号21～234に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を含んでなるヒト化モノクローナル抗体である［27］、［29］、［30］及び［32］のいずれかに一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート。
　［34］抗体が、N－結合型糖鎖付加、O－結合型糖鎖付加、N末のプロセッシング、C末のプロセッシング、脱アミド化、アスパラギン酸の異性化、メチオニンの酸化、N末におけるメチオニン残基の付加、プロリン残基のアミド化、及び重鎖のカルボキシル末端における1つ又は2つのアミノ酸残基の欠失からなる群より選択される1又は2以上の修飾を含む、［16］～［33］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート。
　［35］抗体の重鎖のカルボキシル末端において1つ又は数個のアミノ酸残基が欠失している、［34］に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
　［36］抗体の2本の重鎖の双方のカルボキシル末端において1つのアミノ酸残基が欠失している、［34］又は［35］に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
　［37］重鎖のカルボキシル末端のプロリン残基が更にアミド化されている、［34］～［36］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［38］抗体が、以下の工程で得られることを特徴とする糖鎖リモデリング抗体である、［1］～［37］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート；
　i）［12］～［37］のいずれか一つに記載の抗体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養し、得られた培養物から目的の抗体を採取する工程、
　ii）工程i）で得られた抗体を加水分解酵素で処理し、(Fucα1,6)GlcNAc－抗体を製造する工程、及び、
　iii）MSG(9)又はSG(10)のシアル酸の2位のカルボン酸のカルボニル基にアジド基を有するPEGリンカーを導入し、還元末端をオキサゾリン化して得た糖鎖ドナー分子と、糖転移酵素存在下で(Fucα1,6)GlcNAc－抗体を反応させる工程。
　［39］更に、工程ii）の反応液を、ハイドロキシアパタイトカラムによる精製により(Fucα1,6)GlcNAc－抗体を精製する工程を含む、［38］に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
　［40］次式；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000059
で示されるいずれか一つの化合物、その塩、又はそれらの水和物。
　［41］［38］又は［39］に記載の糖鎖リモデリング抗体を［40］に記載の化合物、その塩、又はそれらの水和物と反応させる工程を含む、［1］～［39］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲートの製造方法。
　［42］［41］に記載の製造方法で得られることを特徴とする、抗体－薬物コンジュゲート。
　［43］N297糖鎖が、N297-(Fuc)MSG1である、［1］～［39］及び［42］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート。
　［44］m1が、1の整数である、［1］～［39］、［42］及び［43］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート。
　［45］抗体―薬物コンジュゲートにおける抗体1分子あたりの平均薬物結合数が、1～3又は3～5である、［1］～［39］及び［42］～［44］のいずれか一つに記載の抗体―薬物コンジュゲート。
　［46］［1］～［39］及び［42］～［45］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート、その塩、又はそれらの水和物を含むことを特徴とする医薬組成物。
　［47］抗腫瘍薬であることを特徴とする、［46］に記載の医薬組成物。
　［48］［1］～［39］及び［42］～［45］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート、その塩、又はそれらの水和物を個体に投与することを特徴とする腫瘍の治療方法。
　［49］［1］～［39］及び［42］～［45］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート、その塩、又はそれらの水和物を含む医薬組成物、及び、少なくとも一つの抗腫瘍薬を、同時に、別々に又は連続して個体に投与することを特徴とする医薬組成物。
　本発明の提供する新規な抗体－ピロロベンゾジアゼピン（PBD）誘導体コンジュゲートは優れた抗腫瘍活性と安全性を有するため、抗腫瘍剤として有用である。また、本発明のPBD誘導体は抗腫瘍活性を有し、該コンジュゲートの薬物として有用である。更に、本発明の抗体は腫瘍細胞に発現している抗原を認識又は当該抗原に結合するため、該コンジュゲートの抗体として有用である。
本発明の抗体－薬物コンジュゲート（（I）の分子）を模式的に表したものである。（a）は薬物D、（b）はリンカーL、（c）はN3-L(PEG)-、（d）はN297糖鎖（ここで、白の楕円はNeuAc(Sia)、白の六角形はMan、塗りつぶした六角形はGlcNAc、白のひし形はGal、及び、白の逆三角形はFuc）、をそれぞれ表す。（b）と（c）は（c）のアジド基（黒の涙型）と（b）のスペーサー（白の半円）におけるアルキン構造が反応し、トリアゾール環を形成して結合している。Y字型は、抗体Abを表す。また、本模式図では、N297糖鎖を便宜上N297-(Fuc)MSGとして表示し、N297糖鎖それぞれの一方の分岐鎖においてのみアジド基を有するPEGリンカー(N3-L(PEG)-)が結合したシアル酸を有し、他方の分岐鎖の非還元末端にシアル酸を持たない態様を示しているが、N297-(Fuc)SGを採用することで、両方の分岐鎖の非還元末端にアジド基を有するPEGリンカーが結合したシアル酸を有する態様でもよい。　このような表示方法は、特に言及がない限り、本明細書の全体を通じて適用される。 本発明の抗体－薬物コンジュゲートの製造中間体である、(Fucα1,6)GlcNAc-抗体（図2Aの（II）の分子）、及び、MSG型糖鎖リモデリング抗体（図2Bの（III）の分子）の構造を示す模式図である。両方の図において、Y字型は図1と同様に抗体Abを表す。図2Aにおいて、（e）はFucの1位と、6位においてαグリコシド結合したGlcNAcのみからなるN297糖鎖を示す。図2Bにおいて、（d）は図1と同様のN297糖鎖を表し、（f）は、アジド基を有するPEGリンカー部分の構造であり、末端にリンカーLとの結合に供されるアジド基を表す。アジド基を有するPEGリンカーの結合様式は、図1の説明と同様である。 動物細胞で産生された抗体からMSG型糖鎖リモデリング抗体を製造する工程の模式図である。図中の分子（II）、（III）は、図2と同様に、（Fucα1，6）GlcNAc－抗体及びMSG型糖鎖リモデリング抗体をそれぞれ表す。（IV）の分子は動物細胞で産生された抗体であり、N297糖鎖が不均一な分子の混合物である。図3Aは、（IV）の不均一なN297糖鎖を、EndoSのような加水分解酵素で処理することで、均一な（Fucα1，6）GlcNAc－抗体（II）が作製される工程を示す。図3Bは、抗体（II）のN297糖鎖のGlcNAcに対して、EndoS　D233Q／Q303L変異体のような糖転移酵素を用いて、MSG型糖鎖ドナー分子の糖鎖を糖鎖転移させることで、（III）のMSG型糖鎖リモデリング抗体が作製される工程を示す。ここで用いられるMSG型糖鎖ドナー分子は、MSGの非還元末端のシアル酸がアジド基を有するPEGリンカーで修飾されたものであり、作製されるMSG型N297糖鎖リモデリング抗体においても、図2Bで説明したとおり、非還元末端のシアル酸が同様の修飾を受けたものとなる。図3Bにおいては、便宜上ドナー分子としてMSGを表示しているが、SG（10）を糖鎖ドナーとすることで、（III）の糖鎖リモデリング抗体はN297糖鎖の両方の非還元末端にアジド基を有するリンカー分子が結合した糖鎖リモデリング抗体が合成される。 皮下移植したヒト胃がん株であるNCI－N87細胞への抗HER2抗体－薬物コンジュゲートADC2、ADC1効果を示す。 皮下移植したヒト胃がん株であるNCI－N87細胞への抗HER2抗体－薬物コンジュゲートADC7、Trastuzumab、抗LPS抗体－薬物コンジュゲートADC13の効果を示す 皮下移植したヒト乳がん株であるKPL－4細胞への抗HER2抗体－薬物コンジュゲートADC7、抗LPS抗体－薬物コンジュゲートADC13又はTrastuzumab-Tesirine（参考例1）の効果を示す。 皮下移植したヒト乳がん株であるJIMT-1細胞への抗HER2抗体－薬物コンジュゲートADC7、又はTrastuzumab-Tesirineの効果を示す。 皮下移植したヒト卵巣がん株であるOV-90細胞への抗CLDN6抗体－薬物コンジュゲートADC8、又は抗CLDN6抗体(H1L1)-Tesirineの効果を示す。 皮下移植したヒト卵巣がん株であるNIH：OVCAR-3細胞への抗CLDN6抗体－薬物コンジュゲートADC8、又は抗CLDN6抗体(H1L1)-Tesirineの効果を示す。 皮下移植したヒト頭頸部がん細胞株であるFaDu細胞への抗体－薬物コンジュゲート抗TROP2抗体－薬物コンジュゲートADC11、又は抗LPS抗体－薬物コンジュゲートADC13の効果を示す。 ヒトCLDN6の全長アミノ酸配列（配列番号1）及び全長cDNAの塩基配列（配列番号2）を示す。 ヒトCLDN9の全長アミノ酸配列（配列番号3）及び全長cDNAの塩基配列（配列番号4）を示す。 B1抗体軽鎖のCDRL1～3のアミノ酸配列（配列番号5～7）を示す。 ヒト化B1抗体軽鎖L4のCDRL3のアミノ酸配列（配列番号8）を示す。 B1抗体重鎖のCDRH1～3のアミノ酸配列（配列番号9～11）を示す。 C7抗体軽鎖のCDRL1～3のアミノ酸配列（配列番号12～14）を示す。 C7抗体重鎖のCDRH1～3のアミノ酸配列（配列番号15～17）を示す。 B1抗体軽鎖の可変領域をコードするcDNAのヌクレオチド配列（配列番号18）及びB1抗体軽鎖の可変領域のアミノ酸配列（配列番号19）を示す。アミノ酸配列における下線はCDR配列を示す。 B1抗体重鎖の可変領域をコードするcDNAのヌクレオチド配列（配列番号20）及びB1抗体重鎖の可変領域のアミノ酸配列（配列番号21）を示す。アミノ酸配列における下線はCDR配列を示す。 C7抗体軽鎖の可変領域をコードするcDNAのヌクレオチド配列（配列番号22）及びC7抗体軽鎖の可変領域のアミノ酸配列（配列番号23）を示す。アミノ酸配列における下線はCDR配列を示す。 C7抗体重鎖の可変領域をコードするcDNAのヌクレオチド配列（配列番号24）及びC7抗体重鎖の可変領域のアミノ酸配列（配列番号25）を示す。アミノ酸配列における下線はCDR配列を示す。 chB1軽鎖のアミノ酸配列（配列番号28）及びchB1軽鎖のアミノ酸配列をコードするDNA配列を含むDNA断片（配列番号29）を示す。アミノ酸配列における下線はCDR配列を示す。 chB1軽鎖の可変領域のアミノ酸配列（配列番号30）及びchB1軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列（配列番号31）を示す。アミノ酸配列における下線はCDR配列を示す。 chB1重鎖のアミノ酸配列（配列番号32）及びchB1重鎖をコードするヌクレオチド配列（配列番号33）を示す。アミノ酸配列における下線はCDR配列を示す。 chB1重鎖の可変領域のアミノ酸配列（配列番号34）及びchB1重鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列（配列番号35）を示す。アミノ酸配列における下線はCDR配列を示す。 ヒト化抗体軽鎖hL1のアミノ酸配列（配列番号36）及びヒト化抗体軽鎖hL1をコードするヌクレオチド配列（配列番号37）を示す。アミノ酸配列における下線はCDR配列を示す。 ヒト化抗体軽鎖hL1の可変領域のアミノ酸配列（配列番号38）及びヒト化抗体軽鎖hL1の可変領域をコードするヌクレオチド配列（配列番号39）を示す。アミノ酸配列における下線はCDR配列を示す。 ヒト化抗体軽鎖hL2のアミノ酸配列（配列番号40）及びヒト化抗体軽鎖hL2をコードするヌクレオチド配列（配列番号41）を示す。アミノ酸配列における下線はCDR配列を示す。 ヒト化抗体軽鎖hL2の可変領域のアミノ酸配列（配列番号42）及びヒト化抗体軽鎖hL2の可変領域をコードするヌクレオチド配列（配列番号43）を示す。 ヒト化抗体軽鎖hL3のアミノ酸配列（配列番号44）及びヒト化抗体軽鎖hL3をコードするヌクレオチド配列（配列番号45）を示す。アミノ酸配列における下線はCDR配列を示す。 ヒト化抗体軽鎖hL3の可変領域のアミノ酸配列（配列番号46）及びヒト化抗体軽鎖hL3の可変領域をコードするヌクレオチド配列（配列番号47）を示す。アミノ酸配列における下線はCDR配列を示す。 ヒト化抗体軽鎖hL4のアミノ酸配列（配列番号48）及びヒト化抗体軽鎖hL4をコードするヌクレオチド配列（配列番号49）を示す。アミノ酸配列における下線はCDR配列を示す。 ヒト化抗体軽鎖hL4の可変領域のアミノ酸配列（配列番号50）及びヒト化抗体軽鎖hL4の可変領域をコードするヌクレオチド配列（配列番号51）を示す。アミノ酸配列における下線はCDR配列を示す。 ヒト化抗体重鎖hH1のアミノ酸配列（配列番号52）及びヒト化抗体重鎖hH1をコードするヌクレオチド配列（配列番号53）を示す。アミノ酸配列における下線はCDR配列を示す。 ヒト化抗体重鎖hH1の可変領域のアミノ酸配列（配列番号54）及びヒト化抗体重鎖hH1の可変領域をコードするヌクレオチド配列（配列番号55）を示す。アミノ酸配列における下線はCDR配列を示す。 ヒト化抗体重鎖hH2のアミノ酸配列（配列番号56）及びヒト化抗体重鎖hH2をコードするヌクレオチド配列（配列番号57）を示す。アミノ酸配列における下線はCDR配列を示す。 ヒト化抗体重鎖hH2の可変領域のアミノ酸配列（配列番号58）及びヒト化抗体重鎖hH2の可変領域をコードするヌクレオチド配列（配列番号59）を示す。 ヒト化抗体重鎖hH3のアミノ酸配列（配列番号60）及びヒト化抗体重鎖hH3をコードするヌクレオチド配列（配列番号61）を示す。アミノ酸配列における下線はCDR配列を示す。 ヒト化抗体重鎖hH3の可変領域のアミノ酸配列（配列番号62）及びヒト化抗体重鎖hH3の可変領域をコードするヌクレオチド配列（配列番号63）を示す。アミノ酸配列における下線はCDR配列を示す。 B1抗体及びC7抗体のフローサイトメトリーによるヒトCLDN6及びファミリー分子CLDN3、CLDN4、CLDN9に対する結合能を示す。 B1抗体及びC7抗体のMab－ZAPによる抗体内在化活性能を示す。 ヒト化抗CLDN6抗体H1L1、H2L2、H1L3、H2L4、及びH3L3のフローサイトメトリーによるCLDN6及びファミリー分子に対する結合能を示す。 Trastuzumab軽鎖のアミノ酸配列（配列番号64）及び重鎖のアミノ酸配列（配列番号65）を示す。 Trastuzumab変異体の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号73）及び重鎖のアミノ酸配列（配列番号75）を示す。 ヒトキメラ化抗CLDN6抗体chB1の重鎖であるchB1＿H、ヒト化抗体重鎖であるhH1、hH2及びhH3のアミノ酸配列の比較を示す図。「・」はchB1＿Hと同一のアミノ酸残基を示し、アミノ酸残基が記載されている箇所は置換されたアミノ酸残基を示す。 ヒトキメラ化抗CLDN6抗体chB1の軽鎖であるchB1＿L、ヒト化抗体軽鎖であるhL1、hL2、hL3及びhL4のアミノ酸配列の比較を示す図。「・」はchB1＿Lと同一のアミノ酸残基を示し、アミノ酸残基が記載されている箇所は置換されたアミノ酸残基を示す。 皮下移植したヒト乳がん株であるKPL－4細胞への抗HER2抗体－薬物コンジュゲートADC7及びADC14の効果を示す。 皮下移植したヒト乳がん株であるJIMT－1細胞への抗HER2抗体－薬物コンジュゲートADC14の効果を示す。 皮下移植したヒト膵臓がん株であるCFPAC－1細胞への抗HER2抗体－薬物コンジュゲートADC7及びADC14、抗LPS抗体－薬物コンジュゲートADC13の効果を示す。
〔抗体－薬物コンジュゲート〕
　本発明の抗体－薬物コンジュゲートは、腫瘍細胞に発現している抗原を認識又は当該抗原に結合できる抗体に、リンカー構造部分を介して抗腫瘍性化合物を結合させた抗腫瘍性薬物である。
　本発明の抗体―薬物コンジュゲートは、次式；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000060
　で示され、
　m1は1又は2の整数（好ましくは、1）であり、Dは薬物、LはN297糖鎖とDを連結するリンカー、Abは抗体又は該抗体の機能性断片、N297糖鎖は前記抗体のAsn297の側鎖に結合する糖鎖を示す。N297糖鎖はリモデンリングされた糖鎖でも良い。
＜薬物＞
　本発明の薬物Dは抗腫瘍性化合物であることが好ましい。本抗腫瘍性化合物は、本発明の抗体－薬物コンジュゲートのリンカーの一部又は全部が腫瘍細胞内で切断され抗腫瘍性化合物部分が遊離されて抗腫瘍効果が発現される。
　本発明の抗体－薬物コンジュゲートにおける薬物すなわちPBD誘導体は、例えば以下の群から選択されるいずれか一つである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000061
ここで、式中、アステリスク＊はLと結合していることを示す。
　本発明のPBD誘導体は、11’位の水酸基の絶対立体配置はS配置である。
＜リンカー構造＞
　本発明のリンカーLはN297糖鎖とDを連結するリンカーである。
　当該リンカーLは、次式で示される。
　　－Lb－La－Lp－NH－B－CH2－O（C＝O）－＊
　アステリスク＊は薬物DのN10’位の窒素原子と結合していることを示し、Lbは、LaとN297糖鎖又はリモデリングされたN297糖鎖を結合するスペーサーを示す。
　Bは、フェニル基又はヘテロアリール基を示し、好ましくは、1，4－フェニル基、2，5－ピリジル基、3，6－ピリジル基、2，5－ピリミジル基、2，5－チエニル基であり、より好ましくは、1，4－フェニル基である。
　Lpは、生体内又は標的細胞において切断可能なアミノ酸配列からなるリンカーを示す。Lpは、例えば、エステラーゼやペプチダーゼ等の酵素の作用によって、切断される。
　Lpは、2から7個（好ましくは、2から4個）のアミノ酸で構成されるペプチド残基である。すなわち、2から7個のアミノ酸がペプチド結合したオリゴペプチドの残基によって構成される。
　Lpは、N末端においてLb－La－のLaのカルボニル基に結合し、C末端においてリンカーの－NH－B－CH2－O（C＝O）－部分のアミノ基（－NH－）とアミド結合を形成する。前記エステラーゼ等の酵素によって、LpのC末端と－NH－間の結合が切断される。
　Lpを構成するアミノ酸は特に限定されることはないが、例えば、L－又はD－アミノ酸であり、好ましくはL－アミノ酸である。また、α－アミノ酸の他、β－アラニン、ε－アミノカプロン酸、γ－アミノ酪酸等の構造のアミノ酸であってもよく，さらには例えばN－メチル化されたアミノ酸等の非天然型のアミノ酸であってもよい。
　Lpのアミノ酸配列は、特に限定されないが、構成するアミノ酸として、グリシン（Gly；G）、バリン（Val；V）、アラニン（Ala；A）、フェニルアラニン（Phe；F）、グルタミン酸（Glu；E）、イソロイシン（Ile；I）、プロリン（Pro；P）、シトルリン（Cit）、ロイシン（Leu；L）、セリン（Ser；S）、リシン（Lys；K）及びアスパラギン酸（Asp；D）等を挙げることができる。これらのうちで好ましくは、グリシン（Gly；G）、バリン（Val；V）、アラニン（Ala；A）、シトルリン（Cit）である。
　これらのアミノ酸は重複してもよく、任意に選択されたアミノ酸を含むアミノ酸配列を有する。また、アミノ酸の種類によって、薬物遊離のパターンをコントロールすることができる。
　リンカーLpの具体例として、
-GGVA-、-GG-(D-)VA-、-VA-、-GGFG-、-GGPI-、-GGVCit-、-GGVK-、-GG(D-)PI-、-GGPL-、-EGGVA、-PI-、-GGF-、-DGGF-、(D-)D-GGF-、-EGGF-、-SGGF-、-KGGF-、-DGGFG-、-GGFGG-、-DDGGFG-、-KDGGFG-、-GGFGGGF-
を挙げることができる。
　ここで、上記の『（D-）V』はD－バリン、『（D-）P』はD-プロリン、『(D-)D』はD-アスパラギン酸を意味する。
　リンカーLpは、好ましくは、以下である。
-GGVA-、-GG-(D-)VA-、-VA-、-GGFG-、-GGPI-、-GGVCit-、-GGVK-、-GG(D-)PI-、-GGPL-
　リンカーLpは、より好ましくは、以下である。
　-GGVA-、-GGVCit-、-VA-
　Laは、以下の群から選択されるいずれか一つを示す。
　-C(=O)-(CH2CH2)n2-C(=O)-、-C(=O)-(CH2CH2)n2-C(=O)-NH-(CH2CH2)n3-C(=O)-、
　-C(=O)-(CH2CH2)n2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)n3-CH2-C(=O)-、
　-C(=O)-(CH2CH2)n2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)n3-CH2CH2-C(=O)-、-(CH2)n4-O-C(=O)-
　ここで、式中、n2は1～3の整数（好ましくは、1又は2）、n3は1～5の整数（好ましくは、2～4の整数、より好ましくは、2又は4）、n4は0～2の整数（好ましくは、0又は1）を示す。
　Laは、好ましくは、以下の群から選択されるいずれか一つを示し、
　-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-、-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-、
　-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-
　-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-、
　-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-、
　-CH2-OC(=O)-、及び、-OC(=O)-
　Laは、より好ましくは、-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-、又は、-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-である。
　Lbのスペーサーは特に限定されないが、例えば、次式で示されるスペーサーが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000062
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000063
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000064
　上記で示されるLbのそれぞれの構造式において、アステリスクはLaの左端の-(C＝O）、又は-(CH2)n4と結合していることを示し、波線はAbのN297糖鎖又はリモデリングされたN297糖鎖と結合していることを示す。
　上記で示されるLb(Lb-1、Lb-2又はLb-3)のそれぞれの構造式において、アジド基とDBCOのclick reactionで形成されるトリアゾール環部位は、幾何異性構造を有し、1つのLbは、これら２種類の構造のいずれか一方、又は、それらの混合物として存在する。本発明の抗体－薬物コンジュゲート1分子中には2又は4個(m1は1又は2)の『－L－D』が存在し、2又は4個それぞれの『－L－D』におけるL中のそれぞれのLb(Lb-1、Lb-2又はLb-3)は、これら２種類の構造のいずれか一方、又は、その両方が混在している。
　Lは、好ましくは、－Lb－La－Lp－NH－B－CH2－O（C＝O）－＊で示され、
　Bは、1，4－フェニル基であり、
　Lpは、以下の群から選択されるいずれか一つを示し、
　-GGVA-、-GG-(D-)VA-、-VA-、-GGFG-、-GGPI-、-GGVCit-、-GGVK-、-GG(D-)PI-、-GGPL-
　Laは、以下の群から選択されるいずれか一つを示し、
　-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-、-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-、
　-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-、
　-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-、
　-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-、-CH2-OC(=O)-、-OC(=O)-
　Lbは、上記で示されるLbのいずれかの構造式を示す。
　Lは、より好ましくは、以下の群から選択されるいずれか一つである。
　-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
　-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GG-(D-)VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
　-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
　-Z1-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
　-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGPI-NH-B-CH2-OC(=O)-、
　-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-B-CH2-OC(=O)-、
　-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-B-CH2-OC(=O)-、
　-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVK-NH-B-CH2-OC(=O)-、
　-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGPL-NH-B-CH2-OC(=O)-、
　-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
　-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
　-Z1-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
　-Z2-OC(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z3-CH2-OC(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-
　ここで、Z1は、上記Lbの以下で示される構造式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000065
を示し、Z2は、上記Lbの以下で示される構造式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000066
を示し、Z3は上記Lbの以下で示される構造式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000067
を示し、Bは1，4－フェニル基である。
　Lは、最も好ましくは、以下のいずれかである。
　-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
　-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
　-Z1-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
　-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、及び
　-Z1-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-
　ここで、Bは1，4－フェニル基であり、
　Z1は上記Lbの以下で示される構造式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000068
である。
＜遊離薬物＞
　本発明の抗体－薬物コンジュゲートの遊離薬物は、以下の群から選ばれる一つである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000069
　本発明の遊離薬物は、本発明の抗体－薬物コンジュゲートが腫瘍細胞内に移行した後、リンカーL部分が切断されて生成する。当該遊離薬物は抗腫瘍細胞効果が確認された。
＜抗体＞
　本発明において、「がん」と「腫瘍」は同じ意味に用いている。
　本発明において、「遺伝子」とは、蛋白質のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列が含まれるヌクレオチドもしくはヌクレオチド配列、またはその相補鎖を意味し、例えば、蛋白質のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列が含まれるヌクレオチド配列またはその相補鎖であるポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、DNA、mRNA、cDNA、RNA等は「遺伝子」の意味に含まれる。本発明の「CLDN6遺伝子」としては、例えば、CLDN6蛋白質のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が含まれるDNA、mRNA、cDNA、cRNA等をあげることができる。
　本発明において、「ヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」又は「ヌクレオチド配列」と「核酸」は同義であり、例えば、DNA、RNA、プローブ、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、プライマー等も「ヌクレオチド」又は「ヌクレオチド配列」の意味に含まれる。
　本発明においては、「ポリペプチド」、「ペプチド」、「蛋白質」は区別せずに用いている。
　本発明において、「CLDN6」は、CLDN6蛋白質と同じ意味で用いている。
　本発明において、「細胞」には、動物個体内の細胞、培養細胞も含んでいる。
　本発明において、「細胞傷害活性」とは、何らかの形で、細胞に病理的な変化を引き起こすことをいい、直接的な外傷にとどまらず、DNAの切断や塩基の二量体の形成、染色体の切断、細胞分裂装置の損傷、各種酵素活性の低下などあらゆる細胞の構造や機能上の損傷を引き起こすことをいう。
　本発明において、「抗体の機能性断片」とは、「抗体の抗原結合断片」とも呼ばれ、抗原との結合活性を有する抗体の部分断片を意味しており、Fab、F（ab’）2、Fv、scFv、diabody、線状抗体及び抗体断片より形成された多特異性抗体等を含む。また、F（ab’）2を還元条件下で処理した抗体の可変領域の一価の断片であるFab’も抗体の抗原結合断片に含まれる。但し、抗原との結合能を有している限りこれらの分子に限定されない。また、これらの抗原結合断片には、抗体蛋白質の全長分子を適当な酵素で処理したもののみならず、遺伝子工学的に改変された抗体遺伝子を用いて適当な宿主細胞において産生された蛋白質も含まれる。
　本発明の機能性断片は、IgG重鎖のFc領域においてよく保存されたN結合型糖鎖による修飾を受けるアスパラギン（Asn297）及びその周辺のアミノ酸を保持し、且つ抗原との結合能を有している機能性断片を含む。
　本発明において、「エピトープ」とは、特定の抗体（例えば、抗CLDN6抗体）が結合する抗原の部分ペプチド又は部分立体構造（例えば、CLDN6の部分ペプチド又は部分立体構造）を意味する。前記の部分ペプチド（例えば、CLDN6の部分ペプチド）であるエピトープは免疫アッセイ法等当業者にはよく知られている方法によって、決定することができる。　
　本発明における「CDR」とは、相補性決定領域（CDR：Complementarity　determining　region）を意味する。抗体分子の重鎖及び軽鎖にはそれぞれ3箇所のCDRがあることが知られている。CDRは、超可変領域（hypervariable　region）とも呼ばれ、抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域内にあって、一次構造の変異性が特に高い部位であり、重鎖及び軽鎖のポリペプチド鎖の一次構造上において、それぞれ3ヶ所に分離している。本明細書中においては、抗体のCDRについて、重鎖のCDRを重鎖アミノ酸配列のアミノ末端側からCDRH1、CDRH2、CDRH3と表記し、軽鎖のCDRを軽鎖アミノ酸配列のアミノ末端側からCDRL1、CDRL2、CDRL3と表記する。これらの部位は立体構造の上で相互に近接し、結合する抗原に対する特異性を決定している。
　本発明において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、市販のハイブリダイゼーション溶液ExpressHyb　Hybridization　Solution（クロンテック社）中、68℃でハイブリダイズすること、又はDNAを固定したフィルターを用いて0．7－1．0MのNaCl存在下68℃でハイブリダイゼーションを行った後、0．1－2倍濃度のSSC溶液（1倍濃度SSCとは150mM　NaCl、15mMクエン酸ナトリウムからなる）を用い、68℃で洗浄することによって同定することができる条件又はそれと同等の条件でハイブリダイズすることをいう。
　本発明において、「1～数個」とは、1～10個、1～9個、1～8個、1～7個、1～6個、1～5個、1～4個、1～3個又は1～2個を意味する。
　本発明において、CLDN6もしくはCLDN6及びCLDN9を認識する又は結合する抗体を、それぞれ「抗CLDN6抗体」、「抗CLDN6／CLDN9抗体」と標記することがある。かかる抗体には、キメラ化抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体等が含まれる。CLDN6及びCLDN9を認識する又は結合する抗体を、「抗CLDN6抗体」と標記することがある。
　本発明の抗体－薬物コンジュゲートに使用される抗体は、免疫グロブリンを意味し、抗原と免疫特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子である。本発明の抗体として、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及びIgYのいずれのクラスでもよいが、IgGが好ましい。また、サブクラスとして、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及びIgA2のいずれであってもよいがIgG1、IgG2、IgG4が好ましい。IgG1又はIgG4を用いる場合は、定常領域のアミノ酸残基の一部を置換することによって、エフェクター機能を調整することが可能である（WO88/07089、WO94/28027、WO94/29351参照）。
　また、本発明の抗体のアイソタイプとしてIgG1を用いる場合は、定常領域のアミノ酸残基の一部を置換することによって、エフェクター機能を調整することが可能である。エフェクター機能を低減又は減弱させたIgG1の変異体としては、IgG1 LALA（IgG1-L234A，L235A）、IgG1 LAGA（IgG1-L235A，G237A）等が挙げられ、好ましくはIgG1 LALAである。なお、前記L234A，L235AはEU index（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., Vol. 63, No.1 (May 15, 1969), pp.78-85）により特定される234位、235位のロイシンのアラニンへの置換、G237AはEU indexにより特定される237位のグリシンのアラニンへの置換を示す。
　本発明の抗体は、いずれの種に由来してもよいが、好ましくは、ヒト、ラット、マウス及びウサギを例示できる。ヒト以外の種に由来する場合は、周知の技術を用いて、キメラ化又はヒト化することが好ましい。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体が好ましい。モノクローナル抗体には、ラット抗体、マウス抗体、ウサギ抗体等の非ヒト動物由来のモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、それらの機能性断片、又はそれらの修飾体が含まれる。
　本発明の抗体は、好ましくは腫瘍細胞を標的にできる抗体、すなわち腫瘍細胞表面で発現している抗原に結合する抗体である。
　本発明の抗体－薬物コンジュゲートは抗腫瘍効果を発揮する化合物を結合させてあるので、抗体自体が抗腫瘍効果を有することは、好ましいが、必須ではない。抗腫瘍性化合物の細胞傷害性を腫瘍細胞において特異的・選択的に発揮させる目的からは、抗体が内在化して腫瘍細胞内に移行する性質を有することが重要であり、好ましい。抗体の内在化の際、抗体－薬物コンジュゲートも細胞内に移行し得る。抗腫瘍効果の点からは抗体又は抗体－薬物コンジュゲートが内在化して腫瘍細胞内に移行する性質を有することが、薬物によって腫瘍細胞を特異的・選択的に傷害を与える点で重要であり、好ましい。抗体の抗腫瘍活性は、腫瘍細胞への細胞傷害活性、抗細胞効果をいう。公知のin vitro又はIn vivoの評価系を用いて、抗腫瘍活性を確認することができる。抗体の内在化能は公知の評価系で測定することができる。
　このような抗体として、腫瘍関連抗原に対する抗体が挙げられ、抗CLDN6抗体、抗CLDN9抗体、抗CLDN6／CLDN9抗体、抗HER2抗体、抗HER3抗体、抗DLL3（Delta like protein3）抗体、抗A33抗体、抗CanAg抗体、抗CD19抗体、抗CD20抗体、抗CD22抗体、抗CD25抗体、抗CD30抗体、抗CD33抗体、抗CD37抗体、抗CD56抗体、抗CD70抗体、抗CD98抗体、抗B7-H3（CD276）抗体、抗TROP2抗体、抗CEA 抗体、抗Cripto抗体、抗EphA2抗体、抗FGFR2抗体(WO201315206等)、抗G250抗体、抗MUC1抗体(WO2011012309等)、抗GPNMB抗体、抗Integrin抗体、抗PSMA抗体、抗Tenascin－C抗体、抗SLC44A4抗体、抗Mesothelin抗体、抗EGFR抗体、抗5T4 (oncofetal antigen 5T4; also TPBG and trophoblast glycoprotein)抗体、抗LRRC15（Leucine-rich repeat-containing protein 15）抗体、抗DR5抗体、抗CDH3(cadherin 3)抗体、抗PDPN (podoplanin) 抗体、又は抗CD123抗体を例示できるがこれに限らない。
　本発明の抗体として、好ましくは、抗CLDN6抗体、抗CLDN6／CLDN9抗体、抗HER2抗体、抗CD98抗体、抗TROP2抗体であり、さらに好ましくは抗CLDN6抗体、抗HER2抗体（例えば、Trastuzumab、Trastuzumab変異体）である。
　以下に、本発明において使用される抗CLDN6抗体について説明する。
1．CLDN6及びCLDN9
　CLDN6は、Claudinファミリーに属する、220アミノ酸からなる4回膜貫通型の蛋白質であり、N末端及びC末端を細胞内に持つ。
　ヒトCLDN6のアミノ酸配列及びDNA配列は公的データベース上に公開されており、例えばNP_067018（配列番号1）、NM_021195（配列番号2（ともにNCBI）等のアクセッション番号により参照可能である。
　ヒトCLDN6蛋白質のアミノ酸配列（以下、「CLDN6アミノ酸配列」）について、細胞外領域は、配列表の配列番号1のアミノ酸番号29～81からなる細胞外ドメイン（EC1）、アミノ酸番号138～160からなる細胞外ドメイン（EC2）で構成されている。
　CLDN9は、Claudinファミリーに属する、217アミノ酸からなる4回膜貫通型の蛋白質であり、N末端及びC末端を細胞内に持つ。CLDN9はCLDN6と高い相同性をもつ。
　ヒトCLDN9のアミノ酸配列及びDNA配列は公的データベース上に公開されており、例えばNP_066192（配列番号3）、NM_020982（配列番号4）（ともにNCBI）等のアクセッション番号により参照可能である。
2．抗CLDN6抗体
　本発明の抗CLDN6抗体の一例として、配列表の配列番号1に示すCLDN6のN末端より29から81番目のアミノ酸配列、及び138から160番目のアミノ酸配列の2つの細胞外領域からなる高次構造を認識し、かつ内在化活性を有する抗CLDN6抗体を挙げることができる。
　本発明の抗CLDN6抗体は腫瘍細胞を標的にできる抗体であり、すなわち腫瘍細胞を認識できる特性、腫瘍細胞に結合できる特性、そして腫瘍細胞内に取り込まれて内在化する特性等を備えている。したがって、本発明の抗CLDN6抗体と抗腫瘍活性を有する化合物を、リンカーを介して結合させて抗体－薬物コンジュゲートとすることができる。
　本発明の抗CLDN6抗体は抗腫瘍活性を有していてもよい。
（1）本発明の抗CLDN6抗体は、以下（a）及び（b）の特性を有する；
　（a）CLDNファミリーを認識又は結合する。
　　本発明の抗体はCLDNファミリーを認識する。言い換えれば、本発明の抗体はCLDNファミリーに結合する。本発明の抗体は、好ましくはCLDN6に結合し、より好ましくは、CLDN6に特異的に結合する。更に、本発明の抗体はCLDN9を認識し又はCLDN9に結合してもよい。
　　本発明において「特異的な認識」、すなわち「特異的な結合」とは、非特異的な吸着ではない結合を意味する。結合が特異的であるか否かの判定基準としては、例えば、解離定数（Dissociation　Constant：以下、「KDという」）をあげることができる。本発明の好適な抗体のCLDN6及び／又はCLDN9に対するKD値は1×10－5M以下、5×10－6M以下、2×10－6M以下または1×10－6M以下、より好適には5×10－7M以下、2×10－7M以下または1×10－7M以下である。
　　本発明における抗原と抗体の結合は、ELISA法、RIA法、Surface　Plasmon　Resonance（以下、「SPR」という）解析法等により測定または判定することができる。細胞表面上に発現している抗原と抗体との結合は、フローサートメトリー法等により測定することができる。
　（b）CLDN6及び／又はCLDN9と結合することによってCLDN6及び／又はCLDN9発現細胞に内在化する活性を有する。
（2）CLDN6及び／又はCLDN9がヒトCLDN6及び／又はヒトCLDN9である上記（1）に記載の抗体。
　本発明の抗CLDN6モノクローナル抗体は、ハイブリドーマを用いる方法等で得ることができる。抗CLDN6モノクローナル抗体の例としては、マウス抗CLDN6抗体B1及びC7を挙げることができる。なお、本発明においては、当該「B1」を「B1抗体」、当該「C7」を「C7抗体」と表記することもある。
　B1抗体の重鎖可変領域の塩基配列は、配列表の配列番号20に、アミノ酸配列は配列番号21に記載されている。また、B1抗体の軽鎖可変領域の塩基配列は、配列表の配列番号18に、アミノ酸配列は配列番号19に記載されている。
　B1抗体のCDRH1のアミノ酸配列は配列番号9に、CDRH2のアミノ酸配列は配列番号10に、CDRH3のアミノ酸配列は配列番号11に、CDRL1のアミノ酸配列は配列番号5に、CDRL2のアミノ酸配列は配列番号6に、CDRL3のアミノ酸配列は配列番号7に記載されている。
　C7抗体の重鎖可変領域の塩基配列は、配列表の配列番号24に、アミノ酸配列は配列番号25に記載されている。また、C7抗体の軽鎖可変領域の塩基配列は、配列表の配列番号22に、アミノ酸配列は配列番号23に記載されている。
　C7抗体のCDRH1のアミノ酸配列は配列番号15に、CDRH2のアミノ酸配列は配列番号16に、CDRH3のアミノ酸配列は配列番号17に、CDRL1のアミノ酸配列は配列番号12に、CDRL2のアミノ酸配列は配列番号13に、CDRL3のアミノ酸配列は配列番号14に記載されている。
　本発明の抗CLDN6抗体として、B1抗体又はC7抗体と同一のエピトープに結合する抗体を挙げることができる。該抗体が、B1抗体又はC7抗体の結合する部分ペプチド又は部分立体構造に結合すれば、該抗体がB1抗体又はC7抗体と同一のエピトープに結合すると判定することができる。また、B1抗体又はC7抗体のCLDN6に対する結合に対して該抗体が競合する（即ち、該抗体が、B1抗体又はC7抗体とCLDN6の結合を妨げる）ことを確認することによって、具体的なエピトープの配列又は構造が決定されていなくても、該抗体が抗CLDN6抗体と同一のエピトープに結合すると判定することができる。エピトープが同一であることが確認された場合、該抗体がB1抗体又はC7抗体と同等の抗原結合能、生物活性及び／又は内在化活性を有していることが強く期待される。
　本発明の抗体には、上記CLDN6に対するモノクローナル抗体に加え、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（Chimeric）抗体、ヒト化（Humanized）抗体、ヒト抗体等も含まれる。これらの抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。
（1）キメラ抗体
　キメラ抗体としては、抗体の可変領域と定常領域が互いに異種である抗体、例えばマウス又はラット由来抗体の可変領域をヒト由来の定常領域に接合したキメラ抗体を挙げることができる。
　本発明のキメラ抗体として例示されるマウス抗ヒトCLDN6抗体B1抗体由来のキメラ抗体は、配列番号21に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖及び配列番号19に示される軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む抗体であり、任意のヒト由来の定常領域を有していてよい。
　マウス抗ヒトCLDN6抗体B1抗体由来のキメラ抗体の具体例として、マウス抗ヒトCLDN6抗体B1抗体由来のキメラ抗体chB1抗体（以下、「chB1」とも記載する。）を挙げることができる。chB1抗体のアミノ酸配列は、配列表の配列番号32の20～471番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列表の配列番号28の21～234からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体を挙げることができる。
　なお、配列表の配列番号32に示される重鎖配列中で、1～19番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はシグナル配列であり、20～141番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は重鎖可変領域であり、142～471番目の残基からなるアミノ酸配列は重鎖定常領域である。また、配列表の配列番号28に示される軽鎖配列中で、1～20番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はシグナル配列であり、21～127番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は軽鎖可変領域であり、128～234番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は軽鎖定常領域である。
