KR100907248B1 - 분화된 어린 지방 세포와 생분해성 중합체의 이식에 의한신체의 부피 대체 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간의 지방 조직에서 유래한 지방 전구 세포(preadipocyte)를 지방 세포로 분화시키고 생분해성 중합체(biodegradable scaffold)와 함께 체내에 이식하는 기술에 관한 것으로, 지방조직 유래의 지방전구세포로부터 지방세포로 분화시켜서 얻어지는 지름 20∼40 ㎛의 어린 지방세포를 scaffold와 함께 자가 또는 동종이식에 이용할 경우, 이식 부위에서 지방세포가 성숙함에 따라 이식세포의 부피가 점진적으로 증가되므로 효과적인 신체부피 대체물로 이용될 수 있으며, 연부조직결손 또는 미용상의 외형적 결함으로 인한 장애를 치료할 수 있다.

미분화 지방전구세포, 분화된 어린 지방세포, 생분해성 중합체

Description

분화된 어린 지방 세포와 생분해성 중합체의 이식에 의한 신체의 부피 대체 방법{TRANSPLANTATION OF DIFFERENTIATED IMMATURE ADIPOCYTES AND BIODEGRADABLE SCAFFOLD FOR TISSUE AUGMENTATION}

도 1은 분화된 어린 지방세포와 성숙한 지방세포를 Oil Red O로 염색하여 크기를 측정한 현미경 사진(400 배)이고,

도 2는 분화된 어린 지방세포를 피브린(fibrin)에 도입하여 1 달 동안 공동 배양한 후 성숙한 지방세포를 Oil Red O로 염색한 현미경 사진(400 배)이며,

도 3은 분화된 어린 지방세포를 피브린(fibrin)에 도입하여 공동 배양을 실시하면서 배양 상등액에 분비된 렙틴 양을 측정한 도표이고,

도 4는 분화된 어린 지방세포를 알기네이트 비드(alginate bead)에 도입하여 공동 배양한 후 지방세포를 Oil Red O로 염색한 현미경 사진(40 배, 400 배)이다.

본 발명은 인간의 지방 조직에서 유래한 지방 전구 세포(preadipocyte)를 지방 세포로 분화시키고 생분해성 중합체(biodegradable scaffold)와 함께 체내에 이식하는 기술에 관한 것으로, 구체적으로는 인간의 지방 조직에서 지방 전구 세포 (preadipocyte)를 분리하고 성장 인자를 포함하는 배지에서 배양시킨 후 지방 세포로 분화시켜 얻어지는 지름 20∼40 ㎛의 어린 지방세포(immature adipocytes), 이의 배양 방법, 그리고 이를 생분해성 중합체(biodegradable scaffold)와 함께 체내에 이식하는 방법에 관련된다.

현재 지방 세포의 자가 이식은 널리 행해지고 있다. 자가 지방 세포 이식은 1890년대부터 시작되었고, 1980년대 지방 흡입술이 시작된 이래 널리 사용됨으로써 그 사례도 상당히 많아져서 자가 지방 이식의 안전성은 이미 입증되어 있다. 특히 지방 이식은 나이로 인하여 노화된 피부의 주름 개선을 비롯하여, 입술선, 턱선, 이마선의 교정, 코 성형 등에 사용되고 있다. 또한, 화상이나 상처로 인하여 함몰된 피부, 암 절제 수술로 상실된 부분 등에도 지방을 이식함으로써 결함부위를 교정하는 수술로서 좋은 성과를 보이고 있다.

그러나, 단순히 지방 흡입으로부터 얻어진 지방 조직을 이식할 경우, 이식 후에 이식 부피의 40∼60 %가 흡수되는 등 생존률과 생존 기간이 기대에 미치지 못하여 재이식이 필요하다는 문제가 있다(S Eremia et al., 2000, Dermatol. Sur. 26, 1150-1158; Fulton JE et al., 2001, Dermatol. Clin. 19(3), 523-530).

이에 따라, 지방 흡입술 이후 얻은 지방 덩어리로부터 순수하게 지방 세포를 분리하고자 하는 연구가 지속되어 왔다. 이러한 노력의 일환으로 일부에서는 지방 덩어리로부터 섬유질, 혈액 등을 제거한 후 지방 이식을 하고 있으나 아직까지 그 효과가 만족스럽지 못하다(G Sattler et al., 2000, Dermatol. Sur. 26, 1140-1144).

