KR20030013633A - Ｔａｇ-72 항원에 결합하는 반인간 단일클론항체 및 이를구성하는 인간경쇄 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 암 특이항원 TAG-72에 특이하게 결합하는 반인간 항체(semi-human monoclonal antibody)에 관한 것으로서, 구체적으로는 TAG-72에 대한 기존의 인간화 항체 AKA/HzK의 인간화경쇄를 상기 인간화경쇄 가변영역의 아미노산 서열과 완전히 다른 인간 경쇄로 치환한 반인간 항체에 관한 것이다. 본 발명의 반인간 항체는 기존 AKA/HzK 항체의 인간화경쇄를 인간경쇄 라이브러리와 치환 후, TAG-72에 특이하게 결합할 수 있는 것을 골라낸 것으로서, 경쇄의 아미노산 서열이 완전히 인간의 것으로부터 유래한 것이므로 인체에 반복 투여시 인체 면역반응을 유발하는 문제점을 개선하여 암의 진단 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 암 특이항원 TAG-72에 특이하게 결합하는 반인간 항체(semi-human monoclonal antibody)에 관한 것으로서, 구체적으로는 TAG-72에 대한 기존의 인간화 항체 AKA/HzK의 인간화경쇄를 상기 인간화경쇄 가변영역의 아미노산 서열과 완전히 다른 인간 경쇄로 치환한 반인간 항체에 관한 것이다.
종양-특이 당단백질-72(tumor-associated glycoprotein-72, 이하 "TAG-72"라 약칭함)는 일종의 뮤신(mucin) 단백질로서, 대장암, 위암, 이자암, 유방암, 난소암 등의 광범위한 인간 암종(human carcinomas)에서 발현되는 암특이 항원이다. TAG-72에 특이한 항체로서는 1980년대 초 미국 NIH 국립 암 연구소(NIH NationalCancer Institute)의 제퍼리 쉬롬 박사(Dr. Jeffrey Schlom) 그룹에 의하여 사람 유방암 조직의 막분획을 면역원으로 사용하여 제조한 B72.3 생쥐 단일클론항체가 처음으로 보고되었다(Colcher et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,1981, 78, 3199). 그 후 B72.3보다 항원결합 친화도가 높은 2세대 항체인 CC49과 CC83 등이 동 연구그룹에서 개발되었다(Muraro et al.,Cancer Res.,1988, 48, 4588).
CC49나 CC83은 80% 이상의 대장암과 약 50%의 유방암에 결합하나 정상조직에는 거의 결합하지 않았다. 또한 I-131로 표지된 CC49나 CC83을 암환자를 대상으로 생체내 이미지(in vivoimaging)한 결과 원발성 암과 전이된 암을 검출하였다(Divgi et al.,Nucl. Med. Biol.,1994, 21, 9). 그러나, 생쥐 단일클론항체는 인체에 반복 투여하였을 경우 인체의 면역반응을 유발하여 부작용이 생기거나 치료효과가 감소된다. 따라서 이러한 면역반응을 최소한으로 줄이기 위하여 생쥐 항체의 항원결합부위인 CDR(complementarity determining region)과 항원결합 친화도를 높여주기 위하여 FR(framework region)의 몇 아미노산 잔기들을 인간 항체에 이식시킨 인간화 항체들을 제조하여 왔으며(Owens and Young,Journal of Immunological Methods,1994, 168, 149), 실제로 이러한 인간화 항체들을 환자에게 반복 투여할 경우 인체면역반응이 많이 감소됨이 보고되었다(Brown et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,1991, 88, 2663). 그러나, 인간화 항체라 하더라도 생쥐 유래의 아미노산 잔기들이 사람에게 면역반응을 유발시킬 가능성은 여전히 존재한다.
TAG-72에 대한 CC49 생쥐항체의 인간화 항체(HuCC49)도 카시미리 등에 의하여 제조되었으나(Kashmiri et al.,Hybridoma,1995, 14, 461) 상기 CC49 인간화 항체도 인체면역반응(HAMA, human anti-mouse antibody)을 유발시킴이 간접적으로 조사되었다. 따라서, 이러한 단점을 보완하기 위하여 가능한 한 최소의 생쥐유래의 아미노산 잔기를 가지며 항원결합 친화도를 유지하는 인간화 항체를 개발할 필요성이 대두되었다.
본 발명자들은 TAG-72에 대한 생쥐항체의 CDR 및 FR 서열과 가장 유사한 사람 유전자를 검색하고 이를 대상으로 인간화 항체의 경쇄 및 중쇄 유전자를 제조한 후 이들을 발현벡터에 클로닝하여 숙주세포를 형질전환한 다음 이를 배양하여 상기 HuCC49 인간화 항체보다 생쥐유래의 CDR 및 FR 아미노산 잔기들이 많이 감소되었지만 유사한 항원결합능을 가지는 인간화 항체 AKA/HzK를 개발하였고 특허출원한 바 있다(대한민국 특허출원 제1999-20451호).
