KR100739422B1 - 헤파린이 결합된 항석회화성 무세포성 생체조직 이식물 및그 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 헤파린이 결합된 항석회화성 무세포성 생체조직 이식물 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 (a) 인간 이외 동물의 생체조직을 무세포성 생체조직으로 처리하는 단계; (b) 상기 무세포성 생체조직을 글루타르알데히드 용액으로 가교처리하는 단계; 및 (c) 상기 가교처리된 무세포성 생체조직에 헤파린을 결합시키는 단계를 포함하는 헤파린이 결합된 항석회화성 무세포성 생체조직 이식물 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 헤파린이 결합된 항석회화성 무세포성 생체조직 이식물은 항석회화 기능, 생체 내 내구성, 혈액친화성(blood compatibility) 및 조직친화성(tissue compatibility)이 우수하여 인공심장판막, 조직혈관 및 순환계 수술용 패치(Patch), 조직재생막 및 조직충진제 등 무세포성 생체조직 이식물로 유용하게 사용될 수 있다.

헤파린, 항석회화(calcification-resistance), 혈액적합성(blood compatibility), 조직적합성(tissue compatibility), 인공심장판막(artificial cardiac valve), 수술용 조직 패치, 조직재생막, 조직충진제

Description

헤파린이 결합된 항석회화성 무세포성 생체조직 이식물 및 그 제조방법{Calcification-resistant heparinized acellular bioprosthetic tissue implant and preparation method thereof}

[산업상 이용 분야]

본 발명은 헤파린이 결합된 항석회화성 무세포성 생체조직 이식물 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 항석회화 기능, 생체 내 내구성, 혈액친화성(blood compatibility) 및 조직친화성(tissue compatibility)이 우수하여 인공심장판막, 조직혈관 및 순환계 수술용 패치(Patch), 조직재생막 및 조직충진제 등 무세포성 생체조직 이식물로 유용하게 사용될 수 있는 헤파린이 결합된 항석회화성 무세포성 생체조직 이식물 및 그 제조방법에 관한 것이다.

[종래 기술]

생체조직 이식물 (bioprosthetic tissue implants)이란 사람 또는 동물의 생체조직을 화학적으로 처리하여 면역특성을 제거하고 특정 기능을 부여한 것을 질병 등으로 손상된 사람의 조직이나 장기에 이식할 수있는 생체조직을 말한다. 상기 생체조직 이식물의 제조를 위한 동물의 생체조직으로는 돼지의 대동맥 판막(porcine aortic valve)이나 심막(porcine pericardium), 소의 심막(bovine pericardium) 및 소 또는 돼지의 경막(dura mater)들이 일반적으로 사용되 고 있다.

상기 동물의 생체조직을 임상적으로 사용하기 위해서 이식된 생체조직이 숙주에 의한 면역 거부반응을 유도하지 않는 상태에서 강도와 유연성을 유지할 수 있는 방법이 필요하다. 현재, 임상용 생체조직의 일반적인 제조방법은 먼저 생체조직을 채취하여 행크 용액(Hanks Solution)으로 씻어 가용성 항원물질을 제거한 뒤에, 글루타르알데히드 완충용액으로 화학처리(개질)하여 생체조직 중에 포함된 당단백질의 아미노기들과 글루타르알데히드를 가교결합(corsslinking)시킨 후 수산화붕소나트륨(NaBH₄)으로 환원시켜 생체조직을 안정화시키는 방법이다(A. 카펜티어, Biological Tissue in Heart Replacement, M.I. Ionescu et all. (Eds), Butterworth, London, 1972).

상기와 같이 제조되는 대표적인 생체조직 이식물로는 생체조직 심장판막(tissue heart valve), 수술용 조직패치, 조직혈관(bioprosthetic vascular graft), 인대, 힘줄 대체조직(ligament and tendon substitute) 등이 있다.

