KR102283289B1

KR102283289B1 - 물푸레나무 유래 신규 쿠마린계 화합물의 제조방법 및 주름 개선용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102283289B1
Application number: KR1020190087710A
Authority: KR
Inventors: 이범주; 이슬해; 홍광원
Original assignee: 주식회사 케미랜드
Priority date: 2019-07-19
Filing date: 2019-07-19
Publication date: 2021-07-29
Anticipated expiration: 2039-07-19
Also published as: KR20210010160A

Abstract

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 신규한 쿠마린계 화합물 후라노사이드 A(Franoside A)의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 쿠마린계 화합물은 인간 호중구 엘라스타아제 활성을 효과적으로 저해할 뿐만 아니라 일산화 질소의 생성을 유효하게 저해함으로 우수한 피부 주름 개선 효과를 나타내므로 이를 유효성분으로 함유하는 조성물은 주름 개선을 위한 화장료 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
[화학식 1]

Description

물푸레나무 유래 신규 쿠마린계 화합물의 제조방법 및 주름 개선용 화장료 조성물{A new coumarin compound isolated from Fraxinus rhynchophylla, preparation method thereof and anti-wrinkle composition containing the same as an active ingredient}

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발명에 속하는 기술 및 그 분야의 종래기술

본 발명은 물푸레나무 추출물로부터 얻어진 신규 쿠마린계 화합물 및 본 화합물의 인간 호중구 엘라스타아제 발현 저해활성에 관한 것으로, 상세하게는 물푸레나무 껍질을 에탄올로 추출한 후 재차 Diaion HP-20 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 그 분획으로부터 얻어진 신규한 쿠마린계 화합물의 화학구조, 물리화학적 특성 및 엘라스타아제 저해활성에 관한 것으로 본 화합물은 본 발명자들에 의하여 최초로 분리되어 화학구조와 생물활성이 규명된 화합물로 최종적으로 피부 주름개선용 화장료 조성물로 제공될 수 있다.

피부는 신체의 가장 바깥부분을 차지하는 인체에서 제일 큰 감각기관이다. 성인의 피부 무게는 약 5 kg으로 전체 체중의 약 16%를 차지하며 표면적은 약 2m²라고 알려져 있다. 또한 피부는 촉감, 압력 및 온도에 대한 감각을 느낄 수 있는 신경이 존재하기 때문에 화학적, 물리적, 기계적 손상 등 외부의 자연환경으로부터 인체를 보호하는 기능을 한다. 뿐만 아니라 피부는 특히 인체 내부의 불필요한 수분 손실의 방지와 유용성분들의 외부로의 유출 방지, 체온 조절, 세균의 침입을 막는 등 다양한 생리적 기능을 담당하고 있다. 그러나 일반적으로 나이가 들면 이러한 피부의 기능이 점차 약화되면서 피부의 노화가 촉진되고 피부의 장벽기능이 저하되어 피부 수분 함량의 감소, 피부가 건조해 지면서 세포노화가 촉진되어 주름이 생기며 색소침착에 따른 다양한 피부 병변이 발생하게 된다. 피부는 주로 콜라겐 섬유(교원질, collagen fiber), 엘라스틴 섬유(elastic fiber), 섬유성 및 특별한 형체가 없는 기질(dermal matrix)로 구성되며, 이들은 모두 섬유아세포(fibroblast)에 의해 만들어 지며 피부의 탄력을 유지하는데 중요한 역할을 담당하고 있다.

콜라겐은 피부의 유연성을 주는 섬유조직으로 진피 조직의 75%를 차지하고 있으며 피부에 장벽(tensile strength)을 제공한다. 콜라겐 섬유의 폴리펩타이드 사슬은 섬유아세포의 과립형질세망 내에서 양끝에 확장펩타이드(telepeptide)를 가지고 있는 상태로 합성된 뒤, 3중 나선 구조로 조합된 프로콜라겐 형태로 세포 외로 분비된다. 이렇게 분비된 프로콜라겐은 특정 효소에 의해서 확장펩타이드가 절단되어 트로포콜라겐이 생성되고 이들은 세포외 기질에서 서로 조합되어 콜라겐 섬유가 합성된다. 이러한 콜라겐 섬유의 합성은 피부 노화가 진행되면서 급격히 감소하며, 또한 외부환경에 의해 콜라겐 섬유가 변형되면서 피부에 주름이 많이 생성되고 깊어지게 된다. 이러한 콜라겐의 분해에는 콜라겐 분해 효소인 콜라게나아제(collagenase)가 관여한다.

