JP2021519584A - 扁桃由来間葉系幹細胞から運動神経細胞の分化方法 - Google Patents

Abstract

【課題】扁桃由来間葉系幹細胞から運動神経細胞の分化方法及びこれを用いた細胞治療剤を提供する。【解決手段】本発明の分化方法は、運動神経細胞への高い分化能を示して多量の運動神経細胞の確保が可能であり、本発明によって分化した細胞は、捨てられる扁桃組織を使用することによって組織収得に倫理的な問題が少なく、量的確保も容易なので、細胞治療剤として優れた利用可能性を示す。

Description

発明の詳細な説明

［技術分野］
本発明は、扁桃由来間葉系幹細胞から運動神経細胞の分化方法及びこれを用いた細胞治療剤に関する。
［背景技術］
幹細胞（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）は、生物組織を構成する様々な細胞に分化可能な細胞であり、胚、胎児及び成体の各組織から得られる分化する前段階の未分化細胞を総称する。幹細胞は分化刺激（環境）によって特定細胞への分化が進行され、細胞分裂によって自身と同じ細胞を生産（ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ）できる特性があり、また、分化刺激によって異なる細胞にも分化可能な柔軟性（ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ）を持つのが特徴である。

幹細胞はその分化能によって万能（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）、多分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）及び単分化能（ｕｎｉｐｏｔｅｎｃｙ）の幹細胞に区別できる。万能幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）は全ての細胞に分化可能な潜在力を持つ全分化能（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）の細胞であり、一部の幹細胞は多分化能又は単分化能の潜在力を持つ。

前記幹細胞が持つ分化能を基に細胞治療剤として利用可能性があり、これに関する研究開発が活発に行われている。しかし、胚性幹細胞を用いた細胞治療剤の場合、倫理的問題や組織適合性不一致の問題が提起されており、逆分化幹細胞を細胞治療剤として使用する場合、腫瘍発生の恐れもある
そのため、分化能が低いものと知られているが、相対的に安全な間葉系幹細胞を用いた研究が多く行われている。間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ，ＭＳＣｓ）は、成体骨髄などにある多分化能非造血前駆細胞（ｍｕｌｔｉ−ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｎｏｎ−ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）であり、脂肪、軟骨、骨、筋肉、皮膚などの種々の細胞に分化可能な細胞を意味する。このような間葉系幹細胞を用いて様々な組織再生のための臨床研究が行われており、臓器移植分野にも適用可能性を示している。

しかし、間葉系幹細胞のうちいくつかの幹細胞はその利用において細胞の獲得に大きい制限があり、その利用が困難である。例えば、最も非侵襲的な方法によって獲得可能な細胞は骨髄採取による間葉系幹細胞である。しかし、最も非侵襲的な方法である骨髄採取は、麻酔が必要であり、苦痛を誘発するため、その利用に制限がある。その代案として、患者カスタマイズ型幹細胞を分離するために末梢血液を用いた細胞獲得法などが要求されているが、末梢血液だけでは成人から分離可能な間葉系幹細胞の数が少なすぎ、分離方法が不経済的であり、分離したとしても細胞治療に使用可能な十分量を増殖し難い場合が殆どであるため、さらに実用性を高め得る代替方案が必要である。

また、高齢者患者から得る成体幹細胞は低年齢から得る細胞に比べて増殖能力が顕著に劣り、各種因子の分泌及び幹細胞の病変への移動能力などが劣るため、低年齢の患者から自然に分離可能であるか、或いは捨てられる組織から細胞を得る必要性がある。

一方、先天的、遺伝的に運動神経細胞の欠損を持っているか、後天的に神経組織が損失された運動神経関連の疾患に対して幹細胞を用いて関連疾患を治療しようとする研究開発が進行されている。一例として、血管内皮成長因子が過発現した神経幹細胞をルーゲリック病動物モデルに移植した結果、ルーゲリック病の発病時期が遅れ、運動機能が大きく好転したという研究結果が報告されたことがある。また、脂肪や骨髄から抽出した幹細胞を血管内皮成長因子と共に移植する方法によってルーゲリック病を治療しようとする研究がなされている。ただし、血管内皮成長因子は大きすぎて血管の関門を通過できず、半減期が短くて短期間に消滅するため、これを用いた幹細胞治療剤は治療効率面においてその利用が非常に制限的である。

これによって、運動神経細胞への高い分化能を示し得る特定幹細胞から最適の分化方法を確認し、人体適用に適した運動神経細胞を確保する方案に関する研究開発が必要な実情である。
［先行技術文献］
［特許文献］
［特許文献１］国際公開特許第ＷＯ２０１７／１３５７５３号
［発明の概要］
［発明が解決しようとする課題］
本発明は、ＤＭＥＭ、ＦＢＳ、Ｎ_２補充物、レチノイン酸、脳由来神経成長因子、神経成長因子及びソニックヘッジホッグを含む、扁桃由来間葉系幹細胞又はこれから分化した前駆細胞から運動神経細胞に分化させるための分化培養液培地組成物に関する。

本発明はまた、前記分化培地組成物を用いた運動神経細胞への分化方法に関する。

本発明はまた、前記方法によって製造された運動神経細胞に関する。

本発明はまた、前記運動神経細胞を含む神経疾患の予防又は治療用薬学組成物に関する。
［課題を解決するための手段］
本発明者らは、人体適用に適した運動神経細胞の大量生産方法を研究した結果、扁桃由来間葉系幹細胞から運動神経細胞を短期間に大量生産する方法を発明し、本発明を完成するに至った。

本発明の目的を達成するための一態様として、本発明は、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＦＢＳ、Ｎ_２補充物（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）、レチノイン酸、脳由来神経成長因子（ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ，ＢＤＮＦ）、神経成長因子（ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ，ＮＧＦ）及びソニックヘッジホッグ（ｓｏｎｉｃ ｈｅｄｇｅｈｏｇ，ＳＨＨ）を含む、幹細胞又は前駆細胞から運動神経細胞（ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎ）に分化させるための分化培養液培地組成物を提供する。

前記運動神経細胞を誘導するために用いられる分化培養液培地は、好ましくは、低濃度グルコースＤＭＥＭ、０．２５〜２５％（ｗ／ｖ）ＦＢＳ、０．１〜１０％（ｗ／ｖ）Ｎ_２補充物、０．１〜１０μＭレチノイン酸、１〜１００ｎｇ／ｍｌ脳由来神経栄養因子、１〜１００ｎｇ／ｍｌ神経成長因子及び０．０１〜１ｎｇ／ｍｌソニックヘッジホッグを含むことができ、最も好ましくは、低濃度グルコースＤＭＥＭ、２．５％（ｗ／ｖ）ＦＢＳ、１％（ｗ／ｖ）Ｎ_２補充物、１μＭレチノイン酸、１０ｎｇ／ｍｌ脳由来神経栄養因子、１０ｎｇ／ｍｌ神経成長因子及び０．１ｎｇ／ｍｌソニックヘッジホッグを含むことができる。

前記分化培養液培地において、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ）としては一般に高濃度グルコースＤＭＥＭを使用するが、本発明のように低濃度のグルコースＤＭＥＭを使用すれば、細胞の増殖（急増（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）又は成長（ｇｒｏｗｔｈ））状態を停止させ、（分化を開始させるための）細胞に生存だけのための最小限の環境を作るので、分化の効率及び方向性を増大させることができる。

前記分化培養液培地において、Ｎ_２補充物（Ｎ_２ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）は、Ｂ２７補充物が含むビオチン、Ｌ−カルニチン、コルチコステロン、エターノルアミン、ｄ（＋）−ガラクトース、グルタチオン（ｒｅｄｕｃｅｄ）、リノレン酸、リノール酸、酢酸レチノール、セレン、Ｔ３（ｔｒｉｏｄｏ−１−ｔｈｙｒｏｎｉｎｅ）、ｄｌ−α−トコフェロール（ビタミンＥ）、ｄｌ−α−酢酸トコフェロール、カタラーゼ及びスーパーオキシドディスムターゼなどを含有しないため、運動神経細胞への特異的な分化の開始を誘導できる。

