KR100792184B1 - 개의 제대혈, 태반 및 개 태아의 심장 유래 다분화능 성체줄기세포, 그 제조방법 및 이를 함유하는 세포 치료제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 개의 제대혈 및 개 태아의 심장 유래 다분화능 성체 줄기세포, 그 제조방법 및 이를 함유하는 세포 치료제에 관한 것으로, 더욱 자세하게는, 개의 제대혈 및 개 태아의 심장 유래 혈액에서 분리한 유핵세포를 FBS를 함유하는 배지에 배양하여 분리한 다분화능 성체 줄기세포, 그 제조방법 및 이를 함유하는 세포 치료제에 관한 것이다.

본 발명에 따른 성체 줄기세포는 개의 제대혈, 태반 및 개 태아의 심장에서 유래한 것으로서, 사람의 간엽세포 성격과 매우 유사한 성격을 가지고 있으면서도, 사람 제대혈 유래 간엽세포보다 초기 단계에 왕성한 세포 성장을 하므로 개의 난치병, 불치병 치료에 유용하게 사용될 수 있고, 골형성 세포 및 신경세포로 분화하는 능력을 가지고 있어, 근골격계 질환 및 뇌 신경계 질병 등의 치료에 유용하다.

제대혈, 태반, 성체 줄기세포, 다분화능

Description

개의 제대혈, 태반 및 개 태아의 심장 유래 다분화능 성체 줄기세포, 그 제조방법 및 이를 함유하는 세포 치료제{Mutipotent Adult Stem Cell Derived from Canine Umbilical Cord Blood, Placenta and Canine Fetus Heart, Method for Preparing the Same and Cellular Therapeutics Containing the Same}

도 1은 본 발명에 따른 개의 제대혈 및 개 태아의 심장 유래 다분화능 성체 줄기세포를 현미경으로 촬영한 사진이다 (a: 개의 제대혈 및 개 태아의 심장으로부터 분리한 단핵세포로 배양한 세포배양 3일후의 세포모양을 40배 확대한 사진, b: 100배 확대한 사진, c: 200배 확대한 사진).

도 2는 유식세포 분석기(FACS)를 이용하여 본 발명에 따른 개의 제대혈 및 개 태아의 심장 유래 다분화능 성체 줄기세포의 면역학적 특성을 나타낸 것이다 (no.1: MHC CL I, no.2: MHC CL II, no.3: MHC CL II HLA DR, no.4: PAN LYMPHOCYTE, no.5: B LYMPHOCYTE, no.6: CD 172a, no.7: CD 4, no.8: CD 8, no.9: CD 14, no.10: NEUTROPHIL, no.11: CD 3, no.12: CD 11c, no.13: THY.1, no.14: CD 45-LIKE, no.15: CD44, no.16: CD44 (BD), no.17: CD 34 (pe conjugated).

도 3은 본 발명에 따른 개의 제대혈 및 개 태아의 심장 유래 다분화능 성체 줄기세포로부터 분화된 골형성세포를 나타낸 것이다 (a: 개의 제대혈 및 개 태아의 심장으로부터 분리한 줄기세포 및 TCP를 혼합한 다음 1주 후 조직사진, b: 8주 후 조직사진, c: b사진을 400배로 확대한 사진).

도 4는 본 발명에 따른 다분화능 성체 줄기세포가 각각 신경세포로 분화 유도된 세포가 신경세포의 특이 마커인 GFAP(glial fibrillary acidic protein), MAP2(microtubule-associated protein2), Tuj1에 대하여 양성 발현하고 있음을 나타낸 것으로, 도 4a는 GFAP 1차항체를 발현하는 본 발명에 따른 성체 줄기세포의 사진(A: GFAP를 발현하고 있는 세포사진, B: Hoechst 염색 사진, C: merge, D: control), 도 4b는 MAP2 1차항체를 발현하는 본 발명에 따른 성체 줄기세포의 사진(A: MAP2를 발현하고 있는 세포사진, B: Hoechst 염색 사진, C: merge, D: control), 도 4c는 Tuj1 1차항체를 발현하는 본 발명에 따른 성체 줄기세포의 사진(A: Tuj1을 발현하고 있는 세포사진, B: Hoechst 염색 사진, C: merge, D: control), 도 4d 및 4e는 1차항체를 반응시키지 않은 세포에 2차항체를 반응시킨negative control(A 및 E: 1차항체를 반응시키지 않은 상태에서 2차항체를 반응시킨 세포사진, B 및 F: confocal 현미경의 DIC image, C 및 G: Hoechst 염색방법을 이용하여 세포핵 염색 사진, D: A,B 및 C의 merge, H: E,F 및 G의 merge)을 각각 나타낸 것이다.

도 5는 실시예 5에서 나타난 Olby score가 어떤 기준에 의해 매겨지는지를 나타내는 기준 표이다.

도 6은 실시예 5에서 1번 내지 4번 실험견의 본 발명의 다분화능 성체 줄기 세포 이식전 상태 및 세포 이식내용을 개략적으로 설명한 표이다.

도 7은 실시예 5에서 1번 내지 4번 실험견의 성체 줄기세포 이식 후 시간 경과에 따른 증상 또는 임상적 변화 상태를 개략적으로 설명한 표이다.

도 8는 실시예 5에서 본 발명의 다분화능 성체 줄기세포를 이식한 실험군들의 이식 후, 2, 4, 16, 32주 경과함에 따른 Obly score를 나타낸 그래프이다 (no.1: 1번 실험견, no. 2: 2번 실험견, no. 3: 3번 실험견, no.4: 4번 실험견).