　chB1抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列表の配列番号34、配列番号30に記載されている。
　chB1抗体の重鎖アミノ酸配列は、配列表の配列番号33に示されるヌクレオチド配列によってコードされている。配列表の配列番号33に示されるヌクレオチド配列の1～57番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はchB1抗体重鎖のシグナル配列をコードしており、配列表の配列番号33に示されるヌクレオチド配列の58～423番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はchB1抗体の重鎖可変領域をコードしており、配列表の配列番号33に示されるヌクレオチド配列の424～1413番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はchB1抗体の重鎖定常領域をコードしている。
　chB1抗体の重鎖可変領域の塩基配列は配列表の配列番号35に記載されている。
　chB1抗体の軽鎖アミノ酸配列は、配列表の配列番号29に示されるヌクレオチド配列によってコードされている。配列表の配列番号29に示されるヌクレオチド配列の26～85番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はchB1抗体軽鎖のシグナル配列をコードしており、配列表の配列番号29に示されるヌクレオチド配列の86～406番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はchB1抗体の軽鎖可変領域をコードしており、配列表の配列番号29に示されるヌクレオチド配列の407～727番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はchB1抗体の軽鎖定常領域をコードしている。
　chB1抗体の軽鎖可変領域の塩基配列は配列表の配列番号31に記載されている。
（2）ヒト化抗体
　ヒト化抗体としては、相補性決定領域（CDR;complementarity　determining　region）のみをヒト由来の抗体に組み込んだ抗体（Nature(1986)321,p.522-525参照）、CDR移植法によって、CDRの配列に加え一部のフレームワークのアミノ酸残基もヒト抗体に移植した抗体（WO90／07861号）、更に、抗原に対する結合能を維持しつつ、一部のCDRのアミノ酸配列を改変した抗体（WO2012/075581、WO2011/084496、US2018/0501692）を挙げることができる。CDRのアミノ酸配列は、Kabatの定義、Chothiaの定義、Abmの定義、IMGT等公知の方法によって決めることができるが、本発明におけるCDRはいずれの方法によって定義されたものでもよい。
　但し、B1抗体又はC1抗体由来のヒト化抗体としては、B1抗体又はC1抗体の6種全てのCDR配列を保持し、CLDN6結合活性を有する限り、特定のヒト化抗体に限定されず、更に1～数個（好ましくは、1～2個、より好ましくは1個）のCDRのアミノ酸配列を改変したヒト化抗体変異体もCLDN6蛋白質を認識する又は該抗体のCLDN6蛋白質結合活性を有する限り、特定のヒト化抗体に限定されない。
　本発明の抗CLDN6ヒト化抗体又はその機能性断片としては、例えば、
　配列表の配列番号9に示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の1～数個（好ましくは、1～2個）のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるCDRH1、
　配列表の配列番号10に示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の1～数個（好ましくは、1～2個）のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるCDRH2、及び、
　配列表の配列番号11に示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の1～数個（好ましくは、1～2個）のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるCDRH3を含む可変領域を有する重鎖、並びに、
　配列表の配列番号5に示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の1～数個（好ましくは、1～2個）のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるCDRL1、
　配列表の配列番号6に示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の1～数個（好ましくは、1～2個）のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるCDRL2、及び、
　配列表の配列番号7に示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の1～数個（好ましくは、1～2個）のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるCDRL3を含む可変領域を有する軽鎖を含み、
　本発明のCLDN6蛋白質を認識する又は該抗体のCLDN6蛋白質結合活性を保持している抗体又は該抗体の機能性断片等を挙げることができる。
　上記抗CLDN6ヒト化抗体又はその機能性断片におけるCDRのアミノ酸置換の例としては、好ましくは、上記CDRL3の1～数個（好ましくは、1～2個）のアミノ酸置換が挙げられ、配列表の配列番号7のアミノ酸番号4番と5番のアミノ酸を置換した配列表の配列番号8に示されるCDRL3を例示できる。
　上記CDRHを有するヒト化抗体の重鎖可変領域として、配列表の配列番号54に示されるアミノ酸配列、配列表の配列番号58に示されるアミノ酸配列、及び配列表の配列番号62に示されるアミノ酸配列を例示でき、上記CDRLを有するヒト化抗体の軽鎖可変領域として配列表の配列番号38に示されるアミノ酸配列、配列表の配列番号42に示されるアミノ酸配列、配列表の配列番号46に示されるアミノ酸配列、及び配列表の配列番号50に示されるアミノ酸配列を例示できる。
　上記、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の組合せを含むヒト化抗体として、
　配列表の配列番号54に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列表の配列番号38に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含むことからなるヒト化抗体、
　配列表の配列番号58に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、および、配列表の配列番号42に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含むことからなるヒト化抗体、
　配列表の配列番号54に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、および、配列表の配列番号46に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含むことからなるヒト化抗体、
　配列表の配列番号58に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、および、配列表の配列番号50に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含むことからなるヒト化抗体、
　配列表の配列番号62に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、および、配列表の配列番号46に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含むことからなるヒト化抗体を好適に例示できる。
　上記重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の組合せを含むことからなるヒト化抗体の全長配列として、
　配列表の配列番号52のアミノ酸番号20～471に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び、配列表の配列番号36のアミノ酸番号21～234に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含むことからなるヒト化抗体（H1L1）、
　配列表の配列番号56のアミノ酸番号20～471に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び、配列表の配列番号40のアミノ酸番号21～234に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含むことからなるヒト化抗体（H2L2）、
　配列表の配列番号52のアミノ酸番号20～471に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び、配列表の配列番号44のアミノ酸番号21～234に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含むことからなるヒト化抗体（H1L3）、
　配列表の配列番号56のアミノ酸番号20～471に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び、配列表の配列番号48のアミノ酸番号21～234に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含むことからなるヒト化抗体（H2L4）、又は、
　配列表の配列番号60のアミノ酸番号20～471に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び、配列表の配列番号44のアミノ酸番号21～234に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含むことからなるヒト化抗体（H3L3）を例示できる。
　なお、配列表の配列番号52、56、又は60に示される重鎖アミノ酸配列中で、1～19番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はシグナル配列であり、20～141番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は重鎖可変領域であり、142～471番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は重鎖定常領域である。
　また、配列表の配列番号36、40、44又は48に示される軽鎖アミノ酸配列中で、1～20番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はシグナル配列であり、21～127番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は軽鎖可変領域であり、128～234番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は軽鎖定常領域である。
　上記ヒト化抗体H1L1、H2L2、H1L3、H2L4、H3L3の重鎖のカルボキシル末端は、後述のように、1又は2つのアミノ酸が欠失していてもよく、当該欠失体も本発明に含まれる。
　欠失体の重鎖として、配列表の配列番号52、56、60のアミノ酸番号20～470番目に記載のアミノ酸配列を含む重鎖が挙げられる。
　当該欠失体として、
　配列表の配列番号52のアミノ酸番号20～470に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び、配列表の配列番号36のアミノ酸番号21～234に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含むことからなるヒト化抗体（H1L1）、
　配列表の配列番号56のアミノ酸番号20～470に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び、配列表の配列番号40のアミノ酸番号21～234に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含むことからなるヒト化抗体（H2L2）、
　配列表の配列番号52のアミノ酸番号20～470に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び、配列表の配列番号44のアミノ酸番号21～234に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含むことからなるヒト化抗体（H1L3）、
　配列表の配列番号56のアミノ酸番号20～470に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び、配列表の配列番号48のアミノ酸番号21～234に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含むことからなるヒト化抗体（H2L4）、又は、
　配列表の配列番号60のアミノ酸番号20～470に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び、配列表の配列番号44のアミノ酸番号21～234に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含むことからなるヒト化抗体（H3L3）を例示できる。
　上記ヒト化抗体H1L1の重鎖アミノ酸配列をコードする塩基配列は配列番号53、軽鎖アミノ酸配列をコードする塩基配列は配列番号37、
　ヒト化抗体H2L2の重鎖アミノ酸配列をコードする塩基配列は配列番号57、軽鎖アミノ酸配列をコードする塩基配列は配列番号41、
　ヒト化抗体H1L3の重鎖アミノ酸配列をコードする塩基配列は配列番号53、軽鎖アミノ酸配列をコードする塩基配列は配列番号45、
　ヒト化抗体H2L4の重鎖アミノ酸配列をコードする塩基配列は配列番号57、軽鎖アミノ酸配列をコードする塩基配列は配列番号49、
　ヒト化抗体H3L3の重鎖アミノ酸配列をコードする塩基配列は配列番号61、軽鎖アミノ酸配列をコードする塩基配列は配列番号45で示されるポリヌクレオチドである。
　上記ヒト化抗体H1L1の重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列は配列番号55、軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列は配列番号39、
　ヒト化抗体H2L2の重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列は配列番号59、軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列は配列番号43、
　ヒト化抗体H1L3の重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列は配列番号55、軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列は配列番号47、
　ヒト化抗体H2L4の重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列は配列番号59、軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列は配列番号51、
　ヒト化抗体H3L3の重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列は配列番号63、軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列は配列番号47で示されるポリヌクレオチドである。
　なお、配列表の配列番号53、57、61に示される各ヌクレオチド配列の1～57番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は該ヒト化抗体重鎖のシグナル配列をコードしており、58～423番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は該ヒト化抗体重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードしており、424～1413番目の塩基配列のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は該抗体重鎖定常領域をコードしている。
　また、配列表の配列番号37、41、45、49に示される各ヌクレオチド配列の1～60番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は該ヒト化抗体軽鎖のシグナル配列をコードしており、61～381番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は該ヒト化抗体軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードしており、382～702番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は該抗体軽鎖定常領域をコードしている。
　上記重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の組合せを含むことからなる抗体、又は、上記重鎖及び軽鎖の組合せを含むことからなる抗体のアミノ酸配列との同一性又は相同性が80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、更に好ましくは97％以上、最も好ましくは99％以上である抗体もCLDN6への結合活性を有する限り、本発明の抗体に含まれる。
　また、上記重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の組合せを含むことからなる抗体、又は、上記重鎖及び軽鎖の組合せを含むことからなる抗体のCDRと同一のアミノ酸配列からなるCDRを有し、かつ該抗体のCDRのアミノ酸配列を除いたアミノ酸配列の同一性又は相同性が80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、更に好ましくは97％以上、最も好ましくは99％以上である抗体もCLDN6への結合活性を有する限り、本発明の抗体に含まれる。
　更に、重鎖又は軽鎖のアミノ酸配列に1～数個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を組み合わせることによっても、上記の各抗体と同等の生物活性を有する抗体を選択することが可能である。また、本明細書中におけるアミノ酸の置換としては保存的アミノ酸置換が好ましい（WO2013154206）。
　保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸側鎖に関連のあるアミノ酸グループ内で生じる置換である。かかるアミノ酸置換は元のアミノ酸配列を有する物質の特性を低下させない範囲で行うのが好ましい。
　二種類のアミノ酸配列間の相同性は、Blast algorithm version　2.2.2(Altschul, Stephen F., Thomas L.Madden, Alejandro A.Schaaffer,　Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J.Lipman(1997), 「Gapped　BLAST and PSI-BLAST:a new generation of protein database search　programs」, Nucleic Acids Res.25:3389-3402)のデフォルトパラメーターを使用することによって決定することができる。Blast algorithmは、インターネットでwww.ncbi.nlm.nih.gov/blastにアクセスすることによっても使用することができる。
（3）ヒト抗体
　本発明の抗体としては、さらに、CLDN6及び／又はCLDN9に結合する、ヒト抗体を挙げることができる。抗CLDN6及び／又はCLDN9ヒト抗体とは、ヒト染色体由来の抗体の遺伝子配列のみを有するヒト抗体を意味する。抗CLDN6ヒト抗体は、公知の方法によって得ることができる（Nature Genetics(1997)16,p.133-143、Nucl.Acids Res.(1998)26, p.3447-3448、Animal Cell Technology:Basic and Applied Aspects, vol.10, p.69-73、Kluwer Academic Publishers, 1999.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA(2000) 97, p.722-727、Investigative Ophthalmology & Visual Science.(2002)43(7), p.2301-2308、Briefings in Functional Genomics and Proteomics(2002), 1(2), p.189-203、Ophthalmology(2002)109(3),p.427-431、WO92/01047、WO92/20791、WO93/06213、WO93/11236、WO93/19172、WO95/01438、WO95/15388、Annu.Rev.Immunol(1994)12, p.433-455、Nature Biotechnology(2005)23(9), p.1105-1116）も知られている。
　以下に、本発明において使用される抗HER2抗体について説明する。
本発明の抗HER2抗体は、以下の特性を有する；
　（1）以下の特性を有することを特徴とする抗HER2抗体；
　　（a）HER2に特異的に結合する。
　　（b）HER2と結合することによってHER2発現細胞に内在化する活性を有する。
　（2）HER2の細胞外ドメインに結合する上記（1）に記載の抗体。
　（3）前記抗体がモノクローナル抗体である上記（1）又は（2）に記載の抗体。
　（4）抗体依存性細胞傷害（ADCC）活性及び／又は補体依存性細胞傷害（CDC）活性を有する上記（1）～（3）のいずれかに記載の抗体。
　（5）マウスモノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体又はヒト化モノクローナル抗体である、上記（1）～（4）のいずれかに記載の抗体。
　（6）重鎖定常領域がヒトIgG1の重鎖定常領域であり、ADCC及び／又はCDC活性の低減をもたらす変異を含む、上記（1）～（3）及び(5)のいずれかに記載の抗体。
　（7）重鎖定常領域がヒトIgG1の重鎖定常領域であり、EU Indexにより示される234位及び235位のロイシンがアラニンに置換されている、上記（6）に記載の抗体。
　（8）配列番号65に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号64に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を含んでなる抗体である、上記（1）～（5）のいずれかに記載の抗体。
　（9）配列番号75のアミノ酸番号20～139に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号73のアミノ酸番号21～127に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗体である、上記（1）～（3）及び（5）～（7）のいずれかに記載の抗体。
　（10）配列番号75のアミノ酸番号20～469に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号73のアミノ酸番号21～234に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を含んでなる抗体である、上記（1）～（3）、（5）～（7）及び(9)のいずれかに記載の抗体。
　（11）重鎖カルボキシル末端において1又は2つのアミノ酸が欠失している、上記（1）～（10）のいずれかに記載の抗体。
　（12）配列番号65のアミノ酸番号1～449に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号64のアミノ酸番号1～214に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を含んでなる、上記（1）～（5）、（8）及び（11）のいずれかに記載の抗体。
　（13）配列番号75のアミノ酸番号20～468に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号73のアミノ酸番号21～234に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を含んでなる、上記（1）～（3）、（5）～（7）、及び（9）～（11）のいずれかに記載の抗体。
　（14）上記（1）～（13）のいずれかに記載の抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターによって形質転換された宿主細胞を培養する工程及び当該工程で得られた培養物から目的の抗体を採取する工程を含む当該抗体の製造方法によって得られる抗体。
　なお、本願において、trastuzumabの重鎖定常領域（配列番号65）のEU Indexにより示される234位及び235位のロイシンがアラニンに置換されている抗体をTrastuzumab変異体と呼ぶ。
　更に、本発明の抗HER2抗体として、Trastuzumab変異体2が挙げられる。Trastuzumab変異体2の重鎖アミノ酸配列は配列番号77、軽鎖アミノ酸配列は配列番号76に記載されている。
　本発明の抗体には抗体の修飾体も含まれる。当該修飾体とは、本発明の抗体に化学的又は生物学的な修飾が施されてなるものを意味する。化学的な修飾体には、アミノ酸骨格への化学部分の結合、N－結合又はO－結合炭水化物鎖の化学修飾体等が含まれる。生物学的な修飾体には、翻訳後修飾（例えば、N－結合又はO－結合型糖鎖付加、N末又はC末のプロセッシング、脱アミド化、アスパラギン酸の異性化、メチオニンの酸化）されたもの、原核生物宿主細胞を用いて発現させることによってN末にメチオニン残基が付加したもの等が含まれる。また、本発明の抗体又は抗原の検出又は単離を可能にするために標識されたもの、例えば、酵素標識体、蛍光標識体、アフィニティ標識体もかかる修飾体の意味に含まれる。このような本発明の抗体の修飾体は、抗体の安定性及び血中滞留性の改善、抗原性の低減、抗体又は抗原の検出又は単離等に有用である。
　また、本発明の抗体に結合している糖鎖修飾を調節すること（グリコシル化、脱フコース化等）によって、抗体依存性細胞傷害活性を増強することが可能である。抗体の糖鎖修飾の調節技術としては、WO1999/54342、WO2000/61739、WO2002/31140、WO2007133855、WO2013120066等が知られているが、これらに限定されるものではない。本発明の抗体には当該糖鎖修飾を調節された抗体も含まれる。
　かかる修飾には、抗体又はその機能性断片における任意の位置に、または所望の位置においても施されてもよく、1つ又は2つ以上の位置に同一又は2種以上の異なる修飾がなされていてもよい。
　本発明において「抗体断片の修飾体」は「抗体の修飾体の断片」をもその意味に含むものである。
　抗体遺伝子を一旦単離した後、適当な宿主に導入して抗体を作製する場合には、適当な宿主と発現ベクターの組み合わせを使用することができる。抗体遺伝子の具体例としては、本明細書に記載された抗体の重鎖配列等をコードする遺伝子、及び軽鎖配列等をコードする遺伝子を組み合わせたものを挙げることができる。宿主細胞を形質転換する際には、重鎖配列遺伝子等と軽鎖配列遺伝子等は、同一の発現ベクターに挿入されていることが可能であり、又別々の発現ベクターに挿入されていることも可能である。
　真核細胞を宿主として使用する場合、動物細胞、植物細胞、真核微生物を用いることができる。特に動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、サルの細胞であるCOS細胞（Cell(1981)23,p.175-182、ATCC　CRL-1650）、マウス線維芽細胞NIH3T3（ATCC No.CRL-1658）やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（CHO細胞、ATCC CCL-61）のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1980)77、 p.4126-4220）、FreeStyle 293F細胞（Invitrogen社）を挙げることができる。
　原核細胞を使用する場合は、例えば、大腸菌、枯草菌を挙げることができる。
　これらの細胞に目的とする抗体遺伝子を形質転換によって導入し、形質転換された細胞をin vitroで培養することによって抗体が得られる。当該培養においては抗体の配列によって収量が異なる場合があり、同等な結合活性を持つ抗体の中から収量を指標に医薬としての生産が容易なものを選別することが可能である。よって、本発明の抗体には、上記形質転換された宿主細胞を培養する工程、及び当該工程で得られた培養物から目的の抗体又は当該抗体の機能性断片を採取する工程を含むことを特徴とする当該抗体の製造方法によって得られる抗体も含まれる。
　上記抗体遺伝子は、好ましくは、以下の（a）～（e）のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドである。
（a）B1もしくはC7抗体、chB1抗体、ヒト化抗体H1L1、H2L2、H1L3、H2L4、H3L3、 Trastuzumab及びその変異体のいずれか一つの抗体の重鎖アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと軽鎖アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの組み合わせ、
（b）B1もしくはC7抗体、chB1抗体、及び、ヒト化抗体H1L1、H2L2、H1L3、H2L4、H3L3、 Trastuzumab及びその変異体のいずれか一つの抗体のCDRH1～CDRH3を含む重鎖アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとCDRL1～CDRL3を含む軽鎖アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの組み合わせ
（c）B1もしくはC7抗体、chB1抗体、及び、ヒト化抗体H1L1、H2L2、H1L3、H2L4、H3L3、 Trastuzumab及びその変異体のいずれか一つの抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列を含む重鎖アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む軽鎖アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの組み合わせ
（d）（a）～（c）のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドからなるヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、CDLN6又はHER2に結合する抗体のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、及び、
（e）（a）～（c）のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドにおいて1～50個、1～45個、1～40個、1～35個、1～30個、1～25個、1～20個、1～15個、1～10個、1～8個、1～6個、1～5個、1～4個、1～3個、1若しくは2個、または1個のアミノ酸が置換、欠失、付加または挿入してなるポリペプチドのアミノ酸配列をコードし、且つ、CLDN6又はHER2に結合する抗体のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
　本発明は、本発明の抗体もしくはその機能性断片又はその修飾体をコードするヌクレオチド、該遺伝子が挿入された組換えベクター、該遺伝子又は該ベクターが導入された細胞を含む。
　また、本発明は、前記細胞を培養する工程、及び、その培養物から抗体もしくはその機能性断片又はその修飾体を回収する工程を含む、抗体もしくはその機能性断片又はその修飾体の製造方法も含む。
　なお、哺乳類培養細胞で生産される抗体の重鎖のカルボキシル末端のリシン残基が欠失することが知られており（Journal of Chromatography A,  705:129-134(1995)）、また、同じく重鎖カルボキシル末端のグリシン、リシンの2アミノ酸残基が欠失し、新たにカルボキシル末端に位置するプロリン残基がアミド化されることが知られている（Analytical Biochemistry、360:75-83(2007)）。しかし、これらの重鎖配列の欠失及び修飾は、抗体の抗原結合能及びエフェクター機能（補体の活性化や抗体依存性細胞傷害作用等）には影響を及ぼさない。従って、本発明に係る抗体には、当該修飾を受けた抗体及び当該抗体の機能性断片も含まれ、重鎖カルボキシル末端において1又は2つのアミノ酸が欠失した欠失体、及びアミド化された当該欠失体（例えば、カルボキシル末端部位のプロリン残基がアミド化された重鎖）等も包含される。但し、抗原結合能及びエフェクター機能が保たれている限り、本発明に係る抗体の重鎖のカルボキシル末端の欠失体は上記の種類に限定されない。本発明に係る抗体を構成する2本の重鎖は、完全長及び上記の欠失体からなる群から選択される重鎖のいずれか一種であってもよいし、いずれか二種を組み合わせたものであってもよい。各欠失体の量比は本発明に係る抗体を産生する哺乳類培養細胞の種類及び培養条件に影響を受け得るが、本発明に係る抗体の主成分としては2本の重鎖の双方でカルボキシル末端の1つのアミノ酸残基が欠失している場合を挙げることができる。
　得られた抗体は、均一にまで精製することができる。抗体の分離、精製は通常の蛋白質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。例えばカラムクロマトグラフィー、フィルター濾過、限外濾過、塩析、透析、調製用ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離、精製することができる(Strategies for Protein Purification and Characterization:A Laboratory Course Manual, Daniel R.Marshak et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996);Antibodies:A Laboratory Manual.Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory(1988))が、これらに限定されるものではない。
＜N297糖鎖＞
　近年、不均一な抗体の糖タンパク質を、酵素反応等によってリモデリングし、官能基を有する糖鎖を均一に導入する方法が報告されている（ACS Chemical Biology 2012, 7, 110、ACS Medicinal Chemistry Letters 2016, 7, 1005、Bioconjugate Chemistry 2015, 26, 2233、Angew. Chem. Int. Ed. 2016, 55, 2361-2367、US2016361436）。
　本発明の糖鎖のリモデリングはまず加水分解酵素を利用して、蛋白質（抗体等）に付加されている不均一な糖鎖を末端のGlcNAcのみ残して切除し、GlcNAcが付加した均一な蛋白質部分を調製する（以下、「アクセプター」と言う）。次に、別途調製した任意の糖鎖を用意し（以下、「ドナー」と言う）、このアクセプターとドナーを糖転移酵素を用いて連結する。これにより、任意の糖鎖構造を持った均一な糖蛋白質を合成できる。
　本発明において、「糖鎖」とは、2つ以上の単糖がグリコシド結合により結合された構造単位を意味する。具体的な単糖や糖鎖を、例えば”GlcNAc－”、”MSG－”のように、略号として標記することがある。構造式中でこれらの略号で記載した場合、還元末端で別の構造単位とのグリコシド結合に帰属する酸素原子又は窒素原子は、特別な定義がある場合を除き、当該糖鎖を表す略号には含まれないものとして表示される。
　本発明において、糖鎖の基本単位となる単糖の記載は、別に定める場合を除き、便宜上、その環構造において、環を構成する酸素原子に結合し、且つ、水酸基（又はグリコシド結合に帰属する酸素原子）と直接結合した炭素原子を1位（シアル酸においてのみ2位）として表記する。実施例化合物の名称は、化学構造全体として付されたものであり、このルールは必ずしも適用されない。
　本発明において、糖鎖を記号（例えば、GLY、SG、MSG、GlcNAc等）として記載する場合、別に定義される場合を除き、還元末端の炭素までを、当該記号に含めるものとし、N－又はO－グリコシド結合に帰属するN又はOは、当該記号には含まれないものとする。
　本発明において、特別な記載がない限り、アミノ酸の側鎖において糖鎖と連結した場合の部分構造は、側鎖部分を括弧で表示し、例えば、「（SG－）Asn」のように表記するものとする。
　本発明の抗体―薬物コンジュゲートは、次式
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000070
で示され、抗体Ab又はその機能性断片は、N297糖鎖又はリモデリングされたN297糖鎖からLに結合しており、好ましくは、AbのリモデリングされたN297糖鎖からLに結合している。
　本発明におけるAbの糖鎖は、N結合型糖鎖やO結合型糖鎖であり、好ましくは、N結合型糖鎖である。
　N結合型糖鎖は、Nグリコシド結合、O結合型糖鎖はOグリコシド結合により、抗体のアミノ酸側鎖と結合している。
　IgGはその重鎖のFc領域における297番目のアスパラギン残基（以下、「Asn297又はN297」という）によく保存されたN結合型糖鎖を有しており、抗体分子の活性や動態等に寄与することが知られている（Biotechnol.Prog., 2012,28, 608-622, Anal.Chem.,2013,85,715-736）。
　IgGの定常領域におけるアミノ酸配列はよく保存されており、Edelman et al.,（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., Vol.63, No.1(May 15,1969),p.78-85）において、それぞれのアミノ酸がEu番号（Eu INDEX）で特定されている。例えば、Fc領域においてN結合型糖鎖が付加するAsn297は、Eu番号において297位に相当するものであり、分子の断片化や領域欠損によって実際のアミノ酸位置が変動した場合であってもEu番号で表示することによってアミノ酸が一義的に特定される。
　本発明の抗体－薬物コンジュゲートにおいて、好ましくは、抗体又はその機能性断片はそのAsn297の側鎖に結合する糖鎖（以下、「N297糖鎖」という）からLに結合しており、より好ましくは、抗体又はその機能性断片は前記N297糖鎖からLに結合しており、当該N297糖鎖がリモデリングされた糖鎖である。
　SGPはSialyl　GlycoPeptideの略であり、N結合型複合糖鎖の代表的なものである。鶏卵の卵黄から、SGPは、例えば、WO2011／0278681に記載の方法に従って単離、精製することができる。また、SGPの精製品が市販（東京化成（株）、（株）伏見製薬所）されており、購入することができる。SGの糖鎖部分において還元末端のGlcNAcが一つ欠損した糖鎖（以下、「SG（10）」）のみからなるジシアロオクタサッカリド（東京化成（株））などが市販されている。
　本発明において、SG（10）のβ－Manの分岐鎖のいずれか一方のみで非還元末端のシアル酸が欠失した糖鎖構造をMSG（9）といい、分岐鎖の1－3糖鎖のみにシアル酸を有するものをMSG1、分岐鎖の1－6糖鎖のみにシアル酸を有するものをMSG2、とそれぞれ表記するものとする。
　本発明のリモデリングされたN297糖鎖は、N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2もしくはN297-(Fuc)MSG1とN297-(Fuc)MSG2の混合物、又はN297-(Fuc)SGであり、好ましくは、N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2又はN297-(Fuc)SGであり、より好ましくはN297-(Fuc)MSG1又はN297-(Fuc)MSG2である。
　N297-(Fuc)MSG1は以下の構造式又は配列式で示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000071
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000072
　上記式中、波線は抗体のAsn297に結合していることを示し、
　L（PEG）は、＊-(CH2CH2-O)n5- CH2CH2-NH-を示し、右端のアミノ基がN297糖鎖のβ－Manの分岐鎖の1－3鎖側の非還元末端のシアル酸の2位のカルボン酸とアミド結合を介して結合しておりし、左端のアステリスク＊は、前記リンカーLにおけるLbの1,2,3－トリアゾール環上の1位又は3位の窒素原子と結合していることを示し、n5は2～10の整数であり、好ましくは、2～5の整数である。
　N297-(Fuc)MSG2は以下の構造式又は配列式で示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000073
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000074
　上記式中、波線は抗体のAsn297に結合していることを示し、
　L（PEG）は、＊-(CH2CH2-O)n5- CH2CH2-NH-を示し、右端のアミノ基がN297糖鎖のβ－Manの分岐鎖の1－6鎖側の非還元末端のシアル酸の2位のカルボン酸とアミド結合を介して結合しており、左端のアステリスク＊は、前記リンカーLにおけるLbの1,2,3－トリアゾール環上の1位又は3位の窒素原子と結合していることを示し、n5は2～10の整数であり、好ましくは、2～5の整数である。
　N297-(Fuc)SGは以下の構造式又は配列式で示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000075
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000076
　上記式中、波線は抗体のAsn297に結合していることを示し、
　L（PEG）は、＊-(CH2CH2-O)n5- CH2CH2-NH-を示し、右端のアミノ基がN297糖鎖のβ－Manの分岐鎖の1－3鎖側及び1－6鎖側の両方の非還元末端のシアル酸の2位のカルボン酸とアミド結合を介して結合しており、左端のアステリスク＊は、前記リンカーLにおけるLbの1,2,3－トリアゾール環上の1位又は3位の窒素原子と結合していることを示し、n5は2～10の整数であり、好ましくは、2～5の整数である。
　本発明の抗体－薬物コンジュゲートにおける抗体のN297糖鎖が、N297-(Fuc)MSG1もしくはN297-(Fuc)MSG2又はそれらの混合物である場合、抗体は二量体であるため、抗体―薬物コンジュゲートは2つの薬物リンカー(-L-D)が結合された分子（上記m1＝1）となる（図1参照）。
　例えば、実施例27：ADC5はN297糖鎖がN297-(Fuc)MSG1の場合である。
　本発明の抗体－薬物コンジュゲートにおける抗体のN297糖鎖が、N297-(Fuc)SGである場合、抗体は二量体であるため、抗体－薬物コンジュゲートは4つの薬物リンカー(-L-D)が結合された分子（上記m1＝2）となる。
　N297糖鎖は、好ましくは、N297-(Fuc)MSG1もしくはN297-(Fuc)MSG2又はN297-(Fuc)SGであり、より好ましくは、N297-(Fuc)MSG1もしくはN297-(Fuc)MSG2であり、最も好ましくは、N297-(Fuc)MSG1である。
　本発明の抗体－薬物コンジュゲートにおける抗体のN297糖鎖がN297-(Fuc)MSG1もしくはN297-(Fuc)MSG2又はN297-(Fuc)SGである場合、均一な品質のADCを取得することができる。
　本発明は、以下i）～iii）の工程を含む糖鎖リモデリング抗体又は該抗体の機能性断片の製造方法を提供する。
　i)上述の宿主細胞（例えば、動物細胞（CHO細胞等））を培養し、得られた培養物から目的の抗体を採取する工程、
　ii)工程i)で得られた抗体を加水分解酵素で処理し、N297糖鎖が(Fucα1,6)GlcNAcである抗体((Fucα1,6)GlcNAc－抗体)を製造する工程（図3A）、
　好ましくは、更に当該反応液を、ハイドロキシアパタイトカラムによる精製を含む工程により(Fucα1,6)GlcNAc－抗体を精製する工程、及び、
　iii)MSG（9）又はSG（10）のシアル酸の2位のカルボン酸のカルボニル基にアジド基を有するPEGリンカー－(N3－L(PEG))を導入し、且つ、還元末端をオキサゾリン化した糖鎖ドナー分子と、糖転移酵素存在下で（Fucα1,6）GlcNAc－抗体を反応させ、シアル酸にアジド基が導入された糖鎖リモデリング抗体を合成する工程。
　また、かかる製造方法により得られた糖鎖リモデリング抗体もしくはその機能性断片、又はそれらの修飾体も本発明に含まれる。
　前記本抗体―薬物コンジュゲートの製造中間体はDBCO（Dibenzocyclooctyne）等のアジド基と反応するアルキン構造を有する（実施例2-1、化合物3-14参照）。従って、当該製造中間体を前記i）～iii）の工程で得られる糖鎖のシアル酸にアジド基を有するPEGリンカーが導入されたMSG1型、MSG2型又はSG型糖鎖リモデリング抗体又は該抗体の機能性断片と反応させることで、本発明の抗体―薬物コンジュゲートを製造することができる。
　本発明のN297糖鎖において、還元末端のフコース付加したGlcNAc-（Fucα1，6）GlcNAc）は、動物細胞で産生された抗体に由来し、それより非還元末端側の糖鎖は、上述したMSG（MSG1、MSG2）又はSGと同様の糖鎖構造にリモデリングされたものが好ましい。いずれもその非還元末端のシアル酸2位に結合したカルボン酸を利用して、L（PEG）と結合している。
　このようなMSG（MSG1、MSG2）又はSG型N297糖鎖を有する糖鎖リモデリング抗体は、例えばWO2013／120066などに記載の方法に準じて、図3に示すような方法で製造することができる。公知の方法に準じて宿主として動物細胞を用いて、遺伝子組み換え蛋白質として抗体を産生させた場合（上記工程i）、N297糖鎖は、基本構造としてフコース付加したN結合型糖鎖構造を有するが、非還元末端の構造や構成糖に多様な修飾がされた様々な構造からなる糖鎖を有する抗体またはその断片の混合物として得られる（図3AのIV）。このように動物細胞で産生された抗体は、EndoSなどの加水分解酵素で処理することによって、還元末端のキトビオース構造のGlcNAcβ1－4GlcNAcの間のグリコシド結合が加水分解され、N297糖鎖として（Fucα1,6）GlcNAcのみを有する単一の糖鎖構造を有する抗体分子(「（Fucα1,6）GlcNAc-抗体」という、図2のA参照)が得られる(図3A)(上記工程ii))。
