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KR100952805B1 - 신규 미세 조류 및 탄화수소의 생산 방법 - Google Patents

신규 미세 조류 및 탄화수소의 생산 방법 Download PDF

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KR100952805B1
KR100952805B1 KR1020077026214A KR20077026214A KR100952805B1 KR 100952805 B1 KR100952805 B1 KR 100952805B1 KR 1020077026214 A KR1020077026214 A KR 1020077026214A KR 20077026214 A KR20077026214 A KR 20077026214A KR 100952805 B1 KR100952805 B1 KR 100952805B1
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히로시 세키구치
아키라 사토
사토루 마츠다
교코 아다치
미카 아츠미
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가부시키가이샤 덴소
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Abstract

본 발명은, 디젤 연료(경유)의 대체 연료로서 이용할 수 있는 탄화수소를 생산하는 신규의 미세 조류를 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명은, 탄화수소 생산 능력을 가진 신규 미세 조류 슈도코리시스티스 엘립소이디아(Pseudochoricystis ellipsoidea), 및 슈도코리시스티스(Pseudochoricystis) 속(屬) 또는 코리시스티스(Choricystis) 속(屬)에 속하며, 탄화수소 생산 능력을 가진 미세 조류를 배양하여, 배양물로부터 탄화수소를 채취하는 것을 특징으로 하는 탄화수소의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

신규 미세 조류 및 탄화수소의 생산 방법{NOVEL MICROALGAE AND PROCESS FOR PRODUCING HYDROCARBON}
본 발명은 탄화수소 생산 능력을 가진 신규 미세 조류(微細藻類) 및 미세 조류를 이용하는 탄화수소의 생산 방법에 관한 것이다.
지금까지 탄화수소 생산 능력을 가진 세균에 대해서 몇 개의 보고가 있다. 예를 들면, 탄소원(炭素源)을 기질로 해서 C14∼C22의 n-알칸을 생산하는 비브리오 퍼니시(Vibrio furnissii) M1(FERM P-18382)(M.-O. Park, M. Tanabe, K. Hirata, K. Miyamoto, Isolation and characterization of a bacterium that produces hydrocarbons extracellularly which are equivalent to light oil, Appl Microbiol Biotechnol 56(2001), 448-452; 일본국 특개 2003-229호 공보), 이산화탄소를 고정해서 n-테트라데칸이나 n-헥사데칸 등을 생산하는 슈도모나스 아나에로올레오필라(Pseudomonas anaerooleophila) HD-1(FERM P-14035) 등이 있다(일본국 특개평 7-194386호 공보). 그러나, 이들 균주(菌株)는 탄화수소 생산에 유기물을 필요로 하거나, 증식 능력이나 생산 능력이 만족할 만한 레벨이 아니다. 또한, 혐기(嫌氣)적 조건 하에서 알칸류를 분해 또는 이산화탄소를 고정해서 알칸류를 생산하는 클레브시엘라 아나에로올레오필라(Klebsiella anaerooleophila) TK-122(FERM P-16920)도 알려져 있는데(일본국 특개 2000-125849호 공보), 이 균주는 분해와 생산을 동시에 하기 때문에, 탄화수소의 네트(net)의 생산 능력은 낮다. 또한, 산소가 없는 조건으로만 탄화수소 생산이 확인되고 있기 때문에, 통상적인 공기 조건 하에서 탄화수소를 생산시키기 위해서는, 산소를 차단하기 위한 특수한 배양 장치, 생산 장치를 필요로 한다.
한편, 미세 조류는 CO2(무기 탄소)와 광 에너지와 물이 있으면 광합성을 하여 CO2로부터 탄화수소를 함유하는 유기물을 생산할 수 있다. 직쇄상(直鎖狀) 탄화수소를 기름 방울로 해서 세포 내외에 축적하는 주(株)로서는 Botryococcus braunii가 알려져 있다(Metzger and Largeau, Botryococcus braunii: a rich source for hydrocarbons and related ether lipids, Appl. Microbiol. Biotechnol 66(2005)). Botryococcus의 특징은, 중유에 상당(탄소수 30 이상)하거나, 혹은 더욱 장쇄(長鎖: long-chain)의 탄화수소를 축적하는 점에 있다. 그러나 이 Botryococcus 외의 미세 조류로 직쇄상 탄화수소를 현저하게 축적하는 예는 알려져 있지 않다.
본 발명의 목적은 CO2를 원료로 해서 탄화수소, 특히, 디젤 연료(경유)의 대체 연료로서 이용할 수 있는, 탄소수 10∼25의 범위의 탄화수소를 생산하는 신규의 미세 조류를 제공하는 것에 있다.
발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해, 일본국 내의 각지의 담수 샘플을 수집하여, 스크리닝(screening)을 한 결과, 탄화수소 생산 능력을 가진 신규 미세 조류를 분리하는 것에 성공하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 이하의 발명을 포함한다.
(1) 탄화수소 생산 능력을 가진 신규 미세 조류 슈도코리시스티스 엘립소이디아(Pseudochoricystis ellipsoidea).
(2) 탄화수소 생산 능력을 가진 신규 미세 조류 슈도코리시스티스 엘립소이디아 세키구치 엣 구라노 젠 엣 에스피 노브(Pseudochoricystis ellipsoidea Sekiguchi et Kurano gen. et sp. nov.) MBIC11204주(株).