지방조직에서 단순 분리된 지방세포를 이식하였을 때 나타나는 이식 부피의 감소는, 대부분의 지방세포가 충분히 성숙한 것이기 때문에 흡입 과정중 상당 부분이 파괴되거나 이식 후 생착율이 떨어지고, 혈관 재생 또는 혈관 신생이 원활하게 진행되지 못함에 기인한다.

이에 따라, 지방조직에 포함되어 있는 지방전구세포를 생체이식재료로 이용하고자 하는 연구가 다양하게 진행되고 있다. 지방조직 유래 지방전구세포는 분화 조건에 따라 뼈세포, 지방세포, 근세포, 신경세포 등으로 분화되므로, 지방전구세포를 체내에 이식함으로써 이식부위에 생착하여 지방세포로 분화되는 기전을 응용하는 것이다(JM Gimble et al., 2000, Bone 19: 421-428). 그러나 지방전구세포는 그 자체로 다양한 분화능을 가지므로 안전하지 않을 뿐 아니라, 이식 부위의 주변 환경(physiological microenvironment)에 따라 지방세포로의 분화능 및 분화율에 크게 영향을 받으므로 결과의 예측이 어렵다는 문제가 있다. 또한, 지방세포로의 분화를 돕기 위해 성장인자 등의 보조요법을 함께 처리할 경우 안전상의 문제를 야기할 수도 있다.

이와 같은 문제점을 개선한 것으로서, 미국특허 제6,153,432호(2000. 11. 28)에서는 지방 흡입술을 통해 얻어진 지방조직으로부터 미분화 지방전구세포를 분리하고 이식에 필요한 지방 세포로 분화하는 방법에 대하여 기술하고 있다. 이 방법은 지방 흡입으로 얻어진 지방조직에서 지방전구세포를 분리하고; 이를 기질배지(stromal media)에 현탁시켜 배양용기에 접종한 후, 37 ℃, CO₂ 인큐베이터에서 24 시간 동안 배양하여 지방전구세포가 배양용기 바닥에 붙으면; 기질배지를 제거하고 분화배지(differentiation media)를 넣어 3 일 동안 배양한 후; 지방세포배지(adipocyte media)를 넣고 지방세포로 분화시키는 과정을 포함한다. 이 방법에 따르면, 기존의 지방이식술에서 사용되는 노화된 지방 세포가 아닌 건강한 어린 세포만 이식하여 효과를 극대화시킬 수 있으며, 지방전구세포 사용에서 나타날 수 있는 안전성 및 유효성의 문제를 극복할 수 있다는 장점이 있다.

그러나, 위 특허 방법에서는 분화된 지방세포의 형태학적인 특징을 구체적으로 정의하지 않고 "지질방울을 함유한 분화된 지방세포"로 표현하고 있으며, 지방전구세포로부터 최종적으로 얻어지는 분화된 지방세포의 수집 시기 및 결과로 얻어지는 지방세포의 품질을 규정하기 힘들다는 문제가 있다.

지방전구세포는 분화 단계를 거치면서 분화 초기에는 세포질 내에 작은 지질방울의 형성이 시작되는 단계, 작은 지질방울의 수가 점차 증가하는 단계, 그리고 작은 지질방울들이 점점 합쳐져 큰 지질방울을 형성하는 단계를 거치면서 성숙하고, 완전히 성숙하면 한 개의 지질방울이 세포질 전체를 차지하게 되며 성숙과정 동안 세포의 크기도 점차 증가하게 된다. 충분히 지방세포로 분화되지 않은 세포는 이식 후 지방세포로의 분화를 확신할 수 없으며, 완전히 성숙한 지방세포는 세포수집 과정에서 손실되거나 이식 후 생착율이 떨어진다. 따라서, 이식에 사용할 세포의 특징을 구체적으로 정하여 건강한 어린 지방세포를 얻어 이식 후 효과를 극대화할 수 있는 방법이 요구된다.

