KR100957233B1 - 여성의 소음순 유래 성체세포로부터 리프로그래밍의 과정을통해 다양한 신경줄기세포로 분화할 수 있는신경줄기세포를 제조하는 방법 및 상기 분화된 세포의 세포치료제로서의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 여성의 소음순 유래 성체세포로부터 리프로그래밍(reprogramming)의 과정을 통하여 다양한 신경세포로 분화할 수 있는 신경줄기세포(neural stme cells)를 제조하는 방법 및 상기 분화된 세포의 세포 치료제로서의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따라 여성의 소음순으로부터 분리한 성체세포를 로우 글루코즈(low glucose) DMEM 배지에 배양하였을 때 다분화능을 유지하면서 대량 증식이 가능하였다. 그러나 이러한 다분화능의 효율은 현저히 떨어지는 바 이를 극복하기 위해 상기 성체세포를 ITS + bFGF가 함유된 글루코즈(low glucose) DMEM/F12 serum-free의 배지에서 3~7일 동안 배양한 다음 신경 줄기세포의 증식에 필요한 N2 배지 배양조건으로 변환함으로써 신경구 형성을 촉진할 뿐 아니라 신경구의 증식도 촉진하여 분화능이 있는 신경 줄기세포를 빠르고 쉽게 대량으로 획득할 수 있었다. 상기 성체세포와 리프로그래밍(reprogramming)의 과정을 통해 생성된 신경 줄기세포는 다양한 종류의 질환에 대한 세포치료제로서 이용할 수 있다.

성체세포, 리프로그래밍, reprogramming, 분화, 신경줄기세포, 로우 글루코즈 DMEM 배지, ITS 함유 serum-free 배지, 세포치료제

Description

여성의 소음순 유래 성체세포로부터 리프로그래밍의 과정을 통해 다양한 신경줄기세포로 분화할 수 있는 신경줄기세포를 제조하는 방법 및 상기 분화된 세포의 세포 치료제로서의 용도{A method for preparing multipotent neural stem cells from women labia minora skin cells by reprogramming method, and use of reprogrammed neural stem cells as a cell therapy product}

본 발명은 쉽게 분리 가능한 인간의 피부 세포 중 여성의 소음순으로부터 분리한 성체세포를 로우 글루코즈 DMEM에서 배양하여 수득한 다분화성의 성체 줄기세포, 이를 이용하여 리프로그래밍(reporgramming)에 필요한 체외 배양조건에서 신경 줄기세포로의 전환을 획기적으로 증가시킬 수 있는 방법 및 상기 리프로그래밍(reprogramming) 과정을 통해 생성된 신경 줄기세포의 세포치료제로서의 용도에 관한 것이다.

줄기세포는 무한한 범위까지 분열하는 능력이 있고 다른 유형의 세포를 형성하기 위해 적합한 환경 하에서 적합한 자극을 통해 분화하는 능력을 가지는 세포이다. 줄기세포는 특징적인 형상과 특화된 기능을 가지는 세포로 발달하는 잠재력을 가지며, 다양한 질병에서 효율적인 치료수단으로 많은 연구가 행해지고 있다.

다른 유형의 세포로 분화하기 위한 줄기세포들의 다른 잠재력의 차이를 기준으로, 지금까지 배아줄기세포와 성체줄기세포 사이에 구분이 있어 왔다. 수정란 세포로부터 배아단계로, 성체 유기체로 발달하면서 줄기세포의 잠재력이 줄어든다는 것이 일반적으로 일치된 의견이다. 이러한 성질에 따라, 수정란 세포는 만능(toticpotent)이라 일컬어지고, 배아줄기세포는 전분화능(pluripotent)이라 일컬어지고, 성체줄기세포는 다능성(multipotent)이라 일컬어진다.

만능 줄기세포는 완전한 유기체로 발달할 수 있는 세포이다. 만능세포는 수정란세포와 함께 초기 배아단계의 세포들을 포함한다. 전분화능은 전형적으로 분열된 배반포의 내세포덩이(intermal cell mass)로부터 얻어지는 배아줄기세포가 중배엽, 내배엽 및 외배엽의 세 가지 배엽 세포 모두로 분화할 수 있는 줄기세포를 말한다.

그러나 지금까지 알려진 견해에 따르면 성체줄기세포는 단지 다분화능으로,적은 범위까지 분화할 수 있는 능력을 가진다고 알려졌다. 따라서 조직특이 줄기세포는 오직 같은 조직유형의 세포로만 분화할 수 있는 것이다. 성체줄기세포는 중추신경계(central nervous system) (Science 255, 1707-1710 1992; Science 287, 1433-1438 2000), 골수(bone marrow) (Science 276, 71-74, 1997; Science 287, 1442-1446, 2000; Science 284, 143-147, 1999), 망막(retina) (Science 287, 2032-2036, 2000)와 골격근(skeletal muscle) (Proc . Natl Acad . Sci . USA 96, 14482-14486, 1999; Nature 401, 390-394, 1999)에서 분리하였으며, 이들은 각각 유사한 계통으로 분화가 가능하다. 그 예로 신경 줄기세포(neural stem cells)은 뉴런과 신경아교세포(glial cell)로, 골수중간엽 줄기세포(bone marrow mesenchymal stem cells)는 중배엽 세포(mesodermal cell)로 분화가 가능하며, 조혈줄기세포(hematopoietic stem cells)는 혈액에 관련된 세포로 분화가 가능하다. 구체적 예는, 시각장애 치료에 있어서 각막 외부의 표피 줄기세포(epithelial stem cells)(Cell 57, 201-209, 1989)는 각막이식의 새로운 방법으로 부각되고 있다(N. Engl. J. Med . 343, 86-93, 2000). 그리고 조혈 줄기세포(hematopoietic stem cells)의 경우 자가이식을 통한 치료에 이용할 수 있다(Blood Cells 20, 15-24, 1994).

그러나 최근에는 이들 성체 줄기세포가 같은 계통뿐만 아니라 다른 종류의 계통으로 분화됨으로써 이전에 알려졌던 것보다 성체줄기세포의 분화가 더 가능할 것으로 분석되며 이에 대한 연구가 진행 중이다. 골수조직(WO 02/064748) 또는 재생조직으로부터(WO 02/057430) 얻어진 성체줄기세포를 이용한 연구가 타겟 조직으로의 이식, 피더세포(feeder cell)층 위에서의 배양 및/또는 특정 성장인자의 존재 하에서의 배양과 같은 조건 하에서, 다른 배엽의 세포유형을 형성하기 위해 각각의 줄기세포의 분화도 일어날 수 있다는 것을 증명했다. 따라서 성체줄기세포가 동일 계통으로만 분화가능하다는 견해는 수정되어야만 했다. 예를 들면, 신경 줄기세포(neural stem cell)가 in vivo에서 혈액(Science 283, 534-537, 1999)과 골격근 세포(skeletal muscle cells) (Nature Neurosci. 3, 986-991, 2000)로 분화됨을 증명하였으며, 이식된 골수 중간엽 줄기세포(bone marrow mesenchymal stem cells)는 골격근 세포(skeletal muscle cell) (Nature 401, 390-394, 1999; Science 279, 1528-1530, 1998)와 간세포(liver cell) (Science 284, 1168-1170, 1999)로 분화되었고, 뇌에 이식하였을 경우 신경 마커(neuronal marker)가 발현됨을 확인하였다(Science 290, 1779-1782, 2000; Science 290, 1775-1779, 2000).

그렇지만, 이런 줄기세포를 분리하는데 많은 어려움이 따른다. 그 예로 중추신경계(central nervous system)나 골수(bone marrow), 망막(retina), 골격근 세포(skeletal muscle cells)와 같은 부위를 인간의 몸에서 분리하기란 많은 어려움과 고통이 따르기 때문이다. 특히 중추 신경계(central nervous system)과 같은 경우는 분리하는데 위험도가 크기 때문에 사실상 불가능하다.

또한, 성체 줄기세포를 얻는다고 하여도 성체줄기세포를 이용하여 세포치료를 하기에는 역부족이다. 첫 번째 이유로 세포치료를 하기 위해서는 많은 수의 세포들이 필요한데, 지금까지 제시된 방법에서는 그에 대한 세포수를 충족할 수 없기 때문이다. 두 번째 이유는 경제성인데, 현재 제시된 연구결과는 세포 치료를 하는데 있어서 많은 재료(배지 내 포함되어 있는 cytokine 등)를 필요로 한다. 세포배양에 첨가되는 재료들은 대부분 고가의 재료이기 때문에 경제적으로 효율성이 떨어진다.

