KR100867202B1 - 결명자 추출물 또는 이로부터 분리된 에모딘을 포함하는미백용 피부 외용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 결명자 추출물 또는 이로부터 분리된 에모딘(emodin)을 포함하는 미백용 피부 외용 조성물에 대한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명에 따른 결명자 추출물 및 이로부터 분리된 에모딘은 자외선에 의한 멜라닌 합성의 촉진과 관련된 신호전달에서 중요하게 관여하는 c-Kit 활성을 저해함으로써, 멜라닌 세포의 성숙 및 분화를 저해할 뿐만 아니라 멜라닌 색소의 합성을 저해하는 효과가 있기 때문에 피부 톤을 밝게 하는 피부 미백, 및 자외선, 호르몬, 유전에 기인한 기미와 주근깨 등의 피부 과색소 침착증 예방 및 치료를 목적으로 하는 미백용 피부 외용 조성물 뿐만 아니라 c-Kit 저해제 및 멜라닌 생성 저해제로 유용하게 사용될 수 있다.

결명자, 에모딘, c-Kit

Description

결명자 추출물 또는 이로부터 분리된 에모딘을 포함하는 미백용 피부 외용 조성물 {A composition for external application for skinwhitening containing extract of seeds of cassia tora or emodin isolated therefrom}

도 1은 본 발명에 따른 에모딘이 c-Kit 활성화에 미치는 영향을 나타낸 것이다.

본 발명은 결명자 추출물 또는 이로부터 분리된 에모딘을 포함하는 미백용 피부 외용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 c-Kit 활성을 저해하는 결명자 추출물 또는 이로부터 분리 및 정제한 에모딘을 포함하는 피부톤을 밝게 하는 피부 미백 및 자외선, 호르몬, 유전에 기인한 기미와 주근깨 등의 피부 과색소 침착증 예방 및 치료를 목적으로 하는 미백용 피부 외용 조성물 뿐만 아니라 c-Kit 저해제 및 멜라닌 생성 저해제에 관한 것이다.

희고 고운 피부를 갖고자 하는 것은 모든 사람의 한결같은 소망이다. 사람의 피부색은 피부 내부의 멜라닌(melanin) 농도와 분포에 따라 결정되는데, 유전적인 요인 외에도, 태양 자외선이나 피로, 스트레스 등의 환경적 또는 생리적 조건에 의해서도 영향을 받는다. 멜라닌은 아미노산의 일종인 티로신(tyrosine)에 티로시나제(tyrosinase)라는 효소가 작용하여 도파(DOPA), 도파퀴논(dopaquinone)으로 바뀐 후 비효소적인 산화반응을 거쳐 만들어진다. 이와 같은 멜라닌의 합성이 피부 내에서 과도하게 일어나면, 피부 톤을 어둡게 하고, 기미, 주근깨 등을 발생시키기 기도 한다. 따라서, 피부내의 멜라닌 색소의 합성을 저해시키면, 피부 톤을 밝게 하여 피부 미백을 실현할 수 있을 뿐만 아니라 자외선, 호르몬 및 유전적인 원인에 기인하여 발생하는 기미, 주근깨 등의 피부 과색소 침착증을 개선시킬 수 있다.

종래에는 하이드로퀴논(hydroquinone)이나 아스콜빈산(ascorbic acid), 코지산(kojic acid), 글루타치온(glutathione)과 같은 티로시나제에 저해 활성을 갖는 물질을 연고나 화장료에 배합하여, 피부 미백이나 기미, 주근깨 개선의 목적으로 사용하여 왔었다. 그러나 하이드로퀴논은 색소침착에 대해서 수 십년 동안 가장 효과적인 성분으로 사용되어 왔었으나, 장기간 사용에 대해서 알러지 반응 등 부작용(흰반점, 검은 반점)이 발생할 수 있다는 보고가 있어, 여러 나라에서 사용의 제약을 받는 추세이다. 또한 티로시나제 효소의 활성을 저해하여 미백 효과를 나타내는 아스콜빈산은 산화되기 쉬워 이를 배합한 화장료는 변색, 변취되는 등의 문제를 야기하며, 그 불안정성을 극복하기 위해 아스코빌 팔미테이트(Ascorbyl- palmitate), 아스코빌 디팔미테이트 (Ascorbyl-dipalmitate), 아스코빌 스테아레이트(Ascorbyl stearate), 아스코빌 마그네슘 포스페이트(Ascorbyl magnesium phosphate) 등의 유도체가 개발되어 사용되고 있으나 특수한 기술을 사용하지 않으면 피부 속으로 침투시키기 어렵다. 글루타치온, 시스테인 등의 티올계 화합물은 특유의 불쾌한 냄새와 경피 흡수에 문제가 있어 사용되기에 문제가 있다. 또한 이들의 배당체 및 유도체들은 극성이 높아 화장료의 배합 성분으로 사용되기에는 문제가 있다.