前記分化培養液培地において、脳由来神経栄養因子（ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ，ＢＤＮＦ）とは、脳神経細胞の発生、成長、機能の維持及び神経可塑性などに関与する、主に脳に存在する神経栄養因子の一種を意味する。

前記分化培養液培地において、神経成長因子（ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ，ＮＧＦ）は神経組織の分化及び生長活性に関与するサイトカイン性ペプチド因子を意味する。

本発明の分化培養液培地は通常、幹細胞の増殖に用いられる培地とは違い、低い濃度のグルコースＤＭＥＭ及びＦＢＳを含み、既存の幹細胞培養培地に比べて顕著な分化効果を有する。特に、本発明の運動神経細胞を誘導するために用いられる分化培養液培地は、具体的な成分として低濃度グルコースＤＭＥＭ、ＦＢＳ、Ｎ_２補充物（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）、レチノイン酸、脳由来神経栄養因子（ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ，ＢＤＮＦ）、神経成長因子（ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ，ＮＧＦ）及びソニックヘッジホッグ（ｓｏｎｉｃ ｈｅｄｇｅｈｏｇ，ＳＨＨ）を全て含む構成を有するが、前記全ての成分を含む分化培養液培地は、一部の成分が欠如した培地に比べて顕著な運動神経細胞分化効果を有する。

上記の目的を達成するための他の一態様として、本発明は、扁桃由来間葉系幹細胞又はこれから分化した前駆細胞を前記分化培地組成物において培養して運動神経細胞を誘導する段階を含む運動神経細胞への分化方法を提供する。

本発明の分化方法において、前記培養は２〜４週間行われることが好ましい。

本発明において、運動神経細胞（ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎ）とは、神経細胞においてその神経突起が運動神経となって骨格筋を支配する全細胞質の神経細胞体であり、運動ニューロンともいい、主に大脳皮質の運動野と脊髄前角に存在する。具体的に、脊髄前角細胞までを上位運動神経細胞（運動ニューロン）といい、脊髄前角細胞以下を下位運動神経細胞（運動ニューロン）という。

本発明において、扁桃由来間葉系幹細胞とは、喉の内側と鼻の奥部に位置して外部から侵入する細菌などの物質から一次的に我々の身体を防御すると同時に、リンパ上皮免疫組織として働く組織である扁桃から由来した、自己複製能力を有し、且つ２つ以上の新しい細胞に分化する能力を持つ未分化した幹細胞を意味する。

本発明の好ましい具現例によれば、前記扁桃由来間葉系幹細胞は、他の組織由来間葉系幹細胞に比べて、神経前駆細胞のマーカーであるビメンチン（ｖｉｍｅｎｔｉｎ）の発現率が高い。

前記他の組織由来の間葉系幹細胞は制限されず、好ましくは、脂肪由来間葉系幹細胞（ＡｄＭＳＣ）、骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭ−ＭＳＣ）、臍帯由来又は臍帯血由来間葉系幹細胞（例えば、ワルトンゼリー由来間葉系幹細胞（ＷＪ−ＭＳＣ））を含み、前記扁桃由来間葉系幹細胞は、他の組織由来の間葉系幹細胞に比べて、神経前駆細胞のマーカーであるビメンチン（ｖｉｍｅｎｔｉｎ）の発現率が１０％以上、好ましくは３０％以上高いことを特徴とする。

本発明において、前駆細胞とは、特定細胞の形態及び機能を揃える前段階の細胞であり、具体的に神経前駆細胞（ｎｅｕｒａｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）とは、中枢神経系を構成する神経細胞、星状膠細胞、希突起膠細胞などの神経細胞に分化できる前駆細胞を意味する。

本発明の好ましい具現例によれば、前記扁桃由来間葉系幹細胞から分化した前駆細胞は、他の組織由来間葉系幹細胞から分化した前駆細胞に比べて、ニューロン特異マーカー（Ｎｅｕｒｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍａｒｋｅｒ）であるＴｕｊ１の発現率が高い。

前記他の組織由来の間葉系幹細胞は制限されないが、好ましくは、脂肪由来間葉系幹細胞（ＡｄＭＳＣ）、骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭ−ＭＳＣ）、臍帯由来又は臍帯血由来間葉系幹細胞（例えば、ワルトンゼリー由来間葉系幹細胞（ＷＪ−ＭＳＣ））を含み、前記扁桃由来間葉系幹細胞から分化した前駆細胞は、他の組織由来の間葉系幹細胞から分化した前駆細胞に比べて、ニューロン特異マーカー（Ｎｅｕｒｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍａｒｋｅｒ）であるＴｕｊ１の発現率が１０％以上、好ましくは３０％以上高いことを特徴とする。

本発明の分化方法は、前記運動神経細胞を誘導するための前段階として、扁桃由来間葉系幹細胞を浮遊状態で培養して細胞凝集体を形成する段階をさらに含むことができる。

前記細胞凝集体を形成する段階における増殖培養液培地は、ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、β−メルカプトエタノール及び非必須アミノ酸を含むことができる。好ましくは、前記増殖培養液培地は５〜２０％（ｗ／ｖ）ＦＢＳ、０．５〜２％（ｗ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシン、０．０５〜０．２ｍＭ β−メルカプトエタノール及び０．５〜２％（ｗ／ｖ）非必須アミノ酸を含むことができ、最も好ましくは、１０％（ｗ／ｖ）ＦＢＳ、１％（ｗ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシン、０．１ｍＭ β−メルカプトエタノール及び１％（ｗ／ｖ）非必須アミノ酸を含むことができる。

前記増殖培養液培地に含まれる成分のうち、前記非必須アミノ酸は、体内で代謝的に合成されないアミノ酸であり、具体的に、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−プロリン又はＬ−セリンのいずれか一つ以上を含むことができるが、これに制限されない。

前記段階で用いられた増殖培養液培地の種類には、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＲＰＭＩ１６４０（Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ １６４０）、ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉａ）又はＨａｍ Ｆ１０から選ばれるいずれか一つであり得、具体的に、前記培地はＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ）培地である。

前記段階において、前記細胞凝集体の形成は、ポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ）がコーティングされた培養皿において培養液１０ｍｌ当たり５×１０^６〜７×１０^６個の細胞を浮遊状態で１〜７日間培養してなり得る。細胞凝集体の誘導は、幹細胞間の相互作用を増大させ、胚体（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｂｏｄｙ）と類似の形態を製造し、この形態から運動神経細胞をより適切に誘導するために行われる。

本発明の分化方法において、前記細胞凝集体を形成する段階後、運動神経細胞を誘導する段階の前に、形成された細胞凝集体を１〜３世代まで継代培養して神経前駆細胞（ｎｅｕｒａｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）に分化させる段階をさらに含むことができる。

本発明において、継代培養とは、細胞、具体的に幹細胞を健康な状態で持続して長期間培養するために細胞の代を継いで培養する方法であり、培養容器を入れ替えること又は細胞群を分けて培養することを意味する。１回、培養容器を入れ替えたり又は細胞群を分けて培養することを１継代という。本発明において前記継代は世代と同じ意味で使用可能である。

上記の目的を達成するためのさらに他の態様として、本発明は前記運動神経細胞分化方法によって製造された運動神経細胞を提供する。

本発明の扁桃由来間葉系幹細胞から分化した運動神経細胞は他の幹細胞から分化した運動神経細胞と比較して、発現するマーカーの強度及び分化した運動神経細胞の形状が異なる（図５Ａ〜５Ｃ）。

本発明によって製造された運動神経細胞は、ＩＳＬ１（ｉｎｓｕｌｉｎ ｇｅｎｅ ｅｎｈａｎｃｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＨＢ９（ｈｏｍｅｏｂｏｘ ｐｒｏｔｅｉｎ）又はＣｈＡＴ（ｃｈｏｌｉｎｅ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）の発現が増加する特性を示す。

