KR0185192B1

KR0185192B1 - 신규의 유전자 및 폴리펩티드의 무세포 합성 및 분리

Info

Publication number: KR0185192B1
Application number: KR1019920700769A
Authority: KR
Inventors: 글렌가와사끼
Original assignee: 제임스 더블유. 데이비; 옵타인 인코포레이티드
Priority date: 1989-10-05
Filing date: 1990-10-04
Publication date: 1999-04-01
Also published as: EP0494955A1; EP0494955A4; JP2001078787A; JP3127158B2; EP0494955B1; CA2067194C; US5658754A; DE69032483D1; KR100204360B1; WO1991005058A1; KR100204359B1; KR920703839A; AU638762B2; DE69032483T2; AU6537390A; ATE168416T1; DK0494955T3; JPH05503000A; ES2118066T3; US5643768A

Abstract

본 발명은 신규한 유전자 및 폴리펩티드의 무세포 분리 및 합성방법을 제공한다. 한 실시예에서, 세미-랜덤 뉴클레오티드 서열이 부착된 발현 유니트를 제조한다. 먼저 세미-랜덤 뉴클레오티드 서열을 전사하여 RNA를 생성시킨후, 폴리솜이 형성되는 조건하에서 번역된다. 관심물질에 결합된 폴리솜을 분해하여 유리된 mRNA을 회수한다. mRNA을 사용하여 cDNA를 제조하고 이를 발현하여 신규한 폴리펩티드를 제조한다.

Description

[발명의 명칭]

신규의 유전자 및 폴리펩티드의 무세포 합성 및 분리

[발명의 상세한 설명]

본 발명은 일반적으로 시험관내(in vitro)에서 신규 유전자 및 폴리펩티드의 합성 및 분리에 관한 것이며, 보다 구체적으로 말하자면 세미-랜덤 (semi-random) DNA 또는 RNA 서열을 생성 및 발현시키는 방법, 이들 서열로부터 신규의 유전자를 분리하는 방법, 및 이들 유전자를 사용하여 신규의 폴리펩티드를 생성하는 방법에 관한 것이다.

관심있는 서열을 얻기 위하여, 큰 개체군 및 유전학적으로 다양한 개체군의 세포를 스크린할 필요성에 의하여 세미-랜덤 서열로부터 신규의 유전자 및 폴리펩티드의 분리는 현재 제한받는다. 예를 들면, 10개 아미노산의 폴리펩티드 사슬(string)은 20¹⁰또는 약 10¹³의 순열이 가능하다. 이들 순열중 10개가 바람직한 특성(이를테면 특이항원에 결합하는 능력)이 있다면, 한가지의 바람직한 신규 유전자를 발견하려는 기대감속에서 그중 10¹²개의 개체군을 스크리닝해야 한다. 종래의 방법(미생물에 의한 신규 유전자 발현)을 통하여, 신규 유전자가 생물체의 구별할 수 있는 성장 또는 생존의 장점을 제공하지 못하면 특이한 특성을 지닌 다수의 새로운 예를 들면은 스크리닝을 실제 할 수 없다. 사실, 현 기술 상태하에 10¹²의 별개의 형질전환체를 각각 스크링닝하여 그것을 한가지 바람직한 신규 유전자에 각각 지정하여야 한다.

세포내에 위치한 신규 유전자 산물을 검출하는 현존 스크리닝 방법에서는 각 형질 전환세포로부터 유래된 콜로니를 파괴처리하여 세포를 개방시켜야 한다. 전형적으로 표준 페트리접시당 1000-2000 세균 콜로니가 스크리닝 방법을 위하여 분리된다(예, 클로로포름에 의하여). 따라서, 10¹²의 형질전환체된 유기체를 시험하기 위하여, 500,000-10억개의 페트리접시가 필요하다. 이에 더하여, 10,000-100,000 리터의 대수적으로 분할하는 세포가 다수의 형질전환성 세포를 생성하는데 필요할 수 있다.

다른 방법으로서, 유전자 산물이 분비되고 세포 외부에 부착되는 경우에, 형광화합물 또는 다른 표시자에 결합능을 이용하여 검출할 수 있다. 이 경우에, 신규의 바람직한 폴리펩티드 합성을 위하여 스크린하는데 세포 분류기가 이용될 수 있다. 그러나, 초당 5,000 세포의 유속에서조차, 세포 분류기는 10¹²의 세포를 스크린하는데 60년 이상 걸린다. 따라서, 현재 스크리닝 방법은 경비와 시간이 극도로 많이 소모되며, 세미-랜덤 서열로부터 신규 유전자 및 폴리펩티드의 분리를 오리려 상당히 방해한다.

상기에 간략히 논의된 방법에 더하여, Fields 와 Song(Nature 340：245-246, 1989)은 효모 GAL4 유전자의 영역을 이용함으로써 특이적으로 다른 폴리펩티드에 결합하는 폴리펩티드를 선택적으로 얻는 방법을 제안하였다. 그러나, 이 시스템은 심각한 제한이 있다. 첫째로, 폴리펩티드-폴리펩티드 결합만이 선택될 수 있으며; 폴리펩티드-비폴리펩티드 상호작용은 배제된다. 둘째로, 그 방법을 상업적 사용하기 위해서는 공지 폴리펩타이드 및 신규의 폴리펩티드 모두가 효모에서 적당히 높은 수준으로 그리고 천연의 형태로 발현되어야 한다. 셋째로, 글리코실화 폴리펩티드 또는 특이 변형된 폴리펩티드는 또한 본 방법에 의하여 제외될 수 있다. 네째로, 그들은 물리작용이 잘 확립된 폴리뉴레오티드를 사용했으나, 단지 조절 GAL4 활성의 4.5%만을 나타냈다는 사실에 기초하여, 랜덤 또는 세미-랜덤 서열이 작용할 수 있는지가 불분명하다. 다섯째, Fields와 Song은 매우 큰 서열을 사용하였다：633개 아미노산인 SNF1 단백질 및 322개 아미노산인 SNF4단백질, 이들은 상호작용하는 2차 구조를 포함한다. 여섯째, 심지어 10¹⁰다양한 세미-랜덤 서열에 그 방법을 적용함으로써 극히 많은 양의 DNA, 조절효소(modifying enzyme), 및 수용성(competent) 효모 세포가 필요하다.

이전에 알려진 방법과 반대로, 본 발명은 신규의 유전자 및 폴리펩티드의 무세포 스크리닝 방법을 기재하고 있다. 본 방법은 Fields와 Song에 의하여 기재된 방법의 한정뿐만 아니라 많은 수의 형질전환체와 관련한 문제점을 회피할 수 있고 수주내에 완성할 수 있다. 따라서, 이 방법으로 신규의 유전자 산물의 분리에 관계되는 상당한 시간과 비용이 절약된다.

[발명의 요약]

간략히 말하자면, 본 발명은 다수의 신규 유전자 및 폴리펩티드를 합성, 스크리닝 및 선택하는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 일반적으로 다음의 단계로 이루어진다. (a) RNA 폴리머라제 결합 서열, 리보솜 결합 서열, 및 번역개시 신호를 함유한 5' 미번역 영역으로 이루어진, mRNA를 생성할 수 있는 서열내(in vitro)발현 유니트를 제조하고; (b) 한가지 또는 그이상의 세미-랜덤 뉴클레오티드 서열을 발현유니트에 부착하며; (c) 발현 유니트와 관련한 서열 및 세미-랜덤 뉴클레오티드 서열을 전사 또는 복제하여 RNA를 생성하며; (d) 폴리솜을 유지하는 데 충분한 조건에서 그 RNA를 번역하여 폴리솜을 생성하며; (e) 그 폴리솜을 관심있는 물질에 결합하고; (f) 관심있는 물질에 결합하는 폴리솜을 분리하며; (g) 분리된 폴리솜을 분쇄하여 mRNA를 유리하며; (h) 유리된 mRNA로부터 cDNA를 회수, 제조하며; (i) 유전자를 발현시켜 신규의 폴리펩티드를 생성하는 단계.

상기에 기재된 방법의 일유형에서, RNA 또는 cDNA를 증폭함으로써 바람직한 서열을 위해 집적한 mRNA에 대하여 본 방법을 반복할 수 있다. 이이서, 바람직한 서열이 절단된 개체군의 상당 분율(10^-3)을 나타낼 때까지, 이와 같이 증폭된 유전자의 서브세트(subset)는 상기에 요약된 여러 단계를 순환하여 바람직한 신규 유전자에 대하여 추가로 집적할 수 있다. 주로, 유전자 개체군이 거의 균질일 때까지 본 방법을 반복할 수 있다.