미백용 피부 외용 조성물에 관한 특허에는 엠블리카 추출물 및 상지 추출물을 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물 특허(대한민국 등록특허 제449345호), 신규한 크로만 유도체 및 이의 제조방법 및 이를 함유하는 피부 외용제 조성물(대한민국 등록특허 제456974호), 프로토카테큐익 알데히드를 유효성분으로 하는 피부미백용 조성물(대한민국 등록특허 제336180호)등이 있다. 그러나 아직까지 결명자 추출물 또는 이로부터 분리된 에모딘을 포함하는 미백용 피부 외용 조성물에 대해서는 공지되어 있지 않다.

한편, c-Kit는 RTK(receptor tyrosine kinase)의 class Ⅲ에 속하는 수용체로서 멜라닌 세포의 생존, 증식 및 분화에 관여하는 것으로 알려져 있다. c-Kit은 지금까지 미백제의 표적으로 보다는 항암제 개발의 표적으로 더 많이 연구되어져 왔다. 이마티니브(Imatinib; Gleevec, STI-571, Novatis, East Hanover, NJ, USA) 는 Bcr-Ab1 카이네이즈(kinase)를 표적으로 하는 백혈병 등의 항암제로 널리 알려져 있다. 그런데 이마티니브를 처방받은 6명의 환자들에게서 피부의 색소감소 현상이 나타났고 이것은 이마티니브가 Bcr-Ab1 이외에도 c-Kit의 활성을 저해하여 나타난 결과이며, 또한 줄기세포인자(stem cell factor) 및 c-Kit이 사람의 멜라닌 세포의 성장과 유지에 필수적 역할을 하고 있음을 알 수 있다[Cancer 98, 2483-7, 2003].

자외선을 받으면 케라티노사이트(keratinocyte)에서 분비되는 줄기세포인자는 c-Kit이 존재하고 있는 전구체 멜라닌 세포의 성숙한 멜라닌 세포로의 분화를 촉진하고, 이러한 자극에 의해 c-Kit이 활성화되면 MAPK (mitogen acitivated protein kinase)를 활성화시키고, 다시 헬릭스-루프-헬릭스(helix-loop-helix), 루신 지퍼(leucine zipper) 단백질인 MITF(microphthalmia-associated transcription factor)를 인산화시켜 활성 상태로 만든다. 활성화된 MITF는 티로시나아제, Tyrp-2 등의 멜라닌 생성 효소의 전사를 활성화시켜 멜라닌 색소를 생성하게 한다. 따라서 자외선에 의한 멜라닌 합성을 촉진하도록 하는 신호전달 과정에서 중요하게 관여하는 c-Kit에 대한 저해제는 멜라닌 세포의 분화, 성숙의 저해 뿐만 아니라 멜라닌 합성에 관여하는 효소의 합성도 저해하는 다기능 미백제로 가능하며 멜라닌 합성의 신호전달 초기에 작용함으로써 소량으로도 효과적이고 우수한 멜라닌 합성 저해능을 보인다.