　N297糖鎖の加水分解反応に用いる酵素としては、Endo S又はその加水分解活性を保持した変異酵素などを用いることができる。
　上記の加水分解反応により得られた（Fucα1,6）GlcNAc－抗体を糖鎖アクセプター分子として、EndoS D233Q又はEndoS D233Q/Q303L変異体のような糖転移酵素（WO2017010559等）を用いてMSG（MSG1、MSG2）又はSG型糖鎖ドナー分子と反応させることによって、上述の構造からなるMSG（MSG1、MSG2）又はSG型N297糖鎖を有する抗体（図2のB参照）を得ることができる（図3B）（上記工程iii）-1、iii)-2）。
　抗体－薬物コンジュゲートにおける抗体1分子あたりの薬物結合数m1が1の場合、糖鎖としてMSG（MSG1、MSG2）を有する糖鎖ドナー分子を採用する。このような糖鎖は、市販のmonosialo-Asn free(1S2G/1G2S-10NC-Asn、（株）糖鎖工学研究所、以下、「（MSG-）Asn」と言う）を原料に実施例3に記載の方法に準じて（MSG-）Asn1又は（MSG2-）Asnを分離して採用することもできるし、分離せずに混合物として採用することもできる。
　抗体－薬物コンジュゲートにおける抗体1分子あたりの薬物結合数m1が2の場合、この糖転移反応には糖鎖としてSG（10）を有する糖鎖ドナー分子を用いる。このようなSG（10）糖鎖は、例えばSGPから加水分解等によって取得されたものを用いても良く、市販のジシアロオクタサッカリド（東京化成工業（株））のようなSG（10）糖鎖を用いてもよい。
　ドナー分子に含まれるMSG（MSG1、MSG2）又はSG型糖鎖はそのシアル酸の2位にアジド基を含むPEGリンカー（N3-L（PEG））を有する。
　ドナー分子に含まれるMSG（MSG1、MSG2）又はSG型糖鎖の還元末端のGlcNAcは、例えば2－クロロ－1，3－ジメチル－1H－ベンズイミダゾール－3－イウム－クロライド処理によるオキサゾリン化のような形で活性化されたものを用いることが好ましい(J.Org.Chem.,2009,74(5),2210-2212)。
　糖転移反応に用いる酵素（糖転移酵素）としては、N297糖鎖に複合型糖鎖を転移させる活性を有するものであれば様々なものが採用できるが、好ましいものはEndoSの233番目のAspをGlnに置換することで加水分解反応を抑制した改変体であるEndoS D233Qである。EndoS D233Qを用いた糖転移反応については、WO2013/120066などに記載されている。また、EndoS D233Qに対して、さらに変異を加えたEndoS D233Q/Q303Lのような改変体酵素（WO2017010559）を利用してもよい。
　抗体の糖鎖リモデリング（糖加水分解、及び糖鎖転移反応）後の抗体の精製操作は、反応に使用した低分子化合物及び酵素との分離を目的とし、このような精製には、通常、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどが使用されるが、更にハイドロキシアパタイトカラムによる追加精製を行ってもよい。すなわち、本発明は、抗体の糖加水分解後の反応液からの中間体の精製工程において、更にハイドロキシアパタイトカラムによる精製工程を含む、抗体－薬物コンジュゲートの製造方法を提供する。糖鎖リモデリング報告例(JACS. 2012, 134,12308-12318.、Angew. Chem. Int. Ed.　2016, 55, 2361-2367)に従うと、抗体を加水分解酵素で処理した反応液をプロテインAカラム（アフィニティクロマトグラフィーカラム）で精製するのみであるが、この精製方法では、加水分解酵素（EndoS等）が完全には除去できず、残留酵素が影響して、次の糖転移反応に影響を与えることが判明した。ここで、精製法を検討した結果、抗体を加水分解酵素で処理した反応液をプロテインAカラム、ハイドロキシアパタイトカラム（CHTカラム、Bio-Rad Laboratories, Inc.）の順に精製することによって、残留酵素の影響なく、次の糖鎖転移反応の反応効率が向上した。
　本発明の抗体－薬物コンジュゲートは、最も好ましくは、次の群から選ばれる1の抗体－薬物コンジュゲートである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000077
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000078
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000079
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000080
上記で示されるそれぞれの構造式において、m1は1又は2の整数（好ましくは、m1は1の整数）であることを示し、
　抗体Abは、抗CLDN6抗体、抗CLDN9抗体、抗CLDN6／CLDN9抗体、抗HER2抗体、抗HER3抗体、抗DLL3抗体、抗A33抗体、抗CanAg抗体、抗CD19抗体、抗CD20抗体、抗CD22抗体、抗CD25抗体、抗CD30抗体、抗CD33抗体、抗CD37抗体、抗CD56抗体、抗CD70抗体、抗CD98抗体、抗B7-H3抗体、抗TROP2抗体、抗CEA抗体、抗Cripto抗体、抗EphA2抗体、抗FGFR2抗体(WO201315206等)、抗G250抗体、抗MUC1抗体(WO2011012309等)、抗GPNMB抗体、抗Integrin抗体、抗PSMA抗体、抗Tenascin－C抗体、抗SLC44A4抗体、抗Mesothelin抗体、抗EGFR抗体、抗5T4抗体、抗LRRC15抗体、抗DR5抗体、抗CDH3抗体、抗PDPN 抗体、又は抗CD123抗体であり（好ましくは、前記抗CLDN6抗体または抗HER2抗体であり、
　N297糖鎖は、N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2もしくはそれらの混合物又はN297-(Fuc)SG（好ましくは、N297-(Fuc)MSG1）のいずれか一つであることを示し、
　L（PEG）は、＊-(CH2CH2-O)3-CH2CH2-NH-であることを示し、右端のアミノ基がN297糖鎖のβ－Manの分岐鎖の1－3鎖側又は／及び1－6鎖側（好ましくは、1－3鎖側）の非還元末端のシアル酸の2位のカルボン酸とアミド結合を介して結合しており、左端のアステリスクは、前記構造式中のトリアゾール環上の1位又は3位の窒素原子と結合していることを示す。
　便宜上、上記最も好ましい抗体－薬物コンジュゲートとして、コンジュゲート1分子中に「N297糖鎖がL中のLbのトリアゾール環上の1位の窒素原子と結合した『-(N297糖鎖)-L-D』（『(N297糖鎖)-(N1Lb)L-D』）を2又は4個（m2＝1又は2）有するか、「3位の窒素原子と結合した『-(N297糖鎖)-L-D』（『(N297糖鎖)-(N3Lb)L-D』）」を2又は4個（m2＝1又は2）有する構造を記載しているが、コンジュゲート1分子中に『(N297糖鎖)-(N1Lb)L-D』(m2＝1の場合、1個、m2＝2の場合、1,2,3個)及び『(N297糖鎖)-(N3Lb)L-D』(m2＝1の場合、1個、m2＝2の場合、3,2,1個)の両方を有する抗体－薬物コンジュゲートも含む。すなわち、コンジュゲート1分子中に『(N297糖鎖)-(N1Lb)L-D』か『(N297糖鎖)-(N3Lb)L-D』のいずれか一方のみ、又は、その両方が混在している。
　本発明の抗体－薬物コンジュゲート、その遊離薬物もしくはその製造中間体には、立体異性体あるいは不斉炭素原子に由来する光学異性体、幾何異性体、互変異性体又はｄ体、ｌ体、アトロプ異性体等の光学異性体が存在することもあるが、これらの異性体、光学異性体及びこれらの混合物のいずれも本発明に含まれる。
　本発明の抗体－薬物コンジュゲートは、強い腫瘍活性（in vivo抗腫瘍活性、in vitro抗細胞活性）、良好な体内動態及び物性を示し、かつ安全性が高いため、医薬品として有用である。
　本発明の抗体－薬物コンジュゲートにおいて、抗体1分子への薬物の結合数は、その有効性、安全性に影響する重要因子である。抗体－薬物コンジュゲートの製造は、薬物の結合数が一定の数となるよう、反応させる原料・試薬の使用量等の反応条件を規定して実施されるが、低分子化合物の化学反応とは異なり、異なる数の薬物が結合した混合物として得られるのが通常である。抗体1分子への薬物の結合数は平均値、すなわち、平均薬物結合数（DAR:Drug to Antibody Ratio）として特定することができる。抗体分子へのピロロベンゾジアゼピン誘導体の結合数はコントロール可能であり、1抗体あたりの平均薬物結合数(DAR)として、1から10の範囲のピロロベンゾジアゼピン誘導体を結合させることができるが、好ましくは1から8個であり、より好ましくは1から5個である。
　本発明の抗体－薬物コンジュゲートにおいて、抗体が、抗体のリモデリングされた糖鎖からLに結合している場合、抗体薬物コンジュゲートにおける抗体1分子あたりの薬物結合数m2は1または2の整数である。当該糖鎖がN297糖鎖であり、糖鎖がN297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2又はN297-(Fuc)MSG1とN297-(Fuc)MSG2の混合物の場合、m2は1であり、DARは1～3の範囲（好ましくは、1.0～2.5の範囲、より好ましくは、1.2～2.2もしくは1.6～2.2の範囲）である。N297糖鎖が、N297-(Fuc)SGの場合、m2は2であり、DARは3～5の範囲（好ましくは、3.2～4.8の範囲であり、より好ましくは、3.5～4.2の範囲）である。
　なお、当業者であれば本願の実施例の記載から抗体に必要な数の薬物を結合させる反応を設計することができ、ピロロベンゾジアゼピン誘導体の結合数をコントロールした抗体を取得することができる。
　なお、本発明の抗体－薬物コンジュゲート、遊離薬物又は製造中間体は、大気中に放置したり、又は再結晶することにより、水分を吸収し、吸着水がついたり、水和物になる場合があり、そのような水を含む化合物及び塩も本発明に包含される。
　本発明の抗体－薬物コンジュゲート、遊離薬物又は製造中間体が、アミノ基等の塩基性基を有する場合、所望により医薬的に許容される塩とすることができる。そのような塩としては、例えば塩酸塩、ヨウ化水素酸塩等のハロゲン化水素酸塩；硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、燐酸塩等の無機酸塩；メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩等の低級アルカンスルホン酸塩；ベンゼンスルホン酸塩、p－トルエンスルホン酸塩等のアリ－ルスルホン酸塩；ギ酸、酢酸、りんご酸、フマル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、蓚酸塩、マレイン酸塩等の有機酸塩；及びオルニチン酸塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩等のアミノ酸塩を挙げることができる。
　本発明の抗体－薬物コンジュゲート、遊離薬物又は製造中間体が、カルボキシ基等の酸性基を有する場合、一般的に塩基付加塩を形成することが可能である。医薬的に許容される塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩等の無機塩；ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、N－メチルグルカミン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、シクロヘキシルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、N，N’－ジベンジルエチレンジアミン塩、ジエタノールアミン塩、N－ベンジル－N－（2－フェニルエトキシ）アミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩等の有機アミン塩、等を挙げることができる。
　本発明の抗体－薬物コンジュゲート、遊離薬物又は製造中間体は、空気中の水分を吸収すること等により水和物として存在することもある。本発明の溶媒和物としては、医薬的に許容し得るものであれば特に限定されないが、具体的には、水和物、エタノール和物、2－プロパノール和物等が好ましい。また、本発明の抗体－薬物コンジュゲート、遊離薬物又は製造中間体中に窒素原子が存在する場合にはN－オキシド体となっていてもよく、これら溶媒和物及びN－オキシド体も本発明の範囲に含まれる。
　また、本発明には、種々の放射性または非放射性同位体でラベルされた化合物も包含される。本発明の抗体－薬物コンジュゲート、遊離薬物又は製造中間体を構成する原子の1以上に、原子同位体の非天然割合も含有し得る。原子同位体としては、例えば、重水素（2H）、トリチウム（3H）、ヨウ素－125（125I）または炭素－14（14C）等を挙げることができる。また、本発明化合物は、例えば、トリチウム（3H）、ヨウ素－125（125I）または炭素－14（14C）のような放射性同位体で放射性標識され得る。放射性標識された化合物は、治療または予防剤、研究試薬、例えば、アッセイ試薬、及び診断剤、例えば、インビボ画像診断剤として有用である。本発明の抗体－薬物コンジュゲートの全ての同位体変異種は、放射性であると否とを問わず、本発明の範囲に包含される。
［製造方法］
R法：抗体の調製
　糖鎖リモデリング抗体、例えばWO2013／120066などに記載の方法に準じて、図3に示すような方法で製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000081
R－1工程　還元末端のキトビオース構造のGlcNAcβ1－4GlcNAcの間のグリコシド結合の加水分解
　本工程は目的の抗体に対して、公知の酵素反応を用いて抗体のアミノ酸配列297番目のアスパラギンに結合するN結合型糖鎖（N297結合糖鎖）を切断し、糖鎖切断抗体を調製する工程である。
　目的の抗体（20mg／ml）を緩衝溶液（50mMリン酸緩衝溶液等）中、0℃から40℃までにおいて、EndoS酵素等の加水分解酵素を用いて還元末端のキトビオース構造のGlcNAcβ1と4GlcNAcの間のグリコシド結合の加水分解反応を実施する。反応時間は10分から72時間、好ましくは1時間から6時間である。野生型EndoS酵素は抗体100mgに対して、0．1から10mg、好ましくは0．1から3mgを用いる。反応終了後、後述するアフィニティークロマトグラフィー精製及び／又はハイロドキシアパタイトカラム精製を実施することでGlcNAcβ1と4GlcNAcの間の糖鎖が加水分解された（Fucα1，6）GlcNAc抗体を製造することができる。
R－2工程　糖鎖転移反応
　本工程は上述の（Fucα1，6）GlcNAc抗体に対し、酵素反応を用いてアジド基を含むPEGリンカーを有するMSG（MSG1、MSG2）又はSG型糖鎖オキサゾリン体（以下、「アジド糖鎖オキサゾリン体」）を結合させ、糖鎖リモデリング抗体を製造する工程である。
　上記の糖鎖切断抗体を緩衝溶液（リン酸緩衝溶液等）中、0℃から40℃までにおいて、触媒量のEndoS（D233Q／Q303L）等の糖転移酵素存在下、アジド糖鎖オキサゾリン体と反応させることで、糖鎖転移反応を実施する。反応時間は10分から72時間、好ましくは1時間から6時間である。EndoS酵素（D233Q／Q303L）は抗体100mgに対して、1から10mg、好ましくは1から3mgを用い、アジド糖鎖オキサゾリン体は2から過剰当量、好ましくは2から20当量を使用する。
　反応終了後、アフィニティークロマトグラフィー精製とハイロドキシアパタイトカラム精製を実施することで精製した糖鎖リモデリング抗体を得ることができる。
　アジド糖鎖オキサゾリン体は実施例3～5に記載の方法に従い調製できる。MSG（MSG1、MSG2）又はジシアロオクタサッカリド（東京化成工業（株））に有機合成科学分野で公知の反応（縮合反応等）を利用して、アジド基を含むPEGリンカー（N3-L(PEG)）であるN3-(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH2を導入することができる。すなわち、シアル酸2位へのカルボン酸とN3-(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH2の右末端のアミノ基が公知の縮合反応によりアミド結合を形成する。
　なお、MSG、MSG1又はMSG2は、前記（MSG－）Asn又は分離精製した（MSG1－）Asnもしくは（MSG2－）Asn（実施例56）をEndoM等の加水分解酵素で加水分解することにより得ることができる。
　上記の糖鎖リモデリング抗体の調製において、抗体水溶液の濃縮、濃度測定、バッファー交換は以下の共通操作A乃至Cに従って行うことができる。
（共通操作A：抗体水溶液の濃縮）
　Amicon　Ultra(30,000乃至50,000 MWCO,　Millipore Co.）の容器内に抗体又は抗体－薬物コンジュゲート溶液を入れ、遠心機（Allegra　X-15R,Beckman　Coulter,Inc.）を用いた遠心操作（2000G乃至4000Gで5乃至20分間遠心）にて、抗体および後述する抗体－薬物コンジュゲート溶液を濃縮した。
（共通操作B：抗体の濃度測定）
　UV測定器（Nanodrop 1000, Thermo Fisher Scientific Inc.）を用いて、メーカー規定の方法に従い、抗体濃度の測定を行った。その際に、抗体ごとに異なる280nm吸光係数（1．3mLmg－1cm－1乃至1．8mLmg－1cm－1）を用いた。
（共通操作C：抗体のバッファー交換）
抗体水溶液は緩衝溶液（リン酸緩衝生理食塩水（pH6．0）、リン酸緩衝液（pH6．0）等）を加え共通操作Aを用いて濃縮した。この操作を数回行った後、共通操作Bを用いて抗体濃度の測定を行い、緩衝溶液（リン酸緩衝生理食塩水（pH6.0）、リン酸緩衝液（pH6.0）等）を用いて10mg／mLに抗体濃度を調整した。
S法：コンジュゲーション
　本製造法は、上述の糖鎖リモデリング抗体と製造中間体(2)をSPAAC反応(strain-promoted alkyne azide cycloaddition: JACS. 2004, 126,15046-15047)により結合させ、抗体－薬物コンジュゲートを製造する方法である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000082
　式中Abは糖鎖リモデリング抗体を示し、
　La’、Lp’、B’は、La、Lp、Bと同義であり、
　Ｊは、以下で示されるいずれかの構造式を示し、
　式中、アステリスクはLa’と結合していることを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000083
　J-La’-Lp’-NH-B’-CH2-O(C=O)-PBDは実施例2-1～2-6に記載の方法等により合成することができる。
　抗体Abの緩衝溶液（酢酸ナトリウム溶液、リン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム溶液等またはそれらの混合物）と、化合物（2）を適当な溶媒（ジメチルスルホキシド（DMSO）、ジメチルホルムアミド（DMF）、ジメチルアセトアミド（DMA）、N－メチル－2－ピリドン（NMP）、プロピレングリコール（PG）等またはそれらの混合物）に溶解させた溶液を混合することで、SPAAC反応は進行する。
　抗体1モルに対し、化合物（2）は2モルから過剰モル、好ましくは1モルから30モルであり、有機溶媒の比率は、抗体の緩衝液に対し1乃至200％v／vが好ましい。反応温度は0℃乃至37℃、好ましくは10℃から25℃であり、反応時間は1から150時間、好ましくは6時間から100時間である。反応時のpHは5乃至9が好ましい。
　抗体－薬物コンジュゲートは、前述の共通操作A乃至Cおよび後述の共通操作D乃至Fによってバッファー交換、精製、抗体濃度、及び抗体一分子あたりの薬物平均結合数の測定を行い、抗体－薬物コンジュゲート化合物（ADC）の同定を行うことができる。
共通操作D：抗体－薬物コンジュゲートの精製
　市販のSorbitol（5％）を含む酢酸緩衝液（10mM，pH5．5；本明細書でABSと称する）でNAP－25カラムを平衡化させた。このNAP－25カラムに、抗体－薬物コンジュゲート反応水溶液（約1．5～2．5mL）をのせ、メーカー規定の量の緩衝液で溶出させることで、抗体画分を分取した。この分取画分を再びNAP－25カラムにのせ、緩衝液で溶出させるゲルろ過精製操作を計2乃至3回繰り返すことで、未結合の薬物リンカーやジメチルスルホキシド、プロピレングリコールを除いた抗体－薬物コンジュゲートを得た。必要に応じて、共通操作AおよびCにより抗体－薬物コンジュゲート溶液の濃度を調製した。
共通操作E：抗体－薬物コンジュゲートにおける抗体濃度の測定
　抗体－薬物コンジュゲートにおける結合薬物濃度は、下記に示すランベルト・ベールの法則を用いて、算出することができる。
　以下にランベルト・ベールの法則を用いた式（I）を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000084
ここで、A280は抗体－薬物コンジュゲート水溶液の280nmにおける吸光度を示し、ε280、は抗体－薬物コンジュゲートの280nmにおけるモル吸光係数を示し、C（mol・L－1）は抗体－薬物コンジュゲートのモル濃度を示す。
上記式（I）より抗体－薬物コンジュゲートのモル濃度C（mol・L－1）は以下の式（II）で求められる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000085
さらに両辺に抗体-薬物コンジュゲートのモル質量MW（g・mol－1）を掛けることで、抗体－薬物コンジュゲートの重量濃度C’（mg・mL－1）を求めることができる（式（III））。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000086
　以下に、上記式に用いて本実施例に適用した各値について記載する。
　吸光度A280は、抗体－薬物コンジュゲート水溶液の280nmにおけるUV吸光度の実測値を用いた。モル質量MW（g・mol－1）は抗体のアミノ酸配列からより求められる抗体分子量の計算推定値を抗体-薬物コンジュゲートのモル質量の近似値として用いている。光路長l（cm）は1cmで測定した。
　抗体薬物コンジュゲートのモル吸光係数ε280は、以下の式（IV）によって求めることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000087
　ここで、εAb，280は280nmにおける抗体のモル吸光係数を示し、εDL，280は280nmにおける薬物のモル吸光係数を示す。
　εAb，280は抗体のアミノ酸配列から、既知の計算方法（Protein　Science,　1995,　vol.4,　2411-2423）によって推定することができる。実施例において、Trastuzumabのモル吸光係数は、εAb，280＝215400（計算推定値）を用いた。CLDN6抗体のモル吸光係数は、εAb，280＝221340（計算推定値）、TROP2抗体のモル吸光係数は、εAb，280＝226400（計算推定値）、CD98抗体のモル吸光係数は、εAb，280＝240400（計算推定値）、LPS抗体のモル吸光係数は、εAb，280＝230300（計算推定値）を、Trastuzumab変異体のモル吸光係数は、εAb，280＝215057（計算推定値）を用いた。
　εDL，280は、都度UV測定で得た実測値より算出したものを使用した。すなわち、コンジュゲート前駆体（薬物）をあるモル濃度に溶解させた溶液の吸光度を測定し、ランベルト・ベールの法則、式（I）を適用することで得られる値を使用した。
（共通操作F：抗体－薬物コンジュゲートにおける抗体一分子あたりの薬物平均結合数の測定）
　抗体－薬物コンジュゲートにおける抗体一分子あたりの薬物平均結合数は、以下の方法を用いる高速液体クロマトグラフィー（HPLC）分析によって求めることができる。
［F－1．HPLC分析用サンプルの調製（抗体－薬物コンジュゲートの還元）］
　抗体－薬物コンジュゲート溶液（約1mg／mL、60μL）をジチオトレイトール（DTT）水溶液（100mM、15μL）と混合する。混合物を37℃で30分インキュベートすることで、抗体－薬物コンジュゲートのL鎖及びH鎖間のジスルフィド結合を切断したサンプルを、HPLC分析に用いる。
［F－2．HPLC分析］
　HPLC分析を、下記の測定条件にて行う。
　HPLCシステム：Agilent　1290　HPLCシステム（Agilent　Technologies）
　検出器：紫外吸光度計（測定波長：280nm、329nm）
　カラム：BEH　Phenyl（2.1×50mm、1.7μm、Waters　Acquity）
　カラム温度：75℃
　移動相A：0．1％トリフルオロ酢酸（TFA），15％イソプロピルアルコール水溶液
　移動相B：0．075％TFA、15％イソプロピルアルコールアセトニトリル溶液
　グラジエントプログラム：14％－36％（0分－15分）、36％－80％（15－17分）、80％－14％（17分―17．1分）、14％－14％（17．1分―23分）
　サンプル注入量：5μL
［F－3．データ解析］
〔F－3－1〕薬物の結合していない抗体のH鎖（H0）に対して、薬物の結合したH鎖（薬物が一つ結合したH鎖：H1、薬物が二つ結合したH鎖：H2）は、結合した薬物の数に比例して疎水性が増して保持時間が大きくなることから、L0、H0、H1、H2、の順に溶出される。L0及びH0との保持時間比較により検出ピークをL0、H0、H1、H2のいずれかに割り当てることができる。また薬物の結合は、薬物の特長的な329nmの波長吸収でも確認できる。
〔F－3－2〕薬物リンカーにUV吸収があるため、薬物リンカーの結合数に応じて、L鎖、H鎖及び薬物リンカーのモル吸光係数を用いて下式に従ってピーク面積値の補正を行う。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000088
ここで、各抗体におけるL鎖及びH鎖のモル吸光係数（280nm）は、既知の計算方法（Protein　Science,　1995,　vol.4,　2411-2423）によって、各抗体のL鎖及びH鎖のアミノ酸配列から推定される値を用いることができる。Trastuzumabの場合、そのアミノ酸配列に従ってH鎖のモル吸光係数として81290を推定値として用いた。同様に、CLDN6抗体の場合H鎖のモル吸光係数として77280を、TROP2抗体の場合H鎖のモル吸光係数として68990を、CD98抗体の場合H鎖のモル吸光係数として78500を、LPS抗体の場合H鎖のモル吸光係数として77470を、Trastuzumab変異体の場合H鎖のモル吸光係数として81488を、薬物リンカーのモル吸光係数（280nm）は、コンジュゲート前駆体である化合物（1）の実測のモル吸光係数（280nm）を用いた。
〔F－3－3〕　ピーク面積補正値合計に対する各鎖ピーク面積比（％）を下式に従って計算する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000089
〔F－3－4〕　抗体－薬物コンジュゲートにおける抗体一分子あたりの薬物平均結合数を、下式に従って計算する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000090
＜医薬＞
　本発明の抗体－薬物コンジュゲートは、がん細胞に対して細胞傷害活性を示すことから、医薬として、特にがんに対する治療剤及び／又は予防剤として使用することができる。
　本発明の抗CLDN6抗体－薬物コンジュゲートが適用されるがんの種類としては、肺がん（非小細胞肺がん、小細胞肺がん等）、腎がん、尿路上皮がん、大腸がん、前立腺がん、多形神経膠芽腫、卵巣がん（表層上皮性腫瘍、間質性腫瘍、胚細胞腫瘍等）、膵がん、乳がん、メラノーマ、肝がん、膀胱がん、胃がん、食道がん、子宮体がん、精巣がん（セミノーマ、非セミノーマ）、子宮頸がん、胎盤絨毛がん、脳腫瘍、頭頚部がんならびにそれらの転移性形態等、抗HER2抗体－薬物コンジュゲートが適用されるがんの種類としては、肺がん、尿路上皮がん、大腸がん、前立腺がん、卵巣がん、膵がん、乳がん、膀胱がん、胃がん、胃腸間質腫瘍、子宮頸がん、食道がん、扁平上皮がん、腹膜がん、肝臓がん、肝細胞がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、子宮がん、唾液腺がん、腎臓がん、外陰部がん、甲状腺がん、又は陰茎がんならびにそれらの転移性形態等を挙げることができるが、治療対象となるがん細胞において抗体－薬物コンジュゲート中の抗体が認識できる蛋白質を発現しているがん細胞であればこれらには限定されることはない。
　本発明の抗体－薬物コンジュゲートは、哺乳動物に対して好適に投与することができるが、より好ましくはヒトである。
　本発明の抗体－薬物コンジュゲートが含まれる医薬組成物において使用される物質としては、投与量や投与濃度において、この分野において通常使用される製剤添加物その他から適宜選択して適用することができる。
　本発明の抗体－薬物コンジュゲートは、1種以上の薬学的に適合性の成分を含む薬学的組成物として投与され得る。例えば、上記薬学的組成物は、代表的には、1種以上の薬学的キャリア（例えば、滅菌した液体（例えば、水および油（石油、動物、植物、または合成起源の油（例えば、ラッカセイ油、大豆油、鉱油、ごま油など）を含む））を含む。水は、上記薬学的組成物が静脈内投与される場合に、より代表的なキャリアである。食塩水溶液、ならびにデキストロース水溶液およびグリセロール水溶液もまた、液体キャリアとして、特に、注射用溶液のために使用され得る。適切な薬学的賦形剤は、当該分野で公知である。上記組成物はまた、所望であれば、微量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはpH緩衝化剤を含み得る。適切な薬学的キャリアの例は、E.W.Martinによる「Remington’s　Pharmaceutical　Sciences」に記載される。その処方は、投与の態様に対応する。
　種々の送達システムが公知であり、本発明の抗体－薬物コンジュゲートを投与するために使用され得る。導入方法としては、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、および皮下の経路が挙げられるが、これらに限定されない。投与は、例えば、注入またはボーラス注射によるものであり得る。特定の好ましい実施形態において、上記リガンド薬物結合体の投与は、注入によるものである。非経口的投与は、好ましい投与経路である。
　代表的実施形態において、上記薬学的組成物は、ヒトへの静脈内投与に適合した薬学的組成物として、常習的手順に従って処方される。代表的には、静脈内投与のための組成物は、滅菌の等張性の水性緩衝液中の溶液である。必要である場合、上記医薬はまた、可溶化剤および注射部位での疼痛を和らげるための局所麻酔剤（例えば、リグノカイン）を含み得る。一般に、上記成分は、（例えば、活性剤の量を示すアンプルまたはサシェなどの密封してシールされた容器中の乾燥凍結乾燥粉末または無水の濃縮物として、別個に、または単位剤形中で一緒に混合して、のいずれかで供給される。上記医薬が注入によって投与される予定である場合、それは、例えば、滅菌の製薬グレードの水または食塩水を含む注入ボトルで投薬され得る。上記医薬が注射によって投与される場合、注射用滅菌水または食塩水のアンプルは、例えば、上記成分が投与前に混合され得るように、提供され得る。
　本発明の医薬組成物には本発明の抗体－薬物コンジュゲートのみを含む医薬組成物であってもよいし、抗体－薬物コンジュゲート及び少なくとも一つのこれ以外のがん治療剤を含む医薬組成物であってもよい。本発明の抗体－薬物コンジュゲートは、他のがん治療剤と共に投与することもでき、これによって抗がん効果を増強させることができる。このような目的で使用される他の抗がん剤は、抗体－薬物コンジュゲートと同時に、別々に、あるいは連続して個体に投与されてもよいし、それぞれの投与間隔を変えて投与してもよい。このようながん治療剤として、abraxane、carboplatin、cisplatin、gemcitabine、irinotecan(CPT-11)、paclitaxel、pemetrexed、sorafenib、vinblastin又はWO2003／038043号パンフレットに記載の薬剤、更にLH－RHアナログ（リュープロレリン、ゴセレリン等）、エストラムスチン・フォスフェイト、エストロジェン拮抗薬（タモキシフェン、ラロキシフェン等）、アロマターゼ阻害剤（アナストロゾール、レトロゾール、エキセメスタン等）等を挙げることができるが、抗腫瘍活性を有する薬剤であれば限定されることはない。
　このような医薬組成物は、選択された組成と必要な純度を持つ製剤として、凍結乾燥製剤あるいは液状製剤として製剤化すればよい。凍結乾燥製剤として製剤化する際には、この分野において使用される適当な製剤添加物が含まれる製剤であってもよい。また液剤においても同様にして、この分野において使用される各種の製剤添加物を含む液状製剤として製剤化することができる。
　医薬組成物の組成及び濃度は投与方法によっても変化するが、本発明の医薬組成物に含まれる抗体－薬物コンジュゲートは、抗体－薬物コンジュゲートの抗原に対する親和性、すなわち、抗原に対する解離定数（Kd値）の点において、親和性が高い（Kd値が低い）ほど、少量の投与量であっても薬効を発揮させことができる。したがって、抗体－薬物コンジュゲートの投与量の決定に当たっては、抗体－薬物コンジュゲートと抗原との親和性の状況に基づいて投与量を設定することもできる。本発明の抗体－薬物コンジュゲートをヒトに対して投与する際には、例えば、約0．001～100mg／kgを1回あるいは1～180日間に1回の間隔で複数回投与すればよい。
　また、本発明の抗体又は該抗体の機能性断片もまた、医薬として使用することができる。この場合、上述の＜医薬＞に関する「抗体－薬物コンジュゲート」に関する記載を、適宜「抗体又は該抗体の機能性断片」に関する記載であると読み替えることができる。
　さらに、本発明の遊離薬物（新規PBD誘導体化合物）、その塩、又はそれらの水和物もまた、医薬として使用することができる。この場合、上述の＜医薬＞に関する「抗体－薬物コンジュゲート」に関する記載を、適宜「遊離薬物（新規PBD誘導体化合物）、その塩、又はそれらの水和物」に関する記載であると読み替えることができる。
　以下に示す実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。また、これらはいかなる意味においても限定的に解釈されるものではない。また、本明細書において、特に記載のない試薬、溶媒及び出発材料は、市販の供給源から容易に入手可能である。
　参考例1：Trastuzumab Tesirine
工程1：抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション
　Trastuzumab（参考例3）の5mM四酢酸エチレンジアミン－リン酸緩衝生理食塩水（pH6．5）溶液（9.91mg/mL,　0.70mL）に、20℃にてリン酸二カリウム水溶液（1.0M,　0.0112mL）、トリス（2－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩水溶液（10mM，　0.0086mL）を加え、20℃にて60分間、室温で30分間反応させた。反応溶液に文献（Med．Chem．Lett．2016，7，983－987）を参考にして合成したTesirine（0．36mg）のジメチルアセトアミド溶液（0．0415mL）を加え、室温で1時間反応させた。反応溶液にN－アセチルシステイン水溶液（100mM、0.0024mL）を加え、30分間反応させて反応を停止した。
　精製操作：上記溶液を共通操作Dを用いて精製を行い、目的の化合物を有する溶液を3.5mL得た。
　特性評価：共通操作E、Fを用いて下記の特性値を得た。
　抗体濃度：1.40mg／mL，抗体収量：4.90mg（71％），抗体一分子あたりの薬物平均結合数（n）：2.0
　参考例2：抗CLDN6（H1L1）抗体Tesirine
工程1：抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション
　抗CLDN6（H1L1）抗体の5mM四酢酸エチレンジアミン－リン酸緩衝生理食塩水（pH6．5）溶液（9．87mg／mL，0．45mL）に、20℃にてリン酸二カリウム水溶液(1.0M,　0.0072mL)、トリス（2－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩水溶液（10mM,　0.0041mL）を加え、20℃にて90分間反応させた。反応溶液に文献(Med.Chem.　Lett.2016,7,983-987)を参考にして合成したTesirine(0.15mg)のN、N－ジメチルアセトアミド溶液（0.0277mL）を加え、20度で1時間反応させた。反応溶液にN－アセチルシステイン水溶液(100mM、　0.001mL)を加え、30分間反応させて反応を停止した。
　精製操作：上記溶液を共通操作Dを用いて精製を行い、目的の化合物を有する溶液を3．5mL得た。
　特性評価：共通操作E、Fを用いて下記の特性値を得た。
　抗体濃度：1．56mg／mL，抗体収量：3．90mg（88％），抗体一分子あたりの薬物平均結合数（n）：2．1
　参考例3：抗HER2抗体Trastuzumab
　抗HER2抗体はUS5821337を参照して作製した。Trastuzumabの軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列を配列番号64及び配列番号65に示した。
　参考例4：抗LPS抗体h＃1G5－H1L1
　抗LPS抗体はWO2015/046505を参照して作製した。h＃1G5－H1L1の軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列を配列番号66及び配列番号67に示した。
　参考例5：抗TROP2抗体hRS7
　抗TROP2抗体はWO2003/074566、WO2015/098099（参考例1）を参照して作製した。hRS7の軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列を配列番号68及び配列番号69に示した。
　参考例6：抗CD98抗体hM23－H1L1
　抗CD98抗体はWO2015/146132を参照して作製した。hM23－H1L1の軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列を配列番号70及び配列番号71に示した。
〔製造中間体（薬物リンカー）の合成〕
実施例1 
［実施例1-1：中間体1］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000091
工程1：ベンジル（6S)-6-（ヒドロキシメチル）-5-アザスピロ［2.4］ヘプタン-5-カルボキシレート（1-2）
　5-ベンジル 6-メチル（6S）-5-アザスピロ［2.4］ヘプタン-5，6-ジカルボキシレート（1-1）（104mmol，WO2012087596）のテトラヒドロフラン（500mL）溶液に、水素化ホウ素リチウム（4.30g，178mmol）を0℃にて少量ずつ加えた。0℃にて30分撹拌した後、室温にて2時間撹拌した。0℃にて水（180mL）、2規定塩酸（186mL）を加え、減圧留去した。得られた残渣を酢酸エチルで4回抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧留去し、得られた残渣（1-2）（27.9g，90％）をそのまま次の反応に用いた。
工程2：ベンジル （6S）-6-（｛［tert-ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝メチル）-5-アザスピロ［2.4］ヘプタン-5-カルボキシレート（1-3）
　上記工程1にて得られた化合物（1-2）（27.9g，107mmol）とイミダゾール（14.5g，214mmol）のジクロロメタン（300mL）溶液に、室温にてtert-ブチルジメチルシリルクロリド（24.2g，160mmol）を加え、室温にて18時間撹拌した。反応溶液を飽和クエン酸水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝100：0（v/v）～50：50（v/v）］にて精製し、目的物（1-3）（32.5g，81％）を得た。
1H-NMR（CDCl3）δ:7.39-7.34(5H,m),5.23-5.11(2H,m),4.10-3.48(4H,m),
3.16-3.14(1H,m),2.15-2.04(1H,m),1.81-1.77(1H,m),0.91-0.88(9H,m),0.65-0.55(4H,m),0.08-0.01(6H,m).
　MS(APCI)m/z:376(M+H)+
工程3：（6S）-6-（｛［tert-ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝メチル）-5-アザスピロ［2.4］ヘプタン（1-4）
　上記工程2で得られた化合物（1-3）（32.5g，86.5mmol）のエタノール（400mL）溶液に、室温にて7.5％パラジウム炭素触媒（54％水分、5.00g）を加え、室温、水素雰囲気下にて6時間撹拌した。反応溶液をセライト濾過し、濾液を減圧留去し、目的物（1-4）（21.3g，定量的）を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ:3.79-3.77(1H,m),3.71-3.69(1H,m),3.65-3.60(1H,m),3.01-2.98(2H,m),1.81-1.71(2H,m),0.90(9H,s),0.65-0.57(4H,m),0.08(3H,s),0.07(3H,s).
　MS(APCI、ESI)m/z:242(M+H)+
工程4：［（6S）-6-（｛［tert-ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝メチル）-5-アザスピロ［2.4］ヘプト-5-イル］（5-メトキシ-2-ニトロ-4-｛［トリ（プロパン-2-イル）シリル］オキシ｝フェニル）メタノン（1-5）
　5-メトキシ-2-ニトロ-4-｛トリ（プロパン-2-イル）シリル］オキシ｝安息香酸（52.2g，141mmol，US20150283262）と1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（23.8g，155mmol）のジクロロメタン（500mL）溶液に、氷冷下にてN，N’-ジシクロヘキシルカルボジイミド（35.0g，170mmol）を加えた。反応混合物を室温にて撹拌した。カルボン酸消失後、-60℃にて上記工程3にて得られた化合物（1-4）（34.1g，141mmol）とトリエチルアミン（29.4mL，212mmol）のジクロロメタン（100mL）溶液をゆっくりと滴下した。反応溶液を室温にて一晩撹拌した後、反応混合物に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、反応混合物をクロロホルムで抽出した。有機層を水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧留去して得られた残渣に酢酸エチルとジエチルエーテルを加え、固体成分を濾過により取り除き、濾液を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝100：0（v/v）～25：75（v/v）］にて精製し、目的物（1-5）（55.0g，66％）を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ:7.72-7.66(1H,m),6.80-6.73(1H,m),4.53-4.49(1H,m),4.04-3.95(1H,m),3.91-3.88(3H,m),3.59-3.54(1H,m),3.36-3.25(0.5H,m),3.01-2.96(1.5H,m),2.24-2.20(0.3H,m),2.09-2.05(0.7H,m),2.00-1.97(0.7H,m),1.69-1.67(0.3H,m),1.32-1.24(3H,m),1.12-1.05(18H,m),0.93-0.91(6H,m),0.79-0.77(3H,m),0.71-0.62(2H,m),0.57-0.40(2H,m),0.12-0.10(4H,m),0.11-0.15(2H,m). 
　MS(APCI、ESI)m/z:593(M+H)+
工程5：（2-アミノ-5-メトキシ-4-｛［トリ（プロパン-2-イル）シリル］オキシ｝フェニル）［（6S）-6-（｛［tert-ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝メチル）-5-アザスピロ［2.4］ヘプト-5-イル］メタノン（1-6）
　上記工程4で得られた化合物（1-5）（55.0g，92.8mmol）のエタノール（300mL）溶液に、窒素雰囲気下にて、7.5％パラジウム炭素（10.0g）を加えた。窒素風船を直ちに水素風船に付け替え、反応混合物を水素雰囲気下、室温で激しく撹拌した。原料消失後、反応混合物を濾過し、濾液を減圧留去し、得られた目的物（1-6）（52.2g，100％）をそのまま次の反応に用いた。
1H-NMR(CDCl3)δ:6.71(1H,s),6.25(1H,s),4.55-4.28(2H,m),3.97(1H,m),3.75-3.62(3H,m),3.70(3H,s),3.09-3.07(1H,m),2.24-2.19(1H,m),1.81-1.68(1H,m),1.27-1.22(3H,m),1.09-1.05(18H,m),0.90(9H,s),0.65-0.46(4H,m),0.07-0.03(6H,m).
　MS(APCI、ESI)m/z:563(M+H)+
工程6：N-［（プロプ-2-エン-1-イルオキシ）カルボニル］-L-バリル-N-［4-（｛［（2-｛［（6S）-6-（｛［tert-ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝メチル）-5-アザスピロ［2.4］ヘプト-5-イル］カルボニル｝-4-メトキシ-5-｛［トリ（プロパン-2-イル）シリル］オキシ｝フェニル）カルバモイル］オキシ｝メチル）フェニル］-L-アラニンアミド（1-7）
　上記工程5で得られた化合物（1-6）（18.6g，33.0mmol）およびトリエチルアミン（6.26mL，45.2mmol）のTHF（300mL）溶液に、エタノール-氷浴上にて、トリホスゲン（4.22g，14.2mmol）をゆっくりと添加した。添加後、氷冷した反応混合物に、N-［（プロプ-2-エン-1-イルオキシ）カルボニル］-L-バリル-N-［4-（ヒドロキシメチル）フェニル］-L-アラニンアミド（11.4g，30.2mmol，WO2011130598）とトリエチルアミン（6.26mL，45.2mmol）のテトラヒドロフラン（100mL）、N，N-ジメチルホルムアミド（30mL）混合溶液をゆっくりと滴下した。滴下後、氷浴をはずし、反応混合物を、窒素雰囲気下、40℃にて撹拌した。原料消失後、反応混合物に水を加え、反応混合物を酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。濾過後、減圧留去して得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝100：0（v/v）～40：60（v/v）］にて精製し、目的物（1-7）（23.5g，74％）を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ:8.99(1H,m),8.58(1H,s),7.80(1H,s),7.55-7.53(2H,m),7.34-7.32(2H,m),6.77-6.75(2H,m),5.94-5.87(1H,m),5.40-5.38(1H,m),5.33-5.29(1H,m),5.23-5.21(1H,m),5.13(1H,m),5.10(2H,m),4.69-4.64(1H,m),4.62-4.52(2H,m),4.06-4.03(1H,m),3.98(1H,m),3.76-3.65(6H,m),3.04(1H,m),2.28-2.26(1H,m),2.18-2.13(1H,m),1.46(3H,m),1.32-1.25(3H,m),1.11-1.09(18H,m),0.99-0.84(15H,m),0.65-0.40(4H,m),0.08-0.00(6H,m).
