KR100365838B1

KR100365838B1 - 브레비바실러스 보스테렌시스 ｂｃｓ-1 에서 유래한 신규내열성 ｄ-입체특이적 디펩티다아제 및 이를 이용한ｄ-아미노산 함유 펩타이드의 합성 방법

Info

Publication number: KR100365838B1
Application number: KR1020000015174A
Authority: KR
Inventors: 성문희; 이승구; 권석준; 백대헌; 홍승표; 조성호; 정미희
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2000-03-24
Filing date: 2000-03-24
Publication date: 2002-12-26
Also published as: KR20010090321A; WO2001070937A1; AU5710500A

Abstract

본 발명은 신규 고온성 미생물인브레비바실러스 보스테렌시스BCS-1 (Brevibacillus borstelensisBCS-1; KCTC 0673BP) 유래의 신규한 D-입체특이적 디펩티다아제 및 상기 디펩티다아제를 생물촉매로 하여 D-아미노산 함유 펩타이드를 합성하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 다양한 D-펩타이드 유도체 가수분해 효소들을 탐색하는 방법을 개발하여, 고온성 미생물인브레비바실러스 보스테렌시스BCS-1을 선별하고, 상기 미생물에서 유래한 내열성과 높은 pH 안정성 및 높은 기질특이성을 갖는 신규한 D-입체특이적 디펩티다아제 및 그 유전자, 상기 유전자를 클로닝하여 얻어진 재조합 벡터 및 형질전환체와 이를 생물촉매로 하여 산업적으로 유용한 D-아미노산 함유 펩타이드를 경제적이고 환경친화적으로 합성하는 방법에 관한 것이다.

Description

브레비바실러스 보스테렌시스 ＢＣＳ-1에서 유래한 신규 내열성 Ｄ-입체특이적 디펩티다아제 및 이를 이용한 Ｄ-아미노산 함유 펩타이드의 합성 방법{A New thermostable D-stereospecific dipeptidase from Brevibacillus borstelensis BCS-1 and its use as a biocatalyst for the synthesis of peptides containing D-amino acids}

자연계에 존재하는 아미노산의 대부분은 광학활성을 나타내는 알파 탄소를 가지고 있으며 입체특이성을 나타낸다. 자연계에 존재하는 대부분의 단백질은 L-형의 아미노산으로 구성되어 있으나, 미생물의 펩티도글리칸이나 펩티드계 항생물질의 구성성분 및 고등식물의 생리활성물질의 구성성분 등은 D-형의 아미노산으로 구성되어 있다. D-형의 아미노산은 신경전달물질, 백신, 합성감미료, 항생제 및 호르몬 등의 생리활성물질을 합성하는 중간물질로서 식품과 의약분야에서 널리 이용되고 있다. 또한 산업적으로 유용한 항생제, 신경펩타이드, 감미료 등은 D-형의 아미노산 함유 펩타이드이며 특히 L-D-구조의 아미노산으로 구성된 디펩타이드 구조를 포함하고 있다.

D-형의 아미노산 함유 펩타이드를 생산하는 방법에는 화학적 합성방법과 효소적 생산방법이 있다. 특히 산업적으로 유용한 L,D-구조의 디펩타이드는 현재 모두 화학식 1과 같은 다단계의 화학합성방법으로 생산되고 있으나, 반응기질인 아실기 공여체로 아스파르트산(aspartic acid)을 사용하기 때문에 알파 아미노기와 베타 카르복실기를 화학적으로 보호해야 하는 단점이 있다(화학식 1). 따라서 화학적 합성방법에 의하면 상기 보호기를 결합하고 다시 이를 분리하는 과정을 거쳐야 하므로 반응단계가 복잡하여 보다 간단한 합성방법이 요구되어 왔다.

이에 반해 효소가 보유하고있는 특징인 선택적입체특이성을 이용하여 D-입체특이적 디펩타이드를 효소적으로 합성하는 방법은 반응기질인 아실기 공여체와 아실기 수용체로서 상대적으로 가격이 저렴한 라세믹 혼합물(racemic mixture)을 사용할 수 있다는 장점이 있으며, 상기 화학적 합성방법과는 달리 아실기 공여체를 보호할 필요가 없기 때문에 보호기를 결합하고 분리하는 과정을 생략할 수 있다. 현재까지 알려진 효소적 방법으로는 세린 계열의 L-형 프로테아제인 알파-키모트립신(α-chymotrypsin)을 이용하여 속도론적 반응으로 합성하는 방법(West, J. B., Wong, C. H.,J. Org. Chem.,51, 2728-2735, 1986)과 D-아미노 펩티다아제를 이용하여 유기용매 상에서 D-알라닌 올리고머를 합성방법(Kato et al.,Biocatalysis, 3, 207-215, 1989) 등이 있으나, D-입체특이적 디펩티다아제를 이용하여 D-아미노산 함유 펩타이드를 생산하는 방법에 대해서는 아직까지 보고된 바 없다.

이에 D-입체특이적 디펩타이드를 효소적으로 합성하기 위한 연구가 계속되어 왔는 데, 이러한 효소적 합성방법에는 D-아미노산 디펩타이드를 생산하는 생물 전환 공정에 있어 필수적인 요인인 생물촉매의 안정성이 효소 전환 합성 반응의 생산성을 결정하는 가장 중요한 요인으로 알려져 왔다. 일반적으로 고온의 생육환경에 서식하는 고온성 미생물들은 서식지의 고온 극한 환경에 적응하여 열에 대하여 매우 안정한 내열성 효소를 생산하고 이들 내열성 효소는 열에 안정한 특징 이외에도 유기용매에 대한 안정성 및 화학 변성제 등에 대한 안정성도 가지고 있는 것으로 보고되고 있어 효소전환 합성기술에 사용되는 가장 유효한 생물촉매이다.

