KR100475008B1

KR100475008B1 - 디우리딘 테트라포스페이트 또는 그의 염의 결정 및 그의제조법, 그리고 그 화합물의 제조법

Info

Publication number: KR100475008B1
Application number: KR10-2001-7004083A
Authority: KR
Inventors: 마에다히데아키; 야마다토시로; 사토히로시; 노다유타카
Original assignee: 야마사 쇼유 가부시키가이샤
Priority date: 1998-10-02
Filing date: 1999-10-01
Publication date: 2005-03-08
Also published as: AU747096C; EA004513B1; CN1151166C; IL142181A; EA003167B1; WO2000020430A1; EP1043329B1; DE69902624T2; ES2183650T3; EP1043329A4; PL199434B1; HUP0103754A3; BR9914453A; SK4402001A3; CA2345624C; EA200100407A1; NO20011634D0; NZ510748A; SK283729B6; US20020156269A1

Abstract

본 발명은 P¹,P⁴-디(우리딘 5'-)테트라포스페이트(U₂P₄) 또는 그의 염의 고순도로 안정한 결정 및 U₂P₄를 음이온교환 크로마토그래피와 활성탄 크로마토그래피를 사용하여 정제하고 친수성유기용매로 결정을 석출시키는 제조방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 UMP를 출발원료로 하고, DPC와 PPi를 사용하여 U₂P₄ 또는 그의 염을 제조하는 방법에 있어서, (a) UMP-DPP와 PPi-유기알카리염을 반응시키는 공정에 있어서, UMP-DPP를 복수회로 나누어 첨가하는 것, (b) UMP-DPP와 PPi-유기알카리염을 반응시키는 공정에 있어서, 염기를 공존시키는 것, (c) U₂P₄합성반응 후에 알카리처리를 하는 것, 이들 중 적어도 하나 이상의 처리를 행하는 것을 특징으로 하는 U₂P₄또는 그의 염의 고수율 제조방법에 관한 것이다.

Description

디우리딘 테트라포스페이트 또는 그의 염의 결정 및 그의 제조법, 그리고 그 화합물의 제조법 {CRYSTAL OF DIURIDINE TETRAPHOSPHATE OR SALT THEREOF AND METHOD FOR PREPARING THE SAME, AND METHOD FOR PRODUCING SAID COMPOUND}

본 발명은 거담제 또는 폐렴치료약으로서 유용한 P¹,P⁴-디(우리딘 5'-)테트라포스페이트(U₂P₄) 또는 그의 염의 안정결정 및 그의 제조법, 및 U₂P₄ 또는 그의 염의 효율적인 제조법에 관한 것이다.

하기 식 (Ⅰ)로 표시되는 P¹,P⁴-디(우리딘 5'-)테트라포스페이트·테트라나트륨염 (U₂P_4·4Na)은 담 배출유도작용을 가지고 있으며 거담제, 폐렴치료약으로의 개발이 기대되는 화합물이다(미국특허 5,789,391호 공보, 미국특허5,763,447호 공보, 미국특허 5,635,160호 공보 등).

지금까지, U₂P₄은 결정 형태로 취득될 수 없어서 오직 동결 건조품으로 조제되였다(WO 99/05155, 실시예 1 참조). 즉, 지금까지 얻어지고 있는 U₂P₄의 순도는 통상 90% 전후로 낮았으며 U₂P₄의 합성에 있어서 생성되는 부생성물, 예컨대 우리딘 5'-테트라포스페이트(UP₄), 우리딘 5'-트리포스페이트(UTP), 우리딘 5'-디포스페이트(UDP), 우리딘 5'-모노포스페이트(UMP) 등의 뉴클레오시드 5'-(폴리)포스페이트류; 및 P¹,P⁴-디(우리딘 5'-)트리포스페이트(U₂P₃) , P¹,P⁴-디(우리딘 5'-)디포스페이트(U₂P₂) 등의 디뉴클레오시드 폴리포스페이트류가 혼재되어 있었다. 특히, UTP 등의 뉴클레오시드 5'-(폴리)포스페이트류와 U₂P₄와의 분리는 어렵고, 종래 정제에 사용되었던 이온교환 크로마토그래피만으로는 고순도의 U₂P₄를 조제하는 것이 매우 곤란하였다(WO 99/05155, Biochimica et Biophysica Acta, 438, (1976) 304-309).

이와 같이 순도가 낮은 동결 건조품은 흡습하기 쉬운 것 등의 결점을갖고 있으므로, U₂P₄를 의약품으로서 제제화하는 경우에는 습기를 배려한 특별한 제조장치가 필요하고, 제제 제조 후에도 엄중한 포장을 요하고, 또한 안정성이 나쁘기 때문에 유효기간이 매우 짧은 약제를 얻을 수밖에 없으므로, 고순도의 안정한 U₂P₄결정체를 얻는 것이 요망되고 있다.