이에, 본 발명자들은 상기 인간화 항체 AKA/HzK의 인간화경쇄를 완전한 인간경쇄로 치환하여 TAG-72에 대한 결합능은 그대로 유지하면서 인체에 투여시 면역반응을 유발할 가능성이 더 줄어든 신규 반인간 단일클론항체를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 TAG-72에 대한 기존의 인간화 항체 AKA/HzK보다 인체에 투여시 면역반응을 유발할 가능성이 더 줄어든 신규한 반인간 단일클론항체(semi-human monoclonal antibody)를 제공하는 것이다.
도 1은 인간경쇄 라이브러리로부터 TAG-72 항원에 결합하는 파지(phage)를 1차, 2차, 3차 및 4차로 패닝(panning)한 것을 나타낸 그래프이고,
□ : BSA, ▨ : PSM, ■ : BSM
도 2는 본 발명의 인간 경쇄 가변영역의 아미노산 서열을 나타낸 것이고,
... : Kabat Number의 해당 위치에 KCS10과 동일한 아미노산을 가지는 경우
--- : Kabat Number의 해당 위치에 아미노산이 없는 경우
도 3은 본 발명의 인간 경쇄를 포함하는 반인간 단일클론항체들을 Fab 형태로 발현하여 정제한 후 SDS-PAGE로 확인한 것을 보여주는 전기영동 사진이고,
레인 1 : AKA, 레인 2 : KCS10, 레인 3 : KCS18
레인 4 : KCS8, 레인 5 : KCS1, 레인 6 : KCS5
도 4는 본 발명의 반인간 항체 Fab의 항원결합능을 기존의 인간화항체AKA/HzK의 Fab과 비교한 것을 보여주는 그래프이고,
● : AKA, ○ : KCS1, ▼ : KCS5,
▽ : KCS8, ■ : KCS10, □ : KCS18
도 5는 본 발명의 pdCMV-dhfrC-AKA/HzK 벡터의 제조 과정을 보여주는 모식도이고,
도 6은 본 발명의 온전한 형태의 반인간 항체와 기존의 온전한 형태의 AKA/HzK 항체의 항원결합능을 비교한 것을 보여주는 그래프이다.
● : AKA, ○ : KCS1, ▼ : KCS5,
▽ : KCS8, ■ : KCS18
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인간 항체 유래의 경쇄를 가지며 암 특이항원 TAG-72에 특이적으로 결합하는 항체, 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터 및 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환 세포주를 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 인간 항체 유래의 경쇄를 가지며 가변영역과 불변영역으로 구성되는, 암 특이항원 TAG-72에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 및 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터를 제공한다.
상기에서, 암 특이항원 TAG-72에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄의 가변영역은 FR(framework region)과 CDR(complementary determining region) 부위로 구성되며,서열번호 9내지서열번호 13으로 기재되는 아미노산 서열 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 암 특이항원 TAG-72에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄는 인간화 항체 AKA/HzK의 경쇄를 완전한 인간항체의 경쇄로 치환하여 TAG-72에 대한 결합능은 그대로 유지하면서 인체에 투여시 면역반응을 유발할 가능성이 현저히 줄어든 신규한 인간항체의 경쇄이다.본 발명의 인간유래 항체의 경쇄는 인간 면역글로불린 카파 경쇄 생식세포주(human immunoglobulin kappa light chain germline)의 VK1 또는 VK4 패밀리(family)로부터 선택되는 것이 바람직하나, 이외의 다른 패밀리도 본 발명의 인간항체의 경쇄에 사용될 수 있음은 당업자에게는 당연하다 할 것이다.
본 발명자들은 인간화 항체 AKA/HzK의 경쇄보다 HAMA 반응의 가능성이 줄고 항원 결합능은 그대로 보유한, 암 특이항원 TAG-72에 특이적으로 결합하는 신규한 항체의 인간 경쇄를 제조하기 위하여, 먼저 인간 PBL(peripheral blood lymphocytes), 비장(spleen) 및 골수(bone marrow)로부터 인간경쇄 라이브러리를 제조하였다. 구체적으로, 인간 PBL, 비장, 골수로부터 총(total) RNA를 분리하였으며, 이를 주형으로 인간경쇄 cDNA를 선택적으로 합성하였다. 다시 상기 cDNA를 주형으로 인간 경쇄 (Kappa chain) 가변 영역(variable region)의 5' 특이 프라이머들과 인간 Kappa 경쇄 불변영역의 3' 말단 특이 프라이머를 사용하여 인간항체 경쇄 유전자를 PCR을 이용하여 선택적으로 증폭하였다.
상기 PCR로부터 얻은 DNA 단편들과 pC3-Q-AKA 벡터(대한민국 특허출원 제1999-20451호의 pC3-Q-HzCC49Fab-1 벡터의 중쇄 가변영역 93번 트레오닌 잔기를 알라닌으로 치환시킨 것)를 각각 같은 제한효소로 절단한 후 정제하였고, 정제된 두 DNA 단편을 접합(ligation)시킨 후 가열하여 효소를 불활성화시켰으며, 이후에 DNA를 하룻밤 동안 침전시켰다. 침전된 DNA를 에탄올로 세척한 후 건조시켜 증류수에 현탁하였으며, 이 라이브러리 DNA로E. coliTG1 세포를 형질전환시켰다. 형질전환된 세포는 2×YT 배지를 첨가한 후 진탕배양하였으며, 상기 세포에 VCSM13 헬퍼 파지(helper phage)를 접종한 후 정치하였고 다시 진탕배양하였다. 원심분리하여 세포를 침전시키고 침전된 세포를 2×YTAK 배지에 현탁한 후 하룻밤동안 진탕배양하였다. 다음날 배양액을 원심분리하여 세포를 침전시키고, 상층액에 있는 라이브러리 파지만을 수거하였다.
