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KR100699059B1 - 항체 및 폴리알킬렌글리콜 결합 리포좀 - Google Patents

항체 및 폴리알킬렌글리콜 결합 리포좀 Download PDF

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KR100699059B1
KR100699059B1 KR1020017013584A KR20017013584A KR100699059B1 KR 100699059 B1 KR100699059 B1 KR 100699059B1 KR 1020017013584 A KR1020017013584 A KR 1020017013584A KR 20017013584 A KR20017013584 A KR 20017013584A KR 100699059 B1 KR100699059 B1 KR 100699059B1
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maleimide
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미쯔비시 가가꾸 가부시끼가이샤
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Abstract

지질말단의 일부가 말레이미드화된 리포좀에 폴리알킬렌글리콜부분을 포함하는 화합물을 티오에테르기를 통하여 결합되고, 항체를 티오에테르기를 통하여 결합된 리포좀으로 전기화합물의 결합량 및 전기 항체의 결합량이 각각 리포좀에 포함되는 말레이미드화지질 1몰에 대하여 15 내지 50몰% 및 0.1 내지 2몰%인 리포좀. 전기 리포좀은 우수한 혈중 체류성과 치료효과를 함께 가진다.
리포좀, 말레이미드화.

Description

항체 및 폴리알킬렌글리콜 결합 리포좀{Antibody and Polyalkylene Glycol-bonded Liposome}
본 발명은 리포좀에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 항체 및/또는 폴리알킬렌글리콜이 결합되어 있고, 우수한 혈중체류성과 치료효과를 함께 가지는 리포좀에 관한 것이다.
약제를 특정부위로 대량수송하는 방법으로, 리포좀으로 약제를 봉입하고 그 표면에 항체를 결합하는 방법이 제안되고 있다. 특히, 암치료 분야에 있어서 항종양제를 봉입한 항체결합 리포좀의 유효성이 다수 보고되어져 있다(참조: Konno et al., Cancer Tes., 47:4471, 1987; 특개소 58-134032호 공보). 또한, 리포좀의 문제점인 봉입물의 누출이나, 리포좀의 응집 및 망내계장관에서의 포착 등을 개선하는 방법으로 리포좀에 폴리에틸렌글리콜을 결합시키는 방법이 제안되어 있다(참조: 특개평 1-249717호 공보; 특개평 2-149512호 공보; Klibanovet, A. L. et al., FEBS Lett., 268, 235, 1990).
특개평 4-346918호 공보에서는, 약제를 내포하는 리포좀 표면의 말레이미드 기와 각각의 티올기를 통하여 결합하는 단백질 및 폴리알킬렌글리콜부위를 포함하는 화합물 잔기를 가지는 것을 특징으로 하는 약제함유 단백질결합 리포좀이 개시 되어져 있다. 이 리포좀은 리포좀 표면의 말레이미드기에 대하여 항체에 결합된 티올기와 폴리알킬렌글리콜부분을 포함하는 화합물에 결합된 티올기를 반응시켜 제조되어, 종래의 리포좀에서 볼 수 있는 것처럼, 간장, 비장 등의 망내계에서의 비특이적 포착이 억제되어져 있고, 선택적인 화학요법을 달성할 수 있는 특징이 있다.
상기 공보에서는 리포좀에 결합되는 폴리알킬렌글리콜 부분을 포함하는 화합물의 양은 구체적으로 설명되어 있지 않고, 말레이미드기(말레이미드화 지질) 1몰에 대하여 0.1몰% 내지 20몰%의 티올화 항체를 반응시키고, 잔존하는 말레이미드기에 대하여 과잉량의 티올화 폴리알킬렌글리콜 부분을 포함하는 화합물, 바람직하게는 2배 이상을 가하여 항체결합폴리알킬렌글리콜 수식 리포좀을 수득하는 것이 기재되어져 있다(0016단락). 또한, 실시예에서 구체적으로 기재된 리포좀의 제조방법에서는 전지질(total lipid) 100mg에 대하여 5μ몰의 티올화 폴리에틸렌글리콜부분을 포함하는 화합물(환산하면 전지질에 대하여 3.1몰%)을 반응시켜, 지질에 대하여 다량으로 남는 티올화 폴리에틸렌글리콜 부분을 포함하는 화합물을 반응시켜, 이론량(리포좀 표면에 잔존하는 말레이미드기의 양)의 폴리에틸렌글리콜으로 수식된 리포좀을 수득하는 것으로 생각되어 진다.
또한, 상기 공보에서는 리포좀에 결합하는 항체의 양도 구체적으로 설명되어 있지는 않고, 말레이미드기(말레이미드화 지질) 1몰에 대하여 0.1몰% 내지 20몰%의 티올화 항체(환산하면 전지질 100mg에 대하여 0.3 내지 60mg)을 반응시키는 것이 설명되어져 있지만, 실시예에서 구체적으로 기재된 리포좀의 제조방법에서는 전지 질 100mg에 대하여 5mg(환산하면 말레이미드화 지질에 대하여 1.7몰%)의 항체를 결합시킨 내용이고, 상기 공보에서는 이외의 결합량에 대하여 구체적으로 개시되어 있지는 않다.
본 발명의 발명자들은 특개평 4-346918호 공보에 기재된 리포좀을 토대로 보다 높은 혈중체류성을 가지며 안전성이 우수한 리포좀을 제공하기 위한 예의 연구를 행하였다. 그 결과, 특개평 4-346918호 공보에서 기재된 리포좀에 있어서, 리포좀을 수식한 폴리알킬렌글리콜의 양은 이론치(리포좀 표면에 잔존한 말레이미드기의 양)보다도 감소시킨 결과, 수식량이 이론치보다 적은 리포좀에 있어서도 종래공지된 리포좀과 거의 동등한 혈중체류성이 얻어지는 것을 발견하였다.
또한, 본 발명자들은 특개평 4-346918호 공보에 기재된 리포좀을 토대로 보다 높은 치료효과를 달성할 수 있는 리포좀을 제공하기 위한 에의 연구를 행하였다. 그 결과, 특개평 4-346918호 공보의 실시예에 기재된 리포좀에 있어서, 항체의 결합량을 감소시킨 결과, 상기 공보의 실시예에서 기재된 리포좀보다도 훨씬 높은 치료효과를 보이는 것을 발견하였다. 본 발명은 이들 지견을 토대로 완성시킨 것이다.
