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KR100479146B1 - 큰게놈dna결실유발법 - Google Patents

큰게놈dna결실유발법 Download PDF

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KR100479146B1
KR100479146B1 KR1019970707460A KR19970707460A KR100479146B1 KR 100479146 B1 KR100479146 B1 KR 100479146B1 KR 1019970707460 A KR1019970707460 A KR 1019970707460A KR 19970707460 A KR19970707460 A KR 19970707460A KR 100479146 B1 KR100479146 B1 KR 100479146B1
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KR
South Korea
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cells
locus
hprt
gene
construct
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KR1019970707460A
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아야 야코보비츠
히로히사 쓰다
Original Assignee
셀 제네시스, 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Abstract

본 발명의 방법은 유전자 표적화를 사용하여 게놈 DNA의 큰 단편을 치환형 표적화 작제물을 사용하여 결실시킨다. 이 치환 표적화 작제물은 선별가능한 마커를 포함할 수 있으며, 표적이 된 유전자좌의 5' 및 3' 측접 서열에 상동인 두 개의 서열 영역을 포함하도록 작제된다. 표적화 작제물을 원하는 세포주 내로 형질감염시킨 후에, 유전자 표적-중재 결실을 선별하여 확인하고 더욱 특성화한다. 적당한 유전자좌의 예로는 MHC 클래스 I 및 II 항원 및 카파, 람다 또는 중쇄의 가변 또는 불변 영역을 비롯한 면역글로불린 유전자가 있다.

Description

큰 게놈 ＤＮＡ 결실 유발법{Generation of Large Genomic DNA Deletions}
본 발명의 분야는 치환형 표적화 작제물(targeting constructs)에 의한 유전자 표적화를 이용한 큰 게놈 DNA 결실 유발에 의한 포유동물 유전자의 게놈 변형이다.
외인성 DNA 및 내인성 상동 염색체 서열 사이의 상동성 재조합에 의한 유전자 표적화가 마우스 배간 (embryonic stem, ES 세포)를 비롯한 마우스 내에서 배양된 포유동물 세포에서 고안된 돌연변이를 야기하거나 유전자 돌연변이를 수정하는 데, 그리고 "표적이 된 E 세포의 주입" 시에 이러한 돌연변이를 마우스 배선(germline)에 전달하는 데 훌륭한 수단임이 입증되었다 (Smithies et al., Nature, 317:320-234, 1985; Thomas et al., Cell, 51:503-512, 1987; Koller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:8927-8931, 1989; Kuhn et al., Science, 254:707-710, 1991; Thomas et al., Nature, 346:847-850, 1990; Schwartzberg et al., Science, 246:799-803, 1989; Doetschmann et al., Nature, 330:576-578, 1987; Thomson et al., Cell, 56:313-321, 1989; Shesely et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:4294-4298, 1991). 또한, 유전자 표적화에 의해 큰 결실을 야기하는 능력이, 특히 유전자 클러스터 및(또는) 다수의 카피 (copy)를 함유하는 큰 유전자 또는 복잡한 유전자좌에 관련하여 극히 유용함이 당업계에 잘 알려져 있다. 이러한 유전자에서, 완전한 표적화를 위해서는 통상적으로 여러가지 마커를 사용한 순차적인 표적화가 요구되며 이에 따라 ES 세포는 더욱 오랜 계대 (passage)가 될 수 밖에 없는데, 이러한 계대 배양 동안 배선으로의 전달 능력이 저하될 수 있다. 또한, 포유동물의 초대 배양 세포에 있어서 계대가 늘어나는 것은 세포의 분화 성향에 영향을 미칠 수 있다. 멤베르츠 등 (Mombaerts et al.)이 T-세포 항원 수용체 β-서브유닛 유전자좌에서 15 kb라는 상당한 크기의 결실을 성공하였지만 (Mombaerts et al., Proc., Natl. Acad. Sci. USA, 88:3084-3087, 1991), 더 큰 게놈 결실도 이룰 수 있는 방법에 대한 상당한 요구가 남아있다.
발명의 요약
본 발명은 야생형 유전자좌를 함유하는 세포에 야생형 유전자좌 중 결실될 영역의 5' 및 3' 측접 서열과 상동인 2개의 서열 영역을 포함하는 표적화 작제물을 도입함으로써 상기 세포의 게놈을 변형시키는 단계를 포함하는, 표적 유전자좌 내에 15 kb 보다 큰 결실을 갖는 포유동물 세포를 수득하는 방법을 제공한다. 이 방법은 상기 변형된 세포를 선별가능한 작용제(seletable agent)를 함유하는 배지 중에서 배양하는 단계 및 상기 결실을 함유하는 세포를 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 방법에서 표적 유전자좌는 임의의 유전자좌일 수 있으며, 예컨대 히포크산틴 포스포리보실트랜스퍼라제 (HPRT), 주조직적합성복합체 (MHC) 클래스 I 또는 II 또는 면역글로불린 유전자좌일 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 포유동물 세포는 본래의 세포일 수도 있고 형질전환된 세포주(cell line)일 수도 있으며, 예를 들면 랑게르한스섬, 부신수질 세포, 조골세포, 파골세포, 상피 세포, 내피 세포, B-림프구, T-림프구, 뉴런, 신경교 세포, 신경절 세포, 망막 세포, 배간 (ES) 세포, 간 세포, 골수 세포, 각질세포 및 근원 (근)세포를 비롯한 임의의 세포형도 가능하다.