도 9은 본 발명에 따른 개의 제대혈에서 분리된 다분화능 성체 줄기세포가 척수 손상부위로 이식된 실험견의 transverse T2 강조영상을 나타낸 것이다 (A: 줄기세포 이식 전, B: 줄기세포 이식 후, Arrow: T2 강조영상에서 고신호를 보이는 척수부위, Arrow heads: 증가한 축 위 근육).

본 발명은 개의 제대혈 및 개 태아의 심장 유래 다분화능 성체 줄기세포 및 그 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는, 개의 제대혈 및 개 태아의 심장 유래 혈액에서 분리한 유핵세포를 FBS를 함유하는 배지에 배양하여 분리한 다분화능 성체 줄기세포 및 그 제조방법에 관한 것이다.

현대 의학분야에서 인간의 난치병 치료를 위해 장기이식이나 유전자 치료 등 이 제시되었으나, 면역거부와 공급 장기 부족, 벡터개발이나 질환유전자에 대한 지식부족으로 효율적인 실용화가 이루어지지 못하였다. 이에, 최근 생명공학의 눈부신 발전에 힘입어 난치병 치료에 줄기세포를 도입하고자 하는 시도가 계속되고 있다.

이와 같이 줄기세포연구에 대한 관심이 고조되어, 증식과 분화를 통해 모든 기관을 형성할 능력을 가진 만능 줄기세포가 대부분의 질병 치료는 물론 장기 훼손을 근원적으로 해결할 수 있는 것으로 인식되었다. 또한, 많은 과학자들이 인체의 거의 모든 장기 재생은 물론 난치병이었던 파킨슨병, 각종 암, 당뇨병과 척수손상등의 치료에 이르기까지 다양하게 줄기세포를 이용한 세포치료의 적용 가능성을 제시해 왔다.

세포치료법이란 세포와 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가(autologous), 동종(allogenic) 또는 이종(xenogenic) 줄기세포를 체외에서 증식 혹은 선별하거나, 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 방법 등을 통하여 질병을 치료 및 예방하는 것이다. 세포치료법은 환자 자신이나 타인 또는 다른 동물의 체세포를 채취하여 증식시키거나, 줄기세포를 원하는 세포로 분화시켜 치료에 이용하는 등 그 적용범위가 넓어서, 각종 난치병 및 불치병의 치료에 있어 무한한 가능성을 가지고 있다.

줄기세포(stem cell)란 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말하며, 만능 줄기세포(totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cells), 다분화능 줄기세포(multipotent stem cells)로 분류할 수 있다.

만능 줄기세포(totipotent stem cells)는 하나의 완전한 개체로 발생해 나갈 수 있는 만능의 성질을 가진 세포로 난자와 정자의 수정 이후 8세포기 까지의 세포가 이러한 성질을 가지며 이 세포를 분리하여 자궁에 이식하면 하나의 완전한 개체로 발생해 나갈 수 있다.

전분화능 줄기세포(pluripotent stem cells)는 외배엽, 중배엽, 내배엽층 유래의 다양한 세포와 조직으로 발생할 수 있는 세포로서, 수정 4-5일 후 나타나는 배반포(blastocyst)의 안쪽에 위치한 내세포괴(inner cell mass)에서 유래하며, 이를 배아 줄기 세포라 하며 다양한 다른 조직 세포로 분화되지만 새로운 생명체를 형성하지는 못한다.

다분화능 줄기세포(multipotent stem cells)는 이 세포가 포함되어 있는 조직 및 기관에 특이적인 세포로만 분화할 수 있는 줄기세포로서, 태아기, 신생아기 및 성체기의 각 조직 및 장기의 성장과 발달은 물론 성체조직의 항상성 유지와 조직손상 시 재생을 유도하는 기능에 관여하고 있으며 조직 특이적 다능성 세포들을 총칭하여 성체 줄기세포라 한다.

성체 줄기세포는 인체의 각종 장기에 이미 존재하는 세포를 채취, 줄기세포를 발전시킨 것으로 특정 조직으로만 분화되는 특징이 있다. 그러나, 최근에는 성체줄기 세포를 이용, 간세포 등 각종 여러 조직으로 분화시키는 실험이 성공을 거두고 있어 주목된다.

상기 다분화능 줄기세포는 성체 골수에서 최초로 분리되었고(Y. Jiang et al., Nature, 418:41, 2002), 그 후 다른 여러 성체 조직에서도 확인되었다(C.M. Verfaillie, Trends Cell Biol ., 12:502, 2002). 다시 말해, 골수는 가장 널리 알려진 줄기 세포의 소스이지만, 다분화능 줄기세포는 피부, 혈관, 근육 및 뇌로부터도 확인되었다(J.G. Toma et al ., Nat . Cell Biol., 3:778, 2001; M. Sampaolesi et al, Science, 301:487, 2003; Y. Jiang et al ., Exp . Hematol ., 30:896, 2002).

또한, 골수 뿐만 아니라, 최근 사람의 제대혈에서 분리한 조혈모세모와 간엽줄기세포는 다양한 세포로 분화유도되어 혈액 관계 질환의 치료 등에 필요한 세포치료제로써 활용 가능성이 높아, 성체줄기세포를 확보할 수 있는 공급원으로써 중요성이 높아지고 있다.

