KR0138907B1 - 합성 펩티드 - Google Patents

Abstract

내용없음.

Description

[발명의 명칭]

합성 펩티드

[발명의 상세한 설명]

본 발명은 인간 및 기타 동물의 뇌하수체의 기능에 영향을 미치는 펩티드들에 관한 것이다. 특히 본 발명은 뇌하수체에 의한 성장 호르몬의 방출을 촉진하는 펩티드들에 관한 것이다.

생리학자들은 각 뇌하수체 호르몬의 분비를 자극하거나 저해하는 시상하부를 생성하는 특정 물질로 시상하부가 뇌하수체 선부의 분비기능을 조절하는 것으로 오랫동안 인식하여 왔다. 시상하부 저해인자는 1972년에 성장 호르몬(GH)의 분비를 저해하는 소마토스타틴의 형태로 동정되었다. 1982년에는 인간 췌장 방출인자들이 인간 췌장 종양의 추출물로부터 분리, 정제, 동정, 합성 및 시험되어, 이것이 뇌하수체에 대한 GH의 방출을 촉진하는 것으로 밝혀졌다. 두 개의 하수체선 인자들 모두는 총합성(total synthesis)에 의해 재생되어졌으며 천연 구조물의 유사체도 합성되었다. 인간 시상하부 GH 방출 인자도 정확히 동일한 구조를 가지며, 따라서 이하에서는 hGRF로 사용한다.

이제 배양된 뇌하수체 세포들로부터 GH를 방출하고 체내에서의 효소 분해에 대한 저항성을 증가시키고 본질적으로 매우 증진된 효력을 갖는 합성 폴리펩티드들이 합성되고 시험되었다. 이러한 유리한 성질들은 안정성이 증가된 고리 형태를 갖는 펩티드들로부터 초래되는 것으로 믿어진다. 이 펩티드들은 바람직하게는 25와 29 위치의 잔기들 사이에 고리화 결합을 가진다. 바람직하게는 이 결합은 D-Cys 또는 L-Cys일 수 있는 한쌍의 시스테인 잔기 사이의 디설파이드 결합이다. 또는, 고리화 결합은 이들 두 잔기들 상의 아미노 측쇄와 카르복실 측쇄 사이의 아미드 결합일 수 있다. Ala 또는 β-Ala는 바람직하게는 15-위치에 치환되고 Nle는 바람직하게는 27-위치에 존재한다. Lys, Arg, Ser, Glu 또는 Asp는 8-위치에 치환될 수 있다. 이 펩티드들은 1-위치에 다음의 잔기들 중 하나를 가질 수 있으며 : Tyr, D-Tyr, Met, D-Met, Phe, D-Phe, pCl-Phe, Leu, His 및 D-His, 이 잔기는 임의로 알파-탄소 또는 알파-아미노기에 메틸 치환제를 가질 수 있다. 또한 알파-아미노기는 삭제될 수 있거나(데스아미노); 또는 알파-아미노기는 바람직하게는 아세틸(Ac) 또는 포르밀(For)에 의해 아실화될 수 있다. 펩티드들은 임의로 2-위치에 D-Ala, NMA 또는 D-NMA 및/또는 3-위치에 D-Asp 및/또는 12-위치에 Arg 및/또는 10-위치에 Phe 또는 D-Tyr을 가질 수 있다. 이들은 또한 27-위치에 Met 또는 Nle 대신 D-Met 또는 Nva 또는 다른 잔기들을 가질 수 있고/있거나 28-위치에 Asn을 가질 수 있다. 13- 및 22-위치의 잔기들은 Leu, Ile, Ala 및 Val 중 어느 것일 수 있다.

본 발명에 따른 제약학적 조성물은 제약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 액체 또는 고체 담체에 분산된, 그 길이가 약 29-44의 잔기들 사이를 갖는 유사체 또는 이들의 무독성염을 함유한다. 그러한 제약학적 조성물은 치료 및 진단용으로 투여하기 위해 인간 및 가축의 임상의약에 사용될 수 있다. 또한 이들은 물고기, 뱀장어 등과 같은 냉혈동물의 수경재배 및 가금류를 포함하는 온혈동물의 성장을 촉진시키기 위해 사용될 수 있다.

펩티드들을 정의하기 위해 사용된 명명법은 쉬로더 및 룹케(Schroder ＆ Lubke)의 펩티드, 아카데믹프레스(1965)에 특정된 바와 같은데, N-말단의 아미노기를 왼편에, C-말단의 카르복실기를 오른편에 나타내는 통상적인 표시에 따른다. 천연 아미노산은 Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Tyr, Lys, Arg, Asp, Asn, Glu, Gln, Cys, Met, Phe, Tyr, Pro, Trp 및 His로 구성되는, 단백질에서 발견되는 자연 발생의 일반적인 아미노산을 의미한다. Nle는 노르로이신을 의미하며, Nva는 노르발린을 의미한다. 아미노산 잔기가 이성체 형태를 가질 경우, 특별한 언급이 없는 한 표시되는 아미노산은 L-형태의 것이다. 더 적은 경우로는 D- 또는 L-이성체 중 어느 하나가 포함될 수 있음을 나타내기 위하여 사용되기도 한다. 즉, cys는 D-Cys 또는 L-Cys를 의미하며; orn은 D- 또는 L-오르니틴을 의미하고; dab는 D- 또는 L-α,δ 디아미노부티르산을 의미하고; dap는 D- 또는 L-α,δ-디아미노프로피온산을 의미하고; abu는 α-아미노부티르산을 의미한다. D-NMA는 알파-아미노기가 메틸로 치환된 알라닌의 D-이성체를 나타내며 : NMT는 마찬가지로 N-메틸 티로신을 나타내며 N^aMeTyr으로도 표시된다.

본 발명은 일반적으로 하기 서열(I)을 갖는 합성 펩티드를 제공한다 :

(B)R₁-R₂-R₃-Ala-Ile-Phe-Thr-R₈-Ser-R₁₀-Arg-R₁₂-R₁₃-Leu-R₁₅-Gln-Leu-R₁₈-Ala-Ar-g-R₂₁-R₂₂-Leu-R₂₄

Gln-Gln-Gly-Glu-R₃₄-Asn-Gln-Glu-R₃₈-R₃₉-R₄₀-Arg-R₄₂-R₄₃-R₄₄, 이 식에서 R₁은 Tyr, D-Tyr, Met, D-Met, Phe, D-phe, pCl-Phe, Leu, His 또는 D-His; B는 H, C^aMe, N^aMe, 데스아미노, Ac 또는 For; R₂는 Ala, D-Ala, NMA 또는 D-NMA; R₃는 Asp 또는 D-Asp; R₈은 Ser, Asn, Lys, Arg, Asp 또는 Gln; R₁₀은 Tyr, D-Tyr 또는 Phe; R₁₂는 Arg 또는 Lys; R₁₃은 Ile, Val, Leu 또는 Ala; R₁₅는 Gly, Ala 또는 β-Ala; R₁₈은 Ser 또는 Tyr; R₂₁은 Lys, D-Lys, Arg 또는 D-Arg; R₂₂는 Leu, Ile, Ala 또는 Val; R₂₄는 Gln 또는 His; R₂₅는 Cys, abu, Asp, Glu, orn, Lys, dab 또는 dap; R₂₇은 Met, D-Met, Ala, Nle, Ile, Leu, Nva 또는 Val; R₂₈은 Asn 또는 Ser; R₂₉는 cys, abu, asp, glu, orn, lys, dab 또는 dap; R₃₄는 Ser 또는 Arg; R₃₈은 Arg 또는 Gln; R₃₉는 Gly 또는 Arg; R₄₀은 Ala 또는 Ser; R₄₂는 Phe 또는 Ala; R₄₃은 Asn 또는 Arg; R₄₄는 천연 아미노산, 예를 들면 Leu 또는 Val이고; 단 R₄₄에서 시작되어 R₂₉까지 뻗어있는 잔기의 임의의 C-말단 서열은 삭제될 수 있다. R₂₅가 cys 또는 abu일 때, R₂₉는 cys 또는 abu이고; R₂₅가 asp 또는 glu일 때 R₂₉는 orn, lys, dab 또는 dap이고, 그 반대일 수도 있다. C-말단에서의 아미노산 잔기의 카르복실 부분은 다음의 라디칼들 중 어느 것일 수 있다 : -COOR, -CRO, -CONHNHR, -CON(R)(R') 또는 -CH₂OR, 여기서 R 및 R'는 저급알킬, 플루오로 저급 알킬 또는 수소이고; 메틸, 에틸 및 프로필이 바람직한 저급 알킬기이다.