즉, 본 발명은 지질말단의 일부가 말레이미드화된 리포좀에서 폴리알킬렌글리콜 부분을 포함하는 화합물을 티오에테르기를 통하여 결합된 리포좀이며, 전기 화합물의 결합량은 리포좀에 포함되는 말레이미드화 지질 1몰에 대하여 15 내지 50 몰%인 리포좀; 전기 화합물의 결합량은 말레이미드화 지질 1몰에 대하여 15 내지 30몰%인 전기 리포좀; 전기 리포좀은 말레이미드화 지질의 말레이미드기와 티올기가 부가된 폴리알킬렌글리콜 부분을 포함하는 화합물을 반응시켜 수득되는 리포좀인 전기 리포좀; 전기 화합물이 리포좀의 표면에서 결합된 전기 리포좀; 폴리알킬렌글리콜은 폴리에틸렌글리콜인 전기 리포좀; 전기 화합물은 2개의 폴리에틸렌글리콜기를 가지는 화합물인 전기 리포좀; 폴리에킬렌글리콜의 분자량은 2,000 내지 7,000달톤인 전기 리포좀; 폴리에틸렌글리콜의 분자량은 약 5,000달톤인 전기 리포좀; 리포좀의 표면에 항체가 결합된 전기 리포좀이 제공된다.
또한, 지질말단의 일부가 말레이미드화된 리포좀에 항체를 티오에테르기를 통하여 결합된 리포좀이고, 전기 항체의 결합량이 리포좀에 포함되는 말레이미드화지질 1몰에 대하여 0.1 내지 2몰%인 리포좀; 전기 항체의 결합량은 말레이미드화지질 1몰에 대하여 0.4 내지 0.7몰%인 전기 리포좀; 전기 리포좀이 말레이미드기를 가지는 리포좀과 항체 유래의 황 함유기를 반응시켜서 티오에테르 결합을 형성하여 수득되는 리포좀인 전기 리포좀; 항체는 GAH항체인 전기 리포좀; 항체는 항체 조각(fragment)F(ab')2인 전기 리포좀; 리포좀의 표면에 폴리알킬렌글리콜 부분을 포함하는 화합물이 결합한 전기 리포좀이 제공된다.
또한 지질말단의 일부가 말레이미드화된 리포좀에 폴리알킬렌글리콜 부분을 포함하는 화합물 및 항체를 티오에테르기를 통하여 결합된 리포좀이고, 전기 화합물의 결합량 및 전기 항체의 결합량은 리포좀에 포함되는 말레이미드화 지질 1몰에 대하여 15 내지 30몰% 및 0.4 내지 0.7몰%인 리포좀; 전기 리포좀은 말레이미드화 지질의 말레이미드기와 티올기가 부가된 폴리알킬렌글리콜 부분을 포함하는 화합물을 반응시켜 수득되는 리포좀인 전기 리포좀; 전기 화합물이 리포좀의 표면에 결합된 전기 리포좀; 폴리알킬렌글리콜은 폴리에틸렌글리콜인 전기 리포좀; 전기 화합물은 두개의 폴리에틸렌글리콜기를 가지는 화합물인 전기 리포좀; 폴리에틸렌글리콜의 분자량은 2,000 내지 7,000달톤인 전기 리포좀; 폴리에틸렌글리콜의 분자량은 약 5,000달톤인 전기 리포좀; 전기 리포좀이 말레이미드기를 가지는 리포좀과 항체 유래의 황 함유기를 반응시켜서 티오에테르 결합을 형성하여 수득되는 리포좀인 전기 리포좀; 항체는 GAH항체인 전기 리포좀; 항체는 항체조각F(ab')2인 전기 리포좀이 제공된다.
또한, 암치료약인 전기 리포좀; 암종류가 위암 또는 대장암인 전기 암치료약; 전기 리포좀을 이용한 암치료방법이 제공된다.
도 1은 리포좀(DXR봉입, 항체 비결합)으로 결합된 폴리에틸렌글리콜양과 혈장 중의 DXR 농도의 관계를 나타낸 그래프이다. 가로축은 PEG량(DPPC 1몰에 대한 몰%)를 나타낸다. 전지질에 대한 몰% 및 말레이미드화 DPPE 1몰에 대한 몰%의 환산치는 각각 0.16 및 8.9(0.25); 0.32 및 17.8(0.5); 0.48 및 26.7(0.75); 0.64 및 35.6(1); 및 0.81 및 45(1.25)이다(괄호 안은 DPPC 1몰에 대한 몰%를 나타낸다).
도 2는 리포좀(DXR 봉입, 항체결합)으로 결합된 폴리에틸렌글리콜양과 혈장 중 DXR 농도와의 관계를 나타낸 그래프이다. 가로축은 PEG량(100mg지질에 대한 PEG양(mg))를 나타낸다. DPPC 1몰에 대한 몰%, 전지질에 대한 몰% 및 말레이미드화 DPPE 1몰에 대한 몰%의 환산치는 각각 0.25, 0.16 및 8(2.5); 0.50, 0.31 및 17(5); 0.75, 0.47 및 26(7.5); 및 1.0, 0.62 및 34(10)이다(괄호안은 100mg지질에 대한 PEG량(mg)을 나타낸다).
도 3은 리포좀(DXR 봉입)에 결합된 항체량과 종양억제효과(%T/C)와의 관계를 나타낸 그래프이다.
도 4는 항체결합량을 2mg/100mg지질 이상으로 한 각 시료에 대한 혈장중 DXR량(혈중체류성)과 항체 결합량과의 관계를 나타낸 그래프이다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
본 발명의 리포좀을 구성하는 지질로는 천연 레시틴(예를 들면, 난황 레시틴, 대두 레시틴)이나, 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 디미리스토일포스파티딜콜린(DMPC), 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 디미리스토일포스파티딜에탄올아민(DMPE), 디팔미토일포스파티딜에탄올아민(DPPE), 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 디팔미토일포스파티딘산(DPPA), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 디미리스토일포스파티딘산(DMPA) 등의 인지질, 스핑고당지질, 글리세로당지질 등의 당지질, 지방산, 양친매성디알킬디메틸암모늄 (dialkyl dimethylammonium amphiphiles), 폴리글리세롤알킬에테르, 폴리옥시에틸렌알킬에테르 등(참조: Liposome Technology, 2nd edition, 1:141, 1993), 알킬글리코시드, 알킬메틸글루카미드, 알킬슈크로스에스테르, 디알킬폴리옥시에틸렌에테르, 디알킬폴리글리세롤에테르 등(참조: Liposome Technology, 2nd edition, 1:141, 1993), 폴리옥시에틸렌폴리유산 등의 양친매성 블록공중합체(특표평 6-508831호 공보) 등을 예로 들 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 이들의 지질은 단독으로 또는 2 종류 이상의 조합으로 이용할 수 있고, 콜레스테롤 등의 비극성 물질, DC-chol(3β-[N-(N', N'-dimethylaminoethyl)carbamoyl]cholesterol) 등의 콜레스테롤 유도체와 조합하여 이용하여도 무방하다.
