KR100699782B1 - 댕댕이나무 추출물을 포함하는 간 기능 회복용 식품 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 댕댕이나무(Lonicera caerulea L. var. edulis) 추출물을 포함하는 간 기능 회복 효과를 가지는 식품 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물을 이용하여 음료, 과자 등의 식품, 기능성식품, 건강식품 또는 건강보조식품 등을 제조할 수 있다.

간보호제, 간기능회복제, 댕댕이나무, 식품, 기능성식품, 건강식품, 건강보조식품

Description

댕댕이나무 추출물을 포함하는 간 기능 회복용 식품 조성물{Food composition for improving liver function comprising a Lonicera caerulea L. var. edulis extract}

도 1은 HepG2 세포에서 댕댕이나무 열매 추출물 투여에 의한 세포성장에 미치는 영향을 분석한 결과이다.

도 2는 HepG2 세포에서 에틸 알콜 투여에 의한 세포성장에 미치는 영향을 분석한 결과이다.

도 3은 에틸 알콜과 댕댕이나무 열매 추출물을 처리하지 않은 웰을 대조군으로 하여 에틸 알콜만을 처리한 웰l에서의 흡광도와 에틸 알콜을 처리한 각 웰에서 댕댕이나무 열매 추출물을 가한 웰에서의 흡광도를 비교 측정한 결과이다.

도 4는 SPOTCHEM ^TM II strip 상에서 댕댕이나무 열매 추출물 투여에 의한 간 기능 회복현상을 살펴본 결과이다.

도 5는 급성 간염 유발 마우스에서 댕댕이나무 열매 추출물과 실리마린 투여의 효과를 조직화학적 분석으로 살펴본 결과이다.

본 발명은 댕댕이나무(Lonicera caerulea L. var. edulis) 추출물을 포함하는 간 기능 회복 효과를 가지는 식품 조성물에 관한 것이다.

간은 인체내 소화기계와 전신순환계 사이에 위치하여 외부로부터 들어온 독성 물질로부터 전신을 방어하고 생체외 물질의 대사를 담당하는 중요한 기능을 담당하고 있다. 생체 내로 들어온 생체외 물질은 일단 간을 통과하기 때문에, 간은 영양소 외에도 많은 독성물질에 노출될 위험이 높기 때문에, 다른 장기보다 손상 받을 가능성이 많다.

간 질환은 유발 원인에 따라 알콜 등을 과다복용에 의한 독성 간 질환과 바이러스 감염에 의한 바이러스성 간 질환이 있다. 바이러스성 간 질환은 B형, C형 간염 바이러스 등의 감염에 의하여 발생하며 최근에는 음식이나 의약, 한약재, 알콜 등에 의한 독성 간 질환이 증가추세에 있다. 간 질환은 자각증상이 잘 나타나지 않아 조기에 진단하기 어려우며 자각증상이 나타난 경우에는 상당한 간 손상이 일어난 경우이다. 간조직은 다른 조직에 비해 회복기능이 큰 조직이긴 하나 이미 간세포가 변형이 된 경우에는 회복이 어렵다.

만성 간염이나 간경변의 치료는 현재까지 뚜렷한 치료제가 개발되어 있지 않다. 인터페론과 핵산 아날로그형인 라비뷰딘이 만성간염의 치료제로 사용되고 있 으나, 이들 약품은 바이러스의 활성 억제효능을 발휘하는 약제로 간세포의 기능을 회복시키는 약제는 아니다. 지금까지 간세포의 기능을 회복제로서 전 세계에서 가장 많이 알려진 것으로 가장 것으로 실리마린이 있다. 실리마린은 약용식물인 Carduus marianus Linne Silybum marianum의 학명을 가진 약초에서 추출한 것으로, 기원전부터 고대 그리스를 위시하여 서방 세계에 중요한 약물로서 알려져 왔다. 1970년대에 우리나라에 간장치료제로 소개된 이후 이 성분을 주성분으로 하는 많은 약제가 시판 중에 있다. 실리마린을 주성분으로 함유하는 제제의 경우 이미 임상적으로 간 질환 치료에 널리 응용되고 있지만, 그 주성분인 실리마린은 물에 거의 녹지 않는 난용성 물질로서 경구 투여시 체내 흡수율이 낮은 단점을 가진다. 현재 실리마린 제제는 중독성 간 질환, 만성간염 및 간경화 등의 간 질환 치료의 보조 요법으로 이용되고 있을 뿐이고, 따라서 간세포의 기능을 신속하게 회복시킬 수 있는 물질의 개발은 여전히 요구되고 있는 실정이다.

천연물로부터 유용한 간 기능 개선 효과를 살펴본 연구로는, 한국특허등록 제80759호에서는 간 기능 유지 및 개선에 유용한 발효유 및 그 제조방법에 관해 개시하고 있고, 한국특허공개 제2003-0027615 에서는 헛개나무 열매 추출물을 유효성분으로 함유하는 간 기능 개선 효과와 숙취개선 효능을 가진 기능성 식품조성물에 관해 개시하고 있으며, 한국특허공개 제2003-0011818호에서는 가시오갈피 추출물이 코팅된 기능성 쌀서의 용도에 관해 개시하고 있으며, 한국특허공개 제2003-0063308호에서는 진주초 식물의 추출물을 포함하는 B형 간염 치료제 및 그 제조방법에 관 해 개시하고 있으며, 한국특허공개 제 2004-0018733호에서는 고들빼기 추출물을 함유한 바이러스성 간 질환 치료용 조성물에 대하여 개시한다.