따라서, 본 발명자들은 이러한 문제점을 극복할 수 있도록 줄기 세포 성격을 갖는 세포를 대량으로 증식시켜서 세포치료에 이용할 수 있는 방법을 제시하고, 보다 적은 재료를 이용하여 세포의 수를 늘린 후, 세포치료에 이용하여 더욱 경제적으로 세포치료를 할 수 있는 방안을 제시하고자 하였다.

이를 위하여 본 발명자들은 인간의 몸을 구성하는 기관 중 가장 접근하기 쉽 고 넓은 면적을 차지하는 피부 중 소음순에 초점을 맞추어 연구하였다. 성체줄기 세포를 분리할 수 있는 곳은 다양하지만 최근에 피부에서도 성체줄기 세포를 분리할 수 있다고 보고되고 있다. 처음 피부에서 다분화능을 가진 성체줄기세포를 분리한 프레다 디, 밀러(Freda D, Miller)는 설치류의 등가죽을 사용하여 줄기세포를 분리하였다. 이 줄기세포는 뉴런과 신경아교세포(glial cell), 평활근세포(smooth muscle cell), 지방세포(adipocyte)로 자발적인 분화가 일어났으며, 피부의 진피에서도 성체줄기세포의 존재를 확인 (Nature cell biology 3, 778-784, 2001)하였으며, 설치류의 피부에 존재하는 성체줄기세포가 모낭에 있는 진피 유두에 존재한다는 것을 증명하였다(Nature cell biology 6, 1082-1093, 2004). 2004년 시드하르탄 찬드란(Siddharthan Chandran)은 사람의 피부에서 성체줄기세포를 분리하여, 뉴런, 지방세포(astrocyte), 평활근 세포(smooth muscle cell)로 분화를 시켰으며, 지방세포(astrocyte)의 경우 칼슘 이미징(calcium imaging) 분석을 통하여 분화된 지방세포(astrocyte)의 기능을 확인하였다(The Lancet 364, 172-178, 2004). 2004년 프레다 디. 밀러(Freda D. Miller)는 또한 2005년 인간의 포경수술 후 나오는 표피 조직으로부터 성체줄기세포를 분리하여 뉴런과 신경아교세포(glial cell), 평활근 세포(smooth muscle cells)로 분화시켜 사람의 피부조직에서 성체줄기세포의 존재를 확인하였다(Stem Cells 23, 727-737, 2005). 그러나 아직까지 여성의 소음순에서 성체줄기세포를 추출하고 이를 다분화능 성체줄기세포로 배양하는 것에 관하여는 개시된 바가 없다.

본 발명자들은 상기와 같은 점을 감안하여 연구한 결과, 쉽게 분리 가능한 인간의 피부 세포 중 여성의 소음순으로부터 다분화능을 가지면서 손쉽게 체외 배양이 가능한 성체세포를 얻고, 상기 체외에서 대량 생산이 가능한 소음순 유래의 세포를 간단히 로우 글루코즈(low glucose) DMEM 배지 배양조건에서 분화 능을 유지하면서 대량으로 증식시킨 방법을 확립하게 되었다. 그러나 이러한 다분화능의 효율은 기존의 연구결과에서 지적하였듯이 다분화능력이 체외배양 과정을 통해 현저히 떨어지는 것을 알 수 있었다. 따라서 본 연구발명의 다른 측면은 이러한 문제점을 극복하는 데 있다. 이를 극복하기 위해 우선적으로는 상기 성체세포의 능력을 향상시키는 방법이 필요하다. 따라서 상기세포를 리프로그래밍(reprogramming) 과정을 통해 분화능력이 향상된 성체줄기세포를 만들기 위해 우선적으로 ITS + bFGF가 함유된 DMEM/F12-serum-free의 배지에서 3~7일 동안 배양을 하여 외배엽 전구세포로 리프로그래밍(reprogramming) 시켰다. 이러한 외배엽 전구세포를 다음에는 신경 줄기세포의 증식에 필요한 N2 배지 배양조건(NSC condition)으로 변환하게 되면 신경구(neurospheres) 형성을 촉진할 뿐 아니라 신경구의 증식도 촉진되게 함으로써 분화능이 있는 신경 줄기세포를 빠르고 쉽게 대량으로 획득할 수 있었다. 이러한 과정을 통해 완성된 리프로그래밍(reprogramming) 된 상기 신경 줄기세포가 다양한 조직으로의 분화능력을 가지는지 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 여성의 소음순 유래 세포를 배양하여 다분화능을 가지면서 손쉽게 체외 배양이 가능한 성체줄기세포를 제조하는 방법을 제공하고자 하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 다분화능을 가지는 여성의 소음순 유래 성체줄기세포를 제공하고자 하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 여성의 소음순 유래 성체세포를 리프로그래밍(reprogramming) 과정을 통해 외배엽 전구세포로부터 신경 줄기세포로의 분화를 유도하여 신경줄기세포의 획득이 현저히 향상되는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기와 같이 리프로그래밍(reprogramming) 과정을 통해 생산된 신경 줄기세포의 세포치료제로서의 용도를 제공하고자 하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 첫 번째 양태에서는 여성의 소음순으로부터 다분화성 성체줄기세포를 분리하는 방법을 제공한다.

여성의 소음순 조직은 남성의 포경수술 후 나오는 표피와 그 기원이 같기 때문에 여성의 조직인 소음순에서 줄기세포를 추출하여 성체 줄기세포를 분리하는 방법에 관한 규명을 통하여 남성뿐만 아니라 여성 또한 세포치료가 가능할 수 있게 되었다. 또한 소음순의 경우 조직 내에 존재하는 섬유 등의 구성 비율이 낮기 때문에 조직의 양에 비해 많은 수의 세포를 획득할 수 있다.

본 발명에 있어서, 여성의 소음순 유래 성체줄기세포는, 여성의 소음순 조직을 분리하여 진피조직을 얻고, 상기 진피조직에서 세포를 분리한 다음, 상기 분리된 세포를 로우 글루코즈(low glucose) DMEM 배지에서 배양함으로써 수득할 수 있다.

즉, 여성의 소음순 조직을 분리하여 진피를 얻고 진피에서 케라티노사이트를 블레이드로 긁어낸 다음, 상기와 같은 방법으로 얻어진 진피조직에서 세포를 분리하고 로우 글루코즈(low glucose) DMEM 배지에서 배양하여 도 2와 같은 소음순 유래 성체세포를 획득할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일 실시예로서, 상기 로우 글루코즈(low glucose) DMEM 배지는 10% FBS, 1% L-글루타민(L-glutamine) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin) 용액을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 로우 글루코즈(low glucose) DMEM 배지는 성체세포를 배양시키는 동안 상기 성체줄기세포의 분화 능을 유지할 수 있는 특징이 있다.

본 발명의 두 번째 양태에서는 상기 방법으로 수득되고, 하기의 특성을 나타내는 성체세포를 제공한다:

(1) CD13, CD29, CD44 및 CD90에 대하여 모두 양성 면역학적 특성을 나타냄;

(2) dermo-1은 발현하나 SHOX-2 유전자는 발현하지 않음;

(3) 세포 배양 접시에 부착되어 성장하며, 선형태의 형태학적 특성을 나타냄; 및

(4) 외배엽 및 중배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가짐.

본 발명의 세 번째 양태에서는 여성의 소음순 유래 성체세포를 신경 줄기세포로 분화 유도하여 다양한 조직으로의 분화능력을 가지는 신경 줄기세포를 얻는 방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 양태로서, 여성의 소음순 유래 다분화성 성체 줄기세포를 신경 줄기세포로 분화 유도하는 방법은 하기의 세 가지 방법을 통해서 가능하다.

첫 번째로, 본 발명의 여성의 소음순 유래 다분화성 성체 줄기세포를 신경 줄기세포로 분화 유도하는 방법은 하기의 단계를 포함할 수 있다:

소음순에서 분리한 성체세포를 로우 글루코스 DMEM 배지조건에서 배양하는 단계; 및

상기 로우 글루코스 DMEM 배지에서 배양된 성체 줄기세포를 N2 배지에서 배양하여 신경구 형성을 유도하는 단계.