N-말단으로부터 잔기-29까지 뻗어있는 단편들은 뇌하수체에 의한 GH 방출에 대하여 양호한 생물학적 효능을 가지며, 아미드 또는 치환된 아미드인 C-말단을 갖는 29 또는 32 길이의 잔기의 생물학적 활성 단편들이 가장 바람직하다. 특히 바람직한 펩티드들의 한 군은 하기 식을 갖는 것이다 :

(B)R₁-R₂-R₃-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-R₁₃-Leu-R₁₅-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-R₂₁-R₂₂-Leu-His-R₂₅-Ile-R₂₇-Asn-R₂₉-NH₂, 이 식에서 R₁은 Tyr, D-Tyr, Met, D-Met, Phe, D-Phe, pCl-Phe, Leu, His 또는 D-His; B는 H, C^aMe, N^aMe, 데스아미노, Ac 또는 For; R₂는 Ala, D-Ala, NMA 또는 D-NMA; R₃는 Asp 또는 D-Asp; R₁₃은 Ile, Val, Leu 또는 Ala; R₁₅는 Gly, Ala 또는 β-Ala; R₂₁은 Lys, D-Lys, Arg 또는 D-Arg; R₂₂는 Leu, Ile, Ala 또는 Val; R₂₅는 cys, abu, asp, glu, orn, lys, dab 또는 dap; R₂₇은 Met, D-Met, Ala, Nle, Ile, Leu, Nva 또는 Val; R₂₉는 cys, abu, asp, glu, orn, lys, dab 또는 dap이다. 펩티드가 40 이상의 잔기를 가질 경우, C-말단 부분에 대하여 특별히 바람직한 것은 없다.

이 펩티드들은 배타적인 고체상 기술, 부분적 고체상 기술, 단편 축합 또는 종래의 용액 커플링과 같은 적절한 방법에 의해 합성된다. 최근 개발된 제조합 DNA 기술을 사용하여 단지 천연 아미노산 잔기만을 함유하는 유사체의 부분을 제조할 수 있으며, 그 다음 이는 짧은 N-말단 또는 C-말단 펩티드에 연결될 수 있다. 예를 들면, 배타적 고체상 합성 기술은 스튜어트 ＆ 영, 후리맨 ＆ Co. 샌프란시스코, 1969년의 교재 고체상 펩티드 합성에 기술되어 있으며, 베일 일행의 1978년 8월 8일자 특허된 미합중국 특허 제4,105,603호의 개시내용에 의해 예시된다. 종래의 용액 합성은 서독, 스투트가르트, 게오르그 티메 벌락의 이.운쉬(편집자)(1974)에 의한 논문 유기화학적 방법 : 펩티드 합성(Methoden der Organischen Chemie(Houben-Weyl)에 상세히 기술되어 있다. 합성의 단편 축합법은 미합중국 특허 제3,972,859호(1976. 8. 3자)에 예시된다. 다른 이용가능한 합성법은 미합중국 특허 제3,843,067호(1074. 10. 15) 및 미합중국 특허 제3,862,925호(1975. 1. 28)에 예시되어 있다.

여러가지 아미노산의 불안정한 측쇄기들을 적당한 보호기, 즉 보호기가 궁극적으로 제거될 때까지 화학반응을 일으키는 것을 방지하는 적당한 보호기로 보호하는 것이 그러한 화학적 합성에 있어서 일반적이다. 또한, 보통 아미노산 또는 단편상의 알파-아미노기를 그것이 카르복실기에서 반응하는 동안 보호하고, 그후 알파-아미노 보호기를 선택적으로 제거하여 그 위치에서 계획적으로 반응이 일어나게 하는 것이 일반적이다. 따라서, 합성의 일 단계로서 펩티드 사슬내의 바람직한 서열에 위치하는 아미노산 잔기 각각을 함유하고, 측쇄 보호기들이 적절한 잔기들에 연결되어 있는 중간체 화합물이 제조되는 것이 일반적이다.

따라서, 본 발명의 펩티드를 제조하기 위해 그러한 화학 합성이 사용될 경우 하기 식(Ⅱ)를 갖는 중간체들이 생산된다 :

(X¹)(B)R₁(X 또는 X²)-R₂-R₃(X³)-Ala-Ile-Phe-Thr(X⁴)-R₈(X⁸)-Ser(X⁴)-R₁₀(X²)-Arg(X⁶)-R₁₂(X⁶또는 X⁷)-R₁₃-Leu-R₁₅-Gln(X⁵)-Leu-R₁₈(X²)-Ala-Arg(X⁶)-R₂₁(X⁶또는 X⁷)-R₂₂-Leu-R₂₄(X 또는 X⁵)-R₂₅(X⁸)-Ile-R₂₇-R₂₈(X⁴또는 X⁵)-R₂₉(X⁸)-Gln(X⁵)-Gln(X⁵)-Gly-Glu(X³)-R₃₄(X⁴또는 X⁶)-Asn(X₅)-Gln(X⁵)-Glu(X³)-R₃₈(X⁶또는 X⁵)-R₃₉(X⁶)-R₄₀(X²)-Arg(X⁶)-R₄₂-R₄₃(X⁵또는 X⁶)-R₄₄(X⁹)-X¹⁰

X¹은 수소 또는 알파-아미노 보호기이다. X¹의 알파-아미노 보호기들은 폴리펩티드의 단계적 합성 분야에서 유용한 것으로 공지된 것들이다. X¹으로서 사용될 수 있는 알파-아미노 보호기들의 군 중에서 (1) 방향족 우레탄형 보호기, 예컨대 플루오레닐메틸옥시카르보닐(Fmoc), 벤질옥시카르보닐(z), 및 치환된 z, 예컨대 p-클로로벤질옥시카르보닐, p-니트로벤질옥시카르보닐, p-브로모벤질옥시카르보닐 및 p-메톡시벤질옥시카르보닐; (2) 지방족 우레탄 보호기, 예컨대 t-부틸옥시카르보닐(BOC), 디이소프로필메틸옥시카르보닐, 이소프로필옥시카르보닐, 에톡시카르보닐, 알릴옥시카르보닐; 및 (3) 시클로알킬 우레탄형 보호기, 예를 들면 시클로펜틸옥시카르보닐, 아다만틸옥시카르보닐, 및 시클로헥실옥시카르보닐이 있다. N^aMe-치환된 잔기가 1-위치에 사용될 때에도 바람직한 아미노 보호기는 BOC이며; 물론 B가 데스아미노 또는 N^aMe일 때 X¹은 H이다.

X는 수소 또는 His의 이미다졸 질소의 보호기, 예를 들면 Tos이다.

X²는 Tyr의 페놀성 히드록시기의 적당한 보호기, 예를 들면 테트라히드로피라닐, 3차-부틸, 트리틸, Bzl, CBZ, 4Br-CBZ 및 2, 6-디클로로벤질(DCB)일 수 있다. 바람직한 보호기는 2, 6-디클로로벤질이다. X²는 수소일 수 있으며 이는 그 위치의 아미노산 잔기 상에 측쇄 보호기가 없음을 의미한다.