이에 본 발명자는 멜라닌 합성을 좀더 효율적으로 저해하기 위하여 멜라닌 세포의 분화 및 성숙을 저해하며, 동시에 멜라닌 합성과 관련된 효소의 합성에도 관여된 c-Kit을 목표으로 하여 c-Kit 활성 저해제를 천연에 자생하는 동식물을 대상으로 검색한 결과, 그 중 결명자 추출물 또는 이로부터 분리된 에모딘이 매우 강력한 c-Kit 활성 저해능을 나타내어 멜라닌 생성 저해 효과 및 미백효과가 뛰어나 피부 미백 및 색소 침착증 예방 및 치료를 목적으로 하는 미백용 피부 외용 조성물로 유용하게 사용할 수 있음을 밝혀내어 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 결명자 추출물 또는 이로부터 분리된 에모딘을 포함하는 미백용 피부 외용 조성물을 제공하고자 한다.

또한 본 발명은 상기 결명자 추출물 또는 이로부터 분리된 에모딘을 포함하는 c-Kit 저해제를 제공하고자 한다.

또한 본 발명은 상기 결명자 추출물 또는 이로부터 분리된 에모딘을 포함하는 멜라닌 생성 저해제를 제공하고자 한다.

본 발명은 결명자 추출물 또는 이로부터 분리된 하기 화학식 1로 표시되는 에모딘을 포함하는 미백용 피부 외용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 결명자 추출물 또는 이로부터 분리된 하기 화학식 1로 표시 되는 에모딘을 포함하는 c-Kit 저해제를 제공한다.

또한 본 발명은 결명자 추출물 또는 이로부터 분리된 하기 화학식 1로 표시되는 에모딘을 포함하는 멜라닌 생성 저해제를 제공한다.

결명자는 콩과에 속하는 1년생 초본인 초결명(학명:Cassia tora.L.)의 성숙한 종자로서 눈을 맑게 한다는 의미에서 결명자라 알려져 있다. 약리성분으로는 비타민A의 전구체인 카로틴(carotene) 알로에향과 쓴맛을 내는 알로인(Alloin), 레인(Rhein), 에모딘, 크리소판올(Chrysophanol), 알로에-에모딘(Aloe-emodin), 피션(Physcion), 오브튜신(Obtusin), 아우란티오-오브튜신(Aurantio-obtusin), 루브로퓨산리(Rubrofusrin), 토라크리손(Torachryson), 코라락톤(Tora lactone) 등이 있다. 이들 성분들 중 카로틴 등은 시신경자극과 전달에 필수성분으로 시력유지에 유효할 뿐 아니라, 적안(충혈), 청맹(시신경위축), 작목(야맹증) 등에도 유효하고, 알로인은 혈중의 콜레스테롤 함량을 낮추어 줌은 물론 혈압강하에도 유효하다.

본 발명에 사용되는 결명자 추출물은 당업계에 알려진 열수, 함침 또는 증류법 등의 추출 방법 또는 하기와 같은 본 발명의 방법에 따라 추출될 수 있으며, 시판 중인 것을 제한없이 사용할 수 있다. 바람직하게, 본 발명에 따라 생약재로 시판되는 결명자를 구입하여 잘게 분쇄한 후, 추출용매로서 물, C₁ - C₄ 알코올, 이들의 혼합용매 또는 클로로포름, 바람직하게는 메탄올을 이용하여 추출할 수 있다. 이때 추출용매는 상기 결명자 분쇄물 건조 중량에 대해 5 - 20 부피배 사용할 수 있으며, 추출 온도는 5 - 100 ℃, 바람직하게는 70 ℃에서 1 - 5 시간, 바람직하게는 3시간 동안 가열하여 추출할 수 있다. 이때 환류 냉각기 등이 장착된 추출기를 사용할 수 있다.

상기의 추출과정은 1회 내지 수회 진행될 수 있으며, 얻어진 추출물은 여과포 등을 이용하는 통상의 여과 단계뿐 아니라 건조, 농축 등의 단계를 추가적으로 거칠 수 있다.