두 번째로, 본 발명의 여성의 소음순 유래 다분화성 성체 줄기세포를 신경 줄기세포로 분화 유도하는 방법은 하기의 단계를 포함할 수 있다:

소음순에서 분리한 성체세포를 로우 글루코스 DMEM 배지조건에서 배양하는 단계;

상기 로우 글루코스 DMEM배지(condition I)에서 배양된 성체 세포를 ITS 배지에서 배양하는 단계; 및

상기 ITS 배지에서 배양된 성체 줄기세포를 N2 배지에서 배양하여 신경구 형성을 유도하는 단계.

세 번째로, 본 발명의 여성의 소음순 유래 다분화성 성체 줄기세포를 신경 줄기세포로 분화 유도하는 방법은 하기의 단계를 포함할 수 있다:

소음순에서 분리한 성체세포를 로우 글루코스 DMEM 배지조건에서 배양하는 단계;

상기 로우 글루코스 DMEM배지(condition I)에서 배양된 성체 줄기세포를 ITS + bFGF 배지에서 배양하는 단계; 및

상기 ITS + bFGF 배지에서 배양된 성체 줄기세포를 N2 배지에서 배양하여 신경구 형성을 유도하는 단계.

본 발명의 바람직한 일 실시예로서, 상기 로우 글루코스 DMEM 배지(condition I)는 10% FBS, 1% L-글루타민(L-glutamine) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일 실시예로서, 상기 ITS 배지(condition II)는 DMEM/F12(1:1), 5 μg/ml 인슐린, 50 μg/ml 트랜스페린, 30 nM 셀레늄 및 1 mM 글루타민으로 구성될 수 있다.

본 발명의 바람직한 일 실시예로서, 상기 ITS + bFGF 배지(condition III)는 DMEM/F12(1:1), 5 μg/ml 인슐린, 50 μg/ml 트랜스페린, 30 nM 셀레늄 및 1 mM 글루타민으로 구성된 ITS 배지와 10 ng/ml bFGF를 포함하여 이루어질 수 있다.

본 발명의 바람직한 양태로서, 상기 ITS와 ITS + bFGF 배지에서의 배양은 3~10일 동안, 가장 바람직하게는 7일 동안 수행될 수 있다.

본 발명의 바람직한 일 실시예로서, 상기 N2 배지는 DMEM/F12(1:1), 1X B27 서플리먼트(serum replacement), 25 μg/ml 인슐린, 20 nM 프로게스테론(progesteron), 100 μM 푸트레신(putrescine), 100 μg/ml 아포-트랜스페린(apo-transferrin), 30 nM 셀레늄, 20 ng/ml EGF(epidermal growth factor), 20 ng/ml bFGF(basic fibroblast growth factor)로 구성될 수 있다.

본 발명에서, 다분화능이란 동일계통뿐만 아니라 본래 성체줄기세포가 획득된 배엽과 다른 배엽으로 분화될 수 있는 능력을 말한다.

상기 소음순 유래 성체세포를 다분화능이 있는 성체줄기세포를 형성할 수 있도록 배양한다. 종래에는 성체세포를 분리한 후 신경구(neural sphere)를 형성하기 위해 곧바로 N2 배지에서 배양하였다. 이러한 배양방법에서는 신경줄기세포의 성격을 가진 세포 이외의 세포들은 죽는 경향이 있으며 신경구(neural sphere)가 형성되어 자라는 기간도 오래 걸린다. 이는 세포치료를 하기 위해서 사용되는 많은 양의 세포를 충족시키지 못하며 많은 시간을 소요하게 된다. 또한 고가의 많은 시료가 들어가기 때문에 경제적이지 못하다.

따라서, 본 발명은 이러한 문제점을 해결하기 위해서 성체세포를 분리한 후 기존의 N2 배양 방법이 아닌 100 mm 세포 배양 접시에 로우 글루코즈 DMEM이 포함된 배양액(condition I)에 세포를 시딩(seeding)한다. 상기 로우 글루코즈 DMEM은 가장 바람직하게는 10% FBS, 1% L-글루타민, 1% 페니실린-스트렙토마이신 용액으로 구성된다. N2 배지에 배양하지 않고 로우 글루코즈 DMEM에 배양할 경우, 얻은 소음순유래 성체세포의 양이 적더라도 계대배양을 통해 많은 양의 성체세포를 획득할 수 있게 되어 세포치료에 사용될 수 있을 정도의 많은 양을 얻을 수 있게 된다.

세포를 로우 글루코즈 DMEM에 시딩(seeding) 후, 계대배양을 통해 많은 양의 세포를 증식시켰으며, 3 패새지(passage) 이후부터 N2 배지에 배양하여 신경구(neurosphere)형성을 유도한다. 상기 N2 배지는 DMEM/F12(1:1), 1X B27 서플리먼트(serum replacement), 인슐린, 프로게스테론, 푸트레신, 아포-트랜스페린, 셀레늄, 20 ng/ml EGF, 20 ng/ml bFGF로 이루어진다. N2 배지 배양 후 대부분의 세포들이 신경구를 형성하기 시작하였다. 그러나 이러한 신경구의 형성 효율은 현저히 낮을 뿐 아니라 페시지 (passage)가 지날수록 신경구 형성의 능력이 현저히 떨어짐을 알 수 있었다. 이러한 문제점을 극복하기 위해 로우 글루코오스 DMEM에서 배양하던 세포를 먼저 ITS 배양액 또는 ITS+bFGF 배양액에서 3~7일 동안, 가장 바람직하기로는 7일 동안 배양함으로써 우선적으로 외배엽 전구세포로 리프로그래밍(reprogramming) 시킨 후 기존의 배양 방법인 로우 글루코즈 DMEM에서 배양된 세포와 비교하여 신경줄기세포로 유도하였을 때 리프로그래밍(reprogramming) 과정을 거친 외배엽 전구세포로부터 생성된 신경줄기세포의 생성 비율이 리프로그래밍(reprogramming) 과정을 거치지 않은 세포로부터 생성된 신경줄기세포의 비율에 비해 현저히 높게 나타나는 것을 확인할 수 있다.

따라서, 본 발명은 크게 세 가지의 방법을 통해 소음순 유래 성체세포로부터 신경줄기세포를 획득할 수 있었다. 먼저, 로우 글루코즈 DMEM에서 배양된 세포를 신경줄기세포로 유도하여 신경줄기세포를 획득하는 방법이다. 두 번째로는 로우 글루코즈 DMEM에서 배양된 세포를 우선 ITS 배양액에서 3-7일 동안 배양하여 세포의 분화능력이 향상된 리프로그래밍(reprogramming) 된 전구세포를 획득한 후 이 세포를 다시 신경줄기세포로 유도하여 신경줄기세포를 획득하는 방법이다. 세 번째로는 상기의 두 가지 방법이 비록 신경줄기세포를 획득할 수 있지만 그 효율은 처음 방법보다는 두 번째 방법에서 증가하였지만 만족할 수준이 되지 않다고 판단하여 이를 극복하기 위해 로우 글루코즈 DMEM에서 배양된 세포를 우선 ITS + bFGF 배양액에서 3-7일 동안 배양하여 세포의 분화능력이 향상된 리프로그래밍(reprogramming) 된 전구세포를 획득하는데 있는데 이는 두 번째 방법인 ITS만 함유된 방법에 비해 리프로그래밍(reprogramming) 된 외배엽 전구세포의 수를 현저히 증가시킬 수 있을 뿐 아니라 이를 통해 생산하는 신경줄기세포의 생산 효율도 현저히 증가함을 알 수 있었다. 즉, 세 번째 방법은 이처럼 리프로그래밍(reprogramming) 과정을 ITS+bFGF로 처리한 후 이 세포를 다시 신경줄기세포로 유도하여 신경줄기세포를 획득하는 방법이다.

상기와 같은 방법으로 소음순에서 얻어진 성체세포를 배양할 때 다분화능 성체줄기세포를 얻을 수 있다.

상기에서 얻어진 신경구는 다분화능이 있는 줄기세포로서 신경줄기세포로 형성될 수도 있으며 중간엽 줄기세포로서의 성격도 가지게 된다.

상기 형성된 신경구들은 배아 신경 줄기 세포에서 발현되는 SOX9(Development 130, 5681-5693, 2003)와 슬러그(Slug:Science 264, 835-839, 1994), 스네일(snail:Development 116, 1033-1039, 1992), 트위스트(twist:Dev . Biol . 247, 251-270, 2002), pax3(Development 124, 505-514, 1997) 등의 유전자를 발현한다. 따라서 분리하여 배양한 세포들이 신경줄기세포가 되었음을 확인할 수 있었다.

