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CN113308378B - 高产麦角硫因的灵芝菌株及其应用 - Google Patents

高产麦角硫因的灵芝菌株及其应用 Download PDF

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CN113308378B CN202010120380.8A CN202010120380A CN113308378B CN 113308378 B CN113308378 B CN 113308378B CN 202010120380 A CN202010120380 A CN 202010120380A CN 113308378 B CN113308378 B CN 113308378B
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Abstract

本发明公开一株高产麦角硫因的灵芝菌株及其应用，属于微生物发酵技术领域。该灵芝菌株名称为Ganoderma resinaceum FQ23，保藏编号：CGMCC NO.19152。所述灵芝菌株是野外采集并分离菌种得到的，具有培养简单、生长速度快且高产麦角硫因等特点；本发明还提供应用于生产麦角硫因的液体发酵体系，在该发酵体系中，该灵芝菌株发酵产生的菌丝体可提取出富含麦角硫因的提取物，且经纯化后的产物可一定程度抑制黄嘌呤氧化酶活性，用于抗高尿酸血症药物或保健品等产品的制备；亦可将该提取物作为添加剂添加到各类非医用产品中，用于制备化妆品、保健品、功能食品等，具有良好的开发利用前景。

Description

高产麦角硫因的灵芝菌株及其应用
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，涉及高产麦角硫因的灵芝菌株，特别涉及一株具有高产麦角硫因能力的灵芝(Ganoderma resinaceum)FQ23，以及其在液体摇瓶发酵生产麦角硫因中的应用。
背景技术
食用菌是能形成大型的、肉质(或胶质)子实体或菌核类组织并能供人们食用或药用的一类大型真菌(顾可飞et al.,2017)。据统计，中国食用菌有936种、23变种、3亚种和4变型(戴玉成et al.,2010)，其中有90多种可以人工培养出子实体，另有十几种可以利用菌丝深层发酵(庄海宁et al.,2015)。食用菌中含有多种生物活性因子，如多萜类物质、多糖、功能性蛋白、黄酮、多酚等，对人体有各类保健功能，如提高免疫调节能力、预防癌细胞形成、抗衰老等(张云野et al.,2016)。
麦角硫因(Ergothioneine，EGT)，学名2-巯基-L-组氨酸三甲基内盐，是一种小分子氨基酸类似物，具有很强的抗氧化性。麦角硫因在自然界中主要以硫醇和硫酮的形式存在，而在生理pH值下主要以硫酮的形式存在，因此性质相对稳定(潘虹余et al.,2019)。麦角硫因最早发现于真菌Claviceps purpurea的菌核中，存在于细菌、真菌、植物及动物体内，其中细菌和真菌已经被证实可以自身合成麦角硫因(ASKARI and MELVILLE,1962)，而人和其他哺乳动物体内无法合成麦角硫因，只能通过摄食积累麦角硫因(Burn et al.,2017)。麦角硫因在人体中主要分布在血液、肝脏、心脏、肾脏、眼晶状体、脑部等部位，但含量差异较大，可能与不同组织受氧化应激程度相关(Cheah and Halliwell,2012)。基于其抗氧化性，麦角硫因具有许多生理生化功能，例如：防止高血糖引起的内脏功能异常(Servillo et al.,2017)和内皮衰老(D Onofrio et al.,2016)、保护细胞免受紫外损伤(Bazela et al.,2014)、免疫调节(Yoshida et al.,2017)、改善癌症免疫疗法微环境(Yoshida et al.,2019)、保护器官免受缺血-注血性损伤(Yoshida et al.,2019)等等。因此，麦角硫因是一种天然的体内抗氧化剂，对人体具有多种保健作用。