(3) 탄화수소 생산 능력을 가진 신규의 미세 조류 슈도코리시스티스 엘립소이디아 세키구치 엣 구라노 젠 엣 에스피 노브(Pseudochoricystis ellipsoidea Sekiguchi et Kurano gen. et sp. nov.) MBIC11220주.
(4) (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 있어서, 탄화수소가 탄소수 10∼25의 포화 또는 불포화 지방족 탄화수소인 신규 미세 조류.
(5) 슈도코리시스티스(Pseudochoricystis) 속(屬)에 속하고, 탄화수소 생산 능력을 가진 미세 조류를 배양하여, 배양물로부터 탄화수소를 채취하는 것을 특징으로 하는 탄화수소의 제조 방법.
(6) (5)에 있어서, 미세 조류가 슈도코리시스티스 엘립소이디아 세키구치 엣 구라노 젠 엣 에스피 노브(Pseudochoricystis ellipsoidea Sekiguchi et Kurano gen. et sp. nov.) MBIC11204주인 방법.
(7) (5)에 있어서, 미세 조류가 슈도코리시스티스 엘립소이디아 세키구치 엣 구라노 젠 엣 에스피 노브(Pseudochoricystis ellipsoidea Sekiguchi et Kurano gen. et sp. nov.) MBIC11220주인 방법.
(8) 코리시스티스(Choricystis) 속(屬)에 속하고, 탄화수소 생산 능력을 가진 미세 조류를 배양하여, 배양물로부터 탄화수소를 채취하는 것을 특징으로 하는 탄화수소의 제조 방법.
(9) (8)에 있어서, 미세 조류가 코리시스티스 마이너(Choricystis minor) SAG251-1주, 또는 코리시스티스 마이너(Choricystis minor) SAG17.98주인 방법.
(10) (5) 내지 (9) 중 어느 하나에 있어서, 탄화수소가 탄소수 10∼25의 포화 또는 불포화 지방족 탄화수소인 방법.
(11) (5) 내지 (10) 중 어느 하나에 있어서, 배양을 질소 결핍 조건 하에서 실행하는 방법.
본 발명에 따르면, 탄화수소 생산 능력을 가진 신규 미세 조류가 제공된다. 본 발명의 미세 조류를 이용함으로써, 기존의 화석 연료의 대체가 되는 바이오 연료(바이오 디젤), 윤활유, 플라스틱·합성 섬유·도료 등의 공업 원료로서 사용할 수 있는 탄화수소의 생산이 가능해진다. 본 발명의 미세 조류를 이용하는 탄화수소 생산은 광합성에 의해 실행되기 때문에, 지구 온난화의 원인이 되는 이산화탄소 배출량을 경감할 수 있어, 환경 부하가 없다.
도 1은 MBIC11204주의 광학 현미경 사진을 나타낸다(검은 선은 1㎛를 나타냄).
도 2는 MBIC11204주의 극박(極薄) 절편(切片) 사진을 나타낸다(검은 선은 1㎛를 나타냄. C: 엽록체, V: 액포(液胞)).
도 3은 4분 포자(四分胞子)에 의해 생식하는 MBIC11204주의 극박(ultra-thin) 절편 사진을 나타낸다(검은 선은 1㎛을 나타냄).
도 4는 이분열에 의해 증식하는 MBIC11204주의 광학 현미경 사진을 나타낸다(검은 선은 1㎛를 나타냄).
도 5는 MBIC11204주의 형광 현미경 사진을 나타낸다(위의 도면: 명시야(Bright Field), 아래 도면: 형광시야(fluorescence field), 밝은 형광 발색(發色): Nile Red에 의해 발색한 세포 내의 기름 방울, 어둑한 부분: 엽록체의 자가(自家) 형광).
도 6은 Nile Red 염색한 MBIC11204주의 형광 패턴(여기(勵起) 파장 488nm)을 나타낸다.
도 7은 녹색 식물에 있어서의 분자 계통수(分子系統樹)(18S rDNA 부분 서열, NJ법)를 나타낸다.
도 8은 녹색 식물 전체의 분자 계통수(rbcL 부분 서열, NJ법)를 나타낸다. 외집단(out-group)으로서 3주의 시아노박테리아(cyanobacteria)를 이용했다.
도 9는 MBIC11204주의 질소 충분 조건(왼쪽)과 질소 결핍 조건(오른쪽)의 세포의 광학 현미경 사진을 나타낸다. 질소 결핍 조건에서 현저한 기름 성분의 축적이 확인된다.
도 10은 질소 결핍 조건 이행 후의 기름 성분 증가 곡선을 나타낸다. 가로 축은 질소 결핍 조건 이행 후의 경과 시간, 세로 축은 단위 세포당의 Nile red의 형광 강도를 나타낸다. Nile red 형광은 기름 성분 함량의 지표이다.
도 11은 MBIC11204주의 건조 중량을 지표로 한 증식 곡선을 나타낸다.
도 12는 MBIC11204주의 pH에 대한 증식 특성을 나타낸다(흰 도형: 증식, 검은 도형: pH).
도 13은 코리시스티스에 속하는 주(SAG251-1주, SAG17.98주)의 형광 현미경 사진을 나타낸다(적색: 엽록체의 자가 형광, 노란 입자: Nile Red에 의해 발색한 기름 방울).
도 14는 720nm에서의 흡광도를 지표로 한 MBIC11220주와 MBIC11204주의 증식 곡선을 나타낸다(능형(菱形): MBIC11220주, 사각: MBIC11204주).