한편, 진피 건조중량의 약 4%를 차지하고 있는 엘라스틴은 콜라겐 섬유보다 가늘고 짧은 단백질로 그물 모양의 형태를 가지며 각각의 분자들의 교차결합을 이루고 있다. 주된 기능은 가해진 힘에 의해 변형된 피부가 원래의 모습으로 돌아오도록 피부의 탄력성을 주관하는 세포로 피부의 이완과 주름에 깊은 관여를 하고 있다. 엘라스틴은 엘라스타아제(Human Neutrophil Elastase, EC 3.4.21.37)라는 세린계 분해 효소에 의하여 분해되며, 18~19세까지는 섬유아세포에 의하여 계속 생성되지만 그 이후부터는 생성이 중단되고 이미 생성된 엘라스틴만으로 피부 탄력을 담당해야 하므로 엘라스틴이 한번 약화되면 그 탄력성을 회복하기가 매우 어렵다. 즉, 엘라스틴 섬유의 결핍과 응집, 엘라스타아제의 활성도의 현격한 증가는 피부 주름 생성의 주요 요인이므로, 엘라스틴을 분해할 수 있는 유일한 효소로서 이에 대한 발현 저해는 피부 주름 개선을 근본적으로 줄여 줄 수 있다.

특히 인체의 호중구 엘라스타아제(Human neutrophil elastase, HNE)는 주로 다형핵 백혈구의 호아주르 과립에 위치하는 세린 프로테아제로서, 수용성의 탄력 섬유 단백질인 엘라스틴(elastin) 및 피브로넥틴(fibronectin), 콜라겐(collagen), 연골조직(cartilage issue)과 같은 결합조직 단백질을 분해하는 기질 특이성을 가진다. 생물학적으로 엘라스타아제 활성은 나이가 들수록 두드러지게 증가하여 피부 탄력을 감소시키는 것으로 알려져 있다. 따라서, 상기 엘라스타아제 활성을 저해함으로써 피부 주름을 개선할 수 있을 것으로 기대된다(Steinbrecher T. 등, Bioorg. Med. Chem 2008, 16:2385-2390).

물푸레나무가 생산하는 화장품 조성물 및 건강기능식품 관련 기능성물질로는 다음과 같은 특허들이 알려져 있다.

물푸레나무 추출발효물의 피부미백 조성물 (대한민국 특허등록 10-1820732)

MMP-1 및 콜라겐 생성 억제를 통한 피부주름개선 효능 (대한민국 특허공개 10-2019-0050415)

항산화 및 피부염증 개선화장료 조성물 (대한민국 특허등록 10-1829892)

물푸레나무 추출물을 함유하는 건강기능식품 (대한민국 특허등록 10-1944016)

우울증 및 불안장애 예방 개선효능 (대한민국 특허공개 10-2019-0042350)

생물반응기를 이용한 대량증식방법 (대한민국 특허등록 10-1179610)

그러나 상기의 예시로 제시된 물푸레나무 관련 특허와 그 밖의 문헌들은 모두 물푸레나무 추출물로부터 얻어진 조성물로, 활성을 나타내는 화학적 물리적 실체를 규명한 연구는 전무하다.

본 특허는 상기의 특허들과는 달리, 물푸레나무 추물로부터 효능 물질의 분리정제 및 화학구조가 완전히 규명된 신규하면서도 진보된 특허이며, 특히 본 특허에서 제시하고 있는 쿠마린계 화합물은 본인들에 의해서 최초로 분리된 물질로 제조방법, 화학구조, 물리화학적 특성 및 엘라스타아제 저해활성을 통한 피부주름개선 효능과 일산화질소 저해활성 등을 규명한 신규하면서도 더욱 진보된 특허이다.