그 중 현재 상업적으로 사용되는 인공심장판막은 크게 기계식 판막과 생체조직 판막으로 나눌 수 있다. 기계식 판막은 내구성이 뛰어나지만, 혈전형성 (thrombogenesis)이 수반되므로 항응혈제(anticoagulants)를 복용해야 한다. 반면, 생체조직 판막은 기능 및 형태가 생체와 유사하여 혈전 형성율이 아주 낮아서 항응혈제를 복용할 필요가 없는 등 기계식 판막에 비하여 우수하나, 체내내구성이 취약하고, 판막첨판의 비후단축, 특히 병리적 석회화로 인하여 이식 후 판막의 유연성이 떨어지는 결함이 있다.

또한 생체조직으로 널리 사용되는 수술용 조직패치는 선천적 이상이나 질병 또는 사고로 손상된 심장, 혈관, 조직의 결함부위를 보강, 대체하기 위하여 사용되고 있는데, 현재 인조 합성패치(Synthetic patch) 및 동물의 조직패치(xenograft tissue patch)가 사용되고 있다. 이 중에서 동물의 조직패치는 우수한 혈액적합성(blood compatibility) 및 조직적합성을 가지고 있으나, 상기 생체조직 판막과 같이 생체 내에서 석회화에 의하여 내구성이 떨어지는 단점이 있다.

또한 생체조직으로 널리 사용되는 조직혈관은 고분자 인조혈관과 함께 손상된 혈관을 대체하기 위하여 사용되고 있다. 이 외에 동물의 생체조직을 이용하여 인대, 힘줄 등 조직대체 이식물로 사용되며 조직 재생, 상처 치유 및 약물 전달 체계용으로 응용할 수 있다.

그러나 이러한 생체조직 이식물은 숙주에 의한 면역반응을 피하고 유연성 및 강도를 유지할 수 있으나, 장기간 사용할 경우 석회화에 의하여 내구성이 떨어지는 단점이 있다.

이상 설명한 생체조직 심장판막(tissue heart valve), 수술용 조직패치, 조직혈관(bioprosthetic vascular graft), 인대, 힘줄 대체조직(ligament and tendon substitute) 등의 생체조직의 공통적인 문제점으로 석회화를 들 수 있는데, 석회화(Calcification)란 체내에 이식된 재료 내부에 수산화인회석(hydroxyapatite, Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂)과 같은 인산칼슘 또는 탄산칼슘과 같은 칼슘화합물이 침착되는 것을 말하며, 이로 인하여 생체 조직재료의 물성, 특히 유연성이 떨어지고 결국 파괴 및 생체 내 분해를 일으킨다.

현재까지 석회화의 발생기전(mechanism)은 명확히 밝혀지지 않고 있으나, ⅰ)생체조직 처리과정 및 그에 사용된 화합물, 특히 글루타르알데히드의 부작용 및 미반응 잔여 글루타르알데히드, ⅱ)조직의 화학적 구조의 변경 및 인체(숙주)의 면역 반응, ⅲ) 단백질 및 순환하고 있는 세포의 흡착 등 복합적인 원인에 의하여 석회화가 일어나는 것으로 밝혀져 있다.

특히, 화학적으로 처리하지 않은 생체조직이 체내 분해도는 크지만, 석회화가 크게 감소한다는 사실로부터 글루타르알데히드 처리법 자체가 석회화의 일차원인으로 지적되어, 글루타르알데히드 대신에 카보디이미드 도는 폴리에틸렌글리콜 디글리세리딜 에테르와 같은 디에폭시 화합물로 가교처리하는 방법이 연구되었으나(T. Okoshi 등, TASAIO, 35, 411, 1990), 생체내 안정성 및 혈액적합성에 있어 추가 연구가 필요한 실정이다. 또한 석회화를 일으키는 칼슘이온이 양이온이므로, 프로타민을 결합하거나(G.Golomb 등, J.Biomed. Mater. Res., 25, 85, 1991) 또는 알루미늄(C.L. Webb등, TASAIO, 34, 855, 1988), 철화합물(M. Bailwin 등, Trans. Soc. Biomat., 14,61, 1991)과 같은 양이온을 생체조직에 미리 도입하여 전기적 반발력으로 칼슘의 흡착을 억제하려는 방법도 연구된 바 있다.

