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JP4111368B2 - 抗体およびポリアルキレングリコール結合リポソーム - Google Patents

抗体およびポリアルキレングリコール結合リポソーム Download PDF

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JP4111368B2 JP2000613404A JP2000613404A JP4111368B2 JP 4111368 B2 JP4111368 B2 JP 4111368B2 JP 2000613404 A JP2000613404 A JP 2000613404A JP 2000613404 A JP2000613404 A JP 2000613404A JP 4111368 B2 JP4111368 B2 JP 4111368B2
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Description

技術分野
本発明は、リポソームに関する。より具体的には、抗体及び／又はポリアルキレングリコールが結合されており、優れた血中滞留性と治療効果を併せもつリポソームに関する。
背景技術
薬剤を特定部位に大量に輸送する手段として、リポソームに薬剤を封入し、その表面に抗体を結合する方法が提案されている。特に、癌治療の分野において、抗腫瘍剤を封入した抗体結合リポソームの有効性が数多く報告されている（Ｋｏｎｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｔｅｓ．，４７，４４７１，１９８７；特開昭５８−１３４０３２号公報）。さらに、リポソームの問題点、すなわち封入物の漏出や、リポソームの凝集及び網内系器官での捕捉などを改善する方法として、リポソームにポリエチレングリコールを結合する方法が提案されている（特開平１−２４９７１７号公報、特開平２−１４９５１２号公報、Ｋｌｉｂａｎｏｖｅｔ，Ａ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２６８，２３５，１９９０）。
特開平４−３４６９１８号公報には、薬剤を内包するリポソーム表面のマレイミド基と、各々のチオール基を介して結合する蛋白質及びポリアルキレングリコール部分を含む化合物残基を有することを特徴とする薬剤含有蛋白質結合リポソームが開示されている。このリポソームは、リポソーム表面のマレイミド基に対して、抗体に結合したチオール基とポリアルキレングリコール部分を含む化合物に結合したチオール基とを反応させることによって製造され、従来のリポソームでみられたような肝臓、脾臓などの網内系での非特異的取り込みが抑制されており、選択的な化学療法を達成できるという特徴がある。
上記公報には、リポソームに結合するポリアルキレングリコール部分を含む化合物の量は具体的に説明されていないが、マレイミド基（マレイミド化脂質）１モルに対して０．１モル％から２０モル％のチオール化抗体を反応させ、残存したマレイミド基に対して過剰量のチオール化ポリアルキレングリコール部分を含む化合物、好ましくは２倍等量以上を加え抗体結合ポリアルキレングリコール修飾リポソームを得ることが記載されている（００１６段落）。また、実施例に具体的に記載されたリポソームの製造方法では、全脂質１００ｍｇに対して５μモルのチオール化ポリエチレングリコール部分を含む化合物（換算すると全脂質に対して３．１モル％）を反応させており、脂質に対して大過剰のチオール化ポリエチレングリコール部分を含む化合物を反応させることにより、理論量（リポソーム表面に残存したマレイミド基の量）のポリエチレングリコールで修飾されたリポソームを得ているものと考えられる。
また、上記公報には、リポソームに結合する抗体の量も具体的に説明されていないが、マレイミド基（マレイミド化脂質）１モルに対して０．１モル％から２０モル％のチオール化抗体（換算すると全脂質１００ｍｇに対して０．３〜６０ｍｇ）を反応させることが説明されているが、実施例に具体的に記載されたリポソームの製造方法では、全脂質１００ｍｇに対して５ｍｇ（換算するとマレイミド化脂質に対して１．７モル％）の抗体を結合させており、上記公報には、それ以外の結合量についての具体的開示はない。
発明の開示
本発明者らは、特開平４−３４６９１８号公報に記載されたリポソームを基にして、さらに高い血中滞留性を有するとともに、安全性に優れたリポソームを提供すべく鋭意研究を行った。その結果、特開平４−３４６９１８号公報に記載されたリポソームにおいて、リポソームを修飾するポリアルキレングリコールの量を理論値（リポソーム表面に残存したマレイミド基の量）よりも低減させたところ、驚くべきことに、修飾量が理論値よりも少ないリポソームにおいても従来公知のリポソームとほぼ同等の血中滞留性が得られることを見出した。
