KR100425282B1 - 콜레스테롤 저하효과 및 지방세포의 증식 억제 효과를갖는 베타-시토스테롤 유도체 및 그의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 다음의 구조식(I)로 표시되는 화합물 또는 그 약학적으로 허용되는 산 부가염 에 관한 것이며, 본 발명의 화합물은 탁월한 콜레스테롤 저하효과 및 지방세포 증식억제효과를 가진다.

Description

콜레스테롤 저하효과 및 지방세포의 증식 억제 효과를 갖는 베타-시토스테롤 유도체 및 그의 제조방법{β-sitosterol having cholesterol-lowering effect and suppressing effect of fat cell multiplication and process for the preparation thereof}

본 발명은 다음 구조식(Ⅰ)로 표시되는 베타-시토스테롤 유도체 및 그 제조방법에 관한 것이다.

(I)

구조식(I) (코드명 : SJ-2002)

베타-시토스테롤은 식물성 스테롤(Phytosterol)에 60%이상 함유된 주성분으로 동물성 콜레스테롤과 구조는 비슷하나, 장내에서 동물성 콜레스테롤과 경쟁하여 흡수됨으로써 체내 콜레스테롤 농도를 감소시키고, 지방세포의 과성장을 억제할 수 있는 물질로 알려져 있다

본 발명에서 합성한 구조식(I)(코드명 : SJ-2002) 의 화합물은 장내에서 동물성 콜레스테롤과 경쟁에 있어 기존의 베타-시토스테롤 보다 월등한 흡수율을 갖고 있으며, 혈중 콜레스테롤 농도를 혈액내에서 감소 시킴으로써 비만세포의 과성장을 억제하여, 궁극적으로 비만치료에 응용될 수 있을 뿐 아니라 콜레스테롤의 과축적으로 일어나는 성인병의 치료에 유용하도록 개발 되었다. 비만의 원인은 지방세포의 과성장에 있다. 이러한 과성장은 뇌에서 명령하여 분비되는 렙틴(Leptin)이라는 호르몬의 결핍으로 일어 나는데, 유전적으로 결핍이 일어난 경우를 제외하고는 과식, 노화로 인한 생체내 물질대사의 약화, 체내 과량 축적된 동물성 콜레스테롤에 의해 분비가 줄어 든다. 새롭게 개발된 일반구조식(I)의 화합물은 장내에서 콜레스테롤과 경쟁함으로써 또는 혈관을 통해 직접 지방세포에 작용하여, 비만세포의 증식을 억제하고 중성지방의 축적을 저해하여, 궁극적으로 체내의 Leptin 단백질의 분비를 촉진시키고 이로 인하여 포만감을 유도 시켜 생체내 물질대사를 원할히 함으로써 노화에서 비롯된 복부비만, 간지방, 동맥경화 등 성인병의 예방과 치료에 유용할 것으로 기대한다.

도 1은 본 발명의 화합물의 농도별 비만세포억제 효과를 나타낸 막대 그래프이며,

도 2는 대조 약물로 베타시토스테롤 및 글루코사민의 비만세포성장억제효과를 나타낸 막대 그래프이며,

도 3은 본 발명의 화합물의 농도별 비만세포억제 효과를 나타낸 꺽은금 그래프이며,

도 4는 대조 약물로 베타시토스테롤 및 글루코사민의 1 : 1의 비율로 혼합하여 사용된 비만세포성장억제효과를 나타낸 꺽은금 그래프이며,

도 5는 본 발명의 화합물, 콜레스테롤 및 본 발명의 화합물과 콜레스테롤의 병용에 의한 효과를 나타낸 꺽은금 그래프이다.

지방세포의 증식억제 및 콜레스테롤 흡수 저해와 관련하여, 구조식(I)의 화합물은 비만세포 (3T3-L1 cell line)를 이용한 실험에서 그 활성이 확인되었다. 3T3-L1 세포는 중성지방을 축적하는 특징을 가지고 있고, 빠른 속도로 성장하여 비만에 원인이 되는 세포이다. 이 세포에 콜레스테롤과 구조식(I)의 물질을 투여하여 비만 세포의 증식억제 및 콜레스테롤에 미치는 영향을 비교 분석함으로써 본 물질의 항콜레스테롤 효과 및 항비만치료에 우수한 효과가 있음을 발견하였다.