본 발명의 제2일예에서 다음과 같은 단계로 이루어진 신규의 폴리펩티드 제조방법에 관한 것이다：(a) RNA 폴리머라제 결합 서열, 리보솜 결합 서열, 및 번역 개시 신호를 함유한 5' 미번역 영역으로 이루어진, mRNA를 생성할 수 있는 시험관내 발현 유니트를 제조하고; (b) 한가지 또는 그이상의 세미-랜덤 뉴클레오티드 서열을 발현 유니트에 부착하고; (c) 발현 유니트와 세미-랜덤 뉴클레오티드 서열과 관련한 서열을 전사하여 RNA를 생성하며; (d) 그 RNA를 번역하여 생물학적 활성인 폴리펩티드를 생성하고; (e) 생물학적으로 활성인 폴리펩티드를 코드화하는 RNA를 세분하고; (f) 관심있는 유전자가 분리되도록 단계 (c)-(e)에 제시된 바와 같이 전사하고, 번역하고, 세분하며; (g) 분리된 유전자로부터 cDNA를 제조한 다음; (h) cDNA를 발현시켜 신규의 폴리펩티드를 생성하는 단계

본 발명의 또 다른 일예에서, (a) RNA 폴리머라제 결합 서열, 리보솜 결합 서열, 및 번역 개시 신호를 함유한 5' 미번역 영역으로 이루어진, mRNA를 생성할 수 있는 시험관내 발현 유니트를 제조하고; (b) 한가지 또는 그이상의 세미-랜덤 뉴클레오시드 서열을 발현 유니트에 부착하고; (c) 발현 유니트와 세미-랜덤 서열과 관련한 서열을 복제하여 RNA를 생성하며; (d) 그 RNA를 번역하여 생물학적으로 활성인 폴리펩티드를 생성하며; (e) 생물학적으로 활성인 폴리펩티드를 코드화하는 RNA를 세분하고; (f) 관심있는 유전자가 분리되도록 단계 (d)-(e)에 제시된 바와 같이 번역하고 세분하며; (g) 분리된 유전자로부터 cDNA를 제조한 다음; (h) cDNA를 발현시켜 신규의 폴리펩티드를 생성하는 단계.

상기에 기재된 발현 유니트는 RNA 폴리머라제 결합 서열, 리보솜 결합 부위, 및 번역 개시 신호로 이루어진다. 발현 유니트는 추가로 번역 인핸서(enhancer) 또는 활성인자(activator) 서열, 선택 서열의 3' 꼬리부(tail) 및 적합한 제한 부위로 이루어질 수 있다. 세미-랜덤 DNA서열은 자연 발생 DNA를 기계적으로, 화학적으로, 또는 효소적으로 단편화함으로서, DNA를 화학적으로 합성함으로서, 또는 DNA를 직접 발현 유니트로 중합함으로서 제조할 수 있다. 관심있는 물질은 표면 항원, 수용체 단백질, 독소, 유기 중합체, 단백질 분자의 활성부위, 대사물질, 항체, 금속, 호르몬, 또는 다른 화합물일 수 있다.

이들 및 다른 일예는 다음의 상세한 내용을 참고할 때 명백해질 것이다.

본 발명은 신규 유전자 및 폴리펩티드의 분리를 목적으로 한다. 이들 신규 유전자는 실제 무한한 다양성을 가질 수 있으며 상업적으로 중요한 특성, 이들테면 신규의 촉매활성 또는 특정물질에 선택적으로 결합하는 능력을 가진 신규의 폴리펩티드를 코드화할 수 있다. 현존하는 유전자로부터 또는 화학적으로 합성된 DNA의 세미-랜덤 뉴클레오티드 서열로부터 개방 번역 프레임(open reading frame)으로 이루어진 신규 유전자를 제조할 수 있다. 그들은 현존하는 프로모터, 인핸서, 개시화 코돈, 플라스미드, 리보솜 결합부위, 및/또는 종료인자를 이용하여 광범위한 생물체에서 발현할 수 있다. 여러 가지 경우에, 대규모의 제조방법의 일부로서 시험관내 신규 유전자를 발현하는 것이 바람직할 수 있다.

상기에 제시된 바와 같이, 본 발명은 특이 결합 및/또는 생물학적 활성을 가진 신규 폴리펩티드를 코드화하는 신규 유전자 및 유전자 단편을 제조하고 분리하기 위한 다단계 방법을 기재한다. 바람직한 유형으로서, 본 방법은 다음 단계로 이루어진다：

1. RNA 폴리머라제 결합 서열(즉, 프로모터 또는 RNA-지시 RNA 폴리머라제 개시 부위), 리보솜 결합부위, 및 번역 개시 신호를 함유한 발현 유니트가 제조된다. 발현 유니트는 또한 적합한 제한부위, 번역 서열은서 또는 활성인자서열, 및 선택된 서열의 3' 꼬리부를 함유할 수 있다.

2. 그후 세미-랜덤 DNA 또는 RNA 서열은 자연발생 DNA, RNA 또는 cDNA서열을 기계적으로, 화학적으로, 또는 효소적으로 단편화시킴으로서, 또는 뉴클레오티드를 화학적으로 합성하여 생성된다. 그후 발현 유니트에 세미-랜덤 DNA 또는 RNA 서열을 삽입한다. 다른 방도로서, 세미-랜덤 서열을 발현 유니트로 직접 중합될 수 있다. 10¹²또는 그이상의 서로 다른 서열의 라이브러리가 그후 생성될 수 있다.

3. 그후 신규 유전자는 시험관내에서 전사되어 최초 DNA라이브러리의 RNA복사체(copy)의 풀(pool)을 생성한다. RNA-지시 RNA 폴리머라제 서열이 포함된다면, 그 후 이들 레플리카제(replicase)는 RNA를 증폭하는데 사용될 수 있다.

4. RNA(mRNA)를 시험관내에서 번역시켜 폴리솜을 생성한다. 폴리솜(RNA-리보솜-발생 폴리펩티드 복합체)을 유지시키는 조건은 필요로 한 폴리펩티드와 mRNA를 함께 유지하는데 이용된다.

5. 그후 폴리솜을 관심있는 물질, 이를테면 항원, 수용체 단백질, 독소, 유기 중합체, 항체, 대사물질, 호르몬, 및 단백질 분자의 활성부위에 결합시키거나, 또는 생물활성을 나타내도록 한다.

6. 관심있는 물질에 결합하는 폴리솜은 실제 미결합 폴리솜의 제거에 의하여 집적된다. 폴리솜 복합체를 유지하는 조건하에 연속 또는 병류 세척은 필요로한 mRNA의 빈도를 증가시키며, mRNA는 폴리솜 구조를 통하여 관심있는 물질에 부착된 상태를 유지시킨다.

7. 결합/활성 폴리솜은 그후 분쇄되어 폴리솜 복합체로부터 mRNA를 유리한다.

8. 그후 cDNA복사체를 만들거나 RNA-지시 RNA 폴리머라제로 RNA를 직접 증폭함으로써 희귀 mRNA를 회수한다. DNA폴리머라제 및/또는 역전사효소 반응으로 cDNA를 증폭함으로써 적게 존재하는 메시지의 회수를 대단히 용이하게 한다.

9. 그후 얻어진 cDNA를 발현시켜 폴리펩티드를 생성한다.

대부분의 일예에서, 3-8단계의 반복은 폴리솜의 비특이 결합에 비해 특히 결합 단백질의 빈도를 추가로 증가시키는데 보다 바람직하다.

본명세서에 기재된 방법에 의하여 생성, 분리, 정제된 신규 유전자는 유전자가 필요로한 생성물을 코드화하는 긍정적 증거로서 표준 발현기술을 이용하여 관심있는 다양한 폴리펩티드를 생성할 수 있다. 이에 더하여, 종래의 방법에 의하여 서열이 밝혀진 DNA및/또는 폴리펩티드도 신규 폴리펩티드의 조성을 확인하는데 이용될 수 있다.

일단 신규 유전자에 의하여 코드화된 폴리펩티드가 분리되고 확인되면, 신규 폴리펩티드의 대규모 생산은 화학적 합성에 의하여(아미노산 서열이 비교적 짧다면) 또는 유전공학의 미생물을 이용하여 재조합 DNA법을 통하여 성취될 수 있다. 다른 방도로서, 대규모의 시험관내 전사 및/또는 번역 방법을 사용하여 상업적인 양의 폴리펩티드를 생성할 수 있다.