また、本発明者らは、特開平４−３４６９１８号公報に記載されたリポソームを基にして、さらに高い治療効果を達成できるリポソームを提供すべく鋭意研究を行った。その結果、特開平４−３４６９１８号公報の実施例に記載されたリポソームにおいて、抗体の結合量を低減させたところ、驚くべきことに、上記公報の実施例に記載されたリポソームよりもはるかに高い治療効果を達成できることを見出した。本発明はこれらの知見を基にして完成されたものである。
すなわち本発明は、脂質末端の一部がマレイミド化されたリポソームにポリアルキレングリコール部分を含む化合物をチオエーテル基を介して結合したリポソームであって、該化合物の結合量がリポソームに含まれるマレイミド化脂質１モルに対して１５〜５０モル％であるリポソーム；該化合物の結合量がマレイミド化脂質１モルに対して１５〜３０モル％である該リポソーム；該リポソームが、マレイミド化脂質のマレイミド基と、チオール基を付加したポリアルキレングリコール部分を含む化合物とを反応させることにより得られるリポソームである該リポソーム；該化合物がリポソームの表面に結合した該リポソーム；ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコールである該リポソーム；該化合物が２つのポリエチレングリコール基を有する化合物である該リポソーム；ポリエチレングリコールの分子量が２，０００〜７，０００ダルトンである該リポソーム；ポリエチレングリコールの分子量が約５，０００ダルトンである該リポソーム；リポソームの表面にさらに抗体が結合した該リポソームが提供される。
また、脂質末端の一部がマレイミド化されたリポソームに抗体をチオエーテル基を介して結合したリポソームであって、該抗体の結合量がリポソームに含まれるマレイミド化脂質１モルに対して０．１〜２モル％であるリポソーム；該抗体の結合量がマレイミド化脂質１モルに対して０．４〜０．７モル％である該リポソーム；該リポソームが、マレイミド基を有するリポソームと抗体由来のイオウ含有基とを反応させてチオエーテル結合を形成することにより得られるリポソームである該リポソーム；抗体がＧＡＨ抗体である該リポソーム；抗体が抗体フラグメントがＦ（ａｂ´）２である該リポソーム；リポソームの表面にさらにポリアルキレングリコール部分を含む化合物が結合した該リポソームが提供される。
また、脂質末端の一部がマレイミド化されたリポソームにポリアルキレングリコール部分を含む化合物及び抗体をチオエーテル基を介して結合したリポソームであって、該化合物の結合量及び該抗体の結合量が、リポソームに含まれるマレイミド化脂質１モルに対して１５〜３０モル％及び０．４〜０．７モル％であるリポソーム；該リポソームが、マレイミド化脂質のマレイミド基と、チオール基を付加したポリアルキレングリコール部分を含む化合物とを反応させることにより得られるリポソームである該リポソーム；該化合物がリポソームの表面に結合した該リポソーム；ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコールである該リポソーム；該化合物が２つのポリエチレングリコール基を有する化合物である該リポソーム；ポリエチレングリコールの分子量が２，０００〜７，０００ダルトンである該リポソーム；ポリエチレングリコールの分子量が約５，０００ダルトンである該リポソーム；該リポソームが、マレイミド基を有するリポソームと抗体由来のイオウ含有基とを反応させてチオエーテル結合を形成することにより得られるリポソームである該リポソーム；抗体がＧＡＨ抗体である該リポソーム；抗体が抗体フラグメントがＦ（ａｂ´）２である該リポソームが提供される。
また、癌治療薬である該リポソーム；癌種が胃癌又は大腸癌である該癌治療薬：該リポソームを用いた癌治療方法が提供される。
発明を実施するための最良の形態
本発明のリポソームを構成する脂質としては、例えば、天然レシチン（例えば、卵黄レシチン、大豆レシチン）やジパルミトイルフォスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジミリストイルフォスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジステアロイルフォスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルフォスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジミリストイルフォスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジオレオイルフォスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジパルミトイルフォスファチジン酸（ＤＰＰＡ）、ジパルミトイルフォファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジミリストイルフォスファチジン酸（ＤＭＰＡ）等のリン脂質、スフィンゴ糖脂質、グリセロ糖脂質等の糖脂質、脂肪酸、両親媒性ジアルキルジメチルアンモニウム（ｄｉａｌｋｙｌ ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｎｏｎｉｕｍ ａｍｐｈｉｐｈｉｌｅｓ）、ポリグリセロールアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル等（Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，ｖｏｌ．