한편, 최근 수 년에 걸쳐 생체적합물질(biomaterial) 분야에는 괄목할 만한 성장이 있었다. 이미 많은 물질들이 임상에 적용되고 있으며, 대표적인 것으로는 콜라젠이 있다. 그 외에도 조직공학 분야에서 다양한 물질들이 사용되고 있는데, 폴리-락트산(poly-lactic acid), 폴리-글리콜산(poly-glycolic acid), 콜라겐 타입 Ⅰ(collagen type Ⅰ) 유도체, 알지네이트(alginate) 등이 여기에 포함된다. 이러한 생체적합물질에 스테로이드나 성장호르몬과 같은 외인성요소를 처리하여 이식함으로써 이식한 매트릭스 내에서 세포의 성장을 촉진할 수도 있다. 최근 발표된 논문에서는, bFGF(basic fibroblast growth factor)와 Matrigel(basement membrane collagen)을 함께 마우스에 주사하여 새로운 지방조직이 생성되는 것을 확인하고 있다(K Toriyama et al., 2002, Tissue Engineering, vol. 8, 157-165). 즉, Matrigel 부위에는 내피세포(endothelial cell)가 모여들어 새로운 혈관이 형성되고 모여든 섬유모세포-유사 세포(fibroblast-like cell) 내로 지방 방울이 형성되는 것을 확인하였다. 또한, PLGA(poly lactic-co-glycolic acid)로 만든 중합체 골격(scaffold)에 지방전구세포를 도입하여 래트에 이식하였을 때 지방전구세포가 지방세포로 분화되어 지방조직을 형성하는 것이 확인되었다(CW Patrick et al., 2002, Tissue Engineering, vol. 8, 283-293).

이와 같은 생체적합물질(biomaterial) 분야의 발전에도 불구하고 사람에 이식하여 효과적으로 지방조직을 재생할 수 있는 방법은 아직 개발된 바가 없다. 그 이유중 가장 중요한 것의 하나는 in vitro에서 사람의 동종 또는 이종 지방세포를 효과적으로 증식시키고 분화시킬 수 있는 적절한 조건, 이식에 사용하였을 때 잘 생착하고 지속적으로 유지될 수 있는 적절한 형태의 분화된 지방세포를 얻는 조건 이 개발되지 않았기 때문이다. 따라서, 연부조직의 결손 또는 결함 등을 효과적으로 치료하기 위해서는 세포생산기술과 적절한 생체적합물질의 조화가 필요하다.

본 발명에서는 인간의 지방조직에서 분리한 미분화 지방전구세포를 이용하여 이식에 이용할 수 있는 분화된 어린 지방세포를 생산하는 기술을 확립하고, in vitro에서 생분해성 중합체와 함께 배양하여 지방세포가 생분해성 중합체 내에서 성숙하는 것을 확인함으로써 생분해성 중합체와 함께 체내에 이식하였을 때 자연히 존재하는 지방세포와 같은 형태의 지방조직을 형성하도록 하여 효과적으로 신체의 부피 대체를 할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서는, 지방조직 유래의 지방전구세포로부터 지방세포로 분화시켜서 얻어지는 지름 20∼40 ㎛의 어린 지방세포를 포함하는, 신체 부피 대체를 위한 이식용 지방세포 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해,

(a) 자가 또는 동종 지방 조직에서 분리된 미분화 지방전구세포를 지방세포로 분화시키는 단계;

(b) 지름 20∼40 ㎛의 분화된 어린 지방세포(differentiated immature adipocytes)를 수집하는 단계; 및

(c) 수집된 어린 지방세포와 생분해성 중합체(biodegradable scaffold)를 in vitro에서 함께 배양하는 단계를 포함하는, 자가 또는 동종 이식용 지방세포 조성물의 생산 방법을 제공한다.

또한, 본 발명에서는,

(a) 자가 또는 동종 지방 조직에서 분리된 미분화 지방전구세포를 지방세포로 분화시키는 단계;

(b) 지름 20∼40 ㎛의 분화된 어린 지방세포(differentiated immature adipocytes)를 수집하는 단계;

(c) 수집된 어린 지방세포와 생분해성 중합체(biodegradable scaffold)를 in vitro에서 함께 배양하는 단계; 및

(d) 어린 지방세포와 생분해성 중합체를 함께 체내에 이식하는 단계를 포함하는, 지방세포 이식 방법을 제공한다.

본 발명에서는 자가 또는 동종 지방조직에서 분리한 미분화 지방전구세포를 지방세포로 분화시키는 데 있어서, 기질배지, 증식배지, 분화배지 및 분화유지배지를 적절히 사용하여 배양함으로써 일정 크기로 성숙한 어린 지방세포를 수집함으로써 분화율이 극대화된 지방세포를 얻는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 이식에 사용하는 지방세포는 지름 20∼40 ㎛의 분화된 어린 지방세포로, 이식 부위에서 성숙하므로 점진적으로 부피가 증가한다. 이 단계의 어린 지방세포는 지방전구세포와 달리 분화유발인자를 필요로 하지 않으며, 이미 성숙한 지방세포나 다른 어떤 방법으로 얻어진 지방세포에 비해 생존율과 생착율이 뛰어나며 이식부위에서 점진적으로 부피가 증가되는 장점이 있다.

