CN106467896B - 一种耐受高ph的凯氏拟小球藻及其培养应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种耐受高PH的凯氏拟小球藻及其培养应用，通过紫外诱变和逐级提高PH驯化筛选的方法获得耐受高PH的凯氏拟小球藻突变株FSH‑Y3，其分类命名为Parachlorella kessleri，已于2014年5月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9238。本发明选育的凯氏拟小球藻FSH‑Y3在高PH值下能够更好的吸收利用二氧化碳，快速生长繁殖，解决了现有凯氏拟小球藻只能在中性PH下生长，而中性PH条件下存在二氧化碳溶解度小、固定二氧化碳效率低的问题。

Description

一种耐受高PH的凯氏拟小球藻及其培养应用

技术领域

本发明属于微生物工程领域，具体涉及一种耐受高PH的凯氏拟小球藻及其培养应用。

背景技术

随着世界经济的发展，大量的化石能源的使用和消耗，导致能源的短缺和环境的日益恶化，特别是CO₂的急剧增加引起的温室效应越来越严重，微藻的生长周期短、光合效率高，CO₂固定效率高，一定条件下可达陆生植物的10 倍以上，不仅可以减少CO₂排放，同时也降低了培养成本；除CO₂外，废气中的一些SOx、NOx 等成分也随着微藻的代谢被净化处理，有效减少有害气体排放，因此利用微藻油脂作为原料生产的生物柴油是目前最有可能满足世界运输所需燃料的可再生能源。

目前对于小球藻、栅藻等产油微藻研究的较多。CN20110144545.6公开了一株栅藻藻株，该藻株的生长可利用人工培养基或经适当处理的废水生长，其特点是油脂产率高于目前大多数分藻株，该藻株应用领域包括CO₂的固定，废水的净化，油脂、蛋白质、色素、淀粉、多糖、核酸的生产。CN20120154470.4公开了一株富油海洋微藻微拟球藻(Nannochloropsis gaditana )藻株及其应用，该藻株可在pH=4.5的环境下正常生长，其油脂含量可达35%。CN20111019480.X公开了一株微藻藻株（Mychonases sp .）及其用于生产生物柴油的应用，利用该藻株可生产高附加值的多不饱和脂肪酸，包括亚麻酸 C18:3和神经酸C24:1，其在获得生物柴油的同时，获得高附加值的副产品。CN102703326A公开了一种高CO₂耐受性和固定率的微藻及其选育方法，但该专利所提供的藻株并未涉及该藻株的油脂含量。上述专利要么不能高效利用CO₂生产油脂，要么获得的生物质中油脂含量不够高。特别是在实际应用中，当环境中CO₂体积分数大于5v%时，大部分微藻的生长将受到抑制，固碳效率低；同时一般微藻在中性条件下适宜生长，在偏酸性或者偏碱性的条件下不利于微藻的生长，而微藻利用CO₂一般是以溶解在水中的HCO₃ ^-离子形式存在的，二氧化碳在中性环境下溶解度低，不利于藻类吸收利用。

拟小球藻属是由Krienitz, et al.提出的一个新的属，他通过对小球藻属的凯氏小球藻科核糖体小亚基团（SSU rDNA）进行系统学分析，提出将小球藻属中的凯氏小球藻（C. kessleri）划分到小球藻属，改名为凯氏拟小球藻，与拟小球藻（P. beijerinckii）、胡斯拟小球藻（P.hussii）共同构成了一个新属拟小球藻属。拟小球藻属与小球藻属之间的形态极为相似，仅在细胞壁的超微结构方面有细微差异，与小球藻属相比，凯氏拟小球藻细胞壁的电子透明度较低。但在18S rDNA及ITS序列上差异明显。

目前国内外关于凯氏拟小球藻的报道比较少，江丽丽等人在（一株产油微藻的筛选及分子鉴定，水生生物学报，2013年第4期 606-612页）报道一株产油微藻HY-6，为球状单细胞，具有1个明显的蛋白核，杯状色素体周生，从而初步判断该藻株可能属于小球藻属（Chlorella）或拟小球藻属（Parachlorella）；18S rDNA及ITS系统学分析表明HY-6与小球藻属分为两个不同的进化支，但与凯氏拟小球藻（Parachlorella kessleri）的亲缘关系较近，且具有较高的自展支持率，因此将其鉴定为凯氏拟小球藻（P.kessleri），总脂单位体积产率最高达50.8mg/(L.d)，是一株具有潜力的产油微藻。但是，该凯氏拟小球藻只适合在中性PH下生长，并未涉及该凯氏小球藻耐受高PH的能力。