본 발명의 리포좀에 있어서는 폴리알킬렌글리콜을 포함하는 화합물 및 필요에 따라 항체 등의 단백질이 결합할 수 있도록, 지질성분의 일부가 예를 들면 말레이미드화된 지질(본 명세서에서 '말레이미드화 지질'이라 함)인 것을 이용할 필요가 있다. 전지질에 대하여 말레이미드화 지질의 비율은 통상 약 0.5 내지 10몰%이다.
말레이미드화 포스파티딜에탄올아민의 예로 설명하면, 이 화합물은 아미노기에 반응성을 가지는 말레이미드 함유 화합물과 포스파티딜에탄올아민(PE)의 아미노기가 반응하여 수득된다. 전기 말레이미드 함유 화합물은 카프로일기, 벤조일기, 페닐부티릴기 등의 잔기를 포함하고 있어도 무방하고, 예를 들면 N-(ε-말레이미도카프로일옥시)숙신이미드, N-숙신이미딜 4-(p-말레이미도페닐)부틸레이트, N-숙신이미딜 4-(p-말레이미도페닐)프로피오네이트, N-(γ-말레이미도부틸릴옥시)숙신이 미드 등을 예로 들 수 있다. PE로는 디팔미토일포스파티딜에탄올아민(DPPE), 디미리스토일포스파티딜에탄올아민(DMPE), 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE) 등의 포스파티딜에탄올아민류가 사용될 수 있지만, DPPE가 바람직하다. 지질성분으로는 스테아릴아민, 디아세틸포스페이트 등의 하전성 물질을 포함하고 있어도 무방하다. 또한, 본 발명의 리포좀은 바이러스의 일부 또는 전부를 조합한 융합리포좀, 예를 들면 센다이바이러스와 리포좀을 융합시킨 리포좀이어도 무방하다.
전형적인 리포좀으로는 포스파티딜콜린 1몰에 대하여, 콜레스테롤을 0.3 내지 1몰, 바람직하게는 0.4 내지 0.6몰, 말레이미드화 포스파티딜에탄올아민을 0.01 내지 0.2몰, 바람직하게는 0.02 내지 0.1몰, 보다 바람직하게는 0.02 내지 0.05몰을 포함하는 지질조성물을 이용할 수 있고, 포스파티딘산을 가하는 경우에는 0.4몰 이하, 바람직하게는 0.15몰 이하의 지질조성물을 이용할 수 있다.
본 발명의 리포좀의 제조방법은 특별히 한정되지 않고, 당업자에게 이용가능한 방법이면 어느 것이든 적용 가능하다. 또한, 본 발명의 리포좀의 형태도 특별히 한정되지 않고 어떤 형태든 무방하다. 예를 들면 유리벽에 부착시킨 지질박막에서 수용액을 가하고, 기계적으로 진탕하여 형성하는 멀티라멜라리포좀(MLV); 초음파처리법, 에탄올주입법, 프렌치프레스법에 의해 수득되는 스몰유니라멜라리포좀(small unilamella liposome, SUV); 계면활성제 제거법, 역상증발법(리포좀, 수나모토준미 등, 난코도, 1998), MLV를 균일직경의 구멍을 가지는 멤브레인에서 가압하여 압출하는 압출법(extrusion method)에 의해 수득되는 라지 유니라멜라 리포좀(LUV)의 어느 것이라도 무방하다(참조: Liposome Technology 2nd edition 1:141, 1993). 리포좀의 분자의 직경은 예를 들면 300nm이하, 바람직하게는 30에서 200nm정도이다.
본 발명의 리포좀에는 의약을 봉입할 수 있다. 의약의 종류는 특별히 한정되지 않지만, 독소루비신(아드리아마이신), 다우노마이신, 빈블라스틴, 시스플라스틴, 5-플루오로우라실(5-FU) 등의 항종양제; 티모롤 등의 아드레날린 차단제; 클로니진 등의 고혈압제; 프로카인아미드 등의 제토제; 클로로퀴니네 등의 항 말라리아제; 및 이들의 약학적으로 허용될 수 있는 염 및 유도체; 레늄 186, 요오드 131, 이토륨 90등의 방사성 물질; 리신 A, 디프테리아톡신, TNF 등의 생리활성 물질 및 이들을 암호화하는 DNA 등을 이용할 수 있다. 본 발명의 리포좀에 봉입가능한 의약은 이들에 한정되지는 않는다.
상기 의약의 약학적으로 허용될 수 있는 염으로는, 약학적으로 허용될 수 있는 다가 음이온성 물질과 그의 염, 예를 들면 구연산염, 주석산염, 글루타민산염 및 이들의 유도체와 그의 염이 바람직하다. 본 발명의 리포좀에 봉입되는 의약으로는 항종양제가 바람직하다. 본 발명의 리포좀에는 치료용의 의약 외에 진단용의 의약을 봉입할 수 있다. 진단용의 의약으로는 방사성 원소, 예를 들면 인듐, 데크네슘 등의 이미징 약제(imaging agent); 요오드, 카드리늄 등의 조영제; 호스래디쉬 퍼옥시다제(horseradish peroxidase), 알칼리포스파타제, β-갈락토시다제 등의 효소; 유로퓸(europium) 유도체 등의 형광체; N-메틸아크리듐 유도체 등의 발광제 등을 들 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.
이들의 의약을 리포좀에 도입하는 방법은 특별히 한정되지 않고, 당업자에게 이용가능한 방법은 어느 것이라도 적용 가능하다. 예를 들면, 리포좀 형성시의 수용액으로 첨가하여 리포좀 내부에 봉입하여도 무방하다. 또한, 리포좀 형성 후 리포좀낭(vesicle) 내부에 pH 구배 등의 농도 구배를 형성하고, 이 포텐셜을 구동력으로 하여 이온화가능한 약제를 리포좀 내부에 넣는 방법(참조: Cancer Res., 49:5922, 1989; BBA, 455:269, 1976) 등을 이용할 수 있다.
본 발명의 리포좀은 폴리알킬렌글리콜 부분을 포함하는 화합물로 수식되어 있고, 특정량의 항체로 수식되어 있는 것을 특징으로 한다. 폴리알킬렌글리콜로는 예를 들면 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리프로필렌글리콜 등을 이용할 수 있으나, 폴리에틸레글리콜을 이용하는 것이 바람직하다. 폴리에틸렌글리콜을 이용하는 경우에는 분자량 2,000 내지 7,000달톤 정도, 바람직하게는 약 5,000달톤 정도의 것을 이용할 수 있다.