麦角硫因凭借其强大的生理功能受到广泛关注，但其天然产量较低，因此，如何提高麦角硫因产量是一个关键的问题。Naoyuki Tanaka等(Tanaka et al.,2019)尝试将耻垢分枝杆菌中的egtBCDE基因转入大肠杆菌中并使用发酵罐发酵，可产出1.31g/L麦角硫因，利用这种方法生产的麦角硫因虽然产量较高，但其安全性将受到质疑。若要生产大量可食用的麦角硫因，食用菌是较好的麦角硫因来源之一。食用菌中麦角硫因含量丰富，且安全性可达到食品级。Wi Young L ee等(Lee et al.,2009)对28种食药用菌子实体麦角硫因进行比较，不同菌株之间麦角硫因含量从0.06～5.54mg/g DW不等，表明麦角硫因广泛存在于食药用菌中，但菌株间差异较大。另外，Michael D.Kalaras(Kalaras et al.,2017)等比较了13种食药用菌子实体，其中最高为美味牛肝菌(Boletus edulis)的7.27m g/g DW。虽然食药用菌子实体中麦角硫因含量可观，但在大规模工业生产中使用子实体提取的方法往往是不合适的，因为子实体栽培时间长，成本较高，而液体深层发酵技术则可以大量生产食药用菌菌丝体，在工业运用中技术成熟。S hin-Yu Chen等(Chen et al.,2012)利用液体发酵的方法，培养并对比了20种食药用菌的菌丝体麦角硫因含量，其中最高的是杏鲍菇(Pleurotus eryngii)，1514.6mg/kg DW菌丝，产量依然较低。在现有技术中，未见利用灵芝属大型真菌进行液体发酵生产大量麦角硫因的报道，在液体发酵麦角硫因的报道中多使用糙皮侧耳属大型真菌作为菌种进行探究。
参考文献：
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发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种高产麦角硫因的灵芝菌株。克服了麦角硫因来源不安全或食用菌发酵产量过低等问题，提供一种利用安全来源的食药用菌灵芝发酵生产麦角硫因有效应用。
本发明的另一目的在于提供上述高产麦角硫因的灵芝菌株的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
本发明提供一株高产麦角硫因的灵芝菌株，命名为灵芝(Ganoderma resinaceum)FQ23，是野外采集并分离菌种得到的。
所述的Ganoderma resinaceum FQ23的保藏信息：保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2019年12月23日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC NO.19152。
所述的灵芝(Ganoderma resinaceum)FQ23具有以下形态特征：菌盖呈红褐色，形状近似扇形，成熟体有环状纹理，边缘较薄且颜色较浅，菌柄短而粗。菌丝在PDA平板上生长，为白色菌丝，菌丝间结合紧密，紧贴培养基表面，形成一层菌皮。生长时间过长或放置过久时菌丝老化呈淡黄色，较坚韧。
本发明还提供一种Ganoderma resinaceum FQ23在液体摇瓶发酵生产麦角硫因中的应用。
所述的液体摇瓶发酵所用的发酵培养基的配方为：马铃薯200～350g/L，碳源15～35g/L，氮源0～15g/L，KH2PO4 0.5～5g/L，MgSO4·7H2O 0.2～3g/L，麦角硫因底物组合物中各底物的终浓度为4～28mmol/L，pH3.5～6.5。
所述的碳源为葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、甘油、乳糖中的至少一种；
所述的氮源为酵母提取物、蛋白胨、氯化铵、硫酸铵、硝酸钠中的一种或几种。
所述的麦角硫因底物组合物为组氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸中的至少2种；
所述的发酵培养基的制备方法，包括如下步骤：
将去皮马铃薯200～350g切成小块后加800～1000mL水，煮沸后保持沸腾20～30分钟，使用4层纱布过滤，获得马铃薯汁，利用马铃薯汁溶解一定量的固形物后定容至1L；所述的固形物为：碳源15～35g/L，氮源0～15g/L，KH2PO4 0.5～5g/L，MgSO4·7H2O 0.2～3g/L，加入一定配比的麦角硫因底物组合物，调pH至3.5～6.5，装液量为每250mL锥形瓶装60～160mL培养液，121℃灭菌30分钟后备用。
尤其，所述的一定配比麦角硫因底物组合物添加方法为：配制一定浓度的麦角硫因底物组合物的混合溶液，在发酵培养液发酵的第0天或开始发酵后若干天时，于无菌环境中过滤除菌，加入一定量混合溶液至培养基中，使麦角硫因底物组合物中各氨基酸在培养基中的终浓度分别处于4～28mmol/L。
本发明还提供了一种Ganoderma resinaceum FQ23与其他食药用菌菌丝体麦角硫因含量对比的方法。
尤其，在上述的技术方案中，不同食药用菌的培养的方法为：将长满菌丝的母种平板切取部分带琼脂的菌块投入筛选培养基中，以20～35℃、50～220rpm的条件于振荡培养器中培养5～14天，得到不同食药用菌的发酵液。
在上述的技术方案中，所述的母种平板使用的培养基为PPDA培养基。
在上述的技术方案中，所述的母种平板接种量为2％～10％。
在上述的技术方案中，所述的筛选培养基的配方为：