　MS(APCI、ESI)m/z:966(M+H)+
工程7：N-［（プロプ-2-エン-1-イルオキシ）カルボニル］-L-バリル-N-［4-（｛［（2-｛［（6S）-6-（ヒドロキシメチル）-5-アザスピロ［2.4］ヘプト-5-イル］カルボニル｝-4-メトキシ-5-｛［トリ（プロパン-2-イル）シリル］オキシ｝フェニル）カルバモイル］オキシ｝メチル）フェニル］-L-アラニンアミド（1-8）
　上記工程6で得られた化合物（1-7）（23.5g，24.3mmol）のテトラヒドロフラン（50mL），メタノール（50mL），水（44mL）溶液に、室温下にて酢酸（200mL）を加えた。反応混合物を室温にて撹拌した。原料消失後、反応混合物を酢酸エチルで抽出した。有機層を水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。濾過後、減圧留去して得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝100：0（v/v）～0：100（v/v）］にて精製し、目的物（1-8）（18.0g，87％）を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ:8.64-8.62(1H,m),8.50(1H,m),7.69(1H,m),7.55-7.53(2H,m),7.34-7.32(2H,m),6.79-6.75(3H,m),5.91-5.89(1H,m),5.39(1H,m),5.32-5.29(1H,m),5.23-5.21(1H,m),4.68-4.54(4H,m),4.31(1H,m),4.06-4.04(1H,m),3.81-3.79(3H,m),3.76(3H,s),3.63-3.61(1H,m),3.13-3.11(1H,m),2.16-2.13(1H,m),1.87-1.81(2H,m),1.46-1.43(3H,m),1.30-1.24(3H,m),1.12-1.08(18H,m),0.98-0.91(6H,m),0.63-0.45(4H,m).
　MS(APCI、ESI)m/z:852(M+H)+
工程8：N-［（プロプ-2-エン-1-イルオキシ）カルボニル］-L-バリル-N-｛4-［（｛［（11’S,11a’S）-11’-ヒドロキシ-7’-メトキシ-5’-オキソ-8’-｛［トリ（プロパン-2-イル）シリル］オキシ｝-11’，11a’-ジヒドロ-1’H-スピロ［シクロプロパン-1，2’-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン］-10’（5’H）-イル］カルボニル｝オキシ）メチル］フェニル｝-L-アラニンアミド（1-9）
　ジメチルスルホキシド（3.75mL，52.8mmol）のジクロロメタン（300mL）溶液に、窒素雰囲気下、-78℃にて、塩化オキサリル（2.17mL，25.3mmol）をゆっくりと滴下した。滴下後、反応混合物を-78℃にて撹拌した。反応混合物に、上記工程7で得られた化合物（1-8）（18.0g，21.1mmol）のジクロロメタン（50.0mL）溶液をゆっくりと滴下した。反応溶液に-78℃にて、トリエチルアミン（14.6mL，105mmol）を加えた。添加後、冷媒浴をはずし、室温までゆっくりと昇温した。原料消失後、反応混合物に水を加え、反応混合物をクロロホルム（200mL）で抽出した。有機層を水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。濾過後、減圧留去して得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝100：0（v/v）～0：60（v/v）］にて精製し、目的物（1-9）（16.5g，92％）を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ:8.51-8.36(1H,m),7.54-7.38(2H,m),7.22-7.07(3H,m),6.73-6.64(1H,m),5.94-5.87(2H,m),5.33-5.22(3H,m),5.09(1H,m),4.97(1H,m),4.64-4.58(4H,m),4.02-4.00(1H,m),3.86-3.83(3H,m),3.75-3.70(1H,m),3.61-3.54(2H,m),3.38-3.29(1H,m),2.40(1H,m),2.16-2.14(1H,m),1.74-1.71(1H,m),1.44(3H,m),1.18-1.16(3H,m),1.05-1.00(18H,m),0.97-0.92(6H,m),0.72-0.60(4H,m).
　MS(APCI、ESI)m/z:850(M+H)+
工程9：N-［（プロプ-2-エン-1-イルオキシ）カルボニル］-L-バリル-N-｛4-［（｛［（11’S,11a’S）-11’-｛［tert-ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝-7’-メトキシ-5’-オキソ-8’-｛［トリ（プロパン-2-イル）シリル］オキシ｝-11’，11a’-ジヒドロ-1’H-スピロ［シクロプロパン-1，2’-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン］-10’（5’H）-イル］カルボニル｝オキシ）メチル］フェニル｝-L-アラニンアミド（1-10）
　上記工程8で得られた化合物（1-9）（12.0g，14.1mmol）および2，6-ルチジン（6.58mL，56.5mmol）のジクロロメタン（200mL）溶液に、窒素雰囲気下、0℃にて、トリフルオロメチルスルホン酸tert-ブチルジメチルシリル（9.73mL，42.3mmol）をゆっくりと滴下した。氷冷下、10分間撹拌した後に、氷浴をはずし、室温にて撹拌した。原料消失後、反応混合物に水を加え、反応混合物をクロロホルムで抽出した水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。濾過後、減圧留去して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝100：0（v/v）～25：75（v/v）］にて精製し、目的物（1-10）（8.12g，60％）を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ:8.67-8.45(1H,m),7.50-7.44(2H,m),7.19(1H,s),7.13(2H,m),6.95(2H,m),6.62-6.57(2H,m),6.01(1H,m),5.95-5.86(1H,m),5.33-5.13(3H,m),4.82(1H,m),4.65-4.54(3H,m),4.03-4.01(1H,m),3.84-3.82(3H,m),3.73-3.66(1H,m),3.50-3.48(1H,m),3.27(1H,m),2.37-2.33(1H,m),2.19-2.13(1H,m),1.54-1.43(3H,m),1.22-1.13(3H,m),1.10-1.00(18H,m),0.97-0.91(6H,m),0.81(9H,s),0.76-0.59(4H,m),0.19-0.09(6H,m).
　MS(APCI、ESI)m/z:964(M+H)+
工程10：N-［（プロプ-2-エン-1-イルオキシ）カルボニル］-L-バリル-N-｛4-［（｛［（11’S,11a’S）-11’-｛［tert-ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝-8’-ヒドロキシ-7’-メトキシ-5’-オキソ-11’，11a’-ジヒドロ-1’H-スピロ［シクロプロパン-1，2’-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン］-10’（5’H）-イル］カルボニル｝オキシ）メチル］フェニル｝-L-アラニンアミド（1-11）
　上記工程9で得られた化合物（1-10）（8.12g，8.42mmol）のN，N-ジメチルホルムアミド（90mL）、水（2mL）溶液に、酢酸リチウム（0.611g，9.26mmol）を加え、室温下で撹拌した。原料消失後、反応混合物に水を加え、反応混合物を酢酸エチルで抽出した。有機層を水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。濾過後、減圧留去して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝100：0（v/v）～0：100（v/v）］にて精製し、目的物（1-11）（5.48g，81％）を得た。
1H-NMR(400MHz,CDCl3,20.9℃)δ:8.76-8.60(1H,m),7.45-7.44(2H,m),7.21(1H,s),7.10-7.09(2H,m),6.81-6.74(1H,m),6.65(1H,s),6.23(1H,s),6.01-5.99(1H,m),5.95-5.84(1H,m),5.41-5.20(2H,m),5.16(1H,m),4.84(1H,m),4.67-4.54(4H,m),4.05-4.03(1H,m),3.87(3H,s),3.71(1H,m),3.55-3.51(1H,m),3.26(1H,m),2.35(1H,m),2.18-2.12(1H,m),1.55-1.42(4H,m),0.97-0.92(6H,m),0.81(9H,s),0.76-0.61(4H,m),0.20-0.06(6H,m)
　MS(APCI、ESI)m/z:808(M+H)+
　1H-NMR(500MHz,CDCl3,27℃)δ:8.76(1H,s),7.43(2H,brd),7.20(1H,s),7.08(2H,d,J=8.3Hz),7.00(1H,br),6.66(1H,s),6.44(1H,s),6.00(1H,H-11’,d,J11’,11’a=9.2Hz),5.89(1H,m),5.53(1H,brd),5.30(1H,d,J=17.2Hz),5.20(1H,d,J=10.3Hz),5.15(1H,d,JABq=12.5Hz),4.85(1H,d,JABq=12.5Hz),4.66(1H,m),4.60-4.52(2H,m),4.07(1H,m),3.84(3H,s),3.71(1H,H-3’β,d,Jgem=11.7Hz),3.53(1H,H-11’a,m),3.26(1H,H-3’α,d,Jgem=11.7Hz),2.35(1H,H-1’β,dd,J1’β,11’a=8.30Hz,Jgem=13.1Hz),2.14(1H,m),1.54(1H,H-1’ α,d,Jgem=13.1Hz),1.41(3H,d,J=6.90Hz),0.95(3H,d,J=6.80Hz),0.92(3H,d,J=6.80Hz),0.81(9H,s),0.80-0.70(1H,m),0.70-0.59(3H,m),0.2-0.06(6H,m)
　化合物（1-11）についてselective 1D ROESYスペクトルで得られた相関（下図）より、11’ 位の絶対立体配置の解析を行った。1’α-Hと11’-H、 3’α-Hと11’-H、および1’β-Hと3’ β-H間に相関が認められることから、11’位の絶対立体配置はS 配置であることが分かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000092
  　　　　　　　　Selective 1D ROESYスペクトルで得られた有意な相関
　従って、化合物(1-11)、それと同じ絶対立体配置を有する化合物(1-9）及び化合物(1-10)、化合物（1-11）を用いて合成された化合物(3-11)、化合物(3-12)、化合物(3-13)及び薬物リンカー1（化合物(3-14)）、化合物(4-9)、化合物(4-10)、化合物(4-11)及び薬物リンカー2（化合物(4-12)）、ならびに、化合物(6-10)、化合物(6-11)、化合物(6-12)及び薬物リンカー4（化合物(6-13)）における11’位の絶対立体配置はS配置であることが分かった。また、同様の合成手法で得られる化合物(5-9)、化合物(5-10)及び薬物リンカー3（化合物(5-11)）の11’位の絶対立体配置はS 配置であると決定した。
［実施例1-2：中間体2］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000093
工程1：N-［4-（11，12-ジデヒドロジベンゾ［b，f］アゾシン-5（6H）-イル）-4-オキソブタノイル］グリシルグリシン（2-2）
　グリシルグリシン（0.328g，2.49mmol）、N，N-ジイソプロピルエチルアミン（0.433mL，2.49mmol）のN，N-ジメチルホルムアミド（20mL）溶液に、1-｛［4-（11，12-ジデヒドロジベンゾ［b，f］アゾシン-5（6H）-イル）-4-オキソブタノイル］オキシ｝ピロリジン-2，5-ジオン（2-1）（1.00g，2.49mmol，Click　Chemistry　Tools）、水（10mL）を室温にて加え、同温度にて一晩撹拌した。減圧留去し、得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム～クロロホルム：メタノール：水＝7：3：1（v/v/v）の分配有機層］にて精製し、目的物（0.930g，89％）を得た。
1H-NMR(DMSO-D6)δ:12.58(1H,s),8.14-8.12(1H,m),8.08-8.07(1H,m),7.69-7.68(1H,m),7.62-7.61(1H,m),7.53-7.45(3H,m),7.40-7.29(3H,m),5.05-5.01(1H,m),3.73-3.72(2H,m),3.66-3.60(3H,m),2.66-2.60(1H,m),2.33-2.24(1H,m),2.08-2.04(1H,m),1.81-1.77(1H,m).
　MS(APCI、ESI)m/z:420[(M+H)+].
実施例２
　［実施例2-1：薬物リンカー1］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000094
工程1：（2R，11aS）-2-｛［tert-ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝-8-ヒドロキシ-7-メトキシ-10-｛［2-（トリメチルシリル）エトキシ］メチル｝-2，3-ジヒドロ-1H-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン-5，11（10H，11aH）-ジオン（3-2）
　（2R，11aS）-8-（ベンジルオキシ）-2-｛［tert-ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝-7-メトキシ-10-｛［2-（トリメチルシリル）エトキシ］メチル｝-2，3-ジヒドロ-1H-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン-5，11（10H，11aH）-ジオン（3-1）（25.5g，41.6mmol，WO2016149546）のテトラヒドロフラン（150mL）、エタノール（150mL）溶液に、窒素雰囲気下、5％パラジウム炭素（54％水分、10.0g）を加えた後、反応溶液を水素雰囲気下、室温にて三日間撹拌した。反応溶液にクロロホルムを加え、セライト濾過した後、濾液を減圧留去した。得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝100：0（v/v）～50：50（v/v）］にて精製し、目的物（3-2）（19.4g，89％）を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ:7.36(1H,s),7.25(1H,s),6.01(1H,s),5.45-5.43(1H,m),4.69-4.67(1H,m),4.60-4.55(1H,m),4.23-4.21(1H,m),3.96(3H,s),3.76-3.68(2H,m),3.63-3.61(1H,m),3.56-3.53(1H,m),2.88-2.83(1H,m),2.03-2.00(1H,m),1.00-0.98(2H,m),0.87(9H,s),0.10(6H,s),0.02(9H,s).
　MS(APCI、ESI)m/z:523(M+H)+
工程2：（2R，11aS）-8-［（5-ブロモペンチル）オキシ］-2-｛［tert-ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝-7-メトキシ-10-｛［2-（トリメチルシリル）エトキシ］メチル｝-2，3-ジヒドロ-1H-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン-5，11（10H，11aH）-ジオン（3-3）
　上記工程1にて得られた化合物（3-2）（10.8g，20.7mmol）のN，N-ジメチルホルムアミド（30mL）溶液に、1，5-ジブロモペンタン（23.8g，103mmol）、炭酸カリウム（3.43g，24.8mmol）を室温で加えた。室温で3時間撹拌した後、反応溶液に水を加え、酢酸エチルで抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝90：10（v/v）～50：50（v/v）］にて精製し、目的物（3-3）（14.5g，定量的）を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ:7.34(1H,s),7.21(1H,s),5.52-5.49(1H,m),4.63-4.62(1H,m),4.58-4.55(1H,m),4.24-4.22(1H,m),4.07-4.04(2H,m),3.92(3H,s),3.82-3.64(3H,m),3.56-3.53(1H,m),3.45-3.43(2H,m),2.86-2.84(1H,m),2.04-2.00(1H,m),1.97-1.87(4H,m),1.66-1.62(2H,m),1.01-0.98(2H,m),0.87(9H,s),0.10(6H,s),0.04(9H,s)
　MS(APCI、ESI)m/z:673[81Br,(M+H)+],671[79Br,(M+H)+].
工程3：（2R，11aS）-8-［（5-ブロモペンチル）オキシ］-2-ヒドロキシ-7-メトキシ-10-｛［2-（トリメチルシリル）エトキシ］メチル｝-2，3-ジヒドロ-1H-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン-5，11（10H，11aH）-ジオン（3-4）
　上記工程2にて得られた化合物（3-3）（21.5mmol）のテトラヒドロフラン（40mL）溶液に、1mol/Lのテトラブチルアンモニウムフロリド　テトラヒドロフラン溶液（28.0mL，28.0mmol）を0℃にて加えた。室温にて30分間撹拌した後、反応溶液に水を加え、酢酸エチルで抽出し、得られた有機層を飽和食塩水で洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム：メタノール＝97.5：2.5（v/v）～92.5：7.5（v/v）］にて精製し、目的物（3-4）（11.3g，94％）を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ:7.34(1H,s),7.21(1H,s),5.53-5.50(1H,m),4.69-4.64(2H,m),4.32-4.30(1H,m),4.10-4.00(2H,m),3.91(3H,s),3.88-3.75(2H,m),3.73-3.64(2H,m),3.45-3.44(2H,m),2.99-2.96(1H,m),2.15-2.09(1H,m),1.99-1.85(5H,m),1.68-1.62(2H,m),1.01-0.95(2H,m),0.04(9H,s).
　MS(APCI、ESI)m/z:559[81Br,(M+H)+],557[79Br,(M+H)+].
工程4：（11aS）-8-［（5-ブロモペンチル）オキシ］-7-メトキシ-10-｛［2-（トリメチルシリル）エトキシ］メチル｝-1H-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン-2，5，11（3H，10H，11aH）-トリオン（3-5）
　上記工程3にて得られた化合物（3-4）（11.3g，20.2mmol）、テトラブチルアンモニウムブロミド（0.325g，1.01mmol）、臭化カリウム（0.240g，2.02mmol，）を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（60mL）、ジクロロメタン（60mL）に溶解させ、nor-AZADO（0.0279g，0.202mmol）、次亜塩素酸ナトリウム五水和物（2.03g，27.2mmol）を0℃にて加え、0℃にて30分間撹拌した。原料が残存したため、次亜塩素酸ナトリウム五水和物（1.00g、13.4mmol）を0℃にて加え、0℃にて15分撹拌した。さらに次亜塩素酸ナトリウム五水和物（0.300g、4.03mmol）を0℃にて加え、0℃にて15分撹拌し、原料の消失をTLCにて確認した。反応溶液にチオ硫酸ナトリウム水溶液を加え、クロロホルムで抽出し、得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝75：25（v/v）～40：60（v/v）］にて精製し、目的物（3-5）（9.74g，87％）を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ:7.33(1H,s),7.24(1H,s),5.56-5.53(1H,m),4.71-4.69(1H,m),4.66-4.63(1H,m),4.27-4.22(1H,m),4.12-4.02(2H,m),3.93-3.88(4H,m),3.82-3.75(1H,m),3.69-3.67(1H,m),3.61-3.56(1H,m),3.46-3.44(2H,m),2.82-2.77(1H,m),1.97-1.89(4H,m),1.68-1.64(2H,m),1.05-0.93(2H,m),0.04(9H,s). 
　MS(APCI、ESI)m/z:557[81Br,(M+H)+],555[79Br,(M+H)+].
工程5：（11aS）-8-［（5-ブロモペンチル）オキシ］-7-メトキシ-5，11-ジオキソ-10-｛［2-（トリメチルシリル）エトキシ］メチル｝-5，10，11，11a-テトラヒドロ-1H-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン-2-イル　トリフルオロメタンスルフォネート（3-6）
　上記工程4にて得られた化合物（3-5）（9.74g，17.5mmol）のジクロロメタン（160mL）溶液に、2，6-ルチジン（8.17mL，70.1mmol）を-40℃にて加え、-40℃にて10分間撹拌した。反応溶液に無水トリフルオロメタンスルホン酸（8.85mL，52.6mmol）を-40℃にて加え、-40℃にて30分間撹拌した。反応溶液に10％クエン酸水溶液を加え、クロロホルムで抽出し、得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝95：5→70：35］にて精製した後，NH2シリカゲルクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝95：5（v/v）～65：35（v/v）］にて精製し、目的物（3-6）（7.10g，59％）を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ:7.32(1H,s),7.24(1H,s),7.15-7.14(1H,m),5.56-5.53(1H,m),4.70-4.68(1H,m),4.66-4.63(1H,m),4.11-4.01(2H,m),3.94-3.90(4H,m),3.84-3.75(1H,m),3.73-3.68(1H,m),3.46-3.44(2H,m),3.18-3.14(1H,m),1.96-1.88(4H,m),1.69-1.61(2H,m),1.02-0.92(2H,m),0.04(9H,s). 
　MS(APCI、ESI)m/z:689[81Br,(M+H)+],687[79Br,(M+H)+].
工程6：（11aS）-8-［（5-ブロモペンチル）オキシ］-7-メトキシ-2-（4-メトキシフェニル）-10-｛［2-（トリメチルシリル）エトキシ］メチル｝-1H-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン-5，11（10H，11aH）-ジオン（3-7）
　上記工程5にて得られた化合物（3-6）（2.00g，2.91mmol）、4-メトキシフェニルボロン酸（0.884g，5.82mmol）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（0）（0.336g，0.291mmol）、炭酸ナトリウム（1.23g，11.6mmol）の混合物にトルエン（20mL）、エタノール（10mL）、水（10mL）を室温にて加えた。反応溶液を室温にて30分撹拌した後、反応溶液を酢酸エチルで抽出し、水、飽和食塩水で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝90：10（v/v）～50：50（v/v）］にて精製し、目的物（3-7）（1.71g，91％）を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ:7.38-7.37(3H,m),7.33(1H,s),7.25(1H,s),6.89-6.88(2H,m),5.56-5.54(1H,m),4.71-4.68(1H,m),4.65-4.62(1H,m),4.09-4.04(2H,m),3.96-3.91(4H,m),3.85-3.66(5H,m),3.46-3.45(2H,m),3.16-3.12(1H,m),1.99-1.94(4H,m),1.69-1.64(2H,m),1.00-0.98(2H,m),0.04(9H,s). 
　MS(APCI、ESI)m/z:647[81Br,(M+H)+],645[79Br,(M+H)+].
工程7：（11aS）-8-［（5-ブロモペンチル）オキシ］-7-メトキシ-2-（4-メトキシフェニル）-1，11a-ジヒドロ-5H-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン-5-オン（3-8）
　上記工程6にて得られた化合物（3-7）（0.789g，1.22mmol）をエタノール（10mL）、テトラヒドロフラン（10mL）に溶解し、2.0Mの水素化ホウ素リチウムテトラヒドロフラン溶液（6.11mL，12.2mmol）を0℃にて加え、0℃にて3時間撹拌した。反応溶液に水を加え、クロロホルムで抽出し、得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧留去し、得られた残渣をジクロロメタン（10mL）、エタノール（20mL）、水（10mL）に溶解し、シリカゲル（4g）を室温にて加え、室温で4日間撹拌した。シリカゲルをろ過により除き、水を加え、クロロホルムで抽出し、得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝60：40（v/v）～25：75（v/v）］にて精製し、目的物（3-8）（0.496g，81％）を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ:7.90-7.89(1H,m),7.53(1H,s),7.40-7.40(1H,m),7.35-7.34(2H,m),6.92-6.90(2H,m),6.83-6.81(1H,m),4.43-4.40(1H,m),4.13-4.06(2H,m),3.96(3H,s),3.84(3H,s),3.61-3.57(1H,m),3.47-3.36(3H,m),2.00-1.92(4H,m),1.67-1.63(2H,m).
　MS(APCI、ESI)m/z:501[81Br,(M+H)+],499[79Br,(M+H)+].
工程8：（11aS）-8-［（5-ブロモペンチル）オキシ］-7-メトキシ-2-（4-メトキシフェニル）-1，10，11，11a-テトラヒドロ-5H-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン-5-オン（3-9）
　上記工程7にて得られた化合物（3-8）（0.496g，0.992mmol）のジクロロメタン（20mL）溶液にナトリウムトリアセトキシボロヒドリド（0.421g，1.99mmol）を0℃にて加えた。室温にて2時間撹拌した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、クロロホルムで抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧留去した後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝60：40（v/v）～25：75（v/v）］にて精製し、目的物（3-9）（0.426g，86％）を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ:7.53-7.53(2H,m),7.32-7.30(2H,m),6.89-6.87(2H,m),6.05(1H,s),4.33-4.27(2H,m),4.00-3.98(2H,m),3.86(3H,s),3.82(3H,s),3.57-3.55(2H,m),3.42-3.38(3H,m),2.76-2.72(1H,m),1.96-1.88(4H,m),1.65-1.62(2H,m). 
　MS(APCI、ESI)m/z:503[81Br,(M+H)+],501[79Br,(M+H)+].
工程9：プロプ-2-エン-1-イル　（11aS）-8-［（5-ブロモペンチル）オキシ］-7-メトキシ-2-（4-メトキシフェニル）-5-オキソ-11，11a-ジヒドロ-1H-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン-10（5H）-カルボキシレート（3-10）
　上記工程8にて得られた化合物（3-9）（0.426g，0.849mmol）のジクロロメタン（30mL）溶液に、ピリジン（0.102mL1.27mmol）、クロロぎ酸アリル（0.374mL，3.54mmol）を0℃にて加え、0℃にて15分間撹拌した。反応溶液に10％クエン酸水溶液を加え、クロロホルムで抽出し、得られた有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝90：10（v/v）～50：50（v/v）］にて精製し、目的物（3-10）（0.465g，94％）を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ:7.38(1H,s),7.31-7.29(2H,m),7.26-7.25(1H,m),6.89-6.87(2H,m),6.71(1H,s),5.80-5.78(1H,m),5.14-5.11(2H,m),4.65-4.62(1H,m),4.39-4.26(3H,m),4.03-4.01(2H,m),3.92(3H,s),3.82(3H,s),3.66-3.64(1H,m),3.46-3.44(2H,m),3.30-3.27(1H,m),2.72-2.68(1H,m),1.96-1.88(4H,m),1.68-1.60(2H,m). 
　MS(APCI、ESI)m/z:587[81Br,(M+H)+],585[79Br,(M+H)+].
工程10：N-［（プロプ-2-エン-1-イルオキシ）カルボニル］-L-バリル-N-｛4-［（｛［（11’S,11a’S）-11’-｛［tert-ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝-7’-メトキシ-8’-｛［5-（｛（11aS）-7-メトキシ-2-（4-メトキシフェニル）-5-オキソ-10-［（プロプ-2-エン-1-イルオキシ）カルボニル］-5，10，11，11a-テトラヒドロ-1H-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン-8-イル｝オキシ）ペンチル］オキシ｝-5’-オキソ-11’，11a’-ジヒドロ-1’H-スピロ［シクロプロパン-1，2’-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン］-10’（5’H）-イル］カルボニル｝オキシ）メチル］フェニル｝-L-アラニンアミド（3-11）
　実施例1-1工程10にて得られた化合物（1-11）（0.130g，0.161mmol）と上記工程9にて得られた化合物（3-10）（0.104g，0.177mmol）のN，N-ジメチルホルムアミド（3mL）溶液に炭酸カリウム（0.0266g，0.193mmol）を室温にて加え、室温にて一晩撹拌した。反応溶液を酢酸エチルで希釈し、水、飽和食塩水で洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧留去した後、得られた残渣をNH2-シリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝70：30（v/v）～0：100（v/v）］にて精製し、目的物（3-11）（0.184g，87％）を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ:8.76(1H,s),7.58-7.56(2H,m),7.39(1H,s),7.32-7.30(2H,m),7.26-7.24(2H,m),7.19-7.17(3H,m),6.90-6.88(2H,m),6.78(1H,s),6.68-6.66(1H,m),6.37(1H,s),5.99-5.93(3H,m),5.34-5.20(6H,m),4.66-4.01(11H,m),3.90(3H,s),3.89(3H,s),3.78-3.54(9H,m),3.31-3.28(2H,m),2.73-2.69(1H,m),2.38-2.35(1H,m),2.19-2.13(1H,m),1.82-1.80(2H,m),1.46-1.29(6H,m),0.98-0.90(6H,m),0.83(9H,s),0.69-0.63(4H,m),0.19-0.16(6H,m).
　MS(APCI、ESI)m/z:1312(M+H)+
工程11：N-［（プロプ-2-エン-1-イルオキシ）カルボニル］-L-バリル-N-｛4-［（｛［（11’S,11a’S）-11’-ヒドロキシ-7’-メトキシ-8’-｛［5-（｛（11aS）-7-メトキシ-2-（4-メトキシフェニル）-5-オキソ-10-［（プロプ-2-エン-1-イルオキシ）カルボニル］-5，10，11，11a-テトラヒドロ-1H-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン-8-イル｝オキシ）ペンチル］オキシ｝-5’-オキソ-11’，11a’-ジヒドロ-1’H-スピロ［シクロプロパン-1，2’-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン］-10’（5’H）-イル］カルボニル｝オキシ）メチル］フェニル｝-L-アラニンアミド（3-12）
　上記工程10にて得られた化合物（3-11）（0.1837g，0.140mmol）と酢酸（0.048mL，0.840mmol）のテトラヒドロフラン（5.00mL）溶液に1mol/Lのテトラブチルアンモニウムフロリド　テトラヒドロフラン溶液（0.700mL，0.700mmol）を室温にて加え、室温にて3時間撹拌した。反応溶液を酢酸エチルで希釈し、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧留去した後、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー［クロロホルム：メタノール＝99.5：0.5（v/v）～95：5（v/v）］にて精製し、目的物（3-12）（0.178g、定量的）を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ:8.86(1H,s),7.60-7.59(2H,m),7.39(1H,s),7.32-7.20(7H,m),6.90-6.88(2H,m),6.78(1H,s),6.68(1H,s),6.38(1H,s),5.90-5.87(3H,m),5.39-5.22(6H,m),4.72-4.02(11H,m),3.90(3H,s),3.88(3H,s),3.83(3H,s),3.70-3.63(6H,m),3.32-3.29(3H,m),2.73-2.69(1H,m),2.43-2.40(1H,m),2.12-2.06(1H,m),1.77-1.74(2H,m),1.39-1.25(6H,m),0.96-0.89(6H,m),0.73-0.66(4H,m).
　MS(APCI、ESI)m/z:1198(M+H)+
工程12：L-バリル-N-｛4-［（｛［（11’S,11a’S）-11’-ヒドロキシ-7’-メトキシ-8’-［（5-｛［（11aS）-7-メトキシ-2-（4-メトキシフェニル）-5-オキソ-5，10，11，11a-テトラヒドロ-1H-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン-8-イル］オキシ｝ペンチル）オキシ］-5’-オキソ-11’，11a’-ジヒドロ-1’H-スピロ［シクロプロパン-1，2’-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン］-10’（5’H）-イル］カルボニル｝オキシ）メチル］フェニル｝-L-アラニンアミド（3-13）
　上記工程11にて得られた化合物（3-12）（0.140mmol）のジクロロメタン（2mL）溶液に、室温にてピロリジン（0.0579mL, 0.700mmol）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（0）（0.0162g, 0.0140mmol）を加え、室温にて15分撹拌した。減圧留去した後、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー［クロロホルム：メタノール＝99.5：0.5（v/v）～92.5：7.5（v/v）］にて精製し、目的物（3-13）（0.143g, 99%）を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ:9.12(1H,s),7.94-7.92(1H,m),7.57-7.53(4H,m),7.33-7.31(2H,m),7.20-7.18(3H,m),6.90-6.88(2H,m),6.36(1H,s),6.07(1H,s),5.91-5.88(1H,m),5.47-5.44(1H,m),5.21-5.13(1H,m),4.66-4.58(3H,m),4.32(1H,s),4.03-3.49(17H,m),3.38-3.29(4H,m),3.15-3.14(1H,m),2.77-2.73(1H,m),2.57(2H,s),2.43-2.40(1H,m),2.32-2.27(1H,m),1.81-1.39(8H,m),0.98-0.96(3H,m),0.85-0.83(3H,m),0.75-0.62(4H,m).
　MS(APCI、ESI)m/z:1030(M+H)+
工程13：N-［4-（11，12-ジデヒドロジベンゾ［b，f］アゾシン-5（6H）-イル）-4-オキソブタノイル］グリシルグリシル-L-バリル-N-｛4-［（｛［（11’S,11a’S）-11’-ヒドロキシ-7’-メトキシ-8’-［（5-｛［（11aS）-7-メトキシ-2-（4-メトキシフェニル）-5-オキソ-5，10，11，11a-テトラヒドロ-1H-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン-8-イル］オキシ｝ペンチル）オキシ］-5’-オキソ-11’，11a’-ジヒドロ-1’H-スピロ［シクロプロパン-1，2’-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン］-10’（5’H）-イル］カルボニル｝オキシ）メチル］フェニル｝-L-アラニンアミド（3-14）
　実施例1-2工程1にて得られた化合物（2-2）(0.0640g, 0.153mmol)、N-エトキシカルボニル-2-エトキシ-1，2-ジヒドロキノリン(0.0446g, 0.180mmol)の混合物にジクロロメタン（2mL）を室温にて加え、室温にて15分撹拌した。反応溶液に上記工程12にて得られた化合物（3-13）(0.143g, 0.139mmol)のジクロロメタン（2mL）溶液を加え、室温にて五時間撹拌した後、減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー［クロロホルム：メタノール＝99.5：0.5（v/v）～92.5：7.5（v/v）］で精製し、目的物（3-14）(0.103g, 52%)を得た。
1H-NMR(DMSO-D6)δ:9.93(1H,s),8.21-8.16(2H,m),8.07-8.04(1H,m),7.83-7.64(2H,m),7.60-7.55(3H,m),7.51-7.28(10H,m),7.19-7.16(2H,m),7.10-7.04(1H,m),6.92-6.90(2H,m),6.76-6.70(1H,m),6.39(1H,s),5.77-5.75(1H,m),5.21-5.18(1H,m),5.03-4.99(1H,m),4.82-4.79(1H,m),4.37-4.35(1H,m),4.21-4.20(2H,m),4.02-3.24(26H,m),3.16-3.13(1H,m),2.79-2.59(2H,m),2.39-2.28(2H,m),2.05-1.97(2H,m),1.91-1.77(4H,m),1.57-1.54(3H,m),1.28-1.23(3H,m),0.85-0.80(6H,m),0.67-0.61(4H,m).
　MS(APCI、ESI)m/z:1431(M+H)+
　［実施例2-2：薬物リンカー2］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000095
工程1：（2R，11aS）-8-（3-ブロモプロポキシ）-2-｛［tert-ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝-7-メトキシ-10-｛［2-（トリメチルシリル）エトキシ］メチル｝-2，3-ジヒドロ-1H-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン-5，11（10H，11aH）-ジオン（4-1）
　実施例2-1工程1にて得られた化合物（3-2）（5.06g，9.67mmol）と1，3-ジブロモプロパン（4.93mL，48.4mmol）を、実施例2-1工程2と同様に反応させ、目的物（4-1）（4.85g，78％）を得た。
　MS(APCI、ESI)m/z:645[81Br,(M+H)+],643[79Br,(M+H)+].
工程2：（2R，11aS）-8-（3-ブロモプロポキシ）-2-ヒドロキシ-7-メトキシ-10-｛［2-（トリメチルシリル）エトキシ］メチル｝-2，3-ジヒドロ-1H-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン-5，11（10H，11aH）-ジオン（4-2）
　上記工程1にて得られた化合物（4-1）（4.85g，7.54mmol）を、実施例2-1工程3と同様に反応させ、目的物（4-2）（4.05g，定量的）を得た。
　MS(APCI、ESI)m/z:531[81Br,(M+H)+],529[79Br,(M+H)+].
工程3：（11aS）-8-（3-ブロモプロポキシ）-7-メトキシ-10-｛［2-（トリメチルシリル）エトキシ］メチル｝-1H-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン-2，5，11（3H，10H，11aH）-トリオン（4-3）
　上記工程2にて得られた化合物（4-2）（7.54mmol）を、実施例2-1工程4と同様に反応させ、目的物（4-3）（3.73g，93％）を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ:7.34(1H,s),7.29(1H,s),5.56-5.53(1H,m),4.72-4.69(1H,m),4.67-4.61(1H,m),4.23-4.17(3H,m),3.97-3.88(4H,m),3.82-3.75(1H,m),3.74-3.56(4H,m),2.82-2.77(1H,m),2.43-2.38(2H,m),1.06-0.94(2H,m),0.08-0.00(9H,m).
工程4：（11aS）-8-（3-ブロモプロポキシ）-7-メトキシ-5，11-ジオキソ-10-｛［2-（トリメチルシリル）エトキシ］メチル｝-5，10，11，11a-テトラヒドロ-1H-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン-2-イル　トリフルオロメタンスルフォネート（4-4）
　上記工程3にて得られた化合物（4-3）（3.73g，7.08mmol）を、実施例2-1工程5と同様に反応させ、目的物（4-4）（3.27g，70％）を得た。
　MS(APCI、ESI)m/z:661[81Br,(M+H)+],659[79Br,(M+H)+].
工程5：（11aS）-8-（3-ブロモプロポキシ）-7-メトキシ-2-（4-メトキシフェニル-10-｛［2-（トリメチルシリル）エトキシ］メチル｝-1H-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン-5，11（10H，11aH）-ジオン（4-5）
　上記工程4にて得られた化合物（4-4）（3.27g，4.96mmol）を、実施例2-1工程6と同様に反応させ、目的物（4-5）（2.49g，81％）を得た。
　MS(APCI、ESI)m/z:619[81Br,(M+H)+],617[79Br,(M+H)+].
工程6：（11aS）-8-（3-ブロモプロポキシ）-7-メトキシ-2-（4-メトキシフェニル）-1，11a-ジヒドロ-5H-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン-5-オン（4-6）
　上記工程5にて得られた化合物（4-5）（2.49g，4.04mmol）を、実施例2-1工程7と同様に反応させ、目的物（4-6）（1.59g，84％）を得た。
MS（APCI、ESI）m/z：473［81Br，（M＋H）＋］，471［79Br，（M＋H）＋］.
工程7：（11aS）-8-（3-ブロモプロポキシ）-7-メトキシ-2-（4-メトキシフェニル）-1，10，11，11a-テトラヒドロ-5H-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン-5-オン（4-7）
　上記工程6にて得られた化合物（4-6）（1.59g，3.38mmol）を、実施例2-1工程8と同様に反応させ、目的物（4-7）（1.39g，87％）を得た。
　MS(APCI、ESI)m/z:475[81Br,(M+H)+],473[79Br,(M+H)+].
工程8：プロプ-2-エン-1-イル　（11aS）-8-（3-ブロモプロポキシ）-7-メトキシ-2-（4-メトキシフェニル）-5-オキソ-11，11a-ジヒドロ-1H-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン-10（5H）-カルボキシレート（4-8）
　上記工程7にて得られた化合物（4-7）（1.40g，2.95mmol）を、実施例2-1工程9と同様に反応させ、目的物（4-8）（0.885g，54％）を得た。
　MS(APCI、ESI)m/z:559[81Br,(M+H)+],557[79Br,(M+H)+].
工程9：N-｛［（プロプ-2-エン-1-イル）オキシ］カルボニル｝-L-バリル-N-［4-（｛［（11’S,11’aS）-11’-｛［tert-ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝-7’-メトキシ-8’-（3-｛［（11aS）-7-メトキシ-2-（4-メトキシフェニル）-5-オキソ-10-｛［（プロプ-2-エン-1-イル）オキシ］カルボニル｝-5，10，11，11a-テトラヒドロ-1H-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン-8-イル］オキシ｝プロポキシ）-5’-オキソ-11’，11’a-ジヒドロ-1’H，3’H-スピロ［シクロプロパン-1，2’-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン］-10’（5’H）-カルボニル］オキシ｝メチル）フェニル］-L-アラニンアミド（4-9）
　上記工程8にて得られた化合物（4-8）（0.0381g，0.0683mmol）と実施例1-1工程10で得られた化合物（1-11）（0.0552g、0.0683mmol）を、実施例2-1工程10と同様に反応させ、目的物（4-9）（0.0712g，81％）を得た。
MS（APCI、ESI）m/z：1284（M＋H）＋.