선택된 폴리펩티드를 코드화하는 DNA서열을 보다 큰 유전자로(즉, 항체 유전자의 과도가변성 영역으로) 도입하여 다른 결합 및 생물 활성에 더하여 최초 분리된 신규 분리된티드의 특이 결합 및/또는 생물 활성을 가진 하이브리드 단백질을 생성할 수 있다.

I. 발현 유니트

발현 유니트는 5'미번역 영역으로 이루어지며 추가로 3'영역으로 이루어질 수 있다. 발현 유니트의 5'미번역 영역은 프로모터 또는 RNA 폴리머라제 서열, 리보솜 결합 서열, 및 번역 개시 신호를 함유한다, 5'미번역 영역(머리부)은 또한 적합한 제한부위 및 번역 인핸서 또는 활성인자서열을 포함할 수 있다. 3'영역은 적합한 제한 부위 및 선택된 서열의 3'꼬리부를 포함할 수 있다. 본 기술에 숙련된 자에게 잘 알려져 있는 프로토콜에 의하여 발현 유니트를 화학적으로 합성할 수 있다. 다른 방도로서, 이들 성분은 한가지 또는 그 이상의 플라스미드에 혼입되고, 미생물에서 증폭되며, 표준 방법에 의하여 정제되며, 발현 유니트로 결합되기 전에 제한 효소를 가진 적합한 단편으로 절단될 수 있다.

5'미번역 영역은 프로모터 또는 RNA 폴리머라제 결합 서열을 함유한다. 고효율의 프로모터, 이를테면 T7, T3, 또는 SP6 RNA 폴리머라제에 대하 것들은 다음의 이유로 본 발명에서 바람직하다. 이러한 프로모터는 공지 조성물의 짧은 DNA서열이며, 그들의 관련 폴리머라제에 대하여 특이성과 활성이 크므로, DNA주형 당 50회 이상의 전사를 허용한다. 이에 더하여, T7, T3, 및 SP6 폴리머라제는 많은 분리된로부터 상용될 수 있으며 잘 특정된 전사 키트의 성분이다. T7 프로모터에 대하여, 공통서열은 TAATACGACTCACTATAGGGAGA (23개 염기 쌍)이다. 이러한 서열이 본 발명의 바람직한 유형과 관련하여 기재되어 있지만, T7 RNA 폴리머라제에 대하여 작용할 관련 DNA서열이 이용될 수 있다는 것이 명백할 것이며, 다른 서열은 다른 RNA 폴리머라제에 대하여 적합할 것이다. 어떠한 유형에서 두개의 프로모터, 이를테면 T7 및 SP6 프로모터 두가지 모두를 이용하는 것이 바람직하다.

지정된 하류의 또는 그 이내의 프로모터 영역은 리보솜 결합 부위를 코드화하는 DNA서열이다. 이러한 리보솜 결합부위는 원핵 번역 방법이 이용된다면 원핵 리보솜 복합체(리보솜 RNA를 포함)에 대하여 특이적일 수 있다. 그러나, 본 발명의 바람직한 유형은 진핵 서열 및 시험관내 진핵 번역 시스템, 이를테면 토끼 망상적혈구 시스템(Krawetz 외, Can. J. Biochem. Cell. Biol 61：274-287, 1983; Merrick, Meth. Enzymol. 101：38, 1983)을 이용한다. 공통 번역 개시코돈, GCCGCCACCATGG, 그외에 다른 기능적으로 관련된 서열이 척추동물 mRNA에 대하여 성취된 바 있다(Kozak, Nucleic Acids Res. 15：8125-8148, 1987). 이러한 서열 또는 관련 서열은 신규 유전자 제조에 이용되어 시험관내 단백질 합성을 지시할 수 있다. 이러한 개시 서열에서 ATG 삼중항은 메티오닌에 대한 번역 개시코돈이며; 이 지점에서 시험관내 단백질 합성이 시작된다고 예상된다.

프로모터 및 번역 개시부위사이에 다른 공지의 서열, 이를테면 번역 인핸서 또는활성인자 서열을 위치시키는 것이 바람직하다. 예를 들어, Jobling 외 (Nucleic Acids Res. 16：4483-4498, 1988)는 담배 모자이크 비루스로부터 미번역 리더 서열가 SP6-발생 mRNA에서 번역을 상당히 자극했다는 것을 보여주었다. 그들은 또한 알팔파 모자이크 비루스 RNA 4의 36-뉴클레오티드 5' 미번역 영역은 맥 아밀라제 및 사람의 인터루킨 mRNA의 번역 효율을 증가시킨다고 보고하였다(Jobling 과 Gehrke, Nature 325：622-625, 1987). 흑색 투구풍뎅이 비루스(Nodavirus) RNA 2 (Friesen 및 Rueckert, J. Virol. 37：376-886, 1981), 순무모자이크 비루스, 및 참새귀리속(brome) 모자이크 비루스 코트(coat) 단백질 mRNA(Zagorski 외, Biochimie 65：127-133, 1983)는 또한 높은 효율로 번역한다. 비교하여, 어떠한 미번역 리더는 SP6 RNA의 발현을 심각히 감소시킨다.(Jobling 외, ibid., 1988).

적합한 제한부위가 또한 발현 유니트에 포함되어 미래의 유전공학에 도움이 될 수 있다. 예를 들어, 육중항, CCATGG는 제한 효소, NcoI에 대한 인식 서열이다. 리보솜 결합부위의 하류에 위치한 NcoI 절단부위는 뒤이은 유전공학을 위한 적합한 접합 지점이다. 따라서, 필요로 한 신규 유전자의 정제후에 발현 유니트는 이 부위에서 신규 유전자로부터 접합될 수 있으며, 또 다른 프로모터는 신규 폴리펩티드의 생체내 및 대규모 제조에서 발현을 위하여 부착될 수 있다. NcoI 부위는 또한 하이브리드 단백질의 제조를 위한 적합한 클로닝 부위로서 사용될 수 있으며, 두개의 서로 다른 폴리펩티드 영역은 다같이 합쳐서 단일 단백질로서 발현된다.

이에 더하여, 5' 미번역 영역에 신규 유전자를 플라스미드로 후속 클로닝을 위한 적어도 한가지의 제한 효소 부위가 있는 DNA서열을 포함하는 것이 거의 유용하다. 옥타머 서열, GCGGCCGGC가 NotI 뉴클리아제에 의하여 인식되며 그것이 거의 유전자의 신규 코딩 영역내에 속하므로 특히 유용하다(NotI는 65,536 염기쌍마다 1회로 전체 랜덤 DNA를 절단한다 예상된다). 다른 제한부위가 또한 이용될 수 있으며; 신규 코딩영역을 절단하는 예상 빈도는 뉴클레오티드 조성 또는 DNA원에 의존한다. 어떤 회문식 서열은 번역을 방해할 수 있으며; 그러나, 어떠한 서열은 또한 번역율을 증가시킬 수 있다고 알려져 있다.

발현 유니트는 또한 3'영역으로 이루어질 수 있다. 적어도 두가지 이유 때문에 회문식 서열로서 공지의 3'영역(꼬리부)을 제조하는 것이 바람직하다. 첫째, 3' 제한부위는 폴리펩티드 코딩 영역의 후기 유전공학에 적합하다. 예를 들어, NotI 부위가 5' 및 3' 영역 두가지 모두에 위치한다면, 바람직한 폴리펩티드 코딩 서열은 추가 클로닝을 위한 NotI 점착 꼬리부로서 절단될 수 있다. 둘째, 회문형은 전위를 방해하는 2차 구조를 야기시킬 수 있으며, 따라서, 3' 영역에서 회문형은 번역중 리보솜의 이동을 느리게할 수 있다. 이와 같은 제2특성은 mRNA 쇠퇴로부터 리보솜을 방지하며 따라서 시험관내 번역단계에서 폴리솜의 수를 증가시키는 것에 대하여 바람직하다. 3' 영역은 또한 보충 단독중합체 서열로 하이브리드화에 의한 시험관내 번역 반응에서 다른 성분으로부터 mRNA의 후정제를 위한 폴리-A 또는 다른 폴리뉴클레오티드 사슬을 함유할 수 있다.