前記ＩＳＬ１（ｉｎｓｕｌｉｎ ｇｅｎｅ ｅｎｈａｎｃｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）とは、運動神経の生成及び分化に働く因子であり、運動神経細胞の代表マーカーである。

前記ＨＢ９（ｈｏｍｅｏｂｏｘ ｐｒｏｔｅｉｎ）は、発達中の脊椎動物の中枢神経系運動神経細胞から選択的に発現し、分裂後（ｐｏｓｔ−ｍｉｔｏｔｉｃ）運動ニューロンのアイデンティティを確立する上で必須の機能を有すると知られている。しかし、最近では中枢神経系或いは末梢神経系を問わず幹細胞から運動神経への分化と成熟を確認する必須のマーカーである。

前記ＣｈＡＴ（ｃｈｏｌｉｎｅ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）とは、アセチル助酵素Ａ（ａｃｅｔｙｌ ＣｏＡ）に付いている酢酸イオンをコリンと結合させてアセチルコリンを生成する酵素であり、運動神経細胞の代表マーカーである。

具体的に、本発明の一実施例では、本発明によって製造された運動神経細胞に対してＰＣＲ、免疫蛍光分析及びウェスタンブロットによってＩＳＬ１、ＨＢ９及びＣｈＡＴの発現を分析した結果、２週以上分化した運動神経細胞は運動神経細胞の代表マーカーであるＩＬＳ１、ＨＢ９及びＣｈＡＴの発現が増加することを確認した。

本発明によって製造された運動神経細胞は、アセチルコリンの分泌が増加する特性を示す。さらに、上記のような特性を示す運動神経細胞は、骨格筋細胞と共培養して神経筋接合部（ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）の形成が可能な特性を示す。

前記アセチルコリンは、シナプス前ニューロンの軸索突起末端にあるシナプス小包から分泌されてシナプス隙間を通過し、その後、シナプス後ニューロンに結合して神経信号を伝達する、神経末端から分泌される神経筋接合部の神経伝達物質であり、本発明の一実施例では、本発明によって製造された運動神経細胞においてアセチルコリンの分泌が増加したことを確認した。また、本発明の一実施例では、本発明によって製造された運動神経細胞と骨格筋細胞を共培養した結果、アセチルコリン受容体が発現することを確認した。

前記アセチルコリン受容体は、本発明の運動神経細胞から分泌されたアセチルコリンを受容するために発現したものであり、本発明の運動神経細胞は骨格筋細胞と共培養して神経筋接合部が形成され、アセチルコリンを媒介とした正常の神経信号伝達システムを構築できる。

前記神経筋接合部は、運動神経と筋繊維の接触時に化学的シナプスを形成したものであり、本発明の扁桃由来間葉系幹細胞から分化した運動神経細胞は、骨格筋細胞（ＳＫＭＣ）と共培養時にアセチルコリンクラスターが形成され（図８参照）、神経筋接合部の形成が確認されたところ、他の間葉系幹細胞から分化させる場合に比べてより機能性を持つ運動神経細胞に分化させ得る長所がある。

本発明によって製造された運動神経細胞は、１〜３世代まで継代培養が可能であり、凍結後融解して使用可能である。したがって、本発明の運動神経細胞は、継代培養しても再現性に優れた特性を示し、長時間保管後にも正常の運動神経細胞として使用可能な特性を示す。

上記の目的を達成するためのさらに他の態様として、本発明は、本発明に係る運動神経細胞を有効成分として含む神経疾患（Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）の予防又は治療用薬学組成物を提供する。

上記の目的を達成するためのさらに他の態様として、本発明は、本発明に係る運動神経細胞を含む細胞治療剤を提供する。

上記の目的を達成するためのさらに他の態様として、本発明は、神経疾患を予防又は治療するための前記組成物の薬剤学的用途を提供する。

上記の目的を達成するためのさらに他の態様として、本発明は、本発明に係る運動神経細胞の有効量を個体（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与する段階を含む神経疾患の予防又は治療方法を提供する。

本発明において、予防とは、本発明の組成物の投与によって神経疾患を抑制させたり或いは進行を遅延させる全ての行為を意味する。

本発明において、治療とは、本発明の組成物の投与によって神経疾患が好転又は有益に変更される全ての行為を意味する。

本発明において、個体（ｓｕｂｊｅｃｔ）とは、前記組成物の投与を必要とする哺乳動物を意味し、好ましくは、ヒト、或いはイヌ、猫などの愛玩動物、或いはウシ、ブタ、ウマ、ヒツジなどの家畜動物を含む。

本発明において、細胞治療剤とは、哺乳動物から分離、培養及び特殊な操作によって製造された細胞及び組織であり、治療、診断及び予防の目的で使用される医薬品（米国ＦＤＡ規定）であり、細胞或いは組織の機能を復元させるために生きている自己、同種又は異種細胞を体外で増殖、選別したり、或いは他の方法で細胞の生物学的特性を変化させるなどの一連の行為による治療、診断及び予防の目的で使用される医薬品をいう。

本発明の組成物は、中枢神経系又は末梢神経系の損傷、退行性脳疾患、運動神経疾患などを含む神経疾患の予防又は治療に利用可能であり、好ましくは、運動神経疾患の予防又は治療に利用可能である。

本発明において、運動神経疾患とは、自律筋肉の活動を統制する運動神経の退行的進行を起こす神経学的疾患及び遺伝性感覚神経病を意味する。具体的に、前記運動神経疾患は、筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，ＡＬＳ）、重症筋無力症（ｍｙａｓｔｈｅｎｉａ ｇｒａｖｉｓ，ＭＧ）、シャルコーマリートゥース（Ｃｈａｒｃｏｔ−Ｍａｒｉｅ−Ｔｏｏｔｈ，ＣＭＴ）病又は脊髄筋萎縮症（ｓｐｉｎａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ，ＳＭＡ）であるが、これに制限されるものではない。

本発明において、有効量とは、研究者、獣医師、医師又はその他臨床医によって考えられる組織系、動物又はヒトから生物学的又は医学的反応を誘導する有効成分又は薬学組成物の量を意味し、これは、該当の疾患又は障害の症状の緩和を誘導する量を含む。本発明の有効成分に対する有効量及び投与回数は所望の効果に応じて変更可能であることは当業者に明らかである。

前記組成物は、薬学的分野の通常の方法によって患者の身体内投与に適した単位投与型の薬学的製剤に剤形化して投与でき、前記製剤は１回又は多回投与に基づいて効果的な投与量を含む。このような目的に適した剤形としては、非経口投与製剤として注射剤、注入剤、噴霧剤などが好ましい。また、前記運動神経疾患治療用組成物は、薬学的に許容可能な通常の不活性担体を含むことができる。また、当業界における通常の投与方法を用いて移植及び投与可能であり、好ましくは、治療を要する患者の疾患部位に直接生着又は移植が可能であるが、これに限定されない。また、前記投与はカテーテルを用いた非外科的投与及び疾患部位切開後の注入又は移植などの外科的投与のいずれの方法であってもよい。投与量は１．０×１０^５〜１．０×１０^８細胞／ｋｇ体重、好ましくは１．０×１０^６〜１．０×１０^７細胞／ｋｇ体重を１回又は複数回に分けて投与できる。しかし、有効成分の実際投与量は、治療しようとする疾患、疾患の重症度、投与経路、患者の体重、年齢及び性別などの様々な関連因子に照らして決定されるべきものと理解しなければならず、したがって、前記投与量はいずれの面においても本発明の範囲を限定するものではない。
［発明の効果］
本発明の分化方法は、運動神経細胞への高い分化能を示すので多量の運動神経細胞の確保が可能であり、本発明によって分化した細胞は、捨てられる自己組織を使用するので、組織適合性が高く、細胞治療剤として優れた利用可能性を示す。
［図面の簡単な説明］
［図１］扁桃由来間葉系幹細胞（Ｔ−ＭＳＣ，Ａ）を神経前駆細胞（ＮＰ，Ｂ）に誘導し、運動神経細胞（ＭＮ，Ｃ）に分化する段階、及び分化段階別の培地の成分及びその時期の細胞の形態を示す模式図である。