한편, U₂P₄는 우리딘 5'-모노포스페이트(UMP)를 출발원료로 하고, 디페닐포스포로클로리데이트(DPC) 등의 활성화제와 피로포스페이트(PPi) 등의 인산화제를 사용하여 합성되나, 종래법에 의하면 합성수율은 약 10%로 극히 낮아서(WO 99/05155, 실시예 4B 참조), 도저히 실용적인 방법이 될 수 없었다. 따라서, 고수율로 대량합성에 적합한 제조법의 개발이 절실히 요망되고 있다.

본 발명의 목적은 의약품으로서 제제화 하는데 적합한 U₂P₄ 또는 그의 염의 안정한 결정 및 그의 제공하는 것이며, 또한 U₂P₄의 대량합성에 적합한 효율이 양호한 제조법을 제공하는 것이다.

도 1은 에탄올을 사용하여 석출한 U₂P₄ㆍ4Na 결정의 4수화물의 X선회절 스펙트럼을 나타낸다.

도 2는 에탄올을 사용하여 석출한 U₂P₄ㆍ4Na 결정의 8수화물의 X선회절 스펙트럼을 나타낸다.

도 3은 U₂P₄의 동결건조품의X선회절 스펙트럼을 나타낸다.

도 4는 에탄올을 사용하여 석출한 U₂P₄ㆍ4Na 결정의 8수화물의 결정 구조를 나타내는 사진이다.당해 사진은 편광현미경(배율 440배)을 사용하여 촬영한 것으로, 1㎝는 23㎛에 상당한다.

도 5는 에탄올을 사용하여 석출한 U₂P₄ㆍ4Na 결정의 8수화물의 적외선 흡수스펙트럼을 나타낸다.

도 6은 U₂P₄의 동결건조품의 적외선 흡수스펙트럼을 나타낸다.

도 7은 메탄올을 사용하여 석출한 U₂P₄ㆍ4Na 결정의 8수화물의 X-선회절 스펙트럼을 나타낸다.

[본 발명을 실시하기 위한 최량의 형태]

본 발명의 U₂P₄ 또는 그의 염의 결정은, 조 U₂P₄ 또는 그의 염을 특정의 수단으로 정제하고, 정제된 U₂P₄ 또는 그의 염 용액에 친수성 유기용매를 첨가하여 결정을 석출시킴으로서 얻어진다. 본 발명은 이하, (1) U₂P₄ 또는 그의 염의 정제 및 (2) U₂P₄ 또는 그의 염의 결정화로 나누어 설명한다.

(1) U₂P₄ 또는 그의 염의 정제

U₂P₄ 또는 그의 염의 정제는 음이온교환 크로마토그래피와 활성탄 크로마토그래피의 2종 크로마토그래피를 병용함으로서 행할 수 있다. 양 크로마토그래피 기술을 이용한 정제는 어느 것을 먼저 이용하여도 좋지만, 처음에 음이온교환 크로마토그래피를 행하고, 다음에 활성탄 크로마토그래피를 행하는 것이 U₂P₄의 순도를 향상시키는 점에서 바람직하다.

여기서 이용되는 음이온교환수지로서는 스티렌계 또는 아크릴계 수지를 기재로 하는 수지이면 좋고, 강염기성 음이온교환수지(예를 들면, AMBERLITE IRA[Rhom & Hass Co.], DIAION PA-312, DIAION SA-11A, [Mitsubishi Chemical Co., Ltd.]) 또는 약염기성 음이온교환수지 (예를 들면, AMBERLITE IRA 67[Rhom ＆ Hass Co.], DIAION WA-30[Mitsubishi Chemical Co., Ltd.])의 어느 것을 사용하여도 좋다.

활성탄으로는 파쇄상 또는 입상으로 정형된 크로마토그래피용 활성탄, 예를 들어 와코쥰야쿠고교샤(和光純藥工業社), 후타무라카가쿠고교샤(二村化學工業社)제 등의 시판품을 사용할 수 있다.

각 크로마토그래피는 뱃치식, 컬럼식 등 어떠한 형식도 좋고, 컬럼식 으로 행하는 경우, 음이온교환 크로마토그래피의 용출제로는 염산 등의 산수용액 또는 여기에 식염 등을 첨가하여 이온강도를 높인 것, 활성탄 크로마토그래피의 용출제로는 물 또는 수산화나트륨 등의 알카리 수용액을 각각 사용할 수 있다. 각각의 용출제의 농도는 0.001 M∼10 M의 범위내에서 바람직한 것을 소규모시험으로 적절하게 결정하면 좋다.

(2) U₂P₄ 또는 그의 염의 결정화

U₂P₄ 또는 그의 염의 결정화는 얻어진 정제 U₂P₄ 또는 그의 염을 함유하는 용액에 친수성 유기용매를 첨가하여 결정을 석출시킴으로써 행하여진다.

여기서 사용될 수 있는 친수성 유기용매로서는 메탄올, 에탄올 등의 탄소수 6이하의 알코올류; 아세톤 등의 케톤류; 디옥산 등의 에테르류; 아세토니트릴 등의 니트릴류; 및 디메틸포름아미드 등의 아미드류를 들 수 있다. 이중 알코올류, 특히 에탄올이 바람직하다.

