JP2758901B2

JP2758901B2 - Ｇｒｆ類似体▲ｖｉｉ▼

Info

Publication number: JP2758901B2
Application number: JP63125602A
Authority: JP
Inventors: ジャン・エドワール・フレデリック・リベール; ワイリー・ウォーカー・ヴェイル・ジュニア; カテリーヌ・ラウレ・リーベル
Original assignee: Salk Institute for Biological Studies
Current assignee: Salk Institute for Biological Studies
Priority date: 1987-05-22
Filing date: 1988-05-23
Publication date: 1998-05-28
Anticipated expiration: 2013-05-28
Also published as: EP0292334A3; PT87529B; AU1647788A; CA1312704C; IL86166A0; JPS649999A; PT87529A; DK280088A; KR880013974A; KR0143913B1; EP0292334A2; HUT46932A; US5002931A; SU1598881A3; NO882184L; FI89499C; FI89499B; FI882305A; ZA882832B; NO882184D0

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明はヒトや他の動物の下垂体の機能に影響を及ぼ
すペプチドに関する。特に、本発明は下垂体からの成長
ホルモン（GH）の分泌を促進するペプチドに関する。

［従来技術］長い間、生理学者らは視床下部で産生される特殊な物
質が下垂体ホルモンの分泌を刺激または抑制して下垂体
腺部の分泌機能を調節していることを認めてきた。視床
下部の抑制性因子は1972年にGHの分泌を抑制するソフト
スタチン（somatostatin）として同定された。1982年に
は、ヒト膵臓（腫瘍）GH放出因子（hpGRF）がヒトの膵
臓腫瘍の抽出物から単離され、精製，同定，合成および
試験が行われ、下垂体からのGHの分泌を促進することが
判明した。これらの下垂体因子はともに全合成により再
生産され、天然構造の類似体が合成されていた。ヒト視
床下部GH放出因子は完全に同一の構造を有しているた
め、以下これをhGRFという。

［発明の概要］培養下垂体細胞からGHを分泌させる合成ペプチドが現
在合成され試験されているが、これは生体内での酵素に
よる分解を受けにくく実質的効力が極めて高いものであ
る。このような長所を有しているのは、ペプチドが安定
性の高いα−らせん形をしているためであると考えられ
る。これらのペプチドは、その10,13,19および22位の残
基の少なくとも１つのα−炭素原子上にメチル基が置換
されている（Ｃ^aMe）のが好ましい。最も好ましいの
は、これらの残基の複数がメチル基で置換されているペ
プチドである。また、２位ではＤ−Ala,N^aCH₃−Ｄ−Ala
（Ｄ−NMA）またはNMAが置換されていてもよい。21位は
Ｄ−LysまたはＤ−Argであり、27位はNleであるのが好
ましい。８位はLysが置換されているのが好ましいが、A
rg,Ser,GluまたはAspが置換されていてもよい。ペプチ
ドの１位は、Tyr,D−Tyr,Met,Phe,D−Phe,pCl-Phe,Leu,
HisまたはＤ−Hisの中の１残基である。１位の残基のα
−炭素またはα−アミノ基上にはメチル基が置換されて
いてもよい。また、α−アミノ基は除去されていてもよ
い（desNH₂）。さらにα−アミノ基上はアシル化されて
いてもよく、中でもアセチル（Ac）化かホルミル（Fo
r）化されているのが好ましい。ペプチドは３位にＤ−A
spを有しおよび／または12位にArgを有しおよび／また
は10位にPheかＤ−Tyrを有しおよび／または15位にAla
を有していてもよい。27位のMetの代わりにＤ−Met,Nva
または他の残基を有しおよび／または28位にAsnを有し
ていてもよい。13位または22位はLeu,Ile,AlaおよびVal
であってもよい。

本発明による医薬組成物は、薬学的にまたは獣医学的
に受容される液体または固体のキャリアーに分散され
た、長さ約29から44残基の上記の類似体またはそれらの
いずれかの無毒性塩を含有する。これらの医薬組成物は
ヒトおよび動物の臨床医学の分野において使用され、治
療または診断目的のために投与される。さらにまたこれ
らの医薬組成物は鳥禽を含む温血動物や養殖の魚、うな
ぎ等の冷血動物の成長を促進するのに用いることができ
る。

［発明の構成］ペプチドを定義するために用いる命名法はシュレーダ
ー（Schroder）およびリュプケ（Lubke）の“ザ・ペプ
チド”アカデミックプレス（1965）に明記されるもので
あり、その際慣用的表示に従ってＮ末端のアミノ基は左
に、そしてＣ末端のカルボキシル基は右に表わされる。
天然アミノ酸とは、Gly,Ala,Val,Leu,Ile,Ser,Thr,Lys,
Arg,Asp,Asn,Glu,Gln,Cys,Met,Phe,Tyr,Pro,TrpおよびH
isからなるタンパク質中に見出される普通の自然界に存
在するアミノ酸のうちの１種を意味する。Nleはノルロ
イシンを意味し、Nvaはノルバリンを意味する。アミノ
酸基が異性体を有する場合は、特に指定しない限り、表
示されるアミノ酸のＬ体を意味する。Ｄ−NMAはα−ア
ミノ基がメチル置換されたアラニンのＤ−異性体を意味
する。

下垂体からのGHの分泌を促進する合成ペプチドは次の
アミノ酸配列（Ｉ）を有する。

（Ｂ）Ｒ₁‐Ｒ₂‐Ｒ₃‐Ala-Ile-Phe-Thr-R₈‐Ser-
（Ｑ₁）Ｒ₁₀‐Arg-R₁₂‐（Ｑ₂）Ｒ₁₃‐Leu-R₁₅‐Gln-Le
u-R₁₈‐（Ｑ₃）Ala-Arg-R₂₁‐（Ｑ₄Ｒ₂₂‐Leu-R₂₄‐Ｒ
₂₅‐Ile-R₂₇‐Ｒ₂₈‐Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-R₃₄‐Asn-Gl
n-Glu-R₃₈‐Ｒ₃₉‐Ｒ₄₀‐Arg-R₄₂‐Ｒ₄₃‐Ｒ₄₄ （式中、Ｒ₁はTyr,D−Tyr,Met,Phe,D−Phe,pCl-Phe,L
eu,HisまたはＤ−Hisであり;BはH,C^aMe,N^aMe,desNH₂,Ac
またはForであり;R₂はAla,D−Ala,NMAまたはＤ−NMAで
あり;R₃はAspまたはＤ−Aspであり;R₈はSer,Asn,Lys,Ar
g,AspまたはGlnであり;R₁₀はTyr,D−TyrまたはPheであ
り;R₁₂はArgまたはLysであり;R₁₃はIle,Val,LeuまたはA
laであり;R₁₅はGlyまたはAlaであり;R₁₈はSerまたはTyr
であり;R₂₁はLys,D−Lys,ArgまたはＤ−Argであり;R₂₂
はLeu,Ile,AlaまたはValであり;R₂₄はGlnまたはHisであ
り;R₂₅はAspまたはGluであり;R₂₇はMet,D−Met,Ala,Nl
e,Ile,Leu,NvaまたはValであり;R₂₈はAsnまたはSerであ
り;R₃₄はSerまたはArgであり;R₃₈はArgまたはGlnであ
り;R₃₉はGlyまたはArgであり;R₄₀はAlaまたはSerであ
り;R₄₂はPhe,AlaまたはValであり;R₄₃はAsnまたはArgで
あり;R₄₄は天然アミノ酸であり;Q₁〜Ｑ₄はＨまたはＣ^aM
eである；但し、Ｒ₃₀からＲ₄₄までの残基のいずれかあ
るいは全ては除去されていてもよく、また、Ｑ₁〜Ｑ₄の
少なくとも１つはＣ^aMeでありおよび／またはＲ₈はLys
またはArgでありおよび／またはＲ₂₁はＤ−LysまたはＤ
−Argである。）上記のペプチドは次のアミノ酸配列を有しているのが
好ましい。