일반적으로 조혈모세포는 CD34 항체에 대하여 세포 표면 항원 인자에 대하여 양성 발현하는 특성을 가지고 있으며, 간엽줄기세포는 이와 반대로 음성 반응을 일으키는 것으로 알려져 있다. Flow Analysis Cell Sorting (FACS)을 사용한 분석 결과에 따르면, 사람의 골수에서 분리한 CD34 (-) 세포의 특징은 대체로 제대혈에서 분리한 간엽줄기세포와 유사하게 세포표지항체의 발현 양상을 나타낸다. 골수에서 분리한 간엽줄기세포와 마찬가지의 세포표지항체 발현 양상을 나타내는 제대혈에서 유래한 간엽줄기세포는 분화 실험 결과 다양한 종류의 세포로 분화가 유도되는 것이 확인되었으며, 앞서 연구되었던 사람의 골수에서 분리된 간엽줄기세포와 마찬가지로 다양한 세포치료와 분화와 관련된 연구에 활용될 수 있는 가능성을 가지고 있는 것으로 나타났다. 그러나, 현재까지 사람의 제대혈에서 분리한 간엽줄기세포는 초기 배양 단계에서 적은 세포수로 존재하여, 수가 충분히 확보될 때까지는 분석과 분화실험에 활용에 제한이 따르는 어려움이 있다.

이에 본 발명자들은 개의 제대혈 및 개 태아의 심장으로부터 간엽세포를 분리하여, 사람의 제대혈에서 유핵세포층을 분리하여 줄기세포를 배양하는 방법과 동일한 방법으로, 세포 배양한 결과, 개의 제대혈 및 개 태아의 심장으로부터 분리한 간엽세포의 경우, 사람의 간엽세포와 달리 초기 단계에서 왕성한 세포성장을 관찰할 수 있으며, FACS분석과 세포분화 실험결과 사람의 제대혈 또는 골수에서 분리한 간엽줄기세포의 성격과 매우 유사하다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 초기 단계에서 왕성한 세포 성장을 하고, 사람의 간엽세포 성격과 매우 유사한 개의 제대혈, 태반 및 개 태아의 심장 유래 다분화능 성체 줄기세포 및 그 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 다분화능 줄기세포로부터 근골격계 및 뇌신경계 세포로 분화시키는 방법 및 상기 분화된 세포 또는 상기 성체 줄기세포들을 함유하는 세포 치료제를 제공하는데 있다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 개의 제대혈 및 개 태아의 심장 유래 혈액에서 분리한 유핵세포를 FBS 함유 배지에서 배양하여 수득되는 것을 특징으로 하고, 다음과 같은 특성을 나타내는 성체 줄기세포의 제조방법을 제공한다:

(a) MHC CL Ⅰ, Thy.1 및 CD44(BD)에 대하여 적어도 하나 이상의 양성 면역학적 특성을 나타내고, 동시에 CD34에 대하여 모두 음성의 면역학적 특성을 나타냄;

(b) 플라스틱에 부착되어 성장하며, 선형태(spindle-shape)의 형태학적 특성을 나타냄; 및

(c) 내배엽, 외배엽 및 중배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가짐.

본 발명에 있어서, 상기 배지는 DMEM이고, 1∼30% FBS를 함유하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 방법에 의하여 제조되고, 다음과 같은 특성을 가지는 성체 줄기세포를 제공한다:

(a) MHC CL Ⅰ, Thy.1 및 CD44(BD)에 대하여 적어도 하나 이상의 양성 면역학적 특성을 나타내고, 동시에 CD34에 대하여 모두 음성 면역학적 특성을 나타냄;

(b) 플라스틱에 부착되어 성장하며, 선형태(spindle-shape)의 형태학적 특성을 나타냄; 및

(c) 내배엽, 외배엽 및 중배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가짐.

본 발명에 있어서, 상기 성체 줄기세포는 초기단계에 왕성한 세포 성장을 하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 중배엽 유래 세포는 골형성 세포인 것을 특징으로 하지 만, 상기 중배엽 유래 세포가 이에 제한되는 것은 아니며, 중배엽 유래 세포라면 무엇이든지 가능하다.

본 발명은 또한, 상기 성체 줄기세포를 TCP(Tricalcium phosphate)와 혼합하여 동소이식 또는 이소이식하는 것을 특징으로 하는 성체 줄기세포를 골형성 세포로 분화시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 성체 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 근골격계 질환 치료용 세포 치료제를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 분화된 골형성세포를 유효성분으로 함유하는 근골격계 질환 치료용 세포 치료제를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 중배엽 유래 세포는 신경 세포인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 신경 세포는 뇌신경세포인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 성체 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 신경계 질환 치료용 세포 치료제를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 성체 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 개의 난치성 질환 치료용 세포 치료제를 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 상기 성체 줄기세포를 β-mercaptoethanol을 함유한 DMEM 배지에 전배양하는 단계; 및 (b) 상기 전배양액을 DMSO 및 BHA(butylated hydroxyanisole)로 처리하여 신경분화를 유도하는 단계를 포함하는 성체 줄기세포를 신경세포로 분화시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 분화된 신경세포를 유효성분으로 함유하 는 신경질환 치료용 세포 치료제를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 신경질환은 뇌경색, 치매, 파킨슨병 및 척수손상으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

개의 제대혈과 임신중인 개의 태아의 심장으로부터 얻은 혈액을 PBS와 1:1 비율로 희석하여 교반한 다음, Ficoll-pague:제대혈 = 15:25의 비율로 피콜 상 분리를 실시한다. 15㎖의 피콜용액에 PBS와 1:1의 비율로 희석된 혈액 샘플을 천천히 흘려 층이 분리되도록 한 다음, 원심분리 한 후 tube의 중간층에 얇은 버피 코트층(buffy coat layer)이 형성된 것을 확인하고, 분리해 새로운 tube로 이동시킨다. 상기 tube에 HBSS(Hanks Balanced Salt Solution)를 첨가하여 총 30mL의 용액이 되게한 다음, 1200rpm에서 15분간 원심분리한 후, 상층액은 버리고, 침전액을 즉시 얼음에 보관한다.