이에 배경하에 상기에서 살펴본 기존의 물질 외에도 우수한 간 질환 치료 활성을 가지는 물질을 천연물로부터 획득하고자 하는 연구의 일환으로, 본 발명자는 손상된 간 세포주에 댕댕이나무 추출물을 첨가하면 간세포 성장이 촉진되며 이에 의해 손상된 간 기능이 회복되는 것을 간 기능의 생화학적 지표로 사용되는 GOT, GPT 수치가 현저하게 감소되는 것으로 확인하고 댕댕이나무 추출물을 포함하는 조성물이 우수한 간 기능 회복 효과를 가지는 것을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 댕댕이나무(Lonicera caerulea L. var. edulis) 추출물을 포함하는 간 기능 회복 효과를 가지는 식품 조성물을 제공하기 위함이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 댕댕이나무(Lonicera caerulea L. var. edulis) 추출물을 포함하는 간 기능 회복용 식품 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, “추출물(extract)"은 천연물로부터 분리된 활성성분을 의미하며, 여기서는 댕댕이나무부터 분리된 물질로 간세포 성장 촉진 효과를 가진다. 추출물은 물, 유기 용매, 또는 이들의 혼합용매를 이용하는 추출과정으로 획득할 수 있으며, 추출액, 이의 건조 분말 또는 이를 이용하여 제형화된 모든 형태를 포함한다.

본 발명에서 용어, “댕댕이나무(Lonicera caerulea L. var. edulis)"란 천연, 잡종 또는 변종 댕댕이나무의 모든 기관, 예를 들어, 뿌리, 가지, 줄기, 잎, 꽃 및 열매를 모두 포함하여 의미하나, 바람직하게는 댕댕이나무의 열매이다. 댕댕이나무 (Lonicera caerulea L. var. edulis)는 꼭두서니목 인동과의 쌍떡잎식물로 높이가 1.5m에 달하는 낙엽관목으로서 가지가 많이 갈라지고 작은 가지의 마디에 방패 모양의 포엽이 있고 나무줄기의 속부분은 흰색이다. 잎은 마주나며 바소꼴이거나 타원형이고 양 끝이 뭉뚝하거나 날카로우며 톱니가 없고 가장자리 및 표면에 짧은 털이 나고 뒷면에 융모가 많다. 꽃은 대개 꽃자루가 짧고 잎겨드랑이에 달리며 꽃부리는 깔때기 모양으로 엷은 황백색이며 여름에 핀다. 꽃받침은 거치처럼 5개로 갈라지며, 화관은 황백색이고 원통상 종형이며 길이 1.2~1.5cm로서 털이 약간 있다. 수술은 암술대보다 짧고 털이 없으며 자방은 2개가 합쳐지고, 열매는 타원형 또는 거의 원형이며, 7~8월에 자흑색으로 익고 백분으로 덮인다. 시베리아, 사할린, 중국 북부, 티베트, 북한 등지에 분포하고 있는 냉대성 식물이다. 본 발명 이전에 댕댕이나무의 간세포의 성장 촉진 및 이에 의한 간 기능 회복 효과를 살펴본 바는 없었다.

간 기능 회복 효과는 조성물 투여에 의하여 손상된 간세포에서 세포 성장이 촉진되는 정도와 간효소 수치, 즉 AST(Aspartate Aminotransferase: GOT)와 ALT(Alanine Aminotransferase: GPT)로 객곽적으로 평가할 수 있다. ALT와 AST는 간세포에 있는 효소로, 간세포가 손상되거나 파괴되면 유출되어 혈중 농도가 증가하게 되므로, ALT와 AST 수치는 간세포 손상에 의한 간 질환의 생화학적 지표로 사용된다.

본 발명의 구체적인 실시에서, 에틸 알코올에 의해 손상된 사람 간세포인 HepG2 세포주에 댕댕이나무 추출물을 첨가하고 간세포 성장 촉진 정도를 댕댕이나무 추출물을 첨가하지 않은 대조구와 비교한 결과, 농도 비례적으로 성장을 촉진시켰다. 댕댕이나무 추출물을 0.25mg/ml의 농도로 첨가하면 약 27%, 0.5mg/ml의 농도로 첨가하면 약 54%의 세포 성장이 촉진되었다. 또한, 간 기능 개선 여부를 ALT와 AST 양 측정으로 살펴본 결과, HepG2 세포주에서 댕댕이나무 추출물 투여에 의하여 ALT, AST 수치가 감소하며 더 나아가, 급성 간염을 유발시킨 마우스에 댕댕이나무 추출물을 투여하면 ALT, AST 수치는 기존의 약제인 실리마린을 투여한 경우보다 25% 이상 회복능이 뛰어난 것으로 나타났다. 상기 결과는 본 발명의 댕댕이나무 추출물의 우수한 간세포 성장 촉진에 의한 간기능 회복 효과를 가지며, 나아가, 간 질환에 대한 에방 및 치료 활성을 가진다는 것을 입증하는 것이다.