보다 구체적으로는, 정제 U₂P₄ 또는 그의 염 용액, 또는 이 용액을 농축하여 얻은 슬러리를 pH 6∼9로 조정한 후, 60℃이하의 온도조건하에서 친수성 유기용매를 첨가하고, 결정을 석출시킴으로서 U₂P₄의 안정 결정을 얻을 수 있다.

이렇게 하여 얻어진 본 발명의 U₂P₄결정은 적어도 (1) U₂P₄가 95% 이상, (2) 기타 유연 화합물이 5% 이하인 순도를 갖는다.

본 발명에 있어서, 기타 유연 화합물로는 UP₄, UTP, UDP, UMP 등의 뉴클레오시드 5'-(폴리)인산류; 및 U₂P₃, U₂P₂ 등의 디뉴클레오시드 폴리인산류를 의미한다.

이와 같은 U₂P₄결정중에서도 (1) U₂P₄가 97% 이상, (2) UDP가 1%이하, (3) UTP가 1% 이하의 순도를 갖는 것이 바람직하며, 특히 (1) U₂P₄가 98% 이상,(2) UDP가 0.5% 이하, (3) UTP가 0.5% 이하의 순도를 갖는 것이 더욱 바람직하다.

이러한 고순도의 U₂P₄결정은 염, 수화물 또는 함수염의 형태이어도 좋고, 염으로는 나트륨염, 칼륨염 등의 알카리금속염; 칼슘염, 마그네슘염 등의 알카리토류금속염; 및 암모늄염 등의 약학적으로 허용되는 염을 예로 들 수 있다. 염의 치환수는 1∼4개의 금속으로 치환된 것을 들 수 있다.

상기 수화물로는 U₂P₄ 1분자에 대하여 3∼8분자의 물이 결합 또는 부착된 것을 예로 들 수 있으며, 또한, 함수염으로는 U₂P₄결정의 알카리금속염 1분자에 3∼8분자의 물분자가 결합 또는 부착된 것을 예로 들 수 있다.

U₂P₄염 결정의 바람직한 예로서는, U₂P₄ㆍ4Na결정 또는 그의 수화물을 들 수 있다. U₂P₄ㆍ4Na결정은 Cu-Kα선을 사용한 X선회절에 의한 회절각(2θ)이 5.9. 11.5, 12.4, 15.4, 17.2, 18.0, 19.8 및 20.5(°) 부근(오차범위는 ±0.1 °)에서 특징적인 피크를 나타내고, 또한 적외선 흡수스펙트럼에서는 1690, 1277, 1233, 1146, 1116 및 890(㎝^-1) 부근(오차범위는 ±2㎝^-1)에서 특징적인 피크를 나타낸다. 더욱이 U₂P₄·4Na결정은 고온, 다습 조건하에서 안정하고, 결정의 수분함량은 5∼15중량%에서 안정하여, 흡습성을 나타내지 않는 물성을 가지므로 취급이 용이하여 종래의 동결 건조품에 비하여 매우 유용하다.

이러한 U₂P₄·4Na결정은 당연한 것이나 상술한 바와 같이 (1) U₂P₄가 95% 이상의 순도를 나타내고 (2) 기타 유연 화합물 총량이 5%이하이다. 또한, 상기와 같이 바람직한 U₂P₄결정의 예로는 (1) U₂P₄가 97% 이상, (2) UDP가 1% 이하, (3) UTP가 1% 이하의 순도를 갖는 것 및 (1) U₂P₄가 98% 이상(2) UDP가 0.5% 이하 (3) UTP가 0.5% 이하의 순도를 갖는 것을 바람직한 예로 들 수 있다.

또한, 본 발명의 U₂P₄또는 그의 염의 결정에는 호변이성체도 포함한다.

본 발명의 U₂P₄또는 그의 염의 결정은, 필요에 따라 감압건조, 통풍건조, 가열건조 등의 통상의 방법으로 건조 한 후, 용기(병, 파우치, 캔, 앰플 등)에 충전한다. 용기에 있어서 봉입상태는 개방, 밀폐, 기밀, 밀봉의 어느 상태이어도 좋으나, 보존안정성을 유지하는 관점에서 개방상태는 바람직하지 않다.

다음으로 U₂P₄의 효율적인 합성법에 대해 설명한다.

종래, U₂P₄또는 그의 염의 주된 합성법은, 우리딘 5'-모노포스페이트(UMP)을 출발원료로 하고, 이 화합물을 디페닐포스포로클로리데이트(DPC) 등의 활성화제를 사용하여 활성체로 하고, 여기에 피로포스페이트(PPi) 등의 인산화제를 반응시킨다. 구체적으로, UMP의 트리부틸아민염에 DPC와 트리부틸아민을 첨가하여 활성화체인 UMP 디페닐포스페이트(UMP-DPP)를 얻은 후, 이것에 트리부틸아민 피로포스페이트 (TBA-PPi)를 반응시켜 약 9.6 %의 수율로 U₂P₄또는 그의 염을 얻고 있다(WO 99/05155, 실시예 4B 참조).