본 발명의 리포좀은 상기 폴리알킬렌글리콜 부분을 포함하는 화합물은 리포좀표면의 말레이미드화 지질에 티오에테르 결합을 통하여 결합한 형태를 가지고 있고, 통상 폴리알킬렌글리콜을 포함하는 화합물에 티올기를 도입한 후, 이 화합물을 리포좀의 말레이미드기와 반응시켜 폴리알킬렌글리콜을 결합시킨 리포좀을 제조할 수 있다. 폴리알킬렌글리콜을 포함하는 화합물로는 통상 폴리에틸렌글리콜기를 가지는 동시에 말단을 티올화할 수 있는 화합물 또는 말단에 머캅토기를 가지는 화합물을 들 수 있다.
구체적으로는, 폴리알킬렌글리콜기를 트리아진에 결합시킨 화합물, 또한, 전기 트리아진이 아미노산 등에 의해 치환된 화합물을 예로 들 수 있다. 이 때, 폴 리알킬렌글리콜기를 두개 가지는 화합물(2본쇄)이라도 무방하다.
폴리알킬렌글리콜로 폴리에틸렌글리콜을 이용하는 경우에는, 예를 들면 모노메톡시폴리옥시에틸렌아민과 각종 티올카본산과 탈수 축합하는 방법; 모노메톡시폴리옥시에틸렌아민에 SPDP로 피리딜디티오프로피오닐기를 도입하고, 환원하는 방법; 모노메톡시폴리옥시에틸렌아민에 이미노티오란의 티올기를 도입하는 방법; 모노메톡시폴리옥시에틸렌카본산의 활성 에스테르와 각종 티올아민을 결합시키는 방법; 폴리에틸렌글리콜트리아진유도체를 티올아민과 축합하는 방법 등을 이용할 수 있다. 보다 구체적으로는, 2, 4-비스(폴리에티렌글리콜)-6-클로로-s-트리아진[활성화 PEG2(세이카가쿠고교카부시키가이샤 제)]를 시스틴(cystine)과 반응시키고, 환원하여 시스테인(cysteine)결합 활성화 PEG2를 수득할 수 있다.
본 발명의 리포좀에 있어서 폴리알킬렌글리콜 부분을 포함하는 화합물의 도입량은 특별히 한정되지 않고, 잔존 말레이미드화 지질에 대하여 다량으로 반응시켜도 무방하나, 폴리알킬렌글리콜의 바람직한 도입량은 전지질에 대하여 0.28 내지 0.90몰% 정도, 보다 바람직하게는 0.28 내지 0.56몰%정도, 말레이미드화지질에 대하여서는 15 내지 50몰%정도, 보다 바람직하게는 15 내지 30몰%정도이고, DPPC에 대하여서는 0.44 내지 1.45몰%정도, 보다 바람직하게는 0.44 내지 0.89몰%정도이다.
본 발명의 리포좀은 단백질, 즉 항체로 수식되어 있어도 무방하다. 단백질로는 예를 들면 항체, FGF, EGF 등의 여러가지 생리활성 물질을 이용할 수있으나, 바람직하게는 항체를 이용할 수 있다.
항체로는 항체 자체 또는 항체 조각(fragment), 또는 항체 유도체 등을 이용할 수 있으나, 항체로는 항체 자체 또는 항체 조각의 어느 것이라도 이용하여도 무방하다.
본 명세서에 있어서 이용될 수 있는 「항체」는 항체 자체 및 항체 조각의 외, 유도화 또는 수식된 항체 등을 포함하고 있고, 가장 광의적으로 해석되어야 한다. 또한, 항체로는 치료 대상이 되는 조직, 세포, 세균, 바이러스 등과 반응성을 가지는 항체를 이용할 수 있다. 예를 들면, 각종동물의 다클론성 항체, 마우스 단일 클론성 항체, 사람-마우스의 키메라 항체, 사람 단일 클론성 항체 등을 이용할 수 있다. 이종동물의 단백질이 아니라는 점에서 사람 단일 클론성 항체가 보다 바람직하다. 항체로는 특개평 5-304987호 공보에 기재된 사람 단일 클론성 항체(GAH 항체)를 바람직하게 이용할 수 있고, 예를 들면, 상기 공보의 예 7에 구체적으로 표시된 방법에 따라 GAH 항체로 수식된 리포좀을 제조할 수 있다. 특개평 5-304987호 공보에 기재된 것과 같이, GAH 항체는 위암 및 대장암 등에 반응성을 가지기 때문에 본원의 리포좀은 위암이나 대장암 등의 암치료약으로 유용하다. 항체의 종류는 봉입되는 의약과의 조합을 적절히 선택하여 치료효과가 우수한 리포좀을 제조할 수 있다.
항체에 티올기를 부여한 후, 리포좀의 말레이미드기와 전기 티올화 항체를 반응시켜, 리포좀을 항체로 수식할 수 있다. 항체에 티올기를 부여하는 것은 항체의 아미노기에 대하여 단백질의 티올화에 통상이용하는 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피네이트(SPDP)(참조: Carlsson, J., et al., Biochem. J., 173:723, 1978)이나 이미노티오란, 머캅토알킬이미데이트(참조: Traut, R.R., et al., Biochemistry, 12:3266, 1973) 등의 화합물을 반응시키는 방법으로 행할 수 있다. 또한 항체의 내재성 디티올기를 환원시켜 티올기로 반응시키는 것도 가능하고, 항체 활성의 유지의 면에서 내재성티올기를 이용하는 방법이 바람직하다.
예를 들면, IgG를 이용하는 경우는 펩신 등의 효소로 F(ab')2화하고, 디티오스레이톨(dithiothreitol) 등으로 환원되어 수득되는 Fab'으로 생기는 티올기를 리포좀과 결합반응시켜 이용할 수 있다(참조: Martin, F. J., et al., Biochemistry 20:4229, 1981). IgM의 경우에는 미러 등의 방법(참조: J. Biol. Chem., 257:286, 1965)에 준하여 완화한 조건에서 J쇄를 환원시켜 수득되는 IgMs의 Fc부분의 티올기를 리포좀과의 결합에 이용하여도 무방하다. 특개평 5-304987호에 기재된 GAH항체를 이용하는 경우에는 F(ab')2를 이용하는 것이 바람직하다. 티올기가 부여된 항체 등의 단백질과 말레이미드기를 포함하는 리포좀의 결합은 중성의 완충액(pH 6.5 내지 7.5) 중에서 2 내지 16시간 반응시켜 결합시킨다.