따라서, 이러한 고온성 미생물에 의해 생산되는 내열성 효소들로부터 D-형의 아미노산이 포함되어있는 D-펩타이드 유도체를 가수분해하는 효소를 탐색하여 D-형의 아미노산이 포함되어있는 디펩타이드를 생산하는 생물촉매로 이용하기 위한 방법이 제시되어 왔는 데, 현재까지 개발된 D-펩타이드 유도체 가수분해효소 탐색방법으로는 D-아미노산 함유 펩타이드를 배지에 넣어 농화배양(enrichment culture)하는 방법과 소수성의 D-펩타이드인 (D-Phe)4를 포함하는 현탁평판배지에서 투명환(halo)으로 식별할 수 있는 방법이 알려져 있다(Asanoet al.,J. Biol. Chem.,271,30256-30262, 1996). 그러나 상기의 방법은 작업이 힘들고 시간이 많이 걸릴 뿐 아니라 (D-Phe)4를 이용하는 경우 화학합성이 어렵고 가격이 비싸며, 다양한 D-펩타이드 유도체 가수분해 효소들을 탐색할 수 없고 오직 D-펩티다아제의탐색만이 가능한 단점이 있다.

이러한 문제점을 극복하기 위해 본 발명자들은 상기 방법들에 비해 작업이 용이하고, 합성이 간편한 재료를 사용하여 다양한 D-펩타이드 유도체 가수분해 효소들을 탐색할 수 있는 방법을 개발하였으며, 이를 이용하여 한국의 토양, 퇴비, 고온 폐수 등의 고온환경으로부터 55℃ 이상의 고온에서 생육하고 열에 안정하며 D-입체특이적 디펩티다아제를 생산하는 58 ℃ 이상에서 생육이 가능한 신규 고온성 미생물 및 이로부터 유래한 60 ℃에서 30분간 열처리에서 효소활성을 80% 이상 보유하는 열 안정성이 매우 높은 D-입체특이적 디펩티다아제와 이를 코딩하는 유전자를 분리하고 이를 생물촉매로 하여 D-아미노산 펩타이드를 합성하는 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 D-형의 아미노산을 포함하는 D-펩타이드 유도체를 가수분해하는 효소를 탐색하는 방법을 개발하여 D-입체특이적 디펩티다아제를 생산하는 신규 균주를 제공하고 그 균학적 특성을 밝히는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 고온에서도 안정하고 높은 기질특이성을 갖는 새로운 D-입체특이적 디펩티다아제 및 이를 코딩하는 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 디펩티다아제 유전자를 클로닝한 재조합 발현 벡터를 이용하여 대장균 균주를 형질 전환시키고, 상기 형질 전환된 균주를 배양하여 배양액으로부터 신규 내열성 디펩티다아제를 분리하여 D-형의 아미노산을 함유하는 D-펩타이드를 효소적으로 합성하는 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 D-아미노산 아실라아제, D-입체특이적 디펩티다아제, D-아미노산 아미다아제를 탐색할 수 있는, Z-D-Ala-D-Ala-OBzl을 포함하는 현탁평판배지(Turbid plate)를 나타낸 것이고,

a: 신규내열성 D-입체특이적 디펩티다아제를 생산하는 신규 BCS-1 균주

b: 음성 대조군(negative control strain)으로 사용된 대장균

c: 음성 대조군(negative control strain)으로 사용된

바시러스 서틸리스(Bacillus subtilis)

d: BCS-1 균주의 조효소액 (Cell-free extract)

e: 단백질 분해효소인 써모라이신 (Thermolysin)

도 2는브레비바실러스 보스테렌시스BCS-1의 조효소액(Cell-free extrct)을 이용한 Z-D-Ala-D-Ala-OBzl의 가수분해의 결과 그래프이고,

1: Z-D-Ala-D-AlaOBzl의 피크

2:브레비바실러스 보스테렌시스BCS-1이 보유하는 효소에 의해 가수분해된 효소반응 산물중 Z-D-AlaOH의 피크

3:브레비바실러스 보스테렌시스BCS-1이 보유하는 효소에의해 가수분해된 효소반응 산물중 BzlOH의 피크

도 3a는브레비바실러스 보스테렌시스BCS-1의 16S rDNA 염기서열과 기존에 보고된 미생물의 16S rDNA 염기서열을 비교한 것이고,

도 3b는 본 발명의 신규 미생물브레비바실러스 보스테렌시스BCS-1의 16S rRNA 염기서열 분석에 의한 계통분류학상의 위치를 나타낸 것이고,

도 3c는 본 발명의 신규 미생물브레비바실러스 보스테렌시스BCS-1와 기존에 알려진바실러스 보스테렌시스와 최적 성장 온도를 비교한 것이고,

도 4a는브레비바실러스 보스테렌시스BCS-1가 생산하는 D-입체특이적 디펩티다아제 유전자의 클로닝을 위한 재조합 플라스미드의 제조과정을 도시한 것이고,