工程10：N-｛［（プロプ-2-エン-1-イル）オキシ］カルボニル｝-L-バリル-N-［4-（｛［（11’S,11’aS）-11’-ヒドロキシ-7’-メトキシ-8’-（3-｛［（11aS）-7-メトキシ-2-（4-メトキシフェニル）-5-オキソ-10-｛［（プロプ-2-エン-1-イル）オキシ］カルボニル｝-5，10，11，11a-テトラヒドロ-1H-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン-8-イル］オキシ｝プロポキシ）-5’-オキソ-11’，11’a-ジヒドロ-1’H，3’H-スピロ［シクロプロパン-1，2’-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン］-10’（5’H）-カルボニル］オキシ｝メチル）フェニル］-L-アラニンアミド（4-10）
　上記工程9にて得られた化合物（4-9）（0.0712g，0.0554mmol）を、実施例2-1工程11と同様に反応させ、目的物（4-10）（0.0671g，定量的）を得た。
MS（APCI、ESI）m/z：1170（M＋H）＋.
工程11：L-バリル-N-［4-（｛［（11’S,11’aS）-11’-ヒドロキシ-7’-メトキシ-8’-（3-｛［（11aS）-7-メトキシ-2-（4-メトキシフェニル）-5-オキソ-5，10，11，11a-テトラヒドロ-1H-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン-8-イル］オキシ｝プロポキシ）-5’-オキソ-11’，11’a-ジヒドロ-1’H，3’H-スピロ［シクロプロパン-1，2’-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン］-10’（5’H）-カルボニル］オキシ｝メチル）フェニル］-L-アラニンアミド（4-11）
　上記工程10にて得られた化合物（4-10）（0.0571mmol）を、実施例2-1工程12と同様に反応させ、目的物（4-11）（0.0574g，99％）を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ:9.16(1H,s),7.93-7.91(1H,m),7.55-7.52(1H,m),7.50-7.47(3H,m),7.35-7.32(2H,m),7.21(1H,s),7.13-7.11(2H,m),6.90-6.87(2H,m),6.40(1H,s),6.08(1H,s),5.90-5.87(1H,m),5.37-5.34(1H,m),4.73-4.53(3H,m),4.23-4.08(5H,m),3.89(3H,s),3.82(3H,s),3.78-3.72(5H,m),3.57-3.51(3H,m),3.38-3.30(3H,m),2.76-2.71(1H,m),2.36-2.24(4H,m),1.78-1.42(6H,m),1.00-0.98(3H,m),0.87-0.84(3H,m),0.74-0.62(4H,m).
　MS(APCI、ESI)m/z:1002(M+H)+.
工程12：N-［4-（11，12-ジデヒドロジベンゾ［b，f］アゾシン-5（6H）-イル）-4-オキソブタノイル］グリシルグリシル-L-バリル-N-［4-（｛［（11’S,11’aS）-11’-ヒドロキシ-7’-メトキシ-8’-（3-｛［（11aS）-7-メトキシ-2-（4-メトキシフェニル）-5-オキソ-5，10，11，11a-テトラヒドロ-1H-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン-8-イル］オキシ｝プロポキシ）-5’-オキソ-11’，11’a-ジヒドロ-1’H，3’H-スピロ［シクロプロパン-1，2’-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン］-10’（5’H）-カルボニル］オキシ｝メチル）フェニル］-L-アラニンアミド（4-12）
　上記工程11にて得られた化合物（4-11）（0.189g，0.189mmol）と実施例1-2工程1で得られた化合物（2-2）（0.087g、0.207mmol）を、実施例2-1工程13と同様に反応させ、目的物（4-12）（0.169g，64％）を得た。
MS（APCI、ESI）m/z：1402（M＋H）＋.
　［実施例2-3：薬物リンカー3］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000096
工程1：ジメチル（6S，6’S）-5，5’-｛1，5-ペンタンジイルビス［オキシ（5-メトキシ-2-ニトロベンゼン-4，1-ジイル）カルボニル］｝ビス（5-アザスピロ［2.4］ヘプタン-6-カルボキシレート）（5-2）
　4，4’-［1，5-ペンタンジイルビス（オキシ）］ビス（5-メトキシ-2-ニトロ安息香酸）（5-1）（5.41g，10.9mmol，Journal of Medicinal Chemistry 2004，47，1161）のジクロロメタン（50mL）溶液に、0℃にて塩化オキサリル（5.63mL，65.7mmol）を加え、N，N-ジメチルホルムアミド（0.0844mL，1.09mmol）滴下した。反応溶液を室温まで昇温し、2時間撹拌した。減圧留去して得られた残渣をジクロロメタン（100mL）に溶解し、メチル（6S）-5-アザスピロ［2.4］ヘプタン-6-カルボキシレート塩酸塩（4.28g，24.1mmol，Tetrahedron Letters 2012. 53. 3847）とトリエチルアミン（6.07mL，43.8mmol）のジクロロメタン溶液（100mL）に窒素雰囲気下、-40℃で滴下した。反応溶液を0℃に昇温して2時間撹拌した。反応混合物に1規定塩酸（100mL）を加え、有機層を水、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧留去し、目的物（5-2）（8.40g、定量的）を得た。
　MS(APCI、ESI)m/z:769(M+H)+.
工程2：｛1，5-ペンタンジイルビス［オキシ（5-メトキシ-2-ニトロベンゼン-4，1-ジイル）］｝ビス｛［（6S）-6-（ヒドロキシメチル）-5-アザスピロ［2.4］ヘプト-5-イル］メタノン｝（5-3）
　上記工程1にて得られた化合物（5-2）（8.40g，10.9mmol）のテトラヒドロフラン（100mL）溶液に、水素化ほう素リチウム（714mg，32.8mmol）を加え、0℃にて30分撹拌し、室温に昇温して1時間撹拌した。0℃にて1規定塩酸を加えた後、酢酸エチルで抽出し、飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。減圧下にて溶媒留去して、目的物（5-3）（7.70g，99％）を得た。
　MS(APCI、ESI)m/z:713(M+H)+.
工程3：ペンタン-1，5-ジイルビス［オキシ（5-メトキシ-2-ニトロベンゼン-4，1-ジイル）カルボニル（6S）-5-アザスピロ［2.4］ヘプタン-5，6-ジイルメタンジイル］ジアゼテート（5-4）
　上記工程2にて得られた化合物（5-3）（7.70g、10.8mmol）をピリジン（20mL）及び無水酢酸（10mL，105.9mmol）に溶解して、室温にて撹拌した。減圧留去して、目的物（5-4）（8.38g，97％）を得た。
　MS(APCI、ESI)m/z:797(M+H)+.
工程4：1，5-ペンタンジイルビス［オキシ（2-アミノ-5-メトキシベンゼン-4，1-ジイル）カルボニル（6S）-5-アザスピロ［2.4］ヘプタン-5，6-ジイルメタンジイル］ジアセテート（5-5）
　上記工程3にて得られた化合物（5-4）（8.28g，10.4mmol）のN，N-ジメチルホルムアミド（100mL）溶液に、5％パラジウム炭素（54％水分、1.00g）を加えた後、反応溶液を水素雰囲気下、室温にて6時間激しく撹拌した。セライトろ過した後、ろ液を減圧留去して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム：メタノール＝100：0（v/v）～90：10（v/v）］にて精製し、目的物（5-5）（5.05g，66％）を得た。
　MS(APCI、ESI)m/z:737(M+H)+.
工程5:{(6S)-5-[4-({5-[4-({（6S）-6-［（アセチルオキシ）メチル］-5-アザスピロ［2.4］ヘプト-5-イル｝カルボニル）-5-アミノ-2-メトキシフェノキシ］ペンチル｝オキシ）-5-メトキシ-2-｛［（プロプ-2-エン-1-イルオキシ）カルボニル］アミノ｝ベンゾイル］-5-アザスピロ［2.4］ヘプト-6-イル｝メチルアセテート（モノアリルオキシカルボニル体）（5-6）
　上記工程4にて得られた化合物（5-5）（5.05g，6.85mmol）のジクロロメタン（100mL）溶液に、ピリジン（1.10mL，13.7mmol）を加え、窒素雰囲気下、-78℃にてクロロギ酸アリル（0.725mL，6.85mmol）を加え、2時間撹拌した。減圧留去して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝70：30（v/v）～100：0（v/v）、クロロホルム：メタノール＝100：0（v/v）～90：10（v/v）］にて精製し、目的物であるモノアリルオキシカルボニル体（5-6）（2.63g，47％）を得た。
　MS(APCI、ESI)m/z:821(M+H)+.
工程6：N-［（2-プロペン-1-イルオキシ）カルボニル］-L-バリル-N-｛4-［（｛［2-（｛（6S）-6-［（アセチルオキシ）メチル］-5-アザスピロ［2.4］ヘプト-5-イル｝カルボニル）-5-（｛5-［4-（｛（6S）-6-［（アセチルオキシ）メチル］-5-アザスピロ［2.4］ヘプト-5-イル｝カルボニル）-2-メトキシ-5-｛［（2-プロペン-1-イルオキシ）カルボニル］アミノ｝フェノキシ］ペンチル｝オキシ）-4-メトキシフェニル］カルバモイル｝オキシ）メチル］フェニル｝-L-アラニンアミド（5-7）
　上記工程5で得られたモノアリルオキシカルボニル体（5-6）（2.00g，2.44mmol）とN-［（プロプ-2-エン-1-イルオキシ）カルボニル］-L-バリル-N-［4-（ヒドロキシメチル）フェニル］-L-アラニンアミド（1.10g，2.92mmol，WO2011130598）を、実施例1-1工程6と同様に反応させ、目的物（5-7）（2.64g，89％）を得た。
　MS(APCI、ESI)m/z:1224(M+H)+.
工程7：N-［（2-プロペン-1-イルオキシ）カルボニル］-L-バリル-N-［4-（｛［（2-｛［（6S）-6-（ヒドロキシメチル）-5-アザスピロ［2.4］ヘプト-5-イル］カルボニル｝-5-｛［5-（4-｛［（6S）-6-（ヒドロキシメチル）-5-アザスピロ［2.4］ヘプト-5-イル］カルボニル｝-2-メトキシ-5-｛［（2-プロペン-1-イルオキシ）カルボニル］アミノ｝フェノキシ）ペンチル］オキシ｝-4-メトキシフェニル）カルバモイル］オキシ｝メチル）フェニル］-L-アラニンアミド（5-8）
　上記工程6にて得られた化合物（5-7）（2.64g，2.16mmol）のメタノール（10mL）溶液に、炭酸カリウム（1.49g，10.8mmol）を加え、室温で3時間撹拌した。反応混合物に飽和塩化アンモニウム水溶液（100mL）を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。減圧留去して、目的物（5-8）（2.21g，90％）を得た。
　MS(APCI、ESI)m/z:1140(M+H)+.
工程8：N-［（2-プロペン-1-イルオキシ）カルボニル］-L-バリル-N-｛4-［（｛［（11’S,11a’S）-11’-ヒドロキシ-8’-｛［5-（｛（11’S,11a’S）-11’-ヒドロキシ-7’-メトキシ-5’-オキソ-10’-［（2-プロペン-1-イルオキシ）カルボニル］-5’，10’，11’，11a’-テトラヒドロ-1’H-スピロ［シクロプロパン-1，2’-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン］-8’-イル｝オキシ）ペンチル］オキシ｝-7’-メトキシ-5’-オキソ-11’，11a’-ジヒドロ-1’H-スピロ［シクロプロパン-1，2’-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン］-10’（5’H）-イル］カルボニル｝オキシ）メチル］フェニル｝-L-アラニンアミド（5-9）
　上記工程7にて得られた化合物（5-8）（2.03g，1.78mmol）のジクロロメタン（50mL）溶液に、デスマーチンペルヨージナン（1.59g，3.74mmol）を加え、室温で一晩撹拌した。反応混合物に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（100mL）を加え、クロロホルムで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。減圧留去して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム：メタノール＝100：0（v/v）～90：10（v/v）］にて精製し、目的物（5-9）（2.05g，定量的）を得た。
　MS(APCI、ESI)m/z:1136(M+H)+.
工程9：L-バリル-N-｛4-［（｛［（11’S,11a’S）-11’-ヒドロキシ-7’-メトキシ-8’-［（5-｛［（11a’S）-7’-メトキシ-5’-オキソ-5’，11a’-ジヒドロ-1’H-スピロ［シクロプロパン-1，2’-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン］-8’-イル］オキシ｝ペンチル）オキシ］-5’-オキソ-11’，11a’-ジヒドロ-1’H-スピロ［シクロプロパン-1，2’-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン］-10’（5’H）-イル］カルボニル｝オキシ）メチル］フェニル｝-L-アラニンアミド（5-10）
　上記工程8にて得られた化合物（5-9）（2.05g，1.80mmol）を、実施例2-1工程12と同様に反応させ、目的物（5-10）（1.02g，60％）を得た。
　MS(APCI、ESI)m/z:950(M+H)+.
工程10：N-［4-（11，12-ジデヒドロジベンゾ［b，f］アゾシン-5（6H）-イル）-4-オキソブタノイル］グリシルグリシル-L-バリル-N-｛4-［（｛［（11’S,11a’S）-11’-ヒドロキシ-7’-メトキシ-8’-［（5-｛［（11a’S）-7’-メトキシ-5’-オキソ-5’，11a’-ジヒドロ-1’H-スピロ［シクロプロパン-1，2’-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン］-8’-イル］オキシ｝ペンチル）オキシ］-5’-オキソ-11’，11a’-ジヒドロ-1’H-スピロ［シクロプロパン-1，2’-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン］-10’（5’H）-イル］カルボニル｝オキシ）メチル］フェニル｝-L-アラニンアミド（5-11）
　上記工程9にて得られた化合物（5-10）（0.710g，0.747mmol）と実施例1-2工程1にて得られた化合物（2-2）（0.313g、0.747mmol）をジクロロメタン（1.5mL）とメタノール（0.1mL）の混合溶媒に溶解した。4-（4，6-ジメトキシ-1，3，5-トリアジン-2-イル）-4-メチルモルホリニウムクロリド（0.264g，0.897mmol）を加え、室温で1時間撹拌した。減圧留去して得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム：メタノール＝100：0（v/v）～80：20（v/v）］にて精製し目的物（5-11）（0.671g，66％）を得た。
1H-NMR(DMSO-D6)δ:9.91(1H,s),8.32(1H,s),8.23-7.91(3H,m),7.81-7.19(14H,m),7.04(1H,m),6.80-6.62(3H,m),5.77-5.75(1H,m),5.20(1H,m),5.01(1H,m),4.79(1H,m),4.46-4.35(1H,m),4.04(4H,m),3.86-3.38(18H,m),3.22-3.15(2H,m),2.67-2.63(1H,m),2.46-2.23(3H,m),2.09-1.91(2H,m),1.80-1.78(5H,m),1.57(3H,m),1.27(3H,s),1.11-1.04(1H,m),0.87-0.79(6H,m),0.63-0.55(6H,m).
　MS(APCI、ESI)m/z:1351(M+H)+.
　［実施例2-4：薬物リンカー4］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000097
工程1：メチル（6S）-5-［4-（ベンジルオキシ）-5-メトキシ-2-ニトロベンゾイル］-5-アザスピロ［2.4］ヘプタン-6-カルボキシレート（6-2）
　4-（ベンジルオキシ）-5-メトキシ-2-ニトロ安息香酸（6-1）（6.07g，20.0mmol，Tetrahedron　1995，51，5617）、N，N-ジメチルホルムアミド（1.08mL，13.9mmol）のジクロロメタン（100mL）溶液に、氷冷下にて塩化オキサリル（3.43mL，40.0mmol）を5分間かけて滴下した。室温にて反応溶液を5時間撹拌した後、減圧留去し、得られた残渣をジクロロメタン（20mL）に溶解させ、減圧留去した。この操作を3回繰り返した後に、残渣をジクロロメタン（5mL）に懸濁させ、これに過剰のジエチルエーテルとヘキサンを加え、ろ過し、減圧下に乾燥させることにより粗酸クロリドを得た。得られた酸クロリドをジクロロメタンに溶解させ、-40℃（ドライアイス-アセトニトリル浴）に冷却し、メチル（6S）-5-アザスピロ［2.4］ヘプタン-6-カルボキシレート塩酸塩（4.22g，22.0mmol，Tetrahedron　Letters　2012.53.3847）、トリエチルアミン（3.36mL，24.2mmol）を徐々に加えた。反応混合物を一晩かけて室温にまで昇温した。反応混合物に1規定塩酸を加え、反応混合物をジクロロメタンで抽出した。有機層を水，飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧留去して得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝100：0～50：50］にて精製し、目的物（6-2）（6.55g，80％）を得た。
　MS(APCI、ESI)m/z:441(M+H)+
工程2：（11a’S）-8’-（ベンジルオキシ）-7’-メトキシ-1’H-スピロ［シクロプロパン-1，2’-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン］-5’，11’（10’H，11a’H）-ジオン（6-3）
　上記工程1にて得られた化合物（6-2）（6.55g，16.0mmol）のエタノール（150mL），テトラヒドロフラン（150mL）溶液に窒素雰囲気下、ラネ-ニッケル（7.00g）を加えた。反応混合物にヒドラジン一水和物（7mL）を加え、50℃まで徐々に昇温した。50℃にて2時間撹拌した後にラネ-ニッケル（3.00g）、ヒドラジン一水和物（3mL）を加え、1時間撹拌した。反応混合物にTHF（100mL）を加えて、セライトろ過した。減圧留去して得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝100：0～25：75］にて精製し、目的物（6-3）（4.42g，73％）を得た。
　MS(APCI、ESI)m/z:379(M+H)+
工程3：（11a’S）-8’-（ベンジルオキシ）-7’-メトキシ-10’-｛［2-（トリメチルシリル）エトキシ］メチル｝-1’H-スピロ［シクロプロパン-1，2’-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン］-5’，11’（10’H，11a’H）-ジオン（6-4）
　上記工程2にて得られた化合物（6-3）（10.0g，26.4mmol）のテトラヒドロフラン（150mL）溶液に-40℃にて、2.6mol/Lのノルマルブチルリチウムノルマルヘキサン溶液（12.0mL，31.8mmol）をゆっくりと滴下した。反応溶液を-40℃にて15分間撹拌し後、2-（クロロメトキシ）エチルトリメチルシラン（5.57mL，31.7mmol）をゆっくりと滴下した。反応溶液を室温にて3時間撹拌した後、水を加え酢酸エチルで抽出した。有機層を水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧留去して得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝100：0～30：70］にて精製し、目的物（6-4）（11.8g，88％）を得た。
　MS(APCI、ESI)m/z:509(M+H)+
工程4：（11a’S）-8’-ヒドロキシ-7’-メトキシ-10’-｛［2-（トリメチルシリル）エトキシ］メチル｝-1’H-スピロ［シクロプロパン-1，2’-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン］-5’，11’（10’H，11a’H）-ジオン（6-5）
　上記工程3にて得られた化合物（6-4）（18.7g，36.8mmol）のテロラヒドロフラン（50mL）、エタノール（100mL）溶液に、窒素雰囲気下において5％のパラジウム炭素触媒（5.00g）を加えた。直ちに窒素風船を水素風船に付け替え、反応混合物を水素雰囲気下にて6時間撹拌した。反応混合物にクロロホルムを加えて希釈し、セライトろ過をした後、濾液を減圧留去して得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝100：0～25：75］にて精製し、目的物（6-5）（15.1g，98％）を得た。
MS（APCI、ESI）m/z：419（M＋H）＋
工程5：（11a’S）-8’-［（5-ブロモペンチル）オキシ］-7’-メトキシ-10’-｛［2-（トリメチルシリル）エトキシ］メチル｝-1’H-スピロ［シクロプロパン-1，2’-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン］-5’，11’（10’H，11a’H）-ジオン（6-6）
　上記工程4にて得られた化合物（6-5）（2.77g，6.62mmol）を、実施例2-1工程2と同様に反応させ、目的物（6-6）（3.31g，88％）を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ:7.36(1H,s),7.25(1H,s),5.55(1H,m),4.65(1H,m),4.24-4.23(1H,m),4.11-4.03(2H,m),3.93(3H,s),3.85-3.78(1H,m),3.72-3.69(2H,m),3.46-3.39(3H,m),2.47-2.44(1H,m),2.25-2.22(1H,m),1.95-1.91(4H,m),1.67-1.59(1H,m),1.03-0.95(2H,m),0.90-0.85(1H,m),0.70-0.66(4H,m),0.05(9H,s).
工程6：（11a’S）-8’-［（5-ブロモペンチル）オキシ］-7’-メトキシ-1’，11a’-ジヒドロ-5’H-スピロ［シクロプロパン-1，2’-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン］-5’-オン（6-7）
　上記工程5にて得られた化合物（6-6）（3.31g，5.83mmol）を、実施例2-1工程7と同様に反応させ、目的物（6-7）（1.11g，45％）を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ:7.81(1H,m),7.53(1H,s),6.82(1H,s),4.13-4.06(2H,m),3.97(3H,s),3.88-3.83(1H,m),3.69(1H,m),3.52-3.39(3H,m),2.55-2.52(1H,m),2.06-1.89(5H,m),1.67-1.63(2H,m),0.76-0.72(4H,m).
工程7：（11a’S）-8’-［（5-ブロモペンチル）オキシ］-7’-メトキシ-1’，10’，11’，11a’-テトラヒドロ-5’H-スピロ［シクロプロパン-1，2’-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン］-5’-オン（6-8）
　上記工程6にて得られた化合物（6-7）（2.56g，6.08mmol）を、実施例2-1工程8と同様に反応させ、目的物（6-8）（1.15g，45％）を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ:7.60(1H,s),6.07(1H,s),4.11-4.04(1H,m),3.99(2H,m),3.87-3.84(1H,m),3.85(3H,s),3.73(1H,m),3.58-3.53(2H,m),3.47-3.42(3H,m),2.03-1.78(6H,m),1.65-1.63(2H,m),0.77-0.56(4H,m).
工程8：プロプ-2-エン-1-イル　（11a’S）-8’-［（5-ブロモペンチル）オキシ］-7’-メトキシ-5’-オキソ-11’，11a’-ジヒドロ-1’H-スピロ［シクロプロパン-1，2’-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン］-10’（5’H）-カルボキシレート（6-9）
　上記工程7にて得られた化合物（6-8）（1.15g，2.72mmol）を、実施例2-1工程9と同様に反応させ、目的物（6-9）（1.14g，82％）を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ:7.23(1H,s),6.69(1H,s),5.79(1H,s),5.13-5.10(2H,m),4.68-4.66(1H,m),4.48-4.45(2H,m),4.01(2H,m),3.92(3H,s),3.76(1H,m),3.54-3.37(3H,m),2.39(1H,m),1.95-1.90(4H,m),1.68-1.61(3H,m),1.44(1H,m),0.75-0.66(4H,m).
工程9：N-［（プロプ-2-エン-1-イルオキシ）カルボニル］-L-バリル-N-｛4-［（｛［（11’S,11a’S）-11’-｛［tert-ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝-7’-メトキシ-8’-｛［5-（｛（11a’S）-7’-メトキシ-5’-オキソ-10’-［（プロプ-2-エン-1-イルオキシ）カルボニル］-5’，10’，11’，11a’-テトラヒドロ-1’H-スピロ［シクロプロパン-1，2’-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン］-8’-イル｝オキシ）ペンチル］オキシ｝-5’-オキソ-11’，11a’-ジヒドロ-1’H-スピロ［シクロプロパン-1，2’-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン］-10’（5’H）-イル］カルボニル｝オキシ）メチル］フェニル｝-L-アラニンアミド（6-10）
　上記工程8にて得られた化合物（6-9）（0.374g，0.737mmol）と実施例1-1工程10にて得られた化合物（1-11）（0.452g、0.56mmol）を、実施例2-1工程10と同様に反応させ、目的物（6-10）（0.589g，65％）を得た。
MS（APCI、ESI）m/z：1234（M＋H）＋
工程10：N-［（プロプ-2-エン-1-イルオキシ）カルボニル］-L-バリル-N-｛4-［（｛［（11’S,11a’S）-11’-ヒドロキシ-7’-メトキシ-8’-｛［5-（｛（11a’S）-7’-メトキシ-5’-オキソ-10’-［（プロプ-2-エン-1-イルオキシ）カルボニル］-5’，10’，11’，11a’-テトラヒドロ-1’H-スピロ［シクロプロパン-1，2’-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン］-8’-イル｝オキシ）ペンチル］オキシ｝-5’-オキソ-11’，11a’-ジヒドロ-1’H-スピロ［シクロプロパン-1，2’-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン］-10’（5’H）-イル］カルボニル｝オキシ）メチル］フェニル｝-L-アラニンアミド（6-11）
　上記工程9にて得られた化合物（6-10）（0.589g，0.477mmol）を、実施例2-1工程11と同様に反応させ、目的物（6-11）（0.382g，71％）を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ:8.90(1H,s),7.55(2H,m),7.25-7.21(2H,m),6.74(2H,m),6.38(1H,s),5.90-5.87(5H,m),5.33-5.09(8H,m),4.66-4.60(8H,m),3.98-3.91(10H,m),3.77-3.30(12H,m),2.42-2.36(2H,m),1.77-1.39(6H,m),0.91-0.70(14H,m).
工程11：L-バリル-N-｛4-［（｛［（11’S,11a’S）-11’-ヒドロキシ-7’-メトキシ-8’-［（5-｛［（11a’S）-7’-メトキシ-5’-オキソ-5’，10’，11’，11a’-テトラヒドロ-1’H-スピロ［シクロプロパン-1，2’-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン］-8’-イル］オキシ｝ペンチル）オキシ］-5’-オキソ-11’，11a’-ジヒドロ-1’H-スピロ［シクロプロパン-1，2’-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン］-10’（5’H）-イル］カルボニル｝オキシ）メチル］フェニル｝-L-アラニンアミド（6-12）
　上記工程10にて得られた化合物（6-11）（0.382g，0.341mmol）を、実施例2-1工程12と同様に反応させ、目的物（6-12）（0.200g，62％）を得た。
MS（APCI、ESI）m/z：952（M＋H）＋
工程12：N-［4-（11，12-ジデヒドロジベンゾ［b，f］アゾシン-5（6H）-イル）-4-オキソブタノイル］グリシルグリシル-L-バリル-N-｛4-［（｛［（11’S,11a’S）-11’-ヒドロキシ-7’-メトキシ-8’-［（5-｛［（11a’S）-7’-メトキシ-5’-オキソ-5’，10’，11’，11a’-テトラヒドロ-1’H-スピロ［シクロプロパン-1，2’-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン］-8’-イル］オキシ｝ペンチル）オキシ］-5’-オキソ-11’，11a’-ジヒドロ-1’H-スピロ［シクロプロパン-1，2’-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン］-10’（5’H）-イル］カルボニル｝オキシ）メチル］フェニル｝-L-アラニンアミド（6-13）
　上記工程11にて得られた化合物（6-12）（0.0560g，0.0588mmol）と実施例1-2工程1にて得られた化合物（2-2）（0.022g、0.053mmol）を、実施例2-1工程13と同様に反応させ、目的物（6-13）（0.0500g，63％）を得た。
MS（APCI、ESI）m/z：1354（M＋H）＋
〔糖鎖ドナーの合成〕
実施例3：［N3-PEG（3）］-MSG1-Ox
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000098
工程1：（MSG1-）Asn
　市販品であるmonosialo-Asn free (1S2G/1G2S-10NC-Asn、(株)糖鎖工学研究所製）(「(MSG-)Asn」と呼ぶ)(500mg)を以下の条件で逆相HPLC分離精製し、1st　main　peakとして溶出される（MSG1-）Asn（保持時間　15～19　min　付近）と2nd　main　peakとして溶出される（MSG2-）Asn（保持時間　21～26　min　付近）に分離した。0.1％ぎ酸水溶液を溶離液として使用し、装置にはELS-PDAトリガー分取システム（日本分光株式会社製）を使用し、カラムにはInertsil　ODS-3（10um、　30Φx250mm、GLサイエンス社製）を使用し、流速を30mL/minとした。溶出中にUV検出（210nm）された最初のピ-クを分取し、凍結乾燥して、目的物（238mg）を得た。
工程2：MSG1
　上記工程1で得られた化合物（229mg）を200mMりん酸緩衝溶液（pH6.25）（1145μL）に溶解させ、EndoM（東京化成工業（株）製、1U/mL））水溶液（100μL）を加え、35℃で6日間インキュベートした。反応終了後、反応液をVIVASPIN　15R（Hydrosart膜、30K，6，000xG）を用いて限外ろ過し、得られた通過液を逆相HPLC分離精製した。0.1％トリフルオロ酢酸水溶液を溶離液として使用し、装置にはELS-PDAトリガー分取システム（日本分光株式会社製）、カラムにはInertsil　ODS-3（GLサイエンス社製）を使用した。溶出中にUV検出（210nm）された目的物のピークを分取し、凍結乾燥し、目的物（117mg）を得た。
工程3：［N3-PEG（3）］-MSG1
　5mlサンプリングチューブ（（株）イナ・オプティカ）に、11-アジド-3，6，9-トリオキサウンデカン-1-アミン（0.108mL，0.541mmol）と上記工程2で得られたMSG1（117mg，0.068mmol）の水溶液（1.2mL）を加え、1時間撹拌した後に、凍結乾燥した。凍結乾燥後の5mlサンプリングチューブに、O-（7-アザベンゾトリアゾール-1-イル）-N，N，N’,N’-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（103mg，0.27mmol）のN，N-ジメチルホルムアミド溶液（1.2mL）とジイソプロピルエチルアミン（0.046mL，0.27mmol）を加え、37℃で3時間撹拌した。反応終了後、あらかじめジエチルエーテル（20ml）を加えた遠沈管（50ml）に反応液を移した。小型遠心機（日立工機、CF16RX）を利用して、固形物を沈殿させ、上澄みを取り除いた。さらにジエチルエーテル（10ml）を加えて、遠心分離操作後、デカンテーションを行った。続いて、アセトニトリル（10mL）を加え、遠心分離後、デカンテーションする操作を二回繰り返した後、減圧下乾燥し、粗生成物を得た。得られた固形物を上記工程2と同様の条件にて逆相HPLC精製を行い、目的物（94.2mg）を得た。
工程4：［N3-PEG（3）］-MSG1-Ox
　5mLサンプリングチューブ（（株）イナ・オプティカ製）に、上記工程3で合成した化合物（100mg）、2-クロロ-1，3-ジメチル-1H-ベンズイミダゾール-3-イウム-クロライド（伏見製薬所製、56mg，0.257mmol）の水溶液（520μl）を加えた。氷冷後の反応液にりん酸三カリウム（165mg，0.78mmol）の水溶液（520μl）を加え、氷冷下で3時間撹拌した。得られた反応液を、アミコンウルトラ（ウルトラセル30K、Merck　Millipore製）を用いて限外ろ過し、固形物を除去した。その通過液を、ゲルろ過クロマトグラフィーにて精製した。装置にはPurif-Rp2（昭光サイエンティフィック製）を使用し、カラムにはHiPrep　26/10　Desalting（GEヘルスケア製）を使用し、移動相に0.03％-NH3水溶液を使用し、流速を10mL/min、分画容量を10mLとした。溶出中にUV検出（220nm）された目的物を含むフラクションを一つにまとめ、1N水酸化ナトリウム水溶液（104μl，0.104mmol）を加えて凍結乾燥し、目的物（84mg）を得た。
実施例4：［N3-PEG（3）］-MSG-Ox
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000099
工程1：（MSG-）Asnの調製
　市販品である1S2G/1G2S-10NC-Asn-Fmoc（（株）糖鎖工学研究所製）（「Fmoc-（MSG-）Asn」と呼ぶ）（1000mg）をエタノール/水（1/1）（10mL）に溶解させ、1規定の水酸化ナトリウム水溶液（1．75mL，4当量）を加え、室温で3時間撹拌した。反応終了後、反応液をアミコンウルトラ（30K、ミリポア社製）を用いて限外ろ過し、固形物を除去し、得られた通過液に1N塩酸（832μl，1．9当量）加えた。高速濃縮装置V-10（Biotage社製）を用いて、溶媒を除去した。アセトニトリルを加えて、高速濃縮装置V-10（Biotage社製）を用いて、溶媒を除去した後に、逆相HPLC分離精製　した。0.1％トリフルオロ酢酸水溶液と0．1％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液を溶離液とし、装置にはPurif-Rp2（昭光サイエンティフィック製）を使用し、カラムにはInertsil ODS-3（GLサイエンス製）を使用した。溶出中にUV検出（220nm）された目的物を含むフラクションを一つにまとめ、凍結乾燥した。再び、純水に溶解させると、pH試験紙で酸性であることが確認されたので、18％アンモニア水（150μl）を加え、pH試験紙で塩基性になったことを確認し、再び凍結乾燥した。得られた目的物（840mg）をそのまま次の反応に用いた。
工程2：MSGの合成
　工程1にて得られた化合物（840mg）を200mMりん酸緩衝溶液（pH6．25）（6000μL）に溶解させ、EndoM（東京化成工業（株）製、1U/mL））水溶液（200μL）を加え、28℃で26時間インキュベートした。反応が完了していないため、EndoM（東京化成工業（株）製、1U/mL））水溶液（50μL）を加え、28℃で2時間インキュベートした後に、反応が完了するまで室温で放置した。反応終了後、反応液をアミコンウルトラ（30K、ミリポア社製）を用いて限外ろ過した。得られた通過液にトリフルオロ酢酸（80μl）加え、逆相HPLC分離精製した。0．1％トリフルオロ酢酸水溶液と0．1％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液を溶離液とし、装置にはPurif-Rp2（昭光サイエンティフィック製）を使用し、カラムにはInertsil　ODS-3（GLサイエンス製）を使用した。溶出中にUV検出（220nm）された目的物を含むフラクションを一つにまとめ、凍結乾燥した。残留トリフルオロ酢酸を除く目的で、再度純水に溶解させ、目的化合物（618mg）を無色固体として得た。
ESI-MS: Calcd for C66H110N4O49 : [M+H]+ 1743.62, Found 1743.63
工程3：［N3-PEG（3）］-MSGの合成
　上記工程2にて得られた化合物（120mg）を用いて、実施例3工程3と同様の手法に従って、目的物（88．6mg）を得た。
ESI-MS: Calcd for C73H124N8O51 :[M+2H]2+ 965.37, Found 965.37
工程4［N3-PEG（3）］-MSG-Oxの合成
　上記工程3にて得られた合成した化合物（100mg）を用いて、実施例3工程4と同様の手法に従って、目的物（88mg）を得た。
実施例5：［N3-PEG（3）］2-SG（10）-Ox
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000100
工程1：［N3-PEG（3）］2-SG（10）
　5mlサンプリングチューブ（（株）イナ・オプティカ）に、11-アジド-3，6，9-トリオキサウンデカン-1-アミン（0.096mL，0．485mmol）、ジシアロオクタサッカリド（50mg， 0．24mmol）の水溶液（0．5mL）を加え、1時間撹拌した後に、凍結乾燥した。凍結乾燥後の5mlサンプリングチューブに、O-（7-アザベンゾトリアゾール-1-イル）-N，N，N’，N’-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（92mg，0．24mmol）のN，N-ジメチルホルムアミド溶液（0．6mL）とジイソプロピルエチルアミン（0.042mL，0．24mmol）を加え、37℃で4時間撹拌した。反応終了後、あらかじめジエチルエーテル（20ml）を加えた遠沈管（50ml）に反応液を移した。小型遠心機（日立工機、CF16RX）を利用して、固形物を沈殿させ、上澄みを取り除いた。ジエチルエーテル（20ml）を加えて、デカンテーションした。続いて、アセトニトリル（20mL）を加えて、デカンテーションした後に、減圧下乾燥し、粗生成物を得た。得られた固形物を適量の0．2％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解させ、逆相HPLC分離精製した。0．1％トリフルオロ酢酸水溶液と0．1％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液を溶離液とし、装置にはPurif-Rp2（昭光サイエンティフィック製）を使用し、カラムにはInertsil　ODS-3（GLサイエンス製）を使用した。溶出中にUV検出（220nm）された目的物を含むフラクションを一つにまとめ、凍結乾燥して、目的物（42mg）を得た。
工程2：［N3-PEG（3）］2-SG（10）-Ox
　5mLサンプリングチューブ（（株）イナ・オプティカ製）に、上記工程1で合成した化合物（40mg）、2-クロロ-1，3-ジメチル-1H-ベンズイミダゾール-3-イウム-クロライド（伏見製薬所製、17．9mg，0．083mmol）の水溶液（200μl）を加えた。氷冷後の反応液にりん酸三カリウム（52．6mg，0．25mmol）の水溶液（200μl）を加え、氷冷下で2時間撹拌した。得られた反応液を、アミコンウルトラ（ウルトラセル30K、　Merck　Millipore製）を用いて限外ろ過し、固形物を除去した。その通過液を、ゲルろ過クロマトグラフィーにて精製した。装置にはPurif-Rp2（昭光サイエンティフィック製）を使用し、カラムにはHiPrep　26/10　Desalting（GEヘルスケア製）を使用し、移動相に0．03％　NH3水溶液を使用し、流速を10mL/min、分画容量を10mLとした。溶出中にUV検出（220nm）された目的物を含むフラクションを一つにまとめ、1N水酸化ナトリウム水溶液（33μl，0．033mmol）を加えて凍結乾燥し、目的物（34mg）を得た。
実施例6：マウス抗CLDN6抗体B1産生ハイブリドーマ（218B1）及びマウス抗CLDN6抗体C7産生ハイブリドーマ（218C7）
6－1．マウスの免疫とハイブリドーマの取得
1－1）マウス免疫に用いる細胞の準備
　2×106個もしくは5×106個のNOR－P1細胞（ヒト膵がん細胞株、RIKEN　RCB－2139）をRPMI－1640（Roswell　Park　Memorial　Institute－1640）10％FBS（ウシ胎児血清）（＋）培地（10mlもしくは20ml）で5日間培養後に回収し、PBS（リン酸緩衝生理食塩水）で2回洗浄し、PBS（300μl）中に再懸濁した。
1－2）マウスへの免疫
　BALB／cマウス（12週齢）に対し、1～5回目の免疫は約1週間間隔でNOR－P1細胞（2×106個）を腹腔内へ免疫した。5回目の免疫より約2週間後にNOR－P1細胞（5×106個）を腹腔内へ免疫した。6回目の免疫より約3週間後にNOR－P1細胞（2×106個）を腹腔内へ免疫した。8～10回目は約2週間間隔で2×106個のNOR－P1細胞を腹腔内へ免疫した。10回目の約3週間後（11回目）及びその3日後（12回目、最終免疫）では、5×106個のNOR－P1細胞を腹腔内へ免疫した。脾臓細胞は最終免疫から3日後に摘出した。
1－3）免疫したマウスの脾臓細胞の準備
　免疫済みマウスの脾臓を摘出し、すりつぶしてRPMI1640　10％FBS（＋）培地に懸濁した。細胞懸濁液をセルストレイナー（70μm、BD　Falcon社）に通した後、1500rpmで5分間、室温にて遠心して上清を廃棄した。Tris－NH4Cl溶液（20mM　Tris－HCl　pH7．2、77．6mM　NH4Cl；20mL）を加え、室温で5分間処理した。PBS（20mL）を加え、1500rpmで5分間、室温にて遠心した。上清を廃棄した後に、RPMI1640　FBS（＋）培地（10ml）を加えた。
1－4）ミエローマ細胞の準備