본 발명에서 얻어진 어린 지방세포를 scaffold와 함께 이식에 이용할 경우, 이식초기의 부피 대체는 scaffold가 그 역할을 하며 지방세포가 생착하고 성장하는 동안 scaffold는 생분해되어 흡수되므로 최종적으로는 자연히 존재하는 지방조직과 동일한 형태의 지방조직으로 대체되어진다. 이에 따라, 본 발명의 이식용 지방세포 조성물은 이식 부위에서 지방세포의 성숙과 함께 점진적으로 부피가 증가되므로 효과적인 신체부피 대체물로 이용할 수 있으며, 연부조직결손 또는 미용상의 외형적 결함으로 인한 장애를 치료할 수 있다.

이하, 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다.

본 명세서에서 "지방전구세포(preadipocyte)"는 지방조직에서 분리된 세포로, 특히 지방세포로 분화될 수 있는 가능성을 가진 세포를 의미한다.

"지방세포(adipocyte)"는 지방전구세포에 분화 유도 인자를 처리하여 지질방울을 형성하고 렙틴을 분비하는 세포로, 본 발명에서는 미분화 지방전구세포에서 분화된 지방세포를 의미한다.

"분화된 어린 지방세포(differentiated immature adipocyte)"는 지방전구세포에 분화 유도 인자를 처리하여 지질방울을 형성하고 렙틴을 분비하는 세포로, 본 발명에서는 미분화 지방전구세포에서 분화된 지방세포로서 세포 지름이 20∼40 ㎛인 세포를 의미한다.

본 발명에서 "지방전구세포 분화 인자"는 지방전구세포를 지방세포로 분화시키는 데 필요한 물질로, 바이오틴(biotin), 인슐린(insulin), 판토테네이트(pantothenate), 덱사메타손(dexamethasone), 이소부틸메틸잔틴(IBMX), 인도메타신(indomethacin) 등을 포함한다.

본 발명에서 "임상 적용을 위한 이식"은 노화로 인한 주름 개선, 얼굴 윤곽선 교정 등 신체의 윤곽을 바로 잡아주기 위하여, 또는 암 절제술로 인한 결손, 창상으로 인해 함몰된 부위의 재생, 기형으로 인한 함몰 부위 등 신체 전반에 걸쳐 함몰된 부위의 재생을 위하여 지방전구세포로부터 분화된 어린 지방세포를 이식하는 것을 의미한다.

"동종 이식"은 타인 또는 같은 종의 타동물로부터 특정 조직이나 장기 또는 세포를 이식 받는 것으로, 자기 조직이나 장기, 세포를 사용하지 못할 경우 다른 사람이나 다른 동물로부터 조직이나 장기 또는 세포를 이식 받는 것을 의미한다.

본 발명은 자가 또는 동종 지방조직에서 분리한 미분화 지방전구세포를 지방세포로 분화시키는 단계를 포함하는데, 이와 관련된 지방전구세포의 분화방법은 이미 여러 문헌에 다양한 방법으로 발표된 바 있다. 본 발명에서는 위에 언급된 미국특허 제6,153,432호(2000. 11. 28)에서 제시한 방법을 개선함으로써, 이식 후 점진적인 부피증가가 가능한 세포생산방법을 제시한다.

본 발명에서 지방전구세포는 주로 인간의 피하지방조직에서부터 지방흡입(liposuction) 방법으로 얻을 수 있는데, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에서 이식에 사용하기 위한 동종 또는 이종의 분화된 지방세포는 다음 과정에 따라 얻어질 수 있다:

(1) 지방흡입으로 얻어진 지방조직으로부터 지방전구세포의 분리.

지방조직을 KRB 용액으로 세척하고 지방조직을 콜라게나제(collagenase)로 처리한 후 원심분리하여 상층의 지방층을 제거하고, 하층에 기질배지(stromal media)를 넣어 현탁시킨 후 원심분리하여 하층의 지방전구세포를 회수한다.

(2) 지방전구세포를 기질배지(stromal media)에서 배양.

지방전구세포를 기질배지에 현탁시켜 배양용기에 접종한 후 배양하여 바닥에 붙인다. 기질배지는 10 % 우혈청이 포함되어 있는 DMEM/F12(Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 Nutrient Broth) 배지로, 24 시간 배양한다.

(3) 증식배지(expansion media)에서 배양.

기질배지를 제거한 후, 증식배지에서 배양하여 충분한 양의 지방전구세포로 증식시킨다. 증식배지는 10 % 우혈청, EGF(epidermal growth factor), bFGF(basic fibroblast growth factor), TGF-beta 1(transforming growth factor beta 1)를 포함하는 DMEM/F12로, 지방전구세포를 신속하게 증식시켜 세포 양을 다량으로 증가시키는 작용을 한다.