도 4b는 재조합 미생물에서 D-입체특이적 디펩티다아제의 대량발현을 위한 벡터의 제조과정을 도시한 것이고,

DPT : D-입체특이적 디펩티다아제

DAAT: D-아미노산 아미노트랜스퍼라아제

도 5는브레비바실러스 보스테렌시스BCS-1의 D-입체특이적 디펩티다아제 아미노산 서열과 다른 디펩티다아제의 아미노산 서열을 비교하여 나타낸 것이고,

도 6은 온도에 따른 D-입체특이적 디펩티다아제의 활성을 나타낸 그래프이고,

도 7은 D-입체특이적 디펩티다아제의 열 안정성을 나타낸 그래프이고,

도 8은 pH에 따른 D-입체특이적 디펩티다아제의 활성을 나타낸 그래프이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Z-D-Ala-D-AlaOBzl을 포함하는 현탁평판배지(Turbid plate)를 이용하여 D-펩타이드 유도체를 가수분해하는 효소들을 생산하는 균주를 신속하고 간편하게 탐색할 수 있는 새로운 방법을 제공한다.

본 발명자들은 비교적 화학 합성하기 손쉬운 Z-D-Ala-D-AlaOBzl을 합성하고, 이를 함유한 현탁평판배지(turbid plate)에서 투명환(halo)을 형성하는지를 관찰하여 식별할 수 있는 방법을 개발하였다.

구체적으로, Z-D-AlaOH와 D-AlaOBzl.TosOH를 재료로 하여 흰색 분말형태의 Z-D-Ala-D-AlaOBzl를 합성하고, 이를 메탄올에 녹여 LB 배지에 넣고 교반한 후, 이 혼합배지를 페트리디쉬에 분주하여 굳게 하면 현탁평판배지가 형성된다. 이렇게 형성된 배지에 한국 토양에서 분리한 천여 종의 고온성 미생물을 도말한 후, 55 ℃이상의 고온에서 배양하면 D-펩타이드 유도체 가수분해 효소를 생산하는 콜로니 주위로 투명환이 형성된다. 이 방법을 이용하면 다양한 D-펩타이드 유도체 가수분해 효소들(D-아미노 아실라아제, D-입체특이적 디펩티다아제, D-아미노산 아미다아제)을 보유한 미생물들을 신속하고 간편하게 탐색할 수 있다.

또한 본 발명은 상기의 탐색방법을 이용하여 분리한 신규 미생물을 제공한다.

상기 탐색 방법에 의해 선발된 균주의 미생물학적 특성을 살펴본 결과 MY 한천 평판 배지에서 배양하였을 때, 유백색의 콜로니를 형성하였으며, 콜로니의 가장자리가 톱니모양을 가지는 균의 외형을 나타내었다. 또한 액체 배양시 필라멘트(filament) 형태의 균체가 관찰되었고, 액체 배지 내에서 장시간 정치 배양하였을 때 균체의 준말단부위에서 타원형의 내생 포자를 형성하여 전형적인바실러스속의 특성을 나타내었으며, 대수 성장기의 균은 현미경하에서 운동성이 활발한 특징을 나타내었다. 분리균을 혐기적인 조건하에서 배양하였을 경우 균체의 성장이 육안으로는 관찰되지 않았으나, 현미경하에서는 미약한 균 성장이 이루어졌으며 막대모양의 균체의 성장이 확인되었다.

반면, 균의 성장에 필요한 탄소원 이용에서는 대부분의바실러스속 균주가 나타내는 탄소원의 이용과는 달리 만노스(mannose)와 프룩토오스(fructose)에 대해서만 55℃에서 48시간 배양했을 경우 미약한 이용성을 보였을 뿐, 대다수의 탄소원에 대해서는 음성반응을 나타내었다. 보다 정확한 동정을 위하여, 이 분리균의 16S rDNA 염기배열을 결정한 후 기존에 보고된 다른 미생물의 염기배열과 상동성을 비교하였으며, 그 결과브레비바실러스 보스테렌시스(Brevibacillus borstelensis)의 16S rDNA 염기배열과 매우 높은 상동성을 나타내었다(도 3b참조).

상기와 같은 생리학적 및 화학 분류학적 특성의 분석 결과와 함께, 기존에 알려진바실러스 보스테렌시스(Shida et al.,Int. J. Syst. Bacteriol.45: 93-100, 1995)의 최적성장온도는 30℃이고, 본 발명의 미생물 균주브레비바실러스 보스테렌시스는 최적성장온도 45℃, 최고온도는 58℃로서 미생물 생육온도에서의 현저한 차이가 있어(도 3c참조), 본 발명의 미생물 균주를브레비바실러스 보스테렌시스의 신규 균주로 동정하고,브레비바실러스 보스테렌시스BCS-1(Brevibacillus borstelensisBCS-1)로 명명하였다.

토양에서 분리된 상기의 신규 고온성 미생물브레비바실러스 보스테렌시스BCS-1은 생명공학연구소내 유전자은행에 1999년 10월 21일자로 기탁되었다(수탁번호: KCTC 0673BP).

또한 본 발명은 상기 신규 고온성 미생물브레비바실러스 보스테렌시스BCS-1이 생산하는 신규 내열성 D-입체특이적 디펩티다아제를 제공한다.

브레비바실러스 보스테렌시스BCS-1을 LB 배지를 사용하여 55 ℃에서 배양한 균주의 파쇄물을 이용하여, Z-D-Ala-D-AlaOBzlOH를 포함한 트리스 완충액으로 가수분해 반응을 진행시킨 결과, 반응산물로 Z-D-AlaOH, D-AlaOH 및 BzlOH 등이 생성됨을 관찰함으로써 상기 미생물은 내열성 D-입체특이적 디펩티다아제를 함유하고 있음을 확인하였다(도 2참조).