침전액에 1mL의 HBSS를 첨가하여 부드럽게 파이펫팅(pipetting)해주고, 29mL의 HBSS을 추가로 첨가하여, 같은 방법으로 튜브를 흔들어 균일하게 섞어준 다음, 1200rpm에서 5분간 원심분리를 실시하여 상층액은 제거하고, 다시 1200rpm에서 5분간 원심분리를 실시한(상기 과정을 2회 반복하였다) 후, 세포를 수득한다.

cMSC 형태 유사한 세포의 배양에 적합한 배지(DMEM(low glucose) + 1%PSN + 20% FBS)에 세포를 부유시킨 후, 75 flask에 각각 1~2×10⁸의 세포가 들어가도록 배 지에 희석 시킨다(플라스크에 들어가는 배지의 양은 20mL로 한다). CO₂ 배양기에서 3일간 세포배양 후, 상층액을 새로운 75 플라스크에 이동시키고, 플라스크 바닥에 부착되어 있는 세포 위에는 최초 배양 시와 동일한 성분의 배양액을 채워놓는다. 4~10일 이후에, 트립신을 사용하여 세포를 이탈시켜 새로운 플라스크에 1×10⁴/mL로 시딩하여 유지시키는 방법으로, 본 발명에 따른 개 제대혈 다분화능 성체 줄기세포를 배양 및 유지한다.

상기에서 수득한 개의 제대혈 유래 다분화능 성체 줄기세포를 수득하는 방법으로서는 소팅 기능을 가진 플로우 사이토미터를 사용한 FACS 법(Int . Immunol ., 10(3):275, 1998), 자기 비즈를 사용하는 방법, 다분화능 줄기세포를 특이적으로 인식하는 항체를 사용한 패닝법(J. Immunol ., 141(8):2797, 1998) 등이 있다. 또한, 대량의 배양액 등으로부터 다분화능 줄기세포를 수득하는 방법으로서는, 세포의 표면에 발현되어 분자(이하, 표면 항원이라 칭함)를 특이적으로 인식하는 항체를 단독 또는 조합하여 이를 칼럼으로서 사용하는 방법이 있다.

플로우 사이토미터 소팅 방식으로서는, 수적하전 방식, 셀캡쳐 방식 등을 들 수 있다. 어떠한 방법도 세포의 표면항원을 특이적으로 인식하는 항체를 형광으로 표지하고, 표지된 항체와 항원의 결합체에 대한 형광을 측정하여 형광 강도를 전기 신호로 변환함으로서 세포의 항원 발현량을 정량할 수 있다. 또한, 사용하는 형광물질의 종류를 조합함으로서, 복수의 표면 항원을 발현하고 있는 세포를 분리하는 것도 가능하다. 여기에 사용가능한 형광물질로는, FITC(fluorescein isothiocyanate), PE(phycoerythrin), APC(allo-phycocyanin), TR(TexasRed), Cy3, CyChrome, Red613, Red670, TRI-Color, QuantumRed 등이 있다.

플로우 사이토미터를 사용한 FACS 법으로서는, 상기에서 수득한 줄기세포용액을 수집하고, 원심분리 등의 방법으로 세포를 분리한 후, 직접 항체로 염색하는 방법과 한번 적당한 배지 중에서 배양, 증식을 실시한 후에 항체를 염색하는 방법을 이용할 수 있다. 세포의 염색은 우선, 표면 항원을 인식하는 일차항체와 목적 세포샘플을 혼합하고, 얼음 위에서 30분 내지 1시간 인큐베이션한다. 일차 항체가 형광으로 표지되어 있는 경우에는 세정 후 플로우 사이토미터로 분리를 실시한다. 일차 항체가 형광 표지되어 있지 않는 경우에는 세정 후 일차 항체에 대해서 결합 활성을 갖는 형광 표지된 이차 항체와 일차 항체가 반응한 세포를 혼합하고, 다시 얼음에서 30분 내지 1시간 인큐베이션한다. 세정 후, 일차 항체와 이차 항체에서 염색된 세포를 플로우 사이토미터로 분리를 실시한다.

각종 표면 항원으로서는 조혈관련항원, 중간엽계 세포의 표면 항원 또는 신경계 뉴런의 특이항원 등을 들 수 있다. 상기 조혈관련 항원으로는 CD34, CD45 등이 있고, 중간엽계 세포의 표면 항원으로는 SH-2, SH-3 등을 들 수 있으며, 신경계 뉴런의 특이항원으로는 NSE, GFAP 등을 들 수 있다. 전술한 각종 표면 항원을 인식하는 항체를 단독 혹은 조합하여 사용함으로서, 목적하는 세포를 취득할 수 있다.