马铃薯200～350g/L，葡萄糖15～35g/L，L-天冬氨酸1～5g/L，KH2PO40.5～5g/L，MgSO4·7H2O 0.2～3g/L，pH4.0～6.5。
在上述的技术方案中，所述的筛选培养基制作方法为：将去皮马铃薯200～350g切成小块后加800～1000mL水，煮沸后保持沸腾20～30分钟，使用4层纱布过滤，获得马铃薯汁，利用马铃薯汁溶解一定量的固形物后定容至1L；所述的固形物为：葡萄糖15～35g/L，L-天冬氨酸1～5g/L，KH2PO4 0.5～5g/L，MgSO4·7H2O 0.2～3g/L，调pH至4.0～6.5，装液量为每250mL锥形瓶装50～120mL培养液，121℃灭菌30分钟后备用。
本发明还提供了一种利用Ganoderma resinaceum FQ23高产麦角硫因的方法，包括如下步骤：
首先经PPDB培养基活化Ganoderma resinaceum FQ23菌种，培养，获得种子液；再由种子液转接至发酵培养基，以20～33℃，80～220rpm的条件培养5～14天，获得含有较多高产麦角硫因菌丝体的发酵液。
所述的种子液的活化方法为：从母种平板上切取部分带琼脂的菌块投入种子液培养基中，接种量为1～5％，以25～28℃，150～200rpm培养72～120小时后用于接种发酵培养基。
所述的母种平板使用的培养基为PPDA培养基。
所述的PPDA培养基：马铃薯200g/L(煮汁)，葡萄糖25g/L，蛋白胨5g/L，KH2PO4 3g/L，MgSO4·7H2O 1.5g/L，琼脂2％。
所述的PPDB培养基：马铃薯200g/L(煮汁)，葡萄糖25g/L，蛋白胨5g/L，KH2PO4 3g/L，MgSO4·7H2O 1.5g/L。
本发明还提供一种富含麦角硫因的提取物，其是由Ganoderma resinaceum FQ23液体发酵菌丝体获得的。
所述的富含麦角硫因的提取物的提取方法，包括如下步骤：
利用传统固液分离方法(过滤或离心)进行发酵液固液分离，并将固体部分进行干燥处理(烘干或冷冻干燥)，准确称取一定重量的干燥后菌丝，研磨成粉末，以料液比1：20～1：200加入乙醇提取试剂(30～100％乙醇，优选70％乙醇)，加体积分数为10～30％(优选20％)的1％SDS溶液(70％乙醇配制)，颠倒混匀后4℃静置过夜，以一定条件离心后取上清液(菌丝与上清液的固液比为1：100)，氮吹至小体积并将其定容(或氮吹至干再复溶)，取适量经0.22微米水系微孔滤膜过滤后获得富含麦角硫因的提取物，进行高效液相色谱(H ighperformance liquid chromatography，HPLC)检测。
另外，本发明提供的Ganoderma resinaceum FQ23菌株提取物对黄嘌呤氧化酶活性有一定的抑制作用，可作为黄嘌呤氧化酶抑制剂，用于抗高尿酸血症药物或保健品等产品的制备。
所述的提取物除了富含麦角硫因外，还具有灵芝的其他活性成分，因此亦可将该提取物作为添加剂添加到各类非医用产品中，用于制备化妆品、保健品、功能食品等。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明于野外采集并分离了一株Ganoderma resinaceum FQ23菌株，其对比于其他食药用菌具有更高的麦角硫因含量及培养简单、生长速度快等特点，且该菌株在20～33℃时均有较大活性并产生大量麦角硫因，在发酵工业应用中可以根据需要设置培养温度，从而节省能耗，有利于降低生产成本及具有环境友好性。
(2)本发明还提供应用于生产麦角硫因的液体发酵体系，在该发酵体系中，Ganoderma resinaceum FQ23发酵产生的菌丝体可以提取出富含麦角硫因的提取物，且经纯化后的产物可以一定程度抑制黄嘌呤氧化酶活性。众所周知，黄嘌呤氧化酶是人体内尿酸合成的关键酶，因此该菌株提取物可作为对抗高尿酸血症的一类药物或保健品。另外，该提取物除了富含麦角硫因外，还具有灵芝的其他活性成分，因此亦可将该提取物作为添加剂添加到各类非医用产品中，用于制备化妆品、保健品、功能食品等，具有良好的开发利用前景。
附图说明
图1是菌株FQ23培养后子实体形态。
图2是FQ23的ITS序列扩增产物电泳图。
图3是不同培养基成分对Ganoderma resinaceum FQ23产麦角硫因的影响，包括不同碳源及其添加量、不同氮源及其添加量的影响；其中，A：培养基中不同碳源的影响；B：培养基中不同氮源的影响；C：培养基中碳源为不同添加量的蔗糖的影响；D：培养基中氮源为不同添加量的氯化铵的影响。
图4是不同培养时间对Ganoderma resinaceum FQ23产麦角硫因的影响。
图5是不同培养条件对Ganoderma resinaceum FQ23产麦角硫因的影响；其中，A：不同pH值的影响；B：不同装液量的影响；C：不同接种量的影响；D：不同温度的影响。