또한, 본 발명에 사용되는 에모딘은 당업계에 알려진 합성 방법 또는 본 발명의 방법에 의해 제조될 수 있으며, 시판 중인 것을 제한 없이 사용할 수 있다. 바람직하게, 하기 본 발명의 방법에 따라 결명자로부터 제조될 수 있다:

(1) 결명자를 메탄올로 추출하여 추출물을 얻는 단계;

(2) 상기 추출물을 헥산 및 클로로포름으로 순차적으로 분획하여 클로로포름 분획을 얻는 단계; 및

(3) 상기 클로로포름 분획물을 컬럼 크로마토그래피하여 에모딘을 분리하는 단계를 포함하는 방법으로 얻은 것임을 특징으로 하는 미백용 피부 외용 조성물.

우선, 단계 (1)에서는 결명자를 메탄올로 추출하여 추출물을 얻는다.

상기 결명자는 시판되는 것을 구입하여 사용할 수 있으며, 이를 잘게 분쇄한 후 분쇄물 건조 중량에 대해 5 - 20 부피배의 메탄올로 5 - 100 ℃ 바람직하게는 70 ℃에서 1 - 5 시간, 바람직하게는 3시간 가열 추출하여 추출물을 얻을 수 있다.

다음으로, 단계 (2)에서는 상기 단계 (1)에서 얻은 추출물을 분획하여 클로로포름 분획물을 얻는다.

상기 추출물은 물에 현탁시켜 사용할 수 있으며, 분획시 용매로서 헥산 및 클로로포름을 순차적으로 이용할 수 있으며, 분별 깔데기 등을 사용할 수 있다. 상기 분획은 수차례, 바람직하게 2 - 3 차례 수행될 수 있다.

다음으로, 단계 (3)에서는 단계 (2)에서 얻은 결명자 추출물의 클로로포름 분획물을 컬럼 크로마토그래피하여 에모딘을 분리한다.

상기 컬럼 크로마토그래피시 용리액으로 클로로포름 및 메탄올의 혼합용매, 바람직하게는 클로로포름 : 메탄올이 20 : 1 ~ 5 : 1 부피비로 혼합된 용매를 사용하여 순차 용리되도록 할 수 있다. 혼합물은 NMR, 질량분석 등의 분석 통하여 에 모딘임을 확인할 수 있다.

상기와 같은 방법으로 제조한 결명자 추출물, 이의 분획물 및 에모딘은 실험관 내(in vitro) 실험 상에서, 자외선에 의한 멜라닌 합성의 촉진과 관련된 신호전달에서 중요하게 관여하는 c-Kit의 활성을 저해하는 것으로 나타났다. 또한 이들을 포함하는 크림 제형을 자외선에 의해 색소침착된 피부에 적용했을 때 20명 가운데 14명에서 색소침착 저해 효과를 나타내어, 상기 결명자 추출물, 이의 분획물 및 에모딘이 c-Kit 활성을 저해함으로써 색소 침착을 저해함을 확인할 수 있다.

따라서, 상기 결명자 추출물 또는 이로부터 분리된 에모딘은 피부 톤을 밝게 하는 피부 미백, 및 자외선, 호르몬, 유전으로 하는 미백용 피부 외용 조성물에 유용하게 사용될 수 있으며, c-Kit 저해제 또는 멜라닌 생성 저해제로도 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물에서 상기 결명자 추출물 또는 에모딘은 조성물 총 중량에 대하여 0.01 - 10 중량부로 함유되는 것이 바람직하지만, c-Kit 활성 저해 효과가 있고 독성이 나타나지 않는 범위에서 사용 용도에 따라서 상기 범위 이상 또는 이하로도 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 상기 화학식 1의 에모딘에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

본 발명의 결명자 추출물 또는 화학식 1의 에모딘을 유효성분으로 하는 피부 미백용 피부 외용 조성물은 화장료, 비누, 피부 외용연고의 형태로 제형화될 수 있다. 화장료 조성물로 제조되는 화장품은 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조할 수 있다. 유화 제형의 화장품으로는 영양화장수, 크림, 에센스 등이 있으며, 가용화 제형의 화장품으로는 유연화장수가 있다. 또한, 본 발명의 화학식 1의 에모딘을 함유하는 화장품 이외에도 피부 과학적으로 허용 가능한 매질 또는 기제를 함유함으로써 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 국소적용 또는 전신 적용할 수 있는 보조제 형태로 제조될 수 있다.