(4) 기질배지에서 배양.

세포가 배양용기의 바닥에 단일층으로 가득 차면 증식배지를 제거하고 기질배지를 넣어 1∼3 일 동안 추가 배양한다.

(5) 분화배지(differentiation media)에서 배양.

기질배지를 제거하고 분화배지에서 배양한다. 분화배지는 3 % 우혈청, 바이오틴(biotin), 판토테네이트(pantothenate), 인슐린(insulin), 덱사메타손(dexamethasone), 이소부틸메틸잔틴(isobutylmethylxanthin; IBMX), 인도메타신(indomethacin) 등이 포함된 DMEM/F12로서, 지방전구세포가 지방세포로 분화되도록 유도하며, 이때 세포질에 작은 지질방울이 형성되기 시작한다.

(6) 분화유지배지(maintenance media)에서 배양.

분화배지를 제거하고 분화유지배지에서 배양한다. 분화유지배지는 분화배지에서 세포분화를 유도하는 이소부틸메틸잔틴과 인도메타신을 제외한 것으로, 2∼3 일마다 새로 갈아준다. 세포는 유지배지에서 지질방울의 숫자가 더 많아지고 크기가 점점 커져 지방세포로 성숙한다.

특히, 초기 지방조직에서 지방전구세포를 분리하여 배양용기에 분주할 때 세포농도는, 지방흡입(liposuction)으로 얻어진 지방의 경우 지방조직 약 0.04 ㎖/㎠의 농도로 하고 6∼8 일 배양하여 충분히 증식시킨다. 계대배양 없이 passage 0에서 증식과정을 끝마치고 분화시킴으로써 분화율이 극대화된 지방세포를 얻을 수 있다.

상기 방법으로 분화시킨 지방세포를 수집하는 시기는 다음과 같이 결정한다. 즉, 지방전구세포는 분화배지에서 지질방울이 형성되기 시작하고, 분화유지배지에서 배양 시간이 늘어날수록 지질방울의 숫자와 크기가 증가하여 충분히 성숙하게 되면 지질방울이 하나로 합쳐져 세포질 전체를 차지하게 되고, 배양과정에서는 세포가 배양용기 바닥에서 떨어져 부유하게 된다. 또한, 지방전구세포는 분화단계를 거치면서 세포의 크기가 점점 증가하게 되는데, 분화초기의 지방세포 지름은 약 10∼20 ㎛이고 완전히 성숙한 지방세포의 크기는 약 70∼120 ㎛이다. 본 발명에 따르면, 분화된 지방세포의 지름이 20∼40 ㎛로 자랐을 때 세포수집을 실시하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따라, 분화된 어린 지방세포와 생분해성 중합체를 in vitro에서 함께 배양하여 생분해성 중합체 내에서의 지방세포의 결합 및 성숙을 측정하는 단계는 다음과 같이 실시된다.

(1) 분화된 어린 지방세포의 수집.

분화유지배지에서 배양되는 지방세포는 2∼3 일 간격으로 새로운 배지로 교환하면서 유지한다. 6∼9 일 동안 배양된 지방세포를 트립신/EDTA를 이용하여 수집하고 세포 크기를 측정한다. 특히, 수집된 세포를 사람에 적용할 경우, 세포 수집 2∼4 일 전의 배양액부터는 우혈청을 포함하지 않는 것이 바람직하다.

(2) 생분해성 중합체(biodegradable scaffold)

생분해성 중합체의 재료로는 피브린(fibrin), 알지네이트(alginate), PLGA, PTFT(polytetrafluoroethylene) 등이 포함되며, 이에 한정되지는 않는다. 그 형태 또한 주사로서 주입 가능한 것과, 구조물로서 외과적 수술을 통해 이식 가능한 것 모두를 포함한다.

(3) 분화된 어린 지방세포를 생분해성 중합체에 이식.

지름 20∼40 ㎛인 어린 지방세포를 생분해성 중합체에 이식하고 배양배지에서 배양한다.

(4) 생분해성 중합체 내 지방세포의 결합 및 성숙을 측정.

생분해성 중합체 내에서 지방세포의 생착과 지방세포의 성숙은

① Oil Red O 염색을 실시하여 지방세포를 동정하고 지방세포의 성숙 및 크기를 측정하는 방법; 또는

② 세포배양 상등액중의 렙틴을 정량하여 지방세포의 기능을 확인하는 방법 으로 이루어진다.