또한, 실험동물은 통상 렛드나 마우스를 많이 사용하며, 개와 같은 동물은 BBB 스코어라는 것을 사용한다. 이 측정법은 21단계로 나누어 동물의 상태를 나타낸다. 개에서는 5단계로 동물의 상태를 판단하는 Talov 스코어를 사용한다. 올비스 코어(Olby score)는 1990년대 나타냐 올비에 의해 주창되었으며, 개에서 5단계로 평가하기 부족한 부분을 보완하기 위해 단계를 좀 더 세분화시킨 것으로, 통상적으로 널리 적용이 가능한 실험동물보다 좀 더 개에게 적용할 것을 염두에 둔 방법이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

특히, 하기 실시예에서는 개 제대혈 및 개 태아의 심장 유래 성체 줄기세포를 분리하여 실험하였으나, 이에 제한되지 않고, 개 태반으로부터 유래한 성체 줄기세포 또한 본 발명에 따라 분리·증식하여 적용하는 것은 당업자에게 용이할 것이다.

실시예 1: 개 제대혈 및 개 태아의 심장에서 성체 줄기세포의 분리 및 배양

개의 제대혈과 임신중인 개의 태아의 심장으로부터 얻은 혈액을 PBS와 1:1 비율로 희석한 다음, 교반하였다. 그 후 Ficoll-pague:제대혈 = 15:25의 비율로 피콜 상 분리를 실시하였다. 15㎖의 피콜용액에 PBS와 1:1의 비율로 희석된 혈액 샘플을 천천히 흘려 층이 분리되도록 한 다음, 원심분리하였다 (1500∼3500rpm, 5∼30분). 원심분리 후 tube의 중간층에 얇은 버피 코트층(buffy coat layer)이 형성 된 것을 확인하고, 마이크로 파이펫으로 조심스럽게 분리해 새로운 tube로 이동시킨다. HBSS를 tube에 추가하여 총 30mL의 용액이 담긴 tube를 만든다. 그리고, 1500∼3000rpm에서 5∼20분간 원심분리를 실시하였다. 원심 분리 후, 상층액은 버리고, 침전액을 즉시 얼음에 보관하였다.

침전액에 1mL의 HBSS를 첨가하여 부드럽게 파이펫팅(pipetting)해주고, 29mL의 HBSS을 추가로 첨가하여, 같은 방법으로 튜브를 흔들어 균일하게 섞어준 다음, 1000∼2000rpm에서 5∼20분간 원심분리를 실시하였다. 상층액은 제거하고, 다시 1000∼2000rpm에서 5∼20분간 원심분리를 실시하여(상기 과정을 2회 반복하였다), 세포를 수득하였다. 또한, 원심분리 후 상층액은 버리고, 침전액에 1mL의 DMEM을 넣어 부유시킨 후, 세포 계수를 실시하였다.

cMSC 형태 유사한 세포의 배양에 적합한 배지(DMEM(low glucose) + 20% FBS)에 세포를 부유시킨 후, 75 flask에 각각 1~2×10⁸의 세포가 들어가도록 배지에 희석 시켰다(플라스크에 들어가는 배지의 양은 20mL로 한다). CO₂ 배양기에서 3일간 세포배양 후, 상층액을 새로운 75 플라스크에 이동시키고, 플라스크 바닥에 부착되어 있는 세포 위에는 최초 배양 시와 동일한 성분의 배양액을 채워놓았다. 4~10일 이후에, 트립신을 사용하여 세포를 이탈시켜 새로운 플라스크에 1×10³∼1×10⁵/mL로 시딩하였다.

도 1은 본 발명에 따른 제대혈 및 개 태아의 심장 유래 다분화능 성체 줄기세포를 현미경상에서 관찰한 것으로, 개의 제대혈로부터 분리한 단핵세포로 세포배양 3일 후의 세포모양을 나타낸 것이다. 사람의 제대혈에서 분리한 간엽줄기세포와 마찬가지의 fibroblast 형태와 유사한 세포가 배양시도 3∼7일째부터 플라스크의 바닥에 부착하여 성장하였다.

실시예 2: 개 제대혈 및 개 태아의 심장 유래 다분화능 성체 줄기세포의 면역학적 특성

상기 실시예 1에서 수득한 제대혈 유래 다분화능 성체 줄기세포의 면역학적 특성을 알아보기 위하여 세포표면항원의 발현 양상을 조사하였다.

초대 배양(primary culture) 후 P0 상태의 세포를 수거한 다음, 새로운 75 T flask에 시딩(seeding)하여 P1 세포를 배양하였고, P1 세포를 배양하여 수거한 다음, MHC CL II, MHC CL II HLA-DR, Pan lymphocyte, B lymphocyte, CD172a, CD4, CD8, CD14, Neutrophil, CD34, CD3, CD11c, Thy.1, CD45-like 및 CD44 1차 항체에 점착 후, 형광을 발현하는 2차항체 점착을 통해 간접 세포면역표지방법을 사용하여 FACS 분석을 실시하였다.

도 2에서 no.1 내지 no.17은 각각 no.1은 MHC CL I, no.2는 MHC CL II, no.3은 MHC CL II HLA DR, no.4는 PAN LYMPHOCYTE, no.5는 B LYMPHOCYTE, no.6은 CD 172a, no.7은 CD 4, no.8은 CD 8, no.9는 CD 14, no.10은 NEUTROPHIL, no.11은 CD 3, no.12는 CD 11c, no.13은 THY.1, no.14는 CD 45-LIKE, no.15은 CD44, no.16은 CD44 (BD), no.17은 CD 34 (pe conjugated) 및 no.18은 음성대조군(negative control)의 결과를 나타낸 것으로, MHC CL Ⅰ, Thy.1, CD 44(BD) 및 CD34 항체에 대하여 양성반응을 나타내었다.