본원의 가장 바람직한 실시태양은 항체 및 폴리알킬렌글리콜부분을 포함하는 화합물과 결합된 리포좀이고, 이것을 제조하기 위해서는 우선, 말레이미드기를 가지는 리포좀에 대하여 중성의 완충액 중에서 티올화 항체를 반응시킨다. 예를 들면 리포좀을 구성하는 전지질 100mg당 0.5 내지 5.3mg, 0.5 내지 4.5mg, 바람직하게는 1.2 내지 2mg의 항체가 결합하는 것과 마찬가지로, 즉 티올화 항체를 말레이미드기(말레이미드화 지질) 1몰에 대하여 0.1몰%정도(구체적으로는 0.17몰%) 내지 약 2몰%정도(구체적으로는 1.5몰%, 1.8몰%), 바람직하게는 0.4 내지 0.7몰% 반응시키면 무방하다. 잔존하고 있는 말레이미드기에 대하여 티올화 폴리알킬렌글리콜 부분을 포함하는 화합물을 반응시켜, 항체와 폴리알킬렌글리콜 부분을 포함하는 화합물이 결합된 리포좀을 제조할 수있고, 구체적으로는 말레이미드화지질기 1몰에 대하여 15몰%에서 50몰%, 바람직하게는 15 내지 30몰%(전지질에 대하여 0.28 내지 0.90몰%, 바람직하게는 0.28 내지 0.56몰%, DPPC를 이용하는 경우에는 DPPC에 대하여 0.44 내지 1.45몰%, 바람직하게는 0.44 내지 0.89몰%)의 티올화폴리알킬렌글리콜 부분을 포함하는 화합물을 가하고, 항체와 폴리알킬렌글리콜 부분을 포함하는 화합물이 결합된 리포좀을 제조할 수 있다.
본 발명의 리포좀의 바람직한 태양에 따르면, 의약 바람직하게는 독소루비신 등의 항종양제가 봉입되어 있고, 폴리에틸렌글리콜 부분을 포함하는 화합물과 항종양항체가 결합된 리포좀이 제공된다. 상기 의약함유 리포좀은 공지된 방법, 예를 들면, 탈수법(특표평 2-502348호 공보), 안정화제를 가하여 액제로 이용하는 방법(특개소 64-9331호 공보), 동결건조법(특개소 64-9931호 공보) 등으로 제제화할 수 있고, 암 등의 각종 질환의 치료를 위하여 혈관내 투여, 방광내 투여, 복강내 투여, 국소투여 등의 방법으로 환자에게 투여할 수 있다. 투여량은 유효성분의 의약의 종류에 따라 적당히 선택할 수 있고, 예를 들면 독소루비신을 봉입한 리포좀을 투여하는 경우에는 유효 성분량으로 50mg/kg이하, 바람직하게는 10mg/kg이하, 보다 바람직하게는 5mg/kg이하로 이용할 수 있다.
이하에서는 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위는 이하의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
(1) 리포좀의 조제 및 약물의 봉입
디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC)/콜레스테롤/ε-말레이미도카프로일디팔미토일포스파티딜에탄올아민(MC-DPPE)(18/10/0.5몰비)로 구성되는 지질혼합물(1.6g)에 0.3M 구연산 완충용액(pH 4.0) 16ml을 첨가하고 수화시킨 다음, 액체 질소와 60℃의 온수에서 동결융해를 3회 행한 후, 멀티라메리포좀을 제작하였다. 압출법(extrusion method)으로 입자의 크기를 0.1μM로 만들었다. 이 리포좀 용액에 1M NaOH를 적하하여 중화시킨 후, 60℃로 가온하고, 20mg/ml의 독소루비신(DXR, 아드리아마이신, ADM 이라고도 함) 수용액을 지질 100mg당 0.5ml첨가하여 봉입하였다.
(2) 항체의 티올화 및 리포좀에의 결합(항체결합리포좀 제작)
1mM EDTA를 포함하는 50M 인산 완충액(pH 7.5)에 용해한 GAH 항체(특개평 4- 346918호 공보; 특개평 5-304987호 공보, 위암 및 대장암 반응성 단일 클론성 항체, 3mg/ml, 14.4ml)에 3mg/ml의 이미노티오란을 92.4μl 첨가하고, 37℃에서 1시간 반응시켜 티올기를 도입하였다(참조: Biochemistry, 12:3206, 1973). 반응액을 겔여과하고, 완충액을 1mM EDTA를 포함하는 0.1M 인산 완충액(pH 6.0)으로 교환한 후 독소루비신 1mg당 0.21mg의 티올화 항체(1.7mg/ml)을 가하여 25℃에서 1시간 반응시키고 리포좀으로 항체를 결합시켰다.
(3) 폴리에틸렌글리콜의 티올화 및 리포좀에의 결합(PEG 결합리포좀의 제작)
특개평 4-346918호 공보의 방법에 따라, 2, 4-비스(폴리에틸렌글리콜)-6-클로로-s-트리아진에 시스틴을 반응시킨 후, 환원하여 티올기를 가지는 폴리에틸렌글리콜(2본쇄형의 PEG)를 제조하였다. 즉, 시스틴을 이용하여 티올화 PEG[30mg/ml, PEG분자량 2000의 2본쇄형(PEG2000) 또는 PEG 분자량 5000의 2본쇄형(PEG5000)]을 제조하고, 상기의 반응액 1ml당 0.18ml을 첨가하고, 10℃에서 결합반응을 행하였다. 반응개시 후 5 내지 240분 후에 시료를 채취하여 세파로스 CL6B 컬럼에 넣고, 반응하지 않은 티올화 PEG를 제거하고 반응을 정지시켜, PEG양이 다른 이뮤노리포좀을 같은 방법으로 세파로스 CL6B로 겔여과하여 제작하였다.
(4) 항체 및 PEG 결합 리포좀의 제작
상기 (2)에서 제조한 항체결합 리포좀에 대하여 상기(3) 중의 티올화 PEG를 반응시켜 항체 및 PEG가 결합된 리포좀을 제작하였다.
(5) 결합 PEG의 양의 정량
이뮤노리포좀에 결합된 PEG양은 HPLC법으로 측정하였다. 최종농도 2% SDS-이뮤노리포좀 용액을 60℃에서 30분간 가온하고, 리포좀을 완전히 가용화하였다. GPC 컬럼(토소카부시키가이샤 제, 2000SWXL)을 이용하고 pH 7.5의 완충액(25mM NaH2PO4, 0.1% SDS, 70% 메탄올)으로 용리하여 PEG를 분리하고, 215nm에서 검출된 영역치로 정량하였다.
(6) DXR의 정량
시료 50㎕를 50% 프로판올/0.5M 염산 950㎕을 첨가하고, 500nm의 흡광도를 측정하여 DXR을 측정하였다.
(7) 결합항체량의 정량
PEG양의 정량과 마찬가지로, GPC 컬럼(토소카부시키가이샤 제, 3000SWXL)을 이용하여 pH 7.0의 완충액(25mM NaH2PO4, 200mM Na2SO4, 0.1% SDS)로 용리하여 항체를 분리하고 항체 피크 280nm에서 검출된 영역치(area value)로 정량하였다.