X³는 수소 또는 Asp 또는 Glu의 카르복시기에 대한 적절한 에스테르-형성 보호기, 예를 들면, 벤질(OBzl), 2, 6-디클로로벤질, 메틸 및 에틸이다.

X⁴는 Thr 또는 Ser의 히드록시기의 적절한 보호기, 예를 들면 아세틸, 벤조일, 3차-부틸, 트리틸, 테트라히드로피라닐, Bzl, 2, 6-디클로로벤질 및 CBZ일 수 있다. 바람직한 보호기는 Bzl이다. X⁴는 수소일 수 있으며 이는 히드록시기 상에 보호기가 없음을 의미한다.

X⁵는 수소 또는 Asn 또는 Gln의 측쇄 아미도기의 적절한 보호기이다. 바람직하게는 크산틸(Xan)이다.

X⁶는 Arg의 구아니도기에 대한 적절한 보호기, 예를 들면 니트로, Tos, CBZ, 아다만틸옥시카르보닐 및 BOC이며, 또는 수소이다.

X⁷은 수소 또는 Lys의 측쇄 아미노기의 적절한 보호기이다. 적절한 측쇄 아미노 보호기의 예는 2-클로로벤질옥시카르보닐(2-Cl-Z), Tos, t-아밀옥시카르보닐 및 BOC가 있다.

X⁸은 Cys의 설프히드릴기의 보호기, 바람직하게는 p-메톡시벤질(MeOBzl), p-메틸벤질, 아세트아미도메틸, 트리틸 또는 Bzl이며; 또는 보호기 X7을 동시에 제거하지 않으면서 제거될 수 있는 아미노 측쇄의 적절한 보호기, 예를 들면 Fmoc와 같은 염기성-불안정기이며; 또는 보호기 X³를 동시에 제거하지 않으면서 제거될 수 있는 카르복시 측쇄의 적절한 불안정 보호기, 예를 들면 OFm(플루오레닐메틸에스테르)과 같은 염기성-불안정기이며; 또는 고리 형태가 카르바 또는 디카르바 결합으로부터 형성될 경우 25- 및 29- 위치에서의 잔기들 사이의 직접적인 결합이다.

X⁹는 수소 또는 일반적으로 상기한 바와 같은 적절한 측쇄 보호기이다.

Met는 임의로 산소에 의해 보호될 수 있으나 바람직하게는 보호되지 않고 남아 있는 것이다.

합성 중 알파-아미노기를 탈보호하는 동안 제거되지 않는 하나가 선택된다는 것을 제외하고는 측쇄 아미노 보호기의 선택은 중요하지 않다. 그러나 몇몇 아미노산, 예를 들면 His에 있어서, 커플링이 완료된 후 일반적으로 보호는 필요하지 않으며 보호기들은 동일할 것이다.

X¹⁰은 에스테르-형성기 X³와 같은 C-말단 카르복시기의 적절한 보호기이거나 또는 고체 수지 지지체에 결합하기 위한 고체상 합성시 사용되는 정착 결합(anchoring bond)이거나 또는 des-X¹⁰으로서, 이 경우 C-말단의 잔기는 상기 Y로 정의된 카르복시 부분을 가진다. 고체 수지 지지체가 사용될 경우, 이는 -O-CH₂-수지 지지체, -NH-벤즈히드릴아민(BHA) 수지 지지체 또는 -NH-파라메틸벤즈히드릴아민(MBHA) 수지 지지체와 같은 당 기술분야에 공지된 것들 중 하나일 수 있다. 비치환된 아미드가 요구될 경우, BHA 또는 MBHA 수지를 사용하는 것이 바람직한데 그 이유는 절단되어 직접적으로 아미드로 되기 때문이다. N-메틸 아미드가 요구되는 경우, 이는 N-메틸 BHA 수지로부터 생성될 수 있다. 다른 치환된 아미드들이 요구된다면 미합중국 특허 제4,569,967호의 기술 내용이 이용될 수 있고 또는 C-말단에 유리산 이외의 다른 기들이 요구된다면 호우벤-웨일(Houben-Weyl)의 교재에 주어진 바와 같은 종래의 방법들을 사용하여 펩티드를 합성하는 것이 바람직하다.

예를 들면 최종 식에서 B가 아세틸일 때, 임의의 아미노산에 대한 X1 보호기가 1-위치에서 이용되므로, 이를 이용할 수 있다; 그러나 결과적으로 라세미화가 일어나 그러한 보호는 덜 바람직하다. 바람직하게는 반응은(측쇄기가 보호되는 동안 알파-아미노기를 탈보호한 후) 예를 들면 디시클로헥실 카르보디이미드(DCC) 존재하에서 아세트산, 바람직하게는 아세트산 무수물과 반응시킴으로써, 또는 당업계에 공지된 다른 적당한 반응에 의해 수지상에서 펩티드로 수행된다.

중간체의 식에서, X-기들중 적어도 하나는 보호기이거나, X¹⁰은 수지 지지체를 포함한다. 따라서, 본 발명은 또한 관심있는 펩티드의 제조방법을 제공하는데, 이는 하기 단계들을 수행하는 것으로 이루어진다; (a) 적어도 하나의 보호기 및 식(Ⅱ)를 가지는 펩티드를 형성하고(여기서, X, X¹, X², X³, X⁴, X⁵, X⁶, X⁷, X⁸및 X⁹가 각각 수소 또는 보호기이고, X¹⁰은 보호기 또는 수지 지지체에 대한 정착 결합이거나 des-X¹⁰이고, 이 경우에 C-말단에서의 잔기는 바람직한 카르복시 부분을 가질 수 있다.); (b) 식(Ⅱ)의 펩티드로부터 보호기 또는 보호기들 또는 정착 결합을 분리시키고(splitting off); (c) 이미 존재하지 않는다면 단계(b) 전이나 후에 R₂₅와 R₂₉사이에 고리화 결합을 형성하고; (d) 필요하다면, 형성된 펩티드를 그의 무독성 염으로 전환시키는 단계.

펩티드 합성에 사용되는 특정 측쇄 보호기를 선택함에 있어서, 다음의 일반적인 규칙을 따른다 : (a) 보호기는 바람직하게는 보호특성을 가지며 커플링 조건하에서 분리되지 않는다. (b) 보호기는 시약에 안전해야 하며, Xan은 예외이나 합성의 각 단계에서 알파-아미노 보호기를 제거하기 위해 선택되는 반응 조건하에서 안정한 것이 바람직하다 : (c) 측쇄 보호기는 펩티드 사슬을 바람직하지 않게 변경하지 않는 반응 조건하에서 바람직한 아미노산 서열을 함유하는 합성의 완료시 제거될 수 있어야 한다.

펩티드들이 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조되지 않을 경우, 이들은 매리필드, J. Am. Chem. Soc., 85, p 2149(1963)에 일반적으로 기술된 바와 같은 고체상 합성을 이용하여 제조되는 것이 바람직한데, 이 기술분야에 공지된 다른 균등한 화학 합성이 상기한 바와 같이 사용될 수도 있다. 고체상 합성은 보호된 알파-아미노산을 적절한 수지에 커플링시킴으로써 펩티드의 C-말단으로부터 시작된다. 그러한 출발 물질은 알파-아미노-보호된 아미노산을 에스테르 결합에 의해 클로로메틸화된 수지 또는 히드록시메틸 수지에 부착시킴으로써, 또는 아미드 결합에 의해 BHA 수지 또는 NBHA 수지에 부착시킴으로써 제조될 수 있다. 히드록시메틸 수지의 제조는 보단스키 일행의 Chem. Ind. (런던) 38, 1597-98(1966)에 기술되어 있다. 클로로메틸화된 수지들은 캘리포니아 리치몬드 바이오 래드 실험실과 랩 시스템 인코포레이티드로부터 상업적으로 구입할 수 있다. 그러한 수지의 제조는 스튜어트 일행의 고체상 펩티드 합성 (샌프란시스코, 후리맨 ＆ Co., 1969) 제1장 1-6면에 기술되어 있다. BHA 및 MBHA 수지 지지체들은 시중에서 구입할 수 있으며 합성된 바람직한 폴리펩티드가 C-말단에서 비치환된 아미드를 가질 경우에만 일반적으로 사용된다.