发明内容

本发明的目的是提供一种耐受高PH的凯氏拟小球藻及其培养应用。本发明选育的凯氏拟小球藻在高PH值下能够更好的吸收利用二氧化碳，快速生长繁殖，解决了现有凯氏拟小球藻只能在中性PH下生长，而中性PH条件下存在二氧化碳溶解度小、固定二氧化碳效率低的问题。

本发明耐受高PH的凯氏拟小球藻，为凯氏拟小球藻突变株FSH-Y3，其分类命名为Parachlorella kessleri，已于2014年5月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 9238。

本发明提供的凯氏拟小球藻FSH-Y3在显微镜下藻细胞为球形、椭圆形，内有一个周生、杯状或片状的色素体；无性繁殖，每个细胞可以产生2、4、8或16个似亲孢子，成熟时母细胞破裂，孢子逸出，长大后即为新个体。

本发明提供的凯氏拟小球藻FSH-Y3可以耐受的PH值为10～12，在此PH值条件下的生长速率比原始凯氏拟小球藻快2～5倍。

本发明提供的凯氏拟小球藻FSH-Y3藻株的18S rDNA基因测序分析结果见序列表。根据序列比对，本发明FSH-Y3藻株与已公布的拟小球藻藻株的18S rDNA数据存在差异。

本发明提供的凯氏拟小球藻FSH-Y3，在高PH生长时能增加二氧化碳的溶解度，增加拟小球藻光合作用中对二氧化碳的固定，对二氧化碳的减排有显著作用。凯氏拟小球藻的生长需要吸收二氧化碳，一般来说，二氧化碳的溶解性与溶液的酸碱性有一定的关系，二氧化碳在碱性溶液中溶解度显著升高。因此，所获得凯氏拟小球藻FSH-Y3可耐受高PH值的环境，而在高PH值环境下可以溶解更多的二氧化碳，提高了藻株对二氧化碳的固定效率，对控制二氧化碳污染的温室效应具有重要意义。

本发明耐受高PH的凯氏拟小球藻的选育方法，包括以下内容：

（1）配制凯氏拟小球藻生长的BG11培养基；

（2）接种原始凯氏拟小球藻，经光照和黑暗周期诱导，对原始凯氏拟小球藻进行活化；

（3）取对数生长期的凯氏拟小球藻进行紫外诱变，然后进行暗培养；

（4）将暗培养后的藻液用新鲜培养液稀释后涂布到固体培养基上进行光照培养；

（5）挑取生长迅速的单藻落接种到BG11培养液中进行初筛，培养液的PH为8.0～9.0；

（6）将步骤（5）初筛的藻液，接种到逐级提高PH的培养液中进行驯化培养，每次PH提高0.5～1.0，筛选获得耐受高PH的藻株。

在步骤（1）中，将配制好的BG11培养基分装在50～250mL的锥形瓶中，每瓶装液量为20～100mL，用透气膜封口，包上牛皮纸。将上述培养基进行灭菌，在温度121℃，压力0.1MPa下灭菌20～30分钟。

在步骤（2）中，按接种液与培养液的体积比为1:10～1:5接种，操作在无菌间进行，接种后将培养液摇匀，用透气膜包好。所述的光照和黑暗周期诱导是在22～32℃的恒温光照反应摇床中进行，光暗反应周期为24h，光暗时间比为14:10；摇床转速为80～160rpm，培养4～7天，获得活化的原始凯氏拟小球藻藻液。

在步骤（3）中，取对数生长期的藻液5～10mL置于无菌培养皿中进行紫外诱变，藻液在培养皿底面铺一薄层，培养皿放在无菌的暗室中，打开皿盖。在磁力搅拌下，用30w的紫外灯照射诱变，照射时间为10～20min，紫外灯与培养皿的距离为15～25cm，照射致死率为60%～80%。照射后盖上皿盖，用不透光的纸包好培养皿进行暗培养，暗反应的培养温度为20～30℃，培养时间为24～72h。