본 발명자들은 TAG-72에 특이적으로 결합하는 신규한 인간경쇄를 찾아내기 위하여, 상기에서 제조한 라이브러리 파지에 대하여 패닝(panning)과 검색(screening)을 실시하였다. 첫 번째 패닝에서 증폭된 파지를 세척 횟수를 늘리면서 PBST 용액으로 세척하여 2차, 3차 및 4차 패닝을 실시하였으며, 패닝을 거듭할수록 선택된 파지의 TAG72에 대한 항원결합능이 선택적으로 높아졌음을 확인하였다(도 1참조).
2, 4차 패닝 후 얻어진 파지 클론들을E. coliTG1에 감염시켜 플라스미드 DNA를 분리하였고 제한효소로 절단 후 다시 접합시켜 gIII를 제거하였으며,E. coliTG1에 형질전환시켜 soluble Fab을 발현하는 클론을 얻었다. 이들 중 TAG-72에 결합능을 갖는 클론들을 선별하였으며, 이들 클론에 형질전환된 벡터를 각각 pC3Q-KCS1, pC3Q-KCS5, pC3Q-KCS8, pC3Q-KCS10 및 pC3Q-KCS18로 명명하였다.
상기 클론들의 인간경쇄 가변영역의 염기서열을 결정한 결과, 각각서열번호 9내지서열번호 13으로 기재되는 아미노산 서열을 코딩하는서열번호 14내지서열번호 18로 기재되는 염기서열을 코딩하고 있음을 확인하였다. 상기서열번호 14내지서열번호 18로 기재되는 염기서열과 적어도 80% 이상의 유사성(homology)을 가지는 염기서열 또한 본 발명의 항체의 경쇄의 범주에 포함된다.
선별된 5 클론 중 4개(KCS1, KCS8, KCS10, KCS18)가 인간 카파 경쇄 생식세포주(human kappa light chain germline)의 VK1 패밀리에 속하는 유전자들이었고, 나머지 KCS5는 VK4 패밀리에 속하는 유전자들이었다. 이들 클론들의 CDR1, CDR2 및 CDR3 부위의 아미노산 서열들도 AKA/HzK의 인간화경쇄와 차이가 있었다(도 2참조).
본 발명자들은 염소 항-인간 IgG(goat anti-human IgG) 항체가 부착된 칼럼을 사용하여 배양 상등액에 존재하는 soluble Fab를 순수분리하였으며, SDS-PAGE를 이용하여 그 결과를 확인하였다(도 3참조). 상기 Fab 항체의 항원결합특이성과 결합능을 확인한 결과 인간경쇄를 포함하는 본 발명의 반인간 Fab 들이 야생형인 AKA/HzK Fab보다 높은 항원결합능을 가지는 것을 확인할 수 있었으며(도 4참조), 또한 반인간 Fab 들의 TAG-72에 대한 친화 상수(affinity constant)를 결정한 결과 이들 중 몇 개의 클론은 결합능이 AKA/HzK Fab에 비해 2배 이상 우수함을 알 수 있었다(표 1참조).
또한, 본 발명은 상기 항체의 경쇄를 포함하는 암 특이항원 TAG-72에 특이적으로 결합하는 반인간(semi-human) 단일클론항체, 상기 반인간 단일클론항체의 유전자를 포함하는 발현벡터 및 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환 세포주를 제공한다.
본 발명의 암 특이항원 TAG-72에 특이적으로 결합하는 반인간 항체는 상기에서 제공한 인간 항체의 경쇄 및 인간화 항체의 중쇄로 구성되는 항체이며, 어떠한 조합으로 구성되든지 모두 본 발명의 반인간 항체의 범주에 포함됨은 당업자에게는 있어서는 당연하다 할 것이다.