본 발명의 D-입체특이적 디펩티다아제는 65℃에서 최적의 활성을 보였으며, 여러 온도에서 30분 동안 항온 처리한 후 효소활성을 조사한 결과, 약 55℃까지의 열 안정성을 보였다 (도 7참조). 또한 pH 5.5 - 10 구간에서 최적 pH 를 조사한 결과 바람직하게는 pH 7 내지 10에서, 더욱 바람직하게는 pH 8.5에서 최적의 활성을 보였다.

상기 효소의 디펩타이드에 대한 입체특이성에 있어서는 알라닐알라닌 디펩타이드의 4가지 입체이성질체(diastereomers)를 기질로 할 경우, 가수분해하는 결합의 아미노 쪽으로 L-아미노산을, 카르복실 쪽으로 D-아미노산을 입체특이적으로 인식하는 기질특이성을 보이는데, 특히 L-D 구조의 디펩타이드를 보다 선택적으로 가수분해하였다(표 3참조). 또한 디펩타이드의 N-말단과 C-말단이 화학적으로 보호된 기질 등 그 외 다양한 디펩타이드의 가수분해한 결과로 판단컨대, 상기 효소의 활성자리가 비교적 느슨한(flexible) 구조로 되어 있음을 알 수 있다(표 4참조). 이러한 기질특이성을 가진 본 발명의 신규 내열성 D-입체특이적 디펩티다아제가 촉매하는 가수분해반응의 역반응을 이용하면 다양한 D-아미노산 함유 펩타이드 합성 및 특히 L-D 구조의 디펩타이드를 합성하는데 유용한 생물촉매로서 활용될 수 있다.

또한 본 발명은 상기 디펩티다아제를 코딩하는 유전자를 제공한다.

상기 유전자는서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 가지며, 이로부터 유추되는 아미노산 서열(서열번호 4)을 현재까지 연구된 다른 디펩티다아제의 아미노산 서열과 비교한 결과, 엑시네토박터(A. calcoaceticus),인간(human), 쥐(mouse), 쥐(rat), 토끼(rabbit), 돼지(pig), 양(sheep) 유래의 디펩티다아제와 모두 25% 이하의 낮은 상동성을 나타내므로, 본 발명의 D-입체특이적 디펩티다아제는 유전자배열상에 있어서도 종래 알려진 바 없는 신규한 효소임을 확인하였다(도 5참조).

또한, 본 발명은 상기 신규 내열성 D-입체특이적 디펩티다아제를 대량 발현하는 재조합 대장균을 이용한 D-아미노산 함유 펩타이드 또는 펩타이드 감미료 등의 생산방법을 제공한다.

본 발명의 D-입체특이적 디펩티다아제의 입체 선택적 특성을 이용하면 하기 반응식과 같은 1단계 합성반응으로 디펩타이드가 합성된다.

한편, 화학적인 방법으로 펩타이드 감미료를 합성할 경우, 앞서 언급한 바와 같이 반응기질인 아실 공여체로 아스파르트산(aspartic acid)을 사용하기 때문에 α-아미노기와 β-카르복실기를 화학적으로 보호해야만 하는 단점이 있으나, 본 발명의 D-입체특이적 디펩티다아제를 촉매로 이용한 생물 전환 공정에 따르면 그러한 보호기의 착탈과정이 생략된 하기 반응식 3과 같은 1단계 반응기작으로 반응을 수행할 수 있다.

상기 원리에 근거하여 D-아미노산 함유 펩타이드를 합성하기 위하여 본 발명자들은 먼저 고온성 미생물로부터 클로닝한 재조합 D-입체특이적 펩티다아제를 코딩하는 유전자를 중합효소 연쇄반응(PCR)을 이용하여 증폭한 후, 벡터 pTrc99A에 삽입하여 고발현 벡터 pDPT1을 제조하고(도 4b참조), 이를 대장균 XL1-Blue에 도입시켜 D-입체특이적 디펩티다아제를 원균보다 약 4000배 증가된 비활성으로 발현시키는 재조합 대장균을 제조하였다. 이렇게 제조된 재조합 대장균으로부터 대량 발현된 D-입체특이적 펩티다아제를 순수 정제한 후, 이를 D-아미노산 함유 펩타이드 합성을 위한 생물촉매로 이용하여 반응을 수행한 결과 본 발명의 D-입체특이적 펩티다아제가 산업적으로 유용하게 이용될 수 있음을 확인하였다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> D-펩타이드 유도체 가수분해 효소를 생산하는 브레비바실러스 보스테렌시스 BCS-1 균주의 동정.

(단계 1) Z-D-Ala-D-AlaOBzl의 화학적 합성

6 mmol Z-D-AlaOH와 6 mmol D-AlaOBzl·TosOH을 디메틸포름아마이드에 용해시키고, 6.6 mmol의 1-[3-(디메틸아미노)프로필]-3-에틸카보다이이미드 하이드로클로라이드1-[3-(Dimethylamino)propyl]-3-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC 와 1-하이드록시벤조트리아졸 하이드레이트(1-Hydroxybenzotriazole hydrate, HOBT)를 각각 첨가한 후, 16 시간 동안 상온에서 교반시킨 후 수분을 첨가하여, 생성된 Z-D-Ala-D-AlaOBzl을 침전시키고 필터로 여과하여 약 1.8 g의 Z-D-Ala-D-AlaOBzl을 흰색분말형태로 얻었다.

