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KR100428518B1 - 신규의 펠리누스 린테우스 균주 및 이로부터 분리정제된항암 면역활성 다당류 - Google Patents

신규의 펠리누스 린테우스 균주 및 이로부터 분리정제된항암 면역활성 다당류 Download PDF

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KR100428518B1
KR100428518B1 KR10-2001-0003264A KR20010003264A KR100428518B1 KR 100428518 B1 KR100428518 B1 KR 100428518B1 KR 20010003264 A KR20010003264 A KR 20010003264A KR 100428518 B1 KR100428518 B1 KR 100428518B1
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linteus
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환인제약 주식회사
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Abstract

본 발명은 고활성의 항암 면역활성 물질을 생산하는 신규의 펠리누스 린테우스 (Phellinus linteus) KCTC 0912BP 균주 및 이로부터 분리정제된, 평균분자량 1,400,000 달톤, 당성분이 5~30 중량%의 라이보즈, 10~55 중량%의 만노즈, 5~25 중량%의 갈락토즈, 및 5~50 중량%의 글루코즈로 이루어진 고활성의 항암 면역활성 다당류에 관한 것이다.

Description

신규의 펠리누스 린테우스 균주 및 이로부터 분리정제된 항암 면역활성 다당류{A novel phellinus linteus strain and an anticancer immunoactive polysaccharide prepared therefrom}
본 발명은 항암 면역활성 다당류를 생산하는 신규의 펠리누스 린테우스 (Phellinus linteus) KCTC 0912BP 균주 및 이로부터 분리정제된 항암 면역활성 다당류에 관한 것이다.
펠리누스 린테우스 (Phellinus linteus)는 소나무비늘버섯과(Hymenochaetaceae)의 진흙버섯속(Phellinus)에 속하는 백색부후균으로, 한방에서는 상황(桑黃)으로 불리우며, 각종 질병, 특히 종양에 대한 치료 효과가 커서 민간에서 매우 귀중한 약재로 이용되어 왔다.
펠리누스 린테우스 (Phellinus linteus) 균주 및 이로부터 분리정제된 다당류와 관련된 종래의 발명으로는, 대한민국 특허공개 제97-1531호, 대한민국 특허공고 제92-1367호, 대한민국 특허등록 제197446호, 대한민국 특허등록 제174433호, 및 김(충남대 약대 석사논문, 1992년)등이 있다.
대한민국 특허공고 제92-1367호에서 개시한 다당류는 평균분자량이 15,000∼680,000 달톤이며 구성당의 주성분이 D-글루코즈인 다당류이며, 대한민국 특허등록 제197446호에서 개시한 다당류는 분자량이 9,200 달톤이고 알파 타입과 베타 타입의 두 가지 글리코시드 결합이 모두 존재하는 구조를 가지며 구성당의 성분이 15.9 % 의 글루코즈, 10.4 %의 갈락토즈, 34.3 % , 만노즈, 16.1 %의 자이로즈 및 15.8 %의 아라비노즈로 이루어진 다당류이고, 대한민국 특허등록 제174433호에서 개시한 다당류는 분자량이 153,000 달톤이고 구성당의 성분이 5-55 몰%의 글루코즈, 5-30 몰%의 갈락토즈, 10-50 몰%의 만노즈, 1-25 몰%의 자이로즈, 및 5-25 몰%의 아라비노즈로 이루어진 다당류이며, 김 (충남대 약대 석사논문, 1992년)에서 개시한 다당류는 구성당의 성분이 26.2 %의 글루코즈, 21.87 %의 갈락토즈, 50.57 %의 만노즈 및 1.14 %의 자이로즈로 이루어진 다당류이다. 즉, 펠리누스 린테우스 (Phellinus linteus) 균주에 따라 그로부터 생성되는 항암 면역활성 다당류의 종류가 상이하다.
한편 균사를 형성하는 미생물을 액상 배양할 경우 그 성장 형태가 생산수율에 매우 큰 영향을 미친다. 예를 들어A. terreus에 의한 이타코닉산 생산시 펠렛 (pellet) 형태에서 좋았으며(Ward, O.P. and G. S. Byrne. 1989. Effect of nutrition on pellet formation byRhizopus arrhizus. Biotech. Bioeng. 33:912-9124.)P. chrysogenum에 의한 페니실린 생산에서는 펠렛(pellet) 형태와 실 (filamentous) 형태의 2가지 형태로 배양하여 생산하였다(Smith, J.J., M.D. Lilly, and R.I. Fox. 1990. The effect of agitation on the morphology and penicillin production ofPenicillium chysogenum. Biotechnol. Bioeng. 35:1011-1023). 이와 같이 균사 형성 미생물을 이용한 배양에 있어서 성장 형태가 최종산물의 생산성과 중요한 관계가 있으며 동일한 종이라도 액상 배양시 나타나는 성장 형태가 다르게 나타나게 된다. 따라서 액상배양시 가장 적합한 성장 형태를 나타냄으로써 균체와 다당류 생산 수율을 극대화할 수 있는 펠리누스 린테우스 (Phellinus linteus) 균주를 선별하는 것이 필수적이나, 이에 대한 연구는 전혀 이루어져 있지 않은 실정이다.