이에 더하여, 다른 비랜덤 서열이 발현 유니트에 도입될 수 있다. 한 유형으로서, 발현된 폴리펩티드는 비랜덤 및 세미-랜덤 아미노산 서열 두가지 모두를 함유한다. 코딩 영역의 비랜덤 성분이 합성되며 비랜덤 5' 미번역 영역 및/또는 3' 영역으로서 생성된다. 이러한 비랜덤 코딩 서열은 수십억개의 신규 폴리펩티드 가운데 보존되는 아미노산(인식 또는 ID 펩티드)의 서열을 특정화한다. ID 펩티드는 신규 폴리펩티드의 양을 정량화하는데 그리고 신규 폴리펩티드의 정제를 위하여 유용하다(ID 펩티드에 대한 항체가 이용가능하도록 제공되며 또는 생성될 수 있음). 한가지 실예는 11개 아미노산 물질 P이며, 이는 융합 펩티드로서 다른 폴리펩티드에 부착될 수 있다. 안티-물질 P항체는 물질 P를 함유한 융합 단백질을 검출하고 정량화하는데 상용될 수 있다. 또 다른 실예는 8개 아미노산 표시자 펩티드, Flag이다(Hopp외, Bio/Technology 6：1204-1210, 1988).

아미노-말단 ID 펩티드는 카르복시-말단 ID 펩티드에 대하여 적어도 두가지두가지 갖고 있다. 첫째, 세미-랜덤 DNA 또는 RNA의 긴 사슬이 C-말단 ID에 대한 세가지 번역 프레임 모두에서 종료될 경향이 있으므로, N-말단 ID의 적합한 번역 프레임을 유지하는 유전자 두가지물을 만드는 것이 보다 용이하다. 둘째, N-말단 ID는 단일 펩티드로서 형질전환체에서 작용하도록 의도될 수 있으며, 대규모 제조중에 신규 폴리펩티드의 가능한 분비를 허용한다.

그럼에도 불구하고, C-말단 ID 폴리펩티드를 또한 사용할 수 있다. 한가지 바람직한 C-말단 폴리펩티드는 폴리글리신이며, 이는 폴리-dG에 의하여 코드화되며 세미-랜덤 서열의 번역 프레임에 관계없이 Gly-Gly-Gly, 등으로 번역된다. 폴리펩티드의 폴리글리신 3' 꼬리부는 발생기 펩티드의 비간섭 사슬로서 작용할 수 있으며 세미-랜덤 서열을 보다 많이 첨가시켜 관심있는 분자를 결합한다. 이에 더하여, 폴리-dG 서열은 cDNA의 제2사슬 합성을 프라이밍하는데 사용될 수 있으며 폴리 C 또는 폴리-dC 로서 RNA 또는 DNA의 정제에 유용할 수 있다. 다른 반복 서열, 이를테면 GGGCGGGC…는 모든 번역 프레임에서 발현되는 인식 펩티드 서열을 코드화하는데 사용될 수 있다. ID 펩티드의 바람직한 형태는 단순한 화학적 또는 효소적 수단에 의하여 신규 폴리펩티드로부터 절단할 수 있는 것이다.

DNA발현 유니트에 더하여, 세미-랜덤 폴리펩티드 합성을 위하여 RNA 발현 유니트도 제조할 수 있다. RNA 발현 유니트의 한가지 가능한 장점은 폴리솜 mRNA의 회수가 초기 cDNA단계를 필요로 하지 않는다는 것이다. 대신에, 필요로한 서열을 가진 mRNA는 RNA-지시 RNA 폴리머라제, 이를테면 QB(Q 베타) 레플리카제의 것(Haruna와 Spiegelman, Proc. Nat. Acad. Sci. 54：579-587, 1965)으로 증폭될 수 있다. 이러한 효소는 30분에 두가지 RNA 의 십억개 복사체를 만들 수 있다(Lizardi 외, Bio/Technology 6：1197-1202, 1988). 재조합 RNA의 증폭을 위한 한가지 적합한 클로닝 방법이 Lizardi 외(ibid., 1988)에 상술되어 있다. 본 발명의 목적을 위하여, 다른 성분, 이를테면 제한부위, 인핸서, 및 ID 서열이 QB RNA 주형을 생성하는 DNA플라스미드에 첨가될 수 있다. 세미-랜덤 코딩 서열이 표준 DNA방법에 의하여 이들 플라스미드에 삽입될 수 있다. QB 레플리카제 주형이 전사될 때(예를 들어, T7 RNA 폴리머라제에 의하여), 세미-랜덤 유전자 서열을 함유한, 시험관내 복제를 수행할 수 있는 RNA 라이브러리가 생성될 수 있다. 다른 방도로서, 유사한 RNA 발현 유니트가 적합한 RNA 분자를 화학적으로 합성하고 단일-사슬 RNA 및/또는 단일-사슬 DNA를 다같이 연결하는 RNA 리가제, 이를테면 T4 RNA 리가제(상용됨)에 의하여 그들을 접합시킴으로서 제조될 수 있다.

II. 세미-랜덤 뉴클레오티드 서열

DNA 또는 RNA의 세미-랜덤 서열을 발현 유니트에 부착한다. RNA 발현 유니트 및 세미-랜덤 서열이 DNA주형로부터 발생될 수 있으며 또는 DNA발현 유니트와 훨씬 동일한 방식으로 화학적으로 합성된 RNA 또는 mRNA 단편으로부터 제조될 수 있으므로, 다음의 기술은 단지 발현 유니트에 세미-랜덤 DNA부착을 위한 방법을 기재하고 있다. 본 기술에 숙련된 자들은 쉽게 세미-랜덤 폴리뉴클레오티드에 부착된 발현 유니트의 RNA-두가지물을 제조할 수 있다.

세미-랜덤 DNA를 적어도 세가지 방법으로 발생시킬 수 있다. 첫째, 실제 어떠한 생물체로부터 자연 발생 DNA를 기계적으로, 화학적으로, 또는 효소적으로 단편화한 다음 DNA리가제로서 5'미번역 영역에 부착할 수 있다. 서로 다른 DNA원으로부터의 단편 혼합물을 사용할 수 있다. 활성이 분자의 극대 C-말단에 존재하지 않는다면, 최종 결과는 활성 개방 번역 프레임--넌센스(또는 정지) 코돈이 없는 단백질의 일부(단편)의 선택적 발현일 수 있다. 본 발명의 한가지 일예에서, 알려진 기능을 코드화하는 유전자가 단편화될 수 있으며; 얻어진 조각은 5' 미번역영역에 접합되며 후에 폴리솜 시험에서 활성 발현을 위하여 스크린된다. 생물 활성을 제공하는 가장 작은 유전자 단편을 시험함으로서, 단백질 영역에 대하여 분석될 수 있다. 유전자 단편분석은 작은 생물학적 활성 펩티드 및 하이브리드 치료 단백질을 생성하는데 유용하며, 보다 작은 크기가 표적 부위에서 펩티드에 도움이 된다면, 약물 전달에 이점이 있다.

본 발명의 또다른 유형에서, 단편화 DNA는 cDNA라이브러리로부터 세미-두가지 크기의 cDNA분자일 수 있다. 시험관내에서 cDNA를 발현 및 폴리솜 선택을 이용함으로서, 폴리솜을 항체, 수용체 단백질, 또는 다른 진단 분자에 결합을 통하여 매우 희귀한 부분 또는 아마도 고른 완전 크기 유전자가 분리될 수 있다. 본 발명에서 기재된 cDNA 단편의 무세포 발현은 바람직한 cDNA클론을 지정화하는데 이전에 기재된 방법보다 감도가 상당히 클 수 있다.

세미-랜덤 DNA를 생성하는 제2방법은 DNA를 화학적으로 합성하는 것이다. 예를 들어, 약 100개 뉴클레오티드의 비교적 긴 DNA분자가 각 위치에서 뉴클레오티드 두가지로서 합성될 수 있다. 그러나, 넌센스 코돈이 화학적으로 합성된 DNA에 존재할 수 있다는 통계적인 문제가 야기된다. 상기에 기재된 유전자 단편 및 cDNA방법에 대하여, 활성, 개방 번역 프레임이 현존 단백질 서열내에 위치한다. 개방 번역 프레임은 정지 코돈이 존재하지 않는다는 것을 의미하여 때로 단백질 코딩 영역내에 서열을 표시한다.

