JPS6211092A

JPS6211092A - 新規アミノペプチダ−ゼ及びその製造方法

Info

Publication number: JPS6211092A
Application number: JP14766685A
Authority: JP
Inventors: Etsuo Minagawa; 皆川　悦雄; Shiyuuichi Uenokawa; 修一上野川; Kunio Yamauchi; 山内　邦男
Original assignee: HOKKAIDO NOUKIYOU NYUGYO KK
Current assignee: HOKKAIDO NOUKIYOU NYUGYO KK
Priority date: 1985-07-06
Filing date: 1985-07-06
Publication date: 1987-01-20
Also published as: JPH0262237B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕この発明は耐熱性の新規アミノペプチダーゼ及びその精
製方法に関するものである。

〔発明が解決しようとする問題点〕

アミノペプチダーゼはチーズをはじめとした食品の製造
において、呈味アミノ酸の生成。

苦味ペプチドの分解などのプロセスにおいて重要な役割
を果している。このようなプロセスにおいてバイオリア
クターとしてアミノペプチダーゼを利用するには、熱な
どの環境要因に対して安定であることが必要であるが、
公知のアミノペプチダーゼは熱的安定性が不十分である
。

〔問題点を解決するための手段〕

そこでこの出願の発明者は熱的安定性が優れ１食品の製
造プロセスに有利に用いることができる新規アミノペプ
チダーゼを検索すべく研究を重ねた結果、高度好熱性細
菌、サーマス・アクアテイカス（Ｔｈｅｒｏ＋ｕｓ　ａ
ｑｕａｔ、１ｃｕｓ）ＹＴ−１の菌体から耐熱性に優れ
るアミノペプチダーゼを精製することを見い出し、この
知見に基づいてこの発明を完成した。

この発明は、第１に、サーマス・アクアテイカス（丁ｈ
ｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ）　Ｙ　Ｔ　−１の菌
体から取り出され、下記の性質を有する新規アミノペプ
チダーゼに関する。

（ａ）この酵素の活性の至適ｐ）ｌは８．５〜９．０で
ある。

（ｂ）この酵素の活性の至適温度は７５℃〜８０℃であ
る。

（ｃ）この酵素の熱安定性は、Ａｌｇ−２−ＮＡを基質
として、８０℃で酵素濃度２０　ｔｔ　ｇ／ｍ１．　ｐ
Ｈ７，２では、５時間後で約９０％、２０時間後で約６
０％の残存活性を示す。

（ｄ）この酵素は、精製工程中の粗酵素では更に高い熱
安定性を有する。

（ｅ）この酵素は、金属キレート剤によって完全に失活
し、ＳＲ阻害剤によってかなり阻害される。

（ｆ）この酵素は、　ＥＤＴＡで処理した後、Ｃ０２＋
により賦活する。

（ｇ）この酵素の分子量はゲル濾過法で約１０万８千で
あり、ＳＤＳ電気泳動法で約４万８千のサブユニットか
らなる二量体酵素である。

（ｈ）この酵素は広い基質特異性を示す。

この発明は、第２に、サーマス・アクアテイカス（Ｔｈ
ｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ）　Ｙ　Ｔ　−１を超
音波処理で粉砕抽出し、その後、８０％飽和硫安による
塩析、ＤＥＡＥセファセル及びハイドロキシアパタイト
クロマトグラフィ、ゲルシ濾過。

ディスク電気泳動により上述の（ａ）〜（ｈ）の性質を
有する新規アミノペプチダーゼを精製する方法に関する
。

〔実施例〕

次にこの発明を実施例により詳しく説明する。

Ａ、最初に高度好熱性細菌、サーマス・アクアテイカス
（丁ｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔ、１ｃｕｓ）　Ｙ　Ｔ　
−１の菌体より新規アミノペプチダーゼをｍ’ｓする過
程について説明する。

（１）菌の培養及び保存：サーマス・アクアテイカスＹ
Ｔ−１の培養は、グルコース、ポリペプトン、イースト
エキストラクトの混合培地ＰＨ７，６を用いて７０〜８
０°Ｃで行い、定常期の菌体を凍結保存した。

（２）菌体抽出粗酵素の調製；培養後、凍結保存しであ
る菌体を０．０５Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７，０に懸濁（１
０％Ｗ／Ｖ）　した後、超音波処理を行った。その後、
遠心分前（３５，０ＯＯＸｇ、２０分）で得られた上清
液を、同上＃１！衝液で透析し、粗酵素液とした。

（３）硫安塩析：上記粗酵素液に硫安を８０％飽和とな
るように加え、３０分放置後、遠心分離（１０，０ＯＯ
Ｘ　ｇ、３０分）を行い、沈澱を０．０１Ｍリン酸緩衝
液ｐＨ７，０に懸濁し、同緩衝液で透析を行った。

（４）ＤＥＡＥセファセルクロマトグラフィによる分画
：硫安沈澱画分を、０．０１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７，０
で平衡化したＤＥＡＥセファセルカラム（２０Ｘ５００
ｍｎ）に吸着させた。０．１〜０．６ＭのＮａＣＱ濃度
勾配でＩＱの同緩衝液で溶出した。その結果を第１図に
示す。