본 발명자들은 상기 인간 경쇄를 포함하는 완전한 IgG 형태의 반인간 항체를 동물세포로부터 제조하기 위하여, 인간화 항체 AKA/HzK의 발현벡터 pdCMV-dhfr-AKA/HzK(대한민국 특허출원 제1999-20451호)의 경쇄유전자의 클로닝 위치에 상기 인간항체의 경쇄 유전자를 클로닝하였다. 먼저, 본 발명자들은 상기 발현벡터 pdCMV-dhfr-AKA/HzK의 경쇄 유전자 안에 가변영역 유전자만을 클로닝할 수 있도록 가변영역과 불변영역 연결부위에 BsiWI 제한효소 인식서열을 넣은 카셋트 벡터 pdCMV-dhfrC-AKA/HzK를 제조하였다(도 5참조). 그 다음, 항체유전자의 신호 서열과 상기 pC3Q-KCS1, pC3Q-KCS5, pC3Q-KCS8 및 pC3Q-KCS18 내에 있는 인간경쇄 가변영역 서열을 재조합 PCR 방법으로 연결하여 각각의 가변영역유전자를 합성하고, 각 유전자를 BsiWI 제한효소를 이용하여 pdCMV-dhfrC-AKA/HzK에 클로닝하여 본 발명의 발현 플라스미드를 제조하였으며, 각각 pdCMV-dhfrC-KCS1, pdCMV-dhfrC-KCS5, pdCMV-dhfrC-KCS8 및 pdCMV-dhfrC-KCS18 이라 명명하였다. 이 중 pdCMV-dhfrC-KCS1은 2001년 8월 2일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호; KCTC 10028BP).
또한, 본 발명자들은 리포펙타민(Lipofectamine)을 이용하여 상기에서 제조한 본 발명의 발현플라스미드로 동물세포를 형질전환시킨 형질전환 세포주를 제조하였으며, 이로부터 완전한 형태의 IgG를 분리하였다.
본 발명자들은 상기에서 제조한 형질전환 세포주에서 발현되는 항체의 항원결합능과 항원결합친화도를 결정하기 위하여, 먼저 완전한 IgG 형태의 반인간 항체들의 항원결합능을 ELISA에 의하여 측정한 결과 본 발명의 KCS1, KCS5, KCS8 및 KCS18 항체 모두 야생형인 AKA/HzK 항체보다 항원결합능이 우수함을 확인하였다(도 6참조).
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 인간 경쇄 라이브러리(library)의 제조
본 발명자들은 인간화 항체 AKA/HzK의 경쇄보다 HAMA 반응의 가능성이 줄고 항원 결합능은 그대로 보유한 신규한 인간 항체의 경쇄를 제조하기 위하여, 먼저 인간 PBL(peripheral blood lymphocytes), 비장(spleen), 골수(bone marrow)로부터인간경쇄 라이브러리를 제작하였다.
구체적으로, 인간 PBL, 비장, 골수로부터 총(total) RNA를 분리하여, 이를 주형으로 역전사효소(Superscript II, Gibco BRL)와서열번호 1로 기재되는 프라이머 CK1d를 사용하여 인간경쇄 cDNA를 선택적으로 합성하였다. 다시 상기 cDNA를 주형으로 인간 경쇄의 Kappa 가변 부위(variable region)의서열번호 2내지서열번호 6으로 기재되는 5' 특이 프라이머들(VK1, VK2, VK3, VK4 및 VK5)과 프라이머 CK1d를 각기 쌍으로 사용하여 인간항체 경쇄 유전자를 PCR을 이용하여 선택적으로 증폭하였다. 또한, 다음 클로닝 단계의 효율을 증대시키기 위해서열번호 7내지서열번호 8로 기재되는 프라이머 VKext와 CKext를 사용하여 extension PCR을 수행하였다. 이 때, 이들 PCR 반응조건은 95℃에서 5분간 예비변성 후, 95℃에서 50초, 55℃에서 50초, 72℃에서 1분으로TaqDNA 중합효소(polymerase)를 사용하여 30회 수행하였다.
상기 PCR로부터 얻은 DNA 단편들을 상기 인간화 항체 AKA/HzK의 Fab 발현벡터인 pC3-Q-AKA 벡터(대한민국 특허출원 제1999-20451호의 pC3-Q-HzCC49Fab-1 벡터에서 중쇄 가변영역 93번 트레오닌 잔기를 알라닌으로 치환시킨 것)의 인간화경쇄 유전자 대신에 삽입하였다. 구체적으로 pC3-Q-AKA 벡터를 각각 제한효소XhoI과SacI으로 절단하여 정제하고, 상기 PCR로부터 얻은 DNA 단편을 16℃에서 하룻밤동안 방치하여 접합(ligation)시킨 후 70℃에서 10분간 가열하여 효소를 불활성화시켰다. 그 후에 글리코겐(glycogen)과 3 M 아세트산 나트륨(sodium acetate)을 첨가시키고, -20℃에서 에탄올을 가하여 DNA를 하룻밤 동안 침전시켰다. 침전된 DNA를 70%의 에탄올로 세척한 후 건조시켜 20 ㎕의 증류수에 현탁하였으며, 상기 라이브러리 DNA를E. coliTG1에 전기충격 유전자전달법(electroporation)으로 도입하였다. 상기 형질전환 과정을 구체적으로 설명하면,E. coliTG1 세포를 2x YT 500 ㎖에서 37℃에서의 OD(optical density)가 0.5 내지 0.7 정도가 될 때까지 진탕배양한 다음 얼음 위에서 30분간 방치하였다. 4℃, 4000 rpm에서 15분간 원심분리하여 상등액을 제거한 후, 침전된 세포를 10% glycerol 500 ㎖로 현탁하였다. 4℃, 5000 rpm에서 15분간 다시 원심분리하여 상등액을 제거한 후, 침전된 세포를 10% glycerol 250 ㎖로 현탁하였고, 4℃, 5000 rpm에서 15분간 다시 원심분리하였다. 상등액을 제거하고 침전된 세포를 10% glycerol 20 ㎖로 현탁한 후 4℃, 4000 rpm에서 15분간 원심분리하여 상등액을 제거한 후, 세포를 10% glycerol 1 내지 2 ㎖로 현탁하여 competent 세포를 제조하였다. 상기 competent 세포를 1.5 ㎖ 튜브에 300 ㎕씩 분주하여 사용할 때까지 -70℃에 보관하였다.