한편, 물푸레나무(Fraxinus rhynchophylla)는 물푸레나무과 물푸레나무 속에 속하는 낙엽교목으로 높이 30 m, 지름 50 cm에 달하는 큰 나무로 우리나라 전국적으로 분포하고 있다. 잎은 마주나고 기수 1회 우상 복엽이다. 소엽은 5~7개로 난형, 넓은 난형, 넓은 피침형 또는 피침형이다. 길이 6~15cm로서 표면은 녹색이며 털이 없고 뒷면은 회록색으로서 가장자리는 파상의 톱니가 있거나 밋밋하다. 꽃은 암수 다른 그루지만 양성화가 섞이는 경우도 있으며, 5월에 피고 어린 가지의 잎겨드랑이에 원추꽃차례를 이루며 달린다. 수꽃은 수술과 꽃받침 조각이 각각 2개이고, 암꽃은 꽃받침 조각, 수술, 암술이 각각 2~4개이고 꽃잎은 거꾸로 세운 바소 모양이다. 열매는 시과(翅果)로서 길이가 2~4 cm이며 9월에 익는다. 열매의 날개는 바소 모양 또는 긴 바소 모양이다. 가지를 물에 담그면 물이 푸르게 변하기 때문에 물푸레나무 라고 부른다.

한방에서는 수피가 해열, 진통, 청간, 소염의 효능이 있다 하여 류머티스 질환, 통풍, 요산증, 기관지염, 장염, 이질 등의 치료제로 쓰인다. 또, 껍질을 재료로 해서 얻는 즙액에 아교를 넣어 먹을 만드는 접착제로 쓰기도 하였다(조무연저, 원색한국수목도감, 아카데미서적, p. 416, 1992).

물푸레나무에서 분리한 종래 연구들은 리그난(lignan), 간단한 구조의 페놀 화합물(phenolic compounds), 플라보노이드(flavonoid), 세코이리도이드 글루코사이드(secoiridoid glucosides). 쿠마린(coumarins)과 같은 화합물의 존재가 보고되었다 (Si C.L. et al., Chem. Nat. Comp., 2009, 45:814-816, Kostova I. et. al., Fitoterapia, 2007, 78:85-106, Kwon Y. S. et. al., Kor. J. Pharmacogn. 1996, 27:347-349, Ahn J. H. et. al., Nat. Prod. Sci., 2013, 19:236-241)

물푸레나무 추출물의 생물학적 효능도 항산화활성, 항균활성, 항염증활성 등 다양한 활성들이 알려져 있다 (Kostova I. et. al., J. Ethnopharmacol. 1993, 39:205-208, Stefanova Z. et. al., J. Ethnopharmacol. 1995, 46:101-106, Ivanovska N. et. al., Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol, 1994, 16:557-562, Marinova E. M. et. al., Food Chem. 1994, 51:125-132)

그러나, 종래 물푸레나무로부터 분리한 화합물 중 인간의 호중구 엘라스타아제 발현저해 효능과 관련된 효과는 전혀 알려진 바가 없다. 뿐만 아니라 본 발명에서 제시하는 화학식 1과 같은 쿠마린계 화합물은 아직 이 세상에 보고한 적이 없으며 본 발명자들에 의해서 최초로 화학구조와 물리화학적 특성, 인간 호중구 엘라스타아제 발현 저해 효능을 밝힘으로서 본 발명을 완성하였다.

[발명이 이루고자 하는 기술적 과제]

따라서 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 물푸레나무 추출물로부터 인간 호중구 엘라스타아제의 발현을 저해함과 동시에 피부 적용시 안전성이 뛰어난 쿠마린계 신규 화합물의 제조방법, 화학구조, 물리화학적 특성 및 효능을 제공하는 것이다.

[발명의 구성]

상기의 기술적 과제를 달성하기 위하여 본 발명은, 하기 화학식 1로 표시되는 물푸레나무(Fraxinus rhynchophylla)의 껍질에서 추출된 쿠마린계 화합물 및 이의 제조방법을 제공한다.