（Ｂ）Ｒ₁‐Ｒ₂‐Ｒ₃‐Ala-Ile-Phe-Thr-R₈‐Ser-
（Ｑ₁）Ｒ₁₀‐Arg-R₁₂（Ｑ₂）Ｒ₁₃‐Leu-R₁₅‐Gln-Leu-
Ser-（Ｑ₃）Ala-Arg-R₂₁‐（Ｑ₄）Ｒ₂₂‐Leu-Gln-Asp-I
le-R₂₇‐Ｒ₂₈‐Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-
Arg-Gly-Ala-Arg-R₄₂‐Ｒ₄₃‐Ｒ₄₄ （式中、Ｒ₁はTyr,D−Tyr,Met,Phe,D−Phe,pCl−Phe,
Leu,HisまたはＤ−Hisであり;BはH,C^aMe,N^aMe,desNH₂,A
cまたはForであり;R₂はAla,D−Ala,NMAまたはＤ−NMAで
あり;R₃はAspまたはＤ−Aspであり;R₈はSer,Asn,Lys,Ar
g,AspまたはGlnであり;R₁₀はTyr,D−TyrまたはPheであ
り;R₁₂はArgまたはLysであり;R₁₃はIle,Val,LeuまたはA
laであり;R₁₅はGlyまたはAlaであり;R₁₈はSerまたはTyr
であり;R₂₁はLys,D−Lys,ArgまたはＤ−Argであり;R₂₂
はLeu,Ile,AlaまたはValであり;R₂₄はGlnまたはHisであ
り;R₂₅はAspまたはGluであり;R₂₇はMet,D−Met,Ala,Nl
e,Ile,Leu,NvaまたはValであり;R₂₈はAsnまたはSerであ
り;R₃₄はSerまたはArgであり;R₃₈はArgまたはGlnであ
り;R₃₉はGlyまたはArgであり;R₄₀はAlaまたはSerであ
り;R₄₂はPhe,AlaまたはValであり;R₄₃はAsnまたはArgで
あり;R₄₄は天然アミノ酸であり;Q₁〜Ｑ₄はＨまたはＣ^aM
eである；但し、Ｒ₃₀からＲ₄₄までの残基のいずれかあ
るいは全ては除去されていてもよい。）Ｑ₁〜Ｑ₄の少な
くとも１つはＣ^aMeであり、Ｒ₈はLysまたはArgであり、
Ｒ₂₁はＤ−LysかＤ−Argであるのが好ましい。Ｃ末端の
アミノ酸残基のカルボキシル部分は次の基のいずれかで
あってもよい。

−COOR,−CRO,−CONHNHR,−CON（Ｒ）（Ｒ′）または
−CH₂OR （ここでＲおよびＲ′は低級アルキル、フルオロ低級
アルキルまたは水素である）低級アルキルはメチル、エ
チルまたはプロピルであるのが好ましい。１位がMetで
あるとき、27位はMe以外の残基であるのが好ましい。

Ｎ末端から29位の残基までのフラグメントは下垂体に
よるGH分泌に効果を及ぼす生物活性を有しており、長さ
29または32残基のＣ末端がアミドか置換アミドである生
物活性フラグメントであるのが最も好ましい。このペプ
チドが40またはそれ以上の残基を有する場合は、Ｃ末端
部分に対する明確な好適性はない。

本発明は、次式Ｎ^αMeTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-R₈‐Ser-Tyr-Arg-
Lys-Val-Leu-R₁₅‐Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-R₂₁‐Leu-Leu-
Gln-Asp-Ile-Nle-R₂₈‐Arg-NH₂ （式中、Ｒ₈はAsn、LysまたはAspであり;R₁₅はGlyま
たはAlaであり;R₂₁はLysまたはＤ−Lysであり;R₂₈はAsn
またはSerである；但し、次のうちの少なくとも１つが
存在する:R₈はLysであるか、Ｒ₈はAspであるか、または
Ｒ₂₁はＤ−Lysである）を有するペプチドまたはその無
毒性塩を提供する。

該ペプチドは、完全な固相法、部分的な固相法フラグ
メントカップリングまたは古典的な液相カップリングの
ような適当な方法により合成される。最近開発された複
製型DNA法の実施は、天然型アミノ酸残基のみを含有す
る類似体の一部を産生するのに使用されることが可能で
あり、該類似体の部分は次に短い末端ペプチドにつなが
れうる。例えば、完全な固相合成の技術は教科書「固相
ペプチド合成（Solid-Phase Peptide Synthesis）」，
スチュワート（Stewart）およびヤング（Young）,Freem
bn ＆ Co.,サンフランシスコ（1969）において述べら
れ、ヴェール（Vale）らによる1978年８月８日付米国特
許第4,105,603号に例示されている。基本的な液相合成
法は論文「Methoden dev Organischen Chemie（Horben-
Weyl）：ペプチド合成（Synthese von Peptiden）」,E.
ブンシュ（Wunsch）編集，ゲオルグ・ティーム出版，シ
ュトゥットガルト，西独（1974）において詳述される。
合成のフラグメント縮合法は、1976年８月３日付米国特
許第3,972,859号に例示される。他の適用可能な合成は1
974年10月15日付米国特許第3,842,067号および1975年１
月28日付米国特許第3,862,925号に例示される。

種々のアミノ酸成分の不安定な側鎖基を適当な保護基
（その基が最終的に除去されるまで、その部位で化学反
応が起こるのを防ぐ）で保護することは、この種の合成
において一般的である。また、アミノ酸や断片がカルボ
キル基の部位で反応する間その物質のα−アミノ基を保
護することも一般的であり、その後α−アミノ保護基を
選択的に除去してその位置で次の反応を行わせる。従っ
て、合成の一段階として、ペプチド鎖中に意図する配列
で位置するアミノ酸残基を含み且つ適当なアミノ酸残基
に側鎖保護基を結合した中間体化合物が生成することは
普通のことである。

式（Ｉ）のペプチドを製造するための中間体は次式
（II）で表される。

Ｘ¹‐（Ｂ）Ｒ₁（ＸまたはＸ²）‐Ｒ₂‐Ｒ₃（Ｘ³‐Al
a-Ile-Phe-Thr（Ｘ⁴）‐Ｒ₈（Ｘ⁸）Ser（Ｘ⁴）‐Ｒ
₁₀（Ｘ²）‐Arg（Ｘ⁶）‐Ｒ₁₂（Ｘ⁶またはＸ⁷）‐
（Ｑ₂）Ｒ₁₃‐Leu-R₁₅‐Gln（Ｘ⁵）‐Leu-R₁₈（Ｘ²）‐
（Ｑ₃）Ala-Arg（Ｘ⁶）‐Ｒ₂₁（Ｘ⁶またはＸ⁷）‐
（Ｑ₄）Ｒ₂₂‐Leu-R₂₄（Ｘ⁵またはＸ）‐Ｒ₂₅（Ｘ³）‐
Ile-R₂₇‐Ｒ₂₈（Ｘ⁴またはＸ⁵）‐Arg（Ｘ⁶）‐Gln（Ｘ
⁵）‐Glu（Ｘ³）‐Ｒ₃₄（Ｘ⁴またはＸ⁶）‐Asn（Ｘ⁵）
‐Gln（Ｘ⁵）‐Gln（Ｘ⁵）‐Glu（Ｘ³）‐Ｒ₃₈（Ｘ⁶ま
たはＸ⁵）‐Ｒ₃₉（Ｘ⁶）‐Ｒ₄₀（Ｘ²）‐Arg（Ｘ⁶）‐
Ｒ₄₂‐Ｒ₄₃（Ｘ⁵またはＸ⁶）‐Ｒ₄₄（Ｘ⁸）‐Ｘ⁹ 式中、Ｘ¹は水素またはα−アミノ保護基である。Ｘ¹
は包含されるα−アミノ保護基は、ポリペプチドの逐次
合成の分野において有用であると知られているものであ
る。Ｘ¹として使用しうるα−アミノ保護基の種類には
（１）芳香族ウレタン型保護基、例えばフルオレニルメ
チルオキシカルボニル（FMOC）、ベンジルオキシカルボ
ニル（Ｚ）、およびｐ−クロルベンジルオキシカルボニ
ル、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ブロム
ベンジルオキシカルボニル、ｐ−メトキシベンジルオキ
シカルボニルのような置換z;（２）脂肪族ウレタン型保
護基、例えばｔ−ブチルオキシカルボニル（BOC）、ジ
イソプロピルメチルオキシカルボニル、イソプロピルオ
キシカルボニル、エトキシカルボニル、およびアリルオ
キシカルボニル；および（３）シクロアルキルウレタン
型保護基、例えばシクロペンチルオキシカルボニル、ア
ダマンチルオキシカルボニル、およびシクロヘキシルオ
キシカルボニル；が含まれる。好適なα−アミノ保護基
は、たとえＮ^aMe−置換アミノ酸残基が１位に存在する
ときでも、BOCである。もちろんＢがdesNH₂のときＸ¹は
Ｈである。