본 발명에서 용어, “간 기능 회복”이란 바이러스(예를 들어, A. B, C, D, 또는 E형 바이러스), 알코올, 약물(결핵약, 아스피린, 항생제, 마취제, 고혈압 치료제, 경구피임제 등), 선천적 대사이상 등에 의해 저하된 간의 기능을 개선 또는 복구시키는 것을 의미한다. 예들 들어, 간 기능 저하에 의해 유발된 질환, 예들 들어, 급성 간염, 만성 간염, 간경화 및 지방간 등의 간 질환에 의해 저하된 간 기능을 개선 또는 회복시킬 수 있다.

본 발명에서 댕댕이나무 추출물은 물, 유기 용매, 또는 이의 혼합 용매를 사용하여 추출하는 방법으로 제조된다. 추출한 액은 바로 사용하거나 또는 농축 및/또는 건조하여 사용할 수 있다.

유기용매를 사용하여 추출하는 경우, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, N, N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합용매인 유기용매를 사용하며 생약의 유효 성분이 파괴되지 않거나 최소화된 조건에서 실온 또는 가온하여 추출할 수 있다. 추출하는 유기용매에 따라 약제의 유효성분의 추출정도와 손실정도가 차이가 날 수 있으므로, 알맞은 유기용매를 선택하여 사용하도록 한다. 추출 방법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 냉침 추출, 초음파 추출, 환류 추출 등이 있다.

상기 용매 추출물은 부유하는 고체 입자를 제거하기 위하여 추출물을 여과시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 면, 나일론 등을 이용하여 입자를 걸러내거나 한외여과, 냉동여과법, 원심분리법 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

추출액의 농축에는 감압농축, 역삼투압 농축 등의 방법이 사용될 수 있다. 농축 후 건조 단계는 동결건조, 진공건조, 열풍건조, 분무건조, 감압건조, 포말건조, 고주파건조, 적외선건조 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 경우에 따라, 최종 건조된 추출물을 분쇄하는 공정을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 상기 추출물은 추가의 분획 공정을 수행할 수 있다. 예들 들어, 상기 추출물을 증류수에 현탁시켜 비극성 유기 용매, 예를 들어, 헥산, 에테로, 디클로로메탄, 클로로포름, 에틸아세테이드 또는 이들의 혼합 용매로 비극성용매 가용층을 추출, 분리하여 수득하도록 하고, 이를 농축 및/또는 건조하여 사용할 수 있다.

하나의 구체적 실시에서, 본 발명의 댕댕이나무 추출물은 댕댕이나무, 보다 바람직하게는 나무 열매의 건조 중량(㎏)의 5배 내지 25배, 바람직하게는 7배 내지 15배의 물, C₁ 내지 C₄의 저급 알코올 또는 이의 혼합용매, 바람직하게는 물 또는 물과 에틸 알코올의 혼합용매로; 20 내지 100℃, 바람직하게는 60 내지 100℃ 추출온도에서; 0.5시간 내지 2일, 바람직하게는 1 시간 내지 1일간; 열수 추출, 냉침 추출, 초음파 추출, 환류 추출, 바람직하게는 환류 추출 방법으로; 1회 내지 5회, 바람직하게는 2회 내지 3회 연속 추출하여 수득하였다. 또한, 상기 추출물을 여지로 여과하고 여액을 회전진공농축기로 20 내지 100℃, 바람직하게는 50 내지 70℃에서 감압농축한 후 건조하여 분말 형태의 본 발명의 댕댕이나무 추출물을 제조하였다. 분말 형태의 댕댕이나무 추출물은 그대로 사용되거나 용매에 일정농도로 용해시켜 사용될 수 있다.

상기의 댕댕이나무 추출물은 천연물로부터 획득한 성분을 유효 성분으로 함유하므로 안전하고 독성, 부작용 및 내성을 초래하지 않고 안전하므로 식품 조성물로 사용 가능하다. 실제, 마우스 급성 실험결과 독성을 유발하지 않는 것으로 밝 혀졌다. 또한, 상기 조성물은 인간뿐만 아니라 간 기능이 저하될 수 있는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개 등의 가축에게 사용될 수 있다.

상기 댕댕이나무 추출물은 식품 조성물의 총 중량에 대하여 0.01 내지 100 중량%, 보다 바람직하게는 1 내지 80 중량%로 포함한다. 식품이 음료인 경우에는 100㎖를 기준으로 1~30g, 바람직하게는 3 ~ 20g의 비율로 포함될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B₁, B₂, B₆, B₁₂, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu), 크륨(Cr) 등의 미네랄을 포함할 수 있다. 또한, 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다. 또한, 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 첨가할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용된다.

상기의 댕댕이나무(Lonicera caerulea L. var. edulis) 추출물을 포함하는 간 기능 회복 효과용 식품 조성물을 이용하여 간 기능 회복 효과를 가지는 다양한 종류의 식품을 제조할 수 있다.