[화학식 1]

또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 쿠마린계 화합물을 유효성분으로 함유하는 인간 호중구 엘라스타아제 발현을 저해함으로서 피부 주름 예방 및 개선용 약학적 조성물을 제공한다.

나아가, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 쿠마린계 화합물을 유효성분으로 함유하는 주름방지 및 개선용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 쿠마린계 화합물은 인간 호중구 엘라스타제 활성을 효과적으로 저해하여 우수한 피부 주름 개선 효과를 나타내므로, 이들을 유효성분으로 함유하는 조성물은 주름 개선을 위한 화장품에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 실시예 1의 ¹³C-NMR 스펙트럼, ¹H-NMR 스펙트럼 데이터이다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 쿠마린계 화합물을 제공한다.

[화학식 1]

상기 화학식 1은 후라노사이드 A (Franoside A)로 명명한다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 후라노사이드 A 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 뿐 만아니라, 이로부터 제조될 수 있는 가능한 용매화물 또는 수화물을 모두 포함한다.

나아가, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 후라노사이드 A 화합물의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 화학식 1의 쿠마린계 화합물은 물푸레나무에 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매를 가하여 물푸레나무 추출물을 수득하는 단계(단계 1);

다음으로, 상기 단계 2는 상기 단계 1에서 얻은 물푸레나무 추출물을 물에 분산한 후, 극성을 달리하는 용매로 순차적으로 분획하여 분획물을 얻는 단계(단계 2); 및

상기 단계 2에서 수득한 물푸레나무 분획물을 Diaion HP-20 컬럼 크로마토그래피를 수행하는 단계(단계 3)를 포함하여 이루어지는 제조방법에 의해 제조될 수 있다.

이하 본 발명에 따른 상기 제조방법을 단계별로 더욱 구체적으로 설명한다.

먼저, 본 발명에 따른 상기 단계 1은 추출용매로 물푸레나무 추출물을 수득하는 단계이다.

상기 물푸레나무 또는 이의 건조물로부터 추출하여 얻을 수 있으며, 물푸레나무는 채취한 것, 또는 시판되는 것 등 제한 없이 사용할 수 있다.

상기 추출물은 초임계추출, 아임계추출, 고온추출, 고압추출 또는 초음파 추출법 등의 추출장치를 이용한 방법 또는 XAD 및 HP-20을 포함한 흡착수지를 이용하는 방법 등 당업계의 통상적인 추출방법을 사용하여 제조할 수 있으며, 바람직하게는 가온하며 환류 추출 또는 상온에서 추출하여 제조할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 추출 회수는 1 내지 5회인 것이 바람직하며, 3회 반복 추출하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 추출물은 추출용매로 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매를 이용하여 추출될 수 있다. 상기 유기용매는 C1 내지 C4의 알코올, 초산에틸, 염화메틸렌 및 클로로포름으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 이들의 혼합용매인 것이 바람직하고, C1 내지 C4의 알코올인 것이 더욱 바람직하고, 에탄올로 추출하는 것이 가장 바람직하다. 상기 추출용매는 물푸레나무 중량의 2배 내지 10배로 첨가하여 추출하는 것이 바람직하고, 3배 내지 5배로 첨가하여 추출하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

일례로 본 발명에 따른 물푸레나무 추출물은 물푸레나무 건조물을 적당한 크기로 분쇄하여 추출용기에 넣고 추출용매를 넣고, 일정시간 방치한 다음 거름종이 등으로 여과하여 알코올 추출물을 얻을 수 있다. 추출시간은 1 내지 5일인 것이 바람직하며, 2내지 4일인 것이 더욱 바람직하다. 이후에 감압농축 또는 동결건조 등의 방법을 추가적으로 거칠 수 있다.

다음으로, 상기 단계 2는 상기 단계 1에서 얻은 물푸레나무 추출물을 물에 분산한 후, 극성을 달리하는 용매로 순차적으로 분획하여 분획물을 얻는 단계이다.