이에 본 발명자들은 액상배양시 바람직한 성장형태를 가짐으로써 배지 농도 조절이 용이하고 발효조 내의 운전이 양호하며 용존산소 공급 및 정제가 편리할 뿐 아니라, 고활성의 항암 면역활성 다당류를 고수율로 생성할 수 있는 신규의 펠리누스 린테우스 (Phellinus linteus) 균주를 개발하고자 연구를 거듭한 결과, 종래의 균주와는 전혀 상이한 미생물학적 특성 및 이화학적 성질을 갖는 펠리누스 린테우스 (Phellinus linteus)를 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 고활성의 항암 면역활성 물질을 생산하는 신규의 펠리누스 린테우스 (Phellinus linteus) KCTC 0912BP 균주를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 펠리누스 린테우스 (Phellinus linteus) KCTC 0912BP 균주의 균사체로부터 분리정제되고, 평균분자량이 1,400,000 달톤이며, 당성분이 5~30 중량%의 라이보즈, 10~55 중량%의 만노즈, 5~25 중량%의 갈락토즈, 및 5~50 중량%의 글루코즈로 이루어진 고활성의 항암 면역활성 다당류를 제공하는 것을 포함한다.
도1은 리보솜 DNA의 ITS 부위 염기서열 분석과 증폭을 위해 사용된 프라이머 위치와 리보솜 DNA 구조를 나타낸 도면이다.
도2는 펠리누스속 균주들로부터 분리한 리보솜 DNA (ITS1, rDNA 및 ITS2)의 PCR 산물을 1.5% 아가로즈 젤상에서 전기영동하여 나타낸 사진이다.
도3은 펠리누스속 균주들로부터 분리한 리보솜 DNA의 ITS 부위 염기서열 분석을 통한 계통 분석도이다.
도4는 펠리누스속 균주들로부터 분리한 퍼록시다아제 동위효소 양상을 아크릴아마이드 젤상에서 전기영동하여 나타낸 사진이다.
도5는 펠리누스속 균주들로부터 분리한 에스테라아제 동위효소 양상을 아크릴아마이드 젤상에서 전기영동하여 나타낸 사진이다.
도6은 펠리누스속 균주들로부터 분리한 에시드 포스파타아제 동위효소아크릴아마이드 젤상에서 전기영동하여 나타낸 사진이다.
도7은 펠리누스속 균주들로부터 분리한 류신 아미노펩티다아제 동위효소 양상을 아크릴아마이드 젤상에서 전기영동하여 나타낸 사진이다.
도8은 펠리누스속 균주들로부터 분리한 동위효소 패턴 분석을 통한 계통 분석도이다.
도9는 신규 펠리누스 린테우스 WI99041 (KCTC0912BP) 균주의 액체 배양시 시간의 변화에 따른 용존산소량, pH, 건조균체농도와 글루코스농도를 나타낸 그래프이다.
도10은 신규 펠리누스 린테우스 WI99041 (KCTC0912BP) 균주의 배양, 추출 및 정제 과정을 포함하는 다당류 물질의 제조공정도이다.
도11는 신규 펠리누스 린테우스 WI99041 (KCTC0912BP) 균주로부터 추출, 분리 및 정제한 다당류의 구성 단당류를 가스크로마토그래피로 분석한 결과이다.
도12는 신규 펠리누스 린테우스 WI99041 (KCTC0912BP) 균주로부터 추출, 분리 및 정제한 다당류의 분자량을 고속액체크로마토그래피로 분석한 결과이다.
도13은 신규 펠리누스 린테우스 WI99041(KCTC0912BP) 균주의 배양균사체로부터 수득한 고분자 다당류물질의 IR 스펙트럼이다.
본 발명은 항암 면역활성 물질을 생산하는 펠리누스 린테우스 (Phellinus linteus) KCTC 0912BP 균주를 포함한다.
본 발명자들은 강원도 영동지역에서 상황버섯으로 판단되는 다수의 버섯류를 채취한 후 펠리누스 린테우스 (Phellinus linteus) 균주들을 선별하였으며, 선별된 균주로부터 리보솜 DNA를 분리한 후 ITS (Internal transcribed spacer) 부위의 염기서열을 분석하고 동위효소분석 (IEF)에 의한 계통분류 결과, 이중 펠리누스 린테우스 (Phellinus linteus) WI99041 이 놀라운 액상발효 수율을 가질 뿐 아니라, 이로부터 종래와는 전혀 상이한 항암 면역활성 다당류가 얻어진다는 것을 발견하여, 2000년 12월 19일자로 한국과학기술연구원 부설 생명과학연구소 유전자원센터에 기탁번호 KCTC 01912BP 로서 기탁하였다.
본 발명의 펠리누스 린테우스 (Phellinus linteus) KCTC 0912BP 균주의 균학적 특성은 다음과 같다.
배양적 형태적 특성을 보면 포테이토 글루코즈 한천배지 및 맥아액기스 한천배지상에서 펠리누스 린테우스 KCTC 0912BP를 배양한 후 균사 색깔 및 형태를 관찰해 본 결과 실모양의 균사를 형성하며 자라며 균사색깔은 황금색 띠고 한천배지의 색깔을 진갈색으로 변화시키는 특징이 있다. 또한 균사체의 현미경 관찰결과 포자를 형성하지 않는 특징을 가지고 있으며, 유성생식이 일어나기 위해서는 핵 이동을 위한 증거인 클램프 연결과정(clamp connection) 일어나야 하는데 한천배지상에서는 관찰되지 않는다.
본 발명의 펠리누스 린테우스(Phellinus linteus) KCTC 0912BP 균주의 최적 생육환경은 최적 산성도가 5.5이고 최적 성장온도는 25℃ 이며 30℃ 이상에서는 급격한 성장속도 저해가 일어난다.