또한, 콘드로이틴황산염과 같은 음이온 다당류(G.M. Bernacca 등, Biomaterials, 13, 345, 1992)나 키토산(J.Chanda 등, Biomaterials, 15, 465, 1994), 아세틸살리실산(미국특허 4,838,888), 아크릴산 또는 아크릴에스테르(미국특허 4,770,665), 아미노올레산(WO 89/06945) 생리적 석회화 억제제인 디포스포네이트(R.J. Levy 등, Circulation, 81, 349, 1985), 황산도데실나트륨과 같은 세척제(R.J. Levy 등, CRC Crit. Rev. Biocompat., 2, 147, 1986), 술폰산화폴리에틸렌옥시드(한국특허공보 제1996-3746호 및 제1998-66242호)를 도입하는 방법이 제안된 바도 있다.

그러나 상기 방법들은 제조 공정이 용이하지 않을 뿐 아니라, 제안된 화합물들은 생체내 안정성 및 혈액적합성이 검증되지 못하여 임상적으로 사용하기에는 추가 연구가 필요한 실정이다.

이를 개선하기 위하여 글루타르알데히드로 개질된 생체조직에 생리 항혈전성 물질인 헤파린을 결합시킨 생체조직 이식물(대한민국특허공개 제2001-38908호)이 제안된 바 있고, 또한 글루타르알데히드로 개질된 생체조직에 생체조직 아미노산의 하나인 아르기닌을 화학적으로 결합시킨 생체조직 이식물(대한민국특허공개 제2004-0070988호)이 제안된 바 있으나, 지금까지 인간 또는 동물로부터 추출된 생체조직에 무세포성 생체조직 처리를 한 후 항혈전성 물질인 헤파린을 결합시킨 생체조직 이식물에 대하여 소개된 바는 없었다.

본 발명은 상술한 석회화 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 본 발명의 구체적인 목적은 항석회화 기능, 생체 내 내구성, 혈액친화성(blood compatibility) 및 혈관생성 촉진 기능이 우수하여 인공심장판막, 순환계 수술용 패치(Patch), 조직혈관, 피부재생 등 무세포성 생체조직 이식물로 유용하게 사용될 수 있는 헤파린이 결합된 항석회화성 무세포성 생체조직 이식물 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 또한 상기 방법으로 제조된 헤파린이 결합된 항석회화성 무세포성 생체조직 이식물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

(a) 인간 이외 동물의 생체조직을 무세포성 생체조직으로 처리하는 단계;

(b) 상기 무세포성 생체조직을 글루타르알데히드 용액으로 가교처리하는 단 계; 및

(c) 상기 가교처리된 무세포성 생체조직에 헤파린을 결합시키는 단계

를 포함하는 헤파린이 결합된 항석회화성 무세포성 생체조직 이식물 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 방법으로 제조된 헤파린이 결합된 항석회화성 무세포성 생체조직 이식물을 제공한다.

이하 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

본 발명자들은 인간 이외 동물로부터 추출한 생체조직에 무세포성 생체조직 처리를 한 후 헤파린을 결합시켰을 경우 종래 무세포성 생체조직 처리를 하지 않은 생체조직에 헤파린을 결합한 생체조직 이식물에 비하여 항석회화 기능, 생체 내 내구성, 혈액친화성(blood compatibility) 및 조직적합성(tissue compatibility)이 우수함을 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명의 헤파린이 결합된 항석회화성 무세포성 생체조직 이식물 제조방법은 첫째, 인간 이외 동물의 생체조직을 무세포성 생체조직으로 처리하는 단계; 둘째, 상기 무세포성 생체조직을 글루타르알데히드 용액으로 가교처리하는 단계; 및 셋째, 상기 가교처리된 무세포성 생체조직에 헤파린을 결합시키는 단계로 이루어진다. 이하 상기 세 가지 단계에 대하여 보다 상세히 설명하기로 한다.