도 15는 MBIC11220주의 광학 현미경 사진을 나타낸다(검은 선은 10㎛를 나타냄).
이하, 본 발명을 상세히 설명한다. 본원은 2005년 4월 12일에 출원된 일본국 특허출원 2005-114404호의 우선권을 주장하는 것이며, 그 특허출원의 명세서 및/또는 도면에 기재된 내용을 포함한다.
1. 탄화수소 생산 능력을 가진 신규 미세 조류
본 발명에 따르면, 탄화수소 생산 능력을 가진 신규 미세 조류 슈도코리시스티스 엘립소이디아(Pseudochoricystis ellipsoidea)가 제공된다.
이러한 미생물의 예로서는, 본 발명자들이 담수 샘플로부터 분리한 슈도코리시스티스 엘립소이디아 세키구치 엣 구라노 젠 엣 에스피 노브(Pseudochoricystis ellipsoidea Sekiguchi et Kurano gen. et sp. nov.) MBIC11204주, 슈도코리시스티스 엘립소이디아 세키구치 엣 구라노 젠 엣 에스피 노브(Pseudochoricystis ellipsoidea Sekiguchi et Kurano gen. et sp. nov.) MBIC11220주를 들 수 있다.
상기의 미세 조류주는 일본국 내의 각지에서 온천수를 채취하고, 그 30밀리리터에 아래의 표 1에 나타내는 조성을 가진 IMK 배지(일본제약 제조)를 첨가하여, 형광등의 광조사(光照射) 하에서, 약 20℃에서 정치(靜置) 배양한 샘플을 현미경 하에서 관찰함으로써 선출했다.
Figure 112007080774063-pct00001
MBIC11204주의 조류학적 성질은 이하와 같다.
A. 형태적 성질
(1) 영양형 세포는 타원형 또는 약간 구부러진 신장형(腎臟形)으로 양단은 둥글다. 단경(短徑)은 1∼2㎛, 장경(長徑)은 3∼4㎛이다(도 1). 편모(鞭毛)를 가지지 않아 운동성을 나타내지 않는다. 알카리성에서는 세포가 응집한다.
(2) 영양형 세포는, 외위(外圍)가 세포벽으로 둘러싸여 있고, 내부에 핵과 엽록체가 각 한 개 존재하며, 그 외, 미토콘드리아, 골지체, 액포, 기름 방울 등이 관찰된다. 엽록체 내에 피레노이드(pyrenoid)는 관찰되지 않는다(도 2).
B. 생식 양식
(1) 내생 포자(內生胞子)는 영양세포 내에 4개가 형성되어(도 3), 세포 내에 균등하게 분포된다. 내생 포자는 그 세포 내에 핵과 엽록체를 각 1개 가진다.
(2) 이분열(binary fission)에 의한 증식도 실행한다(도 4).
C. 생리학·생화학 성상(性狀)
(1) 배양액: 담수를 원료로 한 배양액 중에서 생육할 수 있다.
(2) 광합성 능력: 광합성에 의한 광독립(光獨立) 영양생육을 할 수 있다.
(3) 함유 색소: 클로로필 a, 클로로필 b 및 기타 카로티노이드류.
(4) 동화(同化) 저장 물질: 전분.
(5) 생육 온도 영역: 15℃∼30℃(최적 온도 25℃).
(6) 생육 pH 영역: pH 6.0∼10.0(최적 pH는 7.0).
(7) 세포 내에 존재하는 기름 방울은 Nile red에 의한 형광 염색으로 오렌지색의 형광을 나타낸다(도 5). 도 6은 Nile red 염색된 MBIC11204주의 전형적인 중성 지방질의 형광 패턴을 나타낸다.
상기와 같이, MBIC11204주는 타원형 또는 약간 구부러진 신장형의 형상을 가지며, 주요 광합성 색소로서 클로로필 a, 클로로필 b를 함유하고 있다. 또한, 유주(遊走)세포의 스테이지를 가지지 않고, 이분열 또는 4분 포자의 형성에 의해 생식을 한다. 또한, 피레노이드가 빠진 엽록체를 가진다.
이상의 관점에서, MBIC11204주는 형태학적으로는 기지의 트레복시아(Trebouxia) 조강(藻綱)의 Choricystis 속(屬)에 잘 일치하여, Choricystis 속(屬)에 속한다고 추측되었다. 그런데, 18S rDNA 유전자를 지표로 한 분자 계통 해석을 한 결과, 기지의 Choricystis 속(屬)과는 유연관계(類緣關係)를 나타내지 않았다(도 7). 한편, Rubisco large subunit 유전자(rbcL)의 부분 서열을 지표로 한 분자 계통 해석에서는, MBIC11204주는 녹색 식물 전체의 근원에 위치하는 것이 밝혀졌다(도 8). MBIC11204주의 18S rDNA 유전자의 염기서열을 서열표의 서열번호 1에 나타내고, 또한, Rubisco large subunit 유전자(rbcL)의 염기서열을 서열표의 서열번호 2에 나타낸다. 동일한 해석으로, Choricystis 속(屬)은 일단의 클레이드(clade)를 만들고 있으며, 그 클레이드와는 멀리 떨어진 위치에 MBIC11204주가 존재한다. 또한, 트레복시아 조강(藻綱)의 타입주나 Chlorella 속(屬)과도 완전히 멀리 떨어져 있다.