Ｘは水素原子またはHisのイミダゾール窒素のための
保護基（例えばTos）である。

Ｘ²はTyrのフェノール性ヒドロキシル基のための適当
な保護基であり、例えばテトラヒドロピラニル、ｔ−ブ
チル、トリチル、Bzl,CBZ,4Br-CBZおよび2,6−ジクロル
ベンジル（DCB）である。また、Ｘ²は水素原子であって
もよく、この場合はその位置のアミノ酸残基に側鎖保護
基が存在しないことを意味する。

Ｘ³は水素原子、もしくはAspまたはGluのカルボキシ
ル基のための適当なエステル形成保護基、例えばベンジ
ル（OBzl）、2,6−ジクロルベンジル、メチルおよびエ
チルである。

Ｘ⁴はThrまたはSerのヒドロキシル基のための適当な
保護基であり、例えばアセチル，ベンゾイル,t−ブチ
ル，トリチル，テトラヒドロピラニル,Bzl,2,6−ジクロ
ルベンジルおよびCBZである。好適な保護基はBzlであ
る。Ｘ⁴はまた水素原子であってもよく、この場合はヒ
ドロキシル基に保護基が存在しないことを意味する。

Ｘ⁵は水素原子、もしくはAsnまたはGlnの側鎖アミド
基のための適当な保護基である。好ましくはそれはキサ
ンチル（Xan）である。

Ｘ⁶はArgのグアニジノ基のための適当な保護基、例え
ばニトロ,Tos,CBZ,アダマンチルオキシカルボニルおよ
びBOCであり、またＸ⁶は水素原子でありうる。

Ｘ⁷は水素原子、もしくはLysの側鎖アミノ基のための
適当な保護基である。適当な側鎖アミノ保護基の例は２
−クロルベンジルオキシカルボニル（２−Cl−ｚ）,To
s,t−アミルオキシカルボニルおよびBOCである。

Ｘ⁸は水素原子、もしくは一般的に先に示した適当な
側鎖保護基である。

Metは任意に酸素原子で保護しうるが、保護しない方
が好ましい。

側鎖アミノ保護基の選択は、一般に合成中のα−アミ
ノ保護基の除去の間に除去されないものを選ぶというこ
とを除いて限定的でない。しかしながら、いくつかのア
ミノ酸例えばHisの場合はカップリング完了後に一般に
保護を必要とせず、従ってα−アミノ保護基と側鎖アミ
ノ保護基は同じものでありうる。

Ｘ⁹はエステル形成基Ｘ³のようなＣ−末端カルボキシ
ル基に対する適当な保護基あるいは固相合成において使
用される、固体樹脂支持体への連結のためのアンカー結
合あるいはdes-X⁹（この場合、残基はＣ−末端において
先に定義したカルボキシル部分Ｚを有する）である。固
体樹脂支持体が使用される場合、それは−Ｏ−CH₂−樹
脂支持体、−NH−ベンズヒドラミン（BHA）樹脂支持体
または−NH−パラメチルベンズヒドリラミン（MBHA）樹
脂支持体のように当業者に既知の担体のいずれかであり
うる。非置換アミドが望ましい場合にBHAあるいはMBHA
樹脂の使用が好適なのは、切断で直接該アミドを与える
からである。Ｎ−メチルアミドが望ましい場合はＮ−メ
チルBHAから得られうる。他の置換アミドが望ましい場
合は米国特許第4,569,967号の方法を用いることができ
る。また、Ｃ末端として遊離酸以外のなお他の基が望ま
しい場合はホウベン−ウェイル（Houben-Weyl）の教科
書にある基本的な方法を用いてペプチドを合成するのが
好ましい。

中間体に対する式においてＸ−基の少なくとも１つは
保護基でありＸ⁹は樹脂支持体を含む。このように本発
明はまた以下のような対象となるペプチド製造の方法を
提供する。

（ａ）少なくとも１つの保護基と式（II）を有するペ
プチドを形成し〔ここでX,X¹,X²,X³,X⁴,X⁵,X⁶,X⁷および
Ｘ⁸は各々水素あるいは保護基であり、Ｘ⁹は保護基また
は樹脂支持体へのアンカー結合であるか、des-X⁹（この
場合、該残基はＣ−末端において望ましいカルボキシル
基を有していてもよい）である〕；（ｂ）式（II）のペプチドから保護基またはアンカー
結合を除去し；そして（ｃ）望ましい場合には、結果としてできる配列
（Ｉ）のペプチドをその無毒性塩に転化する。

ペプチド合成において使用する個々の側鎖保護基を選
択する場合、次の一般規則に従う。

（ａ）保護基はカップリング条件下でその保護特性を
保持して切断されない。

（ｂ）保護基は試薬に対して安定であるべきであり、
合成の各段階でα−アミノ保護基の除去のために選ばれ
た反応条件下でXanを除いて、安定であるのが好まし
い。

（ｃ）側鎖保護基は、意図するアミノ酸配列を含む合
成の完了時点に、ペプチド鎖を変性させない反応条件下
で除去できなければならない。

ペプチドが組換えDNA技法を用いないで製造される場
合、それらは好ましくはメリーフィールド（Merrifiel
d）のJ.Am.Chem.Soc.,85,p2149（1963）に一般的に記述
されるような固相合成法を用いて製造される。しかし、
先に述べたように当分野で知られた他の同様の化学合成
法も使用しうる。固相合成法は保護したα−アミノ酸を
適当な脂肪にカップリングすることによって、ペプチド
のＣ末端から開始される。このような出発物質はα−ア
ミノ保護アミノ酸をクロルメチル化樹脂またはヒドロキ
シメチル樹脂へエステル結合によって結合するか、ある
いはBHA樹脂またはMBHA樹脂へアミド結合することによ
って製造しうる。ヒドロキシメチル樹脂の製法はボダン
スキー（Bodaosky）らのChem.Ind.（ロンドン）38,1597
〜1598（1966）に開示されている。クロルメチル化樹脂
はカリフォルニア州リッチモンドのバイオラッド研究所
（Bio Rad Laboratories）およびラブシステムズ社（La
b.Systems,Inc.）から市販されている。この種の樹脂の
製法はスチュワート（Stewart）らの「固相ペプチド合
成（Solid Phase Peptide Synthesis）」（Freeman ＆
Co.,サンフランシスコ,1969）第１章１〜６頁に開示さ
れている。BHAおよびMBHA樹脂支持体は市販されてお
り、一般に合成しようとする目的ポリペプチドがそのＣ
末端に未置換アミド基をもつときにだけ使用される。

Ｃ末端アミノ酸、例えばBOCおよびXanで保護されたAs
nは先ずK.ホリキらのChmistry Letters,165-168（197
8）の方法に従ってクロルメチル化樹脂へカップリング
される。即ち、例えばラットGRF（rGRF）の43−残基遊
離酸類似体を合成するときには、約60℃でDMF中KFを用
いて24時間撹拌する。樹脂支持体へのBOC保護アミノ酸
のカップリングに続いて、塩化メチレン中トリフルオロ
酢酸（TFA）またはTFA単独を用いてα−保護基が除去さ
れる。この脱保護は約０℃から室温の間の温度で行われ
る。ジオキサン中HClのような他の標準的な切断試薬や
特定のα−アミノ保護基の除去条件は、シュローダー
（Schroder）とリューブク（Lubke）の「ザ・ペプチ
ド」第１巻72〜75頁（アカデミックプレス1965年）に記
述されているように選んでもよい。

α−アミノ保護基の除去後、残りのα−アミノ−およ
び側鎖−保護アミノ酸を意図する順序で段階的にカップ
リングさせて、先に定義した中間体化合物を得る。ある
いは各アミノ酸を別個に反応器へ加える代わりに、若干
のアミノ酸を互いにカップリングさせてから固相反応器
へ添加してもよい。適当なカップリング試薬の選択は当
分野の技術の範囲内である。カップリング試薬として特
に適しているものはN,N′−ジシクロヘキシルカルボジ
イミド（DCCI）である。

ペプチドの固相合成に用いられる活性化試薬はペプチ
ドの分野においてよく知られている。適当な活性化試薬
の例はカルボジイミド類、例えばN,N′−ジイソプロピ
ルカルボジイミドおよびＮ−エチル−Ｎ′−（３′−ジ
メチルアミノプロピル）カルボジイミドである。その他
の活性化試薬ならびにペプチドカップリングにおけるそ
れらの使用はシュレーダー＆リュプケの上記文献第III
章およびカプール（Kapoor）のJ.Phar.Sci.,59,1−27
（1970）に開示されている。