이상의 방법에 따라 얻어진 어린 지방세포를 생분해성 중합체에 이식하였을 때, 이식 부위에 잘 생착하여 지질방울의 크기가 증가하면서 세포크기가 증가하여 완전히 성숙하는 것을 확인하였다. 또한, 지방세포의 특징적 기능인 렙틴(leptin)의 분비량도 지속적으로 상승하였다.

또한, 본 발명에서는 분화된 어린 지방세포와 생분해성 중합체를 함께 체내에 이식하는 단계를 포함한다. 즉, 본 발명의 방법에 따라 얻어진 자가 또는 동종의 지방세포를 생분해성 중합체(scaffold)와 함께 임상적용을 위한 이식에 이용할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발℃명의 예시일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 어린 지방세포 생산 방법

먼저 지방 흡입에 의해 얻어진 지방 조직으로부터 다음과 같이 지방 전구 세포를 분리하였다: 혈액을 제거하기 위해 지방 조직을 같은 부피의 KRB 용액으로 3∼4 회 세척하였다. 지방 조직과 같은 부피의 콜라게나제(collagenase) 용액을 넣어 37 ℃ 수욕에서 반응시켰다. 이를 원심분리용 튜브에 옮겨 넣고 20 ℃, 1200 rpm에서 10 분 동안 원심분리하였다. 상층액인 리피드와 지방층을 제거하고, 아래층인 콜라게나제 용액을 흔들리지 않도록 조심해서 분리하였다. 기질배지(stromal media)를 넣어 현탁시킨 후, 20 ℃, 1200 rpm에서 5 분 동안 원심분리하였다. 이때, 아래에 가라앉는 지방전구세포를 남기고, 상층액을 제거하였다.

얻어진 지방 전구 세포를 기질배지에 현탁시켜 배양용기에 접종하고, 37 ℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 24 시간 동안 배양하여 바닥에 붙였다. 기질배지는 10 % 우혈청이 포함되어 있는 DMEM/F12(Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 Nutrient Broth) 배지이다.

이어서, 배양 용기 바닥에 단일층으로 가득 찰 때까지 증식배지(expansion media)로 갈아주고 배양하였다. 증식배지의 조성은 다음과 같다: DMEM/F12, 10% FBS, 5 ng/㎖ EGF, 0.25 ng/㎖ bFGF, 0.25 ng/㎖ TGF-b1.

세포가 배양 용기의 바닥에 단일층으로 가득 차게 되면, 증식배지를 제거하고 기질배지를 넣어 3 일 동안 배양하였다.

기질배지를 제거하고 분화배지(differentiation media)를 넣어 3 일 동안 배양하였다. 분화 배지의 조성은 다음과 같다: DMEM/F12, 3% FBS, 33 μM 바이오틴, 17 μM 판토테네이트, 1 μM 인슐린, 1 μM 덱사메타손, 250 μM IBMX, 100 μM 인도메타신.

분화배지를 제거한 후, 지방세포배지(adipocyte media, 분화유지배지)로 갈아주고　 지질방울이 커져 수집한 세포의 직경이 20∼40 ㎛ 가 될 때까지 배양하였다. 지방세포배지의 조성은 다음과 같다: DMEM/F12, 3% FBS, 33 μM 바이오틴, 17 μM 판토테네이트, 100 nM 인슐린, 1 μM 덱사메타손.

실시예 2: 어린 지방세포를 scaffold에 생착시킨 후 공동 배양하는 방법

(1) 분화된 어린 지방세포의 수집

실시예 1에서 생산된 어린 지방세포를 포함하고 있는 플라스크에 트립신/EDTA 용액을 첨가하고 1∼15 분 동안 인큐베이터에서 반응시킨 후 DMEM/F12를 넣어 트립신/EDTA 용액을 비활성화시켰다.

용액을 수집한 후 20 ℃, 1200 rpm 으로 5 분 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 운반배지(페놀 레드가 포함되지 않은 DMEM)를 첨가하여 세포를 현탁 시킨 후 다시 한번 위의 조건으로 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 적정량의 운반배지를 첨가한 후 세포수를 측정하였다. 최종적으로 첨가할 운반배지의 양을 계산한 후 다시 한번 원심분리를 실시하였다.

도 1은 분화된 어린 지방세포와 성숙한 지방세포를 Oil Red O로 염색하여 크기를 측정한 현미경 사진(400 배)이다. A는 분화된 어린 지방세포를 수집한 후 크기를 측정한 것으로 수집한 어린 지방세포는 여러 개의 지질방울을 포함하고 있으며 직경이 20∼40 ㎛ 이다. B는 수집한 어린 지방세포를 in vitro에서 삼차원적으로 배양한 후 Oil Red O 염색한 성숙한 지방세포의 사진으로, 여러 개의 지질방울이 하나로 합쳐지고 직경이 60∼100 ㎛ 이다.