실시예 3: 개 제대혈 및 개 태아의 심장 유래 다분화능 성체 줄기세포의 골형성 세포로의 분화

상기 실시예 1에서 수득한 제대혈 및 개 태아의 심장 유래 다분화능 성체 줄기세포액을 초대배양한 다음 P2 상태의 세포를 수거하였다. 그 다음, Beta TCP(Tricalcium phosphate)와 혼합하여 함께 개의 피하 이식에 이소이식을 실시 한 후, 1주, 4주 및 8주에 이식 부위를 생검한 다음, 조직을 처리하여 H&E 염색을 실시하였다.

대조군으로 설정한 TCP만 이식한 군, 개의 척수혈에서 분리한 세포를 함께 이식한 군에 비해, 개의 제대혈 및 개 태아의 심장에서 분리한 세포를 함께 이식한 실험군에서는 도 3에 나타난 바와 같이 유의적으로 높은 비율의 골세포가 새롭게 생성되는 것을 확인하였다. 도 3a는 제대혈 및 개 태아의 심장유래를 TCP와 함께 이식하고 1주 후 이식부위를 생검하여 촬영한 조직사진이고, 도 3b는 8주 후 이식부위를 생검하여 촬영한 조직사진으로, 이식 부위 주변에서 새롭게 골세포가 왕성하게 생성되고 있음을 보여주며, 도 3c는 도 3b를 400배로 확대한 사진으로 골세포가 형성되었음을 관찰할 수 있다.

실시예 4: 개 제대혈 및 개 태아 심장 유래 다분화능 성체 줄기세포의 신경 세포로의 분화

상기 실시예 1에서 수득한 제대혈 및 개 태아의 심장 유래 다분화능 성체 줄기세포액을 초대배양한 다음 P2 상태의 세포를 수거하였다. 그 다음, 수거된 세포를 분화 유도하기 위하여 챔버 슬라이드에 시딩하여 2∼3일 세포부착시킨 후, 1mM β-Mercaptoethanol 이 첨가된 배지조건에서 24시간 preincubation시켰다. 그 후 100uM BHA 및 1% DMSO를 함유하는 배지조건에서 5시간동안 신경세포로 분화를 유도하였다.

도 4a, 4b 및 4c는 각각 신경세포로 분화 유도된 세포가 신경세포의 특이 마커로 알려진 GFAP(glial fibrillary acidic protein), MAP2(microtubule-associated protein2), Tuj1에 대하여 양성 발현하고 있음을 나타낸 것이다.

도 4a는 GFAP 1차항체를 발현하는 본 발명에 따른 성체 줄기세포의 사진(A: GFAP를 발현하고 있는 세포사진, B: Hoechst 염색 사진, C: merge, D: control)이고, 도 4b는 MAP2 1차항체를 발현하는 본 발명에 따른 성체 줄기세포의 사진(A: MAP2를 발현하고 있는 세포사진이며, B: Hoechst 염색 사진, C: merge, D: control), 도 4c는 Tuj1 1차항체를 발현하는 본 발명에 따른 성체 줄기세포의 사진(A: Tuj1을 발현하고 있는 세포사진, B: Hoechst 염색 사진, C: merge, D: control)이고, 도 4d 및 4e는 1차항체를 반응시키지 않은 세포에 2차항체를 반응시킨negative control(A 및 E: 1차항체를 반응시키지 않은 상태에서 2차항체를 반응시킨 세포사진, B 및 F: confocal 현미경의 DIC image, C 및 G: Hoechst 염색방법을 이용하여 세포핵 염색 사진, D: A, B 및 C의 merge, H: E, F 및 G의 merge)을 각각 나타낸 것이다.

신경세포로 분화유도 하지 않은 대조군에서도 상기한 신경세포 관련 마커가 발현하고 있으나, 사람의 골수에서 유래한 분화되지 않은 중간엽 줄기세포(MSC)에서는 GFAP, MAP2, Tuj1이 발현하고 있다는 보고가 있다 (Tatiana et al , Differentiation, 72:319, 2004). 본 발명에 따른 개의 제대혈 및 개 태아의 심장에서 분리된 성체 줄기세포를 실험한 결과, 상대적으로 높은 수준의 발현양이 신경세포 분화유도된 실험군에서 나타났다.

실시예 5: 개 제대혈 및 개 태아 심장 유래 다분화능 성체 줄기세포의 척추 손상 치료

(1) 척수손상을 유도한 실험동물의 손상된 척수부위로의 세포이식

상기 실시예 1에서 수득한 제대혈 및 개 태아 심장 유래 다분화능 성체 줄기세포액을 초대 배양한 다음 P2 상태의 세포를 수거하였다. 척수 손상 치료에 사용되는 모든 동물은 세포이식 전에 혈액, 혈청검사와 흉부 방사선 검사를 하여 마취의 적합 여부를 확인하였다. 자기 공명 영상 검사로 이식할 부위 척수 분절의 상태를 확인한 후, 모든 동물은 전신 마취하에 등쪽 추궁 절제술로 병변부의 척수를 노출한 후 경질막 절제(durotomy)를 하였다. 세포이식은 미세수술현미경 하에 한 마리의 실험동물에 대하여, 200㎕의 멸균생리식염수에 부유시킨 1×10⁶∼1×10⁷개의 세포를 노출된 척수에 직접 주입하였다. 세포주입 후 절개한 경질막 (dura)은 흡습성 봉합사로 봉합하고, 나머지 근육 및 피부는 일반적인 방법으로 봉합하였다.