［図２］本発明に係る方法で分化した運動神経細胞を２世代及び３世代に継代培養時に正常増殖が可能であることを確認した図である。

ＭＮ ２．５ｗ−２．５週分化した運動神経細胞；
ｐ２−２世代継代培養；及び
ｐ３−３世代継代培養、以下、図３も同様。

［図３］本発明に係る方法で分化した運動神経細胞（ＭＮ）を凍結後融解しても運動神経細胞として使用可能であることを確認した図である。

［図４］扁桃由来間葉系幹細胞（Ｔ−ＭＳＣ）を運動神経細胞（ＭＮ）に分化させながら分化期間別に分化した細胞を得、リアルタイムＰＣＲを用いてＩＳＬ１、ＨＢ９及びＣｈＡＴの発現が増加することを確認したグラフである。

ＭＮ２ｗ−２週分化した運動神経細胞；
ＭＮ３ｗ−３週分化した運動神経細胞；及び
ＭＮ４ｗ−４週分化した運動神経細胞。

［図５Ａ］扁桃由来間葉系幹細胞を運動神経細胞に２週間分化させた後、得られた細胞を免疫蛍光染色法を用いてＩＳＬ１の発現が増加することを確認した図である。

［図５Ｂ］扁桃由来間葉系幹細胞を運動神経細胞に２週間分化させた後、得られた細胞を免疫蛍光染色法を用いてＨＢ９の発現が増加することを確認した図である。

［図５Ｃ］扁桃由来間葉系幹細胞を運動神経細胞に２週間分化させた後、得られた細胞を免疫蛍光染色法を用いてＣｈＡＴの発現が増加することを確認した図である。

［図６Ａ〜図６Ｄ］扁桃由来間葉系幹細胞を運動神経細胞に４週間分化させながら分化期間別に分化した細胞を得、ウェスタンブロットを用いて運動神経細胞からＩＳＬ１（図６Ｂ）、ＨＢ９（図６Ｃ）及びＣｈＡＴ（図６Ｄ）の発現増減を確認した図である。

［図７］扁桃由来間葉系幹細胞を運動神経細胞に分化させながら分化期間別に上層液を複数回得て、分化培養液と比較してアセチルコリンの濃度をパーセントで計算して統計的に比較したグラフである。

ＮＰＣ−神経前駆細胞、ｎｅｕｒａｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌ；
ＭＮＣ２ｗ−２週分化した運動神経細胞；
ＭＮＣ３ｗ−３週分化した運動神経細胞；及び
ＭＮＣ４ｗ−４週分化した運動神経細胞。

［図８Ａ］扁桃由来間葉系幹細胞を運動神経細胞に分化させる前後の細胞形態、及び筋肉細胞と共培養中の運動神経細胞を光学顕微鏡で観察した写真である。

［図８Ｂ］本発明によって２週間分化して運動神経に分化したＴ−ＭＳＣとヒト骨格筋細胞を共培養させた後、蛍光免疫染色法及びα−ＢＴＸ処理法によって、神経筋接合部の形成が可能であることを、共培養前後に染色して確認した図である（ｈＳＫＭＣ：ヒト骨格筋細胞だけを培養；Ｔ−ＭＳＣ−ＭＮＣ：扁桃幹細胞由来運動神経細胞だけを培養；ｈＳＫＭＣ ＆ Ｔ−ＭＳＣ−ＭＮＣ：ヒト骨格筋細胞と扁桃幹細胞由来運動神経細胞を共培養。）
［図８Ｃ］図８Ｂと同様に運動神経に分化したＴ−ＭＳＣとヒト骨格筋細胞を共培養させた後、神経筋接合部の形成とともに、両細胞の形態をさらに確実に確認するために、同一スライドで染色に用いられたタンパク質別に撮影をした。α−ＳＭＡ（α−ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ａｃｔｉｎ、青色）パネルは筋肉細胞の形態を示し、Ｔｕｊ１（ｂｅｔａ ＩＩＩ Ｔｕｂｕｌｉｎ、緑色）パネルは神経細胞の形態を示し、α−ＢＴＸ（赤色、Ｂｕｎｇａｒｏｔｏｘｉｎ）パネルは神経筋接合部であるアセチルコリンレセプタクラスター（ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｌｕｓｔｅｒ）を表示する。この３つを重なって示したのがｍｅｒｇｅパネルである。

［図９］扁桃由来間葉系幹細胞（Ｔ−ＭＳＣ）を運動神経細胞（ＭＮＣ）に分化させた後に細胞を得、リアルタイムＰＣＲを用いて４種類の神経栄養因子（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ）の発現が増加することを確認したグラフである。

［図１０］Ｔ−ＭＳＣを免疫蛍光染色法を用いてビメンチンの発現を確認した図である。

［図１１］Ｔ−ＭＳＣ及びこれから由来した神経前駆細胞（ｎｅｕｒａｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌｓ，ＮＰＣｓ）を免疫蛍光染色法でＴｕｊ１の発現を確認した図である。
［発明を実施するための形態］
本発明の理解を助けるために実施例を提示する。下記の実施例は本発明をより容易に理解させるために提供されるものに過ぎず、実施例によって本発明の内容が限定されることはない。

＜実施例１：扁桃由来間葉系幹細胞から運動神経細胞への分化＞
〔実施例１−１：扁桃由来間葉系幹細胞の培養〕
扁桃由来間葉系幹細胞（ｔｏｎｓｉｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ，ＴＭＳＣ）は、イファ女子大学モクドン病院の耳鼻咽喉−頭頸部外科で扁桃摘出術を施した患者から摘出された扁桃組織（４〜２０歳の低年齢層の組織、臨床倫理委員会審議通過：ＥＣＴ１１−５３−０２）を得、幹細胞を分離して１０％ ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ）、０．１ｍＭ β−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、１％非必須アミノ酸（ＧＩＢＣＯ）が補充されたＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ，ＧＩＢＣＯ）で培養した。

〔実施例１−２：扁桃由来間葉系幹細胞から運動神経細胞分化〕
扁桃由来間葉系幹細胞から運動神経細胞（ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎ，ＭＮ）の分化は、下記の段階によって行った。

分化を誘導するための第１段階として球状体（ｓｐｈｅｒｅ）を形成した。球状体は、ＰＥＩコートされた１００ｍｍペトリ皿（ｐｅｔｒｉ ｄｉｓｈ）に実施例１の増殖培養液１０ｍｌ当たり５，０００，０００個〜７，０００，０００個の細胞を浮遊して１〜２日間細胞凝集を誘導することによって製造した。前記形成された球状体を培養皿に再付着（ｒｅｐｌａｔｉｎｇ）させ、増殖培養液で１世代、２世代又は３世代まで継代培養して神経前駆細胞（ｎｅｕｒａｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌ，ＮＰＣ）に分化を誘導した。

前記分化した神経前駆細胞を分化培養液培地［低濃度グルコースＤＭＥＭ、２．５％ ＦＢＳ、１％ Ｎ_２補充物（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）、１μＭレチノイン酸、１０ｎｇ／ｍｌ脳由来神経栄養因子（Ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ，ＢＤＮＦ）、１０ｎｇ／ｍｌ神経成長因子（Ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ，ＮＧＦ）、０．１ｎｇ／ｍｌソニックヘッジホッグ（ｓｏｎｉｃ ｈｅｄｇｅｈｏｇ，ＳＨＨ）］において２〜４週間さらに培養した。これで、運動神経細胞を製造した（図１）。