구체적인 예로, 상기 조성물을 이용하여 농산물, 축산물 또는 수산물의 특성을 살려 변형시키는 동시에 저장성을 좋게 한 가공식품을 제조할 수 있다. 이런 가공식품에는 예들 들어, 과자, 음료, 주류, 발효식품, 통조림, 우유가공식품, 육륙가공식품, 국수 등을 포함한다. 과자는 비스킷, 파이, 케익, 빵, 캔디, 젤리, 껌, 시리얼(곡물푸레이크 등의 식사대용품류 포함) 등을 포함한다. 음료는 탄산음료, 기능성이온음료, 쥬스(예들 들어, 사과, 배, 포도, 알로에, 감귤, 복숭아, 당근, 토마토 쥬스 등), 식혜 등을 포함한다. 주류는 청주, 위스키, 소주, 맥주, 양주, 과실주 등을 포함한다. 발효식품은 간장, 된장, 고추장 등을 포함한다. 통조림은 수산물 통조림(예들 들어, 참치, 고등어, 꽁치, 소라 통조림 등), 축산물 통조림(쇠고기, 돼지고기, 닭고기, 칠면조 통조림 등), 농산물 통조림(옥수수, 복숭아, 파일애플 통조림 등)을 포함한다. 우유가공식품은 치즈, 버터, 요구르트 등을 포함한다. 육류가공식품은 돈까스, 비프까스, 치킨까스, 소세지. 탕수육, 너겟류, 너비아니 등을 포함한다. 밀봉포장생면 등의 국수를 포함한다. 이 외에도 상기 조성물은 레토르트식품, 스프류 등에 사용될 수 있다.

또한, 상기 조성물을 이용하여 기능성식품, 건강식품 또는 건강보조식품을 제조할 수 있다. 기능성식품, 건강식품 또는 건강보조식품은 영양 기능 외에도 생 리활성 성분을 포함하여 생체조절 기능을 제공하는 식품을 의미하고, 본 발명의 조성물은 간 기능 회복 효과를 가지는 댕댕이나무 추출물을 유효성분으로 포함하므로 기능성식품, 건강식품 또는 건강보조식품 등의 제조에 이용될 수 있다.

본 발명에서 용어,“기능성식품(functional food)"은 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)와 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미한다. 본 발명에서 용어,“건강식품(health food)"은 일반식품에 비해 적극적인 건강유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품(health supplement food)는 건강 보조 목적의 식품을 의미한다. 경우에 따라, 기능성식품, 건강식품, 건강보조식품의 용어는 호용된다. 상기 식품은 간 기능 개선 및 회복에 유용한 효과를 얻기 위하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 다양한 형태로 제조될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 댕댕이나무 열매추출물의 제조

(1-1) 물 용매를 이용한 열수추출법

중국의 연변지역에서 직접 수확한 댕댕이나무 열매를 건조시켜 실험에 사용하였다. 분쇄한 상태의 댕댕이나무 열매 100 g을 1 리터의 증류수에 가하여 잘 교반한 다음 90 내지 95℃를 유지하는 추출온도에서 3시간 동안 환류 추출한 후 여액을 분리하였고 55~65℃로 생약추출물을 감압농축한 후, 동결 건조시켜 생약조성물 분말 엑스 21.2g을 얻었다.

(1-2) 물-알콜 혼합용매를 이용한 열수추출법

상기 실시예 1-1과 같이 분쇄된 댕댕이나무 열매 100 g에 1 리터의 25% 에틸 알콜을 가해 잘 교반한 다음, 열을 가해 80 내지 90℃를 유지하는 추출온도에서 3시간 동안 환류 추출한 후 여액을 분리하였고 55~65℃에서 생약추출물을 감압농축한 후, 동결 건조시켜 생약조성물 분말 엑스 19.5g을 얻었다.

실시예 2 : 댕댕이나무 열매 추출물에 의한 간세포주 성장에 미치는 영향 측정

HepG2 세포를 96 웰 플레이트의 각 웰에 세포수가 1×10⁴개가 되도록 넣고 소아태아혈청(fetal bovine serum)이 10% 포함된 세포배양액으로 16시간 배양하였다. 96 웰 플레이트를 생리식염수로 세척하고 0, 0.125mg, 0.25mg, 0.5mg, 1mg/ml의 농도로 새로운 세포배양액에 실시예 1의 (1-2)에서 제조한 댕댕이나무 열매 추출물을 희석한 용액을 각 웰에 가하였다. 48시간을 배양한 후 각 웰에 있는 세포수를 SRB 방법으로 측정하였다.