BOC와 Xan에 의해 보호되는 C-말단 아미노산, 예를 들면 Asn은 예를 들어 쥐 GRF(rGRF)의 43-잔기 유리산 유사체가 합성되어야 할 경우 약 60℃에서 24시간 동안 휘저어 섞으면서 DMF내의 KF를 사용하여, 케이. 호리키 일행의 화학 문헌(Chemistry Letters) 165-168(1978)에 기술된 공정에 따라 클로로메틸화된 수지에 우선 커플링될 수 있다. BOC-보호된 아미노산을 수지 지지체에 커플링시킨 후 알파-아미노 보호기는 염화메틸렌 내의 트리플루오로아세트산(TFA) 또는 TFA 만을 사용하여 제거된다. 약 0℃-실온 사이에서 탈보호를 수행한다. 디옥산내의 HCl과 같은 표준 분리시약(cleaving reagents)과 특정 알파-아미노 보호기의 제거 조건은 쉬로더 및 룹케의 펩티드, 1·72-75면(아카데믹 프레스 1965)에 기술된 바와 같이 사용될 수 있다.

알파-아미노 보호기를 제거한 후, 잔여 알파-아미노- 및 측쇄-보호 아미노산들은 원하는 순서로 단계적으로 커플링되어, 앞에서 정의한 중간체 화합물을 얻거나 또는 합성시 각각의 아미노산을 별도로 첨가하는 대신 이들중 일부는 고체상 반응기에 첨가되기 전에 다른 것에 커플링될 수 있다. 적절한 커플링제의 선택은 당업계의 기술범위 내에 있다. 커플링제로 특히 적합한 것은 N, N'-디시클로헥실 카르보디이미드(DCD)이다.

펩티드의 고체상 합성에서 사용되는 활성화제는 펩티드 기술분야에 잘 알려져 있다. 적절한 활성화제의 예는 카르보디이미드, 예를 들면, N, N'-디이소프로필카르보디이미드 및 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드이다. 다른 활성화제 및 펩티드 커플링에 있어서 이들의 사용은 쉬로더 및 룹케의 J. Phar. Sci., 59, 1-27면(1970) 쿠푸어에 의한 Ⅲ장에 기술되어 있다.

각각의 보호된 아미노산 또는 아미노산 서열은 약 4배 이상의 초과량으로 고체상 반응기로 도입되고 커플링은 디메틸포름아미드(DMF) : CH₂Cl₂(1 : 1) 또는 DMF나 CH₂Cl₂하나만의 매체내에서 수행될 수 있다. 커플링이 불완전하게 발생할 경우, 다음 아미노산의 커플링에 앞서서 알파-아미노 보호기를 제거하기 전에 커플링 공정을 반복한다. 합성의 각각의 단계에서의 커플링 반응의 성공은 수동으로 수행되는 경우, 이. 카이저 일행의 Anal. Biochem. 34,595(1970)에 기술된 바와 같이 닌히드린 반응에 의해 모니터되는 것이 바람직하다. 커플링 반응들은 리버 일행의 바이오폴리머즈, 1978, 17, pp. 1927-1938에 보고된 바와 같은 프로그램을 사용하여 벡크만 990 자동 합성기를 사용하여 자동적으로 수행될 수 있다.

원하는 아미노산 서열이 완료된 후, 고리화를 수행하거나 또는 중간체 펩티드를 시약으로 처리하여 수지 지지체로부터 제거할 수 있는데, 액체 플루오르화수소와 같은 상기 시약은 펩티드를 수지로부터 분리해낼 뿐만 아니라 모든 잔존 측쇄 보호기들 X, X², X³, X⁴, X⁵, X⁶, X⁷, X⁸및 X⁹와 정착 결합 X¹⁰및 하나가 사용되어야 한다면 알파-아미노 보호기 X¹을 분리하여, 유리산 형태로 펩티드를 얻을 수 있다. 서열에 Met가 존재한다면, BOC 보호기는 바람직하게는 HF로 수지로부터 펩티드를 분리해 내기에 앞서서 트리플루오로아세트산(TFA)/에탄디티올을 사용하여 먼저 제거되어 잠재적 S-알킬화를 제거하게 된다. 분리시키기 위해 플루오르화수소를 사용할 경우, 아니솔, 크레졸, 디메틸설파이드 및 메틸에틸설파이드와 같은 하나 이상의 스캐빈저가 반응 용기에 포함된다.

고리화는 Cys 잔기들 사이의 결합이 사용될 경우, 펩티도수지(peptidoresis)의 일부이기는 하지만 펩티드를 고리화하는 것과는 반대로 선형 펩티드에 대해 수행된다. 그러한 디설파이드 고리화 결합을 수행하기 위해서, 이 기술분야에 잘 알려진 바와 같이, 완전히 보호된 펩티드는 암모니아분해(ammonolysis)에 의해 히드록시메틸화된 수지 또는 클로로메틸화된 수지 지지체로부터 분리되어, 완전히 보호된 아미드 중간체를 생성할 수 있으며, 이는 이후에 적절히 고리화되고 탈보호되며; 또는, 벤즈히드릴아민 수지로부터 펩티드를 분리할 뿐만 아니라 탈보호시키는 것이 플루오르산(HF)으로 0℃에서 일어날 수 있다. 몇몇 계획안을 이용하여, 아미드 고리화 결합이 이용되는 경우 부분적으로 보호된 펩티드가 1987년 5월, 제10차 미합중국 펩티드 심포지움 진행서, 465-467(1988)의 에이. 엠. 펠릭스 일행의 펩티드에 기술된 바와 같이 수지에 부착되어 있는 동안 고리화가 수행될 수 있다. 그러한 과정은 Asp, Glu 및/또는 Lys와 같은 다른 잔기들이 그들의 측쇄 보호를 유지하는 동안 두개의 바람직한 측쇄 사이에 아미드 고리화 결합을 효과적으로 형성한다.

GRF 펩티드 유사체의 고리화 단계는 물론 25- 및 29-위치의 잔기들 사이의 원하는 결합의 유형에 의존한다. D- 또는 L-Cys 잔기들이 25- 및 29-위치 둘다에 포함되어 있는 경우, 고리화 단계는 수지로부터 분리되고 펩티드로부터 모든 보호기를 제거한 다음에 수행하는 것이 더욱 편리하다. 펩티드의 고리 형태는 바람직하게는 리버 일행의 바이오폴리머즈 Vol. 17(1978), 1927-38에 기술된 바와 같이, 시안화제이철(ferricyanide) 용액을 사용하여 산화시킴으로써 얻어지며, 또는 산소 산화 또는 공지된 다른 방법에 의하여 얻어진다.

고리화가 25-위치 잔기의 측쇄 아미노기와 29-위치 잔기의 측쇄 카르복실기 사이의 아미드 결합(이것이 바람직함)을 통해 또는 그 반대의 아미드 결합을 통해 되었을 경우, MBHA 또는 BHA 수지상에 보호된 펩티드를 합성하고, 이 펩티드가 수지에 여전히 부착되어 있는 동안 특정의 카르복실산 측쇄의 벤질에스테르를 히드라지드로 유도한 후, 1987년 4월 28일에 특허된 미합중국 특허 제4,661,472호에 나타낸 바와 같이 선택적으로 탈보호된 아미노-측쇄와 반응시키는 것이 바람직하다. 바람직하게 고리화는 아미드-결합 가교에 관여되는 잔기의 카르복실 측쇄에 대해서 염기-불안정성 보호기, 예를 들면 OFm을 사용함으로써, 또한 Fmoc를 관여될 다른 잔기상의 아미노 측쇄에 대한 보호기로서 사용함으로써 수행된다. 아실화되었는지의 여부와는 관계없이 1-위치 잔기상의 알파-아미노 보호기 및 모든 다른 측쇄 보호기들은 그 위치에 남아 있는데, 반면 두개의 염기-불완전기들은 피페리딘 등을 사용하여 제거된다. 이러한 선택적 제거 이후에, 고리화를 위한 반응이 아미드 결합을 거의 완전히 생성하는 BOP로 처리함으로써 수행된다. 고리화 후에, 펩티드는 완전히 탈보호되고 HF와 같은 시약을 사용하여 수지로부터 분리된다. 선택적으로, BOC-보호기는 TFA를 사용하여 먼저 제거될 수 있다.