또한, 소음순 유래 성체세포에서 얻어진 신경구들이 중간엽 줄기세포의 마커(maker)인 CD13, CD29, CD44 및 CD90 등도 발현함으로써, 이들이 중간엽 줄기세포의 성격도 가지고 있음을 알 수 있다. 이 소음순 유래 성체세포로부터 얻어진 다분화능 성체줄기세포는 중간엽 줄기세포의 성격도 가지고 있으므로, 단순히 동일한 계통이 아닌 다른 계통의 기관으로도 분화할 수 있다. 중간엽 줄기세포는 뼈, 연골, 지방, 신경, 근육 등으로 분화할 수 있는 원시 세포로서, 구체적으로는, 빛에 반응하고 이러한 반응을 뇌에 전달할 수 있는 능력을 가진 망막 세포, 뼈를 만드는 조골세포, 뼈를 흡수하는 파골세포 또는 연골을 제조하는 연골세포, 근세포, 내피세로, 상피세포, 심장, 폐, 간, 신장 또는 췌장세포 등 다양한 기관으로 분화할 수 있는 바, 본 발명에 따르면 소음순의 진피조직의 제거와 같은 작은 수술로 세포를 분리하여 약간의 조직만으로도 많은 수의 중간엽 줄기세포의 성질을 가진 세포를 얻을 수 있어, 이를 줄기세포의 이식이 필요한 다양한 질병에 이용하는 것이 가능해진다.

본 발명의 네 번째 양태에서는 여성의 소음순 유래 성체세포를 리프로그래밍(reprogramming) 단계를 거치면서 배양하여 얻은 다분화능 성체줄기세포를 포함하는 세포치료제로서의 용도를 제공한다.

소음순 유래 성체세포로부터 얻어진 다분화능이 있는 성체줄기세포는 적절한 조건하에서 뇌, 체세포 형태, 조형성 조직, 심금세포, 내피조직, 심근 조직, 간, 폐, 소화관, 위장관의 상피, 평활근 조직, 피부, 간 조직, 동맥 및 심혈관 조직과 관련된 세포에서 신경 단백질을 발현하는 세포로 분화될 수 있다. 소음순 유래 줄기세포로부터 얻어진 다분화능이 있는 성체줄기세포가 이식되어 간 조직, 뇌 조직, 심혈관계 조직과 같은 조직을 회복하거나 재생하는 경우에 생체 내에서 분화될 수도 있다.

또한, 소음순 유래 성체세포를 시험관 내에서 분화시켜 신경학적 변성 질환 등의 질환치료에 유사하게 사용할 수 있다. 이렇게 소음순 유래 성체세포에서 얻어진 다분화능이 있는 성체줄기세포인 신경 줄기세포는 알츠하이머 병, 파킨슨 병 및 연령 관련 기억 손실로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 신경학적 질환 치료시 사용된다. 또한 소음순 유래 성체세포에서 얻어진 다분화능이 있는 성체줄기세포는 피부 대체용으로 사용되거나, 화상 또는 피부 노화와 같은 진피 관련된 상태 또는 질환을 치료하는데 사용될 수 있다.

또한, 상기 언급한 질환 및 질병 외에 내피 세포 질환, 간 질환 또는 뇌 질환 및 바람직하게는 하기에서 상세히 논의되는 바와 같은 뇌 또는 간 질환을 포함하는 세포 증식성 및/또는 미분화 질환, 골 대사와 관련된 질환, 심혈관계 질환을 위한 줄기세포 치료법에 사용될 수 있다.

세포 증식성 및/또는 미분화 질환의 예로는 암(예: 암종, 육종), 전이성 종양 질환 또는 조혈성 종양 질환(예: 백혈병)이 포함된다. 전이성 종양은 이로써 제 한되는 것은 아니지만, 전립선, 결장, 폐, 가슴 및 간 기관을 포함하는 다수의 기본 종양 형태로부터 유발될 수 있다.

또한, 본 발명의 소음순 유래 성체세포로부터 얻어진 다분화능 성체줄기세포는 다양한 증식성 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 이러한 질환에는 조혈성 종양 질환이 포함된다. 본 명세서에서 사용된 용어, "조혈성 종양 질환"은 예를 들면 척수, 림프구 또는 적혈구 계통으로부터 유발되는 조혈성 기관의 과형성/종양성 세포 또는 이의 전구체 세포를 포함하는 질병을 포함한다. 바람직하게는, 질병은 불량 미분화 급성 백혈병, 예를 들면 적혈구모세포성 백혈병 및 급성 거핵아세포성 백혈병으로부터 유발되는 백혈병과, 척수 질환의 부가적 예로서는, 이로써 제한되는 것은 아니지만 급성 전골수성 백혈병, 급성 골수성 백혈병 및 만성 골수성 백혈병이 포함되며, 림프구 악성 종양으로는 이로써 제한되지는 않지만, B-계통 ALL 및 T-계통 ALL을 포함하는 림프성 백혈병(All), 만성 림프성 백혈병(CLL), 전림프성 백혈병(PLL), 모양 세포성 백혈병(HLL) 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증(WM) 등이 포함된다. 악성 림프종의 부가형태에는 이로써 제한되는 것은 아니지만, 비포지킨 림프증 및 이의 변형, 말초 T-세포림프종, 성인의 T 세포 백혈병/림프종(ATL), 피부 T 세포 림프종(CTCL), 거대과립 림프구성 백혈병(LGF), 호지킨 병 및 리드-스텐른버그 병이 포함된다.

본 발명의 소음순 유래 성체세포는 골대사와 관련된 질병을 치료하는데 사용될 수 있다. 골 대사는 뼈 구조의 형성 또는 변성시, 예를 들면, 골 형성, 골 흡수 등에 있어서 직접 또는 간접적인 영향을 의미하며, 이는 궁극적으로 칼슘 및 인산 염의 혈청 농도에 영향을 줄 수 있다. 이 용어는 또한 뼈 세포, 예를 들면, 파골세포 및 조골세포에 있어서의 활성을 포함하여, 이는 결국 골 형성 및 변성을 유발할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 소음순 유래 성체세포로부터 얻어진 다분화능 성체줄기세포는 단구 세포 및 단핵 식세포의 파골세포로부의 미분화 자극과 같은 골 재흡수 파골세포의 상이한 작용을 치료하는데 사용될 수 있다. 따라서 본 발명의 소음순 유래 성체세포로부터 얻어진 다분화능의 성체줄기세포는 골 형성 및 변성에 영향을 줄 수 있는 골세포의 생성시 사용될 수 있으므로, 골 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 이러한 질환의 예로는 이로써 제한되는 것은 아니지만 골다공증, 골이영양증, 골연화증, 구루병, 낭종 섬유성 골염, 신성골이영양증, 항경련 치료, 골감소증, 만성신장 질환 등이 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 심장에 관여되는 질환 또는 심혈관계 질환에 는 심혈관계, 예를 들면, 심장, 혈관 및/또는 혈액에 영향을 주는 질병 또는 질환이 포함된다. 심혈관계 질환은 동맥압의 불균형, 심장의 기능 부전, 또는 예를 들면, 혈전에 의한 혈관의 폐색에 의해 유발될 수 있다. 심혈관계 질환에는 이로써 제한되는 것은 아니지만 동맥경화증, 허혈성 재관류 손상, 재발협착증, 동맥 염증, 혈관벽 재형성, 심실 재형성, 속심실 조율, 관산 미세색전증, 빈맥, 서맥, 압력 과부하, 대동맥 벤딩, 관상 동맥 결찰, 부정맥 등을 포함한다.

본 발명의 다섯 번째 양태에서는 여성의 소음순 유래 성체세포를 배양하여 얻은 다분화능 성체줄기세포로부터 분화하여 얻은 신경 줄기세포의 세포치료제로서 의 용도를 제공한다.

상기 신경 줄기세포는 신경학적 질환의 치료를 위하여 사용될 수 있다. 구체적인 신경학적 질환으로는 알츠하이머 병, 파킨슨 병 및 연령 관련 기억 손실 등이 있다.