〔実施例１−３：分化した運動神経細胞の継代培養〕
前記のような方法で２．５週間分化した運動神経細胞を継代培養した結果、２世代及び３世代継代培養した運動神経細胞は正常の増殖能を有することを確認した。したがって、本発明によって分化した運動神経細胞は継代培養しても正常の増殖が可能であることを確認した（図２）。

〔実施例１−４：分化した運動神経細胞の凍結融解後の使用〕
前記のような方法で２．５週間分化した運動神経細胞を培養１０日目に凍結した後１４日目に融解して細胞の形態を観察した結果、凍結融解後にも形態的に変化がないことを確認した。

したがって、本発明によって分化した運動神経細胞は凍結後融解しても正常の運動神経細胞として使用可能であることを確認した（図３）。

＜実施例３：ＰＣＲを用いた扁桃由来間葉系幹細胞から運動神経細胞への分化能＞
扁桃由来間葉系幹細胞から運動神経細胞への分化能を調べるために、運動神経細胞の代表マーカーであるＩＳＬ１（Ｉｎｓｕｌｉｎ ｇｅｎｅ ｅｎｈａｎｃｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＨＢ９及びＣｈＡＴ（Ｃｈｏｌｉｎｅ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）の発現程度をリアルタイムＰＣＲで分析した。

ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．）を用いて、メーカーの指示書に従って総ＲＮＡを抽出した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とｏｌｉｇｏ−ｄ（Ｔ）２０プライマーを用いて４２℃で１時間、７２℃で１５分間反応させてｃＤＮＡを合成した。前記ｃＤＮＡに対する定量リアルタイムＰＣＲ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ）は、ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ^ＴＭキット（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）を用いて、ＡＢＩ ７５００高速リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）で行った。ＩＳＬ１、ＨＢ９及びＣｈＡＴ遺伝子の相対的発現量は比較Ｃｔ定量（ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｃｔ ｍｅｔｈｏｄ；２^{−ΔΔＣｔ}）方法で計算し、全ての測定値は３重（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）で行った。

その結果を図４に示す。図４に示すように、扁桃由来間葉系幹細胞から運動神経細胞への分化の際、分化して２週後から運動神経細胞のマーカーであるＩＳＬ１、ＨＢ９及びＣｈＡＴの発現が増加することを確認し、運動神経細胞に分化したことを確認した。

具体的に、前記ＩＳＬ１は、運動神経細胞への分化初期に発現が増加する運動神経特異マーカーである。図４のように分化２週後にＩＳＬ１の発現が最高であることは、分化２週目に最高の分化率を示すことを意味し、分化２週目に比べて３週後からＩＳＬ１の発現が相対的に減少することは、初期分化段階を経て既に運動神経細胞への分化に進んだことを意味する。未分化細胞であるＴ−ＭＳＣに対する統計的に有意なＩＳＬ１の発現増加は２週、３週に確認された。また、前記ＨＢ９も運動神経細胞への分化初期に発現が増加する運動神経特異マーカーである。ＨＢ９は分化期間にしたがって漸次増加する傾向を示すが、未分化細胞であるＴ−ＭＳＣに対して統計的に有意な発現増加は２週にのみ確認された。

また、前記ＣｈＡＴは、ＩＳＬ１の発現が増加する分化初期よりは、分化が進んだ時に発現が増加する運動神経マーカーであり、アセチルコリン性神経マーカーとも呼ぶ。特に、ＣｈＡＴは中枢神経及び末梢神経に存在する一般型ＣｈＡＴ（ｃｏｍｍｏｎ ｔｙｐｅ ＣｈＡＴ ，ｃＣｈＡＴ）及び末梢神経から優先的に発現する末梢型ＣｈＡＴ（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｔｙｐｅ ＣｈＡＴ，ｐＣｈＡＴ）の同型タンパク質（ｉｓｏｆｏｒｍ）が存在する。図４のように分化２週後から４週までＣｈＡＴのｅｘｏｎ３の発現が有意に増加することは、中枢神経及び末梢神経の両方の特性を示すことを意味する。分化２週目にｅｘｏｎ６の発現が増加するが、３週後から相対的に減少することは、転写過程後変形する間にｅｘｏｎ６のｅｘｏｎ９へのスキッピング（ｓｋｉｐｐｉｎｇ）によって発生し、これは、分化が進むにつれて末梢神経の特性をさらに示すことを意味する。したがって、前記ＣｈＡＴに関連した上記の結果をまとめると、分化２週後から運動神経細胞への分化が始まって３週及び４週後に運動神経細胞に分化されたことを意味する。

前記実験結果から、扁桃由来間葉系幹細胞から分化した細胞は運動神経細胞の特性があることを確認し、したがって、本発明の分化培養液培地の使用時に運動神経細胞への優れた分化能を示すことを確認した。

＜実施例４：免疫蛍光分析を用いた扁桃由来間葉系幹細胞から運動神経細胞への分化能＞
免疫蛍光染色を用いて運動神経細胞への分化能を確認した。前記扁桃由来間葉系幹細胞及び分化２週後運動神経細胞は、カバースリップ（ｃｏｖｅｒ ｓｌｉｐ）上で培養して製造し、分化を終えた後に４％パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）溶液で１５分間室温で固定した後、ＰＢＳで洗浄した。洗浄された細胞を０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０及び２％ウシ血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）を添加したＰＢＳ溶液で１時間処理し、発現を確認しようとする抗体は、生産者が指示した比率通りに希釈し、ＰＢＳに添加した後に室温で１時間又は冷蔵状態で一晩中反応させた。続いて、再びＰＢＳ溶液で洗浄した後、室温又は冷蔵状態でＴＲＩＴＣ（ｔｅｔｒａｒｈｏｄａｍｉｎｅ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）又はＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）接合体の２次抗体を１次抗体と同じ方法で処理した。対照染色で細胞核を染色するためにＤＡＰＩが添加されたマウンティング溶液（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ）を使用し、マウンティング後に蛍光顕微鏡で観察した。

図５Ａから確認されるように、Ｔ−ＭＳＣはＩＳＬ１を示す赤色蛍光信号が全く現れないのに対し、分化後の運動神経細胞（Ｔ−ＭＳＣ−ＭＮＣ）はＩＳＬ１を示す赤色蛍光信号が強く発現することを確認した（図５Ａのｂ及びｅ）。これとともに神経細胞特異タンパク質であるＴｕｊ１（ｎｅｕｒｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｌａｓｓ ＩＩＩ ｂｅｔａ−Ｔｕｂｕｌｉｎ）の発現も共に確認した結果（図５Ａのａ及びｄ）、分化が進みながら発現が増加することを確認した。また、免疫蛍光分析を用いた運動神経細胞への分化確認方法が適切であることを証明するために、誘導万能幹細胞由来運動神経細胞を購入（ｉＸＣｅｌｌ ＴＭ Ｈｕｍａｎ ｉＰＳＣ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｏｔｏｒ Ｎｅｕｒｏｎｓ，ｉＰＳＣ−ＭＮＣ）してＩＳＬ１及びＴｕｊ１発現の有無を観察した。その結果、Ｔ−ＭＳＣ−ＭＮＣとｉＰＳＣ−ＭＮＣの細胞形態はやや異なるが、両マーカー（ＩＳＬ１及びＴｕｊ１）の発現様相は同一であることを確認した（図５Ａのｈ、ｉ、ｊ及びｋ）。

図５Ｂでは、Ｔ−ＭＳＣはＨＢ９を示す赤色蛍光信号が全く現れないのに対し、分化後の運動神経細胞（Ｔ−ＭＳＣ−ＭＮＣ）はＨＢ９を示す赤色蛍光信号が強く発現することを確認した（図５Ｂのｂ及びｅ）。これとともにＴｕｊ１の発現も確認した結果（図５Ｂのａ及びｄ）、分化が進みながら発現が増加することを確認した。また、ｉＰＳＣ−ＭＮＣのＨＢ９及びＴｕｊ１発現の有無を観察した。その結果、Ｔ−ＭＳＣ−ＭＮＣとｉＰＳＣ−ＭＮＣの細胞形態はやや異なるが、両マーカー（ＨＢ９及びＴｕｊ１）の発現様相は同一であることを確認した（図５Ｂのｈ、ｉ、ｊ及びｋ）。