따라서 본 발명의 목적은 탁월한 콜레스테롤 저하효과 및 지방세포의 증식억제 효과를 갖는 구조식 (I)의 화합물 및 그 산부가염을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 구조식 (I)의 화합물 및 그 산부가염을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 화합물들은 약학적으로 허용되는 부형제 등과 혼합하여 약학적으로 통상 사용되는 약학적 제제의 제조방법에 따라 제조하여 콜레스테롤 저헤제 및 지방세포의 증식억제 효과를 갖는 항비만 치료에 사용될 수 있다.

그러므로 본 발명의 또 다른 목적은 일반구조식 (I)의 화합물을 유효성분으로 함유하는 약학적 제제를 제공하는 것이다.

본 발명의 화합물(I)과 반응하여 산부가염을 형성할 수 있는 산은 약학적으로 허용될 수 있는 무기, 유기산, 아미노산 또는 설폰산이며, 염산, 브롬산, 황산, 인산, 질산 등과 같은 무기산; 포름산, 아세트산, 프로피온산, 석신산, 시트르산, 말레인산, 말론산 등과 같은 유기산; 세린, 시스테인, 시스틴, 아스파라긴, 글루타민, 리진, 아르기닌, 파이로신, 프롤린 등과 같은 아미노산; 메탄설폰산, 에탄설폰산, 벤젠설폰산, 톨루엔설폰산 등과 같은 설폰산 등이 사용될 수 있다.

본 발명에서 구조식 (I)의 화합물을 유효성분으로 함유하는 약학적제조에 사용될 수 있는 부형제로는 감미제, 결합제, 용해제, 용해보조제, 습윤제, 유화제,등장화제, 흡착제, 붕해제, 산화방지제, 방부제, 활탁제, 충진제, 방향제 등이 사용될 수 있으며, 예를들면, 락토스, 덱스트로스, 슈크로스, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로오스, 글라이신, 실리카, 탈크, 스테아린산, 스테린, 트라가칸트 고무, 메틸셀룰로오스, 소디움카르복실메틸셀루로오스, 아가, 알지닌산, 물, 에탄올, 폴리에틸렌그리콜, 폴리비닐피롤리돈, 염화나트륨, 염화칼륨, 오렌지 엣센스, 딸기엣센스, 바닐라향등을 들 수 있다.

본 발명의 구조식(I)의 화합물은 다음의 반응식에 의하여 제조될 수 있다.

(반응식)

(I)

SJ-2002

이 반응은 통상의 유기용매, 예를들면 테트라하이드로퓨란, 디클로로메탄, 메탄올, 아세토니트릴, 디메틸포름아미드, 디메틸설폭시드 등을 사용함이 바람직하다.

이 반응의 통상의 염기는 수소화나트륨, 수소화칼륨, 수산화나트륨, 수산화카륨, 탄산나트륨, 탄산칼륨, 탄산세시윰, 탄산수소나트륨, 탄산수소카륨, 트리에틸아민, 피리딘, DBU, 암모니아수 등을 사용함이 바람직하다.

반응온도는 상온～120℃이고 반응시간은 1～48시간 동안 진행한다. 팔라듐의 사용량은 5～10당량까지 사용한다. 반응식에서 a의 화합물은 Chemical. Reviews 1993, Vol 93, No. 4, P1511 등에 기술되어 있거나 또는 이와 유사한 방법으로 제조하여 사용될 수 있다.

다음의 실시예로써 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

실시예

1) 아세트산 4-아세톡시-2-아세톡시메틸-5-벤질옥시카르보닐아미노-6-[17-(4-메틸-1,5-다이메틸-헥실)-10,13-다이메틸-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]펜안트렌-3-일옥시]-테트라하이드로-피란-3-일 에스터

아세트산 4-아세톡시-2-아세톡시메틸-5-벤질옥시카르보닐아미노-6-(2,2,2-트리클로로아세티미도일옥시)-테트라하이드로-피란-3-일 에스터(10그램, 0.0171몰)과 베타-시토스테롤(7.6그램 1.0당량)을 에테르 250밀리리터에 녹이고 BF3ㆍOEt2(0.69밀리리터)을 부가한 후, 상온하에서 16시간동안 교반하였다. 반응용매를 제거하고 메틸렌클로라이드에 녹여 에틸 아세테이트:헥산=1:3로 컬럼분리하여 상기화합물을 얻었다.