(2) 분화된 어린 지방세포와 피브린 공동 배양

피브리노겐 용액과 트롬빈 용액은 사용하기 10 분 전에 다음과 같이 준비하였다: 아프로티닌(aprotinin) 용액을 동결건조된 피브리노겐이 들어 있는 바이알에 넣고 1∼2 분 방치한 후 가볍게 흔들어 완전히 녹였다. 트롬빈 용액은 염화칼슘 용액을 트롬빈이 들어 있는 바이알에 넣어 내용물이 완전히 녹을 때까지 흔들어 만들었다.

위 (1)에서 최종 원심분리 후 상층액을 제거하여 얻은 어린 지방세포에 트롬빈 용액을 넣어 1∼5×10⁷/㎖이 되도록 현탁시켰다. 트롬빈-세포 현탁액 100 ㎕와 피브리노겐 용액 100 ㎕를 잘 혼합하고 1∼2 분 후에 어린 지방세포가 도입된 피브린 겔이 형성되면 지방세포배지를 첨가하고 3 일에 1 번씩 배지를 교환하면서 공동 배양을 실시하였다.

도 2는 분화된 어린 지방세포를 피브린(fibrin)에 도입하여 1 달 동안 공동 배양한 후 성숙한 지방세포를 Oil Red O로 염색한 현미경 사진(400 배)이다. A는 분화된 어린 지방세포를 수집한 후의 현미경 사진으로 이 세포는 세포내 지질 방울을 여러 개 포함하고 있다. B는 수집된 어린 지방세포를 피브린에 도입한 후 1 달 동안 공동 배양한 피브린-세포이고, C와 D는 각각 피브린 겔 내에서 성숙한 지방세포와 Oil Red O로 염색한 현미경 사진으로, 인체에 존재하는 지방조직을 Oil Red O로 염색한 E, F와 크기와 형태가 유사한 것을 보여준다.

도 3은 분화된 어린 지방세포를 피브린(fibrin)에 도입하여 공동 배양을 실시하면서 배양 상등액에 분비된 렙틴 양을 측정한 도표이다. 여기에서 보면, 피브린-세포 공동 배양시 공동 배양 1 일부터 14 일까지 렙틴 분비량이 계속 증가하였고 14 일 이후부터 포화 상태를 나타내는 것을 알 수 있다.

도 2와 3에서 보는 바와 같이, 분화된 어린 지방세포는 피브린 겔 내에서의 3차원적인 배양을 통하여 완전히 성숙하여, 신체에서 자연적으로 형성된 지방조직과 세포생물학적으로 유사함을 보여준다. 피브린은 어린 지방세포에 대하여 독성을 가지고 있지 않으며 어린 지방세포가 성숙하는 동안 분해되어 지방세포의 크기가 커질 수 있는 공간을 제공하여 어린 지방세포의 이식효과를 극대화시킬 수 있다.

(3) 분화된 어린 지방세포와 알지네이트 비드의 공동 배양

알지네이트는 PBS에 녹여 2 % 용액으로 만든 후 멸균하여 실온 보관하였다. 염화칼슘과 염화나트륨 용액은 각각 102 mM, 150 mM로 만들어 멸균한 후 실온 보관하였다.

위 (1)에서 최종 원심분리후 상층액을 제거하여 얻은 어린 지방세포에 알지네이트 용액을 넣어 1∼5×10⁷/㎖이 되도록 현탁시켰다. 알지네이트-세포 현탁액을 주사기에 넣어 염화칼슘 용액에 떨어뜨리고 조심스럽게 흔들어 준 후 10 분 동안 방치하였다. 어린 지방세포를 포함하는 알지네이트 비드(직경 약 1 ㎜)가 형성되면 염화칼슘 용액을 제거하고 염화나트륨 용액으로 4 회 세척하였다. 염화나트륨 용액을 제거한 후 지방세포배지를 첨가하고 3 일에 한번씩 배지를 교환하면서 공동 배양을 실시하였다.

도 4는 분화된 어린 지방세포를 알기네이트 비드(alginate bead)에 도입하여 공동 배양한 후 지방세포를 Oil Red O로 염색한 현미경 사진(A: 40 배, B∼D: 400 배)이다. A는 세포를 포함하고 있는 알지네이트 비드이고, B는 400 배율로 찍은 현미경 사진이다. C는 2 주 동안 공동 배양을 실시한 후의 지방 세포이고, D 는 1 달 동안 공동 배양을 실시한 후 Oil Red O 로 염색한 성숙한 지방세포의 현미경 사진이다.