첫째, 인간 이외 동물의 생체조직을 무세포성 생체조직으로 처리한다. 본 단계에 적용될 수 있는 인간 이외 동물의 생체조직은 소, 말, 돼지 등으로부터 추출된 생체조직이 바람직하며, 특히 심장판막(cardiac valve), 심막(pericardium) 및 경막(dura mater)이 바람직하다. 본 발명에서는 생체조직을 글루타르알데히드 용액으로 고정 처리하기 전 생체조직에 포함된 세포를 용혈시키고 화학적, 효소적 처리를 통하여 세포내 구성성분을 제거하는 방법으로 생체조직을 무세포성 생체조직으로 처리한다. 세포 용혈과정에서 사용되는 용액으로는 저장 트리스 버퍼(Hypotonic tris buffer, pH 8.0)를 이용하며, 단백질 분해효소 억제제로는 페닐메틸설포닐플루오라이드(Phenylmethyl-sulfonyl fluoride)가 바람직하다. 상기 단백질 분해효소 억제제를 포함하는 저장 트리스 버퍼 용액을 이용하여 무세포성 생체조직을 처리하고, 1% 옥틸페녹시폴리에톡시에탄올(octylphenoxypolyethoxyethanol, Triton X-100)을 함유한 단백질분해효소 억제제를 포함하는 저장 트리스 버퍼 용액에 처리한 후 행크 용액으로 세척한다. 본 단계는 사용되는 무세포성 생체조직에 따라 수회 반복될 수 있다. 생체조직 중에 잔존하는 핵산은 1% Triton X-100이 함유된 단백질분해효소 억제제를 포함하는 저장 트리스 버퍼 용액으로 처리함과 동시에 리보뉴클리아제(ribonuclease) 및 디옥시리보뉴클리아제(deoxyribonuclease)와 같은 효소로 처리함으로써 분해(degradation)시킨다. 이 후, 행크 용액으로 세척하고 1% SDS 용액으로 처리하여 무세포성 생체조직 내부에 잔존하는 구성성분을 제거한다.

이렇게 처리된 무세포성 생체조직은 잔존하는 세포를 제거하여 콜라겐 매트 릭스로써 응용함으로써 세포성 생체조직이 가지는 단점인 이물반응과 면역반응에서의 문제점을 개선할 수 있으며, 최대 인장강도와 최대 연신율이 증가함을 보여 물리적 성질 또한 개선되는 효과가 있다. 이처럼 무세포성 생체조직으로 처리한 후 염색을 통해 광학현미경 (Light Microscopy)을 이용하여 세포의 잔존 여부를 확인할 수 있으며, 셀이 존재하는 부분의 면적이 전체 면적의 0.1%를 넘지 않는 것이 바람직하다.

둘째, 무세포성 생체조직을 글루타르알데히드 용액으로 가교처리한다. 상기 추출된 무세포성 생체조직은 조직을 훼손하지 않는 안정적인 pH 조건에서 보존되어 처리되어야 할 필요가 있다. 본 발명에서는 종래 사용되고 있는 방법(카펜티어 등)에 따라 상기 무세포성 생체조직의 기계적 물성 개선, 체내분해 감소, 면역반응에 의한 부작용 제거 및 살균을 위하여 글루타르알데히드 수용액으로 처리하였다. 무세포성 생체조직을 처리에 사용되는 글루타르알데히드 수용액의 농도는 0.05~1.5%가 바람직하고, 0.1~1.0%가 더욱 바람직하다. 만약 글루타르알데히드 수용액의 농도가 0.05% 미만이면 상기한 글루타르알데히드 용액 처리에 따른 가교반응 효과를 기대하기 힘들고, 1.5%를 넘게 되면 가교반응이 급속하게 진행되어 글루타르알데히드가 무세포성 생체조직과 균일하게 가교되지 못하는 문제점이 발생한다.