보다 구체적으로, 본 발명은 또한 hprt가 결핍된, ES 세포를 비롯한 포유동물 세포를 제조하는 방법을 제공한다. 이 방법은 야생형 hprt 유전자좌를 함유하는 표적 세포 내로 상기 야생형 hprt 유전자좌가 위치한 게놈 부위에 상응하는 변형된 DNA 단편을 포함하는 표적화 작제물을 도입하는 단계를 포함하며, 이때의 상기 변형된 DNA 단편은, 야생형 hprt 유전자좌를 함유하는 천연 DNA의 hprt 유전자좌 제2 엑손 바로 하류의 제1 서열이 그의 55 kb 상류에 존재하는 야생형 서열과 연결된 (congruent) 것을 포함한다.
도 1은 하기 실시예 1에 기재된 바와 같이 정상 마우스 세포 및 돌연변이 E14TG2a 세포 내 hprt 유전자좌 및 55 kb를 결실시키는 데 사용된 표적화 작제물을 도시한다. (제한 효소 부위: B; BamHI, C; ClaI, E; EcoRI, X; XhoI, SS; SaII 및 XmnI).
도 2 (a 및 b)는 하기 실시예 1에 기재된 바와 같이 E14.1, E14TG2a, pm4.2 및 pm5x.1 세포 내 hprt 유전자 유전자좌의 펄스장 겔 전기영동 (PFGE)을 도시한다. (도 2a에서는, DNA를 SacII (A, B) 또는 BssHII (E, F)로 절단하고 5' 프로브 (A, E) 또는 3' 프로브 (B, F)로 프로빙 (probing)했고; 도 2b는 E14.1 및 pm4.2 ES 세포에서 hprt 유전자 내의 SacII 및 BssHII 제한 부위에 대한 도식적인 설명이다).
도 3 (a 및 b)는 하기의 실시예 1에 기재된 바와 같이 표적화 작제물 (pMp4)를 사용하여, 유전자 표적화된 55 kb 결실에 의한 마우스 hprt 유전자좌의 불활성화를 도시하고 (도 3a은 분석에 사용된 프로브 (5' 및 3' 프로브) 및 E14.1 세포, E14TG2a 세포 및 얻어진 표적화된 클론 내의 표적화 영역 주변의 hprt 유전자 구조이며 (B; BamHI, C; ClaI, X; XhoI, R; RsaI; jx; 연결부 (junction) 및 Ex; 엑손), 도 3b는 E14.1, E14TG2a 및 표적화된 ES 클론인 pm4.2 및 pm5x.1 내의 hprt 유전자 유전자좌의 서던 블롯 분석이다. DNA를 BamHI(A,B)로 또는 BamHI/ClaI(C,D)로 절단하고 5' 프로브 (A,C)로 또는 3' 프로브(B,D)로 프로빙했다).
본 발명의 방법에서는 치환형 표적화 작제물을 이용하여 유전자 표적화에 의해 게놈 DNA의 큰 단편을 결실시킨다. 이 치환 표적화 작제물은 선별가능한 마커를 포함할 수 있으며, 표적이 되는 유전자좌의 5' 및 3' 측접 서열과 상동인 두 개의 서열 영역을 함유하도록 작제된다. 이 표적화 작제물을 원하는 세포주에 형질감염시킨 후에, 유전자 표적화-매개 결실을 선별에 의해 확인하고, 서던 블롯 분석 및 펄스장 겔 전기영동 (PFGE)에 의해 특성화했다.
본 발명을 이용하여, 예를 들면 연구, 치료, 세포주 및 트랜스제닉 포유동물의 생성 등을 비롯한 임의의 목적을 위해 큰 게놈 결실을 창출하기 원하는 임의의 유전자좌에서 결실을 유발할 수 있음이 강조되어야 한다. 적당한 유전자좌의 예로는 T-세포 수용체, 주조직적합성복합체 (MHC) 클래스 I 및 II 항원, 및 면역글로불린 유전자좌 (예컨데, 카파, 람다, 또는 중쇄 유전자좌의 가변 및 불변 영역을 코딩하는 유전자 등) 등이 있다. 유전자좌의 다른 예로는 저밀도 지단백질 (LDL), 아포지단백질 E, 아포지단백질 B, 인자 VIII, 인자 IX, CS 막횡단 조절자 및 디스트로핀 유전자 등이 있다. 큰 게놈 결실을 함유하는 이러한 세포 및 트랜스제닉 포유동물을 사용하여 유전자 구조 및 기능, 또는 예를 들면 단백질 생산 또는 억제와 같은 생화학적 과정을 연구할 수 있다. 게다가, 트랜스제닉 포유동물을 세포, 기관, 또는 조직의 공급원으로 사용하거나, 또는 이를 사용하여 예를 들면 근위축증, 면역계 장애, 고콜레스테롤혈증, 혈우병 및 낭섬유증과 같은 인간 질환의 모델계를 제공할 수 있다.