실시예 3: 어린 지방세포를 scaffold와 함께 이식하는 방법

피브리노겐 용액과 트롬빈 용액은 사용하기 10 분 전에 다음과 같이 준비하였다: 아프로티닌 용액을 동결건조된 피브리노겐이 들어 있는 바이알에 넣어 1∼2 분 방치하고 가볍게 흔들어 완전히 녹인 후 주사기에 충전시켰다. 트롬빈 용액은 염화칼슘 용액을 트롬빈이 들어있는 바이알에 넣어 내용물이 완전히 녹을 때까지 흔들어 만들었다.

실시예 1의 (1)에서 최종 원심분리한 후 상층액을 제거하고 세포에 트롬빈 용액을 넣어 세포가 1∼5×10⁷/㎖ 농도로 되도록 현탁시킨 후 또 다른 주사기에 충전시켰다. 피브리노겐 용액이 충전된 주사기와 트롬빈-세포 현탁액이 충전된 주사기를 분무 조절 장치 키트(dual syringe kit)의 각 부위에 연결하고 스프레이 팁 끝에 18 호 주사바늘을 끼웠다. 분무 조절 장치를 이용하여 피브리노겐 용액과 트롬빈-세포 현탁액을 혼합시키면서 동시에 누드(nude) 마우스(Crl:Nu/Nu-nuBR) 흉골 위 피하에 200 ㎕씩 이식하였다. 이식 후 1 일부터 12 달 동안 사육한 후 이식부위 조직을 생검을 통하여 분리하였다. 이식물의 분포 위치, 크기, 생착율과 생존율을 측정하고, 면역거부반응 발생 여부를 확인하기 위하여 면역염색 반응, 생화학적 검사, 분자생물학적 검사를 실시하였다. 분화된 인간의 어린 지방세포의 검출은 인간 특이항체를 이용한 면역염색 반응과 인간 특이적 DNA 유전자 마커인 alu 서열을 이용하여 PCR법으로 확인하였다.

이식부위의 조직검사 결과 이식된 어린 지방세포가 마우스의 피하에 잘 생착 하여 성숙한 지방세포로 성장해 있음을 확인하였다.

이상에서 설명한 바와 같이, 인간의 지방 조직에서 얻어진 지방전구세포로부터 분화된 지름 20∼40 ㎛의 어린 지방세포를 scaffold와 함께 자가 또는 동종이식에 이용할 경우, 이식 부위에서 지방세포의 성숙과 함께 점진적으로 부피가 증가되므로 효과적인 신체부피 대체물로 이용할 수 있으며, 연부조직결손 또는 미용상의 외형적 결함으로 인한 장애를 치료할 수 있다.

Claims (14)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. (a) 자가 또는 동종 지방 조직으로부터 미분화 지방전구세포를 분리하는 단계;

   (b) 상기 미분화 지방전구세포를 배양하여 지방세포로 분화시키는 단계; 및

   (c) 상기 분화된 세포 중 지름 20~40 ㎛의 분화된 어린 지방세포 (differentiated immature adipocytes)를 수집하는 단계를 포함하는, 자가 또는 동종 이식용 지방세포의 생산방법.
7. 삭제
8. 제6항의 방법에 의해 얻어지는 지름 20∼40 ㎛의 어린 지방세포를 포함하는 이식용 지방세포 조성물.
9. 제8항에 있어서, 생분해성 중합체(biodegradable scaffold)를 추가로 포함하는 조성물.
10. 제9항에 있어서, 상기 생분해성 중합체(biodegradable scaffold)는 피브린(fibrin), 알지네이트(alginate), PLGA(Poly(DL-lactide-co-glycolide)) 또는 PTFT (polytetrafluoroethylene)인 조성물.
11. 제6항의 방법에 의해 얻어지는 어린 지방세포와, 생분해성 중합체(biodegradable scaffold)를 in vitro에서 함께 배양하는 단계를 포함하는, 자가 또는 동종 이식용 지방세포 조성물의 생산방법.
12. 제11항에 있어서, 상기 생분해성 중합체(biodegradable scaffold)는 피브린(fibrin), 알지네이트(alginate), PLGA(Poly(DL-lactide-co-glycolide)) 또는 PTFT (polytetrafluoroethylene)인 생산방법.
13. 제11항 또는 제12항의 방법에 의해 얻어지는 지름 20∼40 ㎛의 어린 지방세포를 포함하는 이식용 지방세포 조성물.
14. 삭제

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