적합한 화장품의 제형으로는 예를 들면, 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱(conceal stick)의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 화학식 1의 에모딘에 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온 봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 그리고, 상기의 성분들은 피부과학 분야에 서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 구체적인 제형으로서는 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더, 아이섀도 등의 제형을 포함한다.

이하 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 상세하게 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것으로, 본 발명의 내용이 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 결명자의 메탄올 추출물 제조

생약재로 시판되는 결명자를 구입하여 잘게 분쇄한 후, 분쇄물 10 kg에 대하여 100 L 메탄올로 환류 냉각기가 달린 추출기에서 70 ℃로 3시간 가열하여 추출하였다. 추출물은 여과포로 여과한 후 잔사를 같은 방법으로 1회 이상씩 더 추출하였다. 추출물을 합하여 감압 농축하여 건조 추출물 2.1 kg을 얻었다.

<실시예 2> 결명자 메탄올 추출물의 클로로포름 분획물 제조

상기 실시예 1에서 제조된 결명자 메탄올 추출물 1 kg을 10 L의 물에 현탁시킨 후 헥산 10 L씩을 가해 2회 용매 분획하여 헥산 가용분획을 제거하고, 다시 클 로로포름 10 L씩을 가해 3회 용매 분획하여 클로로포름 분획을 얻고, 이를 감압 농축하여 건조물 35 g을 얻었다.

<실시예 3> 에모딘의 분리 및 확인

상기 실시예 2에서 제조된 결명자 추출물의 클로로포름 가용분획 30 g을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피하였다. 이때 용리액으로 클로로포름과 메탄올의 혼합용매로서 클로로포름 : 메탄올이 20 : 1 ~ 5 : 1 부피비로 혼합된 용매를 사용하여 순차 용리시켜 유효분획을 얻었고, 이 분획으로 분취용 HPLC를 수행하여 유효성분 60 mg을 얻었다. 분리한 유효성분은 핵자기 공명스펙트럼(NMR)과 질량분석기를 통하여 하기 화학식 1의 에모딘임을 확인하였다. 또한 분리한 물질이 동일 물질인지 확인하기 위해 판매되고 있는 에모딘(Sigma, Cas No. 518-82-1)을 표준품으로 하여 박층 크로마토그래피(TLC)와 HPLC를 수행하여 동일 물질임을 확인하였다.

<화학식 1>

- 분자식 : C₁₅H₁₀O₅

- 분자량 : 270.2439

- 융점 : 259 - 260 ℃

- V(

max, nm)(EtOH) 222, 253, 266, 289, 436

- ¹H-NMR(300 MHz, CDC1₃) σ22.42(s,3H), 7.29(d,1H,J1.0 Hz),

7.33(d,1H,J=0.0 Hz), 7.56(d,1H,J=7.5 Hz), 7.79(d,1H,J=7.6 Hz)

- 질량분석 : M⁺=270, m/z=255, 253, 242

<실시예 4> 크림의 제조

상기 실시예 3에서 얻은 에모딘을 함유하는 크림을 하기 표 1의 처방에 따라 제조하였다.

에모딘을 함유하는 크림 처방

성분	중량%
에모딘	0.5
스테아린산	15.0
세탄올	1.0
수산화칼륨	0.7
글리세린	5.0
로필렌그리콜	3.0
방부제	적량
향	적량
정제수	적량
총	100

<실시예 5> 화장수의 제조

상기 실시예 3에서 얻은 에모딘을 함유하는 화장수를 하기 표 2 또는 표 3의 처방에 따라 제조하였다.