在步骤（4）中，将步骤（3）暗反应后的藻液用BG11新鲜培养基稀释10～10000倍，吸取0.1～0.3mL涂布到BG11固体琼脂平板（琼脂含量为1%～2%）上。在光照培养箱中进行培养，培养温度为20～30℃，光照强度为1000～5000Lux，光暗反应周期为24h，光暗时间比为14:10，培养时间为10～15d。挑选在平板上长得比较大、颜色比较深、生长迅速的单藻落进行筛选。

在步骤（5）中，在恒温光照摇床中培养，摇床转速为60～180rpm，光照强度为1000～5000Lux，光暗反应周期为24h，培养温度为20～30℃，光暗时间比为14:10，培养时间为10～15d天。培养结束后，测定藻液的OD₆₈₀值，由于与生物量细胞干重具有很好的线性关系，根据OD₆₈₀的大小来进行藻种的筛选，选出OD值比较大的耐受高PH的藻株，进行驯化筛选。

在步骤（6）中，以1:10～1:5的比例将步骤（5）中挑选的藻落接种到培养基中。采用逐级提高PH值的方式进行驯化培养，初始PH为8.0～9.0，每次PH提高0.5～1.0，每提高一次在相同条件下培养24～96h，选择出OD值比较大的耐受高PH的藻液，获得耐受PH为10～12的藻株。

本发明的凯氏拟小球藻在固定CO₂中的应用。该藻株能够耐受高达40v%的CO₂浓度，具有较高的CO₂固定效率。

本发明的凯氏拟小球藻在生产微藻油脂中的应用。该藻株在PH为10～12的生长条件下，细胞总脂含量可占细胞干重的40%以上，能够进行生物柴油的生产。

本发明的凯氏拟小球藻在高PH下生产微藻油脂同时固定CO₂中的应用。该藻株可以在PH为10～12的生长条件下固定二氧化碳并进行光照自养生长获取富含油脂的生物质，该藻株可以利用BG11、SE等淡水培养基培养，培养的光照强度1500～20000Lux，温度为15～40℃，培养液的初始PH为8.0～9.0，每次PH提高0.5～1.0，直至提高至10～12，培养7天进入稳定期，收获藻细胞。经检测，细胞总脂含量占细胞干重的40%以上。

与现有藻株相比，本发明可以带来以下有益效果：

1、通过紫外诱变和逐级提高PH驯化筛选的方法选育获得凯氏拟小球藻，获得耐受高PH的凯氏拟小球藻突变株。与原始藻株相比，原始藻株在PH达到10以上时生长缓慢，或者停止生长甚至死亡，而本发明选育的凯氏拟小球藻能够耐受的PH可达10～12，在PH值为10～12的条件下生长速率提高了2～5倍。

2、本发明的凯氏拟小球藻在高PH值下能够增加二氧化碳的溶解度，增加光合作用中对二氧化碳的固定，更好的吸收利用二氧化碳，对二氧化碳的减排有显著作用，解决了现有凯氏拟小球藻只能在中性PH下生长，而中性PH条件下存在二氧化碳溶解度小、固定二氧化碳效率低的问题。同时，在高PH值培养凯氏拟小球藻时，可以有效抑制凯氏拟小球藻生长过程中杂菌的生长。

3、本发明方法采用逐级提高PH值的方式驯化筛选耐受高PH的藻种，避免了一次提高PH筛选带来藻种的损伤，造成诱变筛选的失败，保证了逐级驯化的可靠性和提高了诱变藻株的遗传稳定性。以OD₆₈₀值作为生物量和生长速率的衡量指标，具有直观便捷的特征，保证了在较短时间内较高的筛选量。

生物材料保藏说明

本发明提供的凯氏拟小球藻突变株（Parachlorella kessleri）FSH-Y3，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所；保藏编号：CGMCC No. 9238；保藏日期：2014年5月26日。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步详细说明。本发明中，v%为体积分数。