１，１４１，１９９３）、アルキルグリコシド、アルキルメチルグルカミド、アルキルシュークロースエステル、ジアルキルポリオキシエチレンエーテル、ジアルキルポリグリセロールエーテル等（Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，ｖｏｌ．１，１４１，１９９３）、ポリオキシエチレン−ポリ乳酸等の両親媒性ブロック共重合体等（特表平６−５０８８３１号公報）などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。これらの脂質は単独で、又は２種以上を組み合わせて用いることができ、さらにコレステロール等の非極性物質、ＤＣ−ｃｈｏｌ（３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）ｃａｒｂａｍｏｙｌ］ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）等のコレステロール誘導体と組み合わせ用いてもよい。
本発明のリポソームにおいては、ポリアルキレングリコールを含む化合物及び必要に応じて抗体などの蛋白質の結合のために、脂質成分の一部として、例えばマレイミド化フォスファチジルエタノールアミンなどのマレイミド化された脂質（本明細書において「マレイミド化脂質」と呼ぶ。）を用いる必要がある。全脂質に対するマレイミド化脂質の割合は、通常、約０．５〜１０モル％である。
マレイミド化フォスファチジルエタノールアミンの例で説明すると、この化合物はアミノ基に反応性を有するマレイミド含有化合物とフォスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）のアミノ基との反応により得られる。該マレイミド含有化合物はカプロイル基、ベンゾイル基、フェニルブチリル基等の残基を含んでいてもよく、例えば、Ｎ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド、Ｎ−サクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート、Ｎ−サクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）プロピオネート、Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミド等を挙げることができる。ＰＥとしてはジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルフォスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジオレオイルフォスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）等のフォスファチジルエタノールアミン類が使用できるが、好ましくはＤＰＰＥである。脂質成分として、さらにステアリルアミン、ジセチルフォスフェートなどの荷電性物質を含んでいてもよい。また、本発明のリポソームは、ウイルスの一部または全部を組み込んだ融合リポソーム、例えばセンダイウイルスとリポソームを融合したリポソームであってもよい。
典型的なリポソームとしては、例えば、フォスファチジルコリン１モルに対して、コレステロールを０．３〜１モル、好ましくは０．４〜０．６モル、マレイミド化フォスファチジルエタノールアミンを０．０１〜０．２モル、好ましくは０．０２〜０．１モル、さらに好ましくは０．０２〜０．０５モルを含む脂質組成物を用いることができ、フォスファチジン酸を加える場合には０．４モル以下、好ましくは０．１５モル以下の脂質組成物を用いることができる。
本発明のリポソームの製造方法は特に限定されず、当業者に利用可能な方法はいずれも適用可能である。また、本発明のリポソームの形態も特に限定されず、いかなる形態であってもよい。例えば、ガラス壁に付着させた脂質薄膜に水溶液を加え、機械的振盪を加えて形成するマルチラメラリポソーム（ＭＬＶ）；超音波処理法、エタノール注入法、フレンチプレス法により得られるスモールユニラメラリポソーム（ＳＵＶ）；界面活性剤除去法、逆相蒸発法（リポソーム、砂本順三ら、南江堂、１９９８）、ＭＬＶを均一孔径を有するメンブランから加圧により押し出すイクストゥルージョン法等によって得られるラージユニラメラリポソーム（ＬＵＶ）のいずれであってもよい（Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ ｖｏｌ．１，１４１，１９９３）。リポソームの粒径は、例えば、３００ｎｍ以下、好ましくは３０から２００ｎｍ程度である。