본 발명의 소음순 유래 성체세포로부터 얻어진 다분화능이 있는 성체줄기세포, 및 이로부터 분화된 신경 줄기세포는 치료를 위해 각각의 세포를 포함하는 약학적 조성물로 존재할 수 있다. 이러한 약학적 조성물은 세포에 추가로 생리학적으로 받아들여질 수 있는 매트릭스(matrix) 또는 생리학적으로 받아들여질 수 있는 부형제를 포함할 수 있다. 매트릭스 및 /또는 부형제의 유형은 의도된 투여 루트에 따라 다른 것들에 의존할 것이다. 이 약학적 조성물은 또한 줄기세포 치료시 함께 사용되는 다른 적합한 부형제 또는 활성 성분을 선택적으로 포함할 수 있다.

줄기세포를 치료제로 사용하는 경우 적절한 투여량은 10⁴-10⁶ cells/회이다.

본 발명은 여성의 소음순으로부터 다분화능을 가지는 성체줄기세포를 세포치료에 필요한 만큼 대량으로 빠르고 손쉽게 획득하는 방법을 제공할 수 있다. 소음순 유래 성체세포로부터 리프로그래밍(reprogramming) 과정을 거치면서 다분화능이 있는 성체줄기세포인 신경 줄기세포를 얻기 때문에 여성 또한 세포치료가 가능하도록 한다. 또한, 적은 양의 조직으로부터 줄기세포를 얻고 이를 다량으로 증식시켜 다분화능 성체줄기세포를 얻을 수 있기 때문에 세포치료에 있어 경제적인 효율성이 높다. 즉, 본 발명은 소음순 유래 줄기세포로부터 많은 양의 다분화능이 있는 성체줄기세포를 획득하여 다양한 조직으로의 분화능력을 가지는 신경 줄기세포로 분화시킴으로써 다양한 세포치료에 적용할 수 있는 신경 줄기세포를 제공할 수 있고 이의 대량생산을 가능하게 한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 소음순 유래 성체세포를 이용하여 신경 줄기세포로 유도를 하기 위한 리프로그래밍 조건 확립

도 1은 소음순에서 유래한 성체세포를 이용하여, 보다 더 효율적으로 신경 줄기세포를 생성할 수 있는 방법을 나타내고 있다. 소음순 유래 성체 세포를 이용하여, 세 가지의 방법을 이용하여 신경 줄기세포로 유도하였다. Condition I (로우 글루코오스 DMEM), II (ITS), III (ITS+bFGF) 세 가지 조건을 사용하였고, 가장 효율적인 방법을 실험을 통해 증명하였다. Pathway I은 condition I에서 신경 줄기세포의 배양액으로 바꿔주었을 때의 결과를 알아보기 위해서이고, pathway II는 condition II (ITS)에서 3-7일 동안 배양을 하여 외배엽전구세포로의 유도를 한 후 신경 줄기세포의 배양액을 바꾸어주었을 때의 신경구의 형성을 알아보기 위해서이 다. 또한, condition II의 조건에서는 세포의 성장이 현저히 떨어지는 문제점이 있어서 이를 극복하기 위해서 bFGF(basic fibroblast growth factor)라는 싸이토카인(cytokine)을 사용하였고, 이 조건이 condition III로 앞의 condition II의 문제점을 해결하고 있다. 이와 같이 condition II와 condition III라는 과정을 통해 소음순 유래 성체세포의 리프로그래밍이 가능하고, 또한 대량 생산도 가능하다는 것을 증명하였다 (도 1).

실시예 2: 소음순 유래 성체세포의 분리

여성 의원으로부터 40대 후반 여성의 음부 성형 및 질공 축소 시술을 받은 환자의 소음순 조직을 얻어서 이를 가지고 분리하였다. 먼저 박테리아로부터의 오염을 방지하기 위해 70% EtOH에 약 30초간 담가 두어 소독을 한 다음, 항생제가 들어있는 PBS로 5번 세척하였다. 응고된 혈액을 제거한 다음 1 ㎠ 크기로 소음순 조직을 절단하였다. 조직을 5 unit / ml의 디스파제(dispase, Invitrogen) 용액에 4℃에서 밤새 배양(incubation)하였다. 표피는 포셉(forcep)을 이용하여 제거하였으며, 표피와 진피 사이에 존재하는 케라티노사이트(keratinocyte)와 분비선을 제거하기 위하여 멸균된 블레이드(blade)로 긁어내었다. 진피 조직을 1mm² 크기로 자른 다음 5%의 콜라게나제(collagenase IV, Invitrogen, USA)에서 30분~1시간 배양(incubation)하였다. 배양(incubation) 후 시료를 원심 분리하여 디스파아제 (dispase)를 제거한 후, 배지에 부유시켰다. 피펫을 이용하여 조심스럽게 피펫팅하 여 조직으로부터 세포들을 분리하였다. 조직과 단일 세포들을 분리하기 위하여 70μm 세포 스트레이너(cell strainer, BD sciences, UK)를 이용하여 분리시켰다. 분리된 세포를 원심 분리하여 모은 후, 로우 글루코즈 DMEM(low glucose DMEM: 10% FBS, 1% L-glutamine, 1% penicillin-streptomycin solution)에 재부유시켜 100mm 세포 배양 접시에 세포를 시딩(seeding)하였다. 24시간 후 배지을 바꾸었다. 24시간 후의 대부분의 세포는 세포 배양 접시에 부착되어 있으며, 외형은 소음순 진피의 형태를 가지고 있었다. 배지는 2일마다 교환해주었으며 90% 세포 밀도 일 때 계대 배양하였다. 이와 같은 방법으로 분리한 세포를 계대 배양을 통해 안정된 세포의 모양을 가지게 되었을 때의 모습을 현미경으로 배율별로 관찰을 하였다(도 2). 도 2에서의 결과와 같이 분리된 세포가 섬유아세포(fibroblasts)와 같은 세포의 모양을 가지고 있는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 3: 소음순 유래 성체세포의 핵형 분석

소음순 유래 성체세포를 분리한 후에 로우 글루코오스 DMEM(condition I)에서 배양한 다음 핵형 분석(삼광의료재단, 서울)을 통해서 정상 핵형을 나타내고 있는지를 확인하였다. 그 결과, 도 3과 같이 정상적인 핵형을 나타냄을 알 수 있었다 (도 3).

실시예 4: 소음순 유래 성체세포의 중간엽 세포의 마커 확인

소음순 유래 성체세포를 분리한 후에 로우 글루코오스 DMEM(condition I)에 서 배양한 다음 중간엽 세포의 마커를 확인하였다. FACS analysis와 RT-PCR을 통해서 각각의 마커의 발현을 확인하였다. FACS analysis를 통해 CD13, CD29, CD44, CD90 등의 마커가 발현되고 있는 것을 확인하였고(도 4A), RT-PCR을 통해 중간엽 세포에서 특이적으로 발현되는 마커들이 발현되는 것을 대조구(positive control)인 MSCs(mesenchymal stem cells)와 비교하여 확인하였다(도 4B). 도 4B에서 hLMDCs가 소음순에서 분리한 성체세포를 의미하고, hMSCs가 대조군의 세포를 나타낸다.

실시예 5: Pathway I을 통한 신경 줄기세포의 형성 유도 및 마커의 확인

실시예 1과 도 1에서 언급한 것과 같이 신경 줄기세포의 유도를 위한 방법으로 condition I인 로우 글루코오스 DMEM에서 배양하고 있던 세포에 Trypsin/EDTA 처리를 한 후에 60mm bacterial plate(suspension cultured plate: non-coated plate)에 40×10⁴의 세포를 시딩(seeding)을 하였다. 상기와 같이 처리된 세포는 신경 줄기세포의 배양액인 N2 media(DMEM/F12 + B27 serum replacement + putrescine + progesteron + selenium + apo-transferrin + Insulin + penicillin/streptomycin)에서 배양을 하고 bFGF와 EGF를 처리해주면서 신경구의 형성을 유도하였다. 신경 줄기세포의 배양액에서 배양을 하면서 다음 날부터 세포가 퇴축(restraction)되기 시작을 했고, 4일 후부터는 신경 줄기세포와 비슷한 모양의 신경구(neurospheres)가 형성되기 시작했다. 이와 같은 실험을 패시 지(passage)별로 비교하기 위해서 초기 패시지(early passage)(도 5B에서 p2)라고 할 수 있는 세포와 후기 패시지(late passage)(도 5B에서 p17)라고 할 수 있는 세포를 위에서 언급한 방법대로 실험을 하였고, 그 결과 도 5A에서의 결과와 같이 유사한 모양의 신경구가 형성이 되는 것을 확인할 수 있었다.