특징적으로 본 발명의 신규균주인 펠리누스 린테우스 KCTC 0912BP는 퍼록시다아제, 에스테라아제, 에시드포스파타아제 및 류신아미노펩티다아제 등의 4가지 동위효소 양상을 전기영동에 의하여 분석한 결과 펠리누스 린테우스 분류군에 속하였고, 리보좀 DNA 분석 결과에서도 펠리누스 린테우스 분류군에 속하여서 두가지 분석법에 의한 분류군이 정확히 일치하는 결과를 얻었다. 따라서 본 발명의 신규 균주 펠리누스 린테우스 KCTC 0912BP 균주는 지리적 환경적 요인에 의한 종내 변이종으로서 신규의 균주임을 확인하였다. 본 균주의 표본 자실체는 환인제약(주) 중앙연구소 균주보관실에 표본번호 WI9904-1로 보존되어 있다.
상기와 같이 상이한 균학적 성질을 갖는 본 발명의 펠리누스 린테우스 (Phellinus linteus) KCTC 0912BP 균주는 액상배양시 1mm 미만의 펠렛(pellet) 형태를 나타냄으로써, 1mm 이상의 펠렛 형태를 나타내거나 실(filamentous) 형태로 성장하는 종래의 균주인 경우에 문제가 되는, 배양액 점도 증가로 산소전달이 어렵기 때문에 발생하는 균사체 생산량의 급격한 감소, 배양 중에 영양분을 유가식 배양공정으로 공급할 경우 영양분의 세포내 공급 및 균질화에 발생하는 문제, 균사체 형태가 실(filamentous) 형태로 자라는 경우 균사체가 펠렛형태로 자라는 것에 비해 발효기 교반속도를 상당히 높게 유지해야 되기 때문에 발생하는 경제적 손실의 문제에서 유리하며, 또한 정제시 여과등에 따른 회수가 쉽고, 배지 농도 조절이 용이하고 발효조 내의 운전이 양호하며 용존산소 공급 및 정제가 편리한 장점이 있다.
본 발명은 상기 펠리누스 린테우스 (Phellinus linteus) KCTC 0912BP 균주의 균사체로부터 분리정제되고, 평균분자량이 1,400,000 달톤이며, 당성분이 5~30 중량%의 라이보즈, 10~55 중량%의 만노즈, 5~25 중량%의 갈락토즈 및 5~50 중량%의 글루코즈를 포함하는 항암 면역활성 다당류를 포함한다.
또한, 상기 다당류중 당성분이 14.2 중량%의 라이보즈, 36.7 중량%의 만노즈, 10.6 중량%의 갈락토즈 및 17.4 중량%의 글루코즈를 포함하는 항암 면역활성 다당류가 더욱 바람직하다.
상기 펠리누스 린테우스 (Phellinus linteus) KCTC 0912BP 균주로부터 분리정제된 다당류의 구조는 베타 타입의 글리코시드 결합이 존재한다.
따라서 이전에 보고된 다당류의 분자량과 구조, 구성 단당의 종류 및 성분비가 완전히 다르며 라이보즈가 다당류의 구성 단당 성분으로 보고된 경우는 전혀 없다.
본 발명에 따른 항암 면역활성 다당류는 하기 실시예에서 확인할 수 있는 바와 같이, 고활성의 종양저지효과를 가지며, 또한 본 발명의 펠리누스 린테우스 (Phellinus linteus) 균주로부터 고수율로 얻어진다.
이하, 본 발명을 실시예를 들어 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명이 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 리보솜 DNA 분석
제 1 공정 : 균주 배양
본 발명자들은 1999∼2000년 2년간 강원도 영동지역에서 채집한 10개의 균주와 한국과학기술연구원 생명공학연구소 유전자은행(KCTC)에서 표준 종으로 펠리누스속의 7종 8균주를 분양받아 사용하였다. 아래의 표 1은 펠리누스속 균주목록을 보인 것이다.
종배양의 배양조건은, 각각의 균주들을 감자 덱스트로즈 아가 배지에서 25℃ 7∼10일간 배양한 뒤 균사조각을 약 0.5㎝크기로 잘라내어 WIM 배지가 50 ㎖씩 분주된 250 ㎖ 삼각플라스크에 10개씩 접종하여 25℃에서 100rpm으로 진탕 배양하였다. 아래의 표 2는 WIM 배지의 조성을 나타낸 것이다.
7일간 배양된 균주를 분쇄기로 4,000rpm에서 1분간 마쇄하여 pH 6.0으로 조절된 50㎖의 감자 덱스트로즈 브로스 배지에 10%(v/v)되게 접종한 후 25℃에서 100rpm으로 12일간 진탕 배양하였다.
제 2 공정 : Genomic DNA 분리
배양된 균사는 멸균된 3차 증류수로 여러 번 세척하여 배지성분을 씻어낸 후 수분을 제거한 뒤 미리 냉동 보관된 막자사발에 균사와 액체질소를 넣고 급냉시킨 상태에서 미세한 분말로 분쇄하였다. 균사분말 400 ㎎당 400 ㎕의 DNA 추출 완충용액(SDS 3%, EDTA 50mM, Tris-HCl pH7.2 50mM, 2-mercaptoethanol 1%)를 첨가하여 강하게 섞어 준 후 65℃에서 1시간 반응하였다. 반응 후 다시 400 ㎕의 페놀:클로로포름:이소아밀알코올(25:24:1)을 첨가하여 섞어준 후 실온에서 30분간 방치 한 다음 25 ℃에서 12,000 g로 10분간 원심분리하였다. 상등액을 새로운 실험관으로 옮긴 후 0.1 부피의 3 M 소듐 아세테이트와 0.54 부피의 이소프로판올을 첨가하여 약하게 섞어 준 다음 4 ℃에서 30분간 방치한 뒤 12,000 g로 5분간 4 ℃에서 원심 분리하여 상등액을 제거하고 침전물만 취하였다. 다시 침전물에 500 ㎕의 70 % 에탄올을 가한 뒤에 동일조건으로 원심 분리하여 수회 세척한 후 상온에서 15분간 건조한 다음 멸균 3차 증류수로 녹여 1% 아가로즈 젤 상에서 DNA를 확인하였다.