(단계 2) D-입체특이적 디펩티다아제를 보유한 고온성 미생물의 탐색.

상기에서 제공한 Z-D-Ala-D-AlaOBzl을 10㎎/㎖의 농도로 메탄올에 녹인 후, 60 ㎖의 용액을 멸균된 2%의 한천이 함유된 LB배지 1ℓ에 넣고 교반한 후 20 ㎖의 혼합배지를 페트리디쉬(petri dish)에 분주하면, 배지가 굳으면서 현탁평판배지가 형성된다. 형성된 현탁평판배지에 한국 토양에서 분리한 1000여 종의 고온성 미생물을 도말한 후 55oC에서 12 시간 이상 항온 처리하여 콜로니(colony)주위에 투명환(halo) 을 형성하는 균주를 선발하였고 이를 BCS-1로 명명하였다(도 1).

도 1은 그 결과를 나타낸 것으로 콜로니a는 신규내열성 D-입체특이적 디펩티다아제를 생산하는 신규 BCS-1 균주의 콜로니이고, 콜로니d는 상기 균주로부터 얻은 조효소액에 대한 것이다.도 1에서 보이는 바와 같이a와d콜로니 주위에투명환이 형성되어 있음을 확인하고, 상기 미생물이 D-입체특이적 펩티다아제를 생산함을 알 수 있었다.

(단계 3) 고온균 BCS-1의 조효소액(Cell-free extract)을 이용한 Z-D-Ala-D-AlaOBzl 의 가수분해.

상기에서 분리한 BCS-1 균주를 LB배지를 사용하여 50oC에서 배양한 후 원심 분리하여 얻은 균체를 0.5 mM 페닐메틸설포닐플로라이드(PMSF)를 함유하는 50 mM 트리스완충용액(Tris-HCl, pH 8.0)에 현탁시킨 후, 초음파 파쇄기로 세포를 파쇄하여 12,000 rpm에서 원심분리하고 상층액을 조효소액으로 얻었다.

5 μ㏖ Z-D-Ala-D-AlaOBzl가 포함된 50 mM 트리스 완충용액(Tris-HCl, pH 8.0) 1 ㎖에 상기의 BCS-1 균주로부터 추출한 조효소액을 100 ㎕를 가하여, 55oC에서 가수분해반응을 진행시킨 후, 반응용액 100 ㎕를 취해 HPLC로 분석한 결과, Z-D-AlaOH, D-AlaOH 및 BzlOH 등이 가수분해 산물로 생성되었음을 확인하였으며, 이로써 상기 미생물이 D-입체특이적 디펩티다아제를 함유하고 있음을 확인할 수 있었다(도 2).

(단계 4) 신규 브레비바실러스 보스테렌시스 BCS-1의 동정

상기와 같이 분리된 고온균 BCS-1 균주의 생리적 및 생화학적 특성은 하기표 1에 나타낸 바와 같다.

브레비바실러스 보스테렌시스BCS-1의 생리적 및 생화학적 특성

생장온도	30-58 ℃
세포모양	막대모양
그램 염색	양성
운동성	양성
내생포자	있음
보게스-프로스카우어(Voges-Proskauer)	양성
니트레이트 환원력	양성
글루코스로부터 산 생성	음성
만니톨로부터 산 생성	음성
아라비노스로부터 산 생성	음성
베타-갈락토시다아제 생성	음성
트립토생판 디아미다아제의 생산	양성
카탈라아제 생산	양성
젤라티나아제 생산	양성
pH 5.7에서의 생장	약함
7% 식염내 생장	음성
혐기적 조건에서의 생장	양성

상기와 같은 균학적 특성을 갖는 본 발명의 고온균의 보다 정확한 동정을 위해 16S rDNA의 유전자 분석을 수행하였다.

16S rDNA의 유전자 분석을 위해 N-말단 프라이머(서열번호 1)와 C-말단 프라이머(서열번호 2)를 사용하여 16S rDNA 유전자를 PCR로 증폭하고, 증폭된 유전자를 플라스미드 pT7Blue에 클로닝한 후 염기서열을 결정하였다. 상기 고온균 BCS-1의 16S rDNA 염기서열을 BLAST 검색하여 기존에 보고된 여러 미생물의 16S rDNA 염기서열과 상동성을 비교한 결과,브레비바실러스 보스테렌시스와 거의 일치함을 확인하였다.도 3은 본 발명에 따라 선별, 분리된 고온성 미생물의 16S rDNA의 염기서열과 기존에 보고된 여러 미생물의 16S rDNA 염기서열과 비교하여 나타낸 것이다.

상기와 같은 생리학적 및 화학 분류학적 특성의 분석 결과와 함께, 기존에알려진바실러스 보스테렌시스(Shida et al.,Int. J. Syst. Bacteriol.45: 93-100, 1995)의 최적성장온도는 30℃이고, 본 발명의 미생물 균주브레비바실러스 보스테렌시스는 최적성장온도 45℃, 최고온도는 58℃로서 미생물 생육온도에서 현저한 차이가 있어 (도 3C참조), 이상의 결과로 본 발명의 분리 균주를브레비바실러스 보스테렌시스의 신규 균주로 동정하고,브레비바실러스 보스테렌시스BCS-1로 명명하였다. 상기 균주는 생명공학연구소내 유전자은행에 1999년 10월 21일자로 기탁하였다(수탁번호: KCTC 0673BP).