도 5A에서 확인하였던 신경구가 신경 줄기세포와 동일한 세포인지를 확인하기 위해서 RT-PCR과 면역형광염색법(Immunocytochemistry)을 사용하였다. 신경 줄기세포에서 특이적으로 발현되는 마커인 nestin, sox2, CD133 등의 마커가 RT-PCR 을 통해 발현되는 것을 확인하였고, 또한 신경능 줄기세포(neural crest stem cells)의 마커인 p75, slug, pax3, twist, sox9의 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 5B). 또한, nestin과 sox2의 발현을 면역형광염색법으로 확인하기 위해서 세포를 폴리-L-오르니틴(PLO, (10 μg/ml, poly-L-orithinine, sigma))와 피브로넥틴(fibronectin, (10 μg/ml, Invitrogen))으로 코팅(coating)된 플레이트(plate)에 시딩을 하고, 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde, EMS)로 20분 동안 고정을 했다. 고정한 시료(sample)를 10% 노말 덩키 세럼(normal donkey serum, Jackson Immunoresearch) + 0.1% BSA( bovine serum album, sigma) + 0.3 % Triton X-100(sigma)이 포함된 PBS로 블러킹(blocking)을 한 후에 anti-nestin(R&D system), anti-Sox2(santacruz)를 사용하여 4℃에서 밤새(overnight) 반응을 시킨 후에 상온(RT)에서 anti-mouse cy3(Jackson Immunoresearch), anti-rabbit alexa 488(Invitrogen)로 반응을 시킨 후 마지막으로 DAPI(1 μg/ml, sigma)를 사용하여 핵염색(nuclear stain)을 하였다. 염색을 한 후에 제이스 콘포칼(Zeiss confocal, Carl Zeiss)로 확인을 하였다. 이와 같은 방법을 통해 신경 줄기세포에서 특이적으로 발현되는 마커가 발현이 되고 있다는 것을 확인하였고, 신경 줄기세포로의 유도가 되었음을 증명할 수 있었다(도 5C).

실시예 6: Pathway II 와 III 를 통한 소음순 유래 성체세포의 신경 줄기세포로의 유도

실시예 1에서 언급했던 다이어그램에서 pathway II와 III의 조건이 필요한 것을 언급하였다. 본 실시예에서는 실시예 5에서의 결과를 토대로 하여, pathway II와 III의 조건에서 사용되는 condition II와 III가 리프로그래밍에 중요하다는 것을 증명하고자 한다. Condition II와 III 단계를 거치면서 성체세포는 외배엽전구세포와 같은 성격을 가지는 세포로 변환하게 된다. 그 이후에 신경 줄기세포의 배양액으로 신경 줄기세포로 유도하는 과정을 통해 신경 줄기세포가 형성되게 된다. 즉, Pathway II에서는 ITS(DMEM/F12 + Insulin + apo-transferrin + selenium + penicillin/streptomycin)라는 condition II의 조건을 사용하였고, condition II의 조건에서 세포를 배양하였을 때, 외배엽에서 특이적으로 발현되는 마커가 증가하고 있는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 condition II의 경우에는 세포의 성장 속도가 현저히 떨어지는 단점을 가지고 있어서, 이를 보완하기 위해서 condition III인 ITS + bFGF(10 ng/ml) 배양액을 사용하게 되었다. 도 6A에서는 각각의 조건에서의 성장 곡선을 비교한 결과는 나타내고 있다. Condition I, II, III에서의 세포의 성장 속도를 7일 동안 측정을 하고, 그 결과를 그래프로 정리하였다. Condition II의 조건은 현재까지 알려진 배아 줄기세포의 신경 줄기세포로의 유도과정 중에 포함된 단계이고, bFGF는 배아 줄기세포의 유지 및 신경 줄기세포의 유지에 필요한 사이토카인이다. 또한, bFGF는 세포의 성장을 증가시켜주는 사이토카인이므로, condition II에서의 세포 성장이 떨어지는 문제를 해결할 수 있었다. 7일 동안 성장률을 측정한 결과, condition II가 가장 성장 정도가 낮았고, condition III는 condition I보다도 더 빠른 성장 속도를 나타내었다. bFGF에 의해서 condition II에서의 성장이 느려지는 부분을 해결할 수 있었다(도 6A).

Condition II와 III에서 외배엽에서 특이적으로 발현되는 마커 및 신경 줄기세포에서 특이적으로 발현되는 마커들을 condition I에서와 비교해보았다. 먼저, FACS analysis 방법을 사용하여, nestin, p75, NCAM의 발현을 확인하였다. Condition II와 III는 각각의 조건에서 7일 동안 배양한 세포를 사용하였고, 1% FBS/PBS로 블로킹(blocking)을 하고, 0.5% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 고정을 한 후에, 1% 사포닌(saponin)(sigma)로 퍼미어빌라이제이션(permeabilization)을 하였다. 그 후에 0.1% 사포닌이 포함된 PBS에서 anti-nestin (R&D), anti-p75 (Promega), anti-NCAM (santacruz)를 4℃에서 1시간 동안 쉐이킹(shaking) 하면서 반응을 시켰다. 그리고 anti-mouse alexa 488, anti-rabbit alexa 488 (Invitrogen)을 4℃에서 40분 동안 쉐이킹 하면서 반응을 시킨 후에, 분석(analysis)을 하였다. Nestin, p75, NCAM이 condition II와 III에서 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이는 도 7A 및 도 7B에서 RT-PCR을 통해서 특이적인 마커들이 증가하고 있는 결과와 일치하고 있었다. 이러한 결과로부터 condition II와 III의 과정을 통해서 소음순에서 분리한 성체세포가 리프로그래밍되어 외배엽 전구세포로의 특징을 가지는 세포로 변환되었음을 증명할 수 있었다(도 7A, 도 7B).

실시예 7: 소음순 유래 성체세포의 배양 조건( condition I, II , III )에 따른 신경구( neurospheres)의 형성 능력 비교

소음순 유래 성체세포를 분리한 후 로우 글루코즈 DMEM(low glucose DMEM, 10% FBS, 1% L-glutamine, 1% penicillin/streptomycin)이 포함된 배양액에 세포를 시딩(seeding)하였다. 그 후 계대배양을 통해 많은 양의 세포를 증식시켰으며 N2 배지(DMEM/F12(1:1), progesteron, putrescine, selenium, insulin, apo-transferrin, penicillin/streptomycin) + 1X B27 + 20 ng/ml EGF + 20 ng/ml bFGF (NSC condition)에서 신경구(neurosphere) 형성을 유도하였다.

또한, 이와 별도로 상기 실시예 6에서 기재한 바와 같이 condition I(로우 글루코오스 DMEM) 후에 condition II(ITS), 또는 condition III(ITS + bFGF)에서 배양을 하던 각각의 세포를 신경 줄기세포의 배양액으로 바꾸어 배양을 하여 condition I에서만 배양을 하던 세포의 결과와 비교를 하였다.

즉, condition II와 condition III에서의 배양은 7일 동안 하였고, 7일 후에 0.05 % Trypsin/EDTA 처리를 하였다. Condition I에서만 배양하던 세포도 0.05 % Trypsin/EDTA 처리를 하였다. 그 후, 상기와 같이 처리된, 40×10⁴ 개의 세포를 60mm bacterial plae(suspension cultured plate)에 시딩(seeding)을 하고 신경 줄기세포의 배양액인 N2(DMEM/F12 +Insulin +apo-transferrin +selenium + progesterone + putrescine + penicillin/streptomycin) + B27 (serum replacement)+ bFGF 20 ng/ml + EGF (human recombinant epidermal growth factor) 20 ng/ml (NSC condition)에서 배양을 하였다. 신경 줄기세포의 배양액에서 배양을 하면서 다음 날부터 세포가 퇴축(retraction)되기 시작을 했고, 4일 후부터는 신경 줄기세포와 비슷한 모양의 세포인 신경구(neurospheres)가 형성되기 시작했다. 각각의 배양액에서의 신경 줄기세포의 형성 정도를 신경구(neurospheres)의 수로 비교를 하였다.