(8) 지질량의 정량
지질(DPPC 및 콜레스테롤의 총량)은 HPLC법으로 정량하였다. L-컬럼 ODS(카가쿠힝켄사쿄카이) 4.6mm X 250mm에 넣어 테트라히드로퓨란(THF): 아세토니트릴: 물(2:1:1, v/v/v, 0.1% 트리플루오로초산)으로 용리하였다. 215nm에서 검출을 행하고, DPPC로 유출되는 피크 및 콜레스테롤에 유출되는 피크의 영역치로 정량하였다. 지질정량용 시료는 리포좀에 대하여 상기 용리액 9배를 가하여 제조하였다.
실시예 2: PEG 결합리포좀의 제작(체내동태시험)
실시예 1의 방법에 따라, 리포좀을 구성하는 전지질 1몰에 대하여 0 내지 약 0.7몰%, DPPC 1몰에 대하여 0 내지 약 1몰%, 말레이미드화 지질 1몰에 대하여 0 내지 약 40몰%의 PEG를 도입한 리포좀(DXR봉입, 항체 비결합, PEG2000 또는 PEG5000결합)을 제조하였다.
표 1
리포좀 DXR농도 (mg/ml) PEG양* PEG양** PEG양***
1 1.14 0.083(PEG5000) 0.13 4.61
2 1.17 0.22(PEG5000) 0.34 12.2
3 1.27 0.40(PEG5000) 0.63 22.2
4 1.32 0.48(PEG5000) 0.75 26.7
5 1.16 0.096(PEG2000) 0.15 5.33
6 1.08 0.30(PEG2000) 0.47 16.7
7 1.47 0.60(PEG2000) 0.94 33.3
8 1.55 0.70(PEG2000) 1.09 38.9
9 3.49 - - -
* 전지질에 대한 몰%
** DPPC 1몰에 대한 몰%
*** 말레이미드화 지질 DPPE 1몰에 대한 몰%
BALB/cAjc1 수컷 마우스(6주령)을 실험에 사용하였다. 각 리포좀에 대하여 1군 4마리로 하고 무처리군으로 비처리 마우스 1마리를 실험에 사용하였다. DXR 양으로 2mg/kg이 되도록 꼬리 정맥내에 리포좀을 투여하였다. 투여 16시간 후, 마우스에 넴부탈(nembutal)주사액(다이닛폰세이야쿠카부시키가이샤 제)를 복강내 투여하고, 마취하에서 개흉하여 채혈하고, 혈장을 분리하여 DXR의 분석을 행하였다.
혈장 100㎕에 0.3M 염산 - 50% 에탄올(염산에탄올) 1ml을 가하고, 60℃에서 10분간 가열하여 DXR을 추출하고, 4℃로 냉각하여 15000rpm으로 10분간 원심하여 상층을 수득하였다. 이 시료를 염산에탄올로 4배로 희석하고, 여기(excitation)파장 490nm, 형광파장 590nm의 형광을 측정하였다. 염산에탄올로 희석한 이미 알고 있는 농도의 DXR을 이용하여 검량선을 작성하고, 혈장 중의 DXR을 정량하였다. 또한 마우스 혈장에서의 DXR 회수률은 DXR 환산 3.75㎍/ml 내지 30㎍/ml의 범위에서 95 내지 98%이었다(참조: Cancer Res., 47:4471, 1989).
각 리포좀군에 대하여 혈장 중의 DXR 농도의 평균치(±표준편차)를 도 1에 나타내었다. 리포좀의 혈중체류성의 지표가 되는 혈장 중의 DXR 농도는 PEG5000 및 PEG2000과 함께 리포좀에 결합된 PEG양에 의존하여 증가하는 것이 확인되었다.
실시예 3: PEG 및 항체결합 리포좀의 제작(체내동태시험)
실시예 1의 방법에 따라 리포좀 전지질에 대하여 0 내지 0.6몰%, DPPC에 대하여 0 내지 약 1몰%, 말레이미드화 DPPE에 대하여 0 내지 약 30몰%의 PEG를 도입한 리포좀(DXR봉입, 항체결합, PEG5000 결합)을 제조하였다.
표 2
리포좀 DXR농도 (mg/100mg지질) 항체 (mg/100mg지질) PEG양* PEG양** PEG양***
1 10.2 1.5 0 0 0
2 10.4 1.6 0.06 0.10 3
3 10.3 1.6 0.10 0.16 5
4 10.3 1.6 0.15 0.24 8
5 11.1 1.6 0.28 0.44 15
6 10.5 1.6 0.30 0.48 16
7 10.2 1.6 0.36 0.56 19
8 11.0 1.8 0.48 0.76 26
9 10.8 1.3 0.52 0.82 28
10 10.8 1.7 0.61 0.97 33
* 전지질에 대한 몰%
** DPPC 1몰에 대한 몰%
*** 말레이미드화 DPPE 1몰에 대한 몰%

실시예 2와 마찬가지로 하여 혈장 중의 DXR을 정량하였다. 각 리포좀그룹에 대하여 혈장 중 DXR 농도의 평균치(±표준편차)를 도 2에 나타내었다. 혈장중 DXR농도는 리포좀에 결합한 PEG 양에 의존하여 증가하였지만, 전지질에 대하여 약 0.3몰%, DPPC에 대하여 약 17몰%의 도입량으로 최대치(plateau)에 도달하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 리포좀으로 부터 DXR이 누출된 경우에는 누출된 DXR은 혈중에서 빠르게 소실되는 것이 확인되어졌기 때문에, 실시예 2 및 3의 결과에서 나타내어진 혈장 중 DXR 농도는 리포좀에 봉입된 DXR에 유출되는 것이라고 생각되어진다.
실시예 4: PEG 및 항체 결합리포좀의 제작(약효시험, 동태시험)
실시예 1의 방법에 따라, 리포좀 전지질 100mg에 대하여 항체를 0.5, 1.2, 2.0, 4.5, 5.3 및 11.4mg를 결합시킨 하기의 리포좀 2 내지 7(DXR봉입, PEG5000결합)을 제조하였다. 마찬가지로 항체를 결합시키지 않은 리포좀 1을 제조하였다. 또한, PEG 결합 리포좀에서는 PEG 결합량 범위(>4.4mg/100mg 지질)에 있어서 각 리포좀의 혈중 체류성은 동등하기 때문에, 이하에 나타내는 실험결과는 항체 결합량에 의존한다.