본 발명방법은, 이러한 종래법의 UMP-DPP와 PPi-유기알카리염을 반응시키는 공정에 있어서, (a) UMP-DPP을 복수회로 나누어 첨가하는 것; (b) 염기를 공존시키는 것; 및 (c) U₂P₄합성 반응 후에 알카리처리하는 것의 어느 것 또는 2종 이상을 조합한 것을 특징으로 하는 것이다.

여기서, "(a) UMP-OPP를 복수회로 나누어 첨가" 란 PPi-유기알카리염의 2배몰이 필요로 하는 UMP-DPP을 한 번에 반응시키는 것이 아니라 복수회로 나누어 첨가하는 것이다. 예를 들면, 최초에 PPi-유기일칼리염과 들몰량의 UMP-DPP를 반응시킨 후, 이어서 PPi-유기알카리염과 등몰량의 UMP-DPP를 첨가하여 반응시킨다. UMP-DPP의 첨가횟수에 특히 한정되는 것은 아니나, 2∼3회로 나누어 행하는 것이 수율향상의 점에서 바람직하다.

또, 여기서 말하는 PPi-유기알카리염의 예로는 헥실아민염, 디부틸아민염, 트리에틸아민염, 트리부틸아민염 등을 들 수 있다. UMP-DPP와의 반응은 PPi-유기알카리염을 DMF, DMAC, 포름아미드 등의 아미드계 용매; 디옥산, 테트라히드로푸란 등의 환상 에테르계 용매; 아세톤 등의 케톤계 용매; 및 디메틸이미다졸이디논, 헥사메틸인산트리아미드, 디메틸술폭시드, 아세토니트릴 등의 단독 또는 혼합용액에 용해하고, 이 용액에 UMP-DPP을 첨가하고, 이 혼합물을 실온에서 30분∼5시간 정도 반응시킴으로서 행할 수 있다.

"(b)염기를 공존시키는 것"이란 상기 PPi-유기알카리염과 UMP-DPP의 반응을 임의의 염기를 공존시켜 반응시키는 것이다. 염기의 예로는 피리딘, 2,6-루티딘, 2,4-루티틴, α,β,γ-피콜린, 2,4-디메틸아미노피리딘, α,β,γ-콜리딘 등의 피리딘계 염기 등을 들 수 있으며, 특히 피리딘이 바람직하다. 이러한 염기가 반응용매를 겸용하고 있는 경우에도 본 발명의 염기에 포함된다. 또한, 염기의 농도는 특별히 제한되지 않으나, UMP에 대하여 6당량 이상, 바람직하게는 18당량 이상의 염기를 첨가하는 것이 좋다.

또한 "(c) U₂P₄합성 반응 후에 알카리처리하는 것"이란 U₂P ₄합성액을 물로 퀀칭 후, 수산화나트륨, 암모니아, 수산화칼륨, 피리딘, 트리에틸아민, 탄산나트륨 등의 유기 또는 무기 알카리용액을 사용하여 처리하는 것을 말한다. 이러한 알카리처리를 행함으로써 퀀칭 후에 바로 정제하는 종래법에 비하여, U₂P₄의 분리 수율을 한층 향상시키는 것이 가능하다.

이러한 알카리처리는 물로 퀀칭 후, U₂P₄합성액에 알카리를 pH 8∼13, 바람직하게는 10∼12 정도가 되도록 첨가하고, 실온에서 10분∼5시간 반응시키는 것이다.

또, UMP로부터 UMP-DPP의 합성은 종래법이 적용될 수 있으며, 예를 들면, 통상의 방법에 의해 조제한 UMP 트리부틸아민염 등의 UMP 트리알킬아민염을 DMF, 디메틸아세트아미드(DMAC) 등의 아미드계 용매; 디옥산, 테트라히드로푸란 등의 환상 에테르계 용매; 아세톤 등의 케톤계 용매; 및 디메틸이미다졸이디논, 헥사메틸인산 트리아미드 등의 단독 또는 혼합용매에 용해하고, DPC와, 필요에 따라 트리알킬아민을 용액에 첨가하고, 이 혼합물을 실온에서 30분∼5시간정도 반응시켜 활성화체인 UMP-DPP를 합성할 수 있다.

본 발명자들은 U₂P₄의 정제법 및 UMP를 사용한 U₂P₄의 합성법에 관하여 예의 연구한 결과, 음이온교환 크로마토그래피와 활성탄을 사용한 크로마토그래피(활성탄 크로마토그래피)를 사용하여 정제된 U₂P₄를 이용함으로써 용이하게 이를 결정화할 수 있는 것, UMP를 출발원료로 하고 DCP와 PPi를 사용하여 U₂P₄또는 그의 염을 제조하는 방법에 있어서 특정의 반응조건을 설정함으로써 U₂P₄의 합성수율을 현저히 향상시킨다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명은 P¹,P⁴-디(우리딘 5'-)테트라포스페이트 또는 그의 염의 결정을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 Cu-Kα선을 사용한 X-선회절에 의한 회절각 (2θ)이 5.9, 11.5, 12.4, 15.4, 17.2, 18.0, 19.8 및 20.5(°) 부근에서 특징적인 피크를 나타내는 결정구조를 갖는 P¹,P⁴-디(우리딘 5'-)테트라포스페이트·4 나트륨염 결정을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 적외선흡수 스펙트럼중 1690, 1277, 1233, 1146, 1116 및 890(㎝^-1) 부근에서 특징적인 피크를 나타내는 결정구조를 갖는 P¹,P⁴-디(우리딘 5'-)테트라포스페이트ㆍ4 나트륨염 결정을 제공하는 것이다.