それぞれの保護アミノ酸またはアミノ酸配列は大体４
倍以上の過剰量で固相反応器へ導入され、カップリング
反応はジメチルホルムアミド（DMF）:CH₂Cl₂（1:1）の
混合媒体中で、あるいはDMFまたはCH₂Cl₂単独中で行わ
れる。不完全なカップリングが起った場合は、α−アミ
ノ保護基を除去する前にそのカップリング反応を繰り返
し、その後次のアミノ酸をカップリングさせる。合成の
各段階でのカップリング反応の成就は、もしその合成が
手動で行われるなら、カイザー（E.Kaiser）らのAnal.B
iochem.34,595（1970）に記載されるようなニンヒドリ
ン反応で監視するのが好ましい。カップリング反応は自
動的に、例えばベックマン990自動合成機で、リビエー
ル（Rivier）らのBiopolymers,1978,17,1927-1938頁に
報告されるようなプログラムを用いて行うことができ
る。

意図するアミノ酸配列が完了した後、液状フッ化水素
のような試薬で処理して中間体ペプチドを樹脂支持体か
ら切り離す。その際液状フッ化水素はペプチドを樹脂か
ら切り離すばかりでなく、残っている全ての側鎖保護基
X,X²,X³,X⁴,X⁵,X⁶,X⁷,X⁸，アンカー結合Ｘ⁹およびもし
使用するならα−アミノ保護基Ｘ¹をも切断して遊離酸
の形でペプチドを得る。配列中にMetが存在する場合、B
OC保護基は潜在的Ｓ−アルキル化を避けるためにHFを用
いる樹脂からのペプチド切断の前にトリフルオロ酢酸
（TFA）／エタンジチオールを使用して、好適にまず除
去される。切断のためにフッ化水素を使用する場合、ア
ニソールおよびメチルエチルスルフィドが反応容器中に
スキャベンジャーとして含有される。

次の実施例１は固相法によるペプチド合成の好適な方
法を示すものである。これと同じ方法でＣ末端に必要な
数のアミノ酸をつなげさえすれば対応する長いペプチド
を合成しうることは容易に理解されるであろう。Ｎ末端
へ残基をつなげるのは有益とは考えられておらず、現在
のところ生物活性フラグメントのＮ末端は所定の配列を
有するべきであると感じられる。

実施例１次式：Ｎ^aMeTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Arg
-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-G
ln-Asp-Ile-Nle-Asn-Arg-NH₂ で表わされるペプチド〔Ｎ^aMeTyr¹,Asp⁸,Ala¹⁵,Nle²⁷,A
sn²⁸〕‐hGRF（１−29）‐NH₂を、ベール（Vale）らの
米国特許第4,292,313号に概要が記載されるようにベッ
クマン990ペプチド合成機を使って市販のMBHA樹脂上で
段階的方法により合成した。この樹脂へのBOC-Arg（To
s）のカップリングは、樹脂1gあたりArg約0.35mmolの置
換をもたらした。

保護基を除去して中和した後、ペプチド鎖を樹脂上に
一段ずつ付加していった。保護基の除去、中和および各
アミノ酸の付加は一般にリビエール（J.Rivier）のJ.Am
er.Chem.Soc.,96,2986-2992（1974）に詳述される方法
に従って行った。使用する全ての溶剤は不活性ガス（例
えばヘリウムや窒素）を散布することによって注意して
ガス抜きしMet残基の硫黄を酸化するおそれのある酸素
を確実に除いた。

保護基の除去スケジュールＡに従って行った：スケジュールＡ試薬混合時間（分） 1.60％TFA/2％エタンジチオール 10 2.60％TFA/2％エタンジチオール 15 3.IPA/1％エタンジチオール 0.5 4.CH₂中のEt₃Ｎ（10％） 0.5 5.MeOH 0.5 6.CH₂Cl₂中のEt₃Ｎ（10％） 0.5 7.MeOH（２回） 0.5 8.CH₂Cl₂（２回） 0.5 カップリングは好ましくはスケジュールＢに記載され
るように行った：スケジュールＢ試薬混合時間（分） 9.DCCI − 10.Boc−アミノ酸 50〜90 11.MeOH（２回） 0.5 12.CH₂Cl₂（２回） 0.5 13.CH₂Cl₂中Ac₂Ｏ（3M） 15.0 14.CH₂Cl₂ 0.5 15.MeOH 0.5 16.CH₂Cl₂（２回） 0.5 簡単に述べれば、樹脂1gあたり塩化メチレン中のBOC
−保護アミノ酸１〜2mmolを使用し、塩化メチレン中の
1.0molDCCI1当量加えて２時間実施した。BOC-Arg（To
s）がカップリングされつつあるとき、50％DMFと塩化メ
チレンの混合物を使用した。SerおよびThrのヒドロキシ
ル側鎖保護基としてBzlエーテルを使用した。AsnやGln
のアミド基は、有利であるようにDCCカップリングを使
用する場合、Xanで保護した。ｐ−ニトロフェニルエス
テル（ONp）はAsnやGlnのカルボキシル末端を活性化す
るために使用し、例えばBOC-Asn（ONp）はDMFと塩化メ
チレンの50％混合物中のHOBt1当量を用いて一晩カップ
リングさせることができ、この場合はDCCを加えなかっ
た。２−クロル−ベンジルオキシカルボニル（2Cl−
ｚ）はLys側鎖の保護基として使用した。TosはArgのグ
アニド基およびHisのイミダゾール窒素を保護するため
に使用でき、GluまたはAspの側鎖カルボキシル基はOBzl
で保護した。Tyrのフェノール性ヒドロキシル基は2,6−
ジクロルベンジル（DCB）で保護した。合成終了時に次
の組成の中間体が得られた： BOC-N^aMeTyr（Ｘ²）‐Ala-Asp（Ｘ³）‐Ala-Ile-Phe-
Thr（Ｘ⁴）‐Asp（Ｘ³）‐Ser（Ｘ⁴）‐Tyr（Ｘ²）‐Ar
g（Ｘ⁶）‐Lys（Ｘ⁷）‐Val-Leu-Ala-Gln（Ｘ⁵）‐Leu-
Ser（Ｘ⁴）‐Ala-Arg（Ｘ⁶）‐Lys（Ｘ⁷）‐Leu-Leu-Gl
n（Ｘ⁵）‐Asp（Ｘ³）‐Ile-Nle-Asn（Ｘ⁵）‐Arg
（Ｘ⁶）‐Ｘ⁹ （ここでＸ²はDCB、Ｘ³はOBzl、Ｘ⁴はBzl、Ｘ⁵はXan,X⁶
はTos,X⁷は2Cl−ｚそしてＸ⁹はNH-MBHA−樹脂支持体で
ある）Xanはα−アミノ保護基を除去するために用いたT
FA処理によって部分的にまたは完全に除去できた。

保護ペプチド−樹脂を切り離して保護基を除去するた
めに、ペプチド−樹脂1gあたりアニソール1.5ml、メチ
ルエチルスルフィド0.5mlおよびフッ化水素（HF）15ml
を用いて−20℃で30分および０℃で30分処理した。高真
空下でHFを除去した後、樹脂−ペプチド残留物を乾燥ジ
エチルエーテルおよびクロロホルムで交互に洗い、次い
でペプチドをガス抜きした2N水性酢酸で抽出し、過に
より樹脂から分離した。

その後、得られたペプチドを０〜５％酢酸に溶解し、
セファデックスＧ−50微細ゲル過を含めた精製工程に
付した。

さらにペプチドはリビエールらのペプチド：構造およ
び生物学的機能,125-128（1979）およびマーキー（Mark
i）らのJ.Am.Chem.Soc.103,3178（1981）に示されるよ
うな調製用または半調製用HPLCで精製した。カートリッ
ジを備えたウォーターズ・アソシエーツ・プレプLC-500
（Waters Associates prep LC-500）はバイダック（Vyd
ac）300Aからの15〜20μのＣ₁₈シリカを装填した。リビ
エールのJ.Liq.Chromatography 1,343-367（1978）に記
載されるように、低圧エルデックス（Eldex）勾配製造
機を使って、TEAP中のCH₃CNの勾配をつくった。クロマ
トグラフ画分は注意してHPLCで監視し、実質的純度を示
す画分のみを集めた。それぞれ別個に純度を調べた精製
画分の脱塩は0.1％TFA中のCH₃CNの勾配を用いて行っ
た。その後センターカット（center cut）を凍結乾燥し
て目的とするペプチド（純度98％以上でありうる）を得
た。