에모딘을 함유하는 유연 화장수 제조

성분	중량%
에모딘	0.2
에탄올	10.0
폴리라우린산폴리옥시에틸렌소르비탄	1.0
파라옥시안식향산메틸	0.2
글리세린	5.0
1,3-부틸글리콜	6.0
향	적량
색소	적량
정제수	적량
총	100

에모딘을 함유하는 영양화장수 제조

성분	중량%
에모딘	0.1
와셀린	2.0
세스퀴올레인산소르비탄	0.8
폴리옥시에틸렌올레일에틸	1.2
파라옥시안식향산메틸	적량
프로필렌글리콜	5.0
에탄올	3.2
카르복시비닐폴리머	18.0
수산화칼륨	0.1
색소	적량
향	적량
정제수	적량
총	100

<실시예 6> 에센스의 제조

상기 실시예 3에서 얻은 에모딘을 함유하는 에센스를 하기 표 4의 처방에 따라 제조하였다.

에모딘을 함유하는 에센스 제조

성분	중량%
에모딘	5
프로필렌글리콜	10.0
글리세린	10.0
히알루론산나트륨수용액(1%)	5.0
에탄올	5.0
폴리옥시에틸렌경화피마자유	1.0
파라옥시안식향산메틸	0.1
향	적량
정제수	적량
총	100

<실시예 7> 팩의 제조

상기 실시예 3에서 얻은 에모딘을 함유하는 팩를 하기 표 5의 처방에 따라 제조하였다.

에모딘을 함유하는 팩 제조

성분	중량%
에모딘	0.5
글리세린	5.0
프로필렌글리콜	4.0
폴리비닐알코올	15.0
에탄올	8.0
폴리옥시에틸렌올레일에틸	1.0
파라옥시안식향산메틸	0.2
향	적량
색소	적량
정제수	적량
총	100

<실시예 8> 연고의 제조

상기 실시예 3에서 얻은 에모딘을 함유하는 연고를 하기 표 6의 처방에 따라 제조하였다.

에모딘을 함유하는 연고 제조

성분	중량%
에모딘	5.0
백색바세린	25.0
스테아릴알콜	20.0
프로필렌글리콜	12.0
프로필렌미스스틴산	0.1
소디움 글리세린 모노라우렐	0.2
폴리옥시에틸렌경화피마자유	4.0
베타인 함유 양이온성 유화제	0.2
모노스테아린산글리세린에스텔	0.1
파라옥시안식향산프로필	0.1
정제수	적량
총	100

<비교예 1>

상기 실시예 4에서 에모딘을 제외한 동일한 조성으로 비교예 1의 크림을 제조하였다.

<실험예 1> c-Kit 활성 저해 측정

상기 실시예 1 - 3에 따라 얻어진 각 시료가 c-Kit 활성 저해 효과가 있는지 알아보기 위하여, RTK(receptor tyrosine kinase) 효능 검색을 다음과 같이 실시하였다.

실시예 1(메탄올 추출물), 실시예 2(클로로포름 가용분획)는 100 ㎍/ml이 되도록 DMSO에 녹여 사용하였고, 실시예 3은 DMSO에 녹여 14.8 uM의 최종농도가 되도록 하였다. RTK인 c-Kit 5 ng, ATP 100 uM(최종농도), 및 상기 실시예 1, 실시예 2 또는 실시예 3을 384 웰 플레이트의 각 웰에 첨가하여 상온에서 15분간 1차 반응시킨 후 기질로서 5 nM(최종농도)의 비오티닐화된 폴리[글루타민:티로신 = 4:1](biotinylated-poly[Glu:Tyr = 4:1])을 첨가하여 2차 효소 반응을 진행시켰다.

펩타이드 기질의 인산화 정도를 탐지하기 위해 스트렙타비딘(Streptavidin)이 피복된 증여체 비드(donor bead)와 항체(P-Tyr-100)가 결합된 수용체 비드(receptor bead)를 포함한 캡쳐 완충액(capture buffer)을 첨가하여 3차 반응을 시키고, 퓨전 마이크로플레이트(Fusion™ microplate) 분석장치를 이용하여 알파스크린 신호를 측정하였다. 또한 기존에 c-Kit 저해제로 알려진 티르포스틴 A51(tyrphostin A51)을 이용하여 저해효과를 비교하였다. 각각의 시료에 대하여 c-Kit 활성 저해 실험을 3회 반복 실시하여 알파스크린 신호를 정확하게 측정하였으며, c-Kit 저해율을 구하기 위해서 양성 대조군에는 시료 대신 DMSO를 가하였고, 음성 대조군에는 시료 대신 DMSO, 효소 대신 완충액을 가하였다. 감지된 신호로부터 c-Kit 활성 저해율은 하기 수학식 1에 의하여 계산하였고, 결과는 표 7에 정리하였다.