다음으로, 상기 단계 3은 상기 단계 2에서 수득한 분획물에 대해 컬럼 크로마토그래피를 수행하는 단계이다.

상기 컬럼 크로마토그래피의 크로마토그래피용 컬럼으로는 Diaion HP-20을 충진한 컬럼을 사용할 수 있다.

상기 단계 2에서 수득한 분획물에 대하여 메탄올과 물의 혼합용매를 사용하여 농도구배 Diaion HP-20 컬럼 크로마토그래피를 수행한다. 이때, 메탄올과 물의 혼합용매의 농도구배는 1:100 내지 100:1인 것이 바람직하며, 유속은 4.0 내지 5.0 ㎖/분인 것이 바람직하고, 수행 시간은 20 내지 25 시간이 바람직하다.

상기 Diaion HP-20 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 수득한 분획물에 대하여 메탄올과 물의 혼합용매를 사용하여 농도구배 역상 C-18 컬럼을 이용한 크로마토그래피를 수행할 수 있다. 이때, 메탄올과 물의 혼합용매의 농도구배는 2:8 내지 100:1인 것이 바람직하다.

상기 Diaion HP-20 컬럼 크로마토그래피와 역상 C-18 컬럼 크로마토그래피를 수행한 후에 고속 액체 크로마토그래피를 수행하여 화학식 1의 후라노사이드 A 화합물을 분리할 수 있다. 상기 고속 액체 크로마토그래피는 메탄올과 증류수의 혼합용매(3:7)를 전개용매로 사용하여 수행될 수 있다. 이때, 상기 이동상의 유속은 3.0 내지 5.0 ㎖/분인 것이 바람직하고, 수행 시간은 20 내지 50 시간이 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 쿠마린계 화합물인 후라노사이드 A 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 주름 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 상기 화학식 1의 후라노사이드 A 화합물은 인간 호중구 엘라스타아제 활성을 저해함으로써 주름 예방 및 치료 용도로 사용될 수 있다. 이들의 주름 예방 및 치료 용도를 구체적인 실험결과를 근거로 설명한다.

본 발명에 따른 화학식 1의 쿠마린계 화합물은 인간 호중구 엘라스타아제 활성저해 효과 측정 실험에서 농도 의존적으로 엘라스타아제 활성을 저해시키고, 3.6 ± 0.2 μM의 IC₅₀ 값을 나타내어 매우 우수한 엘라스타아제 활성저해효과를 나타냄으로써, 우수한 피부 주름 개선 효과를 나타내는 것을 알 수 있다(실시예 2 및 표 1 참조).

따라서, 본 발명에 따른 화학식 1의 후라노사이드 A 화합물은 인간 호중구 엘라스타아제 활성을 효과적으로 저해하여 우수한 피부 주름 개선 효과를 나타내므로, 이들을 유효성분으로 함유하는 조성물은 주름 개선을 위한 화장품에 유용하게 사용될 수 있다.

나아가, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 후라노사이드 A 화합물 또는 이의 화장품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 주름 방지 및 개선용 화장품 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 후라노사이드 A 화합물 또는 이의 화장품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 주름 방지 및 개선용 화장품 조성물은 피부학적으로 허용 가능한 부형제와 함께 기초 화장품 조성물(화장수, 크림, 로션, 에센스, 클렌징 폼 및 클렌징 워터와 같은 세안제, 팩, 바디오일), 색조 화장품 조성물(화운데이션, 립스틱, 마스카라, 메이크업 베이스), 두발제품 조성물(샴푸, 린스, 헤어컨디셔너, 헤어젤), 비누 등의 형태로 제조될 수 있다.