또한 글루타르알데히드 수용액으로 무세포성 생체조직을 처리하는 경우의 pH는 7.0 내지 7.6이 바람직하고, 7.1 내지 7.5가 보다 바람직하다. 이를 위해서 글 루타르알데히드 수용액을 적절한 완충용액(buffer solution)과 함께 처리하는 것이 바람직하다. 이러한 완충용액의 조건으로는 상기 무세포성 생체조직의 글루타르알데히드 처리 또는 보관을 위하여 안정성이 뛰어나야 하며, 글루타르알데히드에 의한 가교반응에 간섭하지 않는 불활성이며 완충능력이 뛰어나야 바람직하며, 대표적으로 인산염 완충식염수(phosphate buffered saline, PBS, pH 7.4, 0.01~0.02M)를 사용할 수 있다.

셋째, 상기 가교처리된 무세포성 생체조직에 헤파린을 결합시킨다. 상기 글루타르알데히드 용액으로 가교처리된 무세포성 생체조직은 글루타르알데히드 용액으로 가교처리 및 보존 공정에서 미반응 글루타르알데히드가 생체재료에 잔류하게 되고, 이 미반응 글루타르알데히드가 바로 생체 재료의 석회화를 일으키는 주요 원인으로 지목되고 있다. 따라서 아미노기를 함유하는 적당한 화합물로서 미반응 글루타르알데히드기를 제거하는 방법들이 항석회화 효과를 나타내는 것으로 보고 되었으며, 키토산(J. Chanda 등, Biomaterials, 15, 465 (1994) 참조), 아미노올레인산 (WO 89/06945 참조), 아미노폴리에틸렌옥시드술폰산(김 영하 등, 한국특허 131046 및 181691 참조) 등이 대표적인 예이다.

그러나 상기 항석회화용 아미노기 함유 화합물들은 체내 이식물에 사용된 예가 거의 없으므로 안정성을 검증할 필요가 있다. 이에 반하여, 본 발명에서 사용된 헤파린은 체내에서 합성되는 다분산성 천연다당류로서 현재 임상에서 대표적 항혈 전제로 사용되고 있는 안전한 화합물이다. 헤파린은 종류에 따라 2,000 내지 5,000의 저분자 헤파린 및 7,000 내지 20,000의 고분자 헤파린이 있고, 저분자 헤파린이 고분자 헤파린에 비하여 항혈전성이 높은 것으로 보고 되고 있다(R.D. Rosengerg, Heparin: New Biochemical and Medical Aspects, Witt Ed., Walter de Gruyter, Berle (1983) 참조).

본 발명의 방법에 사용되는 헤파린의 농도는 0.05 내지 20 %가 바람직하며, 0.1 내지 10 %가 더욱 바람직하다. 헤파린의 농도가 0.05 % 미만이면 농도가 너무 작아서 헤파린 처리효과가 저감되며, 20 %를 초과하면 고가의 헤파린 처리효과가 비례하여 증가하지 않아 경제적이지 못하다는 문제점이 있다.

또한 본 발명에 있어서는 경우에 따라 헤파린을 산화 등 적당한 방법으로 분해한 것을 사용할 수도 있다. 헤파린의 산화에 대해서는 문헌[J. Chanda 등, Biomaterials, 15, 465 (1994)]에 자세히 기재되어 있다.