本発明のリポソームには医薬を封入することができる。医薬の種類は特に限定されないが、例えば、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ダウノマイシン、ビンブラスチン、シスプラチン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）等の抗腫瘍剤；チモロール等のアドレナリン遮断剤；クロニジン等の高血圧剤；プロカインアミド等の制吐剤；クロロキニーネ等の抗マラリア剤；並びにそれらの薬学的に許容し得る塩及び誘導体；レニウム１８６、ヨード１３１、イットリウム９０等の放射性物質；リシンＡ、ジフテリアトキシン、ＴＮＦなどの生理活性物質及びそれらをコードするＤＮＡなどを用いることができる。もっとも、本発明のリポソームに封入可能な医薬はこれらに限定されることはない。
上記医薬の薬学的に許容し得る塩としては、薬学的に許容し得る多価陰イオン性物質との塩、例えば、クエン酸塩、酒石酸塩、グルタミン酸塩、及びそれらの誘導体との塩が好ましい。本発明のリポソームに封入する医薬としては、抗腫瘍剤が好ましい。本発明のリポソームには、治療用の医薬のほか、診断用の医薬を封入することもできる。診断用の医薬としては、放射性元素、例えばインジウム、テクネシューム等のイメージング薬剤；ヨード、ガドリニウム等の造影剤；ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ等の酵素；ユーロピウム誘導体などの蛍光体；Ｎ−メチルアクリジウム誘導体等の発光体などを挙げることができるが、これらに限定されるこはない。
これらの医薬をリポソームに導入する方法は特に限定されず、当業者に利用可能は方法はいずれも適用可能である。例えば、リポソーム形成時に水溶液として添加してリポソーム内部に封入してもよい。また、リポソーム形成後、ベジクル内外にｐＨ勾配などの濃度勾配を形成し、このポテンシャルを駆動力としてイオン化可能な薬剤をリポソーム内部に取り込ませる方法（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，４９，５９２２，１９８９；ＢＢＡ，４５５，２６９，１９７６）などを用いることができる。
本発明のリポソームは、ポリアルキレングリコール部分を含む化合物で修飾されており、さらに特定量の抗体で修飾されていることを特徴としている。ポリアルキレングリコールとしては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコールなどを用いることができるが、ポリエチレングリコールを用いることが好ましい。ポリエチレングリコールを用いる場合には、分子量が２，０００〜７，０００ダルトン程度のもの、好ましくは約５，０００ダルトン程度のものを用いることができる。
本発明のリポソームは、上記ポリアルキレングリコール部分を含む化合物がリポソーム表面のマレイミド化脂質にチオエーテル結合を介して結合した形態を有しているが、通常、ポリアルキレングリコールを含む化合物にチオール基を導入した後、この化合物をリポソームのマレイミド基と反応させることにより、ポリアルキレングリコールを結合させたリポソームを製造することができる。ポリアルキレングリコールを含む化合物としては、通常、ポリエチレングリコール基を有し、かつ末端をチオール化可能な化合物又は末端にメルカプト基を有する化合物を挙げることができる。具体的には、例えば、ポリアルキレングリコール基をトリアジンに結合した化合物、さらに該トリアジンがアミノ酸などにより置換された化合物を挙げることができる。この際、ポリアルキレングリコール基を２つ有する化合物（２本鎖）であってもよい。
ポリアルキレングリコールとしてポリエチレングリコールを用いる場合には、例えば、モノメトキシポリオキシエチレンアミンと各種チオールカルボン酸とを脱水縮合する方法；モノメトキシポリオキシエチレンアミンにＳＰＤＰでピリジルジチオプロピオニル基を導入し、さらに還元する方法；モノメトキシポリオキシエチレンアミンにイミノチオランによりチオール基を導入する方法；モノメトキシポリオキシエチレンカルボン酸の活性エステルと各種チオールアミンを結合させる方法；ポリエチレングリコールトリアジン誘導体をチオールアミンと縮合する方法などを利用することができる。さらに具体的には、２，４−ビス（ポチエチレングリコール）−６−クロロ−ｓ−トリアジン（活性化ＰＥＧ２（生化学工業株式会社製））をシスチンと反応させ、さらに還元してシステイン結合活性化ＰＥＧ２を得ることができる。
本発明のリポソームにおけるポリアルキレングリコール部分を含む化合物の導入量は特に限定されず、残存マレイミド化脂質に対して過剰に反応させてもよいが、ポリアルキレングリコールの好ましい導入量としては、全脂質に対して０．２８〜０．９０モル％程度、より好ましくは０．２８〜０．５６モル％程度、マレイミド化脂質に対しては１５〜５０モル％程度、より好ましくは１５〜３０モル％程度であり、ＤＰＰＣに対して０．４４〜１．４５モル％程度、より好ましくは０．４４〜０．８９モル％程度である。