c-Kit 활성 저해 효과

시료	농도	저해율(%)
메탄올 추출물(실시예 1)	100 ㎍/ml	43.3
클로로포름 가용분획(실시예 2)		62.1
에모딘(실시예 3)	14.8 uM	93.3
티르포스틴 A51	14.8 uM	100.0

표 7의 결과에서 볼 수 있듯이, 실시예 1의 메탄올 추출물 및 실시예 2의 클로로포름 분획물의 c-Kit 활성 저해 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 또한, 실시예 3의 에모딘은 기존에 c-Kit 활성 저해제로 알려진 티르포스틴 A51과 비교할 때 동등 수준의 c-Kit 활성의 저해능이 있음을 알 수 있었다.

따라서, 결명자 추출물 및 에모딘은 c-Kit 활성을 저해하므로 c-Kit 활성화를 인한 색소 침착을 예방 및 치료하는 목적으로 사용할 수 있음이 확인되었다.

<실험예 2> c-Kit의 전기영동 및 웨스턴 블롯팅 분석

상기 실시예 1 - 3에 따라 얻어진 각 시료가 c-Kit 활성 저해 효과가 있는지 알아보기 위하여, 전기영동 및 웨스턴 블롯팅 분석을 실시하였다.

M-07 사람의 골수아구성 백형병(megakaryoblastic leukemia) 세포주인 MO7e를 6-cm 배양접시로 계대하여 전체 면적의 약 70% (2.5× 10⁶ 세포/웰)가 되면, 혈청이 없는 배지로 바꾸어 12 - 18시간 배양하였다. 줄기세포인자를 50 ng/ml로 5분 동안 처리한 후 표준물질로서 PDGFR(platelet drived growth factor receptor) 길항제 Ⅲ 5 uM 또는 에모딘 각각 30, 10, 3 또는 1 uM을 50분간 처리하였다. 이때 대조군으로서 어떤 시료도 처치하지 않은 군을 이용하였다. 세포를 찬 인산완충식염수(phosphate buffer saline)로 두 번 씻어주고 SDS 샘플완충액을 100 ㎕ 가하여 세포 용해제를 준비하였다. 준비된 세포 용해제(lysate) 20 ㎕를 8% SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel)에서 전기영동을 하고 4 ℃에서 이몰리온(Immolilon, 상품명) P-PVDF membrane (polyvinyidenfluoride, 밀리포아, 미국)으로 하루 동안 옮겼다. 1차 항체로서 항인산-c-Kit-Tyr719 마우스 단클론 IgG를 4 ℃에서 하루 동안 붙이고, 10분씩 3번 세척 완충액을 이용해서 씻어주고 2차 항체로서 HRP(horseradish peroxidase, 양고추냉이 과산화효소)가 연결된 항-마우스 IgG를 상온에서 1시간 동안 처리한 후, ECL(enhanced chemiluminoscence) 용액을 이용해서 형광을 발현시키고 LAS3000 기기로 밴드를 측정하였다.

결과는 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타난 바와 같이, 대조군과 비교하여 에모딘은 10 uM 처리한 군에서 밴드의 강도가 대조군에 비해 90% 이상 약하게 나타났으며, 3 uM 처리한 군에서도 밴드의 강도가 약해지는 경향이 확인되었다. 따라서, 에모딘은 농도의존적으로, c-Kit 활성을 저해함을 확인할 수 있었다.

<실험예 3> 색소 침착 저해 효과 측정

상기 실시예 1 - 3에 따라 얻어진 각 시료에 대해서 색소 침착 저해 효과가 있는지 알아보기 위하여, 하기와 같이 패널 테스트를 하였다.