도 8A와 도 8B는 이를 확인한 결과인데, 성장 배지인 condition I (로우 글루코오스 DMEM)에서 바로 신경 줄기세포의 배양액으로 바꾸어 신경 줄기세포로의 유도를 한 경우보다 condition III (ITS+bFGF)에서 7일 동안 배양을 하고 난 후에 신경 줄기세포로의 유도를 한 경우 신경구(neurospheres)의 수가 현저하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이는 condition II (ITS)에서 7일 동안 배양을 한 경우보다 더 많았다. Condition I에서 보다 Condition II에서 7일 동안 배양을 한 경우에 신경구의 수가 더 많은 것으로 측정되었고, bFGF가 있는 경우 배 이상의 신경구의 형성을 관찰할 수 있었다. 도 8A에서 각각의 배양 조건에서 만들어진 신경구의 모습을 현미경으로 관찰한 결과를 나타내고, 도 8B에서 신경구의 형성 비율을 그래프로 그려 비교하였다. 이 결과를 통해 성장 배지인 condition I (로우 글루코오스 DMEM)에서 배양한 후에 condition III (ITS+bFGF) 배양액에서 7일 동안 배양하는 단계를 수행함으로써, 신경 줄기세포로의 유도 효율을 월등히 증가시킬 수 있음을 확인할 수 있었다(도 8A, 도 8B).

실시예 6: 신경 줄기세포의 마커 확인

Condition II와 III에서 7일 동안 배양한 후에 유도해서 만들어진 신경구에 대해서도 신경 줄기세포에서 특이적으로 발현되는 마커가 발현되는지 확인하였다. Condition I에서 만들어진 신경 줄기세포의 경우에는 앞에서 pathway I에서 증명하였기 때문에, pathway II와 III에서 유도된 세포가 동일한 성격을 가지고 있는지를 비교하면서 실험을 하였다. 세 가지 조건에서 유도된 신경구에서 신경 줄기세포에서 특이적으로 발현되는 마커가 동일하게 발현되는 것을 RT-PCR을 통해 증명할 수 있었다. 신경 줄기세포(neural stem cells)에서 특이적으로 발현되는 마커는 nestin, sox2, CD133인데, 이와 같은 마커의 발현이 신경 줄기세포로 유도된 세포에서 발현이 되고 있고, 서로 다른 배양 조건에서 만들어진 세포도 같은 결과를 보였다. 또한, 신경능 줄기세포(neural crest stem cells)에서 발현되는 마커들인 AP2, Sox10, p75도 동일하게 발현이 되고 있었다 (도 9A, 도 9B).

실시예 8: 인 비트로 분화

본 발명의 소음순 유래 성체세포에서 만들어진 신경 줄기세포가 인 비트로 상에서 세 가지 타입, 즉 아스트로사이트(astrocytes), 올리고덴드로사이트(oligodendrocytes) 및 뉴론 (neruons)으로 분화가능한지를 확인하였다.

신경 줄기세포의 배양액인 N2 + B27 + bFGF + EGF (NSC condition)에서 배양을 하던 세포를 PLO(sigma)와 라미닌(Laminin)(10 μg/ml, sigma)으로 코팅한 플레이트에 시딩(seeding)을 하고, bFGF과 EGF를 첨가하지 않은 N2 + B27 배양액에서 분화를 유도하였다.

그 결과, 올리고덴드로사이트로의 분화가 유도된 것을 면역형광염색법을 통해 각각 특이적으로 발현되는 마커를 통해 확인할 수 있었다. 올리고덴드로사이트 (oligodendrocytes)는 O4, CNPase의 마커 발현을 면역형광염색법으로 확인을 하여 분화가 유도된 것을 증명하고 있다(도 10A). 뉴론으로의 분화는 DMEM/F12 + ITS + AA (ascorbic acid, 200 μM, sigma)에서 7일 동안 배양한 결과, 뉴론에서 특이적으로 발현되는 마커인 Map2a 및 Tuj1의 마커가 발현되고 있음을 면역형광염색법 및 RT-PCR을 통해 확인한 결과를 나타내고 있다(도 10B). 따라서 상기 결과를 통해 소음순에서 분리한 성체세포를 이용하여 신경 줄기세포로 유도하여 만들어진 신경구가 뉴론 및 올리고덴드로사이트로 분화 가능함을 확인할 수 있었다.

도 1은 소음순에서 분리한 성체세포를 리프로그래밍 과정을 통해서 신경 줄기세포로 변환시키는 방법을 간략하게 도시한 것이다. Condition I은 로우 글루코오스 DMEM (Low-glucose DMEM + 10% FBS + 1% penicillin/streptomycin)에서 배양하는 조건을 나타내고, condition II은 ITS (DMEM/F12 + 5 μg/ml Insulin + 50 μg/ml apo-transferrin + 30 nM selenium + 1% penicillin/streptomycin), condition III는 ITS + bFGF 10 ng/ml 조건을 나타낸다. 각각의 condition 조건에 따라 pathway를 세 가지로 나눌 수가 있는데, condition I에서 신경 줄기세포 배양 조건 (NSC medium: DMEM/F12 + putrescience + progesteron + Insulin + apo-transferrin + selenium + 1% penicillin/streptomycin + B27 serum replace ment + bFGF + EGF) 으로 바로 바꿔주는 경우가 pathway I이다. 리프로그래밍의 과정은 pathway II와 III로 condition I에서 각각 condition II (ITS) 혹은 condition III (ITS + bFGF)조건으로의 변환을 의미한다. 따라서 pathway II는 condition I에서 II로 바꿔준 후에, NSC condition조건으로 바꿔주면서 신경 줄기세포의 유도를 하는 방법이고, pathway III는 condition I에서 III로 바꿔준 후에 다시 NSC condition조건으로 바꿔주면서 신경 줄기세포로 유도를 하는 방법을 나타낸다. 따라서 도 1에서는 성체세포를 리프로그래밍의 과정을 통해서 신경 줄기세포로 유도하는 방법을 제시하고 있다.

도 2에서는 소음순으로부터 분리한 성체세포를 condition I에서 배양을 하면 서 세포의 모습을 배율별로 현미경으로 관찰한 모습을 나타내고 있다. 섬유아세포 (fibroblast)의 모양을 하고 있는 것을 관찰할 수 있다(a는 40배, b는 100배, c는 200배로 관찰한 결과임).

도 3은 소음순으로부터 분리한 성체세포의 핵형분석 결과를 나타내고 있다. 분리한 세포가 인비트로상에서 배양을 한 후에도 정상핵형을 나타내고 있는 것을 확인할 수 있다.

도 4는 소음순으로부터 분리한 성체세포의 중배엽 관련 마커를 FACS 분석 (A) 및 RT-PCR (B)로 확인한 결과를 나타낸다. RT-PCR에서 중배엽 마커가 발현되는 세포인 MSCs (mesenchymal stem cells)를 positive control로 사용하였다.

도 5는 소음순으로부터 분리한 성체세포를 pathway I에 따라 신경 줄기세포로 유도한 결과를 나타낸다. 소음순으로부터 분리한 성체세포를 condition I에서 배양을 하다가 신경 줄기세포 배양액 (NSC condition)으로 바꿔주면서 신경 줄기세포로의 유도를 하였을 때의 세포의 모습을 나타낸다. A에서 a-c는 passage 2에서 신경구 (neurospheres)의 형성 진행과정을 보여주는 것이고, d-f는 passage 17에서의 신경구의 형성의 진행과정을 보여주는 것이다. 또한, B는 condition I에서 배양을 하면서 패새지 (passage)별로 성체세포의 성장률을 보여주면서, passage 2에서와 passage 17에서의 신경구의 형성 정도를 비교한 결과를 나타낸 그래프이다. 도 5C는 5A와 B에서 형성된 신경구가 신경 줄기세포의 특성을 지니고 있는지를 확인한 결과를 나타내고 있다. 5C의 a번과 b번에서 신경 줄기세포에서 특이적으로 발현되는 마커가 신경구에서 발현이 되고 있는 것을 확인할 수 있고, 신경능 줄기세포의 마커들이 신경구에서 증가하고 있는 양상을 보이고 있는 것을 확인할 수 있다. 도 5D는 이와 같은 세포를 면역형광염색법을 통해서 신경 줄기세포에서 특이적으로 발현되는 대표적인 마커인 nestin과 sox2의 발현을 확인한 결과를 나타낸다. 도 5를 통해서 pathway I에서의 방법을 통해 유도된 신경구가 신경 줄기세포의 특성을 가지는 것을 확인할 수 있다.

도 6 내지 도 10에서는 pathway II와 III의 방법을 증명한 결과를 나타내고 있다. 성체세포의 리프로그래밍의 방법으로 condition II (ITS)를 언급하고 있고, condition III (ITS + bFGF)은 condition II가 가지는 문제점인 성장속도의 저하를 해결할 수 있는 방법으로 제시하였다.