図５Ｃでは、Ｔ−ＭＳＣはＣｈＡＴを示す赤色蛍光信号が全く現れないのに対し、分化後の運動神経細胞（Ｔ−ＭＳＣ−ＭＮＣ）はＣｈＡＴを示す赤色蛍光信号が強く発現することを確認した（図５Ｃのｂ及びｅ）。これとともにＴｕｊ１の発現も確認した結果（図５Ｃのａ及びｄ）、分化が進みながら発現が増加することを確認した。またｉＰＳＣ−ＭＮＣのＣｈＡＴ及びＴｕｊ１発現の有無を観察した。その結果、Ｔ−ＭＳＣ−ＭＮＣとｉＰＳＣ−ＭＮＣの細胞形態はやや異なるが、両マーカー（ＣｈＡＴ及びＴｕｊ１）の発現様相は同一であることを確認した（図５Ｃのｈ、ｉ、ｊ及びｋ）。

前記実験結果から、扁桃由来間葉系幹細胞から分化した細胞は運動神経細胞の特性があることを確認し、したがって、本発明の分化培養液培地の使用時に運動神経細胞への優れた分化能を示すことを確認した。

＜実施例５：ウェスタンブロットを用いた扁桃由来間葉系幹細胞から運動神経細胞への分化能＞
扁桃由来間葉系幹細胞から運動神経細胞への分化をウェスタンブロットを用いて確認した。

前記扁桃由来間葉系幹細胞と分化段階別細胞（未分化扁桃由来間葉系幹細胞、神経前駆細胞、及び分化２週〜４週後運動神経細胞）を取り、タンパク質分解酵素抑制剤（Ｒｏｃｈｅ）が含まれたライシス緩衝液に入れて破砕した。全タンパク質（１０〜３０μｇ）を確認するための１次抗体（ＩＳＬ１、ＨＢ９、ＣｈＡＴ）で免疫ブロットし、ＧＡＰＤＨ（Ａｂｃａｍ）を内部対照群として用いた。ＬＡＳ−３０００（Ｆｕｊｉ ｆｉｌｍ）を用いてバンドの強度を定量化し、ＧＡＰＤＨの強度に標準化した。

その結果を図６に示す。図６Ａのバンドを数値化して整理したグラフが図６Ｂ（ＩＳＬ１）、図６Ｃ（ＨＢ９）、図６Ｄ（ＣｈＡＴ）である。図６から確認されるように、ＩＳＬ１タンパク質はＴ−ＭＳＣにおいてもやや発現するが、神経前駆細胞（ＮＰＣ）への分化時から増加して分化２週目に最大に増加した（図６Ｂ）。ＨＢ９タンパク質はＴ−ＭＳＣ及びＮＰＣではほとんど発現を示さないが、分化２週目と３週目に発現増加を示した（図６Ｃ）。ＣｈＡＴのｉｓｏｔｙｐｅ２タンパク質は分化２週目と３週目に２つのバンドを示し、運動神経細胞への分化を確認した（図６Ｄ）。

前記実施例３と類似に、分化２週後の運動神経細胞においてｉｓｏｔｙｐｅ２の発現量が増加することは、分化した運動神経細胞が末梢神経の特性を示すことを意味する。

前記実験結果から、扁桃由来間葉系幹細胞から分化した細胞は運動神経細胞の特性があることを確認し、したがって、本発明の分化培養液培地の使用時に運動神経細胞への優れた分化能を示すことを確認した。

＜実施例６：アセチルコリンの増加から運動神経細胞への分化能確認＞
運動神経細胞へと４週間分化中であった扁桃由来間葉系幹細胞の培養皿から採取した上層液（上澄み液又は馴化培養液）と分化培養液培地をアセチルコリン分析キット（Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ；Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ，ＩＮＣ．ＣＡ，ＵＳＡ）で分析し、分化培養液に対するアセチルコリンの増加率をパーセントで計算した。

その結果を図７に示す。図７から確認されるように、Ｔ−ＭＳＣからＴ−ＭＳＣ−ＭＮＣへの分化時に、分化１週後からアセチルコリン分泌が増加して分化後２週で最高の増加率を示すことを確認した。この結果は３回の反復実験によって統計的にも有意性が認められており、扁桃由来間葉系幹細胞を運動神経細胞に分化時に、分化２週目に最高の分化率を示すことを意味する。

アセチルコリンは神経末端から分泌される神経筋接合部の神経伝達物質であり、本発明によって製造された運動神経細胞においてアセチルコリンの分泌が増加したということは、正常の運動神経細胞として働き得ることを意味する。

この結果、本発明の分化培養液培地を使用して扁桃由来間葉系幹細胞を培養時に運動神経細胞に分化することを確認した。

＜実施例７：分化した運動神経細胞の神経筋接合部形成能＞
本発明によって分化した運動神経細胞が実際に運動神経細胞の特性を示すかどうかを調べるために、神経筋接合部（ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）形成の有無を確認した。

具体的に、扁桃由来間葉系幹細胞から２週間分化した運動神経細胞をヒト骨格筋細胞（ｈｕｍａｎ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌ，ｈＳＫＭＣ）と共培養（Ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ）して４〜５日後に固定した。その後、蛍光免疫染色法を用いてＴｕｉ１（緑色）に染色して神経細胞であるか否か確認し、神経筋接合部の確認のためにＡｌｅｘａ ５５５−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ α−ＢＴＸを処理し、アセチルコリン受容体の有無を赤色の発現から確認した。

その結果を図８に示す。まず、図８Ａでは神経筋接合部形成を確認する前にＴ−ＭＳＣ−ＭＮＣの形態的変化をまず観察した。Ｔ−ＭＳＣ−ＭＮＣはＴ−ＭＳＣとは違い、多極（ｍｕｌｔｉｐｏｌａｒ）の形態を示し、運動神経細胞の一般形状のように細胞体（ｃｅｌｌ ｂｏｄｙ）の拡張が増加した（図８Ａ、矢印）。また、共培養のために培養中だったｈＳＫＭＣの細胞形態だけでなく、ｈＳＫＭＣとＴ−ＭＳＣ−ＭＮＣの共培養時にもそれぞれの細胞特徴が観察できた。

図８Ｂでは、Ｔ−ＭＳＣ又はｈＳＫＭＣ単独培養時には赤色蛍光は全く現れず、Ｔｕｊ１の低調な発現が観察されたが、本発明によって分化した運動神経細胞を骨格筋細胞と共培養した場合、赤色蛍光が現れ、Ｔｕｊ１の発現も増加することを確認した。図８Ｃでは神経筋接合部形成の確認をさらに詳細に観察するために、筋肉特異マーカーであるα−ＳＭＡ（α−ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｌｃｅ ａｃｔｉｎ）、神経特異マーカーであるＴｕｊ１、及びα−ＢＴＸを用いて３重染色（ｔｒｉｐｌｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ）を行った。その結果、両細胞を共培養した時、赤色のアセチルコリン受容体の存在（矢印）が明確に確認できた。

この結果は、扁桃由来間葉系幹細胞から２週間分化した細胞が、運動神経細胞の機能のうち最も重要な機能である骨格筋細胞との接合（ｊｕｎｃｔｉｏｎ）による信号伝達の可能性を提示する。

したがって、前記のような赤色蛍光は運動神経細胞と骨格筋細胞の共培養によってアセチルコリン受容体が存在することを示すものであり、この実験結果から、本発明によって分化した運動神経細胞は、経筋接合部形成能を有し、アセチルコリンを媒介にした正常の神経信号伝達システムを構築することができる。