헤파린의 구조는 다당류 골격에 많은 술폰산기(항혈전성 발현) 이외에 상당한 농도의 아미노기와 카르복실산기를 함유하므로, 알데히드기와 반응하여 각각 쉬프(Schiff) 염기 및 아세탈화합물로 결합될 수 있다(R.D.Rosenberg, Heparin: New biomedical and medical aspects, W.de Gruyter, Berlin (1983) 참조). 헤파린 결 합과정 중 생성된 쉬프 염기는 수소화붕소나트륨(NaBH₄)을 써서 환원하여 안정화시키는 것이 바람직하다. 쉬프염기 환원에 사용되는 수소화붕소나트륨의 농도는 0.001 N 내지 1 N이 바람직하며, 0.005 N 내지 0.5 N이 더욱 바람직하다. 만일 수소화붕소나트륨의 농도가 0.001 N 미만이면 환원반응이 충분하지 못하며, 1 N을 초과하면 환원효과가 비례하여 증가하지 않는다는 문제점이 있다.

이상 설명한 방법으로 제조된 항석회화성 무세포성 생체조직 이식물은 필요에 의하여 적당한 처리(PBS 세척, 아미노산 용액 세척, 메탄올 처리)를 하여 심장판막, 외과/순환계/치과 분야의 수술용 조직 패치, 조직 혈관, 조직 힘줄, 인대, 조직공학용 다공성 지지체로 사용될 수 있다.

이하, 본 발명의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 본 발명이 이들 실시예에 의하여 제한되는 것은 아니다.

(실시예 1)

무세포성 처리 및 글루타알데히드 가교 처리

소에서 추출한 심막을 행크(Hanks') 용액 내에 보존하고 식염수로 추가의 혈액과 조직을 제거한 후 멸균실에서 심막에 부착된 두터운 지방층을 제거한 다음 페닐메틸설포닐플루오라이드(Phenylmethyl-sulfonyl fluoride, 0.35mg/L)를 포함한 저장 트리스 버퍼(Hypotonic tris buffer, pH 8.0) 용액에 24시간 동안 4℃에서 균일한 속도로 교반하여 세포를 용혈(lysis)시켰다. 다음 단계로 1% 옥틸페녹시폴리에톡시에탄올(octylphenoxypolyethoxyethanol, Triton X-100)을 함유한 단백질분해효소 억제제를 포함하는 저장 용액에 4℃에서 24시간 처리하고 행크용액으로 세척하였다. 세 번째 단계로 리보뉴클리아제(ribonuclease) 용액 및 디옥시리보뉴클리아제(deoxyribonuclease) 혼합용액으로 시료를 37℃에서 3시간 처리하고, 1% 옥틸페녹시폴리에톡시에탄올(octylphenoxypolyethoxyethanol, Triton X-100)을 함유한 단백질분해효소 억제제를 포함하는 저장 tris buffer 용액에 4℃에서 48시간 처리하였다. 마지막으로 행크용액에 세척하고 1% SDS 용액으로 처리한 후 행크용액에 보관하였다. 그 다음 처리된 심막 생체조직을 PBS로 여러 번 세척한 후 0.625% 글루타르알데히드 용액 내에 3일 동안 담가 놓은 다음 다시 PBS로 세척을 반복하였다.

무세포성 조직의 헤파린 고정화 반응

얻어진 무세포성 조직을 2.5%의 헤파린(미국 시그마사, 분자량 4,000, 활성도 100 unit/mg)이 녹아 있는 완충용액(pH 11.0)에서 4℃에서, 2일 동안 반응시켰다. 헤파린이 고정화 처리된 생체조직을 0.01M PBS로 여러 번 수세한 후 0.01N NaBH₄ 용액에 4℃에서, 16 시간 넣어 환원시켰다.