그리하여 MBIC11204주를, (i) 형태적으로는 Choricystis 속(屬)과 유사하지만 18S rDNA 유전자의 계통 해석에서는 Choricystis 속(屬)에 속하지 않고, (ii) rbcL 유전자에 의한 계통 해석에서는 녹색 식물의 근원에 위치하며, (iii) 직쇄상 탄화수소를 함유하는 것을 특징으로 하는, 새로운 속(屬)의 신종(新種)의 미세 조류주라고 판단하여, 슈도코리시스티스 엘립소이디아 세키구치 엣 구라노 젠 엣 에스피 노브(Pseudochoricystis ellipsoidea Sekiguchi et Kurano gen. et sp. nov.) MBIC11204 주라고 명명하였다. 속명(屬名)은 Choricystis 속(屬)과 형태적으로 유사하다는 의미이고, 종명(種名)은, 세포의 형태가 회전 타원체인 것에서 유래한다.
한편, MBIC11220주도 또한 MBIC11204주와 마찬가지의 타원형 또는 약간 구부러진 신장형의 형상을 가지며(도 15), 기타의 조류학적 성질도 일치했다. 또한, MBIC11220주의 18S rDNA 유전자의 염기서열(서열표의 서열번호 3), Rubisco large subunit유전자(rbcL)의 염기서열(서열표의 서열번호 4)을 결정하고, 마찬가지로 해서 18S rDNA 유전자를 지표로 한 분자 계통 해석, 및 Rubisco large subunit 유전자(rbcL)의 부분 서열을 지표로 한 분자 계통 해석을 실행했다. 그것들의 분자 계통 해석과 직쇄상 탄화수소의 생산의 면에 있어서도, MBIC11204주가 가진 상기 (i)∼ (iii)의 특징과 일치했다. 그리하여, MBIC11220주도 또한 새로운 속(屬)의 신종의 미세 조류주라고 판단하여, 슈도코리시스티스 엘립소이디아 세키구치 엣 구라노 젠 엣 에스피 노브(Pseudochoricystis ellipsoidea Sekiguchi et Kurano gen. et sp. nov.) MBIC11220주라고 명명하였다.
MBIC11204주는, 2005년 2월 15일에 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(IPOD: International Patent Organism Depositary)(이바라키현 츠쿠바시 히가시 1죠메 1번지 1 중앙 제6)에 수탁 번호 FERM P-20401로 기탁되어, 2006년 1월 18일에 부다페스트 조약의 규정 하에서 수탁 번호 FERM BP-10484로 국제기탁에 이관되어 있다.
또한, MBIC11220주는, 2006년 1월 18일에 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(IPOD)(이바라키현 츠쿠바시 히가시 1죠메 1번지 1 중앙 제6)에 부다페스트 조약의 규정 하에 수탁 번호 FERM BP-10485로 국제기탁 되어 있다.
2. 미세 조류를 이용하는 탄화수소의 제조 방법
MBIC11204주는 가스 크로마토그래피 질량분석(GC-MS)의 결과, 9종류의 탄화수소를 생산하는 것이 확인되었다. 모두 지방족 탄화수소로, n-헵타데센(n-heptadecene; C17H34), n-헵타데칸(n-heptadecane; C17H36), n-옥타데센(n-octadecene; C18H36), n-옥타데칸(n-octadecane; C18H38), n-노나데센(n-nonadecene; C19H38), n-노나데칸(n-nonadecane; C19H40)의 6종과, 나머지 3종은 n-에이코사디엔(n-eicosadiene; C20H38)으로 이중 결합이 2군데 존재하지만, 모두 이중 결합의 위치는 특정할 수 없다(표 6). 또한, MBIC11220주는, n-헵타데센(n-heptadecene; C17H34), n-헵타데칸(n-heptadecane; C17H36), n-노나데센(n-nonadecene; C19H38), n-노나데칸(n-nonadecane; C19H40)의 4종류의 탄화수소를 생산하는 것이 확인되었다(표 6).
또한, 도 9에 나타낸 바와 같이 MBIC11204주의 탄화수소 기름 방울의 함유량은 질소 결핍 조건에서 현저하게 증대한다. 또한, 세포를 Nile red로 염색해서 그 형광 강도를 조사하면 질소 결핍 조건 이행 후, 단위 세포당 형광 강도가 증대하고 있었다(도 10). 이 Nile red 형광은 세포의 탄화수소 함유량을 반영하고 있으므로, MBIC11204주에 의한 탄화수소 생산의 수량 증대의 수단으로서, 질소 결핍 조건이 유효하다고 할 수 있다.
이상으로부터, 본 발명에 따르면, 슈도코리시스티스(Pseudochoricystis) 속(屬)에 속하고, 탄화수소 생산 능력을 가진 미세 조류를 배양하여, 배양물로부터 탄화수소를 채취하는 것을 특징으로 하는 탄화수소의 제조 방법이 제공된다.
또한, 마찬가지로 미세 조류 코리시스티스(Choricystis)에 속하는 주의 배양 세포 중에도, 마찬가지인 탄화수소 기름 방울이 확인되었다(도 13). 이 탄화수소 기름 방울을 분석한 결과, 코리시스티스 마이너(Choricystis minor) SAG251-1주에 있어서의 탄화수소는, n-헵타데칸(n-heptadecane; C17H36), n-노나데센(n-nonadecene; C19H38), n-헨에이코센(n-heneicosene; C21H42)의 3종, 코리시스티스 마이너(Choricystis minor) SAG17.98주에 있어서의 탄화수소는, n-헵타데칸(n-heptadecane; C17H36), n-노나데센(n-nonadecene; C19H38), n-헨에이코센(n-heneicosene; C21H42), n-트리코센(n-tricosene; C23H46)의 4종이었다(표 6).