상기 competentE. coliTG1 세포 300 ㎕에 상기의 라이브러리 DNA를 첨가한 후 잘 섞어주고 얼음에서 1분간 정치한 뒤, 유전자전달기(electroporator, Biorad)에 2.5 kV, 200 Ω의 펄스(pulse)를 가하여 전기충격 유전자전달법으로 형질전환시켰다. 형질전환된 세포는 2×YT 배지를 첨가한 후 37℃에서 1시간 진탕배양하였으며, 상기 세포에 4×1010PFU(plaque forming unit)의 VCSM13 헬퍼 파지(helper phage)를 접종한 후 37℃에서 30분간 정치하였고 다시 37℃에서 30분간 진탕배양하였다. 원심분리하여 세포를 침전시키고 침전된 세포를 2×YTAK 배지에 현탁한 후 30℃에서 하룻밤동안 진탕배양하였다. 다음날 배양액을 원심분리하여 세포를 침전시키고, 상층액에 있는 라이브러리 파지만을 수거하였다.
<실시예 2> 패닝(panning) 및 검색(screening)
본 발명자들은 TAG-72에 특이적으로 결합하는 신규한 인간경쇄를 찾아내기 위하여 상기 실시예 1에서 제조한 라이브러리 파지에 대하여 패닝(panning)과 검색(screening)을 실시하였다. 이를 위하여, 먼저 TAG-72(+) 항원인 BSM(bovine submaxillary mucin, type-I-S, Sigma사 제품)을 10 ㎍/㎖ 농도로 웰 플레이트(microtiter well plate)에 넣고 4℃에서 밤새 방치하여 코팅(coating)하였다. 상기 웰을 PBS(phosphate buffered saline)로 2회 세척 후, 2% 탈지유(skim milk)를 첨가하여 37℃에서 2시간동안 방치하였다. 탈지유를 제거한 후 인간경쇄 라이브러리 파지를 상기 웰에 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 방치하여 BSM과 결합하게 하였다. 결합하지 않은 파지를 제거하기 위해 0.05% Tween 20이 첨가된 PBS(PBST)로 5회 세척 후, BSM에 특이적으로 결합하여 남아있는 파지를 0.1 M Glycine-HCl(pH 2.2)로 용출한 다음 2 M Tris 를 첨가하여 중화시켰고, 대수증식기까지 자란E. coliTG1 세포에 상기 용출하여 중화시켜둔 파아지를 첨가하여 상온에서 30분간 정치함으로써E. coliTG1 세포에 감염시켰다. 상기 감염된E. coliTG1 세포를 2×YTA 플레이트에 도말한 후 37℃에서 하룻밤 배양하였다.
다음날 플레이트에 2×YT를 첨가하여 세포를 긁어모은 후, 이를 2×YTA에 접종하여 37℃에서 진탕배양하였다. 여기에 4×1010PFU M13KO7을 접종한 후 37℃에서 30분간 정치시켰고 다시 37℃에서 30분간 진탕배양하였다. 원심분리로 세포를 침전시키고 침전된 세포를 2×YTAK 용액에 현탁한 후 30℃에서 하룻밤동안 진탕배양하였다. 다음날 세포 배양액을 원심분리하여 세포를 침전시키고 파아지만을 수거하였다. 첫 번째 패닝(panning)에서 증폭된 파지를 세척 횟수를 10번, 20번, 20번으로 늘리면서 PBST 용액으로 세척하여 2차, 3차 및 4차 패닝을 실시하였다.
패닝을 거듭할수록 항원결합능이 강한 파지가 증폭되었는지는 ELISA로서 확인하였다. 먼저 ELISA 플레이트의 각 웰에 BSA(Bovine serum albumin), TAG72(-) PSM(porcine submaxillary mucin)과 BSM 항원 각각 1 ㎍을 4℃에서 하룻밤 결합시키고 4% 탈지유로 2시간 블록(block)시킨 후 PBST 용액으로 4번 세척하였다. 1, 2, 3, 4차 패닝 후 용출한 파지를 1×1011PFU 첨가하여 37℃에서 2시간동안 반응시킨 후 PBST 용액으로 세척하였다. 2% 탈지유로 2차 항체인 항-M13 파지-HRP를 희석하여 ELISA 플레이트에 첨가하고, ABTS (2',2'-Azino-Bis(3-Ethylbenz- thiazoline-6-Sulphonic Acid) diammonium salt, Sigma)와 H2O2로 발색하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 패닝을 거듭할수록 선택된 파지의 TAG72에 대한 항원결합능이 선택적으로 높아졌음을 확인하였다(도 1).