이식 후, 4주 및 8주가 경과한 후 각 실험 동물군의 Olby score를 측정하고, 세포가 이식된 부위의 MRI사진을 촬영하였다. 세포가 이식된 동물군은, 세포를 넣지 않고 생리식염수를 주입한 대조군(C1∼C5), G-CSF를 주입한 실험군(G1∼G5), 개의 제대혈로부터 유래한 성체줄기세포와 G-CSF를 함께 넣은 실험군(UCB G1∼UCB G5) 및 본 발명에 따른 개의 제대혈 및 개 태아 심장으로부터 유래한 성체 줄기세포를 넣은 실험군(UCB1∼UCB5)으로 나누어 실험하였다. 상기 4개의 실험군으로, 군 당 각 5마리의 실험견이 사용되었다.

도 5에 나타난 기준 표에 근거하여, 4주와 8주차에 상기 실험군들의 Olby score를 측정한 결과, 상기 표 1에 나타난 바와 같이, 대조군(C1∼C5)에 비해 나머지 세 군(G1∼G5, UCB G1∼G5 및 UCB1∼UCB5)의 점수가 높았다. 그 중 개의 제대혈 및 개 태아 심장에서 유래한 성체줄기세포 단독으로 이식한 실험군(UCB1∼UCB5)이 다른 실험군에 비하여 가장 높은 점수를 얻었다.

(2) 만성적인 척수 손상을 입은 동물에 대한 세포 이식

척수손상을 유도한 실험동물의 손상된 척수부위로의 세포이식과 별도로 네 마리의 만성적인 척수 손상을 입은 동물에 대해서 손상된 척수 부위로 개의 제대혈에서 유래한 성체줄기세포를 이식하였다.

도 6에 개략적으로 나타낸 바와 같이, 1번 실험견은 13개월령의 암컷 샤페이 종으로, 교통사고로 인한 요추 3번 추체의 골절로 사고당시 심각한 신경손상으로 어떤 치료도 받지 않은 상태로 13개월동안 후구 완전마비 상태로 지냈다. 세포이식 전에 컴퓨터단층촬영(computed tomography) 및 체성감각유발전위 측정(Somato Sensory Evoked Potential) 검사를 하였으며, 2×10⁴∼2×10⁷개의 세포를 이식하였다.

2번 실험견은 4년령의 수컷 코카스파니엘종으로, 흉추13번과 요추 1번(흉추13번 추간판)에 추간판 탈출증으로 인해 후구 완전마비 상태에서 반측후궁절제술(hemilaminectomy)을 받았다. 그러나 회복되지 못하고 7개월간 후구 완전마비 상태로 지냈다. 자기공명영상(MRI)로 병변부를 확인하였으며 세포이식전 체성감각 유발전위 측정 검사를 하였고, 2×10⁴∼2×10⁷개의 세포를 이식하였다.

3번 실험견은 2년령의 중성화 수컷 페키니즈종으로, 11번요추 추간판탈출증으로 인한 완전후구마비상태로, 수술을 받지 못한 상태였으며 마비된 지 6개월이 지난 상태였다. MRI 검사와 SSEP 검사 후, 1×10⁴∼1×10⁷개의 세포를 이식하였다.

4번 실험견은 2년령의 암컷 말티즈종으로, 교통사고로 인해 요추 13번의 골절로 치료받지 못한 상태로 후구 완전마비된 지 6개월이 경과되어 있었다. 역시 MRI 검사와 SSEP 검사 후, 1×10⁴∼1×10⁷개의 세포를 이식하였다.

(NE: 측정되지 않음, NR: 측정하지 않음)

감각기능을 평가하는 검사인 체성감각유발전위 검사 (Omatosensory evoked potential)로부터 산출한 감각신경전도속도(Nerve conduction velocity)는 상기 표 2에 나타난 바와 같이, 1, 2, 3 및 4번 실험견 모두 세포 이식 전에는 측정이 되지 않았으나, 1,3번 실험견에서는 4주 후부터 측정되기 시작하였고, 16주 경과 후에는 1,2,3번 실험견 모두 정상 속도로 실험결과가 관찰되었다. 4번 실험견은 16주 경과 후에 측정이 가능하였으나 아직 미약한 수준을 보였다. 또한, 4주, 16주 및 32주 경과후의 각 실험견의 상태 및 Olby score는 도 7에 개략적으로 정리한 바와 같다.

도 8에서 나타난 바와 같이, 4번 실험견을 제외한 세 마리 1∼3번 실험견에서 세포이식 후 16주 이상경과 후 Olby score를 측정했을 때, 세포 이식 초기에 비해 현저히 높은 점수를 기록하였다.

또한, MR system (0.2 Tesla magnet (VET-MR®, Esaote, Italy) slice tickness: 5.00 mm, interval 5.00 mm)을 사용하여, 본 발명에 따른 개의 제대혈에서 분리된 다분화능 성체 줄기세포가 척수 손상부위로 이식된 실험견의 transverse T2 강조 영상을 측정하였다. T2 강조영상(T2-weighted image)은 모두 5mm 두께로 scan하였으며, 각 슬라이드의 pixel matrix는 256×176으로 하였다. T2강조영상은 TR : 3800.00 msec, TE : 90.00 msec로, T1강조영상은 TR : 540.00 msec, TE : 26.00 msec동안 측정하였다.