트랜스제닉 포유동물은 인간이 아닌 동물, 구체적으로 영장류가 아닌 포유동물, 예를 들면 마우스, 래트, 기니아 피그 등의 작은 실험용 동물, 가축, 애완 동물 등일 수 있다. 트랜스제닉 포유동물을 사용하여 실험적으로 약물을 스크리닝하거나 생화학적 경로를 연구할 수 있다. 트랜스제닉 포유동물 (바람직하게는 마우스)을 사용하여, 본 명세서에 전문이 참고 문헌으로 인용된 PCT 출원 PCT/US91/00245 및 PCT/US93/06926에 기재된 바와 같이 이종발생성의 바람직하게는 인간 또는 변형 항체를 생산할 수도 있다. 마우스 배간 세포 내 내인성 면역글로불린 유전자좌에 큰 게놈 결실을 생성하고, 별도의 단계에서 사람 경쇄 및 중쇄 면역글로불린 유전자 복합체를 상기 마우스 배선에 도입한다. 이는 인간 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자를 적절한 진핵 또는 원핵 미생물에서 재작제하고, 생성된 DNA 단편을 (바람직하게는 마우스로부터 얻은) 수정된 난모세포 또는 배간 세포의 전핵 내로 도입함으로써 달성된다. 이 변형된 배간 세포로부터 부분적으로 유래되며, 배선을 통하여 유전적 변형을 전달할 수 있는 키메라 마우스가 생성된다. 마우스 면역글로불린 유전자좌가 결실된 균주와, 인간 면역글로불린 유전자좌를 함유하는 마우스 균주를 교배하면 순수한 인간 항체를 생산하는 마우스가 생긴다.
유전자 표적화에 적용시킬 수 있는 세포는 임의의 관심 포유동물 세포일 수 있으며, 세포 치료법, 연구, 시험관 내 다른 세포와의 상호 작용 등에 사용할 수 있는, 본래의 세포와 형질전환된 세포주 모두를 포함한다. 특별히 관심 있는 세포로는 랑게르한스섬, 부신수질 세포, 조골세포, 파골세포, 상피 세포, 내피 세포, B-림프구, T-림프구, 뉴런, 신경교 세포, 신경절 세포, 망막 세포, 배간 (ES) 세포, 간 세포, 골수 세포, 각질세포 및 근원 (근)세포 등이 있으나 이에 한정되지 않는다. 이 세포들은 임의의 포유동물 숙주, 바람직하게는 인간으로부터 얻을 수 있으며, 또한 뮤린 (murine) 및 다른 설치류, 토끼목 동물, 돼지류, 고양이과 동물, 소과 동물, 개과 동물 등이 있다.
이러한 치환 표적화 작제물은 내인성 유전자(들)이 발현되는 것을 방지하기 위하여 이 내인성 유전자(들)의 카피 1개 이상, 바람직하게는 2개 모두에 결실을 도입하기 위해 선택된 유전자좌의 내인성 유전자(들)의 적어도 일부를 포함할 것이다. 이 결실이 불활성화될 유전자의 1개 카피에만 도입되는 경우, 돌연변이되지 않은 표적 유전자 카피를 1개 갖는 세포가 증식되고, 이들을 제2 표적화 단계에 적용할 수 있으며, 여기서 이 결실이 제1 결실과 동일하거나 상이할 수 있고 원래 도입된 결실의 적어도 일부와 중첩될 수 있다. 이 제2 표적화 단계에서, 상동성이 있는 동일한 아암 (arm)을 가지나 상이한 포유동물 선별가능한 마커, 예를 들면 하이그로마이신 내성 유전자 (hygr)을 포함하는 표적화 작제물을 사용하여 동형접합(homozygous) 결실을 갖는 클론을 생산할 수 있다. 생성된 형질전환체를, 예를 들면 네거티브 또는 포지티브 선별가능한 마커를 사용하는 것과 같은 표준 절차에 의해 스크리닝하고, 이 세포의 DNA를 서던 블롯팅과 같은 표준 절차에 의해 더 스크리닝하여 야생형 표적 유전자의 부재를 확고히 할 수 있다. 별법으로, ES 세포가 표적화되고 이를 사용하여 결실이 이형접합형인 마우스를 만드는 경우에는, 결실에 대한 동형접합형은 이형접합형 마우스를 교배시킴으로써 달성할 수 있다.
제2 표적화 단계를 사용하지 않고도 포유동물 세포에서 동형접합형 결실을 야기할 수 있는 또 다른 수단으로는 본 명세서에 전문이 참고로 도입되는 PCT 출원 PCT/US93/00929에 기재된 바와 같은 유전자 표적화 사건의 동형부분이배체화(homogenotization)가 있다. 이 방법에서는, 제1 표적화 단계에서 표적화 작제물을 세포에 도입하여 원하는 게놈 결실을 생성한다. 그 다음, 이 세포들을 유전자-표적화된 재조합체에 대해 스크리닝하고, 이렇게 얻은 재조합체를, 증폭 이외의 방법에 의해 다수의 선별가능한 작용제 카피를 갖는 세포를 선별하기 위해 마커 유전자에 대한 더욱 고농도의 선별가능한 작용제에 노출시킨다.
표적화 작제물을 세포 내로 원하는 대로 도입시키는 DNA 벡터를 사용할 수 있다. 이 작제물은 작제물의 제조, 증폭, 숙주 세포의 형질감염, 및 작제물의 숙주 세포로의 통합 (integration)에 사용될 수 있는, 결실 표적화 작제물 외의 기능부를 포함하도록 변형시킬 수도 있다.