图6是单一添加不同浓度的麦角硫因合成底物Ganoderma resinaceum FQ23产麦角硫因的影响；其中，A：不同浓度的单一组氨酸的影响；B：不用浓度的单一半胱氨酸的影响；C：不同浓度的单一甲硫氨酸的影响。
图7是从野外采摘FQ23到制备麦角硫因纯化提取物的流程图。
图8是麦角硫因提取物纯化曲线。
图9是麦角硫因标准品对黄嘌呤氧化酶的抑制作用探究。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
本发明实施例所用的菌株名称及来源：实验使用的杏鲍菇(杏鲍390)、白灵菇(白灵菇6号)、黑平114、黑平130、榆黄蘑(榆黄菇1号)、金针菇(黄金55)、灰树花菌种购于中国山东省寿光食用菌研究所；
蛹虫草CM10在文献“高产类胡萝卜素的蛹虫草固体发酵体系及其产品研究[D].华南农业大学,2016”中公开；
美国灵芝即赤芝(Ganoderma lucidunm)Gal-0201在文献“薛致鸿,林俊芳,钟武杰,袁浩,and郭丽琼,2007,灵芝Gal-0201的生物学特性及有效成分分析[J].食用菌,p.19-21”中公开。
本发明实施例所用PPDA培养基：马铃薯200g/L(煮汁)，葡萄糖25g/L，蛋白胨5g/L，KH2PO4 3g/L，MgSO4·7H2O 1.5g/L，琼脂2％。
本发明实施例所用PPDB培养基：马铃薯200g/L(煮汁)，葡萄糖25g/L，蛋白胨5g/L，KH2PO4 3g/L，MgSO4·7H2O 1.5g/L。
本发明实施例所用筛选培养基配制方法为：将去皮马铃薯200g切成小块后加1000mL水，煮沸后保持沸腾20～30分钟，使用4层纱布过滤，获得马铃薯汁，利用马铃薯汁溶解一定量的固形物后定容至1L。所述的固形物为：葡萄糖25g/L，L-天冬氨酸3g/L，KH2PO42g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，调pH至5.50，装液量为每250mL锥形瓶装100mL培养液，121℃灭菌30分钟。
本发明实施例所用基础培养基配方为：将去皮马铃薯200g切成小块后加1000mL水，煮沸后保持沸腾20～30分钟，使用4层纱布过滤，获得马铃薯汁，利用马铃薯汁溶解一定量的固形物后定容至1L。所述的固形物为：葡萄糖25g/L，酵母提取物2g/L，KH2PO4 3g/L，MgSO4·7H2O 1.5g/L，调pH至5.50，装液量为每250mL锥形瓶装100mL培养液，121℃灭菌30分钟。
实施例1菌株分离纯化及ITS鉴定
(1)菌株分离纯化：菌株FQ23采集自海南省五指山青菁岭树林地上，形态特征与灵芝相似，培养后子实体的形态如图1所示。在无菌条件下将FQ23子实体进行组织分离，取菌盖截面中央组织，于PDA培养基上进行平板培养，25℃培养7天，无杂菌污染且长出白色细密菌丝，再进行下一步ITS分子鉴定。
(2)ITS鉴定：从活化后长满菌丝的平板上在无菌条件下刮取少量菌丝于1.5mL离心管中，加入植物裂解液(1mol/L KCl，10mmol/L EDTA，用100mmol/L pH9.5 Tris-HCl配制)100μL，用微量研磨器研磨至匀浆状，将离心管置于95℃金属浴10分钟，随后用漩涡振荡器充分震荡，作为PCR扩增模板，使用通用引物ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)进行PCR扩增，扩增后电泳图可见约750bp处有特征条带(图2)。扩增产物送到广州天一辉远基因科技有限公司测序。
(3)将测序得到的ITS序列上传到NCBI数据库进行Blast比对，获得同源性分析结果，FQ23的ITS序列与Ganoderma resinaceumG44 18s核糖体RNA具有99.43％同源性，亲缘关系最近。结合菌株的形态特征，鉴定FQ23为Ganodermaresinaceum FQ23。
所述的Ganoderma resinaceum FQ23的保藏信息：保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2019年12月23日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC NO.19152。
所述的Ganoderma resinaceum FQ23的ITS序列如SEQ ID No：1所示。
实施例2菌丝体制备
(1)接种：在无菌条件下用直径0.8cm打孔器切出带有菌丝的琼脂块6块，投入灭菌后的PPDB培养基中，28℃，180rpm，避光培养，84小时后获得种子液。接种2mL种子液至基础培养基中，28℃、150rpm摇瓶发酵10天获得大量菌丝球。
(2)收获处理：将所得菌液以8000rpm，25℃，离心15分钟，收集菌丝体，用蒸馏水清洗2次，称量空培养皿重量m(g)，将菌丝体置于培养皿中冷冻干燥至恒重后称重M(g)。生物量(Biomass，BM)的计算公式如下：