표 3
리포좀 항체결합량 mg/100mg지질 DXR봉입량 mg/100mg지질 PEG결합량 mg/100mg지질
1 0 9.5 8.2
2 0.5 9.1 8.2
3 1.2 9.5 8.1
4 2.0 8.9 5.3
5 4.5 9.6 6.2
6 5.3 9.7 6.4
7 11.4 10.0 3.2

위암 세포주 MKN 45를 누드마우스의 등쪽 2개소(1 X 106/1개소)에 피하이식하였다. 「약효시험」에 있어서는 종양의 장경, 단경의 측정이 가능한 충분한 크기에 달하는 시점에 항체 결합량이 다른 리포좀의 투여를 개시하였다. 리포좀의 투여량은 1회당 5.0mg/kg(DXR양 환산)으로 하고, 양성대조군으로 DXR 투여군 (5.0mg/kg)을 만들고, 대조군에는 생리식염수를 투여하였다. 전 집단에 있어서 투여 개시일(0일), 3일째 및 6일째에 정맥내 투여를 행하였다.
경시적으로 종양경(장경, 단경)을 측정하고, 추정 종양중량(단경2 X 장경/2)을 산정하였다. 3회의 투여종료 후, 19일째까지 측정을 계속하였다. 각 종양의 투여개시일의 추정종양중량을 1..0으로 하여 종양증식도를 산출하고, 대조군, DXR투여군에 대하여 각 처치군의 종양증식억제 효과를 평가하였다. 최종 측정일(19일째)의 각처치군에 대하여 %T/C치(처치군의 종양증식도/대조군의 종양증식도 X 100)을 산정하고, 각 시료의 항체 결합량과의 관게에서 종양증식억제 효과가 최대가 되는 항체 결합량(최적치)를 구하였다.
그 결과, 대조군에 대하여서 전체 처치군에 유의한 종양증식억제효과가 확인 되었고, DXR 투여군에 대해서는 도 3에서 알 수 있듯이, 결합 항체량이 0.5 내지 5.3mg/100mg전지질의 범위의 시료에서 유의한 종양증식억제성 효과가 확인되었고, 항체 결합량으로 2mg/100mg전지질 부근을 피크로 하여 종양증식억제 활성이 확인되었다.
「동태시험」에 있어서는 마우스에 항체 결합량이 다른 상기 리포좀 4 내지 7(2.0, 4.5, 5, 3 및 11.4mg/100mg전지질)을 정맥내에 투여하고(1군 2 내지 3마리, 1.0mg/kg, DXR량 환산), 투여 4시간 후에 각 개체에서 혈장을 채취하였다. 실시예 2와 마찬가지로 형광 측정법으로 혈장 중의 DXR량을 측정하였다. 각 시료를 투여한 후의 혈장 중의 DXR량을 비교하고, 항체 결합량과 DXR봉입항체 결합리포좀의 혈중체류성과의 관계를 구하였다. 동태시험에 있어서 항체 결합량 2mg/100mg지질 이상의 각 시료에 대하여서 각 시료 투여 후의 혈장 중 DXR량과 각 시료의 항체 결합량과의 관계를 구하였다(도 4). 그 결과, 항체 결합량이 2mg/100mg지질을 상회하면, 항체 결합량에 의존하여 혈중체류성이 저하되는 것이 확인되었다.
본 발명의 리포좀은 우수한 혈중 체류성을 가지고 있고, 폴리알킬렌글리콜의 결합량이 종래의 리포좀에 비하여 적은 특징이 있다. 따라서, 본 발명의 리포좀은 폴리알킬렌글리콜에서 기인하는 부작용을 회피할수 있고, 또한 공업생산성의 관점에서도 유리하다. 또한, 본 발명의 리포좀은 종래의 항체결합 리포좀에 비하여 우수한 치료효과를 달성시킬 수 있는 특징이 있다.

Claims (28)

  1. 지질말단의 일부가 말레이미드화된(maleimidated) 리포좀에 티올기가 부가된 폴리알킬렌글리콜이 티오에테르기를 통하여 결합된 리포좀으로, 전기 화합물의 결합량은 리포좀에 포함되는 말레이미드화 지질 1몰에 대하여 15 내지 50몰%인 리포좀.
  2. 제 1항에 있어서,
    티올기가 부가된 폴리알킬렌글리콜의 결합량은 말레이미드화 지질 1몰에 대하여 15 내지 30 몰%인
    리포좀.
  3. 삭제
  4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    티올기가 부가된 폴리알킬렌글리콜이 티오에테르기를 통하여 리포좀의 표면에 결합된
    리포좀.
  5. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    폴리알킬렌글리콜은 폴리에틸렌글리콜인
    리포좀.
  6. 제 5항에 있어서,
    티올기가 부가된 폴리알킬렌글리콜은 두개의 폴리에틸렌글리콜기를 가지는
    리포좀.
  7. 제 6항에 있어서,
    폴리에틸렌글리콜의 분자량은 2,000 내지 7,000달톤인
    리포좀.
  8. 제 6항에 있어서,
    폴리에틸렌글리콜의 분자량은 약 5,000달톤인
    리포좀.
  9. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    리포좀의 표면에 항체가 추가로 결합된
    리포좀.
  10. 지질말단의 일부가 말레이미드화된 리포좀에 항체가 티오에테르기를 통하여 결합된 리포좀이고, 전기 항체의 결합량은 리포좀에 포함되는 전 지질 100mg당 0.5 내지 4.5mg인 리포좀.
  11. 제 10항에 있어서,
    항체의 결합량은 말레이미드화 지질 1몰에 대하여 0.4 내지 0.7 몰%인
    리포좀.
  12. 제 10항 또는 제 11항에 있어서,
    리포좀은 말레이미드기를 가지는 리포좀과 항체유래의 황 함유기 를 반응시켜서 티오에테르 결합을 형성하여 수득되는
    리포좀.
  13. 제 10항 또는 제 11항에 있어서,
    항체가 사람의 모노클로날 항체인 GAH항체인
    리포좀.
  14. 제 10항 또는 제 11항에 있어서,
    항체가 사람의 모노클로날 항체인 GAH항체로부터 유래된 항체조각(fragment) F(ab')2인
    리포좀.
  15. 제 10항 또는 제 11항에 있어서,
    리포좀의 표면에 티올기가 부가된 폴리알킬렌글리콜이 추가로 결합된
    리포좀.
  16. 지질 말단의 일부가 말레이미드화된 리포좀에 티올기가 부가된 폴리알킬렌글리콜 및 항체가 티오에테르기를 통하여 결합된 리포좀으로, 전기 티올기가 부가된 폴리알킬렌글리콜의 결합량은 리포좀에 포함되는 말레이미드화 지질 1몰에 대하여 각각 15 내지 30몰%이고 및 전기 항체의 결합량은 리포좀에 포함되는 전 지질 100mg당 1.2 내지 2mg인 리포좀.