参考例１次式： H-C^aMeHis-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-
Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-D−Lys-Leu
-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-A
sn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-NH₂ で表わされる40アミノ酸残基のペプチド〔Ｃ^aMeHis¹,D
−NMA²,D−Lys²¹〕−hGRF（１−40）−NH₂を、ベールら
の米国特許第4,292,313号に概要が記載されるように、
ベックマン990ペプチド合成機を使って市販のMBHA樹脂
上で段階的方法により合成した。本ペプチドはTLCおよ
びHPLCを用いて実質的に純粋であることが判明した。

参考例２次式」 H-His-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-
Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-D-Lys-Leu-Leu-
His-Glu-Ile-Nle-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gl
n-Glu-Gln-Arg-Ser-Arg-Phe-Asn-OH で表わされるペプチド〔Ｄ−NMA²,D−Lys²¹,Nle²⁷〕−r
GRF（１−43）−OHを、上述のChemistry Lettersに記載
されるように、ベックマン990ペプチド合成機でクロル
メチル化樹脂を用いて最初のカップリングをした後、実
施例１と同じように段階的方法により合成した。本ペプ
チドはTLCおよびHPLCを用いて実質的に純粋であること
が判明した。

実施例２次式：Ｎ^aMeTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Lys-Ser-Tyr-Arg
-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-G
ln-Asp-Ile-Nle-Asn-Arg-NH₂ で表わされるhGRF類似体フラグメント〔Ｎ^aMeTyr¹,Ly
s⁸,Ala¹⁵,Nle²⁷,Asn²⁸〕−hGRF（１−29）−NH₂を、実
施例１のようにMBHA樹脂上でベックマン990ペプチド合
成機を用いて段階的方法により合成した。本類似体はTL
CおよびHPLCを用いて実質的に純粋であることが判明し
た。

本合成をＮ末端をかえて行い〔Ｎ^aMeHis¹,Lys⁸,Al
a¹⁵,Nle²⁷,Asn²⁸〕−hGRF（１−29）−NH₂を合成した。

実施例３次式：Ｎ^aMeTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg
-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-D-Lys-Leu-Leu
-Gln-Asp-Ile-Nle-Ser-Arg-NH₂ で表わされるhGRF類似体フラグメント〔Ｎ^aMeTyr¹,D−L
ys²¹,Nle²⁷〕−hGRF（１−29）−NH₂を、実施例１のよ
うにMBHA樹脂上でベックマン990ペプチド合成機を用い
て段階的方法により合成した。本ペプチドはTLCおよびH
PLCを用いて実質的に純粋であることが判明した。

参考例３次式：Ｎ^aMe-His-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Lys-Ser-Tyr-
Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-D-Arg-Leu-
Leu-His-Glu-Ile-Nle-Asn-Arg-NH₂ で表わされる〔Ｎ^aMeHis¹,D−NMA²,Lys⁸,D−Arg²¹,Nle
²⁷〕−rGRF（１−29）−NH₂を、実施例１のようにMBHA
樹脂上でベックマン990ペプチド合成機を用いて段階的
方法により合成した。本ペプチドはTLCおよびHPLCを用
いて実質的に純粋であることが判明した。

参考例４次式：Ｎ^aMeTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-D-Tyr-A
rg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-D-Lys-Leu-L
eu-Gln-Asp-Ile-Nle-Ser-Arg-NH₂ で表わされる〔Ｎ^aMeTyr¹,D−Lys²¹,Nle²⁷〕−hGRF（１
−29）−NH₂を、実施例１のようにMBHA樹脂上でベック
マン990ペプチド合成機を用いて段階的方法により合成
した。本ペプチドはTLCおよびHPLCを用いて実質的に純
粋であることが判明した。

参考例５次式： H-His-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Arg-
Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-D-Lys-Leu-Leu-
His-Glu-Ile-Nva-Asn-Arg-NH₂ で表わされる〔Ｄ−NMA²,Asp⁸,D−Lys²¹,Nva²⁷〕−hGRF
（１−29）−NH₂を、実施例１のようにMBHA樹脂上でベ
ックマン990ペプチド合成機を用いて段階的方法により
合成した。本ペプチドはTLCおよびHPLCを用いて実質的
に純粋であることが判明した。

参考例６次式： H-D-Phe-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Glu-Ser-C^aMeTy
r-Arg-Lys-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-D-Lys-Le
u-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH₂ で表わされる〔Ｄ−Phe¹,D−NMA²,Glu⁸,C^aMeTyr¹⁰,Ile
¹³,D−Lys²¹〕−hGRF（１−32）−NH₂を、ベールらの米
国特許第4,292,313号に概要が記載されるように、ベッ
クマン990ペプチド合成機を使ってMBHA樹脂上で段階的
方法により合成した。本ペプチドはTLCおよびHPLCを用
いて実質的に純粋であることが判明した。

参考例７次式： H-pCl-Phe-D-MNA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-
Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-D-Lys-Val-
Leu-His-Asp-Ile-Ile-Asn-Arg-NH₂ で表わされる〔ｐ−Cl-Phe¹,D−NMA²,D−Lys²¹,Val²²,A
sp²⁵,Ile²⁷〕−rGRF（１−29）−NH₂を、実施例１に一
般に記載される方法でMBHA樹脂上でベックマン990ペプ
チド合成機を用いて段階的に合成した。本ペプチドはTL
CおよびHPLCを用いて実質的に純粋であることが判明し
た。

参考例８次式： H-C^aMeLeu-D-NMA-D-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Lys-Ser-Ty
r-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-D-Lys-Al
a-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH₂ で表わされる〔Ｃ^aMeLeu¹,D−NMA²,D−Asp³,Lys⁸,D−Ly
s²¹,Ala²²〕−hGRF（１−32）−NH₂を、実施例１のよう
にMBHA樹脂上でベックマン990ペプチド合成機を用いて
段階的方法により合成した。本類似体はTLCおよびHPLC
を用いて実質的に純粋であることが判明した。

参考例９次式： H-D-Tyr-D-NHA-D-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-C^aMe
-D-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-D-A
rg-C^aMeVal-Leu-Gln-Asp-Ile-D-Met-Ser-Arg-NH₂ で表わされる〔Ｄ−Tyr¹,D−NMA²,D−Asp³,C^aMe−Ｄ−T
yr¹⁰,Ala¹⁵,D−Arg²¹,C^aMeVal²²,D−Met²⁷〕−hGRF（１
−29）−NH₂を、実施例１のようにMBHA樹脂上でベック
マン990ペプチド合成機を用いて段階的方法により合成
した。本類似体はTLCおよびHPLCを用いて実質的に純粋
であることが判明した。

参考例10 次式： H-D-His-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Lys-Ser-Tyr-Ar
g-Arg-Leu-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-D-Lys-Leu-Le
u-His-Glu-Ile-Ala-Asn-Arg-NH₂ で表わされる〔Ｄ−His¹,D−NMA²,Lys⁸,Leu¹³,D−Ly
s²¹,Ala²⁷〕−rGRF（１−29）−NH₂を、実施例１に一般
に記載される方法でMBHA樹脂上でベックマン990ペプチ
ド合成機を用いて段階的に合成した。本ペプチドはTLC
およびHPLCを用いて実質的に純粋であることが判明し
た。

参考例11 次式：Ｎ^aMeTyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Glu-Ser-Tyr-A
rg-Arg-Ala-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-D-Arg-C^aMeI
le-Leu-His-Glu-Ile-Met-Asn-Arg-NH₂ で表わされるrGRF類似体フラグメント〔Ｎ^aMeTyr¹,D−N
MA²,Glu⁸,Ala¹³,D−Arg²¹,C^aMeIle²²〕−rGRF（１−2
9）−NH₂を、実施例１のようにMBHA樹脂上でベックマン
990ペプチド合成機を用いて段階的方法により合成し
た。本ペプチドはTLCおよびHPLCを用いて実質的に純粋
であることが判明した。

参考例12 次式： H-C^aMeLeu-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-
Arg-Arg-Leu-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-C^aMeAla-Arg-D-Lys-
C^aMeAla-Leu-His-Glu-Ile-Ala-Asn-Arg-NH₂ で表わされる〔Ｃ^aMeLeu¹,D−NMA²,Leu¹³,C^aMeAla¹⁹,D
−Lys²¹,C^aMeAla²²,Ala²²〕−rGRF−（１−29）−NH
₂を、実施例１のようにMBHA樹脂上でベックマン990ペプ
チド合成機を用いて段階的方法により合成した。本ペプ
チドはTLCおよびHPLCを用いて実質的に純粋であること
が判明した。