48시간 후 96 웰 플레이트에서 댕댕이나무 열매 추출물이 포함된 배양액을 제거하고 생리식염수로 96 웰 플레이트를 세척하고 70% 아세톤으로 각 웰의 세포를 20분간 고정하였다. 고정된 세포는 건조시킨 후에 SRB 용액으로 30분간 염색시키고 염색되지 않은 용액은 1% 초산용액으로 5회 세척하였다. 세척이 끝나면 다시 건조시키고 10mM tris 용액을 가하여 세포단백질과 결합된 SRB를 용해시키고 분광측정기에서 562nm에서의 흡광도를 측정하였다. 결과는 댕댕이나무 열매 추출물을 처리하지 않은 웰을 대조군으로 하여 댕댕이나무 열매 추출물을 처리한 각 웰의 흡광도를 비교하여 백분율로 표시하였다 (도 1). 이 결과에서 보면 댕댕이나무 열매 추출물은 0.5mg/ml의 농도까지는 댕댕이나무 열매 추출물을 처리하지 않은 웰과 비교하여 세포수가 같거나 약간 증가하거나 세포성장에 영향이 거의 없음을 보여주고 있다.

실시예 3. 에틸알콜이 간세포주 성장에 미치는 영향 측정

HepG2 세포를 96 웰 플레이트의 각 웰에 세포수가 1×10⁴개가 되도록 넣고 소아태아혈청(fetal bovine serum)이 10% 포함된 세포배양액으로 16시간 배양하였다. 96 웰 플레이트를 생리식염수로 세척하고 에틸 알콜을 0, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0% (v/v)의 농도가 되도록 세포배양액에 희석하고 HepG2가 배양되어 있는 96 웰 플레이트의 각 웰에 투여하였다. 24시간 동안 에틸 알콜로 세포손상을 유도한 후 에틸 알콜이 포함된 배양액을 제거하고 새로운 배양액을 가하고 48시간을 배양한 후 각 웰에 있는 세포수를 SRB 방법으로 측정하였다.

배양액을 제거하고 생리식염수로 96 웰 플레이트를 세척하고 70% 아세톤으로 각 웰의 세포를 20분간 고정하였다. 고정된 세포는 건조시킨 후에 SRB 용액으로 30분간 염색시키고 염색되지 않은 용액은 1% 초산용액으로 5회 세척하였다. 세척이 끝나면 다시 건조시키고 10mM tris 용액을 가하여 세포단백질과 결합된 SRB를 용해시키고 분광측정기에서 562nm에서의 흡광도를 측정하였다. 결과는 에틸 알콜을 처리하지 않은 웰을 대조군으로 하여 에틸 알콜를 처리한 각 웰의 흡광도를 비교하여 백분율로 표시하였다(도 2). 이 결과에서 보면 댕댕이나무 열매 추출물은 1%의 농도까지는 오히려 에틸 알콜이 세포성장을 촉진하였으나 1.5% 이상의 농도에서는 에틸 알콜에 의하여 세포 수가 감소되는 것을 알 수 있었다.

실시예 4 : 에틸알콜에 의한 세포성장이 억제유도된 세포에서 댕댕이나무 열매 추출물 투여에 의한 성장회복능 측정

HepG2 세포를 96 웰 플레이트의 각 웰에 세포수가 1×10⁴개가 되도록 넣고 소아태아혈청(fetal bovine serum)이 10% 포함된 세포배양액으로 16시간 배양하였다. 96 웰 플레이트를 생리식염수로 세척하고 에틸 알콜을 1.5% (v/v)의 농도가 되도록 세포배양액에 희석하고 HepG2가 배양되어 있는 96 웰 플레이트의 각 웰에 투여하였다. 24시간 동안 에틸 알콜로 세포손상을 유도한 후 에틸 알콜이 포함된 배양액을 제거하고 0mg, 0.125mg, 0.25mg, 0.5mg, 1mg/ml의 농도로 새로운 세포배양액에 실시예 1의 (1-2)에서 제조한 댕댕이나무 열매 추출물을 희석한 용액을 각 웰에 가하였다. 48시간을 배양한 후 배양액을 제거하고 생리식염수로 96 웰 플레이트를 세척하고 70% 아세톤으로 각 웰의 세포를 20분간 고정하였다. 고정된 세포는 건조시킨 후에 SRB 용액으로 30분간 염색시키고 염색되지 않은 용액은 1% 초산용액으로 5회 세척하였다. 세척이 끝나면 다시 건조시키고 10mM tris 용액을 가하여 세포단백질과 결합된 SRB를 용해시키고 분광측정기에서 562nm에서의 흡광도를 측정하였다. 결과는 에틸 알콜과 댕댕이나무 열매 추출물을 처리하지 않은 웰을 대조군으로 하여 에틸 알콜만을 처리한 웰에서의 흡광도와 에틸알콜을 처리한 각 웰에서 댕댕이나무 열매 추출물을 가한 웰에서의 흡광도를 비교 측정하였다 (도 3).

1.5% 에틸 알콜의 농도에서는 에틸 알콜을 투여하지 않은 웰에 비해 흡광도 비율이 22%가 감소하였으나 댕댕이나무 열매 추출물을 에틸알콜을 투여하였던 웰에 처리하면 0.5mg/ml의 농도까지는 댕댕이나무 열매 추출물의 농도 증가에 비례하여 흡광도도 증가하였다. 따라서 댕댕이나무 열매 추출물을 처리한 웰에서는 에틸 알콜에 의한 손상에서 세포성장이 회복되고 있음을 알 수 있다.