　P3U1細胞（マウスミエローマ細胞株）をRPMI1640　FBS（＋）培地で5日間培養した後に回収し、RPMI1640　FBS（＋）培地（20ml）に再懸濁した。
1－5）細胞融合
　脾臓細胞とミエローマ細胞を5：1になるように混合し、1500rpmで5分間、室温にて遠心した。RPMI1640　FBS（－）培地（10ml）で2回洗浄した後に、遠心分離（1500rpm、5分間）した。得られた沈殿画分の細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら、ポリエチレングリコール－1500（PEG－1500；1ml）を約1分かけて徐々に加えた。3分30秒間攪拌した後に、30秒間室温で静置した。その後、該細胞液に1分かけてRPMI培地　10％Low　IgG　FBS（＋）（10ml）を加えた。該細胞懸濁液を遠心分離（1500rpm、5分間）し、得られた沈殿画分の細胞をゆるやかにほぐした後、HAT培地（10％Low　IgG　FBS、HAT　Media　Supplement、5％BriCloneを含むRPMI1640培地；200ml）中にゆるやかに懸濁した。該懸濁液を96ウェル培養用プレートに200μl／ウェルずつ分注し、37℃、5％　CO2のインキュベーター中で、6日間培養した。
1－6）ハイブリドーマのスクリーニング・プローブの準備
　抗体の内在化及びイムノトキシン活性の測定を目的にリコンビナント複合蛋白質であるDT3Cを作製した。このDT3Cは、ジフテリア毒素（DT）の触媒領域と連鎖球菌プロテインGの抗体結合領域を遺伝子工学的に融合させた蛋白質である。DT3Cは抗体のFc部分に特異的に結合し、細胞内へ取り込まれると蛋白質合成阻害により細胞死を誘導する。この系を用いることで抗体の内在化とイムノトキシンによる殺細胞効果を同時に観察することができる（Yamaguchi，　M．　et　al．，　Biochemical　and　Biophysical　Research　Communications　454（2014）600－603）。
1－7）DT3Cによるハイブリドーマのスクリーニング
　96ウェルプレートに4μg／mlのDT3C（25μl）を加え、さらに工程1－5で取得されたハイブリドーマの培養上清（25μl）を加え、室温で30分インキュベーションした。2×105個／ml（RPMI培地　10％Low　IgG　FBS（＋））のNOR－P1細胞（50μl）を播種し、37℃ CO2インキュベーターで3日間培養した。培養後の顕微鏡観察により、陰性対照抗体を用いた際の付着細胞数の約25％以下の付着細胞数を示したウェルを陽性と判定した。選抜したクローンは1～2回サブクローニングを行い、モノクローナルなハイブリドーマ細胞株8株を樹立した。
6－2：ハイブリドーマの産生する抗体の結合する抗原の同定
　実施例6－1において調製されたハイブリドーマの産生する抗体のうち2つのクローン218B1及び218C7について抗原の同定を行った。
2－1）ビオチンラベルした細胞表面蛋白質の218B1抗体及び218C7抗体を用いた免疫沈降
　2×106個のNTERA－2細胞（ヒト精巣がん細胞株、ATCC　CRL－1973）の培養上清を除去し、PBSで2回洗浄した。EZ－Link　Sulfo－NHS－Biotin（Thermo　Fisher　SCIENTIFIC社）を0．1mg／mlの濃度でPBSに懸濁した。PBSを除去した後に、Biotin／PBS溶液を加え、30分間振盪器上でインキュベーションした後に100mMグリシン／PBS溶液（25ml）で2回洗浄し、その後、PBS（10ml）で1回洗浄した。洗浄後の細胞を200μlの溶解バッファー（150mM　NaCl、50mM　Tris－HCl　pH7．4、1％DDM、Protease　inhibitor、Complete　EDTA　free（Roche社）1粒／50ml）中に再懸濁し、4℃で30分間処理した。遠心分離（13000rpm、20分間、4℃）して細胞溶解液を調製した。Protein　G　Sepharose（Protein　G　Sepharose　4　Fast　Flow（GE　Healthcare社））のバッファーを溶解バッファーに置換して得られたProtein　G　Sepharose／溶解バッファー（50％スラリー；30μl）を細胞溶解液に加え、4℃で30分間ローテートした後に4℃で1分間遠心し、上清を回収した。この上清に218B1抗体あるいは218C7抗体（約3μg）を加え、4℃で30分間ローテートした後にProtein　G　Sepharose／溶解バッファー（50％スラリー；60μl）を加え、4℃で1時間ローテートした。溶解バッファー（1ml）でProtein　G　Sepharoseを6回洗浄した後に1×SDSサンプルバッファー（BioRad社）に再懸濁した。100℃で5分間懸濁液を処理した後、溶液を回収し、SDS－PAGE（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）のためのサンプルとした。
2－2）SDS－PAGE及びウエスタンブロッティング
　2－1）で調製したSDS－PAGEサンプルをSuperSep Ace　5ー20％（Wako社）を用いて、50mVで30分間スタッキングした後に、200mVで1時間泳動した後、ゲルよりメンブレンへ12mVで47分間ブロッティングした。メンブレンをPBS－T（PBS（－）－0．02％　Tween　20）で洗浄した後、1時間ブロッキングを行った。メンブレンをPBS－Tで5分間3回洗浄した後にStreptavidin－horseradish　peroxidase　conjugate（GE　Healthcare社；PBS－Tで2000倍に希釈して使用）と1時間反応させた。メンブレンをPBS－Tで5分間2回洗浄した後に、目的のバンドをenhanced　chemiluminecscence（ECL）法を用いて検出した。218B1抗体及び218C7抗体を用いたいずれの場合においても、DTTの添加の有無によらず分子量18kDaのバンドが検出された。
2－3）細胞蛋白質の218B1抗体及び218C7抗体を用いた免疫沈降産物の質量分析
　2×107個のNTERA－2細胞を回収し、PBSで2回洗浄した。セルスクレーパーを用いて細胞を回収し、1500rpm、5分間遠心した。上清を除去した後に2mlの溶解バッファー中に再懸濁し、4℃で30分間処理した。遠心分離（13000rpm、20分間、4℃）して細胞溶解液を調製した。Protein　G　Sepharose／溶解バッファー（50％スラリー；180μl）を細胞溶解液に加え、4℃で30分間ローテートした後に4℃で1分間遠心し、上清を回収した。この上清に218B1抗体（約9μg）を加え、4℃で30分間ローテートした後にProtein　G　Sepharose／溶解バッファー（50％スラリー；180μl）を加え、4℃で1時間ローテートした。溶解バッファー（1ml）でProtein　G　Sepharoseを6回洗浄した後に1×SDSサンプルバッファーに再懸濁した。100℃で5分間懸濁液を処理した後、溶液を回収し、SDS－PAGEのためのサンプルとした。2－2）と同様の方法でSDS－PAGEを行い、泳動ゲルをCBB染色した。泳動ゲルより18kDaに相当する部分を切り出し、質量分析に供した。質量分析の結果、該ゲル片はClaudin－6を含むことが判明した。
2－4）FACS解析
　質量分析から218B1抗体及び218C7抗体の抗原がClaudin－6であることが予測できたため、cDNAの遺伝子導入による強制発現解析を行った。FACS解析の結果、ヒトClaudin－6発現CHO－K1細胞では218B1抗体及び218C7抗体は強陽性反応を示したため、218B1抗体及び218C7抗体の抗原はClaudin－6であることが示された。
2－5）ハイブリドーマ培養上清からの抗体の精製
　マウス抗CLDN6抗体B1産生ハイブリドーマ（218B1）及びマウス抗CLDN6抗体C7産生ハイブリドーマ（218C7）を、10％のFetal　Bovine　Serum，　Ultra－Low　IgG（Thermo　Fisher　Scientific）を含むHybridoma－SFM（Thermo　Fisher　Scientific）で培養した。培養上清を遠心により回収し0．45μmのフィルター（Corning社製）でろ過した。rProtein　Aアフィニティークロマトグラフィー（4～6℃下）1段階工程で、培養上清から抗体を精製した。rProtein　Aアフィニティークロマトグラフィー精製後のバッファー置換工程は4～6℃下で実施した。最初に培養上清をPBSで平衡化したMabSelectSuRe（GE　Healthcare　Bioscience社製）が充填されたカラムにアプライした。培養液がカラムに全て入ったのち、カラム容量2倍以上のPBSでカラムを洗浄した。次に2M　アルギニン塩酸塩溶液（pH4．0）で溶出し、抗体の含まれる画分を集めた。その画分を透析（Thermo　Scientific社、Slide－A－Lyzer　Dialysis　Cassette）によりPBS（－）への液置換を行った。最後にCentrifugal　UF　Filter　Device　VIVASPIN20（分画分子量UF10K，Sartorius社，4℃下）にて濃縮し、IgG濃度を1mg／mL以上に調製した。Minisart－Plus　filter（Sartorius社）でろ過し、精製サンプルとした。
実施例7：マウス抗CLDN6抗体B1及びC7のin　vitro評価
7－1：フローサイトメトリーによるマウス抗CLDN6抗体の結合能評価
　実施例6で作製したマウス抗CLDN6抗体のヒトCLDN6及びファミリー分子CLDN3、CLDN4、CLDN9結合性をフローサイトメトリー法により評価した。Origene社より購入したhuman　CLDN3／pCMV6－Entry，　human　CLDN4／pCMV6－Entry，　human　CLDN6／pCMV－Entry，　human　CLDN9／pCMV6－Entry，　またはpCMV6－Entryを、293T細胞　(Thermo Fisher Scientific HCL4517)にLipofectamine 2000　(Thermo Fisher Scientific)を用いて一過性に導入し、37℃、5％CO2の条件下で一晩培養した後、細胞懸濁液を調製した。遺伝子導入した293T細胞懸濁液を遠心し、上清を除去した後、マウス抗CLDN6抗体（クローン番号はB1、C7）、又はマウスIgG1コントロール抗体（R&D Systems）を終濃度30μg／mL，　10μg／mL，　3．3μg／mL，　1．1μg／mLで加えて懸濁し、4℃で1時間静置した。5％のウシ胎児血清（Hyclone）を含むDulbecco’s phosphate buffered saline (Sigma-Aldrich)（以下、5％FBS含有PBS）で2回洗浄した後、5％FBS含有PBSで500倍希釈したFLUORESCEIN－CONJUGATED　GOAT　IGG　FRACTION　TO　MOUSE　IGG　(WHOLE　MOLECULE)（MP　BIOMEDICALS）を加えて懸濁し、4℃で1時間静置した。5％FBS含有PBSで2回洗浄した後、フローサイトメーター（FC500；Beckman　Coulter）で検出を行った。データ解析はFlowJo（TreeStar）で行った。なお、各遺伝子導入の確認は、細胞を0．25％Tween20含有PBSで透過処理した後にマウス抗FLAG抗体（Sigma－Aldrich）を用いて行った。結果を図40に示す。図40のグラフにおいて、縦軸は抗体結合量を表すFITCの蛍光強度、横軸は抗体濃度を示す。作製したマウス抗CLDN6抗体はヒトCLDN6とヒトCLDN9に同程度に結合し、ヒトCLDN3、ヒトCLDN4には結合しなかった。マウスコントロールIgG1はいずれの細胞にも結合しなかった。
7－2：抗体内在化活性
　マウス抗CLDN6抗体B1およびC7の内在化活性は、蛋白質合成を阻害する毒素（サポリン）を結合させた抗マウスIgG試薬Mab－ZAP(ADVANCED TARGETING SYSTEMS)を用いて評価した。この評価では、マウス抗CLDN6抗体の内在化活性に依存してMab－ZAPが細胞内に取り込まれ、蛋白質合成を阻害するサポリンが細胞内に放出されることで、細胞増殖が抑制される。
　ヒトCLDN6陽性細胞のヒト絨毛がん株であるJEG-3(ATCC HTB-36)、ヒトCLDN6陽性細胞のヒト卵巣がん株であるNIH：OVCAR-3 (ATCC HTB-161)、又はヒトCLDN6陰性細胞のヒト膵臓がん株であるBxPC－3(ATCC CRL-1687)を2x103 cells/wellで96穴細胞培養用マイクロプレートに播種して37℃、5％　CO2の条件下で一晩培養した。翌日、マウス抗CLDN6抗体、又はマウスIgG1抗体（R＆D　Systems）を終濃度1nMとなるように、Mab-ZAP（終濃度：0．5nM）、又は毒素を結合していないAffiniPure Goat Anti-Mouse IgG,　Fcγ Fragment Specific (Jackson ImmunoResearch) （終濃度：0．5　nM）と混合した混合溶液を添加して、37℃、5％　CO2の条件下で5日間培養した。生存細胞数は、CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega)を用いたATP活性の定量で測定した。抗CLDN6抗体添加による細胞増殖抑制作用は、混合溶液非添加ウェルの値を100％とする相対生存率で求めた。図41に結果を示す。マウス抗CLDN6抗体（B1、C7）はヒトCLDN6陽性細胞株JEG－3とNIH：OVCAR－3に対して細胞増殖抑制効果を認めた。一方、ヒトCLDN6陰性細胞株BxPC－3に対しては細胞増殖抑制効果を認めなかった。また、マウスIgG1抗体はいずれの細胞株に対しても細胞増殖抑制効果を認めなかった。この結果、作製した抗CLDN6抗体（B1、C7）は内在化活性を有し、抗体―薬物コンジュゲート用の抗体として適すると考えられる。
実施例8：マウス抗CLDN6抗体B1及びC7の可変領域をコードするcDNAのヌクレオチド配列の決定
8－1：B1抗体の可変領域をコードするcDNAのヌクレオチド配列の決定
　8－1－1：B1抗体産生ハイブリドーマのtotal RNAの調製
B1抗体の可変領域をコードするcDNAを増幅するため、B1抗体産生ハイブリドーマよりTRIzol Reagent（Ambion社）を用いてtotal RNAを調製した。
　8－1－2：5’-RACE PCRによるB1抗体の軽鎖可変領域をコードするcDNAの増幅と配列の決定
　軽鎖可変領域をコードするcDNAの増幅は、実施例8－1－1で調製したtotal　RNAの約1μgとSMARTer　RACE　5’／3’　Kit（Clontech社）を用いて実施した。B1抗体の軽鎖遺伝子の可変領域をコードするcDNAをPCRで増幅するためのプライマーとして、UPM　(Universal　Primer　A　Mix:SMARTer　RACE　5’/3’　Kitに付属）、及び公知のマウス軽鎖の定常領域の配列から設計したプライマーを用いた。
　5’－RACE　PCRで増幅した軽鎖の可変領域をコードするcDNAをプラスミドにクローニングし、次に軽鎖の可変領域をコードするcDNAのヌクレオチド配列のシークエンス解析を実施した。
決定されたB1抗体の軽鎖の可変領域をコードするcDNAのヌクレオチド配列を配列番号18に示し、アミノ酸配列を配列番号19に示す。
　8－1－3：5’－RACE　PCRによるB1抗体の重鎖可変領域をコードするcDNAの増幅と配列の決定
　重鎖可変領域をコードするcDNAの増幅は、実施例8－1－1で調製したtotal　RNAの約1μgとSMARTer　RACE　5’／3’　Kit（Clontech社）を用いて実施した。LB1抗体の重鎖遺伝子の可変領域をコードするcDNAをPCRで増幅するためのプライマーとして、UPM（Universal　Primer　A　Mix：SMARTer　RACE　5’／3’　Kitに付属）、及び公知のマウス重鎖の定常領域の配列から設計したプライマーを用いた。
　5’－RACE　PCRで増幅した重鎖の可変領域をコードするcDNAをプラスミドにクローニングし、次に重鎖の可変領域をコードするcDNAのヌクレオチド配列のシークエンス解析を実施した。
決定されたB1抗体の重鎖の可変領域をコードするcDNAのヌクレオチド配列を配列番号20に示し、アミノ酸配列を配列番号21に示す。
8－2：C7抗体の可変領域をコードするcDNAのヌクレオチド配列の決定
　実施例8－1と同様の方法で実施した。決定されたC7抗体の軽鎖の可変領域をコードするcDNAのヌクレオチド配列を配列番号22に示し、アミノ酸配列を配列番号23に示す。重鎖の可変領域をコードするcDNAのヌクレオチド配列を配列番号24に示し、アミノ酸配列を配列番号25に示す。
実施例9：キメラ化抗CLDN6抗体chB1の作製
9－1：キメラ化抗CLDN6抗体chB1の発現ベクターの構築
　9－1－1：キメラ化及びヒト化軽鎖発現ベクターpCMA－LKの構築
　プラスミドpcDNA3．3－TOPO／LacZ（Invitrogen社）を制限酵素XbaI及びPmeIで消化して得られる約5．4kbのフラグメントと、配列番号26に示すヒト軽鎖シグナル配列及びヒトκ鎖定常領域をコードするDNA配列を含むDNA断片をIn－Fusion　HD　PCRクローニングキット（Clontech社）を用いて結合して、pcDNA3．3／LKを作製した。pcDNA3．3／LKからネオマイシン発現ユニットを除去することによりpCMA－LKを構築した。
　9－1－2：キメラ化及びヒト化IgG1LALAタイプ重鎖発現ベクターpCMA－G1LALAの構築
　pCMA－LKをXbaI及びPmeIで消化して軽鎖シグナル配列及びヒトκ鎖定常領域を取り除いたDNA断片と、配列番号27で示されるヒト重鎖シグナル配列及びヒトIgG1LALA定常領域をコードするDNA配列を含むDNA断片をIn－Fusion　HD　PCRクローニングキット（Clontech社）を用いて結合して、pCMA－G1LALAを構築した。
　9－1－3：キメラ化chB1重鎖発現ベクターの構築
　配列番号33に示すchB1重鎖のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号36乃至440に示されるDNA断片を合成した（GENEART社）。In－Fusion　HD　PCRクローニングキット（Clontech社）を用いて、pCMA－G1LALAを制限酵素BlpIで切断した箇所に合成したDNA断片を挿入することによりchB1重鎖発現ベクターを構築した。chB1重鎖のアミノ酸配列を配列番号32に示す。
　9－1－4：キメラ化chB1軽鎖発現ベクターの構築
　配列番号29に示すchB1軽鎖をコードするDNA配列を含むDNA断片を合成した（GENEART社）。In－Fusion　HD　PCRクローニングキット（Clontech社）を用いて、合成したDNA断片とpCMA－LKをXbaI及びPmeIで消化して軽鎖シグナル配列及びヒトκ鎖定常領域を取り除いたDNA断片を結合することにより、chB1軽鎖発現ベクターを構築した。chB1軽鎖のアミノ酸配列を配列番号28に示す。
9－2：キメラ化抗CLDN6抗体chB1の生産及び精製
　9－2－1：キメラ化抗体chB1の生産
　FreeStyle　293F細胞（Invitrogen社）はマニュアルに従い、継代、培養をおこなった。対数増殖期の1．2×109個のFreeStyle　293F細胞（Invitrogen社）を3L　Fernbach　Erlenmeyer　Flask(CORNING社)に播種し、FreeStyle293　expression　medium（Invitrogen社）で希釈して2．0×106細胞／mLに調製した。40mLのOpti-Pro　SFM培地（Invitrogen社）に0．24mgの重鎖発現ベクターと0．36mgの軽鎖発現ベクターと1．8mgのPolyethyleneimine（Polyscience　＃24765）を加えて穏やかに攪拌し、さらに5分間放置した後にFreeStyle　293F細胞に添加した。37℃、8％CO2インキュベーターで4時間、90rpmで振とう培養後に600mLのEX－CELL　VPRO培地（SAFC　Biosciences社）、18mLのGlutaMAX　I（GIBCO社）、及び30mLのYeastolate　Ultrafiltrate（GIBCO社）を添加し、37℃、8％CO2インキュベーターで7日間、90rpmで振とう培養して得られた培養上清をDisposable　Capsule　Filter（Advantec　＃CCS－045－E1H）でろ過した。取得したキメラ化抗CLDN6抗体を「chB1」と命名した。
　9－2－2：キメラ化抗体chB1の精製
　実施例9－2－1で得られた培養上清から抗体をrProtein　Aアフィニティークロマトグラフィーの1段階工程で精製した。培養上清をPBSで平衡化したMabSelectSuReが充填されたカラム（GE　Healthcare　Bioscience社製）にアプライしたのちに、カラム容量の2倍以上のPBSでカラムを洗浄した。次に2Mアルギニン塩酸塩溶液（pH4．0）で溶出し、抗体の含まれる画分を集めた。その画分を透析（Thermo　Scientific社、Slide-A-Lyzer　Dialysis　Cassette）によりPBS(-)へのバッファー置換を行った。Centrifugal　UF　Filter　Device　VIVASPIN20（分画分子量UF10K,Sartorius社)で抗体を濃縮し、IgG濃度を1mg/mL以上に調製した。最後にMinisart-Plus　filter（Sartorius社）でろ過し、精製サンプルとした。
実施例10：ヒト化抗CLDN6抗体の作製
10－1：抗CLDN6抗体のヒト化体デザイン
　10－1－1：キメラ化抗体chB1の可変領域の分子モデリング
　chB1の可変領域の分子モデリングは、ホモロジーモデリングとして公知の方法(Methods　in　Enzymology,203,121-153,(1991))を利用した。chB1の重鎖と軽鎖の可変領域に対して高い配列同一性を有するProtein　Data　Bank(Nuc.Acid　Res.35,D301-D303(2007))に登録されている構造(PDB　ID:1XIW)を鋳型に、市販の蛋白質立体構造解析プログラムBioLuminate（Schrodinger社製）を用いて行った。
　10－1－2：ヒト化アミノ酸配列の設計
　chB1は、CDRグラフティング(Proc.Natl.Acad.Sci.USA　86,10029-10033(1989))によりヒト化した。Kabat　et　al.(Sequences　of　Proteins　of　Immunological　Interest,5th　Ed.Public　Health　Service　National　Institutes　of　Health,Bethesda,MD.(1991))において既定されるヒトのgamma鎖サブグループ1およびkappa鎖サブグループ1のコンセンサス配列が、chB1のフレームワーク領域に対して高い同一性を有することから、それぞれ、重鎖と軽鎖のアクセプターとして選択された。アクセプター上に移入すべきドナー残基は、Queen　et　al.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA　86,10029-10033(1989))によって与えられる基準などを参考に三次元モデルを分析することで選択された。なお、CDRL3が疎水的なアミノ酸に富んでいたため、CDRL3に変異を導入したヒト化軽鎖も設計した。
10－2：chB1重鎖のヒト化
　設計された3種の重鎖をhH1、hH2及びhH3と命名した。hH1の重鎖全長アミノ酸配列を、配列番号52に記載する。配列番号52のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を、配列番号53に記載する。hH2の重鎖全長アミノ酸配列を、配列番号56に記載する。配列番号56のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を、配列番号57に記載する。hH3の重鎖全長アミノ酸配列を、配列番号60に記載する。配列番号60のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を、配列番号61に記載する。
10－3：chB1軽鎖のヒト化
　設計された4種の軽鎖をhL1、hL2、hL3及びhL4と命名した。hL1の軽鎖全長アミノ酸配列を、配列番号36に記載する。配列番号36のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を、配列番号37に記載する。hL2の軽鎖全長アミノ酸配列を、配列番号40に記載する。配列番号40のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を、配列番号41に記載する。hL3の軽鎖全長アミノ酸配列を、配列番号44に記載する。配列番号44のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号45に記載する。hL4の軽鎖全長アミノ酸配列を、配列番号48に記載する。配列番号48のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を、配列番号49に記載する。
10－4：重鎖及び軽鎖の組み合わせによるヒト化抗体の設計
　hH1及びhL1からなる抗体を「H1L1抗体」又は「H1L1」と称する。hH2及びhL2からなる抗体を「H2L2抗体」又は「H2L2」と称する。hH1及びhL3からなる抗体を「H1L3抗体」又は「H1L3」と称する。hH2及びhL4からなる抗体を「H2L4抗体」又は「H2L4」と称する。hH3及びhL3からなる抗体を「H3L3抗体」又は「H3L3」と称する。
10－5：ヒト化抗CLDN6抗体の作製
　10－5－1：ヒト化重鎖発現ベクターの構築
　　10－5－1－1：hH1発現ベクターの構築
　配列番号53に示すhH1のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号36乃至440に示されるDNA断片を合成した（GENEART社）。実施例9－1－3と同様の方法でhH1発現ベクターを構築した。
　　10－5－1－2：hH2発現ベクターの構築
　配列番号57に示すhH2のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号36乃至440に示されるDNA断片を合成した（GENEART社）。実施例9－1－3と同様の方法でhH2発現ベクターを構築した。
　　10－5－1－3：hH3発現ベクターの構築
　配列番号61に示すhH2のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号36乃至440に示されるDNA断片を合成した（GENEART社）。実施例9－1－3と同様の方法でhH3発現ベクターを構築した。
　10－5－2：ヒト化軽鎖発現ベクターの構築
　　10－5－2－1：hL1発現ベクターの構築
　配列番号37に示すhL1のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号37乃至402に示されるDNA断片を合成した（GENEART社）。In－Fusion　HD　PCRクローニングキット（Clontech社）を用いて、pCMA－LKを制限酵素BsiWIで切断した箇所に合成したDNA断片を挿入することによりhL1発現ベクターを構築した。
　　10－5－2－2：hL2発現ベクターの構築
　配列番号41に示すhL2のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号37乃至402に示されるDNA断片を合成した（GENEART社）。実施例10－5－2－1と同様の方法でhL2発現ベクターを構築した。
　　10－5－2－3：hL3発現ベクターの構築
　配列番号45に示すhL3のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号37乃至402に示されるDNA断片を合成した（GENEART社）。実施例10－5－2－1と同様の方法でhL3発現ベクターを構築した。
　　10－5－2－4：hL4発現ベクターの構築
　配列番号49に示すhL4のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号37乃至402に示されるDNA断片を合成した（GENEART社）。実施例10－5－2－1と同様の方法でhL4発現ベクターを構築した。
　10－5－3：ヒト化抗体の調製
　　10－5－3－1：ヒト化抗体H1L1、H2L2、H1L3、H2L4、及びH3L3の生産
　実施例9－2－1と同様の方法で生産した。実施例10－4に示した重鎖と軽鎖の組み合わせに対応する重鎖発現ベクターと軽鎖発現ベクターの組み合わせにより、H1L1、H2L2、H1L3、H2L4、及びH3L3を生産した。
　　10－5－3－2：ヒト化抗体H1L1、H2L2、H1L3、H2L4、及びH3L3の2step精製
　実施例10－5－3－1で得られた培養上清をrProtein　Aアフィニティークロマトグラフィーとセラミックハイドロキシアパタイトの2段階工程で精製した。培養上清をPBSで平衡化したMabSelectSuReが充填されたカラム（GE　Healthcare　Bioscience社製）にアプライした後に、カラム容量の2倍以上のPBSでカラムを洗浄した。次に2Mアルギニン塩酸塩溶液（pH4．0）で抗体を溶出した。抗体の含まれる画分を透析（Thermo　Scientific社、Slide－A－Lyzer　Dialysis　Cassette）によりPBSへのバッファー置換を行い、5mMリン酸ナトリウム／50mM　MES／pH7．0のバッファーで5倍希釈した後に、5mM　NaPi／50mM　MES／30mM　NaCl／pH7．0のバッファーで平衡化したセラミックハイドロキシアパタイトカラム（日本バイオラッド、Bio-Scale CHT Type-1 Hydroxyapatite Column）にアプライした。塩化ナトリウムによる直線的濃度勾配溶出を実施し、抗体の含まれる画分を集めた。その画分を透析（Thermo　Scientific社、Slide-A-Lyzer　Dialysis　Cassette）によりHBSor（25mM　ヒスチジン／5％　ソルビトール、pH6．0）へのバッファー置換を行った。Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20（分画分子量UF10K，Sartorius社）にて抗体を濃縮し、IgG濃度を50mg／mLに調製した。最後にMinisart-Plus filter(Sartorius社）でろ過し、精製サンプルとした。
実施例11：フローサイトメトリーによるヒト化抗CLDN6抗体の結合能評価
　実施例10で作製したヒト化抗CLDN6抗体のヒトCLDN6及びファミリー分子CLDN3、CLDN4、CLDN9結合性をフローサイトメトリー法により評価した。実施例7－1と同様の手法にて一過性に遺伝子導入した293T細胞を使用した。ヒトCLDN6又はヒトCLDN9遺伝子を導入した細胞には、ヒト化抗CLDN6抗体H1L1、H2L2、H1L3、H2L4、及びH3L3、又はヒトIgG1コントロール抗体（CALBIOCHEM）を終濃度100nM、20nM、4nM、0.8nMで加えて懸濁し、4℃で30分静置した。ヒトCLDN3、ヒトCLDN4遺伝子、又は空のベクターを導入した細胞には、ヒト化抗CLDN6抗体H1L1、H2L2、H1L3、H2L4、及びH3L3を終濃度100　nMで加えて懸濁し、4℃で30分静置した。5％のウシ胎児血清（Hyclone）を含むDulbecco’s　phosphate　buffered　saline（Sigma－Aldrich）（以下、5％FBS含有PBS）で洗浄した後、5％FBS含有PBSで150倍希釈したFITC　AffiniPureF（ab’）2　Fragment　Goat　Anti－Human　IgG（H＋L）（Jackson　ImmunoResearch）を加えて懸濁し、4℃で30分静置した。5％FBS含有PBSで洗浄した後、フローサイトメーター（FC500；Beckman　Coulter）で検出を行った。データ解析はFlowJo（TreeStar）で行い、抗体の結合量を示すFITCの平均蛍光強度（MFI）を算出した。結果を図42に示す。図42のグラフにおいて、横軸は抗体濃度、縦軸はMFIを示す。作製したヒト化抗CLDN6抗体はヒトCLDN6とヒトCLDN9に同程度に結合し、ヒトCLDN3、ヒトCLDN4には結合しなかった。ヒトコントロールIgG1はいずれの細胞にも結合しなかった。
実施例12：Trastuzumab変異体の作製
　12－1：Trastuzumab－LALAの重鎖発現ベクターの構築
　配列番号74に示すTrastuzumab－LALAの重鎖のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号36乃至434に示されるDNA断片を合成した（GENEART社）。実施例9－1－3と同様の方法で発現ベクターを構築した。Trastuzumab－LALAの重鎖のアミノ酸配列を配列番号75に示す。
12－2：Trastuzumab－LALAの軽鎖発現ベクターの構築
　配列番号72に示すTrastuzumab－LALAの軽鎖のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号37乃至402に示されるDNA断片を合成した（GENEART社）。実施例10－5－2－1と同様の方法で発現ベクターを構築した。Trastuzumab－LALAの軽鎖のアミノ酸配列を配列番号73に示す。
12－3：Trastuzumab変異体の生産
　実施例9－2－1と同様の方法で生産した。
12－4：Trastuzumab変異体の精製
　実施例12－3で得られた培養上清から実施例9－2－2と同様の方法でTrastuzumab－LALAを精製した。ただし、PBS（－）ではなく50mMリン酸緩衝溶液（pH6．0）へのバッファー置換を行った。
〔糖鎖リモデリング抗体の調製〕
実施例13：糖鎖変換1（T－SG）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000101
工程1：（Fucα1，6）GlcNAc－Trastuzumabの調製
　参考例3で調製したTrastuzumab溶液22mg／mLの（25mMヒスチジン溶液（pH6．0）、5％ソルビトール溶液）（45.5mL）を共通操作Cを用いて、50mMりん酸緩衝液（pH6.0）への緩衝液交換を二回に分けて行った。得られた28.1mg／mLのTrastuzumab溶液（50mMりん酸緩衝液（pH6.0）（18mL）と28.0mg／mLの同溶液（18mL）に、2．0mg／mL野生型EndoS溶液（PBS）をそれぞれ1.26mL、1.27mL加え、37℃で4時間インキュベートした。反応の進行具合をExperion電気泳動ステーション（BIO－RAD製）を用いて確認した。反応終了後、以下の方法に従い、アフィニティークロマトグラフィーによる精製とハイドロキシアパタイトカラムによる精製を行った。
（1）アフィニティークロマトグラフィーによる精製
精製装置：AKTA　pure150（GE　ヘルスケア製）
カラム：HiTrap　rProtein　A　FF（5mL）（GE　ヘルスケア製）
流速：5mL／min（チャージ時は1．25mL／min）
　上記で得た反応液を複数回に分けて精製した。カラムは2連結し、カラムへの結合時は、反応液をカラム上部へ添加し、結合バッファー（20mMりん酸緩衝液（pH6．0））を1.25mL／minで2CV流し、更に5mL／minで5CV流した。中間洗浄時は、洗浄溶液（20mMりん酸緩衝液（pH7.0）、0.5M　塩化ナトリウム溶液）を15CV流した。溶出時は、溶出バッファー（ImmunoPure　IgG　Eution　buffer、PIERCE製）を6CV流した。溶出液を1M　トリス緩衝液（pH9.0）で直ちに中和した。溶出中にUV検出（280nm）されたフラクションについて、微量分光光度計Xpose（Trinean製）、及びExperion電気泳動ステーション（BIO－RAD製）を用いて確認した。目的物を含むフラクションを共通操作Cを用いて、5mMりん酸緩衝液50mM2－モルホリノエタンスルホン酸（MES）溶液（pH6.8）への緩衝液交換を行った。
（2）ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーによる精製
精製装置：AKTA　avant25（GE　ヘルスケア製）
カラム：Bio-Scale　Mini　CHT　Type　Iカートリッジ（5mL）（BIO－RAD製）
流速：5mL／min（チャージ時は1．25mL／min）
　カラムを2連結し、上記（1）で得られた溶液を複数回に分けて精製した。溶液をカラムの上部へ添加し、A液（5mMりん酸緩衝液50mM－モルホリノエタンスルホン酸（MES）溶液（pH6．8））を1．25mL／minで2CV流し、更に5mL／minで3CV流した。その後、A液とB液（5mMりん酸緩衝液50mM－モルホリノエタンスルホン酸（MES）溶液（pH6．8）、2M塩化ナトリウム溶液）を用いて、溶出した。溶出条件は、A液：B液＝100：0～0：100（15CV）である。さらに、洗浄溶液（500mMりん酸緩衝液（pH6．5））を5CV流した。
　目的物を含むフラクションを共通操作Cを用いて緩衝液交換を行い、25．5mg／mLの（Fucα1，6）GlcNAc－Trastuzumab溶液（50mMりん酸緩衝液（pH6．0））（35mL）を得た。
工程2：Trastuzumab［SG－（N3）2］2の調製
　上記工程1にて得られた23.9mg／mL（Fucα1，6）GlcNAc－Trastuzumab溶液（50mMりん酸緩衝液（pH6.0））（3.37mL）に、実施例5工程2で合成した化合物（12．9mg）の50mMりん酸緩衝液（pH6.0）溶液（0.258mL）、4．90mg／mLのEndoS　D233Q／Q303L溶液（PBS）（0．328mL）を加えて、30℃で4.5時間インキュベートした。以上の操作を2ロット行った。反応の進行具合をExperion電気泳動ステーション（BIO－RAD製）を用いて確認した。反応終了後、上記工程1と同様にアフィニティークロマトグラフィーによる精製とハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーによる精製を行った後、目的物を含むフラクションを共通操作Cを用いてりん酸緩衝生理食塩水（pH6.0）へ緩衝液交換を行い、10.0mg／mLのTrastuzumab［SG－（N3）2］2溶液（りん酸緩衝生理食塩水（pH6．0））（15．5mL）を得た。
実施例14：糖鎖変換2（T－MSG）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000102
工程1：Trastuzumab［MSG－N3］2
　以下の操作を5ロット行った。実施例13工程1にて得られた化合物（20mg／mL，15．0mL）を用いて、実施例4工程4にて得られた化合物（25．5mg）を糖鎖供与体として使い、30℃で3時間インキュベートし、実施例13工程2と同様の操作を行った。5ロット合わせて、14．4mg／mL　Trastuzumab［MSG－N3］2溶液（りん酸緩衝生理食塩水（pH6．0））（93．5mL）を得た。
実施例15：糖鎖変換3（T－MSG1）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000103
工程1：Trastuzumab［MSG1－N3］2
　以下の操作を2ロット行った。実施例13工程1で得られた化合物（25．5mL，7．8mL）を用いて、実施例3工程4にて得られた化合物（25．5mg）を糖鎖供与体として使い、30℃で3時間インキュベートし、実施例13工程2と同様の操作を行った。2ロット合わせて、10．6mg／mL　Trastuzumab［MSG1－N3］2溶液（りん酸緩衝生理食塩水（pH6．0））（31mL）を得た。
実施例16：糖鎖変換4（CLDN6－MSG1（H1L1））
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000104
工程1：（Fucα1，6）GlcNAc－抗CLDN6抗体（H1L1）
　実施例10で調製した抗CLDN6抗体（H1L1）溶液ca．37．7mg／mL（25mMヒスチジン溶液（pH6．0）、5％ソルビトール溶液）（2．5mL）を用いて、実施例13工程1と同様の操作を行い、19．2mg／mLの（Fucα1，6）GlcNAc－抗CLDN6抗体（H1L1）溶液（50mMりん酸緩衝液（pH6．0））（4．8mL）を得た。
工程2：抗CLDN6抗体（H1L1）－［MSG1－N3］2
　上記工程1で得られた19．2mg／mL（Fucα1，6）GlcNAc－抗CLDN6（H1L1）抗体溶液（50mMりん酸緩衝液（pH6．0））（4．8mL）を用いて、実施例15工程1と同様の操作を行うことによって、10．2mg／mL抗CLDN6抗体（H1L1）－［MSG1－N3］2溶液（リン酸緩衝生理食塩水（pH6．0））（7．2mL）を得た。
実施例17：糖鎖変換5（CLDN6－MSG1（H2L2））
工程1：（Fucα1，6）GlcNAc－抗CLDN6抗体（H2L2）
　実施例10で調製した抗CLDN6抗体（H2L2）溶液ca．20mg／mL（25mMヒスチジン溶液（pH6．0）、5％ソルビトール溶液）（6mL）を用いて、実施例13工程1と同様の操作を行い、21．84mg／mLの（Fucα1，6）GlcNAc－抗CLDN6抗体（H2L2）溶液（50mMりん酸緩衝液（pH6．0））（5．7mL）を得た。
工程2：抗CLDN6抗体（H2L2）－［MSG1－N3］2
　上記工程1で得られた21．8mg／mL（Fucα1，6）GlcNAc－抗CLDN6（H2L2）抗体溶液（50mMりん酸緩衝液（pH6．0））（5．7mL）を用いて、実施例15工程1と同様の操作を行うことによって、10．2mg／mL抗CLDN6抗体（H2L2）－［MSG1－N3］2溶液（リン酸緩衝生理食塩水（pH6．0））（11．1mL）を得た。
実施例18：糖鎖変換6（CLDN6－MSG1（H1L3））
工程1：（Fucα1，6）GlcNAc－抗CLDN6抗体（H1L3）
　実施例10で調製した抗CLDN6抗体（H1L3）溶液ca．39．4mg／mL（25mMヒスチジン溶液（pH6．0）、5％ソルビトール溶液）（3mL）を用いて、実施例13工程1と同様の操作を行い、39.2mg／mLの（Fucα1，6）GlcNAc－抗CLDN6抗体（H1L3）溶液（50mMりん酸緩衝液（pH6．0））（4．5mL）を得た。
工程2：抗CLDN6抗体（H1L3）－［MSG1－N3］2
　上記工程1で得られた39．2mg／mL（Fucα1，6）GlcNAc－抗CLDN6（H1L3）抗体溶液（50mMりん酸緩衝液（pH6．0））（4．5mL）を用いて、実施例15工程1と同様の操作を行うことによって、9．83mg／mL抗CLDN6抗体（H1L3）－［MSG1－N3］2溶液（リン酸緩衝生理食塩水（pH6．0））（7．2mL）を得た。
実施例19：糖鎖変換7（CD98－MSG1）
工程1：（Fucα1，6）GlcNAc－抗CD98抗体
　参考例6で調製した抗CD98抗体溶液ca．20mg／mL（25mMヒスチジン溶液（pH6．0）、5％ソルビトール溶液）（6mL）を用いて、実施例13工程1と同様の操作を行い、21．7mg／mLの（Fucα1，6）GlcNAc－抗CD98抗体溶液（50mMりん酸緩衝液（pH6．0））（4．7mL）を得た。
工程2：抗CD98抗体－［MSG1－N3］2
　上記工程1で得られた21．7mg／mL（Fucα1，6）GlcNAc－抗CD98抗体溶液（50mMりん酸緩衝液（pH6．0））（4．7mL）を用いて、実施例15工程1と同様の操作を行うことによって、10．1mg／mLの抗CD98抗体－［MSG1－N3］2溶液（リン酸緩衝生理食塩水（pH6．0））（7．6mL）を得た。
実施例20：糖鎖変換8（TROP2－MSG1）
工程1：（Fucα1，6）GlcNAc－抗Trop2抗体
　参考例5で調製した抗Trop2抗体溶液ca．20mg／mL（25mMヒスチジン溶液（pH6．0）、5％ソルビトール溶液）（6mL）を用いて、実施例13工程1と同様の操作を行い、21．69mg／mLの（Fucα1，6）GlcNAc－抗Trop2抗体溶液（50mMりん酸緩衝液（pH6．0））（3．3mL）を得た。
工程2：抗Trop2抗体－［MSG1－N3］2
　上記工程1で得られた21.69mg／mL（Fucα1，6）GlcNAc－抗Trop2抗体溶液（50mMりん酸緩衝液（pH6．0））（3．35mL）を用いて、実施例15工程1と同様の操作を行うことによって、10．3mg／mLの抗Trop2抗体－［MSG1－N3］2溶液（リン酸緩衝生理食塩水（pH6．0））（6．4mL）を得た。