치환 표적화 작제물은 1개 부위에 결실을 갖고, 선별가능한 마커 유전자를 비롯한 삽입물을 또 다른 부위에 가질 수 있다. 마커, 예를 들면 네오마이신 내성과 같은 항생제 내성을 제공하는 유전자에 특히 관심이 있다. 표적 유전자 내로 삽입된 이러한 선별가능한 마커 유전자의 존재로 인해, 표적 벡터의 숙주 게놈 내로의 통합이 확인된다. 그러나, 상동성 재조합 또는 비-상동성 재조합이 일어났는지를 확인하기 위해서는 DNA 분석이 필요할 것이다. 이는 삽입물에 대한 프로브를 사용하여 삽입물에 측접한 5' 및 3' 영역을 이 작제물의 측접 영역을 너머 연장된 DNA가 존재하는 지에 대해 서열 결정을 하거나, 결실이 도입되는 경우에는 결실이 존재하는 지를 확인함으로써 결정할 수 있다.
치환 표적화 작제물의 포유동물 세포로의 도입에 사용될 수 있는 기술로는 인산 칼슘/DNA 공동침전법, DNA의 핵산 내로의 미세주입법, 전기천공법, 무손상 (intact) 세포와 박테리아 원형질체의 융합법, 형질감염법, 리포펙션법 (lipofection) 등이 있다. 이 DNA는 단일 또는 이중 가닥, 선형 또는 환형, 풀린 또는 나선형 DNA일 수 있다. 포유동물 세포의 다양한 형질감염 기술에 대해서는 본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 문헌 [Keown et al., Methods in Enzymology (1990) 185권 527-537쪽]을 참조한다.
게놈 결실은 15 kb보다 크며, 바람직하게는 50 kb 내지 3000 kb의 범위내 일 것이다. 보통 이 결실은 1개 이상의 엑손 일부, 1개 이상의 인트론 일부 또는 1개 이상의 인트론을 비롯한 코딩 영역의 적어도 일부를 포함하며, 측접한 비-코딩 영역의 일부, 구체적으로 5'-비코딩 영역 (전사 조절 영역)의 일부는 포함할 수도 있고 포함하지 않을 수도 있다. 따라서, 상동성 영역이 상기 코딩 영역을 너머 5'-비코딩 영역까지 연장될 수 있거나, 별법으로는 3'-비코딩 영역으로 연장될 수 있다. 이 상동성 서열은 약 500 bp이상을 포함해야 한다.
표적 유전자 작제물로부터의 상류 및(또는) 하류는 이중 교차가 일어났는 지를 확인할 수 있는 유전자일 수 있다. 이를 위하여, 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제 유전자를 사용할 수 있는데, 이는 기능성 HSV-tk 유전자를 함유하는 세포에 세포독성 효과를 미치는 아시클로비르 또는 간시클로비스와 같은 뉴클레오시드 유사체를 사용하여 티미딘 키나제 유전자의 존재 여부를 검출할 수 있기 때문이다. 이러한 뉴클레오시드 유사체에 대한 민감성이 없다는 것은 티미딘 키나제 유전자의 부재를 의미하고, 따라서 상동성 재조합이 일어난 경우에 이중 교차도 일어났음을 의미한다.
표적화 작제물은 포유동물 숙주 세포 내에서 기능성인 복제 시스템을 더 포함할 수 있다. 대부분의 부분에서, 이 복제 시스템은 시미안 바이러스(Simian Virus) 40, 엡스테인 바르 바이러스(Epstein-Barr virus), 유두종 바이러스, 아데노바이러스 등과 같은 바이러스 복제 시스템을 포함할 것이다.
유전자의 성질에 따라 삽입물 및(또는) 측접 유전자로서 선별가능한 마커 유전자를 사용하는 경우, 이는 야생형 전사 조절 영역, 구체적으로 프로모터 또는 인핸서와 같은 전사 개시 조절 영역 또는 여러가지 전사 개시 영역을 가질 수 있다. 유전자가 전사 개시 유전자 영역 (프로모터)가 포유동물 숙주 세포의 전사 기구에 의해 인식되지 않는 숙주로부터 유래된 경우에는 상이한 전사 개시 영역 (프로모터)가 언제나 필요할 것이다. 이 영역은 구성적 (constitutive) 영역일 수도 있고 유도가능한 (inducible) 영역일 수도 있다. 광범위하게 다양한 전사 개시 영역이 단리되었고 상이한 유전자들과 함께 사용되어 왔다. 포유동물 숙주로부터의 프로모터 또는 메탈로티오네인-I 및 II, 티미딘 키나제, β-액틴, 면역글로불린 프로모터, 인간 사이토메갈로바이러스 프로모터, SV40 프로모터 및 폴리오마 바이러스 프로모터에 특히 관심이 있다. 프로모터 외에도, 야생형 인핸서가 있을 수도 있고, 또는 상이한 유전자로부터 인핸서가 프로모터 영역에 연결될 수 있다.
표적화 작제물은 원핵 세포에 대한 복제 시스템, 특히 이. 콜라이 (E. coli)를 추가로 포함하여, 벡터 제조, 매번의 조작 후의 클로닝, 분석 (예를 들면 제한 맵핑 또는 서열 결정), 클론의 증식 및 추가의 조작을 위한 플라스미드 단리에 사용될 수 있다. 필요에 따라서는 세균 형질전환체 검출을 위해 다른 마커를 사용할 수 있다.