(비교예 1)

소에서 추출한 심막을 행크(Hanks') 용액 내에 보존하고 멸균실에서 심막에 부착된 두터운 지방층을 제거한 다음 암소에서 24시간 동안 유지하여 가용성 단백질을 제거하였다. 처리된 생체조직을 PBS 용액으로 세척한 후 0.4% 글루타르알데히드 용액 내에 10시간 동안 담가 놓은 다음, 2.5%의 저분자량 헤파린(미국 시그마사, 분자량 4,000, 활성도 100 unit/mg) 완충용액(pH 11.0)에서 4℃에서, 2일 동안 반응시켰다. 헤파린이 고정화처리된 생체조직을 PBS로 여러 번 수세한 후 0.01N NaBH₄ 용액에 4℃에서, 16 시간 넣어 환원시켰다.

(비교예 2)

소에서 추출한 심막을 행크용액에 보존하고 심막에 부착된 두터운 지방층을 제거한 다음 페닐메틸설포닐플루오라이드(Phenylmethyl-sulfonyl fluoride)를 포함한 저장 트리스 버퍼(Hypotonic tris buffer, pH 8.0) 용액에 24시간 동안 4℃에서 처리하여 세포를 용혈(lysis)시켰다. 다음 단계로 1% 옥틸페녹시폴리에톡시에탄올(octylphenoxypolyethoxyethanol, Triton X-100)을 함유한 단백질분해효소 억제제 포함하는 저장 용액에 4℃에서 24시간 처리하고 행크용액으로 세척하였다. 세 번째 단계로 리보뉴클리아제(ribonuclease) 용액 및 디옥시리보뉴클리아제(deoxyribonuclease) 혼합용액으로 시료를 37℃에서 3시간 처리하고, 1% 옥틸페녹시폴리에톡시에탄올(octylphenoxypolyethoxyethanol, Triton X-100)을 함유한 단백 질분해효소 억제제를 포함하는 저장 tris buffer 용액에 4℃에서 24시간 처리하였다. 마지막으로 행크용액에 세척하고 1% SDS 용액으로 처리한 후 행크용액에 보관하였다. 그 다음 처리된 심막 생체조직을 PBS로 여러 번 세척한 후 0.4% 글루타르알데히드 용액 내에 10시간 동안 처리하였다. 그 다음 2%의 아르기닌 용액(pH 11.0)에서 4 ℃에서, 2일 동안 반응시켰다. 아르기닌이 고정 처리된 심막 생체조직을 PBS로 여러 번 수세한 다음 0.01N 수소화붕소나트륨 용액에 4 ℃에서 16시간 넣어 환원시켰다.

(물성 평가)

본 발명의 무세포성 생체조직 이식물의 물리적, 화학적 특성은 수축온도(shrinkage temperature), 기계적 인장강도와 연신도, 콜라젠 분해효소(Collagenase)를 이용한 분해성, 동물 피하근육 이식 실험에 의한 석회화 특성을 통하여 측정하였다.

수축온도는 시차주사식열량분석기(Differential Scanning Calorimeter, DSC, TA 인스트루먼트사, DSC 2010)로 2 ℃/분 승온시키며 측정하였는데, 수축온도가 높을수록 무세포성 생체조직의 안정성이 큰 것을 의미한다.

또한 인장강도는 인장시험기(인스트론사, 모델 8511), 로드 셀(load cell) 50㎏으로 측정하였다. 또한 콜라젠분해성은 조직 약 1㎎을 콜라젠 분해효소 (Clostridium histolyticum Type II, 활성도 357 unit/㎎, 미국 시그마사) 용액을 이용하여 37 ℃에서 36시간 분해시킨 후 잔량을 건조 정량하였다(박기동 등, Biomaterials, 18, 47, 1997).

또한 동물 피하근육 이식실험은 처리된 무세포성 생체조직 패치(크기 1㎝ㅧ 1.5㎝)를 쥐(Sprague-Dawley rat, 수놈 생후 5주, 체중 150~180g)의 등 부위 피부와 근육사이의 피하근육에 이식하고, 8주 후에 꺼내서 6N 염산 용액으로 가수분해한 시료를 유도 결합 플라즈마(Inductively coupled plasma, ICP, Jovin Yvon사, 138 Ultrace)를 이용한 칼슘 정량에 의하여 수행되었다.