实施例1 凯氏拟小球藻突变株FSH-Y3分离和筛选

本发明原始凯氏拟小球藻藻株是2011年11月从辽宁省抚顺市浑河采集的水样中通过平板划线的方式分离出来的野生凯氏拟小球藻，编号为FSH-3。对原始凯氏拟小球藻藻株FSH-3进行紫外诱变和驯化培养选育耐受高PH的凯氏拟小球藻突变株FSH-Y3。

本发明凯氏拟小球藻突变株FSH-Y3的获得方式具体如下：

（1）配制BG11培养基，将配制好的BG11培养基分装在250mL摇瓶中，每瓶装液量为100mL，用透气膜封口，牛皮纸包好，置于121℃，0.1MPa下灭菌30分钟。所述BG11培养基组成如表1、表2所示。

表1 BG11培养基

*表2 表1中A5+Co solution的组成

（2）在无菌条件下，吸取原始凯氏拟小球藻藻液FSH-3约10mL接种到上述灭菌后的摇瓶中，将摇瓶置于恒温光照摇床中培养。摇床的转速设置为120rpm，温度为25℃，设置光暗培养周期为24h，光暗反应时间比为14:10，光照强度为5000Lux。

（3）在光照摇床中培养5天后，藻液进入对数生长期，此时吸取藻液10mL于灭菌后的培养皿中，使藻液在培养皿底部平铺一薄层，在磁力搅拌下放在紫外灯下进行照射，紫外灯功率为30w，照射距离为15cm，照射时间15min，照射完后盖上皿盖，用不透光的纸包好，在25℃下暗培养2天，致死率为75%。

（4）将暗反应培养的藻液用新鲜培养液稀释10000倍，吸取0.2ml涂布到PH为11的BG11琼脂固体平板（琼脂含量为1.5%）上进行培养，培养温度为25℃，光照强度为5000Lux，培养在光照培养箱中进行，光暗反应周期为24h，光暗时间比为14:10，培养时间15天。

（5）挑选平板上体积较大、颜色较绿的藻落进行筛选，将其单藻落接种于装有培养体积为20mL、PH值为9的BG11的培养基的50mL的摇瓶中进行培养。培养温度为25℃，摇床转速为120rpm，光照强度为5000Lux，光暗周期为24h，光暗时间比为14:10，培养10天后，测定摇瓶中藻液的OD₆₈₀值，根据OD₆₈₀的大小，选择出OD值比较大的耐受PH9的藻株进行驯化筛选。

（6）将筛选出的藻株按1:10的比例接入含有100mL的PH为10的BG11培养液的250mL的摇瓶中进行驯化培养，培养温度为25℃，摇床转速为120rpm，光照强度为3000Lux，光暗周期为24h，光暗时间比为14:10，培养3天后，剔除颜色发黄已经死了的藻液，测定剩余摇瓶中藻液的OD₆₈₀值，根据OD₆₈₀的大小，选择出OD值比较大的耐受PH10的藻株进一步驯化。将PH提高至10.5、11.0、11.5，在上述相同条件下进一步驯化，选择出OD值比较大的藻株，此藻株即耐受高PH的目标藻株FSH-Y3。

实施例2 原始藻株与诱变藻株在不同PH下生长速率的比较

将筛选的藻株FSH-Y3的对数生长期的藻液和原始藻种FSH-3的对数生长期的藻液按一定的比例接入装有BG11培养基的摇瓶中，接种后初始OD₆₈₀值相同，均为0.2。从反应器底部通入CO₂含量为5v%的气体，不同的PH值下培养7天，测定OD₆₈₀值作为衡量生长速度的指标，所得的结果如表3所示。

表3 原始藻株与诱变藻株在不同PH值下的OD值比较

由表3可见，诱变藻株随着PH值的升高OD值变化不明显，而原始藻株OD值迅速下降，生长缓慢，甚至死亡。

实施例3 FSH-Y3和FSH-3的生长效果的比较

将对数生长期的FSH-Y3和FSH-3的藻液分别接种在BG11培养基进行培养，培养在实验室自制的柱式反应器（内径为40mm，高度为500mm）中进行，接种后的密度调整为OD₆₈₀为0.2。根据试验需要，组配不同含量的CO₂气体，然后从反应器底部通入。培养过程中光照强度为5000Lux，培养温度为28℃，PH值控制在11，光照周期为24h，光暗时间比为14:10，培养时间为7天，培养结束后收集藻细胞，在-60℃条件下真空冷冻干燥至恒重后测量藻粉干重，计算生物质产量。结果如表4所示。