따라서 에틸 알콜에 의하여 세포손상이 유도된 세포에서 댕댕이나무 열매 추출물 투여에 의해 세포성장이 회복된 정도를 수학식 1에 따라 구하여 표 1로 나타내었다.

표 1의 결과에서 에틸 알콜 투여(1.5%의 농도 조건)에 의하여 세포손상이 유도된 세포에서 댕댕이나무 열매 추출물 농도 0.125mg/ml에서는 20.45±7.72%, 0.25mg/ml 농도에서는 27.14±8.14%, 0.5mg/ml 농도에서는 54.77±3.37%의 손상된 세포가 회복되었다. 따라서 간세포 손상에서 댕댕이나무 열매 추출물은 간세포 성장을 촉진함으로써 간 조직의 기능을 회복시키는 약제로 작용함을 알 수 있었다.

실시예 5 : 에틸알콜 투여에 의해 손상된 간세포주에서 댕댕이나무 열매 추출물에 의한 간 기능 회복

사람 간세포의 일종인 Hep3B 세포를 96 웰 플레이트 의 각 웰에 2×10⁴개로 넣고 12시간 동안 배양하여 세포들을 플레이트의 바닥에 부착시킨 후에 배양상등액을 제거하고 인산완충용액으로 세척하였다. 새로운 배양액에 에틸 알콜을 가하여 에틸 알콜의 최종 농도가 5% 되게 한 배양액을 각 웰에 넣고 12시간 배양하여 세포의 손상을 유도하였다. 각 웰에서 배양액을 제거하고 실시예 1의 (1-2)에서 제조한 댕댕이나무 열매 추출물을 포함한 배양액(0.3mg/ml)과 포함하지 않은 배양액을 각각 에틸 알콜을 가하여 세포의 손상을 유도한 웰에 가하였다. 에틸 알콜을 가한 웰과 가하지 않은 웰에서의 ALT, AST를 측정하기 위하여 일본 Array 사로부터 SPOTCHEM ^TM II strip을 구입하여 본 실험에 사용하였다. SPOTCHEM ^TM II strip 은 ALT(GOT), AST(GPT), blood urea nitrogen, glucose total cholesterol, total bilirubin 의 량을 하나의 스트립(strip)에서 모두 측정이 가능하다. 이 스트립에서는 ALT와 AST의 량를 측정하는 부분이 미색의 존으로 되어 있으나 시료 내에 ALT와 AST 량이 증가하면 짙은 파란색으로 변하게 된다. 48시간이 지난 후에 각 웰의 배양상등액을 취하여 SPOTCHEM ^TM II 스트립에 떨어뜨리고 발색을 확인하였다 (도 4).

도 4에서 대조군은 Hep3B 세포에 에틸 알콜과 댕댕이나무 열매 추출물도 모두 처리하지 않은 웰의 배양액에 의한 발색결과이다. 혈청 내에 있는 미량의 ALT, AST로 인하여 미색에서 옅은 파란색으로 변하였다. 그러나 에틸 알콜을 5%의 농도로 투여한 웰의 배양액에서는 색의 변화가 짙은 파란색으로 나타나 AST와 ALT 활성이 급격히 증가한 것으로 나타났다. 옅은 파란색을 나타낸 대조구의 ALT, AST 값과 유사하였다. 에틸 알콜로 세포손상을 유도한 후에 댕댕이나무 열매 추출물 (0.3mg/ml)을 처리한 결과는 댕댕이나무 열매 추출물 (0.3mg/ml 만을 가한 결과와 같이 옅은 파란색으로 발색되어 에틸 알콜을 처리하고 댕댕이나무 열매 추출물을 처리하지 않은 웰의 배양액과 비교할 때 ALT, AST 값이 감소하였음을 알 수 있다.

실시예 6 : 독성시험

상기 실시예 1에서 제조한 열수 추출물 또는 열수 주정 혼합추출물을 증류수에 용해하고 이를 마우스 (군당 10마리)에 각각 500mg/kg을 투여한 다음 7일간 관찰하였으나, 사망하는 마우스가 없는 것으로 보아 세포 독성은 없는 것으로 나타났다.