Figure BDA0002392779560000091
实施例3麦角硫因提取方法
准确称取干燥后菌丝0.1g，研磨成粉末，加入乙醇提取试剂(70％乙醇)20mL，加4mL 1％SDS溶液(70％乙醇配制)，颠倒混匀后4℃静置过夜，8000rpm，4℃离心15分钟后取10mL上清液，氮吹至干，加2mL超纯水复溶，取1mL经0.22微米水系微孔滤膜过滤后进行高效液相色谱(High performance liquid chromatography，HPLC)检测。
实施例4麦角硫因检测方法
本发明实施例所用麦角硫因检测方法为：使用岛津LC 2030CN仪器进行麦角硫因高效液相色谱检测。所用色谱柱为Welch Ultimate HILIC Amphion II色谱柱，检测波长为257nm，流动相为乙腈：水＝85：15，流速1mL/min，进样量为20μL，柱温30℃。
实施例5～14从十株食药用菌中筛选高产麦角硫因菌株
将收集到的十株食药用菌菌种转接到母种平板(PPDA培养基)上，于25℃培养10天，于无菌环境以5％的接种量接种到筛选培养基中，于25℃，150rpm震荡培养器中培养10天，用离心或过滤的方法收获菌丝进行麦角硫因提取及检测。结果如表1所示。从表1中可知，在10种食用菌中，灵芝FQ23的每升含量最高，达1.3612mg/L，单位重量菌丝中的麦角硫因含量与含量最高的杏鲍菇无显著差异(p＜0.05)，生物量仅次于最高的蛹虫草CM10。
表1十种食用菌麦角硫因含量对比
实施例 菌株名称 学名 生物量(g/L) EGT(mg/g DW) 每升含量(mg/L)
5 榆黄蘑 Pleurotus citrinopileatus 2.1155±0.4013<sup>d</sup> 0.1505±0.0343<sup>ab</sup> 0.3375±0.1055<sup>bc</sup>
6 灵芝FQ23 Ganoderma resinaceum 7.0007±0.9367<sup>b</sup> 0.1803±0.0339<sup>a</sup> 1.3612±0.3649<sup>a</sup>
7 美国灵芝 Ganoderma lucidunm 6.1009±0.3240<sup>bc</sup> 0.0991±0.0259<sup>bc</sup> 0.6326±0.2140<sup>b</sup>
8 灰树花 Polyporus frondosus 0.7667±0.3236<sup>d</sup> 0.0483±0.0166<sup>cd</sup> 0.0393±0.0169<sup>c</sup>
9 白灵菇 Pleurotus tuoliensis 1.3710±0.3237<sup>d</sup> 0.0920±0.0146<sup>bc</sup> 0.1239±0.0205<sup>c</sup>
10 杏鲍菇 Pleurotus eryngii 1.2010±0.3238<sup>d</sup> 0.1884±0.0307<sup>a</sup> 0.2021±0.0089<sup>bc</sup>
11 黑平114 Pleurotus ostreatus 2.0870±0.6447<sup>d</sup> 0.0614±0.0229<sup>cd</sup> 0.1103±0.0405<sup>c</sup>
12 黑平130 Pleurotus ostreatus 4.1405±0.3239<sup>c</sup> 0.0588±0.0038<sup>cd</sup> 0.2441±0.0367<sup>bc</sup>
13 蛹虫草CM10 Cordyceps militaris 10.1605±0.3241<sup>a</sup> 0.0088±0.0035<sup>d</sup> 0.0878±0.0277<sup>c</sup>
14 金针菇 Flammulina velutiper 4.4275±0.3242<sup>c</sup> 0.0751±0.0211<sup>cd</sup> 0.2929±0.0501<sup>bc</sup>
注：同列上标含相同字母表示差异不显著(P＞0.05)，含不同字母表示差异显著(P＜0.05)。
实施例15培养基碳氮源对Ganoderma resinaceum FQ23产麦角硫因的影响