또는, 그러한 아미드 결합에 의한 펩티드의 고리화는 미합중국 특허 제4,115,554(1978. 9. 19); 4,133,805(1979. 1. 9); 4,140,767(1979. 2. 20); 4,161,521(1979. 7. 17); 4,191,754(1980. 3. 4); 7,238,481(1980. 12. 9); 4,244,947(1981. 1. 13); 및 4,261,885(1981. 4. 14)의 기술 내용을 이용하여 수행할 수 있다.

디설파이드 결합이 -CH₂- 결합으로 대치된 경우 25- 및 29-위치들의 변형된 시스테인 잔기들의 등가물을 포함하는 GRF 유사체들은 디카르바로 언급된다. 단지 하나의 설프히드릴기가 CH₂-기로 대치된다면, 카르바로서 언급되는데, 예를 들면 [carba²⁵, Cys²⁹]-GRF이다. 최종적 펩티드의 관점에서 볼 때, Cys 잔기에 의해 대신 차지될 수 있었던 그 위치는 알파-아미노 부티르산(aBu)을 함유한다. 그러한 디카르바 또는 카르바-S 결합을 갖는 펩티드를 제조시, 미합중국 특허 제4,161,521호에 주어진 공정이 바람직하게 사용되어, 식 Ⅱ의 중간체에서 X⁸은 다른 잔기에 대한 직접적인 결합이 된다.

다음 실시예 Ⅰ은 고체상 기술에 의해 펩티드들을 합성하는 바람직한 방법을 제공한다. 물론 대응하는 더 긴 펩티드의 합성은 사슬의 C-말단에 아미노산의 필요한 수를 단순히 첨가함으로써 동일한 방법으로 수행된다는 것을 알 수 있을 것이다. 현재 생물학적으로 활성인 단편들은 N-말단에 지시된 서열을 함유해야 하며, N-말단으로의 잔기의 첨가는 유익하지 않은 것으로 생각되고 있다.

[실시예Ⅰ]

식 N^aMeTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Ala-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-D-

-NH₂을 갖는 펩티드[N^aMeTyr¹, Ala¹⁵, D-Cys²⁵, Nle²⁷, Cys²⁹]-rGRF(1-29)-NH₂의 합성은 베일 일행의 미합중국 특허 제4,292,313호에 일반적으로 기술된 바와 같이 시중에서 구입할 수 있는 MBHA 수지상에 벡크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적 방식으로 수행된다. 수지에 대한 BOC-Cys(MeOBzl)의 커플링은 수지 그램당 Cys 약 0.35mmol의 치환을 초래한다.

탈블록화 및 중화한 다음에 펩티드 사슬을 수지상에 단계적으로 쌓는다. 탈블록화, 중화 및 각 아미노산의 첨가는 리버, 제이의 J. Amer. Chem. Soc., 96, 2986-2992(1974)에 상세히 기술된 공정에 따라 일반적으로 수행한다. 사용된 모든 용매들은 불활성 기체, 예를 들면 헬륨 또는 질소로 흩뿌림으로써 조심스럽게 기체를 제거시킨다.

탈블록화는 바람직하게는 다음의 계획 A에 따라 수행된다.

계획 A

커플링은 바람직하게는 다음의 계획 B에 주어진 바와 같이 수행한다.

계획 B

간단히, 수지 그람당 염화메틸렌내의 BOC-보호된 아미노산 1 내지 2mmol이 사용되며, 염화메틸렌내 1.0몰 DOC 1당량이 또한 2시간동안 사용된다. BOC-Arg(Tos)가 커플링될 때, 50% DMF와 염화메틸렌의 혼합물이 사용된다. Bzl 에테르는 Ser 및 Thr에 대한 히드록실 측쇄 보호기로서 사용된다. Asn 또는 Gl Gln의 아미도기는 바람직하게는 DCC 커플링이 사용되는 경우 Xan에 의해 보호된다; 그러나 보호는 생략될 수도 있다. p-니트로페닐에스테르(ONp)는 Asn 또는 Gln의 카르복실 말단을 활성화하기 위해 사용될 수 있으며, 예를 들면 BOC-Asn(ONp)은 DMF와 염화메틸렌의 50% 혼합물 내(이 경우 DCC가 첨가되지 않음)에서 HOBt 1당량을 사용하여 밤새 커플링될 수 있다. 2-클로로-벤질옥시카르보닐(2Cl-Z)은 Lys 측쇄의 보호기로서 사용된다. Tos는 Arg의 구아니도기와 His의 이미다졸 질소를 보호하기 위해 사용되고 Asp 측쇄 카르복실기는 OBzl로 보호된다. MeOBzl은 Cys의 설프히드릴기의 보호기로서 사용된다. Tyr의 페놀성 히드록실기는 2, 6-디클로로벤질(DCB)로 보호된다. 합성의 끝에, 다음 조성물이 얻어진다 :

BOC-N^aMeTyr(X²)-Ala-Asp(X³)-Ala-Ile-Phe-Thr(X⁴)-Ser(X⁴)-Ser-(X⁴)-Tyr(X²)-Arg(X⁶)-Arg(X⁶)-Ile-Leu-Ala-Gln(X⁵)-Leu-Tyr(X²)-Ala-Arg(X⁶)-Lys(X⁷)-Leu-Leu-His(X)-D-Cys(X⁸)-Ile-Nle-Asn(X⁵)-Cys(X⁸)0X¹⁰, 이 식에서 X는 Tos, X²는 DCB, X³는 OBzl, X⁴는 Bzl, X⁵는 Xan, X⁶은 Tos, X⁷은 2Cl-Z, X⁸은 MeOBzl, X¹⁰은 NH-MBHA-수지 지지체이다. Xan은 알파-아미노 보호기를 탈블록하기 위해 사용되는 TFA 처리에 의해 부분적으로 또는 전적으로 제거될 수 있다.

보호된 펩티드-수지를 분리하고 탈보호시키기 위해서, 반시간 동안 -2℃에서, 그리고 반시간 동안 0℃에서 펩티드-수지의 그람당 아니솔 1.5ml, 메틸에틸설파이드 0.5ml 및 플루오르화수소(HF) 15ml로 처리한다. 고진공하에서 HF를 제거한 후, 수지-펩티드 잔여물은 두수 디에틸 에테르와 클로로포름으로 교대로 세척되며, 그러면 펩티드는 탈기된 2N 수성 아세트산으로 추출되어 여과에 의해 수지로부터 분리된다.

이후에 펩티드를 약 4℃에서 약 48시간 동안, 또 실온에서 약 3일 이상동안(또는 엘만 시험에 의해 측정하여 -SH가 완전히 사라질 때까지……Archives Biochem. Biophys. 82, 1959, p.70 참조) 공기-산화시켜서 각 분자내의 시스테인 잔기들 사이에 디설파이드 결합을 형성한다.

그 다음 분리되고 탈보호된 고리형 펩티드를 0-5% 아세트산에 용해시키고 세파덱스(Sephadex) G-50미세 겔여과를 포함하여 정제시킨다.