그러나, 모든 위치에서 모든 20개 일반 아미노산을 코드화하는 충반한 다양성을 가진 화학적으로 합성된 DNA가 반드시 개방 번역 프레임을 가지고 있지는 않다고 알려져 있다. 정지 코돈 -- TAA, TAG, 및 TGA는 64개의 가능한 DNA삼중항중의 세개를 나타낸다. 완전히 랜덤한 DNA에 대하여, 각 위치에서 어떠한 4개 뉴클레오티드가 같은 확률로서, 넌센스 코돈의 확률은 3/64=4/6875%이다. 30개 아미노산의 사슬을 코드화하는 랜덤 DNA 스트레치에 대하여, 그 사슬내에 적어도 한가지 정지코돈이 존재할 확률은 약 75%이다. 정지 코돈은 번역을 종료시키며 리보솜 복합체에서 발생기 폴리펩티드를 유리시킨다. 따가서, 넌센스 코돈의 빈도를 감소시키며 단백질 번역중 넌센스 코돈의 통상적 결과를 무시하는 방법이 바람직하며, 이에 대해서 다음에 논의된다.

보다 구체적으로 말하자면, A, T, C, 및 G 염기 조성은 어떤 코돈에 유리하고 특히 넌센스 코돈의 확률을 감소하도록 처리할 수 있다. 극단의 경우에, 각 삼중항 코돈의 세번째가 단지 C와 T로서 합성되어 이론적으로 넌센스 코돈을 회피할 수 있다. 그러나, 이러한 경우에 20개 아미노산 모두가 코드화되지 않는다. Lim 과 Sauer(Nature 339：31-36, 1989)는 첫번째의 두개 코돈 위치에서 4개 염기 모두의 동일 두가지 및 람다 억제인자의 신규 영역을 합성하는데 세번째 코돈 위치에서 C와 G의 동일 두가지을 사용한 바 있다. 이러한 조합은 각 코돈에서 20개 아미노산 모두를 준비하며 넌센스코돈 빈도를 1/32=3.125%로 감소시킨다. 그러나, 30개 아미노산의 사슬에서 적어도 한개의 TAG 정지 코돈의 확률은 약 61%이다.

본 발명의 바람직한 유형에서, 염기의 비균일 혼합물이 세개의 코돈 위치 모두에 사용되어 정지 코돈의 빈도를 감소시키며, 반면에 모든 코돈에서 20개 모두의 아미노산의 높은 빈도를 허용한다. 제1코돈 위치에서 C, A, 및 G의 동일 몰량이 사용되나, 단지 반양의 T가 사용된다. 제2코돈에서 A의 양은 다른 세가지 염기의 수준의 반으로 감소된다. 제3코돈 위치에서 단지 G와 C 또는 G와 두가지 게다가 동일 몰량으로 사용된다. 이러한 방법의 결과는 정지 코돈이 30개 아미노산의 사슬에서 존재하지 않을 79% 확률보다 크다. 각 아미노산의 비율은 전체 랜덤 DNA방법에 비하여 이 경우에 약간 변형된다. 그러나, 랜덤 상황과 비교하여 단지 티로신이 예상된 빈도의 반이하에서 표시될 것이다.

화학적으로 합성된 DNA를 사용할 때 넌센스 코돈의 존재를 극복하기 위한 또다른 방법으로, 시험관내 번역단계에 넌센스 서프레서 tRNA가 사용되는 것이 바람직하다. 특히, 상기에 기재된 방법이 거의 모든 TAG 정지 삼중항을 제거하며, 티로신 코돈이 각 코돈위치에서 염기의 비균일 두가지의 결과로서 불충분하게 표시되므로, TAG(실제 mRNA에서 UAG)를 인식하고 티로신을 성장 폴리텝티드 사슬로 삽입하는 넌센스 서프레서인자가 가장 바람직하다. 이러한 티로신-삽입 넌센스 서프레서인자는 티로실-tRNA의 안티코돈 영역을 티로실-tRNA가 현재 mRNA에서 정상의 UAU 및 UAC 티로신 코돈 대신에 UAG를 번역하는 방식으로 변화시킴으로서 발생될 수 있다. 정상의 티로실-tRNA는 또한 번역 단계에 포함되어 티로신 코돈을 번역할 것이다. 두개의 다른 넌센스 코돈을 위한 넌센스 서프레서인자도 또한 만들 수 있다. 실예로서, UGA 정지 코돈의 트립토판- 또는 로이신-삽입 억제인자는 많은 다른 넌센스 서프레서인자를 가짐이 특징이다. 많은 넌센스 서프레서인자의 뉴클레오티드 서열이 알려져 있으며; 따라서, 이러한 분자의 제조는 본 기술에 숙련된 자에게 명백하다.

포유류 번역 시스템의 넌센스 서프레서인자가 알려져 있다(Burke 와 Mogg, Nucleic Acids Res. 13：1317-1326, 1985; Capone 외, EMBO J. 4：두가지-221, 1985; Diamond 외, Cell 25：497-506, 1981; Hudziak 외, Cell 31：137-146, 1982; Laski 외, EMBO J. 3：2445-2452, 1984). 추가로, 효모로부터 티로신-삽입 UAG 억제인자 tRNA를 비롯하여 억제인자 tRNA의 사용함으로써 진핵의 시험관내 번역 시스템에서 넌센스 코돈의 번역이 가능하다고 다른 연구자들이 제시한 바 있다. (Capeechi 외, Cell 6：269-277, 1975; Gesteland 외, Cell 7：381-390, 1976). 이러한 효모 억제인자에 의한 UGA 정지 코돈의 완전 번역은 시험관내에서 70% 정도로 높게 보고된 바 있다 (Pelham, Nature 272：469-471, 1978). Geller와 Rich(Nature 283：41-46, 1980)는 효모 억제인자 tRNA와 세균 서프레서 tRNA 및 tRNA 합성효소가 있는 망상적혈구 시스템에서 넌센스 코돈을 성공적으로 억제시킨바 있다. 따라서, 본 발명에서 번역 단계중 리보솜으로부터 폴리펩티드의 조숙한 유리를 감소시키는 tRNA 억제인자의 사용은 본 기술 범위에 속한다. 또한, Pelham (ibid., 1978) 및 Geller 과 Rich(ibid., 1980) 둘다 진핵 번역 시스템에서 자연 발생 넌센스 억제가 높은 수준으로 발생하고 있다고 기재하고 있다. 특히, Pelham은 담배 모자이크 비루스에서 특정 UAG 코돈이 초과 최적 농도의 Mg⁺², 또는 보고된 2.1mM의 MgCl₂에 의하여 거의 40% 배나 번역(억제)될 수 있다는 것을 보여주고 있다. 따라서 본 발명에서 이러한 수준 또는 그이상의 마그네슘 이온을 사용하여 넌센스 코돈의 완전 번역을 증가시킴으로써 보다 긴 세미-랜덤 뉴클레오티드 서열의 번역 종료 문제점을 감소시킬 수 있다.

화학적 수단에 의한 세미-랜덤 DNA를 제조시키는데 있어서, 선택된 코돈 위치에서 서로 다른 염기의 혼합물은 특정 아미노산에 유리하거나 불리하게 편향시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 코돈의 3 위치에서 G의 제거는 메티오닌과 트립토판이 펩티드에 포함되는 것을 방지한다. 또다른 일예로서, 고-시스테인 함유량으로 치우친 뉴클레오티드 혼합물은 구조 강성을 위한 내부 이황화 결합이 있는 짧은 펩티드를 생성하는데 바람직하다. 이러한 강성 펩티드는 다른 분자를 보다 치밀하게 결합할 수 있다.

이들 합성 뉴클레오티드의 제2사슬 합성은 랜덤 프라이밍과 DNA폴리머라제에 의한 확장에 의하여 및/또는 폴리-서로 다른'와 프라임하는 것으로부터 폴리-dX 꼬리를 포함함으로서 성취할 수 있다. 다른 방법, 이를테면 자기-프라이밍(selfpriming)을 위하여 머리핀 루프를 생성하는 말단 회문형도 제2사슬 합성에 이용될 수 있다. 100개 뉴클레오티드의 이중-사슬 DNA100μg은 약 10¹⁵의 분자를 함유한다. 세미-랜덤 합성법이 이용된다면, 이들 분자 각각은 서로 다른 폴리펩티드를 코드화한다는 것이 예상된다. 따라서, 코딩가능성이 매우 크게 다양할 수 있음은 DNA의 실험실 벤치 규모량 이내에 존재한다. 100개 뉴클레오티드의 이러한 합성 DNA분자는 단지 예시 목적으로 제공되며; 보다 긴 서열이 또한 합성될 수 있다. 이에 더하여, 보다 짧은 분자를 합성하여 접합하여 일정 길이의 세미-랜덤 서열을 만들수 있다. 보다 짧은 분자는 화학적으로 합성된 염기의 매번 첨가가 100%가 되지 않으므로, 보다 긴 분자보다 양호하게 합성 DNA의 번역 프레임을 보존하는 것으로 예상된다. 따라서, 보다 짧은 합성DNA분자를 사용함으로써 보다 많은 넌센스 코돈을 방지할 수 있다. 짧은 단일-사슬 DNA를 연결하는 데 T4 RNA 리가제 또는 다른 수단을 이용할 수 있다.