将上述基础培养基中的葡萄糖分别替换成等量的麦芽糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉，培养基其他成分及培养条件不变；将基础培养基中的酵母提取物分别替换成等量的蛋白胨、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵，培养基其他成分及培养条件不变；探究不同碳源和氮源对麦角硫因发酵的影响。结果如图3A、B所示。从图3A中可知，在5种碳源中，麦角硫因产量从高到低分别为蔗糖＞葡萄糖＞乳糖＞麦芽糖＞可溶性淀粉。以蔗糖作为唯一碳源的实验组产出的麦角硫因远高于其他碳源实验组，产量达到2.8336mg/L，因此选用蔗糖作为培养基碳源进行后续试验。从图3B中可知，在5种氮源中，麦角硫因产量从高到低分别是：氯化铵＞硝酸钠＞硫酸铵＞蛋白胨＞酵母提取物，其中以氯化铵作为氮源的培养基麦角硫因产量达到1.8967mg/L，因此选取了氯化铵作为单一氮源进行后续试验。
实施例16培养基碳氮源含量对Ganoderma resinaceum FQ23产麦角硫因的影响
将基础培养基中的葡萄糖替换为蔗糖，酵母提取物替换为氯化铵，其他成分不变，然后单一改变蔗糖含量(7.5、10、12.5、15、17.5、20、25、30g/L)或氯化铵含量(0、2、4、6、8、10g/L)进行探究，培养基其他成分及培养条件不变，探究不同碳源或氮源含量对麦角硫因发酵的影响，结果如图3C、D所示。从图3C中可知，当培养基中蔗糖含量为20g/L时，麦角硫因产量最高，达5.0217mg/L，其次为15g/L，为4.1530mg/L，与20g/L的差异不显著，因此选用15g/L作为培养基蔗糖添加量。从图3D中可知，当培养基中氯化铵含量为4g/L时，麦角硫因产量最高，达3.1250mg/L。因此，培养基优选的成分为：蔗糖15g/L，氯化铵4g/L，KH2PO4 3g/L，MgSO4·7H2O 1.5g/L。
实施例17培养时间对Ganoderma resinaceum FQ23产麦角硫因的影响
将上述基础培养基中葡萄糖替换成15g/L的蔗糖，酵母提取物替换成4g/L的氯化铵，作为碳源氮源优化后的培养基成分，向碳源氮源优化后的培养基中接种Ganodermaresinaceum FQ23共24瓶，于28℃，150rpm振荡培养器培养。从摇瓶第4天开始，每天随机取3瓶，连续8天取样，进行生物量和麦角硫因含量的测定并计算每升产量，探究不同培养时间对Ganoderma resinaceum FQ23产麦角硫因的影响，结果如图4所示。由于灵芝FQ23在前三天的生长仍处于适应期，菌丝含量较少，从第4天开始菌丝生长开始进入对数生长期，因此从第4天开始进行生物量及麦角硫因产量的检测。从图4中可知，灵芝FQ23在第4天至第6天菌丝量迅速增长，第6天后菌丝量增长开始减缓，逐渐进入平台期；另一方面，由于麦角硫因在真菌中属于次生代谢产物，因此在发酵前期麦角硫因含量较少，在第7天之后开始积累麦角硫因，到第10天时麦角硫因含量较高且之后开始呈现下降趋势，此时灵芝生物量也达到平台期，因此选用十天作为后续发酵的时间。
实施例18pH值对Ganoderma resinaceum FQ23产麦角硫因的影响
使用碳源氮源优化后的培养基，其他培养条件不变，使其装液量为100mL，接种量为2mL，探究不同培养基pH值对麦角硫因产量的影响。选取了3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.5七个梯度进行pH对麦角硫因产量的探究。由图5A可看出，随着培养基初始pH的变化，菌丝麦角硫因含量、生物量、每升产量均呈现先升高后下降的趋势，极大值分别在pH为5.5、4.5、5.0处，在初始pH为5.0时，获得最高产量3.7765mg/L。
实施例19装液量对Ganoderma resinaceum FQ23产麦角硫因的影响
使用碳源氮源优化后的培养基，其他培养条件不变，使其培养基pH值为5.5，接种量为2mL，探究不同装液量(60、80、100、120、140mL)对麦角硫因产量的影响，由图5B中可以看出，随着装液量增大，菌丝麦角硫因含量先升高再下降，在装液量为100mL/250mL时最高，达到3.2873mg/g DW；生物量在装液量为120mL/250mL时达到最大，为1.4897g/L；每升产量在装液量为120mL/250mL时达到最高，为4.5717mg/L。
实施例20接种量对Ganoderma resinaceum FQ23产麦角硫因的影响
使用碳源氮源优化后的培养基，其他培养条件不变，使其培养基pH值为5.5，装液量为100mL，分别添加种子液2、4、6、8、10mL/瓶，即接种量为2、4、6、8、10％，培养十天后检测麦角硫因产量。由图5C可以看出，随着接种量的升高，三个指标均呈现先升高再下降的趋势，菌丝麦角硫因含量在接种量为4％时最高，达到3.3019mg/g DW；生物量在接种量6％时达到最大，为2.6435g/L；每升产量在6％时达到最高，为8.5385mg/L。
实施例21培养温度对Ganoderma resinaceum FQ23产麦角硫因的影响