<실시예 2> 내열성 D-입체특이적 디펩티다아제를 코딩하는 유전자의 염기서열 결정.

고온성 미생물브레비바실러스 보스테렌시스BCS-1로부터 총염색체 (chromosomal DNA)를 분리하고 이 총염색체 DNA를 제한효소 Sau3AI으로 부분 가수분해한 후에 0.7% 아가로스 젤에서 전기영동법으로 분리하여 약 3-10 kb 크기의 DNA 밴드를 잘라내어 진클린II 키트(GENE CLEAN II KIT)로 분리 정제하였다. 벡터 pUC118을 제한효소 BamHI으로 가수분해하고 5'-말단의 인산을 제거한 다음, 상기 분리된 DNA 단편과 혼합하고 16 ℃에서 16 시간동안 T4 DNA 리가제(ligase)의 존재 하에서 반응시켜 재조합 플라스미드 pBCS8을 제조하였고(도 4a), 이를 일렉트로포레이션 법(electroporation)에 의해 D-글루타메이트 요구주인 대장균 WM335내로 형질 전환시켰다. 상기의 재조합 플라스미드로 형질 전환된 대장균들은 암피실린 및 0.2 mM의 D-알라닐-D-글루타메이트(D-alanyl-D-glutamate)를 함유한 D-입체특이적디펩티다아제-선택분리 평판배지에서 유전적 상보 방법(genetic complementation)으로 분리하였다. 이후 상기 배지에서 D-입체특이적 디펩티다아제를 생산하는 것으로 확인된 대장균 WM335 균주의 활성정량을 위해,실시예 1에 기재한 D-입체특이적 디펩티다아제의 활성정량법을 사용하여 대장균 조효소액의 D-입체특이적 디펩티다아제 활성을 측정하였다.

이와 같은 선별과정을 통하여 1종의 D-입체특이적 디펩티다아제 활성균주를 얻었으며, 상기 재조합 대장균에 함유된 재조합 플라스미드로부터 삽입된 DNA 단편을 분리하여 디펩티다아제 유전자의 DNA 염기서열을 분석하였다(서열번호 3).도 5에서 보듯이, 분석된 상기의 염기서열로부터 추정되는 아미노산 서열(서열번호 4)을 지금까지 알려진 다른 디펩티다아제의 아미노산 서열과 비교한 결과, 그 모두에 대해 25% 이하의 상동성을 보였으며 이로부터 본 발명의 D-입체특이적 디펩티다아제는 유전자 배열상으로 현재까지 알려진 바 없는 신규 효소임을 확인할 수 있었다.

<실시예 3> 내열성 D-입체특이적 디펩티다아제의 대량발현 및 활성측정

상기실시예 2의 D-입체특이적 펩티다아제를 코딩하는 유전자의 염기서열에 근거하여 제조한 N-말단 프라이머(서열번호 4)와 C-말단 프라이머(서열번호 5)를 사용하여브레비바실러스 보스테렌시스BCS-1의 펩티다아제 유전자를 PCR 법으로 증폭한 후, 벡터 pTrc99A에 삽입하여 고발현 벡터 pDPT1을 제작하였다(도 4b). 상기 발현벡터로 대장균 XL1-Blue를 형질 전환시킨 후 발현되는 D-입체특이적 디펩티다아제의 비활성(u/mg)을 조사하였다.

D-입체특이적 디펩티다아제의 활성 측정방법은 하기와 같이 수행하였다. 즉 5 mM L-알라닐-D-알라닌이 포함된 50 mM 트리스 완충용액(Tris-HCl, pH8.0)에 D-입체특이적 디펩티다아제를 포함하는 조효소액을 넣고 55oC에서 5 분 동안 반응시킨 후, 반응액 0.1 ㎖를 0.75 ㎖의 카드뮴-닌히드린(Cd-Ninhydrin) 용액(Doi et al.,Anal. Biochem.,118, 173-184, 1981)에 넣어 85oC에서 5 분 동안 발색시켜 505 nm에서 흡광도를 측정하였다(Wu Z. et al.,Biochemistry, 34,2455-63, 1995). 효소 활성 1 유니트(unit)는 1 분 동안 1 μ㏖의 L-알라닐-D-알라닌을 분해하는데 필요한 효소량으로 정의하였다.

그 결과 재조합 대장균 조효소액의 비활성이 원균보다 약 4000배 증가함을 확인하였다.

<실시예 4> 내열성 D-입체특이적 디펩티다아제의 순수분리 정제 및 물리화학적 특성 확인.