그리고 리버 일행의 J. of Chromatography 288, 303-328(1984); 리버 일행의 펩티드 : 구조 및 생물학적 기능 (1979) pp 125-88; 및 마르키 일행의 J. Am. Chem. Soc. 103-3178(1981)에 기술된 바와 같이 펩티드는 제조 또는 반제조된 HPLC에 의해 더 정제된다. 카트리지 피팅 워터즈 어소시에이츠(Cartridge fitting Waters Associates) prep LC-500을 Vydac(300A)으로부터 15-20μ C18 실리카로 패킹시킨다. TEAP내의 CH₃CN의 구배는 리버, 제이의 J. Liq. Chromatography 1, 343-367(1978)에 기술된 바와 같이 저압 엘덱스(Eldex) 구배 제조기에 의해 형성된다. 크로마토크라피 분류물들은 HPLC로 조심스럽게 모니터하고 실질적인 순도를 보이는 분류물만을 모은다. 순도를 개별적으로 검사한 정제된 분류물들은 0.1% TFA내의 CH₃CN 구배를 사용하여 탈염시킨다. 이 다음 중앙 절단물을 동결건조시켜 순도가 98% 보다 더 큰 원하는 펩티드를 얻는다.

얇은막 크로마토그라피와 여러 다른 용매 시스템을 사용하여 펩티드가 균질성인지 판단된다. 구체적으로, 기공크기 300A의 5μm C₁₈실리카로 패킹된 0.21×15㎝ 칼럼으로 상기한 바와 같은 Waters HPLC 시스템을 사용하여, 역-상(reversed-phase) 고압 액체 크로마토그라피에 적용되며; 사용된 완충액은 용액 1000ml 당 트리에틸아민 1.6ml와 H₃PO₄1.0ml 및 아세토니트릴로 구성되는 pH 3.0의 수성 인산 트리에틸암모늄 용액이었다. 측정은 실온에서 수행하였다. 완충액 A는 5% CH₃CN을 함유하는 반면 완충액 B는 75% CH₃CN을 함유하였다. 유속은 0.6ml/분이었는데, 20% 완충액 B로 시작하여 60분에 걸쳐 비례적으로 증가되어 95% 완충액 B가 되었다. 보유시간은 34.45분이었다.

결과의 정제된 펩티드의 아미노산 분석은 제조된 구조식과 일치하였는데, 사슬내의 각 아미노산이 다음의 값을 가짐을 나타냈다 : Asp(2.13), Thr(1.00), Ser(1.75), Glu(1.06), Cys(1.83), Ala(4.00), CH₃Tyr(1.17), Ile(2.71), Leu(4.33), Nle(1.28), Tyr(2.14), Phe(0.94), Lys(1.00), His(1.04) 및 Arg(3.20).

광학회전은 광전기 편광계 상에서 [α]²²D = -62.9±1(c=1, 1% 아세트산)으로 측정된다.

[실시예 ⅠA]

25-위치에서 D-Cys 대신 L-Cys를 사용하고 29-위치에서 L-Cys 대신 D-Cys를 사용하여 실시예 Ⅰ의 합성을 반복함으로써 하기 식을 갖는 아미드화된 펩티드를 합성한다 :

N^aMeTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Ala-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-

-NH₂

얇은막 크로마토그라피와 여러 다른 용매 시스템을 사용하여 펩티드는 균질한 것으로 판단된다. 구체적으로, 기공크기 300A의 5μm C₁₈실리카로 패킹된 0.21×15㎝ 칼럼으로 상기한 바와 같은 Waters HPLC 시스템을 사용하여, 역-상(reversed-phase) 고압 액체 크로마토그라피에 적용되며; 사용된 완충액은 용액 1000ml당 TFA 1.0ml 및 아세토니트릴로 구성되는 0.1% 트리플루오로아세트산 용액이었다. 측정은 37℃에서 수행하였다. 완충액 A는 5% CH₃CN을 함유하는 반면 완충액 B는 80% CH₃CN을 함유하였다. 유속은 1.0ml/분이었는데, 10% 완충액 B로 시작하여 30분에 걸쳐 비례적으로 증가되어 95% 완충액 B가 되었다. 보유시간은 20.68분이었다.

결과의 정제된 펩티드의 아미노산 분석은 제조된 구조식과 일치하였는데, 사슬내의 각 아미노산에 대하여 정수-값을 나타냈다; 광학회전은 광전기 편광계 상에서 [α]²²D = -79.2±1(c=1, 1% 아세트산)으로 측정된다.

[실시예 Ⅱ]

식 : H-N^aMeTyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-

-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH₂을 갖는 44-잔기 아미드화된 펩티드 c(25-29) [N^aMeTyr¹, D-NMA², Ala¹⁵, Nle²⁷, daP²⁹]-hGRF(1-44)-NH₂의 합성은 일반적으로 실시예 Ⅰ에 기술된 바와 같이 MBHA 수지상에서 벡크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적 방식으로 수행하여 식 :

BOC-N^aMeTyr(X²)-Ala-Asp(X³)-Ala-Ile-Phe-Thr(X⁴)-Asn(X⁵)-Ser(X⁴)-Tyr(X²)-Arg(X⁶)-Lys(X⁷)-Val-Leu-Ala-Gln(X⁵)-Leu-Ser(X⁴)-Ala-Arg(X⁶)-Lys(X⁷)-Leu-Leu-Gln(X⁵)-Asp(OFm)-Ile-Nle-Ser(X⁴)-daP(Fmoc)-Gln(X⁵)-Gln(X⁵)-Gly-Glu(X³)-Ser(X⁴)-Asn(X⁵)-Gln(X⁵)-Glu(X³)-Arg(X⁶)-Gly-Ala-Arg(X⁶)-Ala-Arg(X⁶)-Leu-NH-MBHA 수지 지지체(여기서 X²-X⁷은 실시예에서 특정된 바와 같다)을 갖는 중간체를 형성한다. 선택적 탈보호와 고리화는 다음과 같이 수행한다.

보호된-펩티딜 수지 4g(약 5meq.의 펩티드 함유), BOP[벤조트리아졸릴-N-옥시트리스(디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트] 2.20g(5meq.) 및 디이소프로필에틸아민 10meq.를 현탁시키고 실온에서 2시간 동안 휘저어 섞는다. 펩티도수지를 여과하고 DMF, MeOH, CH₂Cl₂및 MeOH로 씻고 최종적으로 건조시킨다.

보호된 펩티도수지 4g을 CH₂Cl₂내의 60% TFA로 처리하여 BOC-보호기를 제거한 후, 0℃에서 60분간 스캐빈저로서 아니솔 1.5ml 존재하에서 증류된 HF 10-15ml로 처리하여 잔존하는 보호기들을 제거하고 수지로부터 펩티드를 분리해낸다. HF는 고진공하에서 제거되며, 펩티드는 무수 에틸에테르와 함께 침전된다. 고형물을 수집하여 50ml의 CH₃CN : H₂O(1 : 1)에 용해시키고 냉동건조시킨다. 이후에 실시예 1에 기술된 바와 같이 RP-HPLC를 사용하여 정제된다.

펩티드는 TLC 및 HPLC를 사용하여 실질적으로 순수한 것인지 판단된다.

[실시예 Ⅲ]

식 : H-His-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-

-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-Arg-Phe-Asn-OH을 갖는 c(25-29)[D-NMA², D-Glu²⁵, Nle²⁷, Orn²⁹] -hGRF (1-43)-OH의 합성은 Chemistry Letters(화학 문헌)에 기술되고 그 후에 실시예 Ⅱ에 일반적으로 기술된 바와 같이 초기에 커플링하면서 클로로메틸화된 수지를 사용하여 벡크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적 방식으로 수행한다. TLC 및 HPLC를 사용하여 펩티드가 본질적으로 순수한지 판단된다.