또한 본 발명은 조(粗) P¹,P⁴-디(우리딘 5'-)테트라포스페이트 또는 그의 염을 음이온교환 크로마토그래피와 활성탄 크로마토그래피를 이용하여 정제하고, 정제된 P¹,P⁴-디(우리딘 5'-)테트라포스페이트 또는 그의 염 용액에 친수성 유기용매를 첨가하여 결정을 석출하는 것을 특징으로 하는 P¹,P⁴-디(우리딘 5'-)테트라포스페이트 또는 그의 염의 결정의 제조법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 우리딘 5'-모노포스페이트 (UMP)을 출발원료로 하고, 디페닐포스포로클로리데이트(DPC)와 피로포스페이트(PPi)를 사용하여 P¹,P⁴-디(우리딘 5'-)테트라포스페이트 또는 그의 염을 제조하는 방법에 있어서, 하기 방법 (a)∼(c) 중 어느 1개 이상의 처리를 행하는 것을 특징으로 하는 P¹,P⁴-디(우리딘 5'-)테트라포스페이트 또는 그의 염의 제조법을 제공하는 것이다.

(a) UMP 디페닐포스페이트(UMP-DPP)와 PPi-유기 알카리염을 반응 시키는 공정에 있어서, UMP-DPP를 복수회로 나누어 첨가하는 것,

(b) UMP-DPP와 PPi-유기 알카리염을 반응시키는 공정에 있어서, 염기를 공존시키는 것,

(c) U₂P₄ 합성반응 후에 알카리처리하는 것.

이하, 실시예를 들어 본 발명을 구체적으로 설명한다.

실시예 1 U₂P₄또는 그의 염의 합성

(1)염기의 효과

탈수된 우리딘 5'-모노포스페이트 트리부틸아민염(UMP-TBA)(6.2mmol)에 DMAC 8㎖를 가하고, 교반하면서 DPC 1.7㎖를 적하하였다. 실온에서 1시간 동안 반응시켜 UMP-DPP를 생성한 후, TBA 7.6㎖를 첨가하고, 다시 10분간 교반하였다. 별도로, 탈수된 TEA-PPi(3.0mmol)를 피리딘 1.7㎖에 용해하고, 이 용액을 UMP-DPP 반응액에 첨가하였다. 이 혼합액을 실온에서 3시간 교반한 후, 물을 가하여 반응을 정지시켰다. 얻어진 을 HPLC (262nm)로 분석한 결과, 수율 18.3%로 목적으로 하는 U₂P₄를 얻었다.

이 결과로부터, UMP-DPP와 TEA-PPi와의 반응을 염기(피리딘) 공존하에서 행함으로써, 종래법의 약 2배의 수율로 U₂P₄를 합성할 수 있다는 것이 밝혀졌다.

(2)염기와 알카리처리의 병용효과

탈수된 우리딘 5'-모노포스페이트의 트리부틸아민염(UMP-TBA) (6.2mmol)에 DMAC 8㎖를 가하고, 교반하면서 DPC 1.7㎖를 적하하였다. 실온에서 1시간 반응시켜 UMP-DPP를 생성시킨 후, TBA 7.6㎖를 첨가한 후, 다시 10분간 교반하였다. 별도로, 탈수된 TEA-PPi (3.0mmol)을 피리딘 1.7㎖에 용해하고, 이 용액을 UMP-DPP 반응액에 첨가하였다. 이 혼합액을 실온에서 3시간 교반한 후, 여기에 물을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 이렇게 얻어진 반응액에 30% 수산화나트륨 용액을 첨가하여 pH 11.0으로 조정하고, 하루 밤 방치하였다. 얻어진 액을 HPLC (262nm)로 분석한 결과, 수율 29.7 %로 목적으로 하는 U₂P₄를 얻었다.

이 결과로부터, UMP-DPP와 TEA-PPi와의 반응을 염기(피리딘) 공존하에서 행하고 알카리처리 함으로써, 종래법의 약 3배 수율로 U₂P₄를 합성할 수 있다는 것이 밝혀졌다.