＜実施例８：ＰＣＲを用いた扁桃由来間葉系幹細胞から分化した運動神経細胞の神経栄養因子増加確認＞
扁桃由来間葉系幹細胞から分化した運動神経細胞の特性を調べるために、中枢神経及び末梢神経の発生と形成を助ける脳由来神経栄養因子（ｂｒａｉｎ ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ，ＢＤＮＦ）、 グリア細胞由来神経栄養因子 （ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ，ＧＤＮＦ）、神経成長因子 （ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ，ＮＧＦ）、及びヘレグリン（ｈｅｒｅｇｕｌｉｎ，ＨＲＧ）のような神経栄養因子（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ）の発現変化をリアルタイムＰＣＲで分析した。ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．）を用いて、製造者の指示書に従って総ＲＮＡを抽出した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とｏｌｉｇｏ−ｄ（Ｔ）２０プライマーを用いて４２℃で１時間、７２℃で１５分間反応させてｃＤＮＡを合成した。前記ｃＤＮＡに対する定量リアルタイムＰＣＲはＳＹＢＲ（登録商標）Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ ＴＭキット（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）を用いて、ＡＢＩ ７５００高速リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）で行った。ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＮＧＦ、ＨＲＧ遺伝子の相対的発現量は比較Ｃｔ定量（２−ΔΔＣｔ）方法で計算し、全ての測定値は３重（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）に行った。

その結果、図９でＴ−ＭＳＣ−ＭＮＣへの分化後、４つの神経栄養因子の発現が共に統計的に有意に増加したが、特に、分化培養液に添加しなかった神経成長因子のＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ及びＨＲＧの発現が有意に増加した点は重要な意味を有するといえる。

＜実施例９：ＡｄＭＳＣ、ＢＭＭＳＣ及びＷＪ−ＭＳＣとの比較＞
図１０は、Ｔ−ＭＳＣを、免疫蛍光染色法を用いてビメンチンの発現を確認した図である。ビメンチンは、神経前駆細胞（ｎｅｕｒａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）のマーカーとして用いられるタンパク質でもある。図１０から、Ｔ−ＭＳＣの発現率が他のＭＳＣ（ＡｄＭＡＣ、ＢＭ−ＭＳＣ、ＷＪ−ＭＳＣ）に比べて有意に高く、よって、運動神経細胞への分化潜在性に優れることが分かる。

図１１は、Ｔ−ＭＳＣ及びこれから由来した神経前駆細胞（ｎｅｕｒａｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌｓ，ＮＰＣｓ）を、免疫蛍光染色法によってＴｕｊ１の発現を確認した図である。図１１から、神経前駆細胞に分化させた場合にも他のＭＳＣ（ＡｄＭＳＣ及びＢＭ−ＭＳＣ）由来のＮＰＳに比べて神経特異マーカー（Ｎｅｕｒｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍａｒｋｅｒ）であるＴｕｊ１の発現が非常に高く、よって、運動神経細胞を含む神経細胞への分化潜在性が格段に高いことが予測できる。

本明細書は、本発明の技術分野における通常の知識を有する者にとって十分に認識して類推できる内容はその詳細な記載を省略しており、本明細書に記載された具体的な例示の他にも、本発明の技術的思想や必須構成を変更しない範囲内でより様々な変形が可能である。したがって、本発明は、本明細書に具体的に説明及び例示の方式と異なる方式で実施されてもよく、これは、本発明の技術分野における通常の知識を有する者には理解可能な事項である。

［この発明を支援した国家研究開発事業］
［課題固有番号］２０１７Ｒ１Ｄ１Ａ１Ａ０２０１８６３４
［部処名］教育部
［研究管理専門機関］韓国研究財団
［研究事業名］基礎研究事業（学術振興）−理工分野基礎研究事業−基本研究（ＳＧＥＲ）
［研究課題名］末梢神経病の治療のための扁桃由来間葉系幹細胞の開発
［寄与率］７０／１００
［主管機関］イファ女子大学校産学協力団
［研究期間］２０１７．０６．０１〜２０２０．０５．３１
［この発明を支援した国家研究開発事業］
［課題固有番号］ＨＩ１２Ｃ０１３５０１００１７
［部処名］保健福祉部
［研究管理専門機関］韓国保健産業振興院
［研究事業名］保健医療技術研究開発事業−希疾患事業
［研究課題名］シャルコーマリートゥース病の新規バイオマーカー及びカストマイズド治療技術開発
［寄与率］３０／１００
［主管機関］イファ女子大学校産学協力団
［研究期間］２０１７．０４．０１〜２０１８．０３．３１

扁桃由来間葉系幹細胞（Ｔ−ＭＳＣ，Ａ）を神経前駆細胞（ＮＰ，Ｂ）に誘導し、運動神経細胞（ＭＮ，Ｃ）に分化する段階、及び分化段階別の培地の成分及びその時期の細胞の形態を示す模式図である。 本発明に係る方法で分化した運動神経細胞を２世代及び３世代に継代培養時に正常増殖が可能であることを確認した図である。

ＭＮ ２．５ｗ−２．５週分化した運動神経細胞；
ｐ２−２世代継代培養；及び
ｐ３−３世代継代培養、以下、図３も同様。
本発明に係る方法で分化した運動神経細胞（ＭＮ）を凍結後融解しても運動神経細胞として使用可能であることを確認した図である。 扁桃由来間葉系幹細胞（Ｔ−ＭＳＣ）を運動神経細胞（ＭＮ）に分化させながら分化期間別に分化した細胞を得、リアルタイムＰＣＲを用いてＩＳＬ１、ＨＢ９及びＣｈＡＴの発現が増加することを確認したグラフである。

ＭＮ２ｗ−２週分化した運動神経細胞；
ＭＮ３ｗ−３週分化した運動神経細胞；及び
ＭＮ４ｗ−４週分化した運動神経細胞。
扁桃由来間葉系幹細胞を運動神経細胞に２週間分化させた後、得られた細胞を免疫蛍光染色法を用いてＩＳＬ１の発現が増加することを確認した図である。 扁桃由来間葉系幹細胞を運動神経細胞に２週間分化させた後、得られた細胞を免疫蛍光染色法を用いてＨＢ９の発現が増加することを確認した図である。 扁桃由来間葉系幹細胞を運動神経細胞に２週間分化させた後、得られた細胞を免疫蛍光染色法を用いてＣｈＡＴの発現が増加することを確認した図である。 扁桃由来間葉系幹細胞を運動神経細胞に４週間分化させながら分化期間別に分化した細胞を得、ウェスタンブロットを用いて運動神経細胞からＩＳＬ１（図６Ｂ）、ＨＢ９（図６Ｃ）及びＣｈＡＴ（図６Ｄ）の発現増減を確認した図である。 扁桃由来間葉系幹細胞を運動神経細胞に４週間分化させながら分化期間別に分化した細胞を得、ウェスタンブロットを用いて運動神経細胞からＩＳＬ１（図６Ｂ）、ＨＢ９（図６Ｃ）及びＣｈＡＴ（図６Ｄ）の発現増減を確認した図である。 扁桃由来間葉系幹細胞を運動神経細胞に４週間分化させながら分化期間別に分化した細胞を得、ウェスタンブロットを用いて運動神経細胞からＩＳＬ１（図６Ｂ）、ＨＢ９（図６Ｃ）及びＣｈＡＴ（図６Ｄ）の発現増減を確認した図である。 扁桃由来間葉系幹細胞を運動神経細胞に４週間分化させながら分化期間別に分化した細胞を得、ウェスタンブロットを用いて運動神経細胞からＩＳＬ１（図６Ｂ）、ＨＢ９（図６Ｃ）及びＣｈＡＴ（図６Ｄ）の発現増減を確認した図である。 扁桃由来間葉系幹細胞を運動神経細胞に分化させながら分化期間別に上層液を複数回得て、分化培養液と比較してアセチルコリンの濃度をパーセントで計算して統計的に比較したグラフである。