세미-랜덤 DNA를 발생시키는 제3의 방법은 직접 5' 미번역 영역의 3' 꼬리부에 분자를 중합시키는 것이다. N-말단 ID 서열이 사용되지 않는다면, 척추동물의 공통개시부위 및 NcoI 부위 모두를 보존하는 ATG 개시 서열뒤에 바로 또는 바람직하게는 ATGG 서열뒤에서 중합반응을 시작할 수 있다. 이러한 중합반응에 가장 일반적으로 사용되는 효소는 말단 트랜스퍼라제(통상적으로 송아지 흉선으로부터)이며, 이는 DNA클로닝의 호모폴리머영역을 발생하는데 일반적으로 사용된다. 그러나, 서로 다른 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트를 혼합함으로서, DNA의 세미-랜덤 헤테로 중합체를 유리 3'-OH로서 DNA프라이머에 합성할 수 있다. 다시, A, T, C, 및 G 염기 조성물을 처리하여 어떠한 코돈에 유리하며 4개의 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트의 상대농도를 조절함으로서 넌센스 코돈의 빈도를 감소시킬 수 있다. 특히, 소량의 dATP는 넌센스 코돈(TAA, TAG, 및 TGA)의 빈도를 감소시킨다. E. coli DNA폴리머라제 I은 DNA의 비-주형(새로운)합성을 수행한다고 보고되어 있으며 말단 트랜스퍼라제 대신에 사용될 수 있다(A. Kornberg. DNAReplication, W.H.Freeman Co., San Francisco, Calif, 1980). 또다른 효소적 또는 화학적 방법은 발현 유니트에 바로 DNA를 중합시킬 수 있다. 랜덤 프라이머 확장에 의하여 제2사슬의 합성이 가장 용이하나, 다른 방법도 동일한 결과를 얻을 수 있다. 다시, 넌센스 서프레서(nonsense suppressor) tRNA의 이용은 이러한 세미-랜덤 DNA서열에서 정지 코돈의 문제점을 극복하는데 크게 도움이 될 수 있다.

III. 신규 유전자의 전사

DNA발현 유니트가 세미-랜덤 서열과 함께 사용된다면, RNA 폴리머라제로서 mRNA를 쉽게 생성할 수 있다. 상기에 논의된 바와 같이, T7, T3, 및 SP6 RNA 폴리머라제가 사용될 수 있으며 매우 활성이 크다. 실예로서, T7 프로모터가 있는 DNA발현 유니트가 제조업체의 사양에 따라 T7 RNA 폴리머라제로서 처리된다. 일반적으로 30분에 각 DNA분자에 대하여 약 50개 mRNA 복사체가 합성될 수 있다. RN아제 없는 DN아제로서 DNA를 분해할 수 있다. 최초 DNA라이브러리가 10¹²분자의 서열 다양성을 갖고 있다면, 얻어진 mRNA 풀은 동일 수준의 다양성을 반영하나 현재 각각의 서로 다른 DNA분자의 50 또는 그이상의 RNA 복사체를 함유한다. RNA 라이브러리 6μg은 각각 30개 아미노산의 세미-랜덤 폴리펩티드를 발현할 수 있는 10¹²개의 서로 다른 mRNA 의 50 복사체를 함유할 수 있다. 6μg은 작은 시험관에서 쉽게 다룰 수 있으므로, 표준 실험실 기구 및 관들이 이용될 수 있다.

진행 시스템에서 효율적인 번역을 위하여 mRNA의 5' 꼬리부를 디구아노신 트리포스페이트 캡(cap)(또는 동족체)을 첨가함으로써 번형시킬 필요가 있다. 5' 캡 mRNA는 시험관내 전사(Hope 와 Struhl, Cell 43：177-188, 1985) 및/또는 시험관내 번역 과정(Krieg와 Melton, Nucleic Acids Res. 12：7057-7070, 1984) 중에 발생될 수 있다. 전사중 mRNA를 캡핑하기 위하여, GTP에 비하여 과량의 디구아노신 트리포스페이트 또는 그의 동족체(예를 들어 Boehringer Mannheim Biochemicals 사로부터, m7G(5')ppp(5')G)를 RNA 중합반응중에 사용된다. 이러한 방법을 기초로 한 mRNA 캡핑 키트는 Stratagene 사 (캘리포니아)로부터 상용될 수 있으며, 이는 얻어진 RNA의 90%-95%가 캡핑된다는 것을 주장한다.

발현 유니트가 RNA-기재, 이를테면 QB 레플리카제 시스템이라면, 적은 RNA 복사체가 T7으로서 발생될 수 있으며 또는 신규 유전자 제조물이 DNA플라스미드를 포함한다면 다른 프로모터 시스템(참조 Lizardi 외, ibid, 1988)으로 발생할 수 있다. 일단 RNA 복사체가 존재한다면(또는 신규 유전자가 RNA 수준에서 결합된다면), RNA-지시 RNA 폴리머라제는 RNA 라이브러리의 실제 무제한 수의 복사체를 만들 수 있다(10 억개 복사체가 쉽게 성취될 수 있음). 그러나, 라이브러리의 다양성은 동일한 것을 유지한다. RNA파지, 이를테면 QB로서, 라이브러리는 DNA중간체를 쓸 필요없이 RNA 수준에서 스스로 이루어질 수 있다.

IV. RNA의 번역

여러가지의 시험관내 번역 방법이 광범위하게 알려져 있다. 편리하게도, 토끼의 망상 적혈구 또는 밀 배자 시스템이 적은 변형으로 사용될 수 있다. 시험관내 번역키트가 상용될 수 있다. 예를 들어, Boehringer Mannheim Biochemicals 사로부터 번역 키트, 망상 적혈구, 유형 I은 100개 번역 반응을 위한 모든 성분을 갖고 있다. 각 반응은 25μl의 부피에서 mRNA 약 1μg에 대하여 최적화된 바 있다. mRNA 1μg은 상기에 기재된 바와 같이 4×10¹²개 이상의 신규 유전자를 코드화하는데 충분하다. 따라서, 비교적 적은 부피에서 극히 높은 수의 신규 유전자를 번역할 수 있다. 예를 들어, 10¹³의 80S 리보솜은 단지 무게 약 66μg이다. mRNA의 작은 크기때문에, 단지 메시지당 적은 리보솜이 mRNA를 포화한다고 예상된다.

상기에 제시된 대표적 번역 키드에 대한 프로토콜에서 기재된 바와 같이, GTP 및 m7G(5') ppp (5') G는 시험관내에서 전사된 RNA의 효율적인 번역에 필요하다. 상기에 기재된 바와 같이, mRNA 캡핑이 이미 전사중에 수행된 경우에도, 번역 반응에 디구아노신 트리포스페이트(또는 그의 동족체) 및 구아닐일트란스퍼라제(Krieg와 Melton, ibid., 1984)를 첨가하는 것이 바람직하다. 전사중에 캡핑이 없는 경우, mRNA의 효율적인 번역을 위하여 두개의 시약이 필요하다. 특히, QB 제조물이 번역될 때, 번역중 RNA를 캡핑하는데 디구아노신 트리포스페이트(또는 그의 동족체) 및 구아닐닐트란스퍼라제가 필요할 수 있다.