本発明のリポソームは蛋白質、すなわち抗体で修飾されていてもよい。蛋白質としては、例えば、抗体、ＦＧＦ、ＥＧＦなどの種々の生理活性物質を用いることができるが、好ましくは抗体を用いることができる。抗体としては、抗体自体又は抗体フラグメント、又は抗体誘導体などを用いることができるが、抗体としては、抗体自体、又は抗体フラグメントのいずれを用いてもよい。本明細書において用いられる「抗体」という用語は、抗体自体及び抗体フラグメントのほか、誘導化又は修飾した抗体などを包含しており、最も広義に解釈しなければならない。また、抗体としては、治療対象となる組織、細胞、細菌、ウイルス等と反応性を有する抗体を利用することができる。例えば、各種動物のポリクローナル抗体、マウスモノクローナル抗体、ヒト−マウスのキメラ抗体、ヒトモノクローナル抗体などを用いることができる。異種動物の蛋白質ではない点から、ヒトモノクローナル抗体がより好ましい。抗体としては、特開平５−３０４９８７号公報に記載されたヒトモノクローナル抗体（ＧＡＨ抗体）を好適に用いることができ、例えば、上記公報の例７に具体的に示された方法に従って、ＧＡＨ抗体で修飾したリポソームを製造することができる。特開平５−３０４９８７号公報に記載のとおり、ＧＡＨ抗体は、胃癌及び大腸癌に反応性を有するので、本願のリポソームは胃癌や大腸癌等の癌治療薬として有用である。抗体の種類と封入すべき医薬との組み合わせを適宜選択することにより、治療効果に優れたリポソームを製造することができる。
抗体にチオール基を付与した後、リポソームのマレイミド基と該チオール化抗体とを反応させることによって、リポソームを抗体で修飾することができる。抗体へのチオール基の付与は、抗体のアミノ基に対して、蛋白質のチオール化に通常用いるＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピネート（ＳＰＤＰ）（Ｃａｒｌｓｓｏｎ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１７３，７２３，１９７８）やイミノチオラン、メルカプトアルキルイミデート（Ｔｒａｕｔ，Ｒ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１２，３２６６，１９７３）等の化合物を反応させる方法により行なうことができる。また、抗体の内在性ジチオール基を還元してチオール基として反応させることもでき、抗体活性の維持の点から内在性チオール基を用いる方法は好適である。
例えば、ＩｇＧを用いる場合はペプシン等の酵素でＦ（ａｂ´）２化し、さらにジチオスレイトール等で還元して得られるＦａｂ´に生じるチオール基をリポソームとの結合反応に利用することができる（Ｍａｒｔｉｎ，Ｆ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０，４２２９，１９８１）。ＩｇＭの場合には、ミラーらの方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７，２８６，１９６５）に準じ、緩和な条件でＪ鎖を還元して得られるＩｇＭｓのＦｃ部分のチオール基をリポソームとの結合に利用すればよい。特開平５−３０４９８７号に記載されたＧＡＨ抗体を用いる場合には、Ｆ（ａｂ´）２を用いることが好適である。チオール基が付与された抗体などの蛋白質とマレイミド基を含むリポソームとの結合は、中性の緩衝液（ｐＨ６．５〜７．５）中で２〜１６時間反応させることにより達成される。
本願の最も好ましい実施態様は、抗体及びポリアルキレングリコール部分を含む化合物とが結合されたリポソームであり、これを製造するためには、まず、マレイミド基を有するリポソームに対して中性の緩衝液中でチオール化抗体を反応させる。例えば、リポソームを構成する全脂質１００ｍｇあたり０．５〜５．３ｍｇ、０．５〜４．５ｍｇ、好ましくは１．２〜２ｍｇの抗体が結合するように、すなわちチオール化抗体をマレイミド基（マレイミド化脂質）１モルに対して、０．１モル％（具体的には０．１７モル％）から約２モル％程度（具体的には１．５モル％、１．８モル％）、好ましくは０．４〜０．７モル％反応させればよい。ついで、残存しているマレイミド基に対してチオール化ポリアルキレングリコール部分を含む化合物を反応させ、抗体とポリアルキレングリコール部分を含む化合物とが結合したリポソームを製造することができ、具体的には、マレイミド化脂質基１モルに対して、１５モル％から５０モル％、好ましくは１５〜３０モル％（全脂質に対して０．２８〜０．９０モル％、好ましくは０．２８〜０．５６モル％、ＤＰＰＣを用いる場合には、ＤＰＰＣに対して０．４４〜１．４５モル％、好ましくは０．４４〜０．８９モル％）のチオール化ポリアルキレングリコール部分を含む化合物を加え、抗体とポリアルキレングリコール部分を含む化合物が結合したリポソームを製造することができる。