상기 부형제로는 피부연화제, 피부 침투 증강제, 착색제, 방향제, 유화제, 농화제 및 용매를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 또한, 향료, 색소, 살균제, 산화방지제, 방부제 및 보습제 등을 추가로 포함할 수 있으며, 물성개선을 목적으로 점증제, 무기염류, 합성 고분자 물질 등을 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 화장품 조성물로 세안제 및 비누를 제조하는 경우에는 통상의 세안제 및 비누 베이스에 상기 화학식 1 또는 화학식 2의 메가스티그만 유도체 화합물 또는 이의 화장품학적으로 허용가능한 염을 첨가하여 용이하게 제조할 수 있다. 크림을 제조하는 경우에는 일반적인 수중유적형(O/W)의 크림베이스에 상기 화학식 1로 표시되는 쿠마린계 화합물 또는 이의 화장품학적으로 허용가능한 염을 첨가하여 제조할 수 있다. 여기에 향료, 킬레이트제, 색소, 산화방지제, 방부제 등과 물성개선을 목적으로 하는 단백질, 미네랄, 비타민 등의 합성 또는 천연소재를 추가로 첨가할 수 있다.

본 발명의 화장품 조성물에 함유되는 화학식 1로 표시되는 쿠마린계 화합물 또는 이의 화장품학적으로 허용 가능한 염의 함량은 전체 조성물 총중량에 대하여 0.001 내지 10 중량%인 것이 바람직하고, 0.01 내지 5 중량%인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 함량이 0.001 중량% 미만인 경우에는 목적하는 주름 개선 효과를 기대할 수 없고, 10 중량% 초과인 경우에는 안전성 또는 제형상의 제조에 어려움이 있을 수 있다.

또한, 본 발명의 화장품 조성물은 상기 화학식 1로 표시되는 쿠마린계 화합물인 후라노사이드 A 화합물 또는 이의 화장품학적으로 허용가능한 염에 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온 봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 그리고 상기의 성분들은 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.

이하 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 후라노사이드 A의 제조

단계 1 : 물푸레나무 에탄올 추출물의 제조

경기도 남양주시에서 채집한 물푸레나무 줄기 1 kg을 추출용기에 넣고, 70% 에탄올 10 ℓ를 가하여 상온에서 3일 동안 추출하였고, 거름종이로 여과하여 추출물을 얻었다. 추출과정을 3회 반복하였고, 이후 용매를 감압 농축 및 건조하여 106g의 에탄올 추출물을 수득하였다.

단계 2 : 물푸레나무 추출 분획물의 제조

상기 제조예 1에서 수득한 에탄올 추출물을 극성에 따라 분획하기 위해 유기용매를 이용한 계통 분획을 실시하였다. 구체적으로는 상기 에탄올 추출물을 Diaion HP-20 컬럼 크로마토그라피를 실시하였는데 이때 100% 물에서 순차적으로 100% 메탄올까지 분획하여 4개의 분획물을 수득하였다.

단계 3 : 후라노사이드 A의 제조

상기 제조예 1의 단계 2에서 수득한 에탄올 분획물을 메탄올과 물의 혼합용매(20~100%)를 사용하여 농도구배 역상 C-18 컬럼을 이용한 크로마토그래피를 수행하여 정제한 후, 고속 액체 크로마토그라피를 실시하여 순수하게 정제된 후라노사이드 A를 얻었다. 이때, 이동상으로 메탄올과 물의 혼합용매(3:7)을 이용하여 20분에 나타나는 피크를 수득하였다. 유속은 4 ㎖/분이었고, YMC-Pack ODS(20×250 mm) 컬럼을 사용하였다.

후라노사이드 A의 물리화학적 특성 : 제조된 후라노사이드 A는 백색 분말의 성상을 가졌으며, 후라노사이드 A의 물리화학적 특성은 메탄올 용액에서의 UV (MeOH) 흡광 스펙트럼, 적외선 분광법(Infrared spectroscopy, IR), 고분해능 전기분무 질량분석법 (High-resolution electrospray ionization mass spectrometry, HR-ESI), ¹H-NMR및 ¹³C-NMR로 분석하였다. 구체적으로 NMR은 Bruker DRX-400 spectrometer를 사용하여 ¹³C-NMR(100 MHz), ¹H-NMR(400MHz)를 측정하였으며 2DNMR(HMQC와 HMBC)은 Bruker Avence 500 NMR spectrometer로 측정하였다. 내부 표준물질로 tetramethylsilane(TMS)를 사용하였다. 분석 결과 후라노사이드 A는 IUPAC Name이 esculetin 6-O-α-L-arabinofuranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside인 하기 화학식 1의 화합물로 나타났다.