수율 : 22.7%

융점 :

1H-NMR(500MHz, CDCl3) 0.68-2.28(47H, m), 1.97(3H,s), 2.01(3H,s), 2.07(3H,s), 3.47(2H,m), 3.61(1H,m), 4.10(1H,d), 4.25(1H,m), 4.80(1H,m), 5.02(1H,t), 5.11(2H,m), 5.30(1H,s), 5.35(1H,m), 7.33(5H,s)

실시예

2) 2-[17-(4-에틸-1,5-다이메틸-헥실)-10,13-다이메틸- 2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,-테트라테카하이드로-1H-사이클로펜타[a]펜안트렌-3-일옥실]-4,5-다이하이드로-6-하이드록시메틸-테트라하이드로-피란-3-일-카르밤익산 벤질 에스터

아세트산 4-아세톡시-2-아세톡시메틸-5-벤질옥시카르보닐아미노-6-[17-(4-메틸-1,5-다이메틸-헥실)-10,13-다이메틸-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]펜안트렌-3-일옥시]-테트라하이드로-피란-3-일 에스터 1 (5.0그램, 0.006몰)을 메틸렌클로라이드 30밀리리터에 녹이고 메탄올 80밀리리터를 부가하고 암모니아수용액 25밀리리터를 부가한 후 반응용기을 마개로 막고 물중탕 40℃에서 16시간동안 교반하였다. 반응후 생성된 고체를 여과하고 증류수로 씻은 후 건조시켜 상기화합물을 얻었다.

수율 : 84%

융점 :

1H-NMR(500MHz, CDCl3) 0.68-2.26(47H, m), 3.29(2H,m), 3.42(1H,m), 3.5-3.8(3H,m), 4.58(2H,m), 5.10(2H,s), 5.28(1H,s), 6.10(1H,m), 7.30(5H,s)

실시예

3) 5-아미노-6-[17-(4-에틸-1,5-다이메틸-헥실)-10,13-다이메틸- 2,3,4,7,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]펜안트렌-3-일옥시]-2-하이드로메틸-테트라하이드로-피란-3,4-다이올 (3)

2-[17-(4-에틸-1,5-다이메틸-헥실)-10,13-다이메틸-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16, 17,-테트라테카하이드로-1H-사이클로펜타[a]펜안트렌-3-일옥실]-4,5-다이하이드로-6-하이드록시메틸-테트라하이드로-피란-3-일-카르밤익산 벤질 에스터 2 (2.0그램 0.0028몰)에 메탄올 220밀리리터, 사이클로헥센 110밀리리터, 증류수 20밀리리터를 부가한 후 팔라듐하이드록사이드(5.0그램)를 부가하고 2시간동안 환류교반시킨다. 셀라이트을 깔고 팔라듐을 제거하고 여과액을 농축한 후 전개용매(메틸렌클로라이드:메탄올=8:1)로 녹여 컬럼분리하여 상기화합물을 얻었다.

수율 : 60%

융점 : 215-220℃

계산치 mass (m/z) = 575.4550 측정치 mass =575.4558

1H-NMR(500MHz, CDCl3) 0.68-2.17(47H, m), 2.42(2H,m), 3.11(4H,m), 3.35(2H,m), 3.69(1H,m), 4.26(2H,m), 4.48(1H,s), 4.96(1H,s), 5.14(1H,s), 5.37(1H,s)

상기와 같이 제조한 본 발명의 화합물에 대하여 비만 세포(3T3-L1 cell line) 증식 억제 효과 및 콜레스테롤 흡수저해 효과 실험을 실시하여 그 결과를 다음의 표에 나타내었다.

실험예

가. 실험방법

한국세포주은행(KCLB)으로 부터 구입한 3T3-L1 세포를 1 x 10 4 cells/ cm2 의 농도로 10%FBS를 첨가한 DMEM배지에, 1% antibiotics, 4.5g/L glucose, pH7.3 의 조건으로 37℃, 5% carbon dioxide그리고 95%의 습도가 유지되는 조건으로 24시간 배양한다.