ＮＰＣ−神経前駆細胞、ｎｅｕｒａｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌ；
ＭＮＣ２ｗ−２週分化した運動神経細胞；
ＭＮＣ３ｗ−３週分化した運動神経細胞；及び
ＭＮＣ４ｗ−４週分化した運動神経細胞。
扁桃由来間葉系幹細胞を運動神経細胞に分化させる前後の細胞形態、及び筋肉細胞と共培養中の運動神経細胞を光学顕微鏡で観察した写真である。 本発明によって２週間分化して運動神経に分化したＴ−ＭＳＣとヒト骨格筋細胞を共培養させた後、蛍光免疫染色法及びα−ＢＴＸ処理法によって、神経筋接合部の形成が可能であることを、共培養前後に染色して確認した図である（ｈＳＫＭＣ：ヒト骨格筋細胞だけを培養；Ｔ−ＭＳＣ−ＭＮＣ：扁桃幹細胞由来運動神経細胞だけを培養；ｈＳＫＭＣ ＆ Ｔ−ＭＳＣ−ＭＮＣ：ヒト骨格筋細胞と扁桃幹細胞由来運動神経細胞を共培養。） 図８Ｂと同様に運動神経に分化したＴ−ＭＳＣとヒト骨格筋細胞を共培養させた後、神経筋接合部の形成とともに、両細胞の形態をさらに確実に確認するために、同一スライドで染色に用いられたタンパク質別に撮影をした。α−ＳＭＡ（α−ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ａｃｔｉｎ、青色）パネルは筋肉細胞の形態を示し、Ｔｕｊ１（ｂｅｔａ ＩＩＩ Ｔｕｂｕｌｉｎ、緑色）パネルは神経細胞の形態を示し、α−ＢＴＸ（赤色、Ｂｕｎｇａｒｏｔｏｘｉｎ）パネルは神経筋接合部であるアセチルコリンレセプタクラスター（ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｌｕｓｔｅｒ）を表示する。この３つを重なって示したのがｍｅｒｇｅパネルである。 扁桃由来間葉系幹細胞（Ｔ−ＭＳＣ）を運動神経細胞（ＭＮＣ）に分化させた後に細胞を得、リアルタイムＰＣＲを用いて４種類の神経栄養因子（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ）の発現が増加することを確認したグラフである。 Ｔ−ＭＳＣを免疫蛍光染色法を用いてビメンチンの発現を確認した図である。 Ｔ−ＭＳＣ及びこれから由来した神経前駆細胞（ｎｅｕｒａｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌｓ，ＮＰＣｓ）を免疫蛍光染色法でＴｕｊ１の発現を確認した図である。

Claims (21)

1. ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＦＢＳ、Ｎ_２補充物（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）、レチノイン酸、脳由来神経成長因子（ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ，ＢＤＮＦ）、神経成長因子（ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ，ＮＧＦ）及びソニックヘッジホッグ（ｓｏｎｉｃ ｈｅｄｇｅｈｏｇ，ＳＨＨ）を含む、扁桃由来間葉系幹細胞又はこれから分化した前駆細胞から運動神経細胞（ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎ）に分化させるための分化培養液培地組成物。
2. 前記分化培養液培地は、低濃度グルコースＤＭＥＭ、０．２５〜２５％（ｗ／ｖ）ＦＢＳ、０．１〜１０％（ｗ／ｖ）Ｎ_２補充物（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）、０．１〜１０μＭレチノイン酸、１〜１００ｎｇ／ｍｌ脳由来神経成長因子（ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ，ＢＤＮＦ）、１〜１００ｎｇ／ｍｌ神経成長因子（ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ，ＮＧＦ）及び０．０１〜１ｎｇ／ｍｌソニックヘッジホッグ（ｓｏｎｉｃ ｈｅｄｇｅｈｏｇ，ＳＨＨ）を含む、請求項１に記載の分化培養液培地組成物。
3. 扁桃由来間葉系幹細胞又はこれから分化した前駆細胞を請求項１の分化培地組成物で培養して運動神経細胞を誘導する段階を含む運動神経細胞への分化方法。
4. 前記培養を２〜４週間行う、請求項３に記載の分化方法。
5. 運動神経細胞を誘導する段階前に扁桃由来間葉系幹細胞を浮遊状態で培養して細胞凝集体を形成する段階をさらに含む、請求項３に記載の分化方法。
6. 前記細胞凝集体を形成する段階の増殖培養液培地は、ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、β−メルカプトエタノール及び非必須アミノ酸を含む、請求項５に記載の分化方法。
7. 前記細胞凝集体を形成する段階の増殖培養液培地は、５〜２０％（ｗ／ｖ）ＦＢＳ、０．５〜２％（ｗ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシン、０．０５〜０．２ｍＭ β−メルカプトエタノール及び０．５〜２％（ｗ／ｖ）非必須アミノ酸を含むＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ）である、請求項６に記載の分化方法。
8. 前記細胞凝集体の形成は、ポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ）がコーティングされた培養皿で培養液１０ｍｌ当たり５×１０^６〜７×１０^６個の細胞を浮遊状態で１〜７日間培養することである、請求項５に記載の分化方法。
9. 細胞凝集体を１〜３世代まで継代培養して神経前駆細胞（ｎｅｕｒａｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）に分化させる段階をさらに含む、請求項５に記載の分化方法。
10. 前記前駆細胞は、神経前駆細胞（ｎｅｕｒａｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌ）である、請求項１に記載の分化方法。
11. 前記扁桃由来間葉系幹細胞は、他の組織由来間葉系幹細胞に比べて、神経前駆細胞のマーカーであるビメンチン（ｖｉｍｅｎｔｉｎ）の発現率が高いことを特徴とする、請求項３に記載の分化方法。
12. 前記扁桃由来間葉系幹細胞から分化した前駆細胞は、他の組織由来間葉系幹細胞から分化した前駆細胞に比べて、ニューロン特異マーカー（Ｎｅｕｒｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍａｒｋｅｒ）であるＴｕｊ１の発現率が高いことを特徴とする、請求項３に記載の分化方法。
13. 請求項３〜１２のいずれか一項による分化方法によって製造された運動神経細胞。
14. 前記運動神経細胞はＩＳＬ１（ｉｎｓｕｌｉｎ ｇｅｎｅ ｅｎｈａｎｃｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＨＢ９（ｈｏｍｅｏｂｏｘ ｐｒｏｔｅｉｎ）、又はＣｈＡＴ（ｃｈｏｌｉｎｅ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）の発現が増加する、請求項１３に記載の運動神経細胞。
15. 前記運動神経細胞はアセチルコリンの分泌が増加する、請求項１３に記載の運動神経細胞。
16. 前記運動神経細胞は神経筋接合部（ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）の形成が可能である、請求項１３に記載の運動神経細胞。
17. 前記運動神経細胞は１〜３世代まで継代培養が可能である、請求項１３に記載の運動神経細胞。
18. 前記運動神経細胞は凍結後融解して使用可能である、請求項１３に記載の運動神経細胞。
19. 請求項１３による運動神経細胞を有効成分として含む神経疾患の予防又は治療用薬学組成物。
20. 前記神経疾患は、筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，ＡＬＳ）、重症筋無力症（ｍｙａｓｔｈｅｎｉａ ｇｒａｖｉｓ，ＭＧ）、脊髄筋萎縮症（ｓｐｉｎａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ，ＳＭＡ）又はシャルコーマリートゥース（Ｃｈａｒｃｏｔ−Ｍａｒｉｅ−Ｔｏｏｔｈ，ＣＭＴ）病である、請求項１９に記載の神経疾患の予防又は治療用薬学組成物。
21. 請求項１３による運動神経細胞を含む細胞治療剤。
    
    

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