2, 4차 패닝 후 얻어진 파지 클론들을 TG1에 감염시켜 플라스미드 DNA를 분리한 후 제한효소 SpeI-NheI으로 절단 후 다시 접합시켜 gIII를 제거하였고, 상기실시예 1과 동일한 방법으로E. coliTG1에 전기충격 유전자전달법으로 형질전환시켜 soluble Fab을 발현하는 클론을 얻었다. 이들 중 TAG-72에 결합능을 갖는 클론들을 상기 예와 같이 ELISA를 이용하여 골라내었으며, 이들 클론들을 각각 pC3Q-KCS1, pC3Q-KCS5, pC3Q-KCS8, pC3Q-KCS10 및 pC3Q-KCS18로 명명하였다.
상기 클론들의 인간경쇄 가변영역의 염기서열을 T7 Sequenase V2.0 DNA 시퀀싱 키트(Amersham)로 결정한 결과, 각각서열번호 9내지서열번호 13으로 기재되는 아미노산 서열을 코딩하는서열번호 14내지서열번호 18로 기재되는 염기서열을 코딩하고 있음을 확인하였다. 선별된 5 클론 중 KCS1, KCS8, KCS10, KCS18는 인간 카파 경쇄 생식세포주(germline) 유전자의 VK1 패밀리에 속한 반면, KCS5는 VK4 패밀리에 속한다는 것을 확인하였다. 이들 클론들의 CDR1, CDR2 및 CDR3 부위의 아미노산 서열들도 AKA/HzK의 인간화경쇄와 차이가 있었다(도 2참조).
<실시예 3> Fab 정제 및 항원결합능 분석
상기 실시예 2에서 얻어진 Fab 클론들을 37℃에서 진탕배양하면서 600 nm에서의 O.D 값이 0.5 내지 1.0 사이가 되도록 키운 후, 1 mM IPTG 용액으로 30℃에서 하룻밤동안 배양하여 Fab의 발현을 유도하였다. 배양 상등액에 존재하는 soluble Fab을 순수분리하기 위해 염소 항-인간 IgG(goat anti-human IgG)(Fab specific, Pierce)항체가 부착된 CNBr-활성화(activated) 세파로즈 칼럼(Sepharose-4B affinity column, Amersham)을 사용하였으며, SDS-PAGE를 이용하여 순수 분리되었음을 확인하였다(도 3).
상기 Fab 항체의 항원결합특이성과 결합능을 알아보기 위하여 ELISA 플레이트의 각 웰에 BSM 각 1 ㎍씩을 하룻밤동안 코팅하였고 2% BSA로 블록시킨 후 TBS-T로 3번 세척하였다. Fab 항체를 첨가하여 37℃에서 1시간동안 반응시켰고 TBS-T로 항원과 결합하지 않은 항체를 제거하였다. 2차 항체로 항-인간 F(ab')2IgG HRP를 TBS-T로 희석해서 결합시키고 OPD와 H2O2로 발색하여 492 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 인간경쇄를 포함하는 본 발명의 반인간(semi-human) Fab 들이 야생형인 AKA Fab보다 높은 항원결합능을 가지는 것을 확인할 수 있었다(도 4). 또한, BiAcore를 이용하여 반인간 Fab 들의 TAG-72에 대한 친화 상수(affinity constant)를 결정한 결과, 이들 중 몇 개의 클론은 결합능이 AKA Fab에 비해 2배 이상 우수함을 알 수 있었다(표 1).
| 클론 | Kon/104(M-1s-1) | Koff/10-3(s-1) | Kd |
| AKA | 1.3 | 13.3 | 1020 |
| kcs1 | 1.01 | 4.33 | 427 |
| kcs5 | 1.35 | 5.06 | 374 |
| kcs8 | 1.68 | 6.33 | 376 |
| kcs10 | 0.48 | 5.14 | 1060 |
| kcs18 | 2.21 | 8.41 | 381 |
Kon: 결합율(association rate) 상수,
Koff: 해리율(dissociation rate) 상수,
Kd: 해리 상수(dissociation constant, Koff/Kon)
<실시예 4> Fab로부터 완전한(whole) IgG의 제조를 위한 발현 플라스미드의 제조
본 발명자들은 상기 반인간 Fab KCS1, KCS5, KCS8 및 KCS18의 인간경쇄를 포함하는 완전한 IgG 형태의 항체를 제조하기 위하여, 인간화 항체 AKA/HzK의 발현벡터 pdCMV-dhfr-AKA/HzK(대한민국 특허출원 제 99-20451)의 경쇄유전자의 클로닝 위치에 상기 인간경쇄 유전자를 클로닝하였다.