따라서, 본 발명에 따르면, 코리시스티스(Choricystis) 속(屬)에 속하고, 탄화수소 생산 능력을 가진 미세 조류를 배양하여, 배양물로부터 탄화수소를 채취하는 것을 특징으로 하는 탄화수소의 제조 방법 또한 제공된다.
상기 방법으로 제조되는 탄화수소에는, 모두 탄소수 10∼25의 포화 또는 불포화 지방족 탄화수소의 1종 또는 2종 이상의 혼합물이 포함된다. 즉, 종래의 미세 조류를 이용하는 방법에서는, 중유 상당의 탄소수의 탄화수소밖에 얻을 수 없었지만, 본원 발명의 미세 조류를 이용하는 방법에 따르면, 경유(輕油) 상당의 탄소수의 탄화수소를 제조하는 것이 가능해진다.
상기 미세 조류를 배양하기 위한 배지로서는, 미세 조류의 배양에 보통 사용되고 있는 것으로 좋은데, 예를 들면, 각종 영양염(營養鹽), 미량 금속염, 비타민 등을 함유하는 공지의 담수산 미세 조류용의 배지, 해산(海産) 미세 조류용의 배지가 모두 사용가능하다. 영양염으로서는, 예를 들면, NaNO3, KNO3, NH4Cl, 요소 등의 질소원; K2HPO4, KH2PO4, 글리세로인산 나트륨 등의 인원을 들 수 있다. 또한, 미량 금속으로서는, 철, 마그네슘, 망간, 칼슘, 아연 등을 들 수 있고, 비타민으로서는 비타민 B1, 비타민 B12 등을 들 수 있다. 배양 방법은, 통기 조건으로 이산화탄소의 공급과 함께 교반(攪拌)을 실행하면 좋다. 그때, 형광등으로 12시간의 광조사, 12시간의 암(暗)조건 등의 명암 사이클을 채용한 광조사, 또는, 연속 광조사하여 배양한다. 또한 배양 조건도 미세 조류의 증식에 악영향을 미치지 않는 범위 내이면 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면 배양액의 pH는 7∼9로 하는 것이 바람직하고, 배양 온도는 20℃∼30℃로 하는 것이 바람직하다. 이상과 같은 조건으로 배양하면, 배양 개시로부터 6∼8일 정도에, 상기의 탄화수소를 채취할 수 있다.
더욱 구체적으로는, MBIC11204주의 배양을 할 경우는, 배양액에는 상기 시판의 IMK 배지(일본제약 제조)를 탈염수에 규정 농도로 용해한 것을 증기 멸균하고, 각종 완충 용액을 첨가한 것을 이용할 수 있다. 이 배양액에, MBIC11204주를 식균(植菌)하고, 25℃에서, 형광등의 광조사 하(연속 조명 하 또는 명암 주기(週期) 하)에서 정치 또는 진탕 또는 공기 통기를 함으로써 배양할 수 있다. 또한, 공기 중으로 이산화탄소를 1∼5％정도 부가하면, 증식이 촉진되어 바람직하다. 또한, 기지의 담수산 미세 조류용의 배지도 이용하는 것이 가능하다. 또한, 기지의 담수산 미세 조류용의 배지를 기초로 작성한 한천 평판 배지도 이용가능하다.
생산된 탄화수소는 배양 조체(藻體: microalgal cell)로부터 채취할 수 있다. 프렌치 프레스나 호모게나이저 등의 일반적인 방법에 의해 세포를 파쇄하고 나서 n-헥산 등의 유기용매에 의해 추출하는 방법이나, 세포를 유리 섬유 등의 필터 위에 회수하여, 건조시킨 후, 유기용매 등에 의해 추출하는 방법이 가능하다. 또한, 세포를 원심분리에 의해 회수하여, 동결 건조해서 분말화하고, 그 분말로 유기용매로 추출하는 것도 가능하다. 추출 후의 용매를, 감압(減壓) 또는 상압(常壓) 하에서, 또한 가온 또는 상온에서 휘산(揮散)시킴으로써 목적으로 하는 탄화수소를 얻을 수 있다.
(발명을 실시하기 위한 최선의 형태)
이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하는데, 이들 실시예는 본 발명을 한정하는 것이 아니다.
(실시예 1)
탈염수를 이용해서 아래의 표 2에 나타내는 조성의 A5 배지를 만들고, 이것을 편평한 유리 플라스크(가동 용량 500ml)에 넣어 가압 멸균하였다.
Figure 112007080774063-pct00002
상기 A5 배지에 슈도코리시스티스 엘립소이디아 세키구치 엣 구라노 젠 엣 에스피 노브(Pseudochoricystis ellipsoidea Sekiguchi et Kurano gen. et sp. nov.) MBIC11204주(이하, MBIC11204주라고 한다)를 식균하고, 통풍성이 있는 마개를 하여, 3%의 CO2를 부가한 공기를 통기하는 동시에 플라스크 내의 배양액을 교반하였다. 이때 플라스크의 주위에서 백색 형광 램프에 의해 광을 조사하고, 항온수조(恒溫水槽)에 담가서 온도를 28℃부근으로 조절했다. 세포의 건조 중량을 MBIC11204주의 생육의 지표로 해서 경시적(經時的)으로 측정했다. 이들의 결과를 도 11에 나타낸다. 대수 증식기(對數增殖期)의 비증식(比增殖) 속도는 0.079 h-1에서, 8.8시간에 1회 세포 분열하였다.