[화학식 1]

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실시예 2. 후라노사이드 A의 엘라스타아제 저해활성

엘라스틴을 분해하는 효소인 인간 호중구 엘라스타아제가 활성을 나타내는 경우, 탄성 섬유인 엘라스틴이 분해되어 피부 주름 형성이 가속된다. 본 발명에 따른 화합물의 인간 호중구 엘라스타아제 활성저해 효과를 측정하기 위하여 아래와 같이 실험을 수행하였다.

500 ㎕의 DMSO에 상기 실시예 1 화합물인 후라노사이드 A를 1, 3, 10, 30 및 100 μM의농도로 용해시킨 후에 Tris-HCl 완충용액을 첨가하여 실험용액을 제조하였다. 상기실험용액 60 ㎕와 엘라스타제의 기질인 N-메톡시석시닐-알라닌-알라닌-프롤린-발린-p-니트로아닐라이드(N-methoxysuccinyl-ala-ala-pro-val-p-nitroanilide) 125 ㎕, Tris-HCl 완충용액 390 ㎕을 혼합하고, 사람 중성구 엘라스타아제(0.18 units) 25 ㎕를 첨가한 후에 37 ℃에서 1시간 동안 배양하였다. 1시간 후에, 대두 트립신 저해제(soybean trypsin inhibitor)을 첨가하여 상기 반응을 중지시켰다. 엘라스타아제의 기질인 N-메톡시석시닐-알라닌-알라닌-프롤린-발린-p-니트로아닐라이드는 분해되면노란색의 p-니트로아닐린이 되며, p-니트로아닐린의 발색정도를 분광분석기를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정함으로써 엘라스타아제 활성 저해율을 측정하였다. 양성대조군으로 EGCG를 사용하였다. 엘라스타아제 활성 저해율은 하기 수학식 1에 의해 계산하였고, 화합물의 농도별 엘라스타아제 활성저해효과를 측정하여 IC₅₀ 값을 계산하였다. 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

A : 엘라스타제 활성 저해제가 없는 경우의 흡광도

B : 엘라스타제 활성 저해제가 있는 경우의 흡광도

상기 표 1을 참조하면, 본 발명에 따른 화합물은 농도 의존적으로 엘라스타아제 활성을 저해시키는 것을 알 수 있다. 특히 실시예 1의 화합물인 후라노사이드 A 화합물은 3.6 ± 0.2 μM의 IC₅₀ 값을 나타냄으로써 대조구로 사용한 EGCG와 유사한 강력한 엘라스타아제 활성 저해효과를 나타내는 것을 알 수 있다.

실시예 3. 후라노사이드 A의 아토피성 항염증 저해활성

염증의 발현 기전에는 다양한 매개체가 관여하고 있으며, 그 병의 원인도 다양하다. 대식세포에 엔도톡신으로 알려져 있는 LPS(lipopolysacharide)를 처리하면 iNOS (inducible NOS) 발현에 의해 NO 생합성이 증가하며 염증 반응이 유도된다. NO는 많은 세포들이 분비하는 병리적인 2차 신호전달물질이며 COX의 활성을 조절하고 염증반응에 상승적으로 작용한다. Raw264.7 세포에서 LPS에 의해 유도되는 NOS에 의해 생성되는 NO를 측정하여 본 발명에 따른 후라노사이드 A의 아토피성 염증반응 억제 효과를 판정할 수 있다.

화학식 1의 화합물의 항염중 효과를 확인하기 위하여 RAW264.7 세포주를 이용한 Griess법으로 nitrix oxide(NO) 저해활성을 실시하였다.