제 3 공정 : 프라이머(Primer) 작성 및 PCR 반응
분리된 genomic DNA의 ITS 영역을 증폭하기 위해 사용된 프라이머는, 곰팡이류의 ITS 영역을 증폭하기 위한 통상의 프라이머(universal primer)인 ITS5(forward) 5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'(22mer)와 ITS4(reverse) 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'(20mer)를 사용하였다. PCR반응은 Perkin-Elmer사의 2400 GeneAmp™ PCR system을 이용하여 0.2㎖ PCR tube에서TaqDNA 중합효소 2.5U, dNTP 250μM, genomic DNA 50ng, primer 50pmole, KCl 40mM, MgCl2 1.5mM이 되게 50㎕의 10mM Tris-HCl(pH9.0)로 조절한 다음 96℃에서 30초간 분해과정 (denaturation), 52℃에서 30초간 연결과정 (annealing), 72℃에서 1분간 연장과정 (extention) 순으로 30 사이클 실시하였으며 증폭된 리보솜 DNA의 부위는 도1과 같다.
제 4 공정 : PCR 산물의 정제
PCR 산물을 1.5% 아가로즈 젤 상에서 80 V의 전압으로 40분간 전기영동한 뒤 EtBr로 염색하여 UV 트랜스일루미네이터상에서 원하는 밴드를 확인, 잘라낸 다음 Bioneer사의 AccuPrep™ 젤 정제 키트로 rDNA를 회수하였다. 회수된 rDNA는 80 % 에탄올로 수회 세척과정을 거친 뒤 상온에서 15분간 건조시킨 다음 멸균 3차 증류수 30 ㎕에 녹인 후 다시 1.5 % 아가로즈 젤에 전기영동하여 rDNA의 순도를 확인하였다 (도2).
제 5 공정 : 염기서열 자동분석
정제된 rDNA의 염기서열은 염기서열 분석기 (PE 377 DNA Sequencer)를 이용하여 결정하였다.
제 6 공정 : 유연관계 분석
결정된 rDNA의 ITS부위의 염기서열은 Clustal X(1.8 version)프로그램을 이용하여 표3에서와 같이 각 균주 간 염기서열을 비교하였으며, 계통 분석도는 Phylip의 Neighbor-Joining 방법에 의해 작성되었다(도3).
펠리누스 (Phellinus)속 균류의 rDNA ITS영역(5.8S, 18S 및 28S 일부 포함) 염기를 비교한 결과P. linteusKCTC6190,P. linteusKCTC6719,P. biscuspidatusKCTC6651,P. gilvusKCTC6653,P. piniKCTC6655,P. pomaceusKCTC6656 및P. tremulusKCTC6659의 ITS영역크기는 747bp, 740bp, 712bp, 683bp, 709bp, 675bp 및 677bp로 각각 밝혀졌다(도 2). 정렬된 염기서열에서 펠리누스 (Phellinus)속의 균주들은P. biscuspidatus를 제외하고 모두 18S rDNA부위인 13∼39bp, 5.8S rDNA부위인 397∼459bp에서 일반적으로 알려진 바와 같이 보존성이 높은 부위로 확인되었으며, ITS부위인 40∼324bp와 481∼660bp부위에서는 종간 변이가 나타나 변이부위로 밝혀졌으며 ITS2부위보다 ITS1부위에서 변이가 심해 기존 보고된 펠리누스(Phellinus)균종에서는 ITS1 부위의 변이율이 ITS2보다 높다는 점과 일치하였다(표 3). 특히P. linteusKCTC6190, KCTC6719균주와 채집된 WI 시리즈 펠리누스 (Phellinus)속 균주인 WI9901P, WI9902P, WI9903P, WI99041 (KCTC0912BP), WI99042, WI9905P, WI9906P 및 WI2001P은 ITS1과 ITS2부위의 크기가 대부분 285bp와 180bp로 같고 상동성이 높으며, 다만 일부 채집균주의 ITS1부위인 98∼257bp에서 몇 개의 염기만이 차이가 있는 것으로 확인되었으나P. biscuspidatus,P. gilvus,P. pini,P. pomaceus및P. tremulus는 ITS1과 ITS2부위의 크기가 각각 달라 비교가 불가능하였다. ITS염기서열 상동성에는P. linteusKCTC6190, KCTC6719와 채집균주인 WI 시리즈 펠리누스 (Phellinus)속 균주들과 96%이상의 상동성을 나타내었으며P. biscuspidatus,P. gilvus,P. pini,P. pomaceus및P. tremulus와 채집균주들 사이에서는 27% 미만의 낮은 상동성을 나타내었다. 이 같은 결과로 볼 때 채집된 WI 시리즈 펠리누스 (Phellinus)속 균주 8개는 모두P. linteus에 속하는 균주로 판단되었다.