얻어진 배양액 400ml 중의 세포를 원심분리(15,000rpm, 10분간)하여, 상기 A5 배지에서 NaNO3를 제외한 질소 결핍 배지로 2회 세정하고, 다시 이 질소 결핍 배지를 이용해서 동일한 조건으로 3일간 배양하였다. 이로써 상당한 양의 탄화수소의 축적이 광학 현미경 하에서 확인되었다(도 9).
(실시예 2)
실시예 1에서 얻어진, 300ml로 배양된 조체를 원심분리에 의해 회수한 후, 동결 건조하였다. 조체의 건조 중량은, 질소 결손 조건에서 721.7mg, 질소 함유 조건에서 884.7mg이었다. 이어서, 건조 조체 200mg에 대하여, 10ml의 n-헥산(hexane)으로 지용성 화합물을 조추출(粗抽出)한 후, 10ml의 추출액을 질소 가스로 1ml 이하로 농축하였다. 측정 전에, 1ml로 메스업하여, 이것을 GC-MS 분석용의 시료로 하였다.
GC-MS 분석용 모세관 칼럼은 DB-5(J&W, 30m × 0.25mm)를 사용하였다. 측정 기기는, GCMS-QP5000(시마즈 제작소)을 사용했다. 이온화법으로서, 전자 이온화(EI)법과, 화학 이온화(CI)법을 이용했다. 성분의 확인에는, GL 사이언스의 직쇄상(直鎖狀) 포화 탄화수소 혼합물(C11, C13, C15, C17, C19, C20, C22, C24, C26, C28, C30) 표준시료를 이용했다.
GC/MS 조건은 아래와 같다.
인젝터 온도: 280℃
시료 주입량: 1㎕
주입 방법: 스플릿리스 모드(splitless mode)
인터페이스 온도: 300℃
샘플링 시간: 0.5분
칼럼 입구 압력: 100kPa
가스 유량: 50.0ml/min
캐리어 가스: 헬륨 가스
승온 조건: 분석 개시로부터 2분 동안 50℃에서 유지, 6℃/min에서 300℃까지 승온 후, 300℃에서 18분 유지.
이온화 전압(EI): 70eV
반응 가스(CI): 메탄
스캔 범위: m/z 50∼500
GC-MS(EI) 분석의 결과, 그 프래그먼트 패턴(fragment pattern)으로부터, 시료에 함유되는 성분은, n-헵타데센(n-heptadecene; C17H34), n-헵타데칸(n-heptadecane; C17H36), n-옥타데센(n-octadecene; C18H36), n-옥타데칸(n-octadecane; C18H38), n-노나데센(n-nonadecene; C19H38), n-노나데칸(n-nonadecane; C19H40)의 6종과, 나머지 3종은 n-에이코사디엔(n-eicosadiene; C20H38)으로 추정되었다. 그러나 n-에이코사디엔의 이중 결합의 위치는 특정할 수 없었다(표 6).
또한, MBIC11204주를 MC 배지(후기 표 4)로 7일간 배양한 후, MC 배지로부터 KNO3을 제거한 배지에 옮겼다. 적당한 시간 간격으로 배양액을 채취하여, 디메틸 술폭시드(DMSO)를 최종 농도 20％가 되도록 첨가해서 교반하고, 5분 후에 Nile red 용액(최종 농도 5㎍/ml)을 가해서 교반하여, 다시 5분 방치한 후 형광 강도를 측정했다(excitation 488 nm, emission 580 nm). 단위 세포당 형광 강도의 증가 패턴을 도 10에 나타낸다. 이 형광 강도는 Nile red에 의해 염색되는 물질의 양, 즉 세포 내의 탄화수소량을 반영하고 있으므로, 형광 강도의 증가는 탄화수소량의 증가를 의미한다. 질소 결핍 조건으로 이행 후, 신속한 탄화수소량의 증가가 나타났다.
(실시예 3)
MBIC11204주를, 아래의 표 3에 나타내는 조성을 가진 Ｃ 배지에 3종의 완충 용액(50mM MES(pH 5.5), 50mM MOPS(pH 7.0), 50mM CHES(pH 9.0))을 각각 첨가한 배양액(가압 멸균 완료)에 식균하고, 실시예 1과 동일한 배양을 실행하여, 배양액의 pH가 세포의 증식에 미치는 영향을 평가하였다.
도 12에 나타낸 바와 같이 pH 7.0에서의 증식이 가장 양호하였다. 완충액의 농도를 50mM로 설정했으므로, 배양 중의 pH는 안정하였다.
Figure 112007080774063-pct00003
(실시예 4)
아래의 표 4에 나타내는 조성을 가진 MC 배지와, 실시예 3에서 사용한 C 배지의 어느 쪽이 MBIC11204주의 배양에 적합한가를 조사하기 위한 실험을 하였다. 동시에, 공기에 CO2를 부가하는 효과에 대해서도 확인하였다.
MC 배지와 C 배지를 넣은 배양 용기(가압 멸균 완료)를 2개씩 준비하고, 2개의 용기 중 1개에는 공기를, 나머지 1개에는 공기에 3%의 CO2를 부가한 혼합 가스를 통기하여, 실시예 1과 동일한 조건으로 6일간 배양했다.