[실시예 Ⅳ]

식 : N^aMeTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Lys-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-D-

-NHCH₂CH₃을 갖는 hGRF 유사체 단편, [N^aMeTyr¹, Lys⁸, Ala¹⁵, D-Cys²⁵, Nle²⁷, Asn²⁸, Cys²⁹]-hGRF(1-29)-NHEt의 합성은 미합중국 특허 제4,569,967호에 기술된 바와 같이 수지상에서 벡크만 990 펩티드 합성기를 사용하여 단계적 방식으로 수행한다. 선형 펩티드는 HF로 처리하여 수지로부터 제거되고 고리화 및 정제는 실시예 Ⅰ에 주어진 바와 같이 수행된다. TLC 및 HPLC를 사용하여 이 유사체가 본질적으로 순수한지 판단한다.

[실시예 Ⅴ]

식 : (B)R₁-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-

-NH₂을 갖는 표 Ⅰ에 나타낸 바와 같은 rGRF 유사체를 상기한 고체상 과정에 의해 제조하였다.

표 Ⅰ

제5번 및 6번과 같은 펩티드들은 미합중국 특허 제4,161,521호의 일반적인 기술내용을 이용하여 합성된다.

[실시예 Ⅵ]

식 : H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-R₈-Ser-Tyr-Arg-Lys-R13-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-

-NH₂을 갖는 표 Ⅱ에 나타낸 바와 같은 rGRF 유사체를 상기한 고체상 과정에 의해 제조하였다.

표 Ⅱ

[실시예 Ⅶ]

식 : N^aMeTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-R₂₁-Leu-Leu-R₂₄-

-NH₂을 갖는 표 Ⅲ에 나타낸 바와 같은 rGRF 유사체를 상기한 고체상 과정에 의해 제조하였다.

표 Ⅲ

[실시예 Ⅷ]

식 : N^aMeTyr-R₂-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-

-Gln-Gln-Gly-Glu-R₃₄-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH₂을 갖는 표 Ⅳ에 나타낸 바와 같은 rGRF 유사체를 상기한 고체상 과정에 의해 제조하였다.

표 Ⅳ

[실시예 Ⅸ]

식 : H-His-Ala-R₃-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-

-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-Arg-Phe-Asn-R₄₄-Y을 갖는 표 Ⅴ에 나타낸 바와 같은 rGRF 유사체를 상기한 고체상 과정에 의해 제조하였다.

표 Ⅴ

[실시예 Ⅹ]

식 : (B)Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-R₂₂-Leu-Gln-

-Gln-Gln-Gly-Glu-NH₂을 갖는 표 Ⅵ에 나타낸 바와 같은 rGRF 유사체를 상기한 고체상 과정에 의해 제조하였다.

표 Ⅵ

[실시예 ⅩⅠ]

식 : H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-R₁₀-Arg-R₁₂-Ile-Leu-R₁₅-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-

-NH₂을 갖는 표 Ⅶ에 나타낸 바와 같은 rGRF 유사체를 상기한 고체상 과정에 의해 제조하였다.

표 Ⅶ

[실시예 ⅩⅡ]

식 : H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-R₁₃-Leu-Gly-Gly-Leu-Ser-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-

-NH₂을 갖는 표 Ⅷ에 나타낸 바와 같은 rGRF 유사체를 상기한 고체상 과정에 의해 제조하였다.

표 Ⅷ

실시예들에서 제조된 합성 펩티드들은 시험관내 분석으로 합성 hGRF(1-40)-OH와 비교되어 GH분비 및 유사한 고유활성에 대해 일반적 더 큰 효능을 갖는 것으로 밝혀졌다. 이 합성 펩티드들 모두가 생물학적으로 활성이고 뇌하수체에 의한 GH 방출을 자극하는데 잠재적으로 유용한 것으로 여겨진다.

성장 호르몬의 방출을 촉진시키는 대표적인 합성 펩티드들의 상대적 효능을 측정하기 위해서, 표준물로서 합성 hGRF(1-40)-OH를 사용하여, 합성된 대표적인 유사체의 등몰 농도와 비교하는 시험관내 분석을 행하였다. 약 3-5일 전에 미리 제거된 쥐의 뇌하수체 세포를 포함하는 배양물이 사용된다. 그러한 배양물은 성장 호르몬 분비에 가장 적합한 것으로 여겨지며, 베일 일행의 내분비학, 91, 562-572(1972)에 기술된 일반적인 방법과 베일 일행의 내분비학, 112, 1553-1555(1983)에 더욱 상세히 기술된 바와 같은 비교 시험을 위해 사용된다. 시험해야 할 물질을 3-4시간 동안 배양하고 배지 분취액을 꺼내어 잘 동정된 방사성 면역분석에 의한 면역 반응성 GH(ir GH) 내의 이들의 함량을 측정하도록 처리한다.

예를 들면, 등몰 농도에 대한 이 비교 시험의 결과는 [N^aMeTyr¹, Ala¹⁵, Cys²⁵, Nle²⁷, D-Cys²⁹]-rGRF(1-29)-NH₂가 hGRF(1-40)-OH의 생물학적 효능의 약 2배와 같은 생물학적 효능을 나타낸다는 것을 보여준다.

성장 호르몬 분비에 대한 시험관내 시험에 부가하여, 생체내 실험에서는 합성 펩티드들을 우레탄-마취된 수컷 쥐에 정맥내 주사하여 이들의 GH 분비를 개시하는 것을 측정한다. 주사전과 주사후 10분, 45분, 90분에 혈액 샘플들을 즉시 취하여 혈액내의 GH 수준을 방사성 면역분석으로 측정한다. 이 합성 펩티드들에 대한 생체내 시험은 이들이 hGRF(1-40)-OH에 의해 나타나는 것보다 실질적으로 더 큰 생물학적 효능을 나타냄을 보여주며; 실시예 Ⅰ의 펩티드 1μg 투여량과 실시예 ⅠA의 펩티드 5μg 투여량 모두는 10분에 hGRF(1-40)-OH 25μg 투여량 보다 더 큰 생체내 반응을 일으킨다는 것을 보여준다. 또한, 이 합성 고리형 GRF 유사체들은 본 발명의 고리형 펩티드들과 hGRF(1-40)-OH의 비교할만한 투여량으로 Ⅳ 투여후 45분에 측정했을 때 뇌하수체 GH의 혈액내 수준에서 보여지는 바와 같이 더욱 긴 효과의 지속성을 갖는다. 체중 kg당 이 고리형 펩티드들의 약 50μg과 약 400ng 사이의 투여량이 GH 분비 유발에 효과적인 것으로 여겨진다.

그러한 합성 hGRF 유사체와 rGRF 유사체들은 의사가 GH 생산을 높이기를 원하는 인간에 적용함에 있어서 유용해야 한다. 그러한 유사체에 의한 GH 분비의 자극을 내부발생 GRF의 생산부족에 기인하는 완전한 또는 상대적인 GH 결핍증을 갖는 환자에게 흥미로운 것이다. 또한, 증가된 GH 분비와 그에 따른 성장의 증가가 정상적인 GH 수준을 갖는 인간 또는 동물에서도 얻어질 수 있다. 또한, 투여에 의해 체지방 함량을 변경시키고 다른 GH-의존성 대사, 면역 및 발달 과정들을 변경시켜야 한다. 예컨대 이 유사체들은 화상에 따른 것과 같은 환경하에서 인체에 동화작용을 자극하는 수단으로서 사용될 수 있다. 또 다른 예로서, 이 유사체들은 닭, 칠면조, 돼지, 염소, 소 및 양과 같은 상업적 온혈 동물에 투여할 수 있으며 물고기 및 다른 냉혈 수중 동물, 예를 들면 바다거북 및 뱀장어와, 양서류 양육 수경법에 사용하여 성장을 촉진하고 펩티드의 유효량을 투여함으로써 얻어지는 지방에 대한 단백질의 비율을 증가시킬 수 있다.