실시예 7 : 급성 간염 유발 마우스에서 댕댕이나무 열매 추출물의 투여효과

급성 간염을 유발시킨 마우스에서 댕댕이나무 열매 추출물 투여에 의한 간 기능 회복능을 분석하고자 다음과 같은 실험을 하였다. 마우스 (ICR 종) 40마리를 각 군당 10마리씩 가, 나, 다, 라 4군으로 나누었다. 가군은 아무런 약제를 투여하지 않았으며, 나군은 올리브오일만을 먹인 군이고, 다군은 시그마사에서 구입한 실리마린을 올리브오일에 20mg/ml이 되도록 녹여서 마우스 한 마리당 100ul을 3일동안 구강 투여하였으며, 라군은 실시예 1에서 얻은 댕댕이나무 열매 추출물을 500mg/ml이 되도록 증류수에 녹이고 이용액을 마우스 한 마리당 100ul을 3일 동안 구강투여하였다. 약제를 투여하는 기간동안은 가, 나, 다, 라군 모두 사료를 투여하지 않고 물만을 공급하였다. 사염화탄소를 올리브 오일에 1%가 되도록 혼합한 다음 100ul를 나, 다, 라군의 마우스들의 복강에 주사하였다. 그리고 18시간이 지난 후에 가, 나, 다, 라 군의 마우스에서 채혈하여 마우스 혈액 내의 AST, ALT의 활성을 실시예 5와 같은 방법으로 측정하고 각 군의 평균 AST, ALT의 활성값을 비교하였다. 이 결과에서 사염화탄소를 주입하지 않은 가군의 AST, ALT 평균활성값은 23유니트, 37유니트 이었으며, 사염화탄소만을 주입한 나군은 AST, ALT의 수치가 1,023 유니트와 1,129유니트로 급성 간염이 유발된 현상을 나타내었다. 반면 실리마린을 사전에 복용시킨 다군의 AST, ALT 수치는 337유니트, 446유니트이고 댕댕이나무 추출물을 사전에 복용시킨 라군의 AST, ALT 평균활성값은 107유니트, 130유니트로서, 댕댕이나무 추출물의 AST, ALT 값이 실리마린을 투여한 마우스에 비해 평균 230유니트, 207유니트가 각각 감소하였다. AST, ALT 회복비율로 보면 실리마린의 간 기능 회복능은 63.8%이었으며 댕댕이나무 열매 추출물의 간 기능 회복능은 89.0%로서 댕댕이나무 열매 추출물이 25% 이상 회복능이 뛰어난 것으로 나타났다.

실시예 8 : 급성 간염 유발 마우스에서 댕댕이나무 열매 추출물과 실리마린의 조직화학적 결과 비교

실시예 7에서 각 실험군 가, 나, 다, 라에서 AST, ALT 의 평균값을 나타낸 마우스의 간조직에 대하여 조직화학적인 분석을 하였다. 각 군의 마우스로부터 간조직을 절편한 후에 10% 포르말린에 고정하였으며 각각 다른 농도의 에틸알콜에 담가 탈수과정을 수행하였으며 최종적으로 파린핀에 포매하였다. 파라핀 포매조직은 4-5um로 절편하여 슬라이드 글래스에 접착시킨 후에 헤마탁실린와 에오신으로 염색하여 광학현미경 하에서 관찰하였다 (도 5). 사염화탄소를 주입한 마우스의 간조직에서는 괴사가 일어나 헤마탁실린과 에오신에 염색되지 않은 부분들이 많이 산재하여 있으나(도 5-A), 실리마린과 댕댕이나무 추출물을 투여하고 사염화탄소를 주입한 마우스의 간조직들은 (도 5-B, 도 5-C) 정상 간조직 (도 5-D)와 비교하여 볼 때 괴사반응이 거의 일어나지 않았음을 볼 수 있다. 특히 댕댕이나무 추출물을 투여한 마우스와 실리마린을 투여한 마우스의 간조직을 비교하여 볼 때는 댕댕이나무 추출물을 투여한 마우스에서 실리마린보다 괴사세포가 더 적음을 확인할 수 있었다.

실시예 9 : 댕댕이나무 열매 추출물에 의한 간 기능 회복 효과 임상실험

평소에 간염 증세를 가지고 있는 세 명의 자원자를 대상으로 실시예 1에서 제조한 댕댕이나무 열매 추출물 (1g)을 10일 또는 20일간 매일 2회 복용하도록 하고 간세포 내에 있는 효소인 ALT와 AST를 조사하였다. 시험에 참여한 세 사람 모두 10일 또는 20일 복용 후 간 수치가 감소하였음을 보고하였다.

지원자 1: 남, 40세

복용전 증상 : 8년전부터 B형 간염으로 고생함.

복용 후 : 10일간 복용 후 AST 32에서 11.1, ALT 73에서 14.3으로 감소하였음.

이후 복용하지 않은 상태에서 20일후 AST 10.3, ALT 10.6으로 감소하였음.

지원자 2: 남, 35세

복용전 증상 : 간 질환을 앓고 있었으며 신체검사때마다 간 수치가 높았음.

복용 후 : 20일간 복용 후 AST 53에서 2.25, ALT 96에서 35로 감소하였음.

이후 복용하지 않은 상태에서 60일후 AST 2.25, ALT 5.75로 감소하였음.

지원자 3: 여, 35세

복용전 증상 : 집안이 모두 간염 환자임

복용 후 : 20일간 복용 후 AST 69에서 26, ALT 72에서 29로 감소하였음.

실시예 10 : 건강기능식품의 제조

제조예 1-건강기능식품의 제조

실시예 1의 댕댕이나무 열매추출물 - 200mg

비타민 B-1 - 10mg

비타민 B-2 - 10mg

비타민 B-5 - 10mg

Vitamin B-6 - 10mg

엽산 - 20mg

비타민 C - 50mg

구연산칼슘 - 20mg

글루콘산 마그네슘 - 20mg

글루콘산 칼륨 - 20mg

옥수수전분 - 140mg

상기 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조 방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하였다.