(3)염기와 UMP-DPP 복수회 첨가효과

탈수된 피로인산의 트리에틸아민염(TEA-PPi) (6mmol)에 포름아미드 1.5㎖ 및 피리딘 1.5㎖를 첨가하고 교반하였다. 한편, 별도의 용기에 탈수된 우리딘 5'-모노포스페이트 트리부틸아민염 (UMP-TBA) (12mmol)에 DMAC 4.3㎖, 디옥산 4.8㎖ 및 트리부틸아민 (TBA) 5.8㎖를 첨가하고 교반한 후, 여기에 DPC 2.5㎖를 적하하고 실온 하에서 1시간 동안 교반하여 UMP-DPP를 생성하였다. TEA-PPi가 들어있는 용기에 UMP-DPP 용액의 반분량을 적하하고, 실온에서 1시간 반응시켰다. 다시, 피리딘 1.5㎖를 첨가한 후, 남은 UMP-DPP 용액을 적하하였다. 이것을 실온에서 한 시간동안 반응시킨 후, 물을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 얻어진 반응 혼합액을 HPLC (262 nm)로 분석한 결과, 수율 29.5 %로 목적으로 하는 U₂P₄를 얻었다.

이 결과로부터, UMP-DPP의 첨가를 2회로 나누어 행하는 것과 UMP-DPP와 TEA-PPi와의 반응을 염기(피리딘) 공존하에서 행함으로써, 종래법의 약 3배 수율로 U₂P₄를 합성할 있다는 것이 밝혀졌다. 또한, 상기 (1)과 비교하면, UMP-DPP의 첨가를 2회로 나누어 행함으로서 18.3 %의 수율이 상기의 수율 29.5 %로 되어 수율이 약 1.6배 향상된다는 것이 밝혀졌다.

(4) 알카리처리의 효과

탈수된 피로인산의 트리에틸아민염(TEA-PPi) (6mmol)에 포름아미드 1.5㎖ 및 피리딘 1.5㎖를 첨가하고 교반하였다. 한편, 별도의 용기에 탈수된 우리딘 5'-모노포스페이트의 트리부틸아민염 (UMP-TBA) (12mmol)에 DMAC 4.3㎖, 디옥산 4.8㎖ 및 트리부틸아민 (TBA) 5.8㎖를 첨가하고 교반한 후, 여기에 DPC 2.5㎖를 적하하고, 실온 하에서 1시간 동안 교반하여 UMP-DPP를 생성하였다. TEA-PPi가 들어있는 용기에 UMP-DPP 용액의 반분량을 적하하고, 실온에서 1시간 반응시켰다. 다시 피리딘 1.5㎖를 첨가한 후, 남은 UMP-DPP 용액을 용기에 적하하였다. 다시 실온에서 1시간 반응시킨 후, 여기에 물을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 반응액에 30% 수산화나트륨 용액을 가하여 pH 11.0으로 조정하고, 하룻밤 동안 방치하였다. 얻어진 반응 혼합액을 HPLC (262 nm)로 분석한 결과, 수율 32.2 %의 목적한 U₂P₄를 얻었다.

상기 (3)과 비교하면, 알카리처리를 추가함으로써, 29.5%의 수율이 상기와 같이 수율32.2 %로 되어, 수율이 약 10% 향상된다는 것이 밝혀졌다.

실시예 2 U₂P₄·4Na 결정의 제조

탈수된 피로인산의 트리에틸아민염(TEA-PPi) (40.5mmol)에 포름아미드 10㎖ 및 피리딘 15㎖을 가하고 교반하였다. 한편, 별도의 용기에 탈수된 우리딘 5'-모노포스페이트의 트리부틸아민염 (UMP-TBA) 80mmol에 DMAC 50㎖, 디옥산 34㎖ 및 트리부틸아민 (TBA) 30㎖를 가하고, 교반한 후, 여기에 DPC 17.8㎖를 적하하고, 실온에서 1시간 교반하여 UMP-DPP를 생성하였다. TEA-PPi가 들어있는 용기에 UMP-DPP 용액의 반분량을 적하하고, 실온에서 1시간 반응시켰다. 다시, 피리딘 15㎖와 4-디메틸아미노피리딘 (DMAP) 50 mg을 가한 후, 남은 UMP-DPP 용액을 적하하였다. 이것을 실온에서 2 시간동안 반응시킨 후, 여기에 물을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 합성액을 총부피 700㎖가 되게 물로 희석시킨 후, 여기에 수산화나트륨 용액을 사용하여 pH를 10으로 조정하였다. 용액을 200㎖ 정도로 농축한 후, 교반하면서 이 농축 용액에 에탄올 250㎖를 첨가하였다. 이 용액을 4℃에서 하룻 밤 방치한 후, 상청을 경사시켜 제거하였다. 얻어진 용액을 총부피 250㎖가 되도록 물로 희석하고, HPLC (262 nm)로 분석한 결과, 수율 30.0 %로 목적한 U₂P₄를 얻었다.

상기 반응액 110㎖를 총부피 2000㎖가 되도록 물로 희석하고, 약 음이온교환수지(AMBERLITE IRA-67) (Cl 형) 200㎖에 가하였다. 수세 후, 부생성물을 0.18 M 염산으로 용출하고 0.35M 염화나트륨를 함유하는 0.005M 염산용액으로 목적으로 하는 U₂P₄를 용출하였다(회수율: 82.7 %).