なお第１図において、溶出速度５０ｍ　Ｑ　／Ｈ１１０
！ＩＩＱ１画分、反応条件は０．０５Ｍトリス塩酸緩衝
液ｐＨ９，０を使用し、８０℃、３０分である。第１図
より、ＡＱａ−２−ＮＡとＶａｎ−Ｇ　Ｑ　ｙ−ｃ　Ｑ
　Ｖと°の活性画分は一致していることが分かる。Ｎｏ
、３３〜４６を活性画分とした。

（５）ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィによる
分画：（４）の画分の１７２を同上緩衝液で透析した後
に、カラム（１５Ｘ　１５０ｍ）に吸着させ、０．０１
〜０．４Ｍのリン酸緩衝液ｐＨ７，０，４００＋ｏ　１
２で溶出した結果を第２図に示す。なお第２図において
、溶出速度１０＋ｎ　Ｑ　／Ｈ１５ｍＱ／画分、反応条
件は第１図と同一、Ｎｏ、　２８〜３９を活性画分とし
た。

（６）セファデックス、Ｇ１５０ゲルシ濾過による分画
：（５）の活性画分を濃縮後、０．０５Ｍリン酸緩衝液
ｐＨ７，０で平衡化を行った。試料をカラム（ψ２０　
Ｘ　５５０　ｕｎ　）に載せ、先の緩衝液で溶出した。

その結果を第３図に示す。なお第３図において、溶出速
度１０ｍ　Ｑ　／Ｈ１５ＩＩＱ画分１反応条画分１エ応
と同一であり、Ｎｏ、１９〜２５を活性画分とした。

（７）ＤＥＡＥセファセルによる再クロマトグラフィー
：セファデックス、Ｇ１５０における活性画分を０．０
１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７，０で透析後、カラム（１５Ｘ
　１２０！１１０）に吸着させ、同上緩衝液で０．１Ｍ
　〜０．４ＭのＮａＣＱ　４００ｍ　Ｑで溶出させた。

その結果を第４図に示す。

な・お第４図において、溶出速度２０ｎ＋　Ｑ　／Ｈ１
５＋ａＱ／画分、反応条件は第１図と同一であり１画分
Ｎｏ　、　３６〜３９を集め、活性画分とした。

（８）ディスク電気泳動による分画及び精製の確認：（
７）の活性画分を濃縮した。７．５％ポリアクリルアミ
ドゲル（ｐＨ８，０）を用い、１本のゲル当り、たん白
質２００μｇを載せ、２　ｎ＋Ａ／　１本で約２時間、
泳動を行い、１本は染色し、他は２１ｍごとにスライス
し、０．０５Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７，０で抽出を行った
。

染色したゲルは第５図のバンドを示し、第５図の↓の部
分と酵素活性が一致した。この活性画分を集め、さらに
泳動を行い、酵素の精製を確認した。第６図は精製した
酵素の活性を示すにの画分を酵素標品とした。酵素の精
製過程を第７図の図表に示す。

新規アミノペプチダーゼは粗酵素液と比較して比活性に
おいてＡＱａ−２−ＮＡでは約６００倍、ＶａＱ　−Ｇ
Ｑｙ−ＧＥｌｙでは約１５０倍に精製され、収率は各々
、　３４．５％、７．９％であった。

Ｂ、こうして精製された新規アミノペプチダーゼの性質
を調べた実験結果について次に説明する。

（１）第８図は酵素活性と温度との関係について示して
いる。この酵素は高い温度で活性があり、至適活性温度
は７５℃〜８０℃である。反応条件は、Ａｌａ　−２−
ＮＡ及びＶａｌ　−Ｇｌｙ　−Ｇｌｙを基質としてｐＨ
９，０で３０分行なった。

（２）第９図は、酵素標品及び粗酵素または精製酵素に
対する温度の影響結果を示している。酵素標品を８０℃
の温度で保持した場合、酵素濃度２０μｇ／ｍｌ　ｐＨ
７，２では、２０時間で約６０％、４０時間でも約２０
％の残存活性を有する。また粗酵素では、先と同一の条
件で２０時間約７０％、４０時間でも約５０％の残存活
性を示す。非常に熱に安定である。反応条件は、Ｌｅｕ
　−４−ＮＡを基質として７０℃で３０分行った。

（３）第１０図は酵素活性とｐＨとの関係について示し
ている。酵素の至適活性とｐＨは８．５〜９．０である
。反応条件はＡｌａ−２−ＮＡ及びＶａｌ　−Ｇｌｙ　
−Ｇｌｙを基質として７０℃で３０分行った。

（４）第１１図、第１２図及び第１３図は酵素活性に対
する金属イオン及び試薬の影響結果を示す図表である。

この酵素は、ＥＤＴＡで処理した後に透析で除去した場
合、ＣＯ２＋によって賦活化する。金属キレート剤によ
って完全に失活し、ＳＨ阻害剤によってかなり阻害され
る。また有機溶媒、各種変性剤によっても阻害される１
反応条件は、Ａｌａ−２−ＮＡ及びＶａｌ−ＧｌｙＧｌ
ｙを基質としてｐＨ８，５，７０℃で３０分行った。