実施例21：糖鎖変換9（LPS－MSG1）
工程1：（Fucα1，6）GlcNAc－抗LPS抗体
　参考例4で調製した抗LPS抗体溶液ca．17mg／mL（25mMヒスチジン溶液（pH6．0）、5％ソルビトール溶液）（6．6mL）を用いて、実施例13工程1と同様の操作を行い、21．03mg／mLの（Fucα1，6）GlcNAc－抗LPS抗体溶液（50mMりん酸緩衝液（pH6.0））（5．4mL）を得た。
工程2：抗LPS抗体－［MSG1－N3］2
　上記工程1で得られた21.03mg／mL（Fucα1，6）GlcNAc－抗LPS抗体溶液（50mMりん酸緩衝液（pH6.0））（5.4mL）を用いて、実施例15工程1と同様の操作を行うことによって、9.89mg／mLの抗LPS抗体－［MSG1－N3］2溶液（リン酸緩衝生理食塩水（pH6.0））（7.9mL）を得た。
実施例22：糖鎖変換10（Trastuzumab変異体－MSG1）
工程1：（Fucα1，6）GlcNAc－Trastuzumab変異体
　実施例12で調整したTrastuzumab変異体溶液ca．22.3mg／ml（50mMりん酸緩衝液（pH6.0））（2.7ml）を用いて、実施例13工程1と同様の操作を行い、6.1mg／mlの（Fucα1，6）GlcNAc－Trastuzumab変異体溶液（50mMりん酸緩衝液（pH6．0））（6.1mL）を得た。
工程2：Trastuzumab変異体－［MSG1－N3］2
　上記工程1で得られた6.1mg/ml(Fucα1,6)GlcNAc-Trastuzumab変異体溶液（50mMりん酸緩衝液（pH6．0））（6．1ml）を用いて、実施例15工程1と同様の操作を行うことによって、10.2mg/ml　Trastuzumab変異体-[MSG1-N3]2溶液（リン酸緩衝生理食塩水（pH6．0））（3．7ml）を得た。
〔ADCの合成〕
　実施例23、24、52に記載のADC1、2、5は、下記の反応式に示すように実施例14の工程1で得られた抗体と薬物リンカーをコンジュゲーションすることによって合成した。式中、Rは各実施例で用いられた薬物リンカーによって異なる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000105
実施例23：ADC1
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000106
（実施例23工程1で得られる化合物は、上記式で示すようにトリアゾール環の幾何異性体を有し、上記Rとして示した2種類の構造からなる薬物リンカーを混合して保持する。）
工程1：抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション
　実施例14工程1にて得られた抗体のリン酸緩衝生理食塩水（pH6．0）溶液（10．0mg／mL，1．00mL）に、室温にて1，2－プロパンジオール（0．917mL）、実施例2-4工程12にて得られた化合物(6-13)を10mM含むジメチルスルホキシド溶液（0．0825mL；抗体1分子に対して12当量）を加え、チューブローテーター（MTR－103、アズワン株式会社）を用いて、室温にて2日間反応させた。
　精製操作：上記溶液を共通操作Dを用いて精製を行い、目的の化合物を有する溶液を6．0mL得た。
　特性評価：共通操作E、Fを用いて下記の特性値を得た。
　抗体濃度：1．33mg／mL，抗体収量：7．97mg（80％），抗体一分子あたりの薬物平均結合数（n）：1．9
実施例24：ADC2
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000107
（実施例24工程1で得られる化合物は、上記式で示すようにトリアゾール環の幾何異性体を有し、上記Rとして示した2種類の構造からなる薬物リンカーを混合して保持する。）
工程1：抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション
　実施例14工程1にて得られた抗体のリン酸緩衝生理食塩水（pH6．0）溶液（9．88mg／mL，0．500mL）に、室温にて1，2－プロパンジオール（0．459mL）、実施例2-3工程10にて得られた化合物(5-11)を10mM含むジメチルスルホキシド溶液（0．0408mL；抗体1分子に対して12当量）を加え、チューブローテーター（MTR－103、アズワン株式会社）を用いて、室温にて1日間反応させた。
　精製操作：上記溶液を共通操作Dを用いて精製を行い、目的の化合物を有する溶液を6．00mL得た。この溶液を共通操作Aを用いて濃縮し、目的の化合物を有する溶液を0．420mL得た。
　特性評価：共通操作E、Fを用いて下記の特性値を得た。
　抗体濃度：7．27mg／mL，抗体収量：3．54mg（72％），抗体一分子あたりの薬物平均結合数（n）：1．8
　実施例25、26に記載のADC3、4は、下記の反応式に示すように、実施例13工程2で得られた抗体と薬物リンカーをコンジュゲートすることによって合成した。式中、Rは各実施例で用いられた薬物リンカーによって異なる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000108
実施例25：ADC3
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000109
（実施例25工程1で得られる化合物は、上記式で示すようにトリアゾール環の幾何異性体を有し、上記Rとして示した2種類の構造からなる薬物リンカーを混合して保持する。）
工程1：抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション
　実施例13工程2にて得られた抗体のリン酸緩衝生理食塩水（pH6．0）溶液（10．0mg／mL，1．00mL）に、室温にて1，2－プロパンジオール（0．835mL）、実施例2-2工程12にて得られた化合物(4-12)を10mM含むジメチルスルホキシド溶液（0．165mL；抗体1分子に対して24当量）を加え、チューブローテーター（MTR－103、アズワン株式会社）を用いて、室温にて48時間反応させた。
　精製操作：上記溶液を共通操作Dを用いて精製を行い、目的の化合物を有する溶液を4．50mL得た。
　特性評価：共通操作E、Fを用いて下記の特性値を得た。
　抗体濃度：1．66mg／mL，抗体収量：7．48mg（75％），抗体一分子あたりの薬物平均結合数（n）：3．8
実施例26：ADC4
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000110
（実施例26工程1で得られる化合物は、上記式で示すようにトリアゾール環の幾何異性体を有し、上記Rとして示した2種類の構造からなる薬物リンカーを混合して保持する。）
工程1：抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション
　実施例13工程2にて得られた抗体のリン酸緩衝生理食塩水（pH6．0）溶液（10．0mg／mL，1．00mL）に、室温にて1，2－プロパンジオール（0．835mL）、実施例2-4工程12にて得られた化合物(6-13)を10mM含むジメチルスルホキシド溶液（0．165mL；抗体1分子に対して24当量）を加え、チューブローテーター（MTR－103、アズワン株式会社）を用いて、室温にて2日間反応させた。
　精製操作：上記溶液を共通操作Dを用いて精製を行い、目的の化合物を有する溶液を10．5mL得た。
　特性評価：共通操作E、F用いて下記の特性値を得た。
　抗体濃度：0．73mg／mL，抗体収量：7．70mg（77％），抗体一分子あたりの薬物平均結合数（n）：3．8
　実施例27、28、29、53～56に記載のADC5～7、16～19は、下記の反応式に示すように実施例15工程1で得られた抗体と薬物リンカーをコンジュゲーションすることによって合成した。式中、R基は各実施例で用いられた薬物リンカーによって異なる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000111
実施例27：ADC5
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000112
（実施例27工程1で得られる化合物は、上記式で示すようにトリアゾール環の幾何異性体を有し、上記Rとして示した2種類の構造からなる薬物リンカーを混合して保持する。）
工程1：抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション
　実施例15工程1にて得られた抗体のリン酸緩衝生理食塩水（pH6．0）溶液（10．0mg／mL，1．00mL）に、室温にて1，2－プロパンジオール（0．917mL）、実施例2-4工程12にて得られた化合物(6-13)を10mM含むジメチルスルホキシド溶液（0．0825mL；抗体1分子に対して12当量）を加え、チューブローテーター（MTR－103、アズワン株式会社）を用いて、室温にて2日間反応させた。
　精製操作：上記溶液を共通操作Dを用いて精製を行い、目的の化合物を有する溶液を6．0mL得た。
　特性評価：共通操作E、Fを用いて下記の特性値を得た。
　抗体濃度：1．46mg／mL，抗体収量：8．76mg（88％），抗体一分子あたりの薬物平均結合数（n）：1．9
実施例28：ADC6
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000113
 （実施例28工程1で得られる化合物は、上記式で示すようにトリアゾール環の幾何異性体を有し、上記Rとして示した2種類の構造からなる薬物リンカーを混合して保持する。）
工程1：抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション
　実施例15工程1にて得られた抗体のリン酸緩衝生理食塩水（pH6．0）溶液（10．0mg／mL，5．00mL）に、室温にて1，2－プロパンジオール（4．59mL）、実施例2-2工程12にて得られた化合物(4-12)を10mM含むジメチルスルホキシド溶液（0．413mL；抗体1分子に対して12当量）を加え、チューブローテーター（MTR－103、アズワン株式会社）を用いて、室温にて48時間反応させた。
　精製操作：上記溶液を共通操作Dを用いて精製を行い、目的の化合物を有する溶液を30．0mL得た。
　特性評価：共通操作E、Fを用いて下記の特性値を得た。
　抗体濃度：1．30mg／mL，抗体収量：38．9mg（78％），抗体一分子あたりの薬物平均結合数（n）：1．9
実施例29：ADC7
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000114
（実施例29工程1で得られる化合物は、上記式で示すようにトリアゾール環の幾何異性体を有し、上記Rとして示した2種類の構造からなる薬物リンカーを混合して保持する。）
工程1：抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション
　実施例15工程1にて得られた抗体のリン酸緩衝生理食塩水（pH6．0）溶液（10．2mg／mL，1．00mL）に、室温にて1，2－プロパンジオール（0．917mL）、実施例2-1工程13にて得られた化合物(3-14)を10mM含むジメチルスルホキシド溶液（0．0825mL；抗体1分子に対して12当量）を加え、チューブローテーター（MTR－103、アズワン株式会社）を用いて、室温にて2日間反応させた。
　精製操作：上記溶液を共通操作Dを用いて精製を行い、目的の化合物を有する溶液を6．00mL得た。
　特性評価：共通操作E、Fを用いて下記の特性値を得た。
　抗体濃度：1．41mg／mL，抗体収量：8．45mg（85％），抗体一分子あたりの薬物平均結合数（n）：1．9
実施例30：ADC8
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000115
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000116
（実施例30工程1で得られる化合物は、上記式で示すようにトリアゾール環の幾何異性体を有し、上記Rとして示した2種類の構造からなる薬物リンカーを混合して保持する。）
工程1：抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション
　実施例16工程2にて得られた抗体のリン酸緩衝生理食塩水（pH6．0）溶液（10．2mg／mL，2．50mL）に、室温にて1，2－プロパンジオール（2．29mL）、実施例2-1工程13にて得られた化合物(3-14)を10mM含むジメチルスルホキシド溶液（0．206mL；抗体1分子に対して12当量）を加え、チューブローテーター（MTR－103、アズワン株式会社）を用いて、室温にて48時間反応させた。
　精製操作：上記溶液を共通操作Dを用いて精製を行い、目的の化合物を有する溶液を14．5mL得た。
　特性評価：共通操作E、Fを用いて下記の特性値を得た。
　抗体濃度：1．54mg／mL，抗体収量：22．3mg（89％），抗体一分子あたりの薬物平均結合数（n）：1．9
実施例31：ADC9
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000117
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000118
（実施例31工程1で得られる化合物は、上記式で示すようにトリアゾール環の幾何異性体を有し、上記Rとして示した2種類の構造からなる薬物リンカーを混合して保持する。）
工程1：抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション
　実施例17工程2にて得られた抗体のリン酸緩衝生理食塩水（pH6．0）溶液（9．96mg／mL，2．50mL）に、室温にて1，2－プロパンジオール（2．29mL）、実施例2-1工程13にて得られた化合物(3-14)を10mM含むジメチルスルホキシド溶液（0．206mL；抗体1分子に対して12当量）を加え、チューブローテーター（MTR－103、アズワン株式会社）を用いて、室温にて48時間反応させた。
　精製操作：上記溶液を共通操作Dを用いて精製を行い、目的の化合物を有する溶液を14．5mL得た。
　特性評価：共通操作E、Fを用いて下記の特性値を得た。
　抗体濃度：1．52mg／mL，抗体収量：22．0mg（88％），抗体一分子あたりの薬物平均結合数（n）：1．9
実施例32：ADC10
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000119
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000120
 （実施例32工程1で得られる化合物は、上記式で示すようにトリアゾール環の幾何異性体を有し、上記Rとして示した2種類の構造からなる薬物リンカーを混合して保持する。）
工程1：抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション
　実施例18工程2にて得られた抗体のリン酸緩衝生理食塩水（pH6．0）溶液（9．83mg／mL，2．50mL）に、室温にて1，2－プロパンジオール（2．29mL）、実施例2-1工程13にて得られた化合物(3-14)を10mM含むジメチルスルホキシド溶液（0．206mL；抗体1分子に対して12当量）を加え、チューブローテーター（MTR－103、アズワン株式会社）を用いて、室温にて48時間反応させた。
　精製操作：上記溶液を共通操作Dを用いて精製を行い、目的の化合物を有する溶液を14．5mL得た。
　特性評価：共通操作E、Fを用いて下記の特性値を得た。
　抗体濃度：1.45mg／mL，抗体収量：21.0mg（84％），抗体一分子あたりの薬物平均結合数（n）：1．9
実施例33：ADC11
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000121
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000122
（実施例33工程1で得られる化合物は、上記式で示すようにトリアゾール環の幾何異性体を有し、上記Rとして示した2種類の構造からなる薬物リンカーを混合して保持する。）
工程1：抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション
　実施例20工程2にて得られた抗体のリン酸緩衝生理食塩水（pH6．0）溶液（10mg／mL，1．00mL）に、室温にて1，2－プロパンジオール（0．917mL）、実施例2-1工程13にて得られた化合物(3-14)を10mM含むジメチルスルホキシド溶液（0．0825mL；抗体1分子に対して12当量）を加え、チューブローテーター（MTR－103、アズワン株式会社）を用いて、室温にて2日間反応させた。
　精製操作：上記溶液を共通操作Dを用いて精製を行い、目的の化合物を有する溶液を6．00mL得た。
　特性評価：共通操作E、Fを用いて下記の特性値を得た。
　抗体濃度：1．47mg／mL，抗体収量：8．8mg（88％），抗体一分子あたりの薬物平均結合数（n）：1．9
実施例34：ADC12
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000123
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000124
（実施例34工程1で得られる化合物は、上記式で示すようにトリアゾール環の幾何異性体を有し、上記Rとして示した2種類の構造からなる薬物リンカーを混合して保持する。）
工程1：抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション
　実施例19工程2にて得られた抗体のリン酸緩衝生理食塩水（pH6．0）溶液（10．2mg／mL，1．00mL）に、室温にて1，2－プロパンジオール（0．917mL）、実施例2-1工程13にて得られた化合物(3-14)を10mM含むジメチルスルホキシド溶液（0．0825mL；抗体1分子に対して12当量）を加え、チューブローテーター（MTR－103、アズワン株式会社）を用いて、室温にて2日間反応させた。
　精製操作：上記溶液を共通操作Dを用いて精製を行い、目的の化合物を有する溶液を6．00mL得た。
　特性評価：共通操作E、Fを用いて下記の特性値を得た。
　抗体濃度：1．36mg／mL，抗体収量：8．19mg（82％），抗体一分子あたりの薬物平均結合数（n）：1．8
実施例35：ADC13
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000125
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000126
（実施例35工程1で得られる化合物は、上記式で示すようにトリアゾール環の幾何異性体を有し、上記Rとして示した2種類の構造からなる薬物リンカーを混合して保持する。）
工程1：抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション
　実施例21工程2にて得られた抗体のリン酸緩衝生理食塩水（pH6．0）溶液（9．89mg／mL，0．40mL）に、室温にて1，2－プロパンジオール（0．367mL）、実施例2-1工程13にて得られた化合物(3-14)を10mM含むジメチルスルホキシド溶液（0．0328mL；抗体1分子に対して12当量）を加え、チューブローテーター（MTR－103、アズワン株式会社）を用いて、室温にて2日間反応させた。
　精製操作：上記溶液を共通操作Dを用いて精製を行い、目的の化合物を有する溶液を2．50mL得た。
　特性評価：共通操作E、Fを用いて下記の特性値を得た。
　抗体濃度：1．16mg／mL，抗体収量：2．89mg（72％），抗体一分子あたりの薬物平均結合数（n）：1．8
実施例36：ADC14
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000127
（実施例36工程1で得られる化合物は、上記式で示すようにトリアゾール環の幾何異性体を有し、上記Rとして示した2種類の構造からなる薬物リンカーを混合して保持する。）
工程1：抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション
　実施例22工程2にて得られた抗体のリン酸緩衝生理食塩水（pH6．0）溶液（10．2mg／mL，0．40mL）に、室温にてリン酸緩衝生理食塩水（pH6．0）溶液（0．40mL）1，2－プロパンジオール（0．767mL）、ジメチルホルムアミド（0．20mL）、実施例2-1工程13にて得られた化合物(3-14)を10mM含むジメチルホルムアミド溶液（0．033mL；抗体1分子に対して12当量）を加え、チューブローテーター（MTR－103、アズワン株式会社）を用いて、室温にて48時間反応させた。
　精製操作：上記溶液を共通操作Dを用いて精製を行い、目的の化合物を有する溶液を7．00mL得た。
特性評価：共通操作E、Fを用いて下記の特性値を得た。
抗体濃度：0．39mg／mL，抗体収量：1．38mg（35％），抗体一分子あたりの薬物平均結合数（n）：1．8
実施例37：抗体－薬物コンジュゲートの細胞増殖阻害評価（1）
　HER2抗原陽性細胞のヒト胃がん株であるNCI－N87（American　Type　Culture　Collection；ATCC　CRL-5822）は、10％のウシ胎児血清（Hyclone）を含むRPMI1640　Medium（Thermo　Fisher　Scientific；以下、RPMI培地）で培養した。HER2抗原陰性細胞のMDA－MB－468（ATCC　HTB-132）は、10％のウシ胎児血清（Hyclone）を含むLeibovitz’s　L－15　Medium（Thermo　Fisher　Scientific；以下、Leibovitz’s培地）で培養した。NCI－N87をRPMI培地、MDA－MB－468細胞をLeibovitz’s培地で、それぞれ2．5×104　Cells／mLになるように調製し、96穴細胞培養用マイクロプレートに80μLずつ添加した。細胞添加後、NCI－N87は37℃、5％CO2下で一晩培養し、MDA－MB－468は37℃、CO2濃度設定なし下で一晩培養した。
　翌日、RPMI培地又はLeibovitz’s培地で100nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM、0.001nMに希釈した抗HER2抗体－薬物コンジュゲートをマイクロプレートに20μLずつ添加した。抗体－薬物コンジュゲート非添加ウェルにはRPMI培地又はLeibovitz’s培地を20μLずつ添加した。NCI－N87は37℃、5％CO2下で6日間、MDA－MB－468は37℃、CO2濃度設定なし下で6日間培養した。培養後、マイクロプレートをインキュベーターから取り出して室温で30分間静置した。培養液と等量のCellTiter-Glo　Luminescent　Cell　Viability　Assay (Promega)を添加してプレートミキサーで攪拌した。室温で10分間静置後にプレートリーダー（PerkinElmer）で発光量を計測した。
　生細胞率は次式で算出した。
生細胞率（％）＝a÷b×100
a：被験物質添加ウェルの発光量の平均値
b：培地添加ウェルの発光量の平均値
　IC50値は次式で算出した。
IC50　(nM)　=antilog((50-d)×(LOG10(b)-LOG10(a))÷(d-c)+LOG10(b))
a：被験物質の濃度a
b：被験物質の濃度b
c：濃度aの被験物質を添加した時の生細胞率
d：濃度bの被験物質を添加した時の生細胞率
a、bは生細胞率50％を挟む2点でa＞b。
　NCI－N87細胞に対して抗体－薬物コンジュゲートADC5、ADC4、ADC16はIC50＜0．001（nM）の抗細胞効果を示した。抗体－薬物コンジュゲートADC2、ADC15、ADC3、ADC6、ADC17、ADC18は0．001≦IC50＜0．1 (nM)の抗細胞効果を示した。また、いずれの抗体－薬物コンジュゲートもMDA－MB－468細胞に対しては抗細胞効果を示さなかった（IC50＞0．1（nM））。 
実施例38：抗体－薬物コンジュゲートの細胞増殖阻害評価（2）
　HER2抗原陽性細胞のヒト胃がん株であるNCI－N87(ATCC CRL-5822)は、10％のウシ胎児血清（Hyclone）を含むRPMI1640 Medium（Thermo Fisher Scientific；以下、RPMI培地）で培養した。HER2抗原陽性細胞のヒト乳がん株であるJIMT－1（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH；DSMZ ACC　589）は10％のウシ胎児血清（Hyclone）を含むDulbecco’s　Modified　Eagle　Medium（Thermo Fisher Scientific；以下、DMEM培地）で培養した。NCI－N87をRPMI培地で5．0×104 Cells／mLに、JIMT－1細胞をDMEM培地で1．3×104 Cells／mLになるように調製し、96穴細胞培養用マイクロプレートに80μLずつ添加し37℃、5％CO2下で一晩培養した。
　翌日、RPMI培地又はDMEM培地で400nM、80nM、16nM、3．2nM、0．64nM、0．13nM、0．026nM、0．0051nM、0．0010　nMに希釈した抗HER2抗体－薬物コンジュゲートADC7、又は抗LPS抗体－薬物コンジュゲーADC13をマイクロプレートに20μLずつ添加した。抗体－薬物コンジュゲート非添加ウェルにはRPMI培地又はDMEM培地を20μLずつ添加した。37℃、5％CO2下で6日間培養した。培養後、マイクロプレートをインキュベーターから取り出して室温で30分間静置した。培養液と等量のCellTiter－Glo　Luminescent　Cell　Viability　Assay（Promega）を添加してプレートミキサーで攪拌した。室温で10分間静置後にプレートリーダー（PerkinElmer）で発光量を計測した。実施例37と同じ式を用いて、生細胞率を算出した。
　NCI－N87、JIMT－1両細胞に対して抗HER2抗体－薬物コンジュゲートADC7は0．001＜IC50＜0．1（nM）の抗細胞効果を示した。一方、抗LPS抗体－薬物コンジュゲートADC13はいずれの細胞に対しても抗細胞効果を示さなかった
（IC50＞0．1（nM））。
実施例39：抗体－薬物コンジュゲートの細胞増殖阻害評価（3）
　CLDN6抗原陽性細胞のヒト卵巣がん株であるOV－90 (ATCC　CRL-11732)は、15％のウシ胎児血清（Hyclone）を含む、Medium199（Thermo　Fisher　Scientific）とMCDB　105　Medium（Sigma－Aldrich）の1対1混合培地（以下、培地）で培養した。OV－90細胞を培地で1．9×104　Cells／mLになるように調製し、96穴細胞培養用マイクロプレートに80μL添加し37℃、5％CO2下で一晩培養した。
　翌日、培地で50nM、10nM、2．0nM、400pM、80pM、16pM、3．2pM、0．64pM、0．13pMに希釈した抗CLDN6抗体－薬物コンジュゲートADC8、ADC9、ADC10をマイクロプレートに20μLずつ添加した。抗体－薬物コンジュゲート非添加ウェルには培地を20μLずつ添加した。37℃、5％CO2下で6日間培養した。培養後、マイクロプレートをインキュベーターから取り出して室温で30分間静置した。培養液と等量のCellTiter－Glo　Luminescent　Cell　Viability　Assay（Promega）を添加してプレートミキサーで攪拌した。室温で10分間静置後にプレートリーダー（PerkinElmer）で発光量を計測した。実施例37と同じ式を用いて、生細胞率を算出した。
　OV－90細胞に対して抗CLDN6抗体－薬物コンジュゲートADC8、ADC9、ADC10は0.001＜IC50＜0.1（nM）の抗細胞効果を示した。
実施例40：抗体－薬物コンジュゲートの抗腫瘍試験（1）
　マウス：4－5週齢の雌BALB／c　ヌードマウス（日本チャールズ・リバー）を実験使用前にSPF条件下で4－7日間馴化した。マウスには滅菌した固形飼料（FR－2，　Funabashi　Farms　Co．，　Ltd）を給餌し、滅菌した水道水（5－15 ppm次亜塩素酸ナトリウム溶液を添加して調製）を与えた。
　測定・計算式：全ての研究において、腫瘍の長径及び短径を電子式デジタルキャリパー（CD－15CX，　Mitutoyo　Corp．）で一週間に2－3回測定し、腫瘍体積（mm3）を計算した。計算式は以下に示すとおり。
腫瘍体積（mm3）＝長径（mm）　×　［短径（mm）］2　×　1／2
　抗体－薬物コンジュゲート及び抗体は全て10　mM－Acetate　Buffer，　5％　Sorbitol，　pH5．5（ナカライテスク株式会社；ABS緩衝液）で希釈し、10mL／kgの液量を尾静脈内投与した。また、コントロール群（Vehicle群）としてABS緩衝液を同様に投与した。
　NCI－N87細胞（ATCC　CRL-5822）を生理食塩水（株式会社大塚製薬工場）に懸濁し、1×107　cellsを雌ヌードマウスの右体側部に皮下移植し（Day0）、Day7に無作為に群分けを実施した。抗HER2抗体－薬物コンジュゲートADC2をDay7に0．3mg／kgの用量で、ADC1をDay7に1mg／kgの用量で尾静脈内投与した。また、コントロール群（Vehicle群）としてABS緩衝液を同様に投与した。
　結果を図4に示す。抗HER2抗体－薬物コンジュゲートADC2、ADC1は腫瘍の退縮を伴う強い抗腫瘍効果が認められた。いずれの抗HER2抗体－薬物コンジュゲートを投与されたマウスにおいても、体重減少は認められなかった。
　以下の抗腫瘍試験に関する評価例において、特に記載のない場合、本評価例で使用した手法で試験が実施されている。
実施例41：抗体－薬物コンジュゲートの抗腫瘍試験（2）
　NCI－N87細胞（ATCC　CRL-5822）をDulbecco’s　phosphate　buffered　saline（Sigma-Aldrich)に懸濁し、1×107　cellsを雌ヌードマウスの右体側部に皮下移植し（Day0）、Day4に無作為に群分けを実施した。抗HER2抗体－薬物コンジュゲートADC7、抗HER2抗体Trastuzumab（参考例3）、又は抗LPS抗体－薬物コンジュゲートADC13をDay4に全て0．33mg／kgの用量で尾静脈内投与した。また、コントロール群（Vehicle群）としてABS緩衝液を同様に投与した。
　結果を図5に示す。抗HER2抗体－薬物コンジュゲートADC7は腫瘍の退縮を伴う強い抗腫瘍効果が認められた。一方、抗HER2抗体Trastuzumab、抗LPS抗体－薬物コンジュゲートADC13では腫瘍の増殖を抑制しなかった。また、抗体－薬物コンジュゲートADC7、ADC13、又は抗HER2抗体投与によるマウスの体重減少は認められなかった。
実施例42：抗体－薬物コンジュゲートの抗腫瘍試験（3）
　KPL－4細胞（川崎医科大学・紅林淳一、British　Journal　of　Cancer,（1999)79(5/6).　707-717）をDulbecco’s　phosphate　buffered　saline（Sigma－Aldrich）に懸濁し、1．5×107 cellsを雌ヌードマウスの右体側部に皮下移植し（Day0）、Day14に無作為に群分けを実施した。抗HER2抗体－薬物コンジュゲートADC7、抗LPS抗体－薬物コンジュゲートADC13、又はTrastuzumab tesirine（参考例1）をDay14に0．4mg／kgの用量で尾静脈内投与した。また、コントロール群（Vehicle群）としてABS緩衝液を同様に投与した。
　結果を図6に示す。抗HER2抗体－薬物コンジュゲートADC7は腫瘍の退縮を伴う強い抗腫瘍効果が認められた。一方、ADC13、Trastuzumab tesirineでは腫瘍の退縮は認められなかった。また、ADC7、Trastuzumabテシリン投与によるマウスの体重減少は認められなかった。
実施例43：抗体－薬物コンジュゲートの抗腫瘍試験（4）
　JIMT－1細胞(DSMZ ACC 589)を生理食塩水（株式会社大塚製薬工場）に懸濁し、5×106 cellsを雌ヌードマウスの右体側部に皮下移植し（Day0）、Day10に無作為に群分けを実施した。抗HER2抗体－薬物コンジュゲーADC7、又はTrastuzumab tesirine（参考例1）をDay10に0．4mg／kgの用量で尾静脈内投与した。また、コントロール群（Vehicle群）としてABS緩衝液を同様に投与した。
　結果を図7に示す。抗HER2抗体－薬物コンジュゲートADC7は腫瘍の退縮を伴う強い抗腫瘍効果が認められた。一方、Trastuzumab tesirineでは抗腫瘍効果が認められたが、腫瘍の退縮は認められなかった。また、ADC7、Trastuzumab tesirine投与によるマウスの体重減少は認められなかった。
実施例44：抗体－薬物コンジュゲートの抗腫瘍試験（5）
　OV－90細胞（ATCC　CRL-11732）をマトリゲル（CORNING）に懸濁し、2．5×106　cellsを雌ヌードマウスの右体側部に皮下移植し（Day0）、Day15に無作為に群分けを実施した。抗CLDN6抗体－薬物コンジュゲートADC8、又は抗CLDN6抗体（H1L1）tesirineをDay15に0．33mg／kgの用量で尾静脈内投与した。また、コントロール群（Vehicle群）としてABS緩衝液を同様に投与した。
　結果を図8に示す。抗CLDN6抗体－薬物コンジュゲートADC8は腫瘍の退縮を伴う強い抗腫瘍効果が認められた。一方、抗CLDN6抗体（H1L1）tesirineでは、腫瘍の退縮は認められなかった。また、ADC8、H1L1 tesirine投与によるマウスの体重減少は認められなかった。
実施例45：抗体－薬物コンジュゲートの抗腫瘍試験（6）
　NIH：OVCAR－3細胞（ATCC　HTB-161）をマトリゲル（CORNING）に懸濁し、1×107　cellsを雌ヌードマウスの右体側部に皮下移植し（Day0）、Day25に無作為に群分けを実施した。抗CLDN6抗体－薬物コンジュゲートADC8、又は抗CLDN6抗体（H1L1）－テシリンをDay25に0．33mg／kgの用量で尾静脈内投与した。また、コントロール群（Vehicle群）としてABS緩衝液を同様に投与した。
　結果を図9に示す。抗CLDN6抗体－薬物コンジュゲートADC8は腫瘍の退縮を伴う強い抗腫瘍効果が認められた。一方、H1L1－テシリンでは抗腫瘍効果は認められたが、腫瘍の退縮は認められなかった。また、ADC8、H1L1－テシリン投与によるマウスの体重減少は認められなかった。
実施例46：抗体－薬物コンジュゲートの抗腫瘍試験（7）
　FaDu細胞（ATCC　HTB-43）を生理食塩水（株式会社大塚製薬工場）に懸濁し、3×106　cellsを雌ヌードマウスの右体側部に皮下移植し（Day0）、Day10に無作為に群分けを実施した。抗TROP2抗体－薬物コンジュゲートADC11、又は抗LPS抗体－薬物コンジュゲートADC13をDay10に0．4mg／kgの用量で尾静脈内投与した。また、コントロール群（Vehicle群）としてABS緩衝液を同様に投与した。
　結果を図10に示す。抗TROP2抗体－薬物コンジュゲートADC11は腫瘍の退縮を伴う強い抗腫瘍効果が認められた。一方、抗LPS抗体-薬物コンジュゲートADC13は腫瘍の増殖を抑制しなかった。また、ADC11、ADC13投与によるマウスの体重減少は認められなかった。
実施例47：抗HER2抗体－薬物コンジュゲートの抗腫瘍試験（8）
　実施例40と同様の実験動物及び手法を用いて、抗HER2抗体－薬物コンジュゲートの抗腫瘍の抗腫瘍効果を測定した。
　KPL－4細胞（川崎医科大学・紅林淳一）をDulbecco’s phosphate buffered saline（Sigma-Aldrich）に懸濁し、1．5×107　cellsを雌ヌードマウスの右体側部に皮下移植し（Day0）、Day14に無作為に群分けを実施した。抗HER2抗体－薬物コンジュゲートADC7、又は抗HER2抗体－薬物コンジュゲートADC14をDay14に0．33mg／kgの用量で尾静脈内投与した。また、コントロール群（Vehicle群）としてABS緩衝液を同様に投与した。
　結果を図47に示す。ADC7とADC14はいずれも0．33mg／kg投与で、同等の抗腫瘍活性を示した。また、ADC7、ADC14投与によるマウスの体重減少は認められなかった。
実施例48：抗HER2抗体－薬物コンジュゲートの抗腫瘍試験（9）
　JIMT－1細胞（DSMZ ACC 589）を生理食塩水（株式会社大塚製薬工場）に懸濁し、5×106cellsを雌ヌードマウスの右体側部に皮下移植し（Day0）、Day11に無作為に群分けを実施した。ADC14をDay11に0．4mg／kgまたは0．2mg／kgの用量で尾静脈内投与した。また、コントロール群（Vehicle群）としてABS緩衝液を同様に投与した。
　結果を図48に示す。ADC14は0.4mg／kg投与時に腫瘍の退縮を伴う強い抗腫瘍効果を認めた。また、いずれの投与用量においてもADC14投与によるマウスの体重減少は認められなかった。
実施例49：抗HER2抗体－薬物コンジュゲートの抗腫瘍試験（3）
　CFPAC－1細胞（ATCC CRL-1918）を生理食塩水（株式会社大塚製薬工場）に懸濁し、5×106　cellsを雌ヌードマウスの右体側部に皮下移植し（Day0）、Day10に無作為に群分けを実施した。抗HER2抗体－薬物コンジュゲートADC7、ADC14又は抗LPS抗体－薬物コンジュゲートADC13をDay10に0．4mg／kgの用量で尾静脈内投与した。また、コントロール群（Vehicle群）としてABS緩衝液を同様に投与した。
　結果を図49に示す。ADC7とADC14いずれを投与したマウスにおいても、腫瘍の退縮を伴う強い抗腫瘍効果が認められた。また、ADC7とADC14、又はADC13投与によるマウスの体重減少は認められなかった。
〔薬物Dの合成〕
実施例50：薬物１
　ADC7～ADC1からの遊離薬物（薬物１）を下記のスキームに従って合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000128
工程1：プロプ－2－エン－1－イル　（2－｛［（6S）－6－（｛［tert－ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝メチル）－5－アザスピロ［2．4］ヘプト－5－イル］カルボニル｝－4－メトキシ－5－｛［トリ（プロパン－2－イル）シリル］オキシ｝フェニル）カルバメート(7-1)
　実施例1-1工程5にて得られた化合物(1-6)を（4．59g，8．15mmol）を、実施例2-1工程9と同様に反応させ、目的物(7-1)（4．86g，92％）を得た。
　MS(APCI、ESI)m/z:647(M+H)+
工程2：プロプ－2－エン－1－イル　（2－｛［（6S）－6－（ヒドロキシメチル）－5－アザスピロ［2．4］ヘプト－5－イル］カルボニル｝－4－メトキシ－5－｛［トリ（プロパン－2－イル）シリル］オキシ｝フェニル）カルバメート(7-2)
　上記工程1にて得られた化合物(7-1)（4．86g，7．51mmol）を、実施例1-1工程7と同様に反応させ、目的物(7-2)（3．42g，86％）を得た。
　MS(APCI、ESI)m/z:533(M+H)+
工程3：プロプ－2－エン－1－イル　（11a’S）－11’－ヒドロキシ－7’－メトキシ－5’－オキソ－8’－｛［トリ（プロパン－2－イル）シリル］オキシ｝－11’，11a’－ジヒドロ－1’H－スピロ［シクロプロパン－1，2’－ピロロ［2，1－c］［1，4］ベンゾジアゼピン］－10’（5’H）－カルボキシレート(7-3)
　上記工程2にて得られた化合物(7-2)（6．68g，12．5mmol）を、実施例1-1工程8と同様に反応させ、目的物(7-3)（6．44g，97％）を得た。
　MS(APCI、ESI)m/z:531(M+H)+
工程4：プロプ－2－エン－1－イル　（11a’S）－11’－｛［tert－ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝－7’－メトキシ－5’－オキソ－8’－｛［トリ（プロパン－2－イル）シリル］オキシ｝－11’，11a’－ジヒドロ－1’H－スピロ［シクロプロパン－1，2’－ピロロ［2，1－c］［1，4］ベンゾジアゼピン］－10’（5’H）－カルボキシレート(7-4)
　上記工程3にて得られた化合物(7-3)（3．24g，6．10mmol）を、実施例1-1工程9と同様に反応させ、目的物(7-4)（3．86g，98％）を得た。
　MS(APCI、ESI)m/z:645(M+H)+
工程5：プロプ－2－エン－1－イル　（11a’S）－11’－｛［tert－ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝－8’－ヒドロキシ－7’－メトキシ－5’－オキソ－11’，11a’－ジヒドロ－1’H－スピロ［シクロプロパン－1，2’－ピロロ［2，1－c］［1，4］ベンゾジアゼピン］－10’（5’H）－カルボキシレート(7-5)
　上記工程4にて得られた化合物(7-4)（4．49g，6．96mmol）を、実施例1-1工程10と同様に反応させ、目的物(7-5)（3．24g，95％）を得た。　
　MS(APCI、ESI)m/z:489(M+H)+
工程6：プロプ－2－エン－1－イル　（11a’S）－11’－｛［tert－ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝－7’－メトキシ－8’－｛［5－（｛（11aS）－7－メトキシ－2－（4－メトキシフェニル）－5－オキソ－10－［（プロプ－2－エン－1－イルオキシ）カルボニル］－5，10，11，11a－テトラヒドロ－1H－ピロロ［2，1－c］［1，4］ベンゾジアゼピン－8－イル｝オキシ）ペンチル］オキシ｝－5’－オキソ－11’，11a’－ジヒドロ－1’H－スピロ［シクロプロパン－1，2’－ピロロ［2，1－c］［1，4］ベンゾジアゼピン］－10’（5’H）－カルボキシレート(7-6)
　上記工程5にて得られた化合物(7-5)（0．080g，0．164mmol）を、実施例2-1工程10と同様に反応させ、目的物(7-6)（0．160g，98％）を得た。
　MS(APCI、ESI)m/z:993(M+H)+
工程7：プロプ－2－エン－1－イル　（11a’S）－11’－ヒドロキシ－7’－メトキシ－8’－｛［5－（｛（11aS）－7－メトキシ－2－（4－メトキシフェニル）－5－オキソ－10－［（プロプ－2－エン－1－イルオキシ）カルボニル］－5，10，11，11a－テトラヒドロ－1H－ピロロ［2，1－c］［1，4］ベンゾジアゼピン－8－イル｝オキシ）ペンチル］オキシ｝－5’－オキソ－11’，11a’－ジヒドロ－1’H－スピロ［シクロプロパン－1，2’－ピロロ［2，1－c］［1，4］ベンゾジアゼピン］－10’（5’H）－カルボキシレート(7-7)
　上記工程6にて得られた化合物(7-6)（160mg，0．161mmol）を、実施例2-1工程11と同様に反応させ、目的物(7-7)（141mg，定量的）を得た。
　MS(APCI、ESI)m/z:879(M+H)+
工程8：（11a’S）－7’－メトキシ－8’－［（5－｛［（11aS）－7－メトキシ－2－（4－メトキシフェニル）－5－オキソ－5，10，11，11a－テトラヒドロ－1H－ピロロ［2，1－c］［1，4］ベンゾジアゼピン－8－イル］オキシ｝ペンチル）オキシ］－1’，11a’－ジヒドロ－5’H－スピロ［シクロプロパン－1，2’－ピロロ［2，1－c］［1，4］ベンゾジアゼピン］－5’－オン(7-8)
　上記工程7にて得られた化合物(7-7)（141mg，0．161mmol）を、実施例2-1工程12と同様に反応させ、目的物(7-8：薬物1)（109.8mg，99％）を得た。
1H-NMR(DMSO-D6)δ:7.92-7.91(1H,m),7.45(1H,s),7.39-7.37(2H,m),7.33(1H,s),7.29(1H,s),6.92-6.89(2H,m),6.85(1H,s),6.56-6.54(1H,m),6.31(1H,s),4.19-4.12(2H,m),4.05-3.99(1H,m),3.95-3.93(2H,m),3.82-3.79(4H,m),3.76(3H,s),3.66(3H,s),3.52-3.46(3H,m),3.30-3.21(2H,m),2.78-2.74(1H,m),2.45-2.42(1H,m),2.06-2.05(1H,m),1.89-1.82(4H,m),1.60-1.58(2H,m),0.80-0.63(4H,m).　