일단 표적화 작제물이 제조되면, 박테리아 서열의 선형화부를 결실시켜 더 조작하여, 상동성 서열 내에 짧은 결실, 예를 들면 60 bp 결실을 제공할 수 있다. 이 작은 결실은 표적이 된 구조 유전자의 한쪽 말단 또는 다른쪽 말단에 가까운 것이 일반적이다. 이렇게 제조한 후에, 이제 이 작제물을 표적이 된 세포 내로 도입될 준비가 된다. 이미 지적한 바와 같이, 임의의 편리한 기술을 사용하여 DNA를 표적 세포 내로 도입할 수 있다. 표적화 작제물의 도입 후에, 표적이 된 세포를 앞서 지적한 바와 같은 네오마이신 내성 및 아시클로비르 또는 간시클로비르 내성과 같은 포지티브 및(또는) 네가티브 마커에 의해 선별할 수 있다. 이어서, 원하는 표현형을 나타내는 세포를 제한 분석, 서던 분석, 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR), 펄스장 겔 전기 영동 (PFGE) 등에 의해 더 분석할 수 있다. 표적 유전자 부위에 결실(들)이 있음을 나타내는 단편을 확인함으로써, 상동성 재조합이 일어나 표적 유전자의 2개 카피 중 1개가 불활성화된 세포를 확인할 수 있다. 특히, PCR을 사용하는 것이 유전자 표적화가 일어난 세포를 검출하는 데 유리하다. 작제물 내의 서열에 대해 상보적이고 작제물 외부이고 표적 유전자좌에 있는 서열에 대해 상보적인 프라이머를 사용할 수 있다. 이러한 방법에서, 상동성 재조합이 일어났다면 상보적 쇄에 존재하는 2개 프라이머를 모두 갖는 이중나선 DNA만을 얻을 수 있다. PCR 생성물 서열의 예상 크기 또는 프라이머 서열의 존재 여부를 입증하여 상동성 재조합의 발생을 확인할 수 있다.
제2 작제물은, 표적 유전자 생성물, 예를 들면 hprt의 부재가 마커로서 사용될 수 있기 때문에, 선별을 위한 마커를 반드시 필요로 하지는 않는다는 점에서 제1 작제물과는 다를 것이다. 따라서, 다시 삽입, 결실 또는 치환을 사용하여 표적 유전자를 변형시키거나 불활성화시킬 수 있다.
표적 유전자가 결실되어 있고 MHC 클래스 I 또는 II 항원 또는 면역글로불린 영역을 코딩하는 유전자를 표적화할 때 특히 유용한 또 다른 세포 검출 방법으로는, 표적화 작제물 및 무수한 독립적으로 표적이 된 클론을 신속하게 검출할 수 있는 ELISA 기재의 검출 시스템을 사용할 수 있다. 이 방법에서는, 상동성 재조합을 위한 부위가 강력한 인핸서/프로모터, 예를 들면 CD4와 같은 에피토프를 함유하는 단백질 도메인에 융합된 인간 CMV 인핸서에 의해 구동된 재조합 융합 단백질을 생성하도록 고안될 수 있다. 이 에피토프는 이에 결합하는 리간드, 예를 들면 항체에 의해 검출할 수 있는데, 예를 들어 재조합 융합 단백질이 정확하게 표적이 된 세포에 의해 분비되어 분비된 융합 단백질을 인식하는 항체를 이용하는 ELISA 기재의 시스템을 사용하여 검출한다. 이 방법에서, 재조합 유전자좌의 5' 말단은 표적화 작제물로부터 유래되는 반면, 이 유전자좌의 3' 말단은 표적 유전자로부터 유래된다. 전체 5' 말단이 실험적으로 제어되기 때문에 재조합 융합 단백질의 발현도 및 궁극적인 이송 운명 모두가 규제될 수 있다. 배지를 스크리닝하여 β2-마이크로글로블린 에피토프를 함유하는 단백질을 포획하고 CD4 에피토프를 함유하는 단백질을 검출하는 ELISA로 융합 단백질을 검출한다. 이 방법은 ES 세포 등을 비롯한 다른 포유동물 세포형에 사용할 수 있다. CD4 에피토프 이외에도, 이 에피토프에 결합하는 리간드, 예를 들어 항체에 의해 인식되는 에피토프를 함유하는 다른 펩티드를 융합 단백질에 사용할 수 있다.
배간 세포, 특히 뮤린 숙주로부터의 ES 세포가 표적화되는 경우에는, 이러한 세포를 사용하여 트랜스제닉 동물을 만드는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 절차에 있어서는, 표적화 작제물을 ES 세포 내로 도입한 후에, 이 세포를 적당한 배지(예를 들면 소 태아 혈청을 함유하는 DMEM 배지) 내의 공급자 (feeder) 층에 플레이팅할 수 있다. ES 세포는 표적 유전자좌를 1개 (이형접합형) 또는 표적 유전자좌를 2개 모두 (동형접합형)를 가질 수 있다. 선별 배지를 사용하여 이 작제물을 함유하는 세포를 검출할 수 있으며, 콜로니를 충분한 시간 동안 증식시킨 후에, 콜로니를 취해 유전자 표적화가 일어났는 지를 분석할 수 있다. 앞서 기재된 바와 같이, 작제물 서열 내 및 외부의 프라이머를 이용하여 표적 유전자좌에서 PCR 또는 서던 블롯 분석 또는 PFGE를 사용할 수 있다. 이어서, 유전자 표적화를 나타내는 콜로니를 사용하여 마우스 배반포에 주입할 수 있다. 4 내지 6 주된 과잉배란 암컷에서 배란 3.5일 후에 자궁을 세정하여 배반포를 얻을 수 있다. 그 다음, ES 세포를 트립신 처리하고 변형된 세포를 배반포를 함유하는 액적에 첨가할 수 있다. 1개 이상, 일반적으로는 약 10개 이상이고 30개 이하의 변형된 배간 세포를 배반포의 포배강 내로 주입할 수 있다. 주입 후에, 1개 이상이고 약 15개 이하의 배반포를 가임신 암컷의 자궁 각에 각각 복귀시킨다. 그 다음, 이 암컷들이 낳은 새끼들을 유전자-표적 결실을 함유하는 돌연변이 세포의 존재 여부에 대해 스크리닝한다.