이러한 결과를 바탕으로 ITS1과 ITS2부위의 계통분석과 염기의 변이가 심한 부분, 염기보존성이 높은 부분, 염기의 변이가 중간정도인 부분이 혼재한 ITS1-5.8S-ITS2의 염기서열에 의한 계통분석에서는 총 4개의 분류군으로 나뉘어졌는데, 분류군 1에서는 동위효소 분석에서 두 분류군으로 나눠졌던P. linteusKCTC6190, KCTC6719와 신규 펠리누스 린테우스 WI99041 (KCTC0912BP)를 비롯한 채집된 WI 시리즈 펠리누스 (Phellinus)속 균주 7개가 하나의 분류군을 형성하였고, 분류군 2에서는P. pomaceusKCTC6656과P. tremulusKCTC6659가 분류군 3에서는P. piniKCTC6655가 분류군 4에서는P. biscuspidatusKCTC6651과P. gilvusKCTC6653이 하나의 분류군으로 분지되었다(도 3).
따라서 강원도 영동지방에서 채집한 WI 시리즈 펠리누스 (Phellinus)속의 10개 균주와 유전자은행에서 분양 받은 펠리누스(Phellinus)속의 7종 8개 균주를 대상으로 동위효소분석과 rDNA의 ITS영역 염기서열 분석으로 계통 분류를 실시하여 분지 별 계통 분류군을 확인한 결과, 두 가지 분석법에 의한 분류군이 정확히 일치하였다.
아래의 표 3a 내지 3n은 펠리누스 속간 ITS 부위(18S rDNA 일부분, ITS1, 5.8S rDNA, ITS2, 28S rDNA 일부분)의 염기서열을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
실시예 2 : 동위효소 분석
제 1 공정 : 균주 배양
실시예 1의 제1공정과 동일한 방법으로 균주를 배양하였다.
제 2 공정 : 조효소 추출
배양된 균사는, 거즈를 이용하여 거른 다음 차가운 3차 증류수로 여러 번 세척하여 배지성분을 씻어낸 뒤 마른 여과지를 이용해 수분을 제거한 후, 미리 냉동 보관된 막자사발에 균사와 액체질소를 넣고 급냉시킨 상태에서 미세한 분말로 마쇄하였다. 여기에 균사무게 5배(w/v)에 해당하는 0.1몰 트리스-염산 완충용액 (pH7.5)를 첨가한 후 4℃ 10,000g로 30분간 원심분리하여 상등액을 취한 뒤 -80℃로 보관하면서 시료로 사용하였다. 단백질의 농도는 Bradford법을 이용하여 정량하였다.
제 3 공정 : 등전점 전기영동
전기영동은 LKB사의 2117 MlutiphorII™ 전기영동장치를 이용하여 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동 (polyacrylamide gel isoelectric focusing, PAGIEF)을 실시하였다. 젤은 6 % 폴리아크릴아마이드농도에 앰폴라인은 각각의 효소 전개에 적절한 넓은 범위 (pH3.0∼10.0)와 좁은 범위 (pH4.0∼6.5)를 2 %되게 첨가하여 pH 범위를 조절하였다. 0.6㎜ 슬랩 젤 (slab gel)에 음극에는 1N NaOH를, 양극에는 1N H3PO4를 완충액으로 한 전해스트립 (electrode strip)을 놓고 800V 전압에서 30분간 전개시킨 후 시료스트립 (sample strip)을 음극 쪽에 일렬로 놓은 후 다시 800V로 30분간 전개하였다. 시료가 시료스트립에서 빠져나갔는지 확인 후 시료스트립을 제거한 뒤 1,200V 전압으로 3시간 동안 전기영동 하였다.
제 4 공정 : 동위효소 활성염색
동위효소 분석에는 퍼록시다아제, 에스터라아제, 에시드 포스파타아제 및 류신 아미노펩티다아제의 총 4종의 동위효소를 활성 염색하여 분석하였으며, 퍼록시다아제는 25℃ 암상태에서 나머지 에스터라아제, 에시드 포스파타아제 및 류신 아미노펩티다아제는 37℃ 암상태에서 젤을 염색액에 담궈 밴드가 나타날 때까지 반응시킨 후 3차 증류수로 세척한 뒤 50% 글리세롤 (PER)과 7% 아세트산 (EST, ACP 및 LAP)로 고정하였다. 아래의 표 4는 동위효소 염색액의 조성을 나타낸다.
제 5 공정 : 유연관계 분석
전기영동상의 동위효소 밴드에 의한 유연관계 분석은 특정위치에 밴드가 있으면 '1', 동일한 위치에 밴드가 없으면 '0'으로 기록하였으며, 통계분석 프로그램인 StatSoft사의 Statistica (5.1 version)을 이용하여 기하학의 거리 방법[F=2mxy/(mx+my)]으로 통계분석 처리하였다 (표 5). 상기 식에서 F는 동위효소 밴드의 유사도, mx 및 my는 균주 x 및 y 각각의 동위효소 밴드 수를 나타내고 mxy는 두 균주의 공통 동위효소 밴드 수를 나타낸다. 분석된 자료는 다시 UPGMA (unweighted pair group method with arithmetic mean) 방법으로 집단 분석을 실시하였다 (도8). 전기영동상의 동위효소 분석은 2회 이상 실시하여 확인하였으며, 밴드의 강약은 고려하지 않았다.