本発明のリポソームの好ましい態様により、医薬、好ましくはドキソルビシンなどの抗腫瘍剤が封入されており、ポリエチレングリコール部分を含む化合物と抗腫瘍抗体とが結合したリポソームが提供される。上記の医薬含有リポソームは、公知の方法、例えば、脱水法（特表平２−５０２３４８号公報）、安定化剤を加え液剤として用いる方法（特開昭６４−９３３１号公報）、凍結乾燥法（特開昭６４−９９３１号公報）等により製剤化することができ、癌などの各種疾患の治療のために、血管内投与、膀胱内投与、腹腔内投与、局所投与などの方法で患者に投与することができる。投与量は有効成分の医薬の種類に応じて適宜選択することができるが、例えばドキソルビシンを封入したリポソームを投与する場合には、有効成分量として５０ｍｇ／ｋｇ以下、好ましくは１０ｍｇ／ｋｇ以下、より好ましくは５ｍｇ／ｋｇ以下で用いることができる。
実施例
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は以下の実施例に限定されることはない。
実施例１
（１）リポソームの調製及び薬物の封入
ジパルミトイルフォスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）／コレステロール／ε−マレイミドカプロイルジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン（ＭＣ−ＤＰＰＥ）（１８／１０／０．５モル比）からなる脂質混合物（１．６ｇ）に０．３Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）１６ｍＬを添加し、水和した後、液体窒素と６０℃の温浴で凍結融解を３回行ないマルチラメラリポソームを作製した。さらに押出し法により０．１μｍに整粒した。このリポソーム溶液に１ＭＮａＯＨを滴下して中和した後、６０℃に加温し、２０ｍｇ／ｍＬのドキソルビシン（ＤＸＲ、別名アドリアマイシン、ＡＤＭ）水溶液を脂質１００ｍｇあたり０．５ｍＬ添加して封入した。
（２）抗体のチオール化及びリポソームへの結合（抗体結合リポソームの作製）
１ｍＭＥＤＴＡを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解したＧＡＨ抗体（特開平４−３４６９１８号公報、特開平５−３０４９８７号公報に記載のもの、胃癌及び大腸癌反応性モノクローナル抗体、３ｍｇ／ｍＬ、１４．４ｍＬ）に３ｍｇ／ｍＬのイミノチオランを９２．４μＬ添加し、３７℃で１時間反応させてチオール基を導入した（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１２，３２０６，１９７３参照）。反応液をゲルろ過し、緩衝液を１ｍＭＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に交換した後、ドキソルビシン１ｍｇあたり０．２１ｍｇのチオール化抗体（１．７ｍｇ／ｍＬ）を加えて２５℃で１時間反応させ、リポソームに抗体を結合させた。
（３）ポリエチレングリコールのチオール化及びリポソームへの結合（ＰＥＧ結合リポソームの作製）
特開平４−３４６９１８号公報の方法に従って、２，４−ビス（ポリエチレングリコール）−６−クロロ−ｓ−トリアジンにシスチンを反応後、還元してチオール基を有するポリエチレングリコール（２本鎖型のＰＥＧ）を調製した。すなわち、シスチンを用いてチオール化ＰＥＧ（３０ｍｇ／ｍＬ、ＰＥＧ分子量２０００の２本鎖型（ＰＥＧ２０００）又はＰＥＧ分子量５０００の２本鎖型（ＰＥＧ５０００））を製造し、上記の反応液１ｍＬあたり０．１８ｍＬ添加して、１０℃で結合反応を行なった。反応開始後５〜２４０分後にサンプリングしてセファロースＣＬ６Ｂカラムにアプライし、未反応のチオール化ＰＥＧを除いて反応を停止し、ＰＥＧ量の異なるイムノリポソームを作製した。ＰＥＧ非結合イムノリポソームは、ＰＥＧ結合操作をしていないイムノリポソームを同様にセファロースＣＬ６Ｂでゲルろ過することで作製した。
（４）抗体及びＰＥＧ結合リポソームの作製
上記（２）で調製した抗体結合リポソームに対し、上記（３）中のチオール化ＰＥＧを反応させることで抗体及びＰＥＧの結合したリポソームを作製した。
（５）結合ＰＥＧ量の定量
イムノリポソームに結合したＰＥＧ量はＨＰＬＣ法により測定した。終濃度２％ＳＤＳ溶液としたイムノリポソーム溶液を６０℃で３０分間加温し、リポソームを完全に可溶化した。ＧＰＣカラム（東ソー株式会社製、２０００ＳＷＸＬ）を用い、ｐＨ７．５の緩衝液（２５ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、０．１％ＳＤＳ、７０％メタノール）で溶離してＰＥＧを分離し、２１５ｎｍで検出してエリア値から定量した。
（６）ＤＸＲ定量
サンプル５０μＬを５０％プロパノール／０．５Ｍ塩酸９５０μＬに添加し、５００ｎｍの吸光度を測定してＤＸＲを測定した。
（７）結合抗体量の定量
ＰＥＧ量の定量と同様にして、ＧＰＣカラム（東ソー株式会社製、３０００ＳＷＸＬ）を用い、ｐＨ７．０の緩衝液（２５ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、２００ｍＭＮａ２ＳＯ４、０．１％ＳＤＳ）で溶離して抗体を分離し、抗体ピークの２８０ｎｍで検出されるエリア値から定量した。
（８）脂質量の定量