使用碳源氮源优化后的培养基，其他培养条件不变，使其培养基pH值为5.5，装液量为100mL，分别添加种子液2mL/瓶，分别将培养液置于20、22.5、25、27.5、30℃的振荡培养器培养十天后检测麦角硫因产量。由图5D可以看出，随着温度的升高，三个指标均呈现先升高再下降的趋势，菌丝麦角硫因含量在温度为27.5℃时最高，达到3.1569mg/g DW；生物量在25℃时达到最大，为3.956g/L；每升产量在27.5℃时达到最高，为9.8395mg/L。
实施例22～30添加底物对麦角硫因产量的影响
使用培养基成分优化后的培养基，调pH至5.5，装液量100mL，接种前分别加入一定浓度的组氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸，以接种量6％接种种子液至液体培养基中，于28℃、150rpm培养10天后提取麦角硫因并进行HPLC检测，探究单一底物添加对麦角硫因产量的影响，结果如图6所示。从图6中可知，单一添加0～16mM的组氨酸时(图6A)，麦角硫因产量呈现先减少后增加的趋势，最低处在8mM处；单一添加0～28mM半胱氨酸时(图6B)，麦角硫因产量缓慢升高，在20mM处迅速增高，随着半胱氨酸浓度进一步增大，麦角硫因产量小幅增加；单一添加0～28mM甲硫氨酸时(图6C)，麦角硫因产量逐渐升高，添加量大于16mM时麦角硫因产量逐渐降低。
使用培养基成分优化后的培养基，调pH至5.5，装液量100mL，接种前加入一定浓度的三种底物(组氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸)的混合物，以接种量6％接种种子液至液体培养基中，于28℃、150rpm培养10天后提取麦角硫因并进行HPLC检测，结果如表2所示。从表2中可知，底物混合物中三种底物浓度分别为：组氨酸8mM，甲硫氨酸16mM，半胱氨酸36mM时，麦角硫因产量达到最高，达8.7626mg/L。
表2三种底物不同浓度混合物对麦角硫因产量的影响
Figure BDA0002392779560000131
从野外采摘FQ23到制备麦角硫因纯化提取物的流程图，如图7所示。
实施例31麦角硫因提取物纯化方法
将麦角硫因粗提液进行层析纯化，层析柱填料为葡聚糖G10，柱高40cm，流速0.8mL/min，上样量为2mL，每7分钟收集一管，取少量进行HPLC检测，结果如图8所示。可知，在第11～15管中出现麦角硫因峰，但其中第11和15管麦角硫因浓度较低，杂质较多，因此取纯度大于30％的第12～14管进行合并收集，冻干后得到纯化后的麦角硫因提取物，其中麦角硫因纯度为43.718％。
实施例32麦角硫因对黄嘌呤氧化酶的抑制作用探究
pH7.5的PBS溶液配制：称取磷酸二氢钾0.9652g，三水合磷酸氢二钾6.96 60g，乙二胺四乙酸0.0368g，用超纯水溶解并定容至500mL。
黄嘌呤溶液配制：精确称取黄嘌呤标准品0.0023g至10mL容量瓶中，加入1mol/LNaOH溶液200μL使其溶解，加PBS定容至10mL。
黄嘌呤氧化酶配制：称取一定重量的黄嘌呤氧化酶粉末，加一定量PBS配制成59U/L的黄嘌呤氧化酶溶液。
麦角硫因标准溶液配制：准确称取麦角硫因标准品，用超纯水定容至10mL，获得一定浓度的麦角硫因标准溶液，对半稀释至不同浓度，获得麦角硫因系列浓度溶液。
反应体系：室温下，将200μL黄嘌呤氧化酶加到1.5mLEP管中，加入样品75μL，于37℃孵育15分钟，加入黄嘌呤溶液200μL启动反应，于37℃反应10分钟，然后立即加入1mol/LHCl 250μL结束反应，37℃保留5分钟后加入PBS定容至1mL。
以上述的反应体系探究麦角硫因对黄嘌呤氧化酶的抑制作用，样品为0.25、0.3、0.5、1.0、1.5、2.0mM的麦角硫因标准溶液，结果如图9所示，由拟合公式计算出麦角硫因标准品对黄嘌呤氧化酶的半数抑制浓度IC50为2.868mM终浓度，即0.6596mg/mL。
实施例33Ganoderma resinaceum FQ23麦角硫因提取物对黄嘌呤氧化酶的抑制作用探究
以上述实施例32的方法，对纯化后的麦角硫因提取物(Ganoderma resina ceumPurified Extract，GRPE)进行黄嘌呤氧化酶抑制作用探究。GRPE配制方法：准确称取纯化后冻干的提取物粉末，加入超纯水溶解配制成不同浓度的GR PE溶液。结果如表3所示，从表3中可知，随着体系中麦角硫因提取物浓度增大，黄嘌呤氧化酶抑制率逐渐增高，当样品浓度达到7.50mg/mL时，抑制率可达71.31％，样品浓度再增大时，抑制率有小幅增加，说明GRPE在浓度为7.50mg/mL时在具有良好XOD抑制作用的同时性价比最高。
表3不同浓度的GRPE对黄嘌呤氧化酶的抑制作用
Figure BDA0002392779560000141