등전점 전기영동을 이용한 동위효소의 분석 결과 각각의 효소에 따라 다양한 밴드의 패턴을 나타내었는데, 특히 퍼록시다아제와 에스터라아제는 종간 밴드의 다형성으로 인해 펠리누스속의 계통분류에 적절한 효소임이 밝혀졌으며 보조적으로 에시드 포스파타아제와 류신 아미노펩티다아제의 종간 밴드 패턴의 다형성을 이용하여 분석하였다.
도4에서와 같이 퍼록시다아제 동위효소 분석에서는 대부분의 균주들이 pH3∼10범위에서 뚜렷한 밴드를 나타내고, 종간 밴드의 양상이 비교적 다양하였다. 총 24개의 밴드가 확인되었으며, 이 중 공지된P. linteus균주와 채집된 WI 시리즈 펠리누스 (Phellinus)속의 균주들은 2∼3개의 주 밴드와 몇 개의 소수 밴드들이 공통적으로 관찰되었고,P. biscuspidatus, P. gilvus, P. johnsonianus, P. pini, P. pomaceus, P. tremulus등도 저마다 독특한 밴드 패턴을 보여 분류가 비교적 용이하였다.
도5에서와 같이 에스터라아제 동위효소 분석에서는 pH3∼10범위에서 총 31개의 밴드가 관찰되어 밴드의 수가 많고, 밴드의 패턴이 다양한 효소임이 확인되었다. 전체적으로 한 균주에 1∼3개의 주 밴드와 몇 개의 소수 밴드로 구성되어 있으며, 종간 밴드의 패턴이 다양하여 퍼록시다아제와 마찬가지로 분류가 매우 용이하였다. 채집된 WI 시리즈 펠리누스 (Phellinus)속의 균주들은P. linteus의 밴드 패턴과 비슷한 경향을 보였다.
도6에서와 같이 에시드 포스파타아제 동위효소 분석에서는 총 15개의 밴드가 pH4∼6.5범위에서 관찰되었다.P. gilvus와P. pini는 주 밴드가 관찰되지 않았으며,P. linteus, P. biscuspidatus, P. johnsonianus, P. pomaceus, P. tremulus및 채집된 WI 시리즈 펠리누스 (Phellinus)속 균주들은 모두 비슷한 위치에서 1∼2개의 동위효소가 관찰되었다.
도7에서와 같이 류신 아미노펩티다아제 동위효소 분석에서는 총 16개의 밴드가 pH4∼6.5범위에서 관찰되었으며 전체적으로 한 균주에 2∼4개의 주 밴드가 비슷한 위치에서 존재하였고, 공지 균주인P. linteusKCTC6190과P. linteusKCTC6719의 밴드 패턴이 전혀 다른 양상을 보인 점이 특이하였으며 채집된 WI 시리즈 펠리누스 (Phellinus)속의 균주들은P. linteusKCTC6719의 밴드 패턴과 유사하였다.
Phellinus속의 7종 8균주와 채집된 WI 시리즈 펠리누스 (Phellinus)속 10개 균주의 동위효소 총 86개의 밴드 패턴에 의한 유연관계 분석결과 유연 거리 (linkage distance)가 최고 0.725에서 최저 0.037로 나타났으며 1.0은 유연관계가 완전히 일치하는 동일한 균주임을 나타낸다(표 5). 이러한 자료를 사용하여 UPGMA방법으로 집단 (cluster) 분석한 결과 펠리누스 (Phellinus)속 균주들은 총 5개 분류군으로 나눌 수 있었다. 분류군 1은P. linteusKCTC6190과 채집균주인 WI9906P, WI2001P로 형성되었고, 분류군 2는P. linteusKCTC6719와 채집균주인 WI99041 (KCTC0912BP), WI9905P, WI2002P, WI2003P, WI99042, WI9901P, WI9902P 및 WI9903P로 나뉘어졌으며 분류군 3은P. biscuspidatusKCTC6651과P. gilvusKCTC6653으로, 분류군 4는P. johnsonianusKCTC6654, P. tremulusKCTC6659 및P. pomaceusKCTC6656으로 나뉘었으며 분류군 5는P. piniKCTC6655가 속하였다(도 8). 전반적으로 채집된 WI 시리즈 펠리누스 (Phellinus)속의 균주들은 모두P. linteus와 같은 종 분류군으로 분류되었으며, 이들은 다시P. linteusKCTC6190과 KCTC6719의 두 분류군으로 나뉘었는데, 이들은 지리적, 환경적 영향에 의한 종내 변이종인 것으로 판단된다.
실시예 3. 균주의 배양학적 특성 및 다당체 생산성
10종의 펠리누스 린테우스 균주와 2종의 공지 균주를 감자 덱스트로즈 아가 (potato dextrose agar) 고체 배지에서 25℃를 유지하면서 15일간 배양한 후 100ml의 감자 덱스트로즈 브로스 (potato dextrose broth) 액체 배지가 들어있는 500ml 삼각플라스크에서 10일 배양하였다．배양된 균사체를 WIM 배지가 200ml 들어있는 1L 삼각플라스크에 10%(v/v)으로 접종한 후 25℃의 진탕배양기(shaking incubator)에서 120rpm으로 교반하면서 7일간 배양하였다. 배양종료 후 배양 균사체의 균체형태를 조사한 후 배양 균사체는 여과지로 여과하고 증류수로 3회 세척한 후 건조기에서 105℃, 8시간 동안 건조 후 균사체 무게를 측정하였으며, 그 결과는 표6과 같다.