또한 침착된 칼슘의 양은 건조된 조직 중량(㎎)당 칼슘의 양(㎍)으로 표시하였다. 순환계 이식 석회화 실험은 개(한국산 잡견, 25~30㎏)를 이용하여 방추형으로 제작한 조직 패치를 대동맥 내부에 이식 8주 후에 꺼내어 침착된 칼슘의 양을 동일한 방법으로 측정하였다(박기동 등, Biomaterilas, 18, 47, 1997).

하기 표 1에 상기 실시예 1 및 비교예 1~2에서 실험한 결과를 정리하였다.

구분	수축온도 (℃)	콜라젠 분해잔량(%)	최대인장강도 (㎏/㎣)	최대연신율 (%)	침착 칼슘의 양 (㎍/㎎)
실시예 1	90	92	1.96	41	5.9
비교예 1	86	90	1.41	34	6.5
비교예 2	86	91	1.52	34	17.0

상기 표 1에서 보는 바와 같이, 인간 이외 동물의 생체조직을 무세포성 생체조직으로 처리한 후 헤파린을 결합시킨 생체조직 이식물(실시예 1)의 경우 무세포성 생체조직 처리를 하지 않은 생체조직 이식물(비교예 1) 및 무세포성 생체조직 처리 후 아르기닌을 결합시킨 생체조직 이식물(비교예 2)에 비하여 물성(수축온도, 콜라젠분해잔량, 최대인장강도, 최대연신율 및 침착칼슘의 양 )이 우수함을 알 수 있었다. 따라서 본 발명의 방법에 따라 제조된 무세포성 생체조직 처리 후 헤파린을 결합시킨 생체조직 이식물은 항석회화 기능, 생체 내 내구성, 혈액친화성(blood compatibility) 및 조직적합성(tissue compatibility)이 우수하여 인공심장판막, 조직혈관 및 순환계 수술용 패치(Patch), 조직재생막 및 조직충진제 등 무세포성 생체조직 이식물로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

본 발명의 헤파린이 결합된 항석회화성 무세포성 생체조직 이식물은 항석회화 기능, 생체 내 내구성, 혈액친화성(blood compatibility) 및 조직적합성(tissue compatibility)이 우수하여 인공심장판막, 조직혈관 및 순환계 수술용 패치(Patch), 조직재생막 및 조직충진제 등 무세포성 생체조직 이식물로 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (14)

1. (a) 심장판막, 심막 또는 경막 중에서 선택되는 인간 이외 동물의 생체조직을 무세포성 생체조직으로 처리하는 단계;

   (b) 상기 무세포성 생체조직을 pH 7.0 내지 7.6, 0.05 ~ 1.5 볼륨%의 글루타르알데히드 용액으로 가교처리하는 단계;

   (c) 상기 가교처리된 무세포성 생체조직에 헤파린을 결합시키는 단계; 및

   (d) 상기 무세포성 생체조직에 헤파린을 결합시킨 후 0.01 내지 1 N의 수산화붕소나트륨(NaBH₄)으로 쉬프염기를 환원시키는 단계

   를 포함하는 헤파린이 결합된 항석회화성 무세포성 생체조직 이식물 제조방법.
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6. 제1항에 있어서,

   상기 헤파린은 분자량이 2,000 내지 5,000으로 저분자 헤파린인 것을 특징으로 하는 항석회화성 무세포성 생체조직 이식물 제조방법.
7. 제1항에 있어서,

   상기 헤파린은 분자량이 7,000 내지 20,000으로 고분자 헤파린인 것을 특징으로 하는 헤파린이 결합된 항석회화성 무세포성 생체조직 이식물 제조방법.
8. 제1항에 있어서,

   상기 헤파린은 부분적으로 산화된 것임을 특징으로 하는 헤파린이 결합된 항석회화성 무세포성 생체조직 이식물 제조방법.
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