SJ-2002를 각각 최고 농도 7.5mM에서 최저 1mM까지 희석하여 배양된 세포에 투여하여 48시간동안 배양한 후 MTS 분석을 통하여 비만세포의 성장저해를 관찰하였다. MTS 분석은 스팩트로포토메터 490nm에서 흡광도를 측정하였다.

나. 결과

실험예 1

대조 약물로는 베타시토스테롤, 글루코사민을 각각 1.75mM 에서 15mM까지 희석하여 SJ-2002와 비교 분석하였다.

비만 세포성장의 저해와 관련하여, SJ-2002는 4mM의 농도에서 90%이상의 세포성장 억제를 보였다. 대조약물인 베타시토스테롤과 글루코사민은 15mM에서 50%의 성장억제를 보였다. SJ-2002는 비만세포 억제 효과는 대조약물보다 3배 이상 우월한 효과를 보여주었다.

실험예 2

SJ-2002 화합물과 대조약물로 베타시토스테롤과 글루코사민을 1:1의 비율로 혼합하여 최고농도 4mM에서의 동등비교 실험을 하였다.

농도가 증가함에 따라 SJ-2002 화합물은 세포증식을 농도 의존적으로 억제하는 반면 칵테일 처리된 두 대조 약물은 실험 최고 농도인 4mM에서 더 이상 세포증식을 억제하지 못하였다.

실험예 3

콜레스테롤과 SJ-2002 화합물을 다양한 비율로 혼합하여, 지방세포에 두 물질이 미치는 영향을 조사하였다.

표1

농도(mM)	SJ-2002	CHO	C:S(2:1)
0	0.555	0.545	0.575
0.5	0.498	0.539	0.368
1	0.391	0.472	0.380
2	0.207	0.423	0.328
4	0.077	0.376	0.229

CHO : cholesterol

C : cholesterol

S : SJ-2002

콜레스테롤과 SJ-2002 화합물을 1:1의 비율로 혼합한 시료에서의 세포성장 억제효과는 콜레스테롤이 단독으로 투여 된 경우에 비해 4mM의 농도이상에서 26%의 억제효과를 보였으며, 콜레스테롤을 약물과 2:1의 비율로 처리한 경우 18%의 억제효과를 보였으며, 1:2의 비율로 약물의 농도를 증가하여 첨가한 경우, 40%의 억제효과를 보였다.

이상의 실험에서 SJ-2002는 비만세포 성장억제 효과를 확인하였고, 콜레스테롤 혼합 처리하여 비만세포의 세포막에서 콜레스테롤과 경쟁하여 흡수를 차단하는 항 콜레스테롤 기능을 확인하였다.

실험예 4

급성 독성실험(LD50)

가. 실험방법: 리치필드-윌콕슨 방법

6주령된 ICR 마우스(수컷 30±2.0g)을 구입하여 실험전에 실온 23±1oC, 습도 60±5%의 조건에서 고형사료 및 물을 자유롭게 섭취시켰다. 실험동물을 군당 6마리씩 사용하여 약물을 복강내에 투여하여, 14일간 외견상태와 생사여부를 기록하였고, 폐사동물은 부검하여 육안적 병변을 관찰하였다. LD50값을 리치필드-윌콕슨법에 의해 구하였다.

나. 결과

본 발명의 화합물 SJ-2002는 급성독성에 있어서 안전성이 월등하여 투약량의 제한, 독성에 있어서 문제점이 없음을 확인하였다.

표2

실시예 번호	LD50(㎎/㎏)
	p.o
SJ-2002	2,000

본 발명의 화합물은 상기의 실험예 1 내지 3에서 확인되는 바와 같이 탁월한 콜레스테롤 저하 효과 및 지방세포 증식억제효과를 가진다.

Claims (4)

1. 다음의 구조식(I)로 표시되는 화합물 또는 그 약학적으로 허용되는 산 부가염.
2. 구조식 (b)로 표시되는 화합물 또는 그 산 부가염.
3. 구조식 (c)로 표시되는 화합물 또는 그 산 부가염.
4. 다음 구조식 (a)의 화합물과 베타-시토스테롤을 산 존재하에서 반응하여 (b)의 화합물을 얻은 후, 염기의 존재하에서 구조식 (c)로 전환시켜서, 전이금속 팔라듐 하에서 보호기를 제거하여 구조식 (I)의 화합물을 제조하는 방법.