이형접합형 자손은 여러가지 유전형의 배반포 및 ES 세포를 제공하여 상이한 외피 색상의 키메라 자손을 생성하기 때문에 쉽게 검출할 수 있다. 임의의 표현형도 사용가능하며, 특히 유용한 표현형은 털 색상이고, 또는 원한다면 유전형을 살펴 변형된 게놈 DNA의 존재에 대해 프로빙할 수 있다. 일반적으로, 배반포를 양육모에게 도입한 지 16 내지 18일 후에 새끼가 태어난다. 이 이형접합형 동물을, 표적이 된 게놈 결실의 존재에 대해 스크리닝하고, 결실이 있는 수컷 및 암컷을 교배시켜 결실이 동형접합형인 동물을 생성한다.
이제까지 본 발명을 총괄적으로 설명했으며, 다음의 실시예는 설명을 위해 제공될 뿐이며 본 발명을 한정하는 것은 아니다. 상기와 하기에 언급된 모든 출판물은 참고 문헌으로서 본 명세서에서 인용된다.
실험
실시예 1: 치환형 유전자 표적화 작제물에 의한, ES 세포 내 마우스 hprt 유전자에서의 55kb 결실
재료 및 방법
세포 배양 및 형질감염
ES 세포주 E14.1 및 E14TG2a를 닥터 라예브스키 (독일, 콜른 대학) 및 닥터 홉퍼 (스코틀랜드, 에딘버그 대학)으로부터 각각 공급받았다. ES 세포를, 15% 열-불활성화 소 태아 혈청 (HYCLONE), β-머캅토에탄올 8 ㎕ 및 재조합 LIF (Esgro) 1,000 U/ml를 함유하고 항생물질로 보충된 둘베코스 변형 (Dulbecco's modified) 배지에서 증식시켰다. 이 세포를 미토마이신 C로 처리한 마우스 배 섬유아세포의 공급자 층에서 배양했다. E14.1 ES 세포 (2x107개/0.8 ml)를, 플라스미드 pMp4 또는 pMp5X로부터 BamHI/XhoI 및 BamHI/SalI 절단에 의해 절단한 표적화 작제물 15 ㎍의 존재하에 각각 250 V 및 960 V㎌에서 Gene-pulser (Biorad)로 전기천공시켰다. 인간 hprt 미니유전자 (minigene) (Reil et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:4299-4303, 1990)를 전기천공 (250V, 500 I1F 또는 960 ㎌) 또는 리포펙션 (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7413-7417, 1987)을 통해 ES 세포 내로 형질감염시켰다.
E14TG2a 세포 내에 결실 연결부를 갖는 게놈 단편의 클로닝 및 맵핑 및 유전자 표적화 작제물의 작제
E14TG2a 및 야생형 ES 세포주로부터 얻어 BamHI로 절단한 유전자 DNA를 분석한 결과, E14TG2a에서는 정상 마우스 DNA에 존재하는 7.0 kb 단편 대신에 엑손 2 및 3을 함유하는 신규한 9.2 kb BamHI가 확인되었다. 이 신규 9.2 kb 단편을 클로닝하기 위해 BamHI으로 절단한 E14.1TG2a DNA로부터의 게놈 라이브러리를 작제하고, hprt cDNA 프로브에 혼성화시켜 필요한 서열을 함유하는 클론을 확인하였다. 엑손 3 서열을 함유하는 9.2 kb 단편을 클로닝하고, 엑손 3 내의 XhoI 부위까지의 결실 연결부 서열을 함유하는 7.0 kb BamHI-XhoI 단편을 블루스크립트 (Stratagene) 작제물 내로 서브클로닝하여 pMP4 플라스미드를 만들었다.
pMP4에 존재하는 상동성 길이를 증가시키기 위해, 정상 ES 세포로부터 엑손 3 및 몇몇 인트론 3 서열의 3' 말단부를 포함하는 1.15 kb XhoI-EcoRI 단편을 클로닝하여, pMP4 중 BamHI/XhoI 단편의 정상적인 원래 위치에 삽입하여 pMP5를 만들었다. pMP5를 EcoRI으로 절단하고 클레노우(Klenow)를 사용하여 평활 말단으로 만들고 이 DNA를 다시 라이게이션시켜 엑손 3의 상류에 유일한 XmnI 부위를 만들어서, pMP5X를 작제했다. 2가지 작제물인 pMP4 및 pMP5X를 유전자 표적화 실험에서 표적화 작제물로 사용하여, E14.1 ES 세포에서 E14T62a 결실을 재생산했다.
HPRT-표적 ES 클론의 선별:
전기천공 후에, 2x106개 E14.1 ES 세포를 공급자로 코팅된 90 mm 플레이트상에 접종했다. 5 내지 6일 후에, 이들 세포를 트립신 처리하고 젤라틴-코팅된 90 mm 접시에 0.5x106개 ES 세포/플레이트 농도로 다시 접종하였다. 6-티오구아닌 (6-TG, 5 ㎍/ml)를 첨가하고 이 배지를 매 2일 마다 교환했다. 선별을 시작한지 7일 내지 10일 후에, 6TG 내성 ES 콜로니를 취하여 분석했다.