도 9는 상기와 같은 방법으로 측정한, 본 발명에 따른 개의 제대혈에서 분리된 다분화능 성체 줄기세포가 척수 손상부위로 이식된 실험견의 transverse T2 강조 영상으로, 좌측(A)은 세포 주입전이며, 우측(B)은 세포주입 후의 transverse T2 강조 영상이다. 세포 주입 후 16주 경과한 실험견에서 우측 등쪽 섬유단의 운동신경로 부위에 두드러졌던 고신호 음영이 감소한 것이 관찰되었다. 도 9에서 화살표(arrow)는 T2 강조영상에서 고신호를 보이는 척수부위를 가리키는 것이고, 화살표의 머리부분(arrow head)은 증가한 축 위 근육을 나타낸 것이다. 또한, 몸통을 이루는 척추 양쪽의 몸통 축위 근육이 상당량 증가한 것으로 나타났다. 상기 실험결과로부터, 본 발명에 따른 다분화능 성체 줄기세포가 개의 손상된 신경 치료에 우수한 효과를 나타냄이 입증되었다.

이상 상세히 기술한 바와 같이, 본 발명에 따른 성체 줄기세포는 개의 제대혈 및 개 태아의 심장에서 유래한 것으로서, 사람의 간엽세포 성격과 매우 유사한 성격을 가지고 있으면서도, 사람 제대혈 유래 간엽세포보다 초기 단계에 왕성한 세포 성장을 하므로 개의 난치병, 불치병 치료에 유용하게 사용될 수 있고, 골형성 세포 및 신경세포로 분화하는 능력을 가지고 있어, 근골격계 질환 및 뇌 신경계 질병 등의 치료에 효과적이다.

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (16)

1. 개의 제대혈 및 개 태아의 심장 유래 혈액에서 분리한 유핵세포를 FBS 함유 배지에서 배양하여 수득되는 것을 특징으로 하는, 다음과 같은 특성을 나타내는 성체 줄기세포의 제조방법:

   (a) MHC CL Ⅰ, Thy.1 및 CD44(BD)에 대하여 적어도 하나 이상의 양성 면역학적 특성을 나타내고, 동시에 CD34에 대하여 모두 음성 면역학적 특성을 나타냄;

   (b) 플라스틱에 부착되어 성장하며, 선형태(spindle-shape)의 형태학적 특성을 나타냄; 및

   (c) 내배엽, 외배엽 및 중배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가짐.
2. 제1항에 있어서, 상기 배지는 DMEM이고, 1∼30% FBS를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제1항 또는 제2항의 방법에 의하여 제조되고, 다음과 같은 특성을 가지는 성체 줄기세포:

   (a) MHC CL Ⅰ, Thy.1 및 CD44(BD)에 대하여 적어도 하나 이상의 양성 면역학적 특성을 나타내고, 동시에 CD34에 대하여 모두 음성 면역학적 특성을 나타냄;

   (b) 플라스틱에 부착되어 성장하며, 선형태(spindle-shape)의 형태학적 특성을 나타냄; 및

   (c) 내배엽, 외배엽 및 중배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가짐.
4. 제3항에 있어서, 상기 성체 줄기세포는 초기단계에 왕성한 세포 성장을 하는 것을 특징으로 하는 성체 줄기세포.
5. 제3항에 있어서, 상기 중배엽 유래 세포는 골형성 세포인 것을 특징으로 하는 성체 줄기세포.
6. 제3항의 성체 줄기세포를 TCP(Tricalcium phosphate)와 혼합하여 동소이식 또는 이소이식하는 것을 특징으로 하는 성체 줄기세포를 골형성 세포로 분화시키는 방법.
7. 제3항의 성체 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 근골격계 질환 치료용 세포 치료제.
8. 제6항의 방법에 의해 분화된 골형성세포를 유효성분으로 함유하는 근골격계 질환 치료용 세포 치료제.
9. 제3항에 있어서, 상기 중배엽 유래 세포는 신경 세포인 것을 특징으로 하는 성체 줄기세포.
10. 제9항에 있어서, 상기 신경 세포는 뇌신경세포인 것을 특징으로 하는 성체 줄기세포.
11. 제3항의 성체 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 신경계 질환 치료용 세포 치료제.
12. 제11항에 있어서, 상기 신경계 질환은 뇌경색, 치매, 파킨슨병 및 척수손상으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 세포 치료제.
13. 제3항의 성체 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 개의 난치성 질환 치료용 세포 치료제.
14. 다음의 단계를 포함하는 성체 줄기세포를 신경세포로 분화시키는 방법:

    (a) 제3항의 성체 줄기세포를 β-mercaptoethanol을 함유한 DMEM 배지에 전배양하는 단계; 및

    (b) 상기 전배양액을 DMSO 및 BHA로 처리하여 신경분화를 유도하는 단계.
15. 제14항의 방법에 의해 분화된 신경세포를 유효성분으로 함유하는 신경질환 치료용 세포 치료제.
16. 제15항에 있어서, 상기 신경질환은 뇌경색, 치매, 파킨슨병 및 척수손상으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 세포 치료제.

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