번역 및 특히 mRNA에 리보솜 부착을 최적화하는데 또한 다른 기술이 이용될 수 있다. 예를 들어, 리보뉴클리아제 억제인자, 바와 같이테면 헤파린을 첨가하는 것이 바람직하다. 진핵 시스템, 이를테면 밀 배자 및 망상 적혈구 번역방법은 원핵 시스템과 유사 결과를 얻을 수 있다. 원핵 시스템은 보다 작은 리보솜 및 보다 쉽게 이용가능한 넌센스 서프레서인자 tRNA을 사용할 수 있는 장점을 갖고 있다. 이에 더하여, 원핵 세포에서 전사 및 번역은 종종 동시에 일어난다. 원핵에서 전사 및 번역의 커플링이 결핍시, mRNA 안정성은 크게 감소된다. 따라서, 전사 및 번역을 결합하는 원핵 시험관내 발현 시스템을 이용할 수도 있다.

상기에 기재된 바와 같이, 본 발명의 바람직한 유형은 억제인자 tRNA(특히 티로신-삽입 억제인자)의 이용이며, 이들은 재조합 DNA기술을 통하여 및/또는 돌연변이 세포주로부터 이들 분자의 부분 정제에 의하여 생성될 수 있다. 방사선 표지된 아미노산, 특히 S35-메티오닌은 시험관내 번역을 검측하는데 그리고 후속 단계에서 소량의 폴리솜을 찾는데 유용하다.

약 30-60분후에, 번역 반응에서 단백질 합성이 시작된다. 방사선 표지된 아미노산(이를테면 S35-메티오닌)의 이용 및 폴리펩티드 합성을 나타내는 TCA 바와 같이가능계수를 검측함으로서 제공된 세트의 번역조건에 대한 정밀시간을 측정할 수 있다. 단백질 합성의 개시후에, 최종 농도 1μg/ml에서 시클로헥시미드를 첨가하여 mRNA 위에서 리보솜의 이동을 방지한다(Lynch, Meth. Enzym. 152：248-253, 1987). 이러한 수준의 시클로헥시미드 및 5mM의 Mg⁺²농도는 mRNA-80S 리보솜-발생기 폴리펩티드 복합체 (폴리솜)을 유지하는데 사용될 수 있다. 다른 리보솜 억제인자는 또한 예를 들어 시클로헥시미드가 원핵 리보솜에서 가공되지 않을 것이므로 사용될 수 있다. 그러나, GPT의 결핍시, 리보솜으로부터 폴리펩티드의 유리가 정상적으로 발생되어서는 안된다.

V. 관심물질에 폴리솜 결합

발생기 펩티드가 결합하는 강력한 화합물의 목록이 실제로 제한되지 않는다. 이들 화합물을 컬럼, 매트릭스, 필터, 비드등에 연결하는 결합 화학은 화합물의 특성에 크게 의존할 것이다. 여러 경우에, 세포 성분, 이를테면 수용체 단백질 및 다른 세포막 결합분자에 결합하는 펩티드를 찾는데 완전 세포 또는 세포 단편을 이용할 수 있다.

많은 단백질 및 핵산에 대하여, 니트로셀룰로스 또는 유사 합성 표면에 결합은 필터 또는 섬유의 특성이다. 이들 경우에, 프로토콜에 의하여 관심 물질이 세포막에 접착된다. 그후 소의 혈청 알부민(BSA), 젤라틴, 카제인 또는 탈지유, 또는 다른 단백질성 물질을 과량 첨가하여 유리 표면 부위를 완전히 결합한다. 예를 들어, 마이크로타이터 접시내 니트로셀룰로스 디스크에 항체 용액을 위치시킴으로서 항체를 먼저 니트로셀룰로스에 결합시킨다. 니트로셀룰로스에 항체를 흡수시킨후, 니트로셀룰로스 디스크를 식염수가 함유된 신선한 마이크로타이터에 이동시킴으로서 세척한다. 세척후, 용액내에 젤라틴을 함유한 마이크로타이터 접시에 디스크를 위치시킨다. 그후 디스크를 식염수로서 다시 세척한다.

폴리솜이 관심물질에 결합하기 전에, 상기에 기재된 과량으로 사용된 BSA, 젤라틴, 및 특히 단백질성 물질(차단 단백질)에 대한 폴리솜 믹스를 예비흡수시하는 것이 바람직하다. 이와 같은 방식으로, 차단 단백질 또는 비특이적으로 어떠한 단백질에 결합된 폴리솜을 제거한다. 이러한 전흡수단계로 인해 관심물질에 결합하는 폴리솜의 훨씬 큰 특이성을 유도할 것이다. 특이항체(상기의 경우와 같이)에 결합하기 위하여, 전흡수단계는 바람직하게는 유사 서브클래스의 또다른 항체, 그러나 서로 다른 가변/과도가변 영역을 가진 항체를 포함할 수 있다. 일반적으로 항체에 결합하나 가변/과도가변 영역에 결합하지 않는 폴리솜을 스크링함으로서, 본 발명은 항-유전형 결합 단백질을 선택하는 것이 유용하다. 이러한 분자는 생물 또는 효소 활성(여러 가지 항-유전형 항체에 대하여 제시된 바와 같이)을 가질 수 있으며 또는 백신으로도 유용하다.

MgCl₂(5mM) 및 RN아제 억제인자, 이를테면 헤파린의 존재하에 관심물질에 폴리솜을 결합할 수 있다. 이에 더하여, 특수한 배양 변수 -- 저온 또는 고온, 높은 염 또는 낮은 염, 또는 서로 다른 pH -- 가 환경에 따라 조건적으로 결합하는 폴리펩티드를 지정하는데 이용될 수 있다. 배양시간은 관심있는 결합물질의 농도 및 이러한 물질의 특성에 따를 것이다.

VI. 관심 물질에 결합하는 폴리솜의 분리

폴리솜을 관심 물질에 선택적으로 결합시킨 후에, 비결합 폴리솜을 일반적으로 세척에 의하여 제거한다. 이러한 세척은 MgCl₂및 아마도 젤라틴, BSA, 또는 폴리솜의 비특이 결합을 감소시키는데 도움이되는 다른 단백질을 함유한다. 번역시 방사표지 아미노산이 사용된다면, 세척(연속 또는 병류)은 관심물질에 결합된 방사활성 계수에서 작은 검출변화가 관찰될 때까지 계속된다. 아미노산이 표지되어 있지 않다면, 세척은 폴리솜 용액의 적어도 10^-6희석액이 얻어질 때까지 계속된다.

조건-결합 신규 펩티드는 이들 세척후에 비결합을 위한 필요로 한 환경, 이를테면 보다 높은 온도, 다른 pH, 금속이온의 고농도, 또는 낮은 염농도로 폴리솜을 이동시킴으로서 분리될 수 있다, 제2의 (엄격한) 조건하에 결합하지 않은 펩티드는 용액으로 유리될 것이며 관심물질에 대한 강력한 조건-결합 인자를 나타낸다. 일단 고정화된다면, 조건-결합 펩티드는 관심물질을 정제하는데 이용될수 있다. 다른 방도로서, 조건-결합 펩티드는 환경적 변화를 모니터하는 시약으로 작용할 수 있다.

VII. 분리된 폴리솜의 분해

분리된(결합된) 폴리솜은 Mg⁺²의 제거에 의하여(희석에 의하여 또는 킬레이트제에 의하여) 또는 여러가지 방법(프로테아제, 클로로포름 등)에 의한 단백질을 파괴함으로써 쉽게 분리할 수 있다. 희석이 가장 쉬운 방법이지만, 그것은 다른 방법에 비교하여 폴리솜의 분해를 통하여 초래될 수 없다. 결합된 폴리솜을 Mg⁺²결핍 용액에 두면 mRNA를 유리하며; RN아제 억제인자가 바람직하다.

바람직한 환경하에 유리된 조건-결합 폴리솜을 유사한 형태로 처리하여 폴리솜을 분해하고 그들의 mRNA를 유리할 수 있다.

VIII. mRNA 회수 및 cDNA제조

이론적으로, 관심물질에 결합한 단일 폴리솜이 영역의 mRNA를 운반한다면, 그의 희귀 mRNA는 전체 mRNA라이브러리로부터 분리(회수) 될 수 있다. 용이한 분리를 위해, 여러가지 기술로 mRNA를 증폭할 수 있다.