건강한 남녀 20명을 선정하여 70% 에탄올 수용액으로 조사 부위 세척하고, 양팔의 하박부에 직경 15 mm 크기의 구멍이 2개씩 2줄로 파인 알루미늄 호일을 붙이고, 팔에서 10 cm 떨어진 거리에서 오리엘 쏠라 시뮬레이터(ORIEL solar simulator) 1000 W를 사용하여 60 mJ/cm² 의 광량을 조사하였다. 조사하기 3일 전부터 조사 후 3주째까지 1일 2회씩 실시예 4와 비교예 1에서 제조된 에모딘을 포함하는 크림을 한 쌍으로 같은 줄에 도포하여 관능검사를 실시하였다.

각각에 대하여 실시예와 비교예의 색소침착도를 육안으로 판정하고, 실시예가 비교예에 비해 색소침착을 저해한 정도를 효과 있음, 차이 없음의 2단계로 평가하였으며, 그 결과는 표 8에 나타내었다.

에모딘을 함유한 크림의 색소침착 저해 효과

실험물질	효과 있음(명)	차이 없음(명)
실시예 4의 크림	14	6

표 8의 결과에서 볼 수 있듯이, 실시예 4에 따라 제조된 에모딘을 함유하는 크림은 피시험자 20명 중에서 14명에 대해서 색소침착 저해 효과를 나타내었으며, 피부내에서 어떠한 부작용도 나타나지 않아, 에모딘이 안전하고 효과가 매우 뛰어나, 자외선에 의한 피부 흑화를 저해하는 피부 미백용 피부 외용 조성물에 유용하게 사용될 수 있다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 결명자 추출물 및 이로부터 분리한 에모딘은 자외선에 의한 멜라닌 합성을 촉진하도록 하는 신호전달에 중요하게 관여하는 c-Kit 활성 저해 효과에서 기존의 c-Kit 활성 저해제로 알려진 티르포스틴 A51과 비교할 때 그 효과가 유사하게 나타나며, 상기 에모딘을 포함하는 크림제형은 사람을 대상으로 실시한 관능검사에서 20명 중에 14명에게서 미백 효과를 보이므로, 상기 결명자 추출물 및 에모딘은 피부 톤을 밝게 하는 피부 미백 및 자외선, 호르몬, 유전에 기인한 기미와 주근깨 등의 피부 과색소 침착증 예방 및 치료를 목적으로 하는 피부 외용 조성물 뿐만 아니라 c-Kit 저해제 및 멜라닌 생성 저해제로 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (14)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 하기 화학식 1로 표시되는 에모딘을 포함하며, RTK(Receptor Tyrosine Kinase)의 Class III 에 속하는 수용체인 c-Kit의 활성을 저해하여, 멜라닌 세포의 분화·성숙을 저해함과 동시에 멜라닌 합성에 관여하는 효소의 합성을 저해하여 피부 미백효과 또는 색소침착증 예방 또는 치료효과를 갖는 미백용 피부 외용 조성물

   <화학식 1>

   

   .
7. 제6항에 있어서, 상기 에모딘은 결명자 추출물로부터 얻은 것임을 특징으로 하는 에모딘을 포함하는 미백용 피부 외용 조성물.
8. 제7항에 있어서, 상기 에모딘은

   (1) 결명자를 메탄올로 추출하여 추출물을 얻는 단계;

   (2) 상기 추출물을 헥산 및 클로로포름으로 순차적으로 분획하여 클로로포름 분획을 얻는 단계; 및

   (3) 상기 클로로포름 분획물을 컬럼 크로마토그래피하여 에모딘을 분리하는 단계를 포함하는 방법으로 얻은 것임을 특징으로 하는 에모딘을 포함하는 미백용 피부 외용 조성물.
9. 제8항에 있어서, 상기 단계 (3)에서 컬럼 크로마토그래피를 실시할 때 용리액으로서 클로로포름 및 메탄올의 혼합용매를 클로로포름: 메탄올이 20:1 ~ 5:1 부피비로 혼합되게 하여 사용하는 것을 특징으로 하는 에모딘을 포함하는 미백용 피부 외용 조성물.
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