参考例13 次式： H-C^aMePhe¹‐NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Lys-Ser-Tyr-
Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-C^aMeAla-Arg-Lys-Le
u-Leu-Gln-Asp-Ile-Ile-Ser-Arg-NH₂ で表わされる〔Ｃ^aMePhe¹,NMA²,Lys⁸,Arg¹²,Ile¹³,C^aMe
Ala¹⁹,Ile²⁷〕−hGRF（１−29）−NH₂を、ベールらの米
国特許第4,292,313号に概要が記載されるように、ベッ
クマン990ペプチド合成機を用いてMBHA樹脂上で段階的
方法により合成した。本ペプチドはTLCおよびHPLCを用
いて実質的に純粋であることが判明した。

参考例14 次式： desNH₂‐D-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Arg-Ser-
Phe-Arg-Lys-C^aMeVal-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Ly
s-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-NH₂ で表わされる〔desaminoD-Tyr¹,D−NMA²,Arg₈,Phe¹⁰,C^a
MeVal¹³,Leu²⁷,Asn²⁸〕−hGRFを、ベールらの米国特許
第4,292,313号に概要が記載されるように、ベックマン9
90ペプチド合成機を用いてMBHA樹脂上で段階的方法によ
り合成した。本ペプチドはTLCおよびHPLCを用いて実質
的に純粋であることが判明した。

参考例15 次式： H-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-C^aMeTyr-
Arg-Lys-C^aMeVal-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-C^a
MeLeu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Asn-Arg-NH₂ で表わされる〔Ｄ−NMA²,C^aMeTyr¹⁰,C^aMeVal¹³,C^aMeLeu
²²,Nle²⁷,Asn²⁸〕−hGRF（１−29）−NH₂を、ベールら
の米国特許第4,292,313号に概要が記載されるように、
ベックマン990ペプチド合成機を用いてMBHA樹脂上で段
階的方法により合成した。本ペプチドはTLCおよびHPLC
を用いて実質的に純粋であることが判明した。

参考例16 次式： H-C^aMePhe-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-C^aMe
Tyr-Arg-Arg-C^aMeIle-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Ly
s-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Val-Asn-Arg-NH₂ で表わされる〔Ｃ^aMePhe¹,D−NMA²,C^aMeTyr¹⁰,C^aMeIle
¹³,Val²⁷〕−rGRF（１−29）−NH₂を、実施例１のよう
にMBHA樹脂上でベックマン990ペプチド合成機を用いて
段階的方法により合成した。本ペプチドはTLCおよびHPL
Cを用いて実質的に純水であることが判明した。

参考例17 次式： desNH₂‐D-Met-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-
C^aMeTyr-Arg-Lys-C^aMeVal-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-C^aMeAl
a-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Asn-Arg-NH₂ で表わされる〔desaminoD-Met¹,D−NMA²,C^aMeTyr¹⁰,C^aM
eVal¹³,C^aMeAla¹⁹,Asn²⁸〕−hGRF（１−44）−NH₂を、
ベールらの米国特許第4,292,313号に概要が記載される
ように、ベックマン990ペプチド合成機を用いてMBHA樹
脂上で段階的方法により合成した。本ペプチドはTLCお
よびHPLCを用いて実質的に純粋であることが判明した。

参考例18 次式：Ｎ^aMeHis-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-A
rg-Lys-C^aMeVal-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu
-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Ser-Arg-NH₂ で表わされる〔Ｎ^aMeHis¹,D−NMA²,C^aMeVal¹³‐Nle²⁷〕
−hGRF（１−29）−NH₂を、ベールらの米国特許第4,29
2,313号に概要が記載されるように、ベックマン990ペプ
チド合成機を用いてMBHA樹脂上で段階的方法により合成
した。本ペプチドはTLCおよびHPLCを用いて実質的に純
粋であることが判明した。

参考例19 次式： For-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-C^aMeTy
r-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-C^aMeAla-Arg-Lys-
Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-NH₂ で表わされるhGRF類似体フラグメント〔For-Tyr¹,D−NM
A²,C^aMeTyr¹⁰,C^aMeAla¹⁹,Leu²⁷,Asn²⁸〕−hGRF（１−3
2）−NH₂を、実施例１のようにMBHA樹脂上でベックマン
990ペプチド合成機を用いて段階的方法により合成し
た。本類似体はTLCおよびHPLCを用いて実質的に純粋で
あることが判明した。

参考例20 次式： H-His-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-
Lys-C^aMeIle-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-C^aMeAla-Arg-Lys-Le
u-Leu-His-Glu-Ile-Nle-Asn-Arg-NH₂ で表わされる〔Ｄ−NMA²,Lys¹²,C^aMeIle¹³,C^aMeAla¹⁹,N
le²⁷〕−rGRF（１−29）−NH₂ で表わされる〔Ｄ−NMA²,Lys¹²,C^aMeIle¹³,C^aMeAla¹⁹,N
le²⁷〕−rGRF（１−29）−NH₂を、実施例１のようにMBH
A樹脂上でベックマン990ペプチド合成機を用いて段階的
方法により合成した。本ペプチドはTLCおよびHPLCを用
いて実質的に純粋であることが判明した。

参考例21 次式： H-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-
Arg-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-C^aMeLeu-Le
u-Gln-Asp-Ile-Ile-Ser-Arg-NH₂ で表わされるhGRF類似体のフラグメント〔Ｄ−NMA²,Arg
¹²,C^aMeLeu²²,Ile²⁷〕−hGRF（１−29）−NH₂を、実施
例１のようにMBHA樹脂上でベックマン990ペプチド合成
機を用いて段階的方法により合成した。本ペプチドはTL
CおよびHPLCを用いて実質的に純粋であることが判明し
た。

参考例22 次式： H-D-Phe-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Ar
g-Lys-C^aMeVal-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-C^aMe
Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-D-Met-Ser-Arg-NH₂ で表わされる〔Ｄ−Phe¹,D−NMA²,C^aMeVal¹³,Ala¹⁵,C^aM
eLeu²²,D−Met²⁷〕−hGRF（１−29）−NH₂を、実施例１
のようにMBHA樹脂上でベックマン990ペプチド合成機を
用いて段階的方法により合成した。本類似体はTLCおよ
びHPLCを用いて実質的に純粋であることが判明した。

参考例23 次式： H-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-
Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-D-Arg-C^aMeLeu-
Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH₂ で表わされる〔Ｄ−NMA²,D−Arg²¹,C^aMeLeu²²〕−hGRF
（１−32）−NH₂を、実施例１のようにMBHA樹脂上でベ
ックマン990ペプチド合成機を用いて段階的方法により
合成した。本類似体はTLCおよびHPLCを用いて実質的に
純粋であることが判明した。

参考例24 次式： desNH₂His-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Lys-Ser-Tyr-
Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Le
u-His-Asp-Ile-Met-Asn-Arg-NH₂ で表わされる〔desaminoHis¹,D−NMA²,Lys⁸,Asp²⁵〕−r
GRF（１−29）−NH₂を、実施例１のようにMBHA樹脂上で
ベックマン990ペプチド合成機を用いて段階的方法によ
り合成した。本ペプチドはTLCおよびHPLCを用いて実質
的に純粋であることが判明した。

参考例25 次式： Ac-D-His-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Arg-Ser-C^aMeT
yr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu
-Leu-His-Glu-Ile-Nle-Asn-Arg-NH₂ で表わされる〔Ac−Ｄ−His¹,D−NMA²,Arg⁸,C^aMeTyr¹⁰,
Nle²⁷〕−rGRF（１−29）−NH₂を、実施例１のようにMB
HA樹脂上でベックマン990ペプチド合成機を用いて段階
的方法により合成した。本ペプチドはTLCおよびHPLCを
用いて実質的に純粋であることが判明した。

参考例26 次式： H-Tyr-D-Ala-D-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-C^aMeTy
r-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-C^aMeAla-Arg-Lys-
C^aMeLeu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH
₂ で表わされる〔Ｄ−Ala²,D−Asp³,C^aMeTyr¹⁰,C^aMeAl
a¹⁹,C^aMeLeu²²,Leu²⁷〕−hGRF（１−32）−NH₂を、実施
例１のようにMBHA樹脂上でベックマン990ペプチド合成
機を用いて段階的方法により合成した。本類似体はTLC
およびHPLCを用いて実質的に純粋であることが判明し
た。