  17. 삭제
  18. 제 16항에 있어서,
    티올기가 부가된 폴리알킬렌글리콜은 티오에테르기를 통하여 리포좀의 표면에 결합된
    리포좀.
  19. 제 16항에 있어서,
    폴리알킬렌글리콜은 폴리에틸렌글리콜인
    리포좀.
  20. 제 19항에 있어서,
    티올기가 부가된 폴리알킬렌글리콜은 두개의 폴리에틸렌글리콜기를 가지는
    리포좀.
  21. 제 20항에 있어서,
    폴리에틸렌글리콜의 분자량은 2,000 내지 7,000달톤인
    리포좀.
  22. 제 20항에 있어서,
    폴리에틸렌글리콜의 분자량은 약 5,000달톤인
    리포좀.
  23. 제 16항 및 제 18항 내지 제 22항의 어느 한 항에 있어서,
    리포좀은 말레이미드기를 가지는 리포좀과 항체 유래의 황 함유기를 반응시켜서 티오에테르 결합을 형성하여 수득되는
    리포좀.
  24. 제 16항 및 제 18항 내지 제 22항의 어느 한 항에 있어서,
    항체는 사람의 모노클로날 항체인 GAH항체인
    리포좀.
  25. 제 16항 및 제 18항 내지 제 22항의 어느 한 항에 있어서,
    항체는 사람의 모노클로날 항체인 GAH항체로부터 유래된 항체조각(fragment) F(ab')2인
    리포좀.
  26. 제 1항, 제 2항, 제 10항, 제 11항, 제 16항 및 제 18항 내지 제 22항의 어느 한 항에 기재된 리포좀에 독소루비신이 봉입된 위암치료제.
  27. 제 1항, 제 2항, 제 10항, 제 11항, 제 16항 및 제 18항 내지 제 22항의 어느 한 항에 기재된 리포좀에 독소루비신이 봉입된 대장암치료제.
  28. 삭제
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Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8352400B2 (en) 1991-12-23 2013-01-08 Hoffberg Steven M Adaptive pattern recognition based controller apparatus and method and human-factored interface therefore
US7966078B2 (en) 1999-02-01 2011-06-21 Steven Hoffberg Network media appliance system and method
GB9915074D0 (en) * 1999-06-28 1999-08-25 Cortecs Plc Ligand-binding composition
EP1401376B1 (en) * 2001-04-30 2016-11-30 Cytimmune Sciences, Inc. Colloidal metal compositions and methods
US20050037061A1 (en) * 2001-07-25 2005-02-17 Saiko Hosokawa Remedies for mammary cancer
KR100470535B1 (ko) * 2002-06-27 2005-02-22 재단법인서울대학교산학협력재단 유피에이 항체 부착 이뮤노리포좀
WO2004089984A1 (ja) 2002-10-04 2004-10-21 Mitsubishi Pharma Corporation 抗体認識抗原
WO2004089419A1 (ja) * 2003-04-04 2004-10-21 The University Of Tokyo 抗ｍｔ－ｍｍｐモノクローナル抗体含有脂質膜構造体
ATE414106T1 (de) * 2003-06-30 2008-11-15 Domantis Ltd Pegylierte single-domain-antikörper (dab)
JPWO2006030602A1 (ja) * 2004-09-16 2008-05-08 田辺三菱製薬株式会社 卵巣癌の診断および／または治療薬
US20070298094A1 (en) 2004-11-18 2007-12-27 Terumo Kabushiki Kaisha Medicinal Composition, Preparation and Combined Preparation
US7786273B2 (en) 2005-03-14 2010-08-31 Medimmune, Llc Macromolecules comprising a thioether cross-link
US20110096174A1 (en) * 2006-02-28 2011-04-28 King Martin T Accessing resources based on capturing information from a rendered document
US9814672B2 (en) * 2007-03-09 2017-11-14 Susan T. Laing Echogenic vehicle for clinical delivery of plasminogen activator and other fibrin-binding therapeutics to thrombi
US20100080773A1 (en) * 2008-09-26 2010-04-01 Sdg, Inc. Orally Bioavailable Lipid-Based Constructs
US8962015B2 (en) 2007-09-28 2015-02-24 Sdg, Inc. Orally bioavailable lipid-based constructs
US8846053B2 (en) 2008-09-26 2014-09-30 Sdg, Inc. Orally bioavailable lipid-based constructs
WO2010055950A1 (ja) 2008-11-17 2010-05-20 財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 癌間質の構成因子に対して特異的結合能を有する物質と抗腫瘍性化合物との複合体による新規の癌ターゲティング治療
US9149432B2 (en) 2010-03-19 2015-10-06 Massachusetts Institute Of Technology Lipid vesicle compositions and methods of use
RU2595872C2 (ru) 2010-03-19 2016-08-27 Массачусетс Интитут Оф Текнолоджи Композиции липидных везикул и способы применения
US20150174209A1 (en) 2012-05-25 2015-06-25 Amylin Pharmaceuticals. Llc Insulin-pramlintide compositions and methods for making and using them
US11077173B2 (en) 2017-03-13 2021-08-03 Sdg, Inc. Lipid-based nanoparticles and methods using same
AU2018236190A1 (en) 2017-03-13 2019-09-26 Sdg, Inc. Lipid-based nanoparticles with enhanced stability
KR102630070B1 (ko) 2017-03-31 2024-01-26 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 알파-v 베타-3-양성인 암 줄기 세포(csc)를 표적화하여 사멸시키고 약물 내성 암을 치료하기 위한 조성물 및 방법
EP3978582B1 (en) 2019-05-29 2024-05-15 FPS Inc. Temperature-responsive fluorescent particles for detection of biomolecules

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0526700A2 (en) * 1991-05-23 1993-02-10 Mitsubishi Chemical Corporation Drug-containing protein-bonded liposome

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6787153B1 (en) * 1991-06-28 2004-09-07 Mitsubishi Chemical Corporation Human monoclonal antibody specifically binding to surface antigen of cancer cell membrane
CA2072249C (en) * 1991-06-28 2003-06-17 Saiko Hosokawa Human monoclonal antibody specifically binding to surface antigen of cancer cell membrane
JP3351476B2 (ja) * 1993-01-22 2002-11-25 三菱化学株式会社 リン脂質誘導体及びそれを含有するリポソーム

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0526700A2 (en) * 1991-05-23 1993-02-10 Mitsubishi Chemical Corporation Drug-containing protein-bonded liposome

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
biochimica et Biophysica Acta Vol 1245, 1995, pp 9-16(이하‘인용발명’이라함) *
Biochimica et Biophysica Acta, Vol.1245, 1995, pp9*
Biochimica et Biophysica Acta, Vol.1245, 1995, pp9-16 *

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