(단계 1) D-입체특이적 디펩티다아제의 분리 정제

재조합 대장균에서 대량 발현된 D-입체특이적 디펩티다아제의 순수정제 확인을 위해실시예 3에 기재된 D-입체특이적 디펩티다아제의 활성정량법을 사용하였는데, 우선 D-입체특이적 디펩티다아제를 재조합 대장균에서 대량 발현시킨 후실시예 1과 같은 방법으로 재조합 대장균의 조효소액(Cell-free extract)을 제조하였다. 상기 조효소액을 55oC에서 20 분간 열처리(Heat treatment)한 후, 음이온 교환수지(Hitrap Q)에 흡착시키고, 1 M NaCl이 포함된 20 mM 트리스 완충용액(Tris-HCl, pH 8.0)을 이용하여 용출시켰다. 용출시킨 활성 분액물을 한외여과막으로 농축시키고 이를 1 M 암모늄설페이트(NH4SO4)가 포함된 50 mM 포타슘 포스페이트 완충용액(KH2PO4/K2HPO4, pH 7.2)에 넣어 소수성수지(Phenyl Sepharose)에 흡착시킨 후 50 mM 포타슘 포스페이트 완충용액을 이용하여 용출시켰다. 용출된 활성분액물을 다시 농축시키고 20 mM 트리스 완충용액(Tris-HCl, pH7.5)에 넣어 음이온 교환수지(Mono Q)에 흡착시킨 후, 1M NaCl이 포함된 20 mM 트리스 완충용액 (Tris-HCl, pH7.5)을 이용하여 용출시킨 결과, 상기 효소를 단일 단백질로 순수 분리 정제하였다. 각 단계별로 분리 정제된 D-입체특이적 펩타이드 수율 및 L-Ala-D-Ala에 대한 활성은 하기표 2와 같다.

D-입체특이적 디펩티다아제의 정제단계별 활성 및 수율

단계(Step)	총단백질 (mg)	총활성 (unit)	비활성 (U/mg)	수율(%)
조효소액(Cell-free extract)열처리(Heat treatment)음이온 교환수지(HiTrap Q)소수성수지(Phenyl Sepharose)음이온 교환수지(Mono Q)	255.2123.550.933.318.2	190931459413407108636256	74.8118.2263.4326.2343.7	10076.470.256.932.8

(단계 2) D-입체특이적 디펩티다아제의 생화학적 특성 조사.

순수 분리한 D-입체특이적 디펩티다아제의 생화학적 특성을 조사하기 위해실시예 3에 기재된 D-입체특이적 디펩티다아제의 활성정량법을 사용하였다. 다양한 온도에서 효소활성을 조사한 결과, 약 65oC에서 최적의 활성을 보였으며(도 6), D-입체특이적 디펩티다아제의 열 안정성을 조사하기 위하여 여러 온도에서 30 분씩 항온 처리한 후 각각에서 효소활성을 조사한 결과 약 55oC까지 안정한 특성을 보였다(도 7). 최적 pH 조사를 위해 비스-트리스(bis-Tris), 트리스(Tris), 체스(CHES) 완충용액을 사용하여 pH 5.5-10 구간에서 활성을 측정한 결과, 바람직하게는 pH 7 내지 10에서, 더욱 바람직하게는 약 pH 8.5 에서 최적의 활성을 보였다(도 8).

(단계 3) D-입체특이적 디펩티다아제의 기질특이성 조사.

상기 순수 분리된 효소의 디펩타이드 기질에 대한 입체특이성을 조사하기 위해 알라닐알라닌(Ala-Ala) 디펩타이드의 4가지 입체이성질체들(diastereomers)을 이용하여 기질특이성을 조사하였다. 그 결과, 상기 효소는 아미노 쪽에 L-아미노산을, 카르복실 쪽에 D-아미노산을 입체 선택적(Stereoselectivity)으로 인식하는 특성을 보이며, L-D 구조의 디펩타이드를 보다 선택적으로 가수분해하는 기질특이성을 보였다(표 3).

D-입체특이적 디펩티다아제의 속도 상수(Kinetic parameters)

기질(Substrate)	k_cat(s^-1)	K_M(mM)	k_cat/K_M(s^-1mM^-1)
D-Ala-D-AlaL-Ala-D-AlaL-Ala-L-AlaD-Ala-L-Ala	271.6760.7225.4n*	313.718n*	8.8205.612.5n*

n*=반응이 일어나지 않음(No reaction).

상기의 디펩타이드 외에도표 4에 나타난 바와 같이 다양한 디펩타이드 및 N-말단과 C-말단이 화학적으로 보호된 디펩타이드 기질인 Z-L-Asp-D-AlaOMe에 대해서도 가수분해가 일어난 것으로 보아 이 효소의 활성부위가 비교적 느슨한 구조로 되어 있음을 알 수 있었다. 상기 결과를 종합하여 볼 때, 본 발명의 효소는 L,D-구조에 가장 큰 입체특이성을 보이며, D,D-구조, D,L-구조의 디펩타이드에 대해서는 활성을 거의 보이지 않음을 알 수 있었다.

D-입체특이적 디펩티다아제의 기질특이성

기질	상대활성 (%)
L-Ala-D-AlaD-Ala-L-AlaD-Ala-D-AlaL-Ala-L-AlaD-Ala-D-GluL-Asp-D-AlaD-Ala-L-AspL-Asp-L-AspD-Ala-D-Ala-D-AlaD-Ala-D-Ala-D-Ala-D-AlaL-Asp-D-Ala-OMeD-AlaNH₂L-AlaNH₂	10002.98.31.737.801.1003.200

<실시예 5> 내열성 D-입체특이적 디펩티다아제를 이용한 D-아미노산 함유 펩타이드의 효소적 합성.

(5-1) Z-L-Asp-D-AlaOBzl의 효소적 합성.

D-아미노산 함유 펩타이드 생산을 위한 모델 반응계로 화학적으로 보호된 Z-L-아스파트르산(Z-L-Asp)을 아실기 공여체로 D-알라닌 벤질에스터(D-AlaOBzl)를 아실기 수용체로 하여, 본 발명의 D-입체특이적 디펩티다아제를 생물촉매로 사용하여 단 한번의 효소반응으로 합성반응을 수행하였다.