参考例27 次式： H-D-Tyr-D-NMA-D-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Lys-Ser-C^aMe
-D-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys
-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-D-Met-Ser-Arg-NH₂ で表わされる〔Ｄ−Tyr¹,D−NMA²,D−Asp³,Lys⁸,C^aMe−
Ｄ−Tyr¹⁰,Ala¹⁵,D−Met²⁷〕−hGRF（１−29）−NH
₂を、実施例１のようにMBHA樹脂上でベックマン990ペプ
チド合成機を用いて段階的方法により合成した。本ペプ
チドはTLCおよびHPLCを用いて実質的に純粋であること
が判明した。

参考例28 次式： H-D-His-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Arg-Ser-Tyr-Ar
g-Arg-Leu-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-C^aMeAla-Arg-Lys-Leu-
Leu-His-Glu-Ile-Nle-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-NH₂ で表わされる〔Ｄ−His¹,D−NMA²,Arg⁸,Leu¹³,C^aMeAla
¹⁹,Nle²⁷〕−rGRF（１−32）−NH₂を、ベールらの米国
特許第4,292,313号に概要が記載されるように、ベック
マン990ペプチド合成機を用いてMBHA樹脂上で段階的方
法により合成した。本ペプチドはTLCおよびHPLCを用い
て実質的に純粋であることが判明した。

参考例29 次式： desNH₂Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Ar
g-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-C^aMeLeu-
Leu-His-Glu-Ile-Met-Asn-Arg-NH₂ で表わされるrGRF類似体のフラグメント〔desaminoTy
r¹,C^aMeLeu²²〕−rGRF（１−29）−NH₂を、実施例１の
ようにMBHA樹脂上でベックマン990ペプチド合成機を用
いて段階的方法により合成した。本ペプチドはTLCおよ
びHPLCを用いて実質的に純粋であることが判明した。

参考例30 次式： Ac-D-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-C^aMeT
yr-Arg-Lys-C^aMeVal-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-C^aMeAla-Arg
-Lys-C^aMeLeu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Ser-Arg-NH₂ で表わされる〔Ac-D-Tyr¹,D−NMA²,C^aMeTyr¹⁰,C^aMeVal
¹³,C^aAla¹⁹,C^aMeLeu²²,Nle²⁷〕−hGRF（１−29）−NH₂
を、ベールらの米国特許第4,292,313号に概要が記載さ
れるように、ベックマン990ペプチド合成機を用いてMBH
A樹脂上で段階的方法により合成した。本ペプチドはTLC
およびHPLCを用いて実質的に純粋であることが判明し
た。

参考例31 次式：Ｈ−Ｃ^aMeLeu-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Glu-Ser-T
yr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-C^aMeAla-Arg-Lys
-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Ile-Asn-Arg-NH₂ で表わされる〔Ｃ^aMeLeu¹,D−NMA²,Glu⁸,C^aMeAla¹⁹,Glu
²⁵,Ile²⁷〕−rGRF（１−29）−NH₂を、実施例１のよう
にMBHA樹脂上でベックマン990ペプチド合成機を用いて
段階的方法により合成した。本ペプチドはTLCおよびHPL
Cを用いて実質的に純粋であることが判明した。

参考例32 次式： For-D-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-
Arg-Lys-C^aMeVal-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-C^aMeAla-Arg-Ar
g-C^aMeLeu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Asn-Arg-NH₂ で表わされる〔For−Ｄ−Tyr¹,D−NMA²,C^aMeVal¹³,C^aMe
Ala¹⁹,Arg²¹,C^aMeLeu²²,Asn²⁸〕−hGRF（１−29）−NH₂
を、ベールらの米国特許第4,292,313号に概要が記載さ
れるように、ベックマン990ペプチド合成機を用いてMBH
A樹脂上で段階的方法により合成した。本ペプチドはTLC
およびHPLCを用いて実質的に純粋であることが判明し
た。

参考例33 次式： H-Tyr-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Ly
s-C^aMeVal-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-
Gln-Asp-Ile-Nle-Ser-Arg-NH₂ で表わされる〔NMA²,C^aMeVal¹³,Nle²⁷〕−hGRF（１−2
9）−NH₂を、ベールらの米国特許第4,292,313号に概要
が記載されるように、ベックマン990ペプチド合成機を
用いてMBHA樹脂上で段階的方法により合成した。本ペプ
チドはTLCおよびHPLCを用いて実質的に純粋であること
が判明した。本ペプチドを水に溶解し、1Nの酢酸を加え
ることによって酢酸塩を調製した。この溶液を凍結乾燥
して酢酸塩を得た。

参考例34 次式： H-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Arg-Ser-Tyr-Arg-
Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-C^aMeAla-Arg-Lys-C^aMeLe
u-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH₂ で表わされるhGRF類似体〔Ｄ−NMA²,Arg⁸,C^aMeAla¹⁹,C^a
MeLeu²².Nle²⁷〕−hGRF（１−32）−NH₂を、実施例１の
ようにMBHA樹脂上でベックマン990ペプチド合成機を用
いて段階的方法により合成した。本類似体はTLCおよびH
PLCを用いて実質的に純粋であることが判明した。

参考例35 次式： H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Lys-Ser-Tyr-Arg-Ar
g-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Arg-Leu-Leu-His-
GluYGwo-Nle-Asn-Arg-NH₂ で表わされる〔Lys⁸,Arg²¹,Nle²⁷，〕−rGRF（１−29）
−NH₂を、実施例１のようにMBHA樹脂上でベックマン990
ペプチド合成機を用いて段階的方法により合成した。本
ペプチドはTLCおよびHPLCを用いて実質的に純粋である
ことが判明した。

参考例36 次式： H-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-
Lys-C^aMeVal-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-C^aMeAla-Arg-Lys-C^a
MeLeu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Asn-Arg-NH₂ で表わされるhGRF類似体〔Ｄ−NMA²,C^aMeVal¹³,C^aMeAla
¹⁹,C^aMeLeu²²,Nle²⁷,Asn²⁸〕−hGRF（１−29）−NH
₂を、実施例１のようにMBHA樹脂上でベックマン990ペプ
チド合成機を用いて段階的方法により合成した。本ペプ
チドはTLCおよびHPLCを用いて実質的に純粋であること
が判明した。

参考例37 次式： H-Tyr-D-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-
Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-D-Lys-Leu-Leu-
Gln-Gln-Ile-Nle-Ser-Arg-NH₂ で表わされる〔Ｄ−Ala²,D−Lys²¹,Nle²⁷〕−hGRF（１
−29）−NH₂を、実施例１のようにMBHA樹脂上でベック
マン990ペプチド合成機を用いて段階的方法により合成
した。本ペプチドはTLCおよびHPLCを用いて実質的に純
粋であることが判明した。

参考例38 次式： H-Met-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Ar
g-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-C^aMeAla-Arg-Arg-Leu-Leu-
His-Glu-Ile-Nle-Asn-Arg-NH₂ で表わされる〔Met¹,C^aMeAla¹⁹,Arg²¹,Nle²⁷〕−rGRF
（１−29）−NH₂を、実施例１のようにMBHA樹脂上でベ
ックマン990ペプチド合成機を用いて段階的方法により
合成した。本ペプチドはTLCおよびHPLCを用いて実質的
に純粋であることが判明した。

参考例39 次式： H-pCl-Phe-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser−Ser-C^aM
eTyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-C^aMeAla-Arg-A
rg-Leu-Leu-His-Asp-Ile-Nle-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu
-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-Arg-Phe-Asn-OHで表わ
される〔pCl-Phe¹,D−NMA²,C^aMeTyr¹⁰,C^aMeAla¹⁹,Ar
g²¹,Nle²⁷〕−rGRF（１−43）−OHを、実施例３のよう
にクロルメチル化樹脂上でベックマン990ペプチド合成
機を用いて段階的方法により合成した。本ペプチドはTL
CおよびHPLCを用いて実質的に純粋であることが判明し
た。

実施例で調製した合成ペプチドは、インビトロ検定に
よって、合成hpGRF（１−40）−OHに比べて一般にGHの
分泌に対する影響が大きく本質的な活性は似ていること
が判明した。これらの合成ペプチドは全て生物学的に活
性であり、下垂体によるGHの分泌を効果的に刺激する有
用な化合物であると考えられる。

成長ホルモンの分泌を促進する代表的な合成ペプチド
の相対効力を決定するために、標品として合成hpGRF
（１−40）−OHを用いて等モル濃度の代表的な合成類似
体と並行比較することによりインビトロ検定を行った。
ここでは、試験の３から５日前に摘出したラット下垂体
細胞を含む培養物を使用した。比較試験のために成長ホ
ルモンの分泌が最適であると考えられる培養物を、ベー
ルらのEndocrinology，91,562-572（1972）に記載さ
れ、またベールらのEndocrinology，112,1553-1555（19
83）にさらに詳しく記載される一般的方法により使用し
た。試験する物質とのインキュベーションは３から４時
間行い、培地アリコートをとり出して、それらの免疫反
応性GH（irGH）の含有値を周知のラジオイムノアッセイ
で測定するための処理した。