인간에 투여하기 위해서, 이 합성 펩티드들은 적어도 약 93%, 바람직하게는 적어도 98%의 순도를 가져야 한다. 이러한 적용을 위해서, 순도는 존재하는 모든 펩티드 및 펩티드 단편들의 언급된 중량%를 구성하는 의도된 펩티드에 관한 것이다. 성장을 촉진하고 지방 함량을 감소시키기 위해서 상업적 및 다른 동물들에 그러한 합성 펩티드들을 투여하기 위해서, 약 5% 또는 0.01%와 같이 낮은 순도도 허용될 수 있다.

제약학적 조성물을 형성하기 위해서 제약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체와 결합된 이 합성 펩티드 또는 그의 무독성 염들은 인간을 포함한 동물에 정맥내, 피하, 근육내, 경피내, 예를 들면 비내 또는 경구적으로도 투여될 수 있다. 처리될 숙주가 GH의 방출을 자극하는 처리를 요하는 경우 GH의 방출을 자극하기 위해 의사에 의해 투여될 수 있다. 필요로 하는 투여량은 처리될 특정 조건, 상태의 심각도 및 필요한 처리 기간에 따라 변할 것이다.

그러한 펩티드들은 흔히 산부가염 또는 금속 착물, 예를 들면 아연, 철 등(이러한 적용을 위한 염으로서 생각되는 것)과 같은 무독성염의 형태로 투여된다. 그러한 산부가염의 예는 염화수소, 브롬화수소, 황산염, 인산염, 말레인산염, 아세트산염, 구연산염, 벤조산염, 숙신산염, 말산염(malate), 아스코르빈산염, 타르타르산염 등이다. 활성성분이 정제 형태로 경구적으로 투여된다면, 정제는 트라가칸트, 옥수수전분 또는 젤라틴과 같은 결합제; 알긴산과 같은 붕해제; 및 마그네슘 스테아린산염과 같은 윤활제를 함유할 수 있다. 액체 형태의 투여가 필요하다면, 감미제 및/또는 향미제가 사용될 수 있으며 등장 염수 인산염 완충용액 또는 이와 유사한 것으로 정맥내 투여를 행할 수 있다.

펩티드들은 의사 지도하에 인간에 투여해야 하며 제약학적 조성물은 보통 통상적인 고체 또는 액체의 제약학적으로 허용가능한 담체와 결합된 펩티드를 함유할 것이다. 보통 비경구적 투여량은 숙주 체중 kg당 펩티드 약 0.01-약 1μg일 것이다.

본 발명이 발명자에게 알려진 가장 좋은 방식을 구성하는 바람직한 구체예로서 기술되었어도 이는 당업자들에게 자명한 여러가지 변경 및 개조들이 첨부된 첨구범위에 주어진 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 한 행해질 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 예컨대, 펩티드 사슬의 변경, 특히 펩티드의 카르복실 말단에서 시작되어 약 29-위치까지 연장되는 삭제는 현재까지 공지된 실험관행에 따라 행해질 수 있으므로, 본 발명의 범위내로 생각되는 펩티드의 생물학적 효능의 모든 또는 매우 본질적인 부분을 보유하는 펩티드 또는 펩티드 단편을 형성한다. 또한, 하나의 말단에 또는 말단 모두에 첨가될 수 있으며, 또는 일반적으로 균등한 잔기들은 펩티드 화학 기술 분야에 잘 알려진 바와 같이 자연 발생하는 잔기들 대신 치환되어, 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 청구된 폴리펩티드의 효능의 적어도 본질적인 부분을 갖는 다른 유사체를 생산할 수 있다. 또한 현 기술상태에 따라 C-말단에서 바람직한 -NH₂기로 변경될 수 있다; 예컨대 C-말단에서 아미노산 잔기의 보통의 카르복실 부분은 -COOR, -CRO, -CONHNHR, -CON(R)(R') 또는 -CH₂OR(여기서, R 및 R'는 저급 알킬, 플루오로 저급 알킬 또는 수소이다)의 라디칼 형태를 가질 수 있는데, 이러한 변형은 균등한 합성 펩티드를 결과적으로 형성하므로 본 발명의 범위를 벗어나지 않는다.

본 발명의 여러 특징들은 다음의 청구범위에서 강조된다.

Claims (8)

1. 하기 서열을 갖는 합성 펩티드 또는 그의 무독성염 : (B)R₁-R₂-R₃-Ala- Ile- Phe -Thr-R₈- Ser-R₁₀-Arg-R₁₂-R₁₃-Leu-R₁₅-Gln-Leu-R|₁₈-Ala-Arg-R₂₁-R₂₂-Leu-R₂₄-

   

   -Gln-Gln-Gly-Glu-R₃₄-Asn-Gln-Glu-R₃₈-R₃₉-R₄₀-Arg-R₄₂-R₄₃-R₄₄(이 식에서 R₁은 Tyr, D-Tyr, Met, D-Met, Phe, D-Phe, pCl-Phe, Leu, His 또는 D-His; B는 H, C^aMe, N^aMe, 데스아미노, Ac 또는 For; R₂는 Ala, D-Ala, NMA 또는 D-NMA; R₃는 Asp 또는 D-Asp; R₈은 Ser, Asn, Lys, Arg, Asp 또는 Gln; R10은 Tyr, D-Tyr 또는 Phe; R12는 Arg 또는 Lys; R₁₃은 Ile, Val, Leu 또는 Ala; R₁₅는 Gly, Ala 또는 β-Ala; R₁₈은 Ser 또는 Tyr; R₂₁은 Lys, D-Lys, Arg 또는 D-Arg; R₂₂는 Leu, Ile, Ala 또는 Val; R₂₄는 Gln 또는 His; R₂₅는 cys, abu, asp, glu, orn, lys, dab 또는 dap; R₂₇은 Met, D-Met, Ala, Nle, Ile, Leu, Nva 또는 Val; R₂₈은 Asn 또는 Ser; R₂₉는 cys, abu, asp, glu, orn, lys, dab 또는 dap; R₃₄는 Ser 또는 Arg; R₃₈은 Arg 또는 Gln; R₃₉는 Gly 또는 Arg; R₄₀은 Ala 또는 Ser; R₄₂는 Phe 또는 Ala; R₄₃은 Asn 또는 Arg; R₄₄는 Leu이며; 단, 잔기 30 내지 44, 잔기 34 내지 44, 또는 R₄₄는 삭제될 수 있다.
2. 제1항에 있어서, R₂₅가 D-Cys이고, R₂₉가 Cys 또는 D-Cys인 펩티드.
3. 제1항에 있어서, R₂₅가 Cys이고, R₂₉가 D-Cys인 펩티드.
4. 제1항에 있어서, R₂₅가 Asp 또는 D-Glu이고 R₂₉가 Orn 또는 daP 펩티드.
5. 제1항에 있어서, 일반식 : (B)R₁-R₂-R₃-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-R₁₃-Leu-R₁₅-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-R₂₁-R₂₂-Leu-His-

   

   -NH₂을 갖는 펩티드.
6. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, R₁이 N^aMeTyr, R₁₅가 Ala, R₂₂가 Ala, R₂₇이 Nle, R₂₈이 Asn인 펩티드.
7. 제1항에 있어서, R₂₅가 D-Cys, R₂₇이 Nle, R₂₉가 Cys이고 잔기 30-44가 삭제되는 펩티드.
8. 제1항에 있어서, 하기 일반식 중 하나를 갖는 펩티드 : [N^aMeTyr¹, Ala¹⁵, D-Cys²⁵, Nle²⁷, Cys²⁹]-rGRF(1-29)-NH₂; [N^aMeTyr¹, Lys⁸, Ala¹⁵, D-Cys²⁵, Nle²⁷, Asn²⁸, Cys²⁹] -hGRF (1-29)-NHEt; [N^aMeTyr¹, D-Asp²⁵, daP²⁹]-rGRF(1-29)-NH₂또는 [N^aMeTyr¹, Ala¹⁵, Cys²⁵, Nle²⁷, D-Cys²⁹]-rGRF(1-29)-NH₂.