表4 不同CO₂含量的效果比较

从结果可以看出，经过驯化筛选的凯氏拟小球藻FSH-Y3比初始藻株FSH-3对CO₂和PH有更好的耐受性，生物量稳定性好。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国石油化工股份有限公司

中国石油化工股份有限公司抚顺石油化工研究院

<120> 一种耐受高PH的凯氏拟小球藻及其培养应用

<130> 新专利申请

<170> PatentIn version 3.5

<211> 1421

<212> DNA

<213> Parachlorella kessleri

<400> 1

gtagtcatat gcttgtctca aagattaagc catgcatgtc taagtataaa ctgctttata 60

ctgtgaaact gcgaatggct cattaaatca gttatagttt atttgatggt accttactac 120

cggataaccg tagtaattct agagctaata cgtgcgtaaa tcccgacttc tggaagggac 180

gtatttatta gatttaaggc cgacccggct ctgccggtcc cacggtgaat catgataact 240

tcacgaatcg catggccttg cgccggcgat gtttcattca aatttctgcc ctatcaactt 300

tcgatggtag gatagaggcc taccatggtg gtaacgggtg acggaggatt agggttcgat 360

tccggagagg gagcctgaga aacggctacc acatccaagg aaggcagcag gcgcgcaaat 420

tacccaatcc tgacacaggg aggtagtgac aataaataac aataccgggc cttttcaggt 480

ctggtaattg gaatgagtac aatctaaacc ccttaacgag gatcaattgg agggcaagtc 540

tggtgccagc agccgcggta attccagctc caatagcgta tatttaagtt gctgcagtta 600

aaaagctcgt agttggattt cgggcggggc ctgccggtcc gccgtttcgg tgtgcactgg 660

ccgggcccgc cttgttgccg gggacgggct cctgggcttc actgtccggg actcggagtc 720

ggcgctgtta ctttgagtaa attagagtgt tcaaagcagg cctacgctct gaatacatta 780

gcatggaata acacgatagg actctggcct atcctgttgg tctgtaggac cggagtaatg 840

attaagaggg acagtcgggg gcattcgtat ttcgatgtca gaggtgaaat tcttggattt 900

tcgaaagacg aactactgcg aaagcatttg ccaaggatgt tttcattaat caagaacgaa 960

agttgggggc tcgaagacga ttagataccg tcctagtctc aaccataaac gatgccgact 1020

agggatcggc ggatgtttct tcgatgactc cgccggcacc ttatgagaaa tcaaagtttt 1080

tgggttccgg ggggagtatg gtcgcaaggc tgaaacttaa aggaattgac ggaagggcac 1140

caccaggcgt ggagcctgcg gcttaatttg actcaacacg ggaaaactta ccaggtccag 1200

acatagtgag gattgacaga ttgagagctc tttcttgatt ctatgggtgg tggtgcatgg 1260

ccgttcttag ttggtgggtt gccttgtcag gttgattccg gtaacgaacg agacctcagc 1320

ctgctaaata gtcacggtct cctcgggggc cggcagactt cttagaggga ctattggcga 1380

ctagccaatg gaagcatgag gcaataacag gtctgtgatg c 1421

Claims (5)

1.一种耐受高PH的凯氏拟小球藻，为凯氏拟小球藻突变株FSH-Y3，其分类命名为Parachlorella kessleri，已于2014年5月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 9238。

2.按照权利要求1所述的凯氏拟小球藻在固定CO₂中的应用。

3.按照权利要求1所述的凯氏拟小球藻在生产微藻油脂中的应用。

4.按照权利要求1所述的凯氏拟小球藻在高PH下生产微藻油脂同时固定CO₂中的应用。

5.按照权利要求4所述的应用，其特征在于：该藻株在PH为10～12的生长条件下固定二氧化碳并进行光照自养生长获取富含油脂的生物质，利用BG11或SE淡水培养基培养，培养的光照强度1500～20000Lux，温度为15～40℃，培养液的初始PH为8.0～9.0，每次PH提高0.5～1.0，直至提高至10～12，培养7天进入稳定期，收获藻细胞。