Figure 112007080774063-pct00004
결과를 표 5에 나타낸다. 가장 증식이 양호한 조건은, MC 배지를 사용해서 3% CO2를 부가한 조건이었다(클로로필 농도가 34.8배). MC 배지의 경우에는 CO2 부가에는 플러스의 효과가 확인되었지만, C 배지의 경우는 공기만으로도 같은 증식이었다.
Figure 112007080774063-pct00005
(실시예 5)
Culture Collection of Algae (SAG) at the University of Gottingen에 기탁된 미세 조류에 대해서, 직접 세포를 Nile red로 염색해서 관찰한 결과, Choricystis minor SAG251-1, Choricystis minor SAG17.98은 오렌지색의 형광을 발하여, 현저한 기름 방울의 존재가 확인되었다(도 13).
이들 기름 방울을 실시예 2와 동일한 조건으로 MS-GS 분석한 결과, 그 프래그먼트 패턴으로부터, 코리시스티스 마이너(Choricystis minor) SAG251-1주에 있어서의 기름 방울은, n-헵타데칸(n-heptadecane; C17H36), n-노나데센(n-nonadecene; C19H38), n-헨에이코센(n-heneicosene; C21H42)의 3종, 코리시스티스 마이너(Choricystis minor) SAG17.98주에 있어서의 기름 방울은, n-헵타데칸(n-heptadecane; C17H36), n-노나데센(n-nonadecene; C19H38), n-헨에이코센(n-heneicosene; C21H42), n-트리코센(n-tricosene; C23H46)의 4종으로 추정되었다(표 6).
(실시예 6)
MBIC11220주를, 상기 표 2에 나타내는 조성을 가진 A5 배지에서 실시예 1과 동일한 배양 조건으로 배양한 결과를 도 14에 나타낸다. 720nm에서의 흡광도를 세포 농도의 지표로 해서 경시적으로 측정하여, 증식 곡선을 그렸다. 도 14에는 동일한 조건으로 배양한 MBIC11204주의 증식도 표시하였다. 이 양쪽의 주는 이 실험 조건에서는 매우 닮은 증식을 나타냈다.
이 배양에 의해 얻어진 MBIC11220주의 세포로부터, 실시예 2와 동일한 방법으로 탄화수소를 추출하여, 분석한 결과, n-헵타데센(n-heptadecene; C17H34), n-헵타데칸(n-heptadecane; C17H36), n-노나데센(n-nonadecene; C19H38), n-노나데칸(n-nonadecane; C19H40)의 4종으로 추정되었다.
상기의 실시예에서 확인된 MBIC11204주, MBIC11220주, SAG251-1주, SAG17.98주의 배양에 의해 생산되는 탄화수소를 아래의 표 6에 정리한다.
Figure 112007080774063-pct00006
본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허출원을 그대로 참고로 해서 본 명세서에 포함시키는 것으로 한다.
본 발명은, 탄화수소 생산 능력을 가진 신규 미세 조류를 제공하는 것이며, 이 미세 조류에 의해 생산되는 탄화수소는 디젤 연료(경유)의 대체 연료로서 이용 할 수 있다. 따라서, 본 발명은, 이산화탄소를 배출하지 않아, 환경 부하가 없는 탄화수소 생산 시스템으로서 대단히 유용하다.
SEQUENCE LISTING <110> Marine Biotechnology Institute Co., ltd <120> Novel microalgae and method for producing hydrocarbons <130> PH-2715-PCT <150> JP 2005-114404 <151> 2005-04-12 <160> 4 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1243 <212> DNA <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: novel microalgae (Pseudochoricystis ellipsoidea) <400> 1 gttgggggct cgaagacgat tagataccgt cctagtctca accataaacg atgccgacta 60 gggattggcg ggcgttcttt tgatgacccc gccagcacct tatgagaaat caaagttttt 120 gggttccggg gggagtatgg tcgcaaggct gaaacttaaa ggaattgacg gaagggcacc 180 accaggcgtg gagcctgcgg cttaatttga ctcaacacgg gaaaacttac caggtccaga 240 catagtgagg attgacagat tgagagctct ttcttgattc tatgggtggt ggtgcatggc 300 cgttcttagt tggtgggttg ccttgtcagg ttgattccgg taacgaacga gacctcagcc 360 tgctaactag tcacgattgg ttcttccagt cggccgactt cttagaggga ctattggcga 420 ctagccaatg gaagtgtgag gcaataacag gtctgtgatg cccttagatg ttctgggccg 480 cacgcgcgct acactgatgc aatcaacgag cctagccttg gccgacaggt ccgggtaatc 540 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gaatgagtac aatctaaacc ccttaacgag gatcaattgg agggcaagtc 540 tggtgccagc agccgcggta attccagctc caatagcgta tatttaagtt gttgcagtta 600 aaaagctcgt agttggattt cgggcgggcc cggccggtcc gcctttgggt gtgcactgac 660 cgggcccgtc ttgttgccgg ggacgggctc ctgggcttaa ctgtccggga ctcggagtcg 720 gcgaggttac tttgagtaaa ttagagtgtt caaagcaggc ctacgctctg aatacattag 780 catggaataa cacgatagga ctctggccta tcttgttggt ctgtgggacc ggagtaatga 840 ttaagaggga cagtcggggg cattcgtatt tcattgtcag aggtgaaatt cttggattta 900 tgaaagacga actactgcga aagcatttgc caaggatgtt ttcattaatc aagaacgaaa 960 gttgggggct cgaagacgat tagataccgt cctagtctca accataaacg