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 高产麦角硫因的灵芝菌株及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 356
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Ganoderma resinaceum FQ23的ITS序列
<400> 1
ctgggagtct acctgatttg aggtcagagg tcataaagct gtctcacaaa cgagacggtt 60
agaagctcgc caaaacgctt cacggtcacg gcgtagacat tatcacaccg agagccgatc 120
cgcaaggaat caagctaata catttaagag gagccgaccg aaacacggcc gacaagcctc 180
caagtccaag cctacaaacc cgcaaaggtt tgtaagttga agatttcatg acactcaaac 240
aggcatgctc ctcggaatac caaggagcgc aaggtgcgtt caaagattcg atgattcact 300
gaattctgca attcacatta cttatcgcat ttcgctgcgt tcttaaatcg atgcaa 356
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ITS4
<400> 2
tcctccgctt attgatatgc 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ITS5
<400> 3
ggaagtaaaa gtcgtaacaa gg 22

Claims (5)

1.一株高产麦角硫因的灵芝菌株，其特征在于：名称为Ganoderma resinaceum FQ23，于2019年12月23日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC NO. 19152。
2.权利要求1所述的高产麦角硫因的灵芝菌株在液体摇瓶发酵生产麦角硫因中的应用，其特征在于：
所述的液体摇瓶发酵所用的发酵培养基的配方为：马铃薯200～350g/L，碳源15～35g/L，氮源0～15 g/L，KH2PO4 0.5～5 g/L，MgSO4·7H2O 0.2～3 g/L，麦角硫因底物组合物中各底物的终浓度为4～28 mmol/L，pH3.5～6.5；
所述的碳源为葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、乳糖中的至少一种；
所述的氮源为酵母提取物、蛋白胨、氯化铵、硫酸铵、硝酸钠中的一种或几种；
所述的麦角硫因底物组合物为组氨酸、甲硫氨酸和半胱氨酸。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：
所述的发酵培养基的制备方法，包括如下步骤：
将去皮马铃薯200～350g切成小块后加800～1000mL水，煮沸后保持沸腾20～30分钟，使用4层纱布过滤，获得马铃薯汁，利用马铃薯汁溶解固形物后定容至1L；所述的固形物为：碳源15～35 g/L，氮源0～15 g/L，KH2PO4 0.5～5 g/L，MgSO4·7H2O 0.2～3 g/L，加入的麦角硫因底物组合物，调pH至3.5～6.5，装液量为每250mL锥形瓶装60～160mL培养液，121 ℃灭菌30分钟后备用。
4.一种利用权利要求1所述的高产麦角硫因的灵芝菌株高产麦角硫因的方法，其特征在于：包括如下步骤：
首先经PPDB培养基活化权利要求1所述的高产麦角硫因的灵芝菌株，培养，获得种子液；再由种子液转接至发酵培养基，以20～33℃，80～220rpm的条件培养5～14天，获得含有高产麦角硫因菌丝体的发酵液；利用传统固液分离方法进行发酵液固液分离，并将固体部分进行干燥处理，称取干燥后菌丝，研磨成粉末，以料液比1：20～1：200加入30～100%乙醇提取试剂，加体积分数为10～30%的1% SDS溶液，颠倒混匀后4 ℃静置过夜，离心后取上清液，上清液的取量按照菌丝与上清液的固液比1：100进行，氮吹至小体积并将其定容或氮吹至干再复溶，经0.22微米水系微孔滤膜过滤后获得富含麦角硫因的提取物；所述PPDB培养基的配方为：马铃薯200 g/L，葡萄糖25 g/L，蛋白胨5g/L，KH2PO4 3g/L，MgSO4·7H2O 1.5g/L。
5.权利要求4所述的方法得到的富含麦角硫因的提取物在制备抗高尿酸血症药物中的应用。
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