脂質（ＤＰＰＣ及びコレステロールの総量）はＨＰＬＣ法により定量した。Ｌ−カラムＯＤＳ（化学品検査協会）４．６ｍｍ×２５０ｍｍに負荷し、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）／アセトニトリル／水（２：１：１、Ｖ／Ｖ／Ｖ、０．１％トリフルオロ酢酸）で溶離した。２１５ｎｍで検出を行ない、ＤＰＰＣに由来するピーク及びコレステロールに由来するピークのエリア値から定量した。脂質定量用サンプルはリポソームサンプル１容に対して上記溶離液９容を加えて調製した。
実施例２：ＰＥＧ結合リポソームの作製（体内動態試験）
実施例１の方法に従って、リポソームを構成する全脂質１モルに対して０〜約０．７モル％、ＤＰＰＣ１モルに対して０〜約１モル％、マレイミド化脂質１モルに対して０〜約４０モル％のＰＥＧを導入したリポソーム（ＤＸＲ封入、抗体非結合、ＰＥＧ２０００又はＰＥＧ５０００ 結合）を調製した。
Figure 0004111368
Figure 0004111368
ＢＡＬＢ／ｃＡｊｃｌ雄性マウス（６週齢）を実験に使用した。各リポソームについて１群４匹とし、ブランクとして非処理マウス１匹を実験に供した。ＤＸＲ量として２ｍｇ／ｋｇとなるように尾静脈内にリポソームを投与した。投与１６時間後、マウスにネンブタール注射液（大日本製薬株式会社製）を腹腔内投与し、麻酔下に開胸して採血し、血漿を分離してＤＸＲの分析に供した。
血漿１００μＬに０．３Ｍ塩酸−５０％エタノール（塩酸エタノール）１ｍＬを加え、６０℃で１０分間加熱してＤＸＲを抽出し、４℃に冷却して１５０００ｒｐｍで１０分間遠心して上清を採取した。この試料を塩酸エタノールで４倍に希釈し、励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５９０ｎｍの蛍光を測定した。塩酸エタノールで希釈した既知濃度のＤＸＲを用いて検量線を作製し、血漿中のＤＸＲを定量した。なお、マウス血漿からのＤＸＲ回収率は、ＤＸＲ換算３．７５μｇ／ｍＬ〜３０μｇ／ｍＬの範囲において９５〜９８％であった（参考文献：Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，４７，４４７１，１９８９）。
各リポソーム群についての血漿中ＤＸＲ濃度の平均値（±標準偏差）を第１図に示す。リポソームの血中滞留性の指標となる血漿中ＤＸＲ濃度は、ＰＥＧ５０００及びＰＥＧ２０００ともに、リポソームに結合したＰＥＧ量に依存して増加することが確認された。
実施例３：ＰＥＧ及び抗体結合リポソームの作製（体内動態試験）
実施例１の方法に従って、リポソーム全脂質に対して０〜０．６モル％、ＤＰＰＣに対して０〜約１モル％、マレイミド化ＤＰＰＥに対して０〜約３０モル％のＰＥＧを導入したリポソーム（ＤＸＲ封入、抗体結合、ＰＥＧ５０００ 結合）を調製した。
Figure 0004111368
実施例２と同様にして血漿中のＤＸＲを定量した。各リポソーム群についての血漿中ＤＸＲ濃度の平均値（±標準偏差）を第２図に示す。血漿中ＤＸＲ濃度は、リポソームに結合したＰＥＧ量に依存して増加したが、全脂質に対して約０．３モル％、ＤＰＰＣに対して約０．５モル％、マレイミド化ＤＰＰＥに対して約１７モル％の導入量でプラトーに達することが確認できた。なお、リポソームからＤＸＲが漏れた場合には、漏出したＤＸＲは血中から速やかに焼失することが確認されているので、実施例２及３の結果に示された血漿中ＤＸＲ濃度は、リポソームに封入されたＤＸＲに由来するものであると考えられる。
実施例４：ＰＥＧ及び抗体結合リポソームの作製（薬効試験、動態試験）
実施例１の方法に従って、リポソーム全脂質１００ｍｇに対して抗体を０．５、１．２、２．０、４．５、５．３、及び１１．４ｍｇ結合させた下記のリポソーム２〜７（ＤＸＲ封入、ＰＥＧ５０００ 結合）を調製した。同様にして、抗体を結合していないリポソーム１を製造した。なお、ＰＥＧ結合リポソームでは、ＰＥＧ結合量範囲（＞４．４ｍｇ／１００ｍｇ脂質）において各リポソームの血中滞留性は同等であるため、以下に示す実験結果は抗体結合量に依存する。
Figure 0004111368
Figure 0004111368
胃癌細胞株ＭＫＮ４５をヌードマウスの背側２ヶ所（１×１０６細胞／１ヶ所）に皮下移植した。「薬効試験」においては、腫瘍の長径、短径の測定が可能な十分な大きさに達した時点に、抗体結合量の異なるリポソームの投与を開始した。リポソームの投与量は、１回あたり５．０ｍｇ／ｋｇ（ＤＸＲ量換算）とし、陽性対照としてＤＸＲ投与群（５．０ｍｇ／ｋｇ）を設け、コントロール群には生理食塩水を投与した。全群につき、投与開始日（０日）、３日目、及び６日目に静脈内投与を行なった。
経時的に腫瘍径（長径、短径）を測定し、推定腫瘍重量（短径２×長径／２）を算定した。３回の投与終了後、１９日目まで測定を継続した。各腫瘍の投与開始日の推定腫瘍重量を１．０として腫瘍増殖度を算出し、コントロール群、ＤＸＲ投与群に対する各処置群の腫瘍増殖抑制効果を評価した。最終測定日（１９日目）の各処置群について％Ｔ／Ｃ値（処置群の腫瘍増殖度／コントロール群の腫瘍増殖度×１００）を算定し、各サンプルの抗体結合量との関係から、腫瘍増殖抑制効果が最大となる抗体結合量（最適値）を求めた。