얻어진 용출액을 수산화나트륨 용액으로 pH 2.5로 조정하였다. 그런 다음, 활성탄 컬럼(Taiko SGP)에 400㎖에 걸고, 수세한 후, 0.05 M 수산화나트륨 용액으로 용출하였다(회수율: 84.9 %).

용출액의 pH를 7.6으로 조정한 후, 38㎖로 농축하였다. 이 농축액에 에탄올 57㎖를 가하여 결정화하여, 3.1 g의 U₂P₄·4Na 결정(수분 7.8%)을 얻었다(분리수율: 18.4%)

(U₂P₄·4Na 결정의 물성)

실시예 2에서 제조한 U₂P₄·4Na 결정을 약 60℃에서 약 4시간 동안 통풍건조 후, 기기분석을 행하였다. 또한 WO 99/05155의 실시예 1기재의 방법과 동일한 방법으로 U₂P₄·4Na의 동결건조품을 제조하고, 결정품과의 물성을 비교하였다.

(1) 기기분석

①순도검정

실시예 2에서 얻은 U₂P₄·4Na 결정 및 각 크로마토그래피 처리에 의해 정제된 U₂P₄획분의 순도를 고속액체 크로마토그래피 법으로 분석한 결과를 표 1에 나타낸다. 고속액체 크로마토그래피법은 하기 조건으로 행하였다.

컬럼 : HITACHIGEL #3013-N (Hitachi Keisokuki Service)

용출액 : 10 % CH₃CN, 0.18 M NH₄Cl, 0.03 M KH₂PO₄및 0.03 M

K₂HPO₄

검출법 : UV 262 nm에서 검출

(-) : 검출한계이하

②수분

칼 피셔법에 따라 측정한 결과, 건조의 정도에 따라 U₂P₄·4Na 결정의 수분함량은 변동하지만, 5∼15중량%의 수분으로 안정화되고, 계산하면 U₂P₄ 1분자에 대하여 3∼8분자의 수분자가 결합 또는 부착되어 있다는 것이 밝혀졌다.

③ 융점

통상의 방법에 따라 U₂P₄·4Na 결정의 융점을 측정한 결과, 분해점은 약 223℃이고, 동결건조품의 분해점은 약 220℃이였다.

④ X선회절

리가쿠 덴기(理學電氣)제 X선회절장치 RINT2500V형을 사용하여, 하기의 측정조건으로 U₂P₄·4Na 결정의 X선회절을 측정하였다. 측정한 X선회절스펙트럼을 도1 및 도2에 나타내고, 이것의 피크 데이터를 표 2 및 표 3에 나타낸다.

(측정 조건)

X선 관구 : Cu-Kα

X선 출력 : 50 kV-300 mA

주사속도 : 4.0 °/ 분

주사간격 : 0.02 °

측각범위 : 2∼40 °

슬리트 : DS-0.5 °, RS-0.15 mm, SS-0.5°

전처리 : 아게이트 몰타르(agate mortar)로 분쇄

도 1 및 표 2는 U₂P₄·4Na 결정의 4수화물의 데이터이고, 도 2 및 표 3은 U₂P₄·4Na 결정의 8수화물의 데이터이다. 또한, 참고로 동결건조품의 X선회절 스펙트럼을 도 3에 나타낸다.

⑤ 흡습성

수분 약 14 %의 U₂P₄·4Na 결정 (8수화물)을 a) 온도 25℃, 상대 습도 57%, b) 온도 25℃, 상대 습도 75%, c) 온도 40℃, 상대 습도 75%의 조건하에서 9일간 보존하였을 경우, 분해나 중량 변화는 관찰되지 않았고, 안정적이며, 흡습성을 가지고 있지 않다는 사실이 확인되었다. 또한, 수분 약 8%의 U₂P₄·4Na 결정 (4수화물)을 온도 40 ℃, 상대습도 75 %의 조건에서 9일간 보존하였을 경우, 수분함량이 14∼15 %로 증가하였으나, 더 이상의 수분함량 증가는 관찰되지 않았고 안정화되었다.

이에 반해, 동결건조품(초기 수분함량 : 약 1%)을 온도 40℃, 상대습도 75%의 조건하에서 9일간 보존하였을 경우, 수분함량은 서서히 증가하여, 보관 7일째에는 조해하여 끈적 끈적한 상태였다.

⑥ 안정성

U₂P₄·4Na 결정 (8수화물)과 동결건조품을 각각 병에 밀봉하고, 60℃에서 13일간 보존하였다(가속시험). 그 결과, 결정품의 분해는 전혀 관찰되지 않았으나, 동결 건조품은 약 1.4%의 U₂P₄·4Na의 순도 저하가 관찰되어 일부가 분해되었다는 것이 밝혀졌다.

⑦ 결정형

U₂P₄·4Na 결정 (8수화물)의 대표적인 결정의 사진을 도 4에 나타낸다.