먼저, 본 발명자들은 상기 발현벡터 pdCMV-dhfr-AKA/HzK의 경쇄 유전자 안에 가변영역 유전자만을 클로닝할 수 있도록 가변영역과 불변영역 연결부위에 BsiWI 제한효소 인식서열을 넣은 카셋트 벡터 pdCMV-dhfrC-AKA/HzK를 제조하였다(도 5). 구체적으로, pdCMV-dhfr-AKA/HzK를 주형으로서열번호 19및서열번호 20으로 기재되는 프라이머 LHS42와 KCBsiWIback 및서열번호 21및서열번호 1로 기재되는 프라이머 KCBsiWIfor와 CK1d를 각기 쌍으로 PCR을 행한 후, 다시서열번호 19및서열번호 1로 기재되는 프라이머 LHS42와 CK1d를 이용하여 재조합 PCR을 수행하였다. 이를 제한효소 HindIII와 XbaI으로 자른 후 원래의 pdCMV-dhfr-AKA/HzK 벡터의 경쇄부위에 치환하여 pdCMV-dhfrC-AKA/HzK를 제작하였다(도 5). 그 다음, 본 발명자들은 항체유전자의 신호 서열과 상기 pC3Q-KCS1, pC3Q-KCS5, pC3Q-KCS8 및 pC3Q-KCS18 내에 있는 인간경쇄 가변영역 서열을 재조합 PCR 방법으로 연결하여 각각의가변영역유전자를 합성하였다. 구체적으로, 항체유전자의 신호 서열을 합성하기 위하여 pdCMV-dhfr-AKA/HzK를 주형으로 하고서열번호 19및서열번호 22로 기재되는 프라이머 LHS42 및 KCleaderBack을 쌍으로 PCR을 수행하였다. 또한, 상기 Fab의 인간경쇄 가변영역 유전자를 합성하기 위하여, pC3Q-KCS1, pC3Q-KCS8, pC3Q-KCS18 벡터의 경우서열번호 23및서열번호 20으로 기재되는 프라이머 KCfor 및 KCBsiWIback를 사용하여 PCR을 수행하였고, pC3Q-KCS5의 경우에는서열번호 24및서열번호 20으로 기재되는 프라이머 KCforII 및 KCBsiWIback를 사용하여 PCR을 수행하였다. 다시, 신호서열과 인간경쇄 가변영역를 연결하기위하여서열번호 19및서열번호 20으로 기재되는 프라이머 LHS42 및 KCBsiWIback를 이용하여 재조합 PCR을 수행하였다. 이 때, PCR 반응 조건은 95℃에서 5분간 예비변성 후, 94℃에서 50초, 55℃에서 50초, 72℃에서 1분으로TaqDNA 중합효소(polymerase)를 사용하여 30회 수행하였다.
상기 DNA 단편의 양끝을 제한효소 HindIII과 BsiWI으로 절단한 후 상기의 동물발현 벡터인 pdCMV-dhfrC-AKA/HzK의 HindIII/BsiWI 위치에 삽입하여 본 발명의 발현 플라스미드를 제조하였으며, 각각 pdCMV-dhfrC-KCS1, pdCMV-dhfrC-KCS5, pdCMV-dhfrC-KCS8 및 pdCMV-dhfrC-KCS18 이라 명명하였다. 이 중 pdCMV-dhfrC-KCS1은 2001년 8월 2일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호; KCTC 10028BP).
<실시예 5> 완전한 IgG 형태의 반인간항체의 COS 세포에서의 발현
본 발명자들은 상기 실시예 4에서 제조한 본 발명의 발현플라스미드로 동물세포를 형질전환시켜 완전한 형태의 IgG를 제조하고자 하였다.
우선, COS7 세포를 소 태아 혈청(fetal bovine serum, FBS)이 10% 첨가된 DMEM 배양배지(GIBCO)에 접종하여 37℃, 5% CO2항온기에서 계대배양하였다. 상기 세포를 100 ㎜ 배양접시에 1 ×106세포/㎖ 농도로 접종하고 37℃에서 밤새 배양한 후 OPTI-MEM I(GIBCO) 용액으로 3회 세척하였다. 한편, 상기에서 제조한 항체발현벡터 pdCMV-dhfrC-KCS1, pdCMV-dhfrC-KCS5, pdCMV-dhfrC-KCS8 및 pdCMV-dhfrC-KCS18을 각각 5 ㎍씩 취하여 OPTI-MEM I 500 ㎕로 희석하였고, 25 ㎕의 리포펙타민(Lipofectamine, GIBCO)도 동일하게 OPTI-MEM I 500 ㎕로 희석하였다. 상기 항체발현 벡터와 리포펙타민 희석액을 15 ㎖ 튜브에 혼합하여 DNA-리포펙타민 혼합물을 제조한 후 이를 15분 이상 실온에서 방치하였다. 상기 각각의 DNA-리포펙타민 혼합물에 5 ㎖의 OPTI-MEM I을 첨가하였고 이를 깨끗이 세척된 COS7 세포에 골고루 혼합한 후 37℃, 5% CO2항온기에서 48시간동안 배양함으로써 본 발명의 변이체 발현벡터로 형질전환된 세포주를 제조하였다.