도 6A는 condition I, II, III에서의 세포의 성장 속도를 비교한 결과를 나타내고 있다. 그 결과, condition III에서 세포가 가장 왕성하게 자라는 것을 확인할 수 있었고, condition II는 condition I에서보다 성장 정도가 떨어지는 것을 확인할 수 있었다. 도 6B는 각각의 condition에서의 세포의 모양을 나타내고 있다.

도 7A와 도 7B는 condition II와 III에서 외배엽에 관련된 마커들이 증가하는 것을 증명하고 있다. 도 7A에서는 신경 줄기세포 (neural stem cells) 및 신경능 줄기세포 (neural crest stem cells)에서 특이적으로 발현되는 마커인 nestin과 p75, NCAM이 condition II와 III에서 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 7B에서도 그와 관련된 마커들이 대부분 각 조건에서 배양을 7일간 한 후에 증가하는 양상을 보이고 있는 것을 확인할 수 있었다.

도 8A와 도 8B는 condition I, II, III에서 NSC condition으로 바꿔주었을 때의 신경구의 형성 비율을 비교한 결과를 나타내고 있다. 도 8A에서는 각각의 조건에서 형성되는 신경구의 모습을 보여주고 있고, 도 8B에서는 신경구의 형성 비율을 그래프로 비교하여, condition III를 통해서 신경 줄기세포의 배양 조건으로 바꿔주었을 때 가장 많은 신경구가 형성되는 것을 증명하고 있다.

도 9A는 이 때 각각의 조건에서 유도된 신경구는 모두 신경 줄기세포에서 특이적으로 발현되는 마커들이 발현되고 있는 것을 RT-PCR의 방법으로 확인한 결과이다. 또한, 도 9B에서는 면역형광염색법을 사용하여 신경 줄기세포에서 특이적으로 발현되는 마커인 nestin, sox2, p75가 발현되고 있는 것을 확인한 결과를 나타내고 있다.

마지막으로, 도 10A와 도 10B는 신경 줄기세포로 유도하여 형성된 세포들이 신경 줄기세포와 같이 인 비트로 상에서 분화가 되는지를 확인한 결과를 나타내고 있다. 올리고덴드로사이트로의 분화를 면역형광염색법으로 CNPase, O4가 발현되는 세포가 형성된 것을 확인하였고(도 10A), 뉴론으로의 분화는 Map2와 Tuj1이 발현되는 것을 면역형광염색법과 RT-PCR을 통해서 확인하였다(도 10B). 이와 같은 과정을 통해서 신경 줄기세포의 동일한 성격을 가지는 세포로의 유도가 가능하다는 것을 증명할 수 있었다.

Claims (25)

1. 여성의 소음순 진피조직에서 세포를 분리한 다음, 상기 분리된 세포를 로우 글루코즈(low glucose) DMEM 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는, 하기의 특성을 나타내는 다분화성 성체줄기세포의 제조방법:

   (1) CD13, CD29, CD44 및 CD90에 대하여 모두 양성 면역학적 특성을 나타냄;

   (2) dermo-1은 발현하나 SHOX-2 유전자는 발현하지 않음;

   (3) 세포 배양 접시에 부착되어 성장하며, 선형태의 형태학적 특성을 나타냄;

   (4) 내배엽, 외배엽 및 중배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가짐; 및

   (5) 사이토카인 미포함 배지 배양 하에서도, 다분화능이 유지된 상태로 수득되고 대량증식 되는 능력을 가짐.
2. 제 1항에 있어서, 상기 로우 글루코즈(low glucose) DMEM 배지는 5~15%의 FBS를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 다분화성 성체줄기세포의 제조방법.
3. 제 1항에 있어서, 상기 로우 글루코즈(low glucose) DMEM 배지는 FBS, L-글루타민(L-glutamine) 및 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin) 용액을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 다분화성 성체줄기세포의 제조방법.
4. 제 1항 기재의 방법으로 수득되고, 하기의 특성을 나타내는 여성의 소음순 유래 다분화성 성체줄기세포:

   (1) CD13, CD29, CD44 및 CD90에 대하여 모두 양성 면역학적 특성을 나타냄;

   (2) dermo-1은 발현하나 SHOX-2 유전자는 발현하지 않음;

   (3) 세포 배양 접시에 부착되어 성장하며, 선형태의 형태학적 특성을 나타냄;

   (4) 내배엽, 외배엽 및 중배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가짐; 및

   (5) 사이토카인 미포함 배지 배양 하에서도, 다분화능이 유지된 상태로 수득되고 대량증식 되는 능력을 가짐.
5. 제 4항의 성체 줄기세포를 로우 글루코스 DMEM 배지조건에서 배양하는 단계; 및

   상기 로우 글루코스 DMEM 배지에서 배양된 성체 줄기세포를 N2 배지에서 배양하여 신경구 형성을 유도하는 단계를 포함하는, 여성의 소음순 유래 다분화성 성체 줄기세포를 신경 줄기세포로 분화 유도하는 방법.
6. 제 4항의 성체 줄기세포를 로우 글루코스 DMEM 배지조건에서 배양하는 단계;

   상기 로우 글루코스 DMEM배지(condition I)에서 배양된 성체 세포를 ITS 배지에서 배양하는 단계; 및

   상기 ITS 배지에서 배양된 성체 줄기세포를 N2 배지에서 배양하여 신경구 형성을 유도하는 단계를 포함하는, 여성의 소음순 유래 다분화성 성체 줄기세포를 신경 줄기세포로 분화 유도하는 방법.
7. 제 4항의 성체 줄기세포를 로우 글루코스 DMEM 배지조건에서 배양하는 단계;

   상기 로우 글루코스 DMEM배지(condition I)에서 배양된 성체 줄기세포를 ITS + bFGF 배지에서 배양하는 단계; 및

   상기 ITS + bFGF 배지에서 배양된 성체 줄기세포를 N2 배지에서 배양하여 신경구 형성을 유도하는 단계를 포함하는, 여성의 소음순 유래 다분화성 성체 줄기세 포를 신경 줄기세포로 분화 유도하는 방법.
8. 제 5항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 로우 글루코스 DMEM 배지는 FBS, L-글루타민(L-glutamine) 및 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 여성의 소음순 유래 다분화성 성체 줄기세포를 신경 줄기세포로 분화 유도하는 방법.
9. 제 6항에 있어서, 상기 ITS 배지(condition II)는 DMEM/F12, 인슐린, 트랜스페린, 셀레늄 및 글루타민으로 구성되는 것을 특징으로 하는, 여성의 소음순 유래 다분화성 성체 줄기세포를 신경 줄기세포로 분화 유도하는 방법.
10. 제 7항에 있어서, 상기 ITS+bFGF 배지는 DMEM/F12, 인슐린, 트랜스페린, 셀레늄으로 구성된 ITS배지와 bFGF를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는, 여성의 소음순 유래 다분화성 성체 줄기세포를 신경 줄기세포로 분화 유도하는 방법.
11. 제 6항 또는 제 7항에 있어서, 상기 ITS 배지 또는 ITS+bFGF 배지에서의 배양은 3~10일 동안 수행하는 것을 특징으로 하는, 여성의 소음순 유래 다분화성 성체 줄기세포를 신경 줄기세포로 분화 유도하는 방법.
12. 제 11항에 있어서, 상기 ITS 배지 또는 ITS+bFGF 배지에서의 배양은 7일 동안 수행하는 것을 특징으로 하는, 여성의 소음순 유래 다분화성 성체 줄기세포를 신경 줄기세포로 분화 유도하는 방법.
13. 제 5항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 N2 배지는 DMEM/F12, B27 서플리먼트(serum replacement), 인슐린, 프로게스테론(progesteron), 푸트레신(putrescine), 아포-트랜스페린(apo-transferrin), 셀레늄, EGF(epidermal growth factor), 및 bFGF(basic fibroblast growth factor)로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 여성의 소음순 유래 다분화성 성체 줄기세포를 신경 줄기세포로 분화 유도하는 방법.
14. 제 4항 기재의 여성의 소음순 유래 다분화성 성체줄기세포를 유효성분으로 포함하는 신경학적 질환 치료용 조성물.
15. 제 14항에 있어서, 상기 신경학적 질환은 알츠하이머 병, 파킨슨 병 및 연령관련 기억 손실 중 선택되는 것임을 특징으로 하는 신경학적 질환 치료용 조성물.
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