　MS(APCI、ESI)m/z:693(M+H)+
実施例51：薬物１の細胞増殖阻害評価（4）
　ヒト乳がん株である　KPL-4細胞（川崎医科大学・紅林淳一、British Journal of Cancer, (1999)79(5/6). 707-717）を、10％のウシ胎児血清（Hyclone）を含むRPMI1640 Medium (Thermo Fisher Scientific;以下、RPMI培地）で6.25×103 Cells/mLになるように調製し、96穴細胞培養用マイクロプレートに80μＬずつ添加した。細胞添加後、37℃、5％CO2下で一晩培養した。
　翌日、RPMI培地で100ｎＭ、20ｎＭ、4ｎＭ、0.8ｎＭ、0.16ｎＭ、0.032ｎＭ、6.4ｐＭ、1.3ｐＭ、0.26ｐＭに希釈した薬物１をマイクロプレートに２０μＬずつ添加した。抗体－薬物コンジュゲート非添加ウェルにはRPMI培地を２０μＬずつ添加した。KPL-4は37℃、5％CO2下で6日間培養した。培養後、マイクロプレートをインキュベーターから取り出して室温で30分間静置した。培養液と等量のCellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega)を添加してプレートミキサーで攪拌した。室温で10分間静置後にプレートリーダー(PerkinElmer)で発光量を計測した。実施例37と同じ式を用いて、生細胞率を算出した。
　KPL-4細胞に対して薬物１は0.01＜IC50＜0.02 （nM）の抗細胞効果を示した。
実施例52－1：薬物リンカー5
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000129
工程1：化合物(8-1)
　実施例2-3工程9にて得られた化合物(5-10)（0．100g，0．105mmol）とアザジベンゾシクロオクチン酸（0.0351g，0.105mmol）を実施例2-3工程10と同様に反応させ、目的物(8-1)（0.0702g，53％）を得た。
　MS(APCI、ESI)m/z:1265(M+H)+.
実施例52-2：ADC15
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000130
（実施例52-2工程1で得られる化合物は、上記式で示すようにトリアゾール環の幾何異性体を有し、上記Rとして示した2種類の構造からなる薬物リンカーを混合して保持する。）
工程1：抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション
　実施例14工程1にて得られた抗体のリン酸緩衝生理食塩水（pH6．0）溶液（9．88mg／mL，1.00mL）に、室温にて1，2－プロパンジオール（0.917mL）、実施例52-1工程1にて得られた化合物(8-1)を10mM含むジメチルスルホキシド溶液（0.0825mL；抗体1分子に対して12当量）を加え、チューブローテーター（MTR－103、アズワン株式会社）を用いて、室温にて1日間反応させた。
　精製操作：上記溶液を共通操作Dを用いて精製を行い、目的の化合物を有する溶液を10.5mL得た。この溶液を共通操作Aを用いて濃縮し、目的の化合物を有する溶液を0.850mL得た。
　特性評価：共通操作E、Fを用いて下記の特性値を得た。
　抗体濃度：8.90mg／mL，抗体収量：7.56mg（77％），抗体一分子あたりの薬物平均結合数（n）：1.8
実施例53-1：薬物リンカー6
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000131
工程1：化合物(9-1) 
　5－アミノ吉草酸（0．436g，3．72mmol）をN，N－ジメチルホルムアミド（10mL）に溶解し、1－｛［4－（11，12－ジデヒドロジベンゾ［b，f］アゾシン－5（6H）－イル）－4－オキソブタノイル］オキシ｝ピロロジン－2，5－ジオン（1.36g，3.38mmol）、トリエチルアミン（0.937mL，6.76mmol）を室温にて加え、室温にて1.5時間撹拌した。反応溶液に1規定塩酸を加え、クロロホルムで抽出し、得られた有機層を水、飽和食塩水で洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧留去し、得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム～クロロホルム：メタノール：水＝7：3：1（v／v／v）の分配有機層］にて精製し、目的物(9-1)のN，N－ジメチルホルムアミド付加物（0.730g，45％）を固体として得た。
　MS(APCI、ESI)m/z:405(M+H)+
工程2：化合物(9-2) 
　上記工程1にて得られた化合物(9-1)（0.0176g，0.0368mmol）を、実施例2-1工程13と同様に反応させ、目的物(9-2)（0.00880g，18％）を得た。
MS（APCI、ESI）m／z：1339（M＋H）
実施例53-2：ADC16
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000132
（実施例53-2工程1で得られる化合物は、上記式で示すようにトリアゾール環の幾何異性体を有し、上記Rとして示した2種類の構造からなる薬物リンカーを混合して保持する。）
工程1：抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション
　実施例15工程1にて得られた抗体のリン酸緩衝生理食塩水（pH6.0）溶液（10.0mg／mL，1．00mL）に、室温にて1，2－プロパンジオール（0.917mL）、実施例53-1工程2にて得られた化合物(9-2)を10mM含むジメチルスルホキシド溶液（0.0825mL；抗体1分子に対して12当量）を加え、チューブローテーター（MTR－103、アズワン株式会社）を用いて、室温にて2日間反応させた。
　精製操作：上記溶液を共通操作Dを用いて精製を行い、目的の化合物を有する溶液を6.0mL得た。
　特性評価：共通操作E、Fを用いて下記の特性値を得た。
　抗体濃度：1.53mg／mL，抗体収量：9.17mg（92％），抗体一分子あたりの薬物平均結合数（n）：1.9
実施例54-1：薬物リンカー7
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000133
工程1：化合物(10-2)
　出発物質(10-1)（3.00g，7.78mmol，東京化成工業株式会社）のN，N－ジメチルホルムアミド（10mL）溶液に、室温にて1，8－ジアザビシクロ［5．4．0］－7－ウンデセン（1.16mL，7.78mL）を加え、室温にて2時間撹拌した後、室温にて1－｛［4－（11，12－ジデヒドロジベンゾ［b，f］アゾシン－5（6H）－イル）－4－オキソブタノイル］オキシ｝ピロリジン－2，5－ジオン（1．10g，2．72mmol）、トリエチルアミン（1.94mL，14.0mmol）を加えた。反応溶液を減圧留去した後、得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム：メタノール＝100：0（v／v）～クロロホルム：メタノール＝90：10（v／v）］にて精製し、目的物(10-2)（0.410g，12％）を得た。
　MS(APCI、ESI)m/z:451(M+H)+
工程2：化合物(10-3)
　上記工程1にて得られた化合物(10-2)（0.050g，0.0499mmol）を、実施例2-1工程13と同様に反応させ、目的物(10-3)（0.0590g，82％）を得た。
　MS(APCI、ESI)m/z:1434(M+H)+
実施例54-2：ADC17
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000134
（実施例54-2工程1で得られる化合物は、上記式で示すようにトリアゾール環の幾何異性体を有し、上記Rとして示した2種類の構造からなる薬物リンカーを混合して保持する。）
工程1：抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション
　実施例15工程1にて得られた抗体のリン酸緩衝生理食塩水（pH6．0）溶液（10．0mg／mL，1.00mL）に、室温にて1，2－プロパンジオール（0．917mL）、実施例54-1工程2にて得られた化合物(10-3)を10mM含むジメチルスルホキシド溶液（0.0825mL；抗体1分子に対して12当量）を加え、チューブローテーター（MTR－103、アズワン株式会社）を用いて、室温にて48時間反応させた。
　精製操作：上記溶液を共通操作Dを用いて精製を行い、目的の化合物を有する溶液を6.0mL得た。
　特性評価：共通操作E、Fを用いて下記の特性値を得た。
　抗体濃度：1.63mg／mL，抗体収量：9.80mg（98％），抗体一分子あたりの薬物平均結合数（n）：1.8
実施例55-1：薬物リンカー8
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000135
工程1：化合物(11-2)
　実施例2-2工程11にて得られた化合物(4-11)（0.0500g，0.0499mmol）、出発物質(11-1)（0.050g，0.0499mmol，Alfa　Aesarより販売）、トリエチルアミン（0.00830mL，0.0599mmol）のジクロロメタン（3mL）溶液を室温にて一晩撹拌した。減圧留去した後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム：メタノール＝100：0（v／v）～クロロホルム：メタノール＝90：10（v／v）］にて精製し、目的物(11-2)（0.0490g，64％）を得た。
MS（APCI、ESI）m／z：1536（M＋H）＋
実施例55-2：ADC18
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000136
（実施例55-2工程1で得られる化合物は、上記式で示すようにトリアゾール環の幾何異性体を有し、得られたADCは上記Rとして示した2種類の構造からなる薬物リンカーを混合して保持する。）
工程1：抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション
　実施例15工程1にて得られた抗体のリン酸緩衝生理食塩水（pH6.0）溶液（10.0mg／mL，1.00mL）に、室温にて1，2－プロパンジオール（0.917mL）、実施例55-1工程1にて得られた化合物(11-2)を10mM含むジメチルスルホキシド溶液（0.0825mL；抗体1分子に対して12当量）を加え、チューブローテーター（MTR－103、アズワン株式会社）を用いて、室温にて48時間反応させた。
　精製操作：上記溶液を共通操作Dを用いて精製を行い、目的の化合物を有する溶液を6.0mL得た。
　特性評価：共通操作E、Fを用いて下記の特性値を得た。
　抗体濃度：1.72mg／mL，抗体収量：10.3mg（定量的），抗体一分子あたりの薬物平均結合数（n）：1.9
実施例56-1：薬物リンカー9
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000137
工程1：化合物(12-2)
　11，12－ジデヒドロ－5，6－ジヒドロジベンゾ[a,e][8]アヌレン－5－イル4－ニトロフェニルカルバメート(12-1)(0.437g,1.14mmol)，N，N－ジイソプロピルエチルアミン(0.198mL,1.14mmol)のN，N－ジメチルホルムアミド（6mL）溶液にグリシルグリシン(0.150g,1.14mmol)、水（3mL）を室温にて加え、室温にて一晩撹拌した。減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム：CMW＝100:0(v/v)～0:100(v/v)］にて精製し、目的物(12-2)(0.324g，75％）を得た。
　MS(APCI、ESI)m/z:378(M+H)+
工程2：化合物(8-3)
　上記工程1にて得られた化合物（12-2）(0.0306g,　0.0305mmol)と実施例2-2工程11で得られた化合物(4-11)を実施例2-1工程13と同様に反応させ、目的物(12-3)(0.0361g,　87%)を得た。
　MS(APCI、ESI)m/z:1362(M+H)+
実施例56-2：ADC19
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000138
（実施例56-2工程1でで得られる化合物は、上記式で示すようにトリアゾール環の幾何異性構造を有し、上記Rとして示した2種類の構造からなる薬物リンカーを混合して保持する。）
工程1：抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション
　実施例15工程1にて得られた抗体のリン酸緩衝生理食塩水（pH6.0）溶液（10.0mg／mL，1.00mL）に、室温にて1，2－プロパンジオール（0.917mL）、実施例56-1工程2にて得られた化合物(12-3)を10mM含むジメチルスルホキシド溶液（0.0825mL；抗体1分子に対して12当量）を加え、チューブローテーター（MTR－103、アズワン株式会社）を用いて、室温にて3日間反応させた。
　精製操作：上記溶液を共通操作Dを用いて精製を行い、目的の化合物を有する溶液を6.00mL得た。
　特性評価：共通操作E、Fを用いて下記の特性値を得た。
　抗体濃度：1.06mg／mL，抗体収量：6.35mg（63％），抗体一分子あたりの薬物平均結合数（n）：1.2
　本発明の抗体－薬物コンジュゲート、抗体及び／又はPBD誘導体等を用いることにより、各種がんの治療又は予防が可能となる。
配列番号1：ヒトCLDN6のアミノ酸配列
配列番号2：ヒトCLDN6のアミノ酸配列をコードするcDNAのヌクレオチド配列
配列番号3：ヒトCLDN9のアミノ酸配列
配列番号4：ヒトCLDN9のアミノ酸配列をコードするcDNAのヌクレオチド配列
配列番号5：B1抗体軽鎖のCDRL1のアミノ酸配列
配列番号6：B1抗体軽鎖のCDRL2のアミノ酸配列
配列番号7：B1抗体軽鎖のCDRL3のアミノ酸配列
配列番号8：ヒト化B1抗体軽鎖L4のCDRL3のアミノ酸配列
配列番号9：B1抗体重鎖のCDRH1のアミノ酸配列
配列番号10：B1抗体重鎖のCDRH2のアミノ酸配列
配列番号11：B1抗体重鎖のCDRH3のアミノ酸配列
配列番号12：C7抗体軽鎖のCDRL1のアミノ酸配列
配列番号13：C7抗体軽鎖のCDRL2のアミノ酸配列
配列番号14：C7抗体軽鎖のCDRL3のアミノ酸配列
配列番号15：C7抗体重鎖のCDRH1のアミノ酸配列
配列番号16：C7抗体重鎖のCDRH2のアミノ酸配列
配列番号17：C7抗体重鎖のCDRH3のアミノ酸配列
配列番号18：B1抗体軽鎖の可変領域をコードするcDNAのヌクレオチド配列
配列番号19：B1抗体軽鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号20：B1抗体重鎖の可変領域をコードするcDNAのヌクレオチド配列
配列番号21：B1抗体重鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号22：C7抗体軽鎖の可変領域をコードするcDNAのヌクレオチド配列
配列番号23：C7抗体軽鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号24：C7抗体重鎖の可変領域をコードするcDNAのヌクレオチド配列
配列番号25：C7抗体重鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号26：ヒト軽鎖シグナル配列及びヒトκ鎖定常領域をコードするDNA配列を含むDNA断片
配列番号27：ヒト重鎖シグナル配列及びヒトIgG1LALA定常領域をコードするDNA配列を含むDNA断片
配列番号28：chB1軽鎖のアミノ酸配列
配列番号29：chB1軽鎖のアミノ酸配列をコードするDNA配列を含むDNA断片
配列番号30：chB1軽鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号31：chB1軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列
配列番号32：chB1重鎖のアミノ酸配列
配列番号33：chB1重鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号34：chB1重鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号35：chB1重鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列
配列番号36：ヒト化抗体軽鎖hL1のアミノ酸配列
配列番号37：ヒト化抗体軽鎖hL1をコードするヌクレオチド配列
配列番号38：ヒト化抗体軽鎖hL1の可変領域のアミノ酸配列
配列番号39：ヒト化抗体軽鎖hL1の可変領域をコードするヌクレオチド配列
配列番号40：ヒト化抗体軽鎖hL2のアミノ酸配列
配列番号41：ヒト化抗体軽鎖hL2をコードするヌクレオチド配列
配列番号42：ヒト化抗体軽鎖hL2の可変領域のアミノ酸配列
配列番号43：ヒト化抗体軽鎖hL2の可変領域をコードするヌクレオチド配列　
配列番号44：ヒト化抗体軽鎖hL3のアミノ酸配列
配列番号45：ヒト化抗体軽鎖hL3をコードするヌクレオチド配列
配列番号46：ヒト化抗体軽鎖hL3の可変領域のアミノ酸配列
配列番号47：ヒト化抗体軽鎖hL3の可変領域をコードするヌクレオチド配列
配列番号48：ヒト化抗体軽鎖hL4のアミノ酸配列
配列番号49：ヒト化抗体軽鎖hL4をコードするヌクレオチド配列
配列番号50：ヒト化抗体軽鎖hL4の可変領域のアミノ酸配列
配列番号51：ヒト化抗体軽鎖hL4の可変領域をコードするヌクレオチド配列
配列番号52：ヒト化抗体重鎖hH1のアミノ酸配列
配列番号53：ヒト化抗体重鎖hH1をコードするヌクレオチド配列
配列番号54：ヒト化抗体重鎖hH1の可変領域のアミノ酸配列
配列番号55：ヒト化抗体重鎖hH1の可変領域をコードするヌクレオチド配列
配列番号56：ヒト化抗体重鎖hH2のアミノ酸配列
配列番号57：ヒト化抗体重鎖hH2をコードするヌクレオチド配列
配列番号58：ヒト化抗体重鎖hH2の可変領域のアミノ酸配列
配列番号59：ヒト化抗体重鎖hH2の可変領域をコードするヌクレオチド配列
配列番号60：ヒト化抗体重鎖hH3のアミノ酸配列
配列番号61：ヒト化抗体重鎖hH3をコードするヌクレオチド配列
配列番号62：ヒト化抗体重鎖hH3の可変領域のアミノ酸配列
配列番号63：ヒト化抗体重鎖hH3の可変領域をコードするヌクレオチド配列
配列番号64：Trastuzumab軽鎖のアミノ酸配列
配列番号65：Trastuzumab重鎖のアミノ酸配列
配列番号66：抗LPS抗体（h#1G5-H1L1）軽鎖のアミノ酸配列
配列番号67：抗LPS抗体（h#1G5-H1L1）重鎖のアミノ酸配列
配列番号68：抗TROP2抗体（hRS7）軽鎖のアミノ酸配列
配列番号69：抗TROP2抗体（hRS7）重鎖のアミノ酸配列
配列番号70：抗CD98抗体（hM23-H1L1）軽鎖のアミノ酸配列
配列番号71：抗CD98抗体（hM23-H1L1）重鎖のアミノ酸配列
配列番号72：Trastuzumab変異体軽鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号73：Trastuzumab変異体軽鎖のアミノ酸配列
配列番号74：Trastuzumab変異体重鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号75：Trastuzumab変異体重鎖のアミノ酸配列
配列番号76：Trastuzumab変異体2軽鎖のアミノ酸配列
配列番号77：Trastuzumab変異体2重鎖のアミノ酸配列

Claims (49)

  1. 　次式；
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式中、m1は1又は2の整数を示し、
    　Dは、以下の群から選択されるいずれか一つであり、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     　式中、アステリスク＊はLと結合していることを示し、
    　Lは、AbのAsn297に結合する糖鎖（N297糖鎖）とDを連結するリンカーであり、
    　N297糖鎖はリモデリングされていてもよく、
    　Abは、抗体又は該抗体の機能性断片であることを示す。）
    で示される抗体－薬物コンジュゲート。
  2. 　Lは、-Lb-La-Lp-NH-B-CH2-O(C=O)-＊で示され、
    　ここで、式中、アステリスク＊はDと結合していることを示し、
    　Bは、1，4-フェニル基、2, 5-ピリジル基、3，6-ピリジル基、2，5-ピリミジル基又は2，5-チエニル基であり、
    　Lpは、以下の群；
    -GGVA-、-GG-(D-)VA-、-VA-、-GGFG-、-GGPI-、-GGVCit-、-GGVK-、及び、-GGPL-、
    から選択されるいずれか一つを示し、
    　Laは、以下の群；
    -C(=O)-CH2CH2-C(=O)-、-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-、
    -C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-、
    -C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-、
    -C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-、-CH2-OC(=O)-、及び、-OC(=O)-、
    から選択されるいずれか一つを示し、ならびに、
    　Lbは、次式で示され、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     、又は、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     　ここで、上記で示されるLbの構造式において、アステリスク＊はLaと結合していることを示し、波線はN297糖鎖又はリモデリングされたN297糖鎖と結合していることを示す、請求項1に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  3. 　Lが、以下の群;
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GG-(D-)VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
    -Z1-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGPI-NH-B-CH2-OC(=O)-、
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-B-CH2-OC(=O)-、
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-B-CH2-OC(=O)-、
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVK-NH-B-CH2-OC(=O)-、
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGPL-NH-B-CH2-OC(=O)-、
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
    -Z2-OC(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-、及び
    -Z3-CH2-OC(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-
    から選択されるいずれか一つを示し、
    　ここで、Bは、1，4－フェニル基を示し、
    　Z1は、以下の構造式；
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     を示し、
    　Z2は、以下の構造式；
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
     を示し、
    　Z3は、以下の構造式；
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
     を示し、
    　ここで、Z1、Z2及びZ3の構造式において、アステリスク＊は隣接するC(=O)、OC(=O)又はCH2と結合していることを示し、波線はN297糖鎖又はリモデリングされたN297糖鎖と結合していることを示す、請求項1又は2に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  4. 　Lが、以下の群；
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
    -Z1-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-B-CH2-OC(=O)-、
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、及び、
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-
    から選択されるいずれか一つを示し、
    　ここで、Bは1，4－フェニル基であり、
    　Z1は以下の構造式；
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
     を示し、
    　ここで、上記Z1の構造式において、アステリスク＊はZ1に隣接するC(=O)と結合していることを示し、波線はN297糖鎖又はリモデリングされたN297糖鎖と結合していることを示す、請求項3に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  5. 　N297糖鎖が、リモデリングされた糖鎖である、請求項1～4のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  6. 　N297糖鎖が、次式で示される構造を有するN297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2もしくはそれらの混合物、又はN297-(Fuc)SGのいずれかであることを示す、請求項1～5のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート；
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
     　上記式中、波線は抗体のAsn297に結合していることを示し、
    　N297糖鎖中のL(PEG)は、＊-(CH2CH2-O)n5- CH2CH2-NH-を示し、
    　ここで、n5は2～5の整数であることを示し、右端のアミノ基がN297糖鎖のβ-Manの分岐鎖の1-3鎖側又は／及び1-6鎖側の非還元末端のシアル酸の2位のカルボン酸とアミド結合を介して結合しており、左端のアステリスク＊は、LにおけるZ1のトリアゾール環上の1位又は3位の窒素原子と結合していることを示す。
  7. 　n5が3である、請求項6に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  8. 　次式；
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
     　（上記で示されるそれぞれの構造式において、m1は1又は2の整数であることを示し、
    　Abは、抗体又は該抗体の機能性断片であり、
    　N297糖鎖は次式で示される構造を有するN297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2もしくはそれらの混合物、又はN297-(Fuc)SGであり、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
     　式中、波線は抗体のAsn297に結合していることを示し、
    　N297糖鎖中のL(PEG)は、＊-(CH2CH2-O)3-CH2CH2-NH-であることを示し、
    　ここで、右端のアミノ基がN297糖鎖のβ-Manの分岐鎖の1-3鎖側又は／及び1-6鎖側の非還元末端のシアル酸の2位のカルボン酸とアミド結合を介して結合しており、左端のアステリスク＊は、上記構造式中のトリアゾール環上の1位又は3位の窒素原子と結合していることを示す）で示される抗体－薬物コンジュゲート。
  9. 　次式；
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
     　（上記で示されるそれぞれの構造式において、m1は1又は2の整数であることを示し、
    　Abは、抗体又は該抗体の機能性断片であり、
    　N297糖鎖は次式で示される構造を有するN297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2もしくはそれらの混合物、又はN297-(Fuc)SGであり、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
     　式中、波線は抗体のAsn297に結合していることを示し、
    　N297糖鎖中のL(PEG)は、＊-(CH2CH2-O)3-CH2CH2-NH-であることを示し、
    　ここで、右端のアミノ基がN297糖鎖のβ-Manの分岐鎖の1-3鎖側又は／及び1-6鎖側の非還元末端のシアル酸の2位のカルボン酸とアミド結合を介して結合しており、左端のアステリスク＊は、上記構造式中のトリアゾール環上の1位又は3位の窒素原子と結合していることを示す）で示される抗体－薬物コンジュゲート。
  10. 　次式；
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
     　（上記で示されるそれぞれの構造式において、m1は1又は2の整数であることを示し、
    　Abは、抗体又は該抗体の機能性断片であり、
    　N297糖鎖は次式で示される構造を有するN297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2もしくはそれらの混合物、又はN297-(Fuc)SGであり、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
     　式中、波線は抗体のAsn297に結合していることを示し、
    　N297糖鎖中のL(PEG)は、＊-(CH2CH2-O)3-CH2CH2-NH-であることを示し、
    　ここで、右端のアミノ基がN297糖鎖のβ-Manの分岐鎖の1-3鎖側又は／及び1-6鎖側の非還元末端のシアル酸の2位のカルボン酸とアミド結合を介して結合しており、左端のアステリスク＊は、上記構造式中のトリアゾール環上の1位又は3位の窒素原子と結合していることを示す）で示される抗体－薬物コンジュゲート。
  11. 　次式；
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
     （上記で示されるそれぞれの構造式において、m1は1又は2の整数であることを示し、
    　Abは、抗体又は該抗体の機能性断片であり、
    　N297糖鎖は次式で示される構造を有するN297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2もしくはそれらの混合物、又はN297-(Fuc)SGであり、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
     　式中、波線は抗体のAsn297に結合していることを示し、
    　N297糖鎖中のL(PEG)は、＊-(CH2CH2-O)3-CH2CH2-NH-であることを示し、
    　ここで、右端のアミノ基がN297糖鎖のβ-Manの分岐鎖の1-3鎖側又は／及び1-6鎖側の非還元末端のシアル酸の2位のカルボン酸とアミド結合を介して結合しており、左端のアステリスク＊は、前記構造式中のトリアゾール環上の1位又は3位の窒素原子と結合していることを示す）で示される抗体－薬物コンジュゲート。
  12. 　内在化活性を有する抗体を含むことを特徴とする、請求項1～11のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  13. 　腫瘍細胞に発現している抗原に結合し、腫瘍細胞内に取り込まれて内在化する性質を有する抗体である、請求項1～12のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  14. 　抗体が、抗腫瘍効果を有することを特徴とする、請求項1～13のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  15. 　抗体が、抗CLDN6抗体、抗CLDN9抗体、抗CLDN6/CLDN9抗体、抗HER2抗体、抗HER3抗体、抗DLL3抗体、抗FAP抗体、抗CDH11抗体、抗A33抗体、抗CanAg抗体、抗CD19抗体、抗CD20抗体、抗CD22抗体、抗CD25抗体、抗CD30抗体、抗CD33抗体、抗CD37抗体、抗CD56抗体、抗CD70抗体、抗CD98抗体、抗B7-H3抗体、抗TROP2抗体、抗CEA抗体、抗Cripto抗体、抗EphA2抗体、抗FGFR2抗体、抗G250抗体、抗MUC1抗体、抗GPNMB抗体、抗Integrin抗体、抗PSMA抗体、抗Tenascin－C抗体、抗SLC44A4抗体、抗Mesothelin抗体、抗EGFR抗体、抗5T4抗体、抗LRRC15抗体、抗DR5抗体、抗CDH3抗体、抗PDPN 抗体、又は抗CD123抗体である、請求項1～14のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。　
  16. 　抗体が、CLDN6及び／又はCLDN9に特異的に結合することを特徴とする、請求項1～15のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  17. 　抗体が、以下の（a）又は（b）に記載のCDRH1、CDRH2及びCDRH3を含む重鎖、並びに、CDRL1、CDRL2及びCDRL3を含む軽鎖を含んでなる、請求項16に記載の抗体－薬物コンジュゲート；
    （a）配列番号9に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号10に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号11に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、並びに、配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号6に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号7に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において1又は2個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるCDRL3、又は、
    （b）配列番号15に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号16に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号17に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、並びに、配列番号12に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号13に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号14に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3。
  18. 　抗体が、以下の（a）又は（b）に記載のCDRH1、CDRH2及びCDRH3を含む重鎖、並びに、CDRL1、CDRL2及びCDRL3を含む軽鎖を含んでなる、請求項17に記載の抗体－薬物コンジュゲート；
    （a）配列番号9に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号10に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号11に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、及び、配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号6に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号7に記載のアミノ酸配列又は配列番号8に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3、又は、
    （b）配列番号15に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号16に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号17に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、及び、配列番号12に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号13に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号14に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3。
  19. 　抗体が、以下の（a）又は（b）に記載の重鎖可変領域、及び、軽鎖可変領域を含む、請求項16～18のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート；
    （a）抗体が、配列番号21に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列番号19に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、又は、
    （b）抗体が、配列番号25に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列番号23に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域。
  20. 　以下の（a）～（e）からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び（f）～（k）からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、請求項16～19のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート；
    （a）配列番号54に記載のアミノ酸配列、
    （b）配列番号58に記載のアミノ酸配列、
    （c）配列番号62に記載のアミノ酸配列、
    （d）（a）～（c）の配列において各CDR配列以外のフレームワーク領域の配列に対して少なくとも95％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
    （e）（a）～（c）の配列における各CDR配列以外のフレームワーク領域の配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列、
    （f）配列番号38に記載のアミノ酸配列、
    （g）配列番号42に記載のアミノ酸配列、
    （h）配列番号46に記載のアミノ酸配列、
    （i）配列番号50に記載のアミノ酸配列、
    （j）（f）～（i）の配列において各CDR配列以外のフレームワーク領域の配列に対して少なくとも95％以上の相同性を有するアミノ酸配列、及び、
    （k）（f）～（i）の配列における各CDR配列以外のフレームワーク領域の配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列。
  21. 　抗体が、以下の（a）～（e）からなる群から選択される重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、請求項20に記載の抗体－薬物コンジュゲート；
    （a）配列番号54に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域および配列番号38に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
    （b）配列番号58に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域および配列番号42に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
    （c）配列番号54に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域および配列番号46に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
    （d）配列番号58に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域および配列番号50に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域からなる軽鎖可変領域、及び、
    （e）配列番号62に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域および配列番号46に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域。
  22. 　抗体が、キメラ抗体である、請求項16～21のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  23. 　抗体が、ヒト化抗体である、請求項16～21のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  24. 　抗体が、ヒトIgG1、ヒトIgG2又はヒトIgG4の重鎖定常領域を含む、請求項16～23のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  25. 　以下の（a）～（e）からなる群から選択される重鎖及び軽鎖を含む、請求項23又は24に記載の抗体－薬物コンジュゲート；
    （a）配列番号52のアミノ酸番号20～471に記載のアミノ酸配列からなる重鎖および配列番号36のアミノ酸番号21～234に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
    （b）配列番号56のアミノ酸番号20～471に記載のアミノ酸配列からなる、重鎖および配列番号40のアミノ酸番号21～234に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
    （c）配列番号52のアミノ酸番号20～471に記載のアミノ酸配列からなる重鎖および配列番号44のアミノ酸番号21～234に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
    （d）配列番号56のアミノ酸番号20～471に記載のアミノ酸配列からなる重鎖および配列番号48のアミノ酸番号21～234に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、及び、
    （e）配列番号60のアミノ酸番号20～471に記載のアミノ酸配列からなる重鎖および配列番号44のアミノ酸番号21～234に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖。
  26. 　抗体が、請求項17～21及び25のいずれか一項に記載の抗体と、CLDN6及び／又はCLDN9への結合において競合するか、又は、請求項17～21及び25のいずれか一項に記載の抗体が認識するCLDN6及び／又はCLDN9上の部位に結合する、請求項16に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  27. 　抗体が、HER2に特異的に結合する、請求項1～15のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  28. 　抗体依存性細胞傷害（ADCC）活性及び／又は補体依存性細胞傷害（CDC）活性を有する、請求項27に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  29. 　抗体の重鎖定常領域がヒトIgG1の重鎖定常領域であり、ADCC及び／又はCDC活性の低減をもたらす変異を含む、請求項27に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  30. 　抗体の重鎖定常領域がヒトIgG1の重鎖定常領域であり、該重鎖定常領域においてEU Indexにより示される234位及び235位のロイシンがアラニンに置換されている、請求項29に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  31. 　配列番号65に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号64に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を含んでなる抗体である、請求項27又は28に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  32. 　配列番号75のアミノ酸番号20～139に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号73のアミノ酸番号21～127に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗体である、請求項27、29及び30のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  33. 　配列番号75のアミノ酸番号20～469に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号73のアミノ酸番号21～234に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗体である、請求項27、29、30及び32のいずれかに一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  34. 　抗体が、N－結合型糖鎖付加、O－結合型糖鎖付加、N末のプロセッシング、C末のプロセッシング、脱アミド化、アスパラギン酸の異性化、メチオニンの酸化、N末におけるメチオニン残基の付加、プロリン残基のアミド化、及び重鎖のカルボキシル末端における1つ又は2つのアミノ酸残基の欠失からなる群より選択される1又は2以上の修飾を含む、請求項16～33のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  35. 　抗体の重鎖のカルボキシル末端において1つ又は数個のアミノ酸残基が欠失している、請求項34に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  36. 　抗体の2本の重鎖の双方のカルボキシル末端において1つのアミノ酸残基が欠失している、請求項34又は35に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  37. 　抗体の重鎖のカルボキシル末端のプロリン残基が更にアミド化されている、請求項34～36のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  38. 　抗体が、以下の工程で得られることを特徴とする糖鎖リモデリング抗体である、請求項1～37のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート；
    　i）請求項12～37のいずれか一項に記載の抗体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養し、得られた培養物から目的の抗体を採取する工程、
    　ii）工程i）で得られた抗体を加水分解酵素で処理し、(Fucα1,6)GlcNAc－抗体を製造する工程、及び、
    　iii）MSG(9)又はSG(10)のシアル酸の2位のカルボン酸のカルボニル基にアジド基を有するPEGリンカーを導入し、還元末端をオキサゾリン化して得た糖鎖ドナー分子と、糖転移酵素存在下で(Fucα1,6)GlcNAc－抗体を反応させる工程。
  39. 　更に、工程ii）の反応液を、ハイドロキシアパタイトカラムによる精製により(Fucα1,6)GlcNAc－抗体を精製する工程を含む、請求項38に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  40. 　次式；
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
     で示されるいずれか一つの化合物、その塩、又はそれらの水和物。
  41. 　請求項38又は39に記載の糖鎖リモデリング抗体を請求項40に記載の化合物、その塩、又はそれらの水和物と反応させる工程を含む、請求項1～39のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲートの製造方法。
  42. 　請求項41に記載の製造方法で得られることを特徴とする、抗体－薬物コンジュゲート。
  43. 　N297糖鎖が、N297-(Fuc)MSG1である、請求項1～39及び42のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  44. 　m1が、1の整数である、請求項1～39、42及び43のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  45. 　抗体―薬物コンジュゲートにおける抗体1分子あたりの平均薬物結合数が、1～3又は3～5である、請求項1～39及び42～44のいずれか一項に記載の抗体―薬物コンジュゲート。
  46. 　請求項1～39及び42～45のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート、その塩、又はそれらの水和物を含むことを特徴とする医薬組成物。
  47. 　抗腫瘍薬であることを特徴とする、請求項46に記載の医薬組成物。
  48. 　請求項1～39及び42～45のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート、その塩、又はそれらの水和物を個体に投与することを特徴とする腫瘍の治療方法。
  49. 　請求項1～39及び42～45のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート、その塩、又はそれらの水和物を含む医薬組成物、及び少なくとも一つの抗腫瘍薬を、同時に、別々に又は連続して個体に投与することを特徴とする腫瘍の治療方法。
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