<실시예 6> 완전한 IgG 형태의 반인간 항체의 항원결합능 결정
본 발명자들은 상기 실시예 5에서 제조한 형질전환 세포주에서 발현되는 항체의 항원결합능과 항원결합친화도를 결정하기 위하여 ELISA를 수행하였다. 먼저, BSM을 웰당 250 ng씩 면역플레이트(immunoplate)에 첨가한 후 4℃에서 하룻밤동안배양하여 플레이트에 결합시킨 후 2% BSA로 블록(block)시키고 PBST로 4번 세척하였다. 상기에서 얻은 완전한 IgG 변이체가 포함된 COS7 세포배양액을 PBS를 사용하여 희석한 후 동일한 농도로 플레이트에 첨가하여 37℃에서 30분동안 반응시켰고 항원과 결합하지 않은 항체를 PBST로 제거하였다. 2차 항체로 사용된 항-인간 IgG(Fc specific)-HRP를 PBST를 사용하여 1:5000 농도로 희석하여 상기 1차 항체와 결합시키고 ABTS와 H2O2로 발색하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, KCS1, KCS5, KCS8 및 KCS18 항체 모두 야생형인 AKA 항체보다 항원결합능이 우수함을 확인하였다(도 6).
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 반인간 항체는 경쇄의 아미노산 서열이 완전히 인간의 것으로부터 유래한 것이므로, 인체에 반복 투여시 인체 면역반응을 유발하는 문제점을 개선하여 암의 진단 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
Claims (20)
- 인간화항체 AKA/HzK의 경쇄가 인간유래 항체의 경쇄로 치환된 TAG-72 항원에 특이적으로 결합하는 반인간 단일클론항체(semi-human monoclonal antibody).
- 제 1항에 있어서, 인간유래 항체의 경쇄는 인간 면역글로불린 카파 경쇄 생식세포주(human immunoglobulin kappa light chain germline)의 VK1 패밀리(family)로부터 유래된 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 반인간 단일클론항체.
- 제 1항에 있어서, 인간유래 항체의 경쇄는 인간 면역글로불린 카파 경쇄 생식세포주의 VK4 패밀리로부터 유래된 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 반인간 단일클론항체.
- 제 1항에 있어서, 인간유래 항체의 경쇄는서열번호 9로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 반인간 단일클론항체.
- 제 4항에 있어서, 상기 항체의 경쇄는서열번호 14로 기재되는 염기서열로부터 발현되는 것을 특징으로 하는 반인간 단일클론항체.
- 제 1항에 있어서, 인간유래 항체의 경쇄는서열번호 10으로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 반인간 단일클론항체.
- 제 6항에 있어서, 상기 항체의 경쇄는서열번호 15로 기재되는 염기서열로부터 발현되는 것을 특징으로 하는 반인간 단일클론항체.
- 제 1항에 있어서, 인간유래 항체의 경쇄는서열번호 11로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 반인간 단일클론항체.
- 제 8항에 있어서, 상기 항체의 경쇄는서열번호 16으로 기재되는 염기서열로부터 발현되는 것을 특징으로 하는 반인간 단일클론항체.
- 제 1항에 있어서, 인간유래 항체의 경쇄는서열번호 12로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 반인간 단일클론항체.
- 제 10항에 있어서, 상기 항체의 경쇄는서열번호 17로 기재되는 염기서열로부터 발현되는 것을 특징으로 하는 반인간 단일클론항체.
- 제 1항에 있어서, 인간유래 항체의 경쇄는서열번호 13으로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 반인간 단일클론항체.
- 제 12항에 있어서, 상기 항체의 경쇄는서열번호 18로 기재되는 염기서열로부터 발현되는 것을 특징으로 하는 반인간 단일클론항체.
- 제 5항, 제 7항, 제 9항, 제 11항 및 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체의 경쇄는 각각서열번호 14내지서열번호 18로 기재되는 염기서열과 80% 이상의 유사성(homology)을 가지는 염기서열인 것을 특징으로 하는 반인간 단일클론항체.
- 제 1항의 반인간 단일클론항체를 발현하는 발현 플라스미드.
- 제 15항에 있어서, 상기 항체의 경쇄 가변영역의 염기서열이서열번호 14로 기재되는 것을 특징으로 하는 발현 플라스미드(pdCMV-dhfrC-KCS1)(수탁번호 ; KCTC 10028BP).
- 제 15항에 있어서, 상기 항체의 경쇄 가변영역의 염기서열이서열번호 15로 기재되는 것을 특징으로 하는 발현 플라스미드(pdCMV-dhfrC-KCS5).
- 제 15항에 있어서, 상기 항체의 경쇄 가변영역의 염기서열이서열번호 16으로 기재되는 것을 특징으로 하는 발현 플라스미드(pdCMV-dhfrC-KCS8).
- 제 15항에 있어서, 상기 항체의 경쇄 가변영역의 염기서열이서열번호 18로기재되는 것을 특징으로 하는 발현 플라스미드(pdCMV-dhfrC-KCS18).
- 제 16항 내지 제 19항 중 어느 한 항의 발현 플라스미드로 형질전환된 동물세포주.
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| KR (1) | KR20030013633A (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8119132B2 (en) * | 2004-06-05 | 2012-02-21 | Korea Research Institute Of Bioscience And Biotech | Humanized anti-tag-72 monoclonal antibodies |
-
2001
- 2001-08-08 KR KR1020010047737A patent/KR20030013633A/ko not_active Application Discontinuation
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