その結果、コントロール群に対しては全ての処置群に有意な腫瘍増殖抑制効果が確認され、ＤＸＲ投与群に対しては、第３図に示すように、結合抗体量が０．５〜５．３ｍｇ／１００ｍｇ全脂質の範囲のサンプルに有意な腫瘍増殖抑制性効果が認められ、抗体結合量として２ｍｇ／１００ｍｇ全脂質付近をピークとした腫瘍増殖抑制活性が認められた。
「動態試験」においては、マウスに抗体結合量の異なる上記リポソーム４〜７（２．０、４．５、５．３、及び１１．４ｍｇ／１００ｍｇ全脂質）を静脈内投与し（一群２〜３匹、１．０ｍｇ／ｋｇ、ＤＸＲ量換算）、投与４時間後に各個体から血漿を採取した。実施例２と同様に蛍光測定法により血漿中のＤＸＲ量を測定した。各サンプル投与後の血漿中のＤＸＲ量を比較し、抗体結合量とＤＸＲ封入抗体結合リポソームの血中滞留性との関係を求めた。動態試験において抗体結合量２ｍｇ／１００ｍｇ脂質以上の各サンプルについて、各サンプル投与後の血漿中ＤＸＲ量と各サンプルの抗体結合量との関係を求めた（第４図）。その結果、抗体結合量が２ｍｇ／１００ｍｇ脂質を上回ると、抗体結合量に依存して血中滞留性が低下することが認められた。
産業上の利用可能性
本発明のリポソームは、優れた血中滞留性を有しており、しかもポリアルキレングリコールの結合量が従来のリポソームに比べて少ないという特徴がある。したがって、本発明のリポソームは、ポリアルキレングリコールに起因する副作用を回避することができ、また、工業生産性の観点からも有利である。さらに、本発明のリポソームは、従来の抗体結合リポソームに比べて、優れた治療効果を達成できるという特徴がある。
【図面の簡単な説明】
第１図は、リポソーム（ＤＸＲ封入、抗体非結合）に結合したポリエチレングリコール量と血漿中ＤＸＲ濃度との関係を示した図である。横軸はＰＥＧ量（ＤＰＰＣ１モルに対するモル％）を示す。全脂質に対するモル％及びマレイミド化ＤＰＰＥ１モルに対するモル％の換算値は、それぞれ０．１６及び８．９（０．２５）；０．３２及び１７．８（０．５）；０．４８及び２６．７（０．７５）；０．６４及び３５．６（１）；並びに０．８１及び４５（１．２５）である（カッコ内はＤＰＰＣ１モルに対するモル％を示す）。
第２図は、リポソーム（ＤＸＲ封入、抗体結合）に結合したポリエチレングリコール量と血漿中ＤＸＲ濃度との関係を示した図である。横軸はＰＥＧ量（１００ｍｇ脂質に対するＰＥＧ量（ｍｇ））を示す。ＤＰＰＣ１モルに対するモル％、全脂質に対するモル％、及びマレイミド化ＤＰＰＥ１モルに対するモル％の換算値は、それぞれ０．２５、０．１６、及び８（２．５）；０．５０、０．３１、及び１７（５）；０．７５、０．４７、及び２６（７．５）；並びに１．０、０．６２、及び３４（１０）である（カッコ内は１００ｍｇ脂質に対するＰＥＧ量（ｍｇ）を示す）。
第３図は、リポソーム（ＤＸＲ封入）に結合した抗体量と腫瘍抑制効果（％Ｔ／Ｃ）との関係を示した図である。
第４図は、抗体結合量を２ｍｇ／１００ｍｇ脂質以上とした各サンプルについて血漿中ＤＸＲ量（血中滞留性）と抗体結合量との関係を示した図である。

Claims (13)

  1. 脂質末端の一部がマレイミド化されたリポソームにポリアルキレングリコール部分を含む化合物及び抗体をチオエーテル基を介して結合したリポソームであって、該化合物の結合量及び該抗体の結合量が、リポソームに含まれるマレイミド化脂質１モルに対して１５〜３０モル％及び全脂質１００ｍｇあたり１．２ｍｇから２ｍｇであるリポソーム。
  2. 該リポソームが、マレイミド化脂質のマレイミド基と、チオール基を付加したポリアルキレングリコール部分を含む化合物とを反応させることにより得られるリポソームである、請求項１に記載のリポソーム。
  3. 該化合物がリポソームの表面に結合した請求項１又は２に記載のリポソーム。
  4. ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコールである請求項１乃至３のいずれかに記載のリポソーム。
  5. 該化合物が２つのポリエチレングリコール基を有する化合物である請求項４に記載のリポソーム。
  6. ポリエチレングリコールの分子量が２，０００〜７，０００ダルトンである請求項５に記載のリポソーム。
  7. ポリエチレングリコールの分子量が約５，０００ダルトンである請求項５に記載のリポソーム。
  8. 該リポソームが、マレイミド基を有するリポソームと抗体由来のイオウ含有基とを反応させてチオエーテル結合を形成することにより得られるリポソームである、請求項１乃至７のいずれかに記載のリポソーム。
  9. 抗体がＧＡＨ抗体である請求項１に記載のリポソーム。
  10. 抗体が、抗体フラグメントである請求項１に記載のリポソーム。
  11. 抗体フラグメントが、Ｆ（ａｂ´）２である請求項１０に記載のリポソーム。
  12. 請求項１乃至１１に記載の癌治療薬。
  13. 癌種が胃癌又は大腸癌である請求項１２に記載の癌治療薬。
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