실시예 4. 다당체 생산성
실시예 3에서 얻어진 각각의 건조 균사체 10g을 물 50ml에 넣고 극초단파 추출기에 장착한 후 Power를 100%(2450MHz)로 조정하고 추출시간을 1분으로 조정하여 다당류를 추출하였다. 추출 완료 후 균사체는 와트만 2번 여과지로 여과하여 제거하였다. 균사체 추출 여과액은 한외여과막(MW300,000)을 통해 저분자량 다당체를제거한 후 건조장치(BUCHI, Rotavapor 124)로 건조하여 고분자량의 다당체를 건조분말로 수득하였으며, 그 결과는 표7과 같다.
표6 및 표7에서 확인할 수 있는 바와 같이, 펠리누스 린테우스 WI99041 균주(KCTC 0912BP)가 가장 높은 균사체 생산성 및 단백다당체 생산수율을 내타냈으며, 공지균주 ATCC26710 과 비교하여 건조중량은 84% 증가되었으며 다당류 수율면에서도 82% 향상된 결과를 나타내었다.
실시예 5 : 펠리누스 린테우스 WI99041 (KCTC0912BP) 균사체의 대량 배양
펠리누스 린테우스 WI99041 (KCTC0912BP) 균사체를 100ml의 감자 덱스트로즈 브로스 (potato dextrose broth) 복합배지가 들어있는 500ml 삼각플라스크에서 10일 배양하였다．배양된 균사체를 다시 200ml 내지 300ml의 WIM 배지가 들어있는 1L 삼각플라스크에 종균 10%(v/v)으로 접종한 후 10일 배양하고 이 배양액을 10%(v/v) 종균으로 사용하였다. 종균으로 사용하는 균사체는 멸균된 믹서기에 넣은 후 균질화시켜 7L 용량의 상부형 발효기(Marubishi Co. Ltd.)에 5L의 WIM 배지가 포함되어 있는 용기에 접종하였다. 펠리누스 린테우스 WI99041 (KCTC0912BP) 균사체의 배양 환경은 공기주입속도를 0.1 vvm내지 1 vvm으로 조정하면서 공급하였다. 공기주입속도 1 vvm 이상에서는 다량의 거품발생으로 인하여 균사체가 배양기 벽면에 붙어자라는 경향이 있어서 공기주입속도는 1 vvm 이하로 조정하였다. 배양온도는 배양실내에 온냉방기를 설치하여 실내 온도를 20℃ 내지 35℃로 조정하여 5일내지 10일간 배양하였다. 생물반응기는 멸균기를 이용하여 121 ℃로 20분간 실시하였다. 배양종료 후 배양 균사체는 여과지로 여과하고 증류수로 3회 세척한 후 건조기에서 105 ℃, 8시간 동안 건조 후 균사체 무게 측정하여 건조중량으로 31.5 g/L를 얻었다(도 9).
실시예 6 : 항암성 다당류의 제조
실시예 5에서 얻어진 건조 균사체 60g을 물 300ml에 넣고 극초단파 추출기에 장착한 후 Power를 100%(2450MHz)로 조정하고 추출시간을 1분으로 조정하여 다당류를 추출하였다. 극초단파 추출 후 균사체 케익은 여과하여 제거하였다. 생성된 여과액을 여과시스템(Satocon slice, satorius co.)으로 미세여과(0.2㎛)를 수행하여 남아있던 균사체 찌거기를 제거하고 한외여과(MW300,000)를 통해 저분자량의 물질을 제거하면서 1/20 농축된 농축액을 얻었다(도 10). 이 농축액을 건조장치(BUCHI, Rotavapor 124)로 건조하여 고분자량의 다당체를 건조분말로 수득하였다.
실시예 7 : 항암성 다당류의 구성당 및 구성 비율
실시예 6에서 얻은 다당류의 구성 단당류 성분을 분석하기 위하여 가스 크로마토그래피를 실시하였다. 다당류를 구성하고 있는 단당류의 분석은 Mitruka (1975)의 방법에 준하였으며 시료 20mg을 3% 염산-메탄올과 함께 테프론 마개로 된 시험관에 넣고 시험관 안의 공기를 질소로 치환시킨 후 80℃의 건조기에 15분간 방치 후 마개를 단단히 막아 20시간동안 메탄올라이시스 시켰다. 이를 1ml의 무수 피리딘에 녹인 후 0.2ml의 헥사메틸디실라잔(hexamethyldisilazane)과 0.1ml의 트리메틸클로로실란(trimethylchlorosilane)을 가하고 30초간 맹렬히 진탕한 뒤 10분간 방치 후 RTX-5 캐필러리 컬럼 ( 0.53 ㎜ × 30 m )이 장착된 GC (Varian 3800)에 의해 분석하였다. 이 때, 컬럼 온도는 초기에 180 ℃에서 1분 간격으로 4 ℃씩 온도를 증가시켜 최종온도가 220 ℃가 유지되도록 하였고, 검출기의 온도는 280 ℃, 주입부의 온도는 250 ℃로 유지하였다. 가스 크로마토그래피에 의해 분석된 다당류의 구성당 및 구성비율을 하기 표 8에 나타내었다.
상기 표8에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명 펠리누스 린테우스 WI99041 (KCTC0912BP) 균주로부터 추출 분리된 다당류는 구성당의 구성성분이 종래에 보고된 다당류의 구성당의 종류와 성분비가 완전히 다르며 또한 라이보즈가 다당류의 구성 단당 성분으로 보고된 경우는 전혀 없으므로 신규한 다당류라 할 수 있다(도11).