6-TG 내성 ES 클론의 분석
6-TG 내성 ES 클론으로부터 추출한 게놈 DNA를 여러가지 제한 효소로 절단하고 하기 프로브를 사용한 서던 블롯 분석으로 분석했다: ATCC로부터 얻은 마우스 hprt cDNA; pMP4로부터의 5' 프로브-400 bp BamHI/PstI 단편 (도 3 참조); 및 3' 프로브-E2 (마우스 hprt 유전자의 인트론 3로부터의 250 bp RsaI 단편). E14TG2a 내의 HPRT 결실 크기 및 유전자 표적-ES 클론 내의 HPRT 결실 크기를 CHEF DRII (BioRad)를 이용하여 PFGE에 의해 결정했다. 전기영동 조건은 0.5x TBE에서 15 초의 일정한 펄스 간격; 200 V, 20-22℃, 22 시간이었다.
ES 세포 미세주입 및 마우스 발생
문헌 (Bradley et al., Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells, Ed., Robertson, E.J. (IRL Oxford), pp. 13-151, 1987)에 기재된 바와 같이 ES 세포를 마우스 배반포 내로 미세주입하고, 키메라 마우스를 만들어 번식시켰다.
결과 및 고찰
129개의 배반포로부터 단리한 ES세포주인 E14의 6-TG 자발성 돌연변이체로서 제1 HRPT-결핍 ES 세포주인 E14TG2a를 선택했다. 먼저, E14TG2a에서 획득된 돌연변이를 특성화하여, hprt 유전자의 첫번째 2개 엑손, 그의 프로모터 및 미결정 길이의 상류 서열이 제거된 결실임을 확인했다. 이 결실 크기는 20 kb인 것으로 추정되나 정확한 크기를 측정하지는 않았다. E14.1 세포에서 유전자 표적화에 의해 E14TG2a 돌연변이를 재현하기 위하여, 이 돌연변이 세포주의 결실 연결부를 함유한 게놈 단편을 클로닝하고 결실의 정확한 크기를 측정했다.
E14TG2a에 대한 맵핑 분석은, 이 돌연변이에 의해 2에서 3에 걸친 7.0 kb 야생형 단편 대신에 9.2 kb BamHI 단편이 생성됨을 지시했다 (도 1 참조). E14TG2a BamHI 게놈 라이브러리로부터 엑손 3 서열을 함유하는 9.2 kb 단편을 클로닝하고 이를 사용하여 결실 연결부 영역을 추가로 맵핑하고 크기를 측정했다 (도 1 참조). 희귀한 제한 효소들을 사용하고 (PFGE) 3' 및 5' 프로브와의 혼성화에 의해 결실 크기를 결정했다 (도 1 참조). E14.1 및 E14TG2a로부터 단리된 ScaII-절단된 게놈 DNA의 서던 블롯과 5' 프로브와의 혼성화를 통해, 각각이 170 및 115 kb 단편임을 밝혀냈다 (도 2A 참조). 이 블롯과 3' 프로브를 혼성화시켰을 때는 동일한 170 및 115 kb 단편이 검출되었는데, 이는 ScaII 단편이 전체 결실 영역에 걸쳐 있음을 시사하며 E14TG2a 내의 55 kb 결실 크기를 의미한다. 이 결실 크기는, 2가지 세포주 모두로부터의 BsHII-절단된 DNA의 분석에 의해 추가로 확인하였다. E14TG2a 내에서는 5' 및 3' 프로브에 의해 하나의 125 kb 단편이 검출된 반면, E14.1에서는 5' 및 3' 프로브에 의해 각각 100 및 80 kb의 2가지 단편이 검출되었다. 이 분석은 결실 영역 내에 BssHII 부위가 존재함을 의미하며 결실 크기가 55 kb임을 추가로 확인해 준다.
E14.1 세포에서 마우스 HPRT 유전자의 55 kb 유전자 표적-결실
9.2 kb 결실 연결부 클론의 7.0 kb BamHI-XhoI 단편을 블루스크립트 작제물 내로 서브클로닝시켜 E14.1-hprt 유전자좌에 상동성이 있는 6.6 kb를 함유하는 pMP4 표적화 작제물을 만들었다. 또한, 추가의 1.1 kb 3' 상동부를 부가한 제2의 표적화 작제물인 pMP5를 만들었다 (도 1 참조). 두 개의 작제물 pMP4 및 변형된 pMP5 (엑손 3의 0.25 kb 상류에 위치한 EcoRI 대신에 XmnI 부위를 함유하고 선별가능한 마커가 없음)를 치환형 표적화 작제물로 사용하여 유전자-표적화에 의해 E14.1 세포 내에 55 kb 결실을 만들었다. 이 작제물을 E14.1 세포 내로 전기천공시키고 이 세포를 7 내지 10일 동안 6-TG로 선별하여 각각 24 및 16개의 6-TG-내성 클론을 만들었다. 모든 클론을 증식시키고, 3' 프로브를 사용하여 이들의 게놈 DNA를 서던 블롯 분석하였다. 유전자-표적 사건은 천연 E14.1 세포에서의 7.0 kb 단편과 대조적으로 9.2 kb BamHI 단편을 생성했다. pMP4 및 pMP5.2X 전기천공으로부터 생성된 두 개의 클론 pm4.2 및 pm5x.1은 예상한 바의 BamHI 패턴을 나타냈다 (도 3 참조). 또한, 이 9.2 kb 단편들도 5' 프로브에 혼성화되어, 모(母) 세포주인 E14.1 내의 12 kb 단편이 검출되었다.