（５）第１４図及び第１５図は酵素の分子量を示す図表
で、ある。この酵素はゲル口過法では、分子量は約１０
万８千である。ＳＤＳ電気泳動法では１分子量は約４万
８千である。この事より、約４万８千のサブユニットか
らなる二量体酵素である。

（６）第１６図は、酵素の基質特異性を調べた実験の結
果を示す図表である。非常に広い基質特異性を持つ酵素
である６反応条件は、　ｐＨ８，５で７０℃３０分であ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図はＤＥＡＥセファセルクロマトグラフィによる硫
安塩析沈澱フラクションのクロマトグラフィの結果を示
す図、第２図はＤＥＡＥセファセルクロマトグラフィに
よって得られた酵素フラクションのハイドロキシアパタ
イトクロマトグラフィの結果を示す図、第３図はセファ
デックス、Ｇ−１５０ゲルシ濾過の結果を示す図、第４
図はＤＥＡＥセファセルによる再クロマトグラフィの結
果を示す図、第５図はディスク電気泳動後染色したゲル
のバンドを示す図、第６図はゲルスライスの加水分解活
性画分とディスク電気泳動パターンが一致する事を示す
図、第７図は新規アミノ−ペプチダーゼの精製過程を表
わす図表、第８図はこの酵素の活性と温度の関係を示す
図、第９図は酵素活性への加熱の影響を示す図、第１０
図は酵素活性とｐＨの関係を示す図、第１１図は酵素活
性への金属イオンの影響を示す図表、第１２図及び第１
３図は酵素活性への種々の試薬の影響を示す図表、第１
４図は、酵素の分子量を示す図、第１５図は、酵素のサ
ブユニットの分子量を示す図、第１６図は種々の合成ペ
プチドに対するこの酵素の相対活性を示す図表である。特許出願人　北海道農協乳業株式会社第２図第３図ｔｏ　　　　　２０　　　　３０　　　　４０　　Ｆ、
Ｎｏ。第４図第５図 ↓ 第６図 ■　　　　　　　　Ｑ１度　（’Ｃ）暗闇　（ｈｒ）

Claims

【特許請求の範囲】

（１）サーマス・アクアテイカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａ
ｑｕａｔｉｃｕｓ）ＹＴ−１の菌体から取り出され、下
記の性質を有する新規アミノペプチダーゼ。（ａ）この酵素の活性の至適ｐＨは８．５〜９．０であ
る。（ｂ）この酵素の活性の至適温度は７５℃〜８０℃であ
る。（ｃ）この酵素の熱安定性は、Ａｌａ−２−ＮＡを基質
として、８０℃で酵素濃度２０μｇ／ｍｌ、ｐＨ７．２
では、５時間後で約９０％、２０時間後で約６０％の残
存活性を示す。（ｄ）この酵素は、精製工程中の粗酵素では更に高い熱
安定性を有する。（ｅ）この酵素は、金属キレート剤によつて完全に失活
し、ＳＨ阻害剤によつてかなり阻害される。（ｆ）この酵素は、ＥＤＴＡで処理した後、Ｃｏ＾２に
より賦活する。（ｇ）この酵素の分子量はゲル濾過法で約１０万８千で
あり、ＳＤＳ電気泳動法で約４万８千のサブユニットか
らなる二量体酵素である。（ｈ）この酵素は広い基質特異性を示す。
（２）サーマス・アクアテイカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａ
ｑｕａｔｉｃｕｓ）ＹＴ−１を超音波処理で破砕抽出し
、その後、８０％飽和硫安による塩析、ＤＥＡＥセフア
セル及びハイドロキシアパタイトクロマトグラフィ、ゲ
ル濾過、ディスク電気泳動により下記の性質を有する新
規アミノペプチダーゼを精製する方法。（ａ）この酵素の活性の至適ｐＨは８．５〜９．０であ
る。（ｂ）この酵素の活性の至適温度は７５℃〜８０℃であ
る。（ｃ）この酵素の熱安定性は、Ａｌａ−２−ＮＡを基質
として、８０℃で酵素濃度２０μｇ／ｍｌ、ｐＨ７．２
では、５時間後で約９０％、２０時間後で約６０％の残
存活性を示す。（ｄ）この酵素は、精製工程中の粗酵素では更に高い熱
安定性を有する。（ｅ）この酵素は、金属キレート剤によつて完全に失活
し、ＳＨ阻害剤によつてかなり阻害される。（ｆ）この酵素は、ＥＤＴＡで処理した後、Ｃｏ＾２＾
＋により賦活する。（ｇ）この酵素の分子量はゲル濾過法で約１０万８千で
あり、ＳＤＳ電気泳動法で約４万８千のサブユニットか
らなる二量体酵素である（ｈ）この酵素は広い基質特異性を示す。