제조예 2 - 건강음료의 제조

실시예 1의 댕댕이나무 열매추출물 - 10g

구연산 - 20mg

올리고당 - 5g

비타민 C - 50mg

타우린 - 1g

정제수를 가하여 전체 -100㎖

상기 구연산 및 올리고당 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조 방법에 따라 상기의 성분을 혼합하여 음료를 제조하였다.

제조예 3 - 분말 및 캅셀제의 제조

실시예 1의 댕댕이나무 열매추출물 - 200mg

락토오스 - 20mg

결정성 셀룰로오스 - 5mg

마그네슘 스테아레이트 - 275mg

상기 락토오스 및 셀룰로오스 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조 방법에 따라 상기의 성분을 혼합하여 분말 및 캅셀을 제조하였다.

제조예 4 - 츄잉껌의 제조

실시예 1의 댕댕이나무 열매추출물 - 0.5 중량％

껌 베이스 - 20 중량％

설탕 - 76.9 중량％

향료 - 1 중량％

물 - 2 중량％

상기 껌 베이스및 설탕 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조 방법에 따라 상기의 성분을 혼합하여 츄잉껌을 제조하였다.

제조예 5 - 캔디의 제조

실시예 1의 댕댕이나무 열매추출물 - 0.2 중량％

설탕 - 60 중량％

물엿 - 39.7 중량％

향료 - 0.1 중량％

상기 설탕 및 물엿 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조 방법에 따라 상기의 성분을 혼합하여 캔디를 제조하였다.

제조예 6 - 비스켓의 제조

실시예 1의 댕댕이나무 열매추출물 - 0.2 중량％

박력 1급 - 25.59 중량％

중력 1급 - 22.22 중량％

정백당 - 4.80 중량％

식염 - 0.73 중량％

포도당 - 0.78 중량％

팜쇼트닝 - 11.78 중량％

암모니움 - 1.54 중량％

중조 - 0.17 중량％

중아황산나트륨 - 0.16 중량％

쌀가루 - 1.45 중량％

비타민B₁ - 0.0001 중량％

비타민 B₂- 0.0001 중량％

밀크향 - 0.04 중량％

물 - 20.4998 중량％

전지분유 - 1.16 중량％

대용분유 - 0.29 중량％

제일인산칼슘 - 0.03 중량％

살포염 - 0.29 중량％

분무유 - 7.27 중량％

상기 밀가루, 설탕, 포도당 및 분유 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조 방법에 따라 상기의 성분을 혼합하여 비스킷을 제조하였다.

제조예 7 - 소세지의 제조

실시예 1의 댕댕이나무 열매추출물 - 0.2 중량％

돈육 - 65.18 중량％

계육 - 25 중량％

전분 - 3.5 중량％

대두단백 - 1.7 중량％

식염 - 1.42 중량％

포도당 - 0.5 중량％

글리세린 - 1.5 중량％

상기 돈육, 계육 및 전분 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조 방법에 따라 상기의 성분을 혼합하여 소세지를 제조하였다.

제조예 8 - 주류의 제조

실시예 1의 댕댕이나무 열매추출물 0.15~0.7％를 소주, 맥주, 양주 또는 과실주와 혼합하여 현탁 상태로 만든 후 진공상태에서 15분간 원심분리기로 8,000rpm에서 분리하거나 고속믹서기로 9,000 rpm에서 혼합 여과하여 댕댕이나무 열매추출물이 함유된 소주를 제조하였다.

제조예 9 - 요구르트의 제조

정제수 115ml에 실시예 1의 댕댕이나무 열매추출물 25g과 탈지분유 24g, 설탕 5g을 혼합하여 요구르트 제조를 위한 베이스를 제조하였다. 상기 베이스에 젖산균을 시판되는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) KCTC8649P의 종균을 3% 접종하여 38℃에서 6시간 40분 발효시킴으로써 총산도 0.62, pH 4.3의 생약 요구르트를 제조하였다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합 비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

이상에서 설명한 바와 같이 본 발명에 따른 댕댕이나무 추출물을 포함하는 식품 조성물은 독성 등의 부작용이 없으면서 우수한 간 기능 회복 및 성장 회복능 을 가지므로, 간 기능 회복용 기능성식품, 건강식품 또는 건강보조식품 등의 제조에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (8)

1. 댕댕이나무(Lonicera caerulea L. var. edulis) 열매 추출물을 포함하는 간 기능개선용 식품 조성물.
2. 삭제
3. 제 1항에 있어서, 물, C1 내지 C4의 저급 알코올, 또는 이의 혼합용매를 이용하여 추출한 조성물.
4. 제 1항에 있어서, 댕댕이나무 열매 추출물이 전체 조성물의 0.01 내지 100% 중량비를 갖는 조성물.
5. 제1항에 있어서, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 액기스 형태인 조성물.
6. 제1항의 조성물로 제조된 식품.
7. 제6항에 있어서, 기능성 식품, 건강식품 또는 건강보조식품인 식품.
8. 제6항에 있어서, 식품이 과자, 음료, 주류, 발효식품, 통조림, 우유가공식품, 육륙가공식품 또는 국수인 식품.

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