상기 두 개의 클론 (pm4.2 및 pm5x.1)을 BamHI-ClaI 절단물을 써서 더 분석했다. 3' 프로브와 혼성화하여 pm4.2 및 pm5x.1 클론에서도 E14TG2a에서 검출된 바와 동일하나 E14.1에서는 결실된 5.2 kb가 밝혀졌다. 나머지 9.2 kb 단편은 불완전 ClaI 절단 (메틸화에 의한 것으로 생각됨)으로부터 초래되었다. 반면에, 5' 프로브와의 혼성화는 예상된 바와 같이 4가지 세포주 모두에서 4.0 kb BamHI-ClaI 단편이 존재함을 나타냈다 (도 3 참조). 이 결과는 유전자 표적화 사건으로부터 pm4.2 및 pm5x.1가 생성됨을 의미한다.
PFGE 분석을 통해 유전자-표적화된 55 kb 결실을 추가로 확인하였다 (도 2 참조). ScaII 및 BssHII로 소화시킨 후에, 클론 pm4.2 및 pm5x.1은 E14TG2a에 대해 검출된 크기와 동일한 크기의 단편들을 생성했다. 이것은 ES 세포 내에서의 유전자 표적화에 의한 E14TG2a 결실의 재현을 의미한다.
본 발명자는 상기 실시예에서 비교적 간단한 치환형 작제물을 사용하여 15 kb 보다 큰 결실이 창출될 수 있음을 증명했다. 이 실시예에서는, hprt-결핍 E14TG2a 세포로부터 유래된 치환 작제물 (Hopper et al., Nature, 326:292-295, 1987)로 hprt 유전자를 표적화하였다. 한편, 당 분야에서 다른 연구자들은 hprt 유전자를 표적으로 하였지만, 얻어진 결실이 본 발명자들이 증명한 것보다 상당히 작은 약 1-2 kb 및 19 kb 정도였다 (Thomas et al., Cell, 51:503-512, 1987; Doetschman et al., Proc. Natel. Acad. Sci. 85:8583-8587, 1988; Zhang et al., Mol and Cell, Bio, 14:2402-2410, 1994). 치환 작제물을 사용하여 본 발명자들은 hprt 유전자좌에 55 kb의 결실을 만들었다. 이 결과는 치환형 작제물을 사용하여 큰 DNA 단편을 결실시킬 수 있음을 입증한다.
상기의 발명을, 명확한 이해를 위해 설명과 실시예로 상세히 기재하였지만, 본 발명의 내용에 비추어 첨부된 청구의 범위의 취지 또는 범위를 벗어나지 않고 특정 변화 및 변형이 가능함을 당업자라면 쉽게 알 것이다.

Claims (9)

  1. a) 야생형 표적 유전자좌를 함유하는 세포 내로 상기 야생형 표적 유전자좌의 5' 및 3' 측접 서열과 상동인 두 개의 서열 영역을 포함하는 작제물을 도입함으로써 상기 세포의 게놈을 변형시키는 단계,
    b) 상기 작제물에 존재하는 선별가능한 마커를 함유하는 세포를 선별함으로써 표적 유전자좌 내에 약 50 kb 내지 약 3000 kb 범위의 게놈 결실을 함유하는 세포를 확인하는 단계, 및
    c) 상기 결실을 함유하는 세포를 회수하는 단계
    를 포함하는, 표적 유전자좌 내에 약 50 kb 내지 약 3000 kb 범위의 게놈 결실을 함유하는 인간이 아닌 포유동물 세포의 수득 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 표적 유전자좌가 히포크산틴 포스포리보실트랜스퍼라제 (HPRT) 유전자좌인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 표적 유전자좌가 주조직적합성복합체 (MHC) 클래스 I 유전자좌인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 표적 유전자좌가 주조직적합성복합체 (MHC) 클래스 II 유전자좌인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 표적 유전자좌가 면역글로불린 유전자좌인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 인간이 아닌 포유동물 세포가 랑게르한스 섬, 부신수질 세포, 조골세포, 파골세포, 상피 세포, 내피 세포, B 림프구, T 림프구, 뉴런, 신경교 세포, 신경절 세포, 망막 세포, 각질세포, 배간 (embryonic stem, ES) 세포, 간 세포, 골수 세포 및 근세포로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  7. 야생형 히포크산틴 포스포리보실트랜스퍼라제 (HPRT) 유전자좌를 함유하는 표적 세포 내로 상기 야생형 HPRT 유전자좌가 위치한 게놈 부위에 상응하는 변형된 DNA 단편을 포함하는 작제물을 도입하는 단계를 포함하며,
    이때의 상기 DNA 단편은, 야생형 HPRT 유전자좌를 함유하는 천연 DNA의 HPRT 유전자좌 제2 엑손 바로 하류의 제1 서열이 그의 55 kb 상류에 존재하는 야생형 서열과 연결된 (congruent) 것인, HPRT가 결핍된 인간이 아닌 포유동물 세포의 제조 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    a) 상기 작제물 내에 존재하는 선별가능한 마커를 함유하는 세포를 선별함으 로써 상기 결실을 함유하는 세포를 확인하는 단계 및
    b) 상기 결실을 함유하는 세포를 회수하는 단계
    를 추가로 포함하는 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제6항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된, 인간이 아닌 포유동물 세포.
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