상세하게는 대식세포인 RAW264.7 세포를 수차례 계대배양하고, 웰 하나에 5×10⁴ 개씩 들어가도록 24-웰 프레이트에 넣은 후, 24 시간 동안 배양시켰다. 이어서, 최종농도 1, 2, 5, 10, 20 μM의 농도로 화학식1의 화합물을 희석한 세포 배지로 교체하였다. 이 때, NO-생성 억제물질인 L-NMMA (L-NG-Monomethyl arginine)을 양성 대조군으로 함께 처리하여 30분 동안 배양하였고, LPS (Lipopolysaccharide)를 1 μg씩 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 상층액을 100 μl 씩 취해 96-웰 프레이트에 옮기고, Griess 용액을 100 μl씩 가해 상온에서 10분간 반응시키고, 540nm에서의 흡광도를 측정함으로써 화학식 1의 화합물의 NO 억제 효과를 조사하고 그 결과를 하기 그림 1에 나타내었다

그림 1. 화학식 1인 후라노사이드 A의 nitric oxide 저해활성 효과

상기 그림을 참조하면, 본 발명에 따른 후라노사이드 A 화합물은 농도 의존적으로 nitrix oxide 활성을 저해시키는 것을 알 수 있다. 특히 실시예 1의 화합물인 후라노사이드 A 화합물은 3.6 ± 0.2 μM의 IC₅₀ 값을 나타냄으로써 대조구 보다도 우수한 nitrix oxide 활성 저해효과를 나타내는 것을 알 수 있다.

그림 2. 후라노사이드 A의 iNOS 및 COX-2 저해활성

상기 그림을 참조하면, 본 발명에 따른 후라노사이드 A 화합물은 농도 의존적으로 iNOS 및 COX-2 활성을 저해시키는 우수한 화합물임을 알 수 있다.

제제예 1: 화장품 제조

제제예 1-1 : 로션의 제조

제제예 1-1에서 제시한 전성분에 의해 로션을 제조하였을 때 효과적으로 로션제조가 가능함을 확인하였다.

제제예 1-2 : 로션의 제조

제제예 1-2에서 제시한 전성분에 의해 크림을 제조하였을 때 효과적으로 크림제조가 가능함을 확인하였다.

제제예 1-3 : 아토피 로션의 제조

제제예 1-3에서 제시한 전성분에 의해 아토피 로션을 제조하였을 때 효과적으로 아토피용 로션제조가 가능함을 확인하였다.

발명의 효과

이상에서 상세히 설명하였듯이, 본 발명에 따른 물푸레나무 추출물 유래 쿠마린계 화합물인 후라노사이드 A 화합물은 아직 보고되지 않은 최초의 화학구조를 갖는 신규 화합물로 인간 호중구 엘라스타아제의 활성을 저해하는 효과가 뛰어나며 동시에 일산화질소의 활성을 저해하여 결과적으로 iNOS 및 COX-2 활성을 저해함으로 피부 자극이 없이 우수한 피부 주름 개선효과를 나타낼 수 있는 장점을 가지고 있어 신규한 화장료 조성물로 활용될 수 있다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는, 물푸레나무(Fraxinus rhynchophylla) 추출물로부터 분리된 것을 특징으로 하는 쿠마린계 화합물.
[화학식 1]
삭제
물푸레나무(Fraxinus rhynchophylla) 추출물을 수득하는 단계(단계 1); 및
상기 단계1에서 수득한 물푸레나무 추출물에서 쿠마린계 화합물을 분리하는 단계(단계2);를 포함하는 제1항의 화학식 1로 표시되는 쿠마린계 화합물의 제조방법.
제1항의 화학식 1로 표시되는 쿠마린계 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 예방 또는 개선용 화장료 조성물
제4항에 있어서, 상기 피부 주름 예방 또는 개선용 화장료 조성물은 인간 호중구 엘라스타아제의 발현을 저해하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물
제1항의 화학식 1로 표시되는 쿠마린계 화합물을 유효성분으로 함유하는 염증 예방 또는 개선용 화장료 조성물
청구항 6에 있어서, 상기 염증 예방 또는 개선용 화장료 조성물은 일산화질소의 발현을 저해하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물
제 1항에 따른 화학식 1로 표시되는 쿠마린계 화합물을 포함하는 물푸레나무 추출물.