⑧ 적외흡수스펙트럼

JASCO 5000 스펙트로포토메터를 사용하여 통상의 방법으로 U₂P₄·4Na 결정 (8수화물)과 동결 건조품의 적외흡수스펙트럼을 측정하였다. 그 결과를 도 5 및 도 6에 나타낸다. U₂P₄·4Na의 동결건조품은 3416, 1702, 1266, 1116, 1079 및 906 (㎝^-1)에 피크를 나타내고(도 6), U₂P₄·4Na 결정은 3386, 1690, 1277, 1233, 1146, 1116 및 890 (㎝^-1)에 피크를 나타낸다 (도 5).

실시예 3 U₂P₄·4Na·8수화물결정의 제조

실시예 2의 컬럼 처리를 통하여 얻은 U₂P₄획분을 농축하여 슬러리를 제조한 후, pH 7.0으로 조정하고, 교반하면서 메탄올을 슬러리에 서서히 첨가하고, 10℃로 냉각하면서 슬러리를 교반하여 U₂P₄·4Na 결정을 석출시켰다.

얻어진 U₂P₄·4Na 결정을 건조 후, 칼 피셔법으로 수분을 측정한 결과, 8수화물인 것임이 밝혀졌다. 이 결정의 X선회절 스펙트럼을 도 7에 나타내고, 그의 피크 데이터를 표 4에 나타낸다.

본 발명 방법에 의해 얻어진 U₂P₄또는 그의 염의 결정은 고순도이고, 동시에 동결 건조품에 비하여 흡습성도 없고, 매우 안정하여, 의약품 원료로서 유용하다.

또한, 본 발명의 U₂P₄또는 그의 염의 제조법은 고수율로 U₂P₄또는 그의 염을 제조할 수 있고, U₂P₄또는 그의 염의 대량합성을 가능하게 한다.

Claims

P¹,P⁴-디(우리딘 5'-)테트라포스페이트 또는 그의 염의 결정.
제 1항에 있어서, 95 %이상의 순도를 갖는 결정.
제 1항에 있어서, 97 %이상의 순도를 가지며, 우리딘 5'-트리포스페이트 및 우리딘 5'-디포스페이트가 1 %이하인 결정.
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정제되지 않은 P¹,P⁴-디(우리딘 5'-)테트라포스페이트 또는 그의 염을 음이온교환 크로마토그래피와 활성탄 크로마토그래피를 사용하여 정제하고, 정제된 P¹,P⁴-디(우리딘 5'-)테트라포스페이트 또는 그의 염 용액에 친수성 유기 용매를 가하여 결정을 석출시키는 것을 특징으로 하는 P¹,P⁴-디(우리딘 5'-)테트라포스페이트 또는 그의 염의 결정의 제조법.
제 6항에 있어서, 정제가 음이온교환 크로마토그래피를 행한 후, 이어서 활성탄 크로마토그래피를 행하는 것을 특징으로 하는 P¹,P⁴-디(우리딘 5'-)테트라포스페이트 또는 그의 염의 결정의 제조법.
우리딘 5'-모노포스페이트 (UMP)을 출발 원료로 하고, 디페닐포스포로클로리데이트(DPC)와 피로포스페이트(PPi)를 사용하여 P¹,P⁴-디(우리딘 5'-)테트라포스페이트(U₂P₄) 또는 그의 염을 제조하는 방법에 있어서, 하기 (a)∼(c)중 어느 것인가 1개 이상의 처리를 행하는 것을 특징으로 하는 P¹,P⁴-디(우리딘 5'-)테트라포스페이트 또는 그의 염의 제조법.

(a) UMP 디페닐포스페이트(UMP-DPP)와 PPi-유기알카리염을 반응시키는 공정에 있어서, UMP-DPP를 복수회로 나누어 첨가하는 것.

(b) UMP-DPP와 PPi-유기알카리염을 반응시키는 공정에 있어서, 염기를 공존시키는 것.

(c) U₂P₄합성반응 후에 알카리처리를 하는 것.
제 8항에 있어서, 처리 (a), (b) 및 (c)를 조합하여 행하는 것을 특징으로 하는 P¹,P⁴-디(우리딘 5'-)테트라포스페이트 또는 그의 염의 제조법.
P¹,P⁴-디(우리딘 5'-)테트라포스페이트·4Na 의 결정.
P¹,P⁴-디(우리딘 5'-)테트라포스페이트·4Na 수화물의 결정.
제 11항에 있어서, P¹,P⁴-디(우리딘 5'-)테트라포스페이트·4Na 1몰에 대해 3∼8몰의 물이 결합 또는 부착된 것이 특징인 결정.
제 11항에 있어서, P¹,P⁴-디(우리딘 5'-)테트라포스페이트·4Na 1몰에 대해 4몰의 물이 결합 또는 부착된 것이 특징인 결정.
제 11항에 있어서, P¹,P⁴-디(우리딘 5'-)테트라포스페이트·4Na 1몰에 대해 8몰의 물이 결합 또는 부착된 것이 특징인 결정.
제 10항 내지 제 14항의 어느 1항에 있어서, 95 %이상의 순도를 갖는 결정.
제 10항 내지 제 14항의 어느 1항에 있어서, 97 %이상의 순도를 가지며, 우리딘 5'-트리포스페이트 및 우리딘 5'-디포스페이트가 1 %이하인 결정.