atgccgacta 1020 gggattggcg ggcgttcttt tgatgacccc gccagcacct tatgagaaat caaagttttt 1080 gggttccggg gggagtatgg tcgcaaggct gaaacttaaa ggaattgacg gaagggcacc 1140 accaggcgtg gagcctgcgg cttaatttga ctcaacacgg gaaaacttac caggtccaga 1200 catagtgagg attgacagat tgagagctct ttcttgattc tatgggtggt ggtgcatggc 1260 cgttcttagt tggtgggttg ccttgtcagg ttgattccgg taacgaacga gacctcagcc 1320 tgctaactag tcacgattgg ttcttccagt cggccgactt cttagaggga ctattggcga 1380 ctagccaatg gaagtgtgag gcaataacag gtctgtgatg cccttagatg ttctgggccg 1440 cacgcgcgct acactgatgc aatcaacgag cctagccttg gccgacaggt ccgggtaatc 1500 tttgaaactg catcgtgatg gggatagatg attgcaatta ttcatcttca acgaggaatg 1560 cctagtaagc gcgagtcatc agctcgcgtt gattacgtcc ctgccctttg tacacaccgc 1620 ccgtcgctcc taccgattgg gtgtgctggt gaagcgttcg gattggcggc agtgcgcggt 1680 tcgccgctcg ctgcagccga gaagttcgtt aaaccctccc acctagagga aggagaagtc 1740 gtaacaaggt ttcc 1754 <210> 4 <211> 1087 <212> DNA <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: novel microalgae (Pseudochoricystis ellipsoidea) <400> 4 caagcaggtg ttaagattac cgattaacct actacactcc agattaccaa gtaaaggaaa 60 cagacatctt ggctgctttc cgtatgacac ctcaaccagg tgttccgcca gaagagtgcg 120 gtgcagcggt tgcagcagaa tcgtcaactg gtacttggac tacagtttgg actgatggtt 180 tgactagtct tgacagatac aaaggtcgtt gctatgacat cgagccggtt cctggtgaag 240 acaaccaata catcgcatat gttgcatacc cgctagatct ttttgaagag ggatcagtta 300 caaacttgtt tacatctatt gtagggaacg ttttcggttt caaagcactt cgtgcattgc 360 gtcttgaaga ccttcgcatc ccacctgctt acgtcaaaac cttccaagga ccgcctcacg 420 gtatccaggt tgagcgtgac aaactaaaca agtacggccg ttctttgtta ggttgcacca 480 tcaagccaaa actaggtctt tctgctaaga actacgggcg tgcagtgtac gaatgtttac 540 gtggtggctt agattttacg aaagacgacg agaacgtaaa ctcacaacca tttatgcgtt 600 ggagagaccg tttccttttc gtttcagaag ctatctacaa agctcaagct gagacaggtg 660 aggttaaagg tcactaccta aacgcgactg ctggtacttg tgaagagatg ctaaaacgtg 720 ctgagtctgc gaaagacttt ggtgttccaa tcattatgca tgactaccta actggtggtt 780 tcactgctaa cacttcattg gcacactact gccgtgacaa cagccttttg cttcacattc 840 accgtgcgat gcacgctgtt attgaccgtc aacgtaacca cggtatgcac ttccgtgttc 900 ttgcgaaagc tcttcgtttg tctggtggtg accaccttca ctcaggtacc gttgtaggta 960 aacttgaggg agaacgtgaa gtaaccctag gtttcgttga cctaatgcgt gacgactaca 1020 ttgagaaaga cagaagccga ggcatctact tcactcaaga ctgggtatct cttcctggtg 1080 tatgcca 1087

Claims (11)

  1. 삭제
  2. 탄화수소 생산 능력을 가진 슈도코리시스티스 엘립소이디아 세키구치 엣 구라노 젠 엣 에스피 노브(Pseudochoricystis ellipsoidea Sekiguchi et Kurano gen. et sp. nov.) MBIC11204주 신규 미세 조류 .
  3. 탄화수소 생산 능력을 가진 슈도코리시스티스 엘립소이디아 세키구치 엣 구라노 젠 엣 에스피 노브(Pseudochoricystis ellipsoidea Sekiguchi et Kurano gen. et sp. nov.) MBIC11220주 신규 미세 조류.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 탄화수소가 탄소수 10∼25의 포화 또는 불포화 지방족 탄화수소인 신규 미세 조류.
  5. 삭제
  6. 슈도코리시스티스 엘립소이디아 세키구치 엣 구라노 젠 엣 에스피 노브(Pseudochoricystis ellipsoidea Sekiguchi et Kurano gen. et sp. nov.) MBIC11204주를 배양하여, 배양물로부터 탄화수소를 채취하는 것을 특징으로 하는 탄화수소의 제조 방법.
  7. 슈도코리시스티스 엘립소이디아 세키구치 엣 구라노 젠 엣 에스피 노브(Pseudochoricystis ellipsoidea Sekiguchi et Kurano gen. et sp. nov.) MBIC11220주를 배양하여, 배양물로부터 탄화수소를 채취하는 것을 특징으로 하는 탄화수소의 제조 방법.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 제6항 또는 제7항에 있어서, 탄화수소가 탄소수 10∼25의 포화 또는 불포화 지방족 탄화수소인 방법.
  11. 제6항 또는 제7항에 있어서, 배양을 질소 결핍 조건 하에서 실행하는 방법.
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