실시예 8 : 항암성 다당류의 분자량 측정
실시예 6에서 얻은 다당류의 분자량을 확인하기 위해 고압 액체 크로마토그래피를 이용하여 용출시간을 측정하고, 이를 다당류의 분자량 표준물질인 덱스트란(Sigma,CO.)을 사용하여 얻은 표준곡선과 비교하여 분자량을 결정하였다. 컬럼으로서 Ultrahydrogel 2000 GPC 컬럼 (7.8× 300 ㎜)을 사용하였고, H2O를 이동상으로 하여 분당 1㎖의 유속으로 용출시키면서 굴절률 검출기 (Waters 410)를 사용하여 측정하였다. 분자량 측정 결과는 하기 표 9 와 같다.
본 발명에서 사용된 신규 펠리누스 린테우스 WI99041 (KCTC0912BP) 균주로부터 추출 분리된 다당류는 표준 물질인 덱스트란과 비교했을 때 평균분자량 1,400,000 달톤으로 확인되었다 (도 12). 아래의 표 9는 다당체의 분자량 측정 결과를 나타낸다.
실시예 9 : 항암 면역활성 다당류의 구조적 특징
실시예 6에서 얻은 다당류 0.5mg과 KBr 0.5mg을 잘 혼합한 후 막자 사발에서 마쇄하여 KBr 펠렛을 만든 다음 적외선 흡수 스펙트로포토미터 (JASco, FT/IR-410)를 사용하여 적외선 흡수 스펙트럼을 얻었다. 도 13은 항암 면역 활성 다당류의 적외선 흡수 스펙트럼으로서 다당류에서 전형적으로 나타나는 피크 즉 3400cm-1부근에서 당의 하이드록시기로부터 유래하는 O-H 신축진동, 1630cm-1부근의 C-O 신축진동, 1500∼1300 cm-1부근에서 C-H 변각진동 및 1250cm-1및 1050 cm-1부근에서 C-H, C-O 진축진동을 볼 수 있었다. 또한 베타-글라이코시딕 결합에 기인하는 피크를 890cm-1부위에서 관찰할 수 있었다.
실시예 10 : 항암활성 효과
아이씨알 쥐의 복강내에서 7일간 배양된 사르코마 180 세포를 복수와 함께 취하여 생리 식염수로 세척하고 사르코마 180 세포만을 분리하였다. 생리식염수로 2X106cells/ml이 되도록 부유액을 만들고, 이 부유액 0.1ml 씩을 4주된 체중 25g 아이씨알 쥐 20마리의 왼쪽 서혜부에 피하 이식하였다.
단백다당체의 투여는 종양세포를 이식하고 24시간 후부터 매일 1회씩 20일간 연속하여 실시예6에서 얻은 단백다당체를 복강내에 주사하였다. 각 실험군당 10마리씩으로 하여 대조군은 0.9% 생리식염수만을 투여하고 단백다당체투여 실험군은 실시예 6에서 얻은 시료를 생리식염수에 용해하여 100mg/kg/day으로 주사하였다. 모든 주사약물은 0.2㎛ 필터로 여과 멸균하여 사용하였다.
결과의 판정은 종양세포를 이식한 날로부터 30일째 되는 날 실험동물을 치사시키고, 생성된 고형암을 적출한 후 그 중량을 측정하여 평균 종양 중량을 얻고 이로부터 다음 식에 따라 종양 저지 백분율을 구하여 표 10에 나타내었다.
저지백분율 (I.R., %) = {(CW - TW)/CW} X 100
CW : 대조군의 평균 종양 무게
TW : 실험군의 평균 종양 무게
상기 표10에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 단백다당체는 대조군에 비해 66.95%의 탁월한 종양저지 효과를 가짐을 알 수 있다.
이상, 상기 실시예를 통하여 설명한 바와 같이 본 발명은 기존에 알려진 공시균주와는 진화적 유연관계 및 미생물학적 특성이 전혀 다른 즉, 균사체 액상 배양시 1 ㎜ 미만의 공 (pellet) 형태를 나타내며 다당체 생산성이 우수한 신규의 펠리누스 린테우스 WI99041 (KCTC 0912BP) 균주를 동정하여 제공하는 효과가 있다. 또한 이러한 신규한 펠리누스 린테우스 WI99041 (KCTC 0912BP) 균주로부터 추출 분리된 다당류 물질은 이전에 보고된 다당류와는 분자량과 구성단당류의 성분 및 조성비가 완전히 다르고 동시에 항암 면역활성을 증가시키는데 매우 뛰어난 효과가 있으므로, 생물의약산업상 매우 유용한 발명이라 할 수 있다.

Claims (3)

  1. 항암 면역활성 물질을 생산하는 펠리누스 린테우스 WI99041 (Phellinus linteus) KCTC 0912BP 균주.
  2. 펠리누스 린테우스 WI99041 (Phellinus linteus) KCTC 0912BP 균주의 균사체로부터 분리정제되고, 평균분자량이 1,400,000 달톤이며, 당성분이 5~30 중량%의 라이보즈, 10~55 중량%의 만노즈, 5~25 중량%의 갈락토즈 및 5~50 중량%의 글루코즈를 포함하는 항암 면역활성 다당류.
  3. 제2항에 있어서, 당성분이 14.2 중량%의 라이보즈, 36.7 중량%의 만노즈, 10.6 중량%의 갈락토즈 및 17.4 중량%의 글루코즈를 포함하는 항암 면역활성 다당류.
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