Z-L-Asp-D-AlaOBzl

D-입체특이적 디펩티다아제

반응조건으로서 5 mM Z-L-AspOH, 10 mM D-AlaOBzl, D-입체특이적 디펩티다아제(L-Ala-D-Ala 1 ㎖당 약 300 unit의 비활성)를 넣고 동결 건조한 후, 수분으로 포화시킨 메틸아세테이트(methylacetate), 에틸아세테이트(ethylacetate), 뷰틸아세테이트(butyl acetate), 디에틸에테르(diethyl ether), 헥산(hexane) 등의 여러 유기용매에서 효소반응을 수행하였다. 그 결과 메틸아세테이트, 뷰틸아세테이트, 디에틸에테르에서 15-30% 수율로 Z-L-Asp-D-AlaOBzl가 효과적으로 합성됨을 확인하였다(표 5).

D-입체특이적 디펩티다아제를 이용한 Z-L-Asp-D-AlaOBzl의 합성

기질	수율(%)
메틸아세테이트에틸아세테이트뷰틸아세테이트디에틸에테르헥산	16.113.220.626.713.6

(5-2) L-Asp-D-AlaOMe의 효소적 합성

아실기 공여체의 화학적 보호 없이 L,D-구조의 디펩타이드를 간단하게 합성하기 위한 모델 반응계로 L-아스파르트산을 아실기 공여체로, D-알라닌 메틸에스터(D-AlaOMe)를 아실기 수용체로 사용하여 본 발명의 D-입체특이적 디펩티다아제를 생물촉매로 한 효소합성반응을 수행하였다.

L-Asp-D-AlaOMe

D-입체특이적 디펩티다아제

반응조건으로서 5 mM L-AspOH, 10 mM D-AlaOMe, D-입체특이적 디펩티다아제를 넣고 동결 건조한 후, 에탄올, 테트라히드로퓨란(tetrahydrofuran), 디메틸포름아마이드(dimethyl formamide), 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide), 에틸아세테이트(ethylacetate), 디에틸에테르(diethyl ether) 등의 여러 유기용매계와 이외에 물, 글리세롤, 메탄올 등을 소량첨가해서 공융시킨 계(Lopez-Fandino et al.,Biotechnol. Bioeng.,43,1024-1030, 1994)에서 효소합성반응을 수행하였다. 그 결과, 유기용매계나 공융계 모두에서 합성반응이 일어났음이 확인되었으며, L-Asp-D-AlaOMe외에 다른 부반응 생성물은 합성되지 않았다.

상기에 언급한 방법으로 실시예에 예시된 모델 반응 뿐 아니라 산업적으로 유용한 D-아미노산 함유 항생물질, 신경활성 펩타이드 감미료 등 L,D-구조의 펩타이드를 합성할 수 있다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에서 제공하는 Z-D-Ala-D-AlaOBzl 함유 현탁평판배지를 이용한 새로운 탐색법으로 다양한 D-펩타이드 유도체 가수분해 효소를 생산하는 균주를 손쉽고 빠르게 선별할 수 있으며, 이를 이용하여 선별한 신규 고온성브레비바실러스 보스테렌시스BCS-1(Brevibacillus borstelensisBCS-1)이 생산하는 신규 내열성 D-입체특이적 디펩티다아제의 열, 유기용매, pH 및 화학 변성제 등에 대한 안정성과 기질에 대한 입체특이성을 이용하면, 산업적으로 유용한 D-아미노산 함유 펩타이드에 포함되는 L,D-구조의 펩타이드를 저렴한 라세믹 혼합물을 반응 기질로 하여서도 부반응물의 생성 없이 일단계 효소반응으로 합성할 수 있으므로, 환경친화적이고 경제적으로 항생물질, 신경활성 펩타이드, 펩타이드 감미료 등 L,D-구조 펩타이드를 효소를 생물촉매로 사용하여 높은수율로 일단계 효소반응으로 합성할 수 있다.

Claims

신규 고온성 미생물브레비바실러스 보스테렌시스BCS-1(수탁번호 KCTC 0673BP).
서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 신규 내열성 D-입체특이적 디펩티다아제.
삭제
제 2항에 있어서, 디펩티다아제는 30분간 열처리 하였을 때, 약 55℃까지의 열 안정성 및 약 pH 7 내지 10 범위의 pH 안정성을 갖는 것을 특징으로 하는 D-입체특이적 디펩티다아제.
제 2항에 있어서, 디펩티다아제는 아미노 말단 쪽에 L-아미노산을, 카르복실말단 쪽에 D-아미노산을 갖는 디펩타이드에 대해 특이성을 갖는 것을 특징으로 하는 D-아미노산 디펩티다아제.
제 2항의 D-입체특이적 디펩티다아제를 코딩하는 유전자로서,서열번호 3으로 기재되는 것을 특징으로 하는 유전자.
제 6항의 D-입체특이적 디펩티다아제 유전자를 포함하며, 도 4B에 기재된 개열지도를 가지는 것을 특징으로 하는 발현벡터 pDPT1.
제 7항의 발현벡터로 형질 전환된 재조합 대장균.
제 1항의 미생물 균주 또는 상기 미생물이 생산하는 제 2항의 D-입체특이적 디펩티다아제를 이용하여 D-아미노산 함유 펩타이드, 펩타이드 감미료 또는 L,D-구조의 디펩타이드를 효소적으로 합성하여 생산하는 방법.
Z-D-Ala-D-AlaOBzl 함유 평판배지를 이용한 D-펩타이드 유도체 가수분해 효소를 생산하는 미생물 균주의 탐색 방법.