等モル濃度の比較試験の結果を表１に示す。

成長ホルモン分泌のインビトロ試験の他に、合成ペプ
チドをウレタンで麻酔した雄ラットに静脈注射してイン
ビボ試験したところ、外因のGRFに対する反応は継続し
ながら自発的なGH分泌は抑えられることが判明した。血
液サンプルは注射前、注射後10分,30分,60分後直ちに採
取し、血液中のGHレベルをラジオイムノアッセイで測定
した。かかるインビボ試験によって、各々の合成ペプチ
ドはhpGRF（１−40）−OHに比べてはるかに生物学的効
力が大きいことが判明した。これらの合成ペプチドは、
静脈注射から30分および60分後の血液中の下垂体GHのレ
ベルによって示されるように、実質的な効果がより長く
持続する。GH分泌を検出するのに効果的なものとして知
られる他のGRFインビボ試験を、以上の結果を確認する
ために行った。GH分泌を促すのに効果的な上記ペプチド
の投与量は体重1kgあたり約500ナノグラムから約50ナノ
グラムであると考えられる。

この種の合成hGRF類似体およびおそらくrGRF類似体は
医師がGH産生を高めることを望むヒトへ適用すのに有用
であろう。この種の類似体によるGH分泌の刺激は、内因
性GRFの産生低下に起因する完全または相対的GH欠乏症
を有する患者を対象としている。さらに、増大したGH分
泌およびそれに伴う成長増加は正常のGHレベルを有する
ヒトまたは動物にも現われるであろう。また、投与は身
体の脂肪含量を変化させ、その他のGH依存性の代謝、免
疫および発生過程を変更させるであろう。例えば、これ
らの類似体は火傷を負ったような情況下にあるヒトの同
化過程を刺激する手段として有用でありうる。他の例と
してこれらの類似体は鶏、七面鳥、豚、ヤギ、牛および
羊のような商業用混血動物に、また魚や例えばウミガメ
やウナギのような冷血動物および両生類の養殖に、有効
量の本ペプチドを与えることにより成長をはやめ且つタ
ンパク質対脂肪の比を高めるために使用しうる。

ヒトに投与する場合、これらの合成ペプチドは少なく
とも約93％、好ましくは少なくとも98％の純度をもつべ
きである。本明細書において純度とは意図するペプチド
が存在する全てのペプチドおよびペプチドフラグメント
の表示重量％を占めることを意味する。この種の合成ペ
プチドを商業用または他の動物に成長促進および脂肪含
量低下の目的で投与する場合は、約５％程度の低い純
度、あるいは0.01％の純度でさえも許容しうるかも知れ
ない。これらの合成ペプチドまたはその無毒性塩は、医
薬組成物をつくるために薬学的または獣医学的に受容さ
れるキャリアーと混合されて、ヒトを含めた動物へ静脈
内、皮下、筋肉内、経皮的（例えば鼻腔内）、または経
口的にさえ投与することができる。投与は治療しようと
する受容者がこのような治療上の処置を必要とする場合
にGHの放出を刺激すべく医師により行われる。必要な投
与量は治療しようとするそれぞれの症状、その症状の程
度、および治療の持続時間により変化するであろう。

この種のペプチドは無毒性塩、例えば酸付加塩または
亜鉛や鉄などとの金属錯体（本明細書においては金属錯
体も塩として考える）の形でしばしば投与される。酸付
加塩の例は塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、マレイン酸塩、
酢酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、コハク酸塩、リンゴ
酸塩、アスコルビン酸塩、酒石酸塩などである。活性成
分を錠剤の形で経口的に投与する場合、錠剤はトラガカ
ント、トウモロコシでんぷんまたはゼラチンのような結
合剤；アルギン酸のような崩壊剤；およびステアリン酸
マグネシウムのような滑沢剤を含みうる。液体での投与
が望まれる場合は甘味料および／または風味料を使用す
ることができ、また等張塩水やリン酸緩衝液での静脈内
投与を行うこともできる。

本ペプチドは医師の指導のもとでヒトに投与されるべ
きであり、医薬組成物は通常薬学的に受容される慣用の
固体または液体キャリアーと共にペプチドを含むだろ
う。一般に、非経口投与量は受容者の体重1kgあたりペ
プチド約0.01〜約１μｇであるだろう。

本発明を本発明者が認める最もよい方法である好適実
施態様で説明したきたが、当分野での通常の知識を有す
る者に明らかないろいろな変更および修飾が特許請求の
範囲に記載する本発明の範囲から逸脱することなくされ
うることを理解すべきである。例えば、ペプチド鎖の修
飾、とりわけペプチドのカルボキシル末端から始まり大
体29位までの欠失は今までに知られた実験慣習に従って
行われ、それによりペプチドの生物学的効力の全てかま
さに本質的部分を保持するペプチドやペプチドフラグメ
ントがつくり出され、この種のペプチドも本発明の範囲
内に含まれると考えられる。さらに、両末端あるいはそ
のいずれかでの付加も行われ、かつ／またペプチド化学
の分野でよく知られるように自然界に存在する残基の代
わりにほぼ均等の残基を用いて、タンパク質の加水分解
に対して増強された抵抗性を有し、また本発明の範囲を
逸脱しない請求されたポリペプチドの効力の少なくとも
本質的部分を有する他の類似体を製造することができ
る。さらに現在の技術によってＣ末端の好ましいNH₂基
に対する修飾を起こってもよい。例えば、Ｃ末端のアミ
ノ酸残基のカルボキシル部分は−COOR,−CRO,−CONHNH
R,−CON（Ｒ）（Ｒ′）または−CH₂OR（ここでＲおよび
Ｒ′は低級アルキル、フルオロ低級アルキルまたは水素
である）とすることができる。このような修飾を行って
も合成ペプチドの効力は変わらないことから、かかる修
飾も本発明の範囲を逸脱するものではない。

本発明の様々な特徴は上述の特許請求の範囲において
強調される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ワイリー・ウォーカー・ヴェイル・ジュニアアメリカ合衆国カリフォルニア州92037, ラ・ホーラ，バルデズ 1643 (72)発明者カテリーヌ・ラウレ・リーベルアメリカ合衆国カリフォルニア州92037, ラ・ホーラ，ブラックゴールド・ロード 9674 (56)参考文献特開昭61−210099（ＪＰ，Ａ) 特開昭60−57000（ＪＰ，Ａ) 特開昭60−260595（ＪＰ，Ａ) 特開昭60−100596（ＪＰ，Ａ) 特開昭59−139347（ＪＰ，Ａ) 米国特許4626523（ＵＳ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C07K 14/60 ＣＡ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】次式：Ｎ^αＭ_eTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-R₈‐Ser-Tyr-Arg
-Lys-Val-Leu-R₁₅‐Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-R₂₁‐Leu-Leu
-Gln-Asp-Ile-Nle-R₂₈‐Arg-NH₂ （式中、Ｒ₈はAsn、LysまたはAspであり;R₁₅はGlyまた
はAlaであり;R₂₁はLysまたはＤ−Lysであり;R₂₈はAsnま
たはSerである；但し、次のうちの少なくとも１つが存
在する:R₈はLysであるか、Ｒ₈はAspであるか、またはＲ
₂₁はＤ−Lysである）で表されるペプチドまたはその無
毒性塩。
【請求項２】Ｒ₈がAspである、請求項１記載のペプチ
ド。
【請求項３】Ｒ₂₁がＤ−Lysである、請求項１記載のペ
プチド。
【請求項４】Ｒ₈がLysである、請求項１記載のペプチ
ド。
【請求項５】Ｒ₂₈がAsnである、請求項１から４のいず
れかに記載のペプチド。
【請求項６】次式：［Ｎ^αMeTyr¹,Asp⁸,Ala¹⁵,Nle²⁷,Asn²⁸］‐hGRF（１−2
9）‐NH₂：［Ｎ^αMeTyr¹,Lys⁸,Ala¹⁵,Nle²⁷,Asn²⁸］‐hGRF（１−2
9）‐NH₂；および［Ｎ^αMeTyr¹,D−Lys²¹,Nle²⁷］‐hGRF（１−29）‐NH₂ より選択される式を有する、請求項１記載のペプチド。