DNA의 단일 복사체 및 희귀 mRNA에 대한 폴리머라제 사슬 반응 (PCR)이 잘 알려져 있다(재검토를 위하여, 참조 H.A. Erlich(ed.), PCR Technology, Stockton Press, New York, N.Y., 1989; M.A. Innis et al.(eds.), PCR Protocols; A Guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego, Calif., 1989; H.A.Erlich(ed.), Polymerase Chain Reaction：Current CommunTcations in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989). 간략히 말하자면, 먼저 mRNA를 표준수단으로 cDNA합성을 한다. 5' 및 3' 영역의 서열이 알려져 있으므로, 특히 프라이머가 cDNA합성에 이용될 수 있다. 둘째, 그후 특정 프라이머(심지어 cDNA합성에 사용된 것과 동일한 프라이머)의 이용을 통하여 단일 cDNA가 증폭될 수 있다. PCR에 사용된 프라이머가 최초 발현 유니트의 5' 및 3' 영역을 보존하는 서열을 포함할 수 있으며 -- 즉, 프로모터(예, T7 폴리머라제 인식서열) 및 3' 영역을 보존하는 서열이 바람직하다. 이러한 방식으로 발현 유니트를 재생성함으로서, 실제 모든 선택 유전자가 결합 펩티드를 코드화할 때까지 반복 희수의 전사-번역-폴리솜 선택이 수행될 수 있다. RNA 파지, 이를테면 QB를 기재로 한 발현 유니트에 대하여, 각 mRNA가 적합한 레플리카제를 이용하여 10억개 복사체 또는 그이상으로 복제될 수 있으므로 희귀 mRNA의 회수 및 증폭은 간단하다.

IX. 신규 유전자의 발현

일단 신규 유전자가 분리되고 서열이 알려지면, 그들 또는 관련 서열은 본 기술에 잘알려진 프로토콜에 의하여 (1) 클론화, (2) 화학적으로 재생, (3) 돌연변이화, 및 (4) 발현될 수 있다. 유전학적으로 처리된 미생물을 사용하여 재조합 DNA방법으로 신규 폴리펩티드를 대규모로 생산할 수 있다. 신규 결합 펩티드의 생체내 합성을 위한 매우 다양한 원핵 및 진핵 발현 시스템이 있다. 필요로 한 프로모터에 신규 유전자의 코딩 영역을 연결하는데 상기에 기재된 적합한 NcoI 부위 또는 다른 제한 부위를 사용할 수 있다. 그 외에 다른 유전자 스플라이싱법이 있다는 것이 본기술에 숙련된 자에게 명백할 것이다. 미생물에서 유전자의 적합한 발현을 위하여 번역 정지코돈 및 전사 종료서열을 신규 유전자의 3' 말단에 첨가할 수 있다. 그후 이와 같이 유전학적으로 처리된 서열을 플라스미드 또는 영역에 도입하고 형질전환, 형질도입, 감염, 전기영동, 미세주입, 또는 다른 유사방법에 의하여 유망한 숙주 세포내에 도입시킬 수 있다. 미생물로부터 분비할 수 있도록 신규 펩티드 서열을 신호 서열에 부착할 수 있으며, 및/또는 본 발명에서 기재된 바와 같이 얻어진 유전자 산물을 정량화하고 정제하기 위하여 ID 펩티드를 함유할 수 있다. 신규 펩티드 또는 관련 서열이 다른 번역 서열에 부착되어 유전공학 생물체에서 유사하게 발현되는 하이브리드 또는 융합 단백질을 형성할 수 있다. 대규모 시험관내 전사 및 번역방법을 사용하여 상업적 양으로 폴리펩타이드를 생성할 수 있다.

끝으로, 신규 펩티드의 아미노산 서열이 비교적 짧다면, 현재 이용가능한 기술은 폴리펩티드의 대규모 화학합성을 고려한다. 신규 펩티드의 화학합성은 시험관내 및 생체내 발현 시스템에 대하여 장점이 있다. 이들 장점 가운데 화학합성은 (1) 보다 잘 특정되어 있어 합성을 위한 더욱 재현가능한 시스템이며, (2) DNA 및 RNA의 오염원이 없으며, (3) 뉴클리아제, 프로테아제, 및 다른 변형 효소의 오염원이 없으며, (4) 합성후 비교적 순수한 생성물을 제공한다.

X. 특이 폴리솜에 대한 반복 집적화(enrichment)

관심물질에 폴리솜의 백그라운드, 비특이 결합량에 따라, 상기에 기재된 번역-전사-결합-회수의 수회 내지 다수의 사이클을 수행하도록 선택하여 필요로 한 폴리펩티드를 코드화하는 서열의 빈도를 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 각 사이클이 10⁴정도를 요망하는 신규 유전자의 빈도를 증가시킨다면, 그후 3회 사이클은 10^-12의 빈도에서 초기 라이브러리에 존재하는 서열을 분리하는데 충분하다. 각 사이클은 1일 내지 3일에 완료될 수 있으며; 자동화 워크스테이션, 또는 로봇에 의하여 본 공정의 많은 단계는 수행될 수 있다. 따라서, 일반적으로 많은 사이클은 1주 이내에 필요로한 결합활성을 성취한다.

XI. 폴리솜 결합없이 번역된 생성물의 활성 스크리닝

본 발명의 한가지 일예는 유전자 영역 위해 폴리솜의 결합을 필요로하지 않는다. 대신에. 리보솜으로부터 새로운 폴리펩티드의 유리되면서 시험관내 번역이 완료된다. 이것은 넌센스 코돈의 이용에 의하여 또는 mRNA말단으로부터 리보솜이 분리되면서 이루어진다. 번역 생성물을 농축시키기 위하여, 리보솜 및 번역 반응의 다른 성분으로부터 겔여과 및/또는 원심분리 및/또는 다른 수단에 의하여 새로운 펩티드를 분리할 수 있다. 그후 펩티드 혼합물을 생물학적 활성 또는 효소활성을 나타내는데 도전하며 --예를 들어, 성장인자가 결핍된 조직 배양세포에 펩티드를 처리함으로서 미토겐 활성에 대하여 시험한다.

신규 펩티드의 전체 배열 또는 서브셋내에서 생물활성 또는 효소활성이 관찰된다면, 초기 라이브러리 또는 그 라이브러리의 RNA 복사체를 세분하고 세분화에서 활성을 스크리닝함으로서 이러한 활성을 코드화하는 유전자의 위치를 알 수 있다. 연속 세분한 후에, 필요로한 유전자는 (예를 들어) 1,000개 이하의 서로 다른 서열을 함유한 풀로 분리될 수 있다. 이론적으로, 세분화에 의하여 필요로한 유전자를 완전히 분리할 수 있다(바로 한가지 유전자를 함유한 풀로). PCR, QB 레플리카제 또는 다른 방법(상기에 기재됨)으로, 시험관내 전사 및 번역이 생물/효소 활성을 가진 매우 농후한 펩티드 용액을 생성하는 수준으로 필요로한 서열을 증폭할 수 있다. 1-10^-3의 빈도에서, 관심 유전자는 쉽게 분리되며 현재 이용가능한 방법을 사용하여 적합한 발현 시스템으로 클론화될 수 있다.

XII. 신규 유전자 및 펩티드의 무세포 확인

추정 결합 또는 생물 활성이 있는 신규 유전자가 분리된 후에, 대규모 시험관내 번역을 하기에 충분한 mRNA가 생성되도록 DNA 및/또는 RNA를 증폭함으로서 영역된 서열이 관심있는 활성을 코드화한다는 것을 알 수 있다. 이와 같이 정제된 서열의 번역 생성물은 분석가능한 활성을 가진 거의 균질인 폴리펩티드이다. 신규 폴리펩티드의 조성을 확인하는 현존 방법에 의하여 유전자 및/또는 폴리펩티드의 서열을 확인할 수 있다. 다른 방도로서, 증폭 및 발현을 위하여 정제된 유전자를 미생물로 클론시킬 수 있다. 이어서, 신규 유전자 및 폴리펩티드에 대하여 서열 동일성뿐만 아니라 생물활성/결합활성을 수립할 수 있다.

XIII. 신규 하이브리드 단백질 생성

신규 유전자의 핵산 서열을 결정한 후에, 보다 큰 유전자에 이 서열을 병합시켜 하이브리드 단백질을 생성하며, 이는 신규 펩티드의 특성 및 다른 유용한 특성을 가지고 있다. 이러한 기술에 의해 제조되는 하이브리드 단백질의 한가지 군의 특징은 세포에 특이결합 및 세포독성 능력이다. 예를 들어, 세포 표면 수용체-결합 펩티드가 DNA스플라이싱 방법을 통하여 리신(ricin) 또는 다른 독소에 결합할 수 있다. 이와 같은 형태의 하이브리드 단백질은 병원체 및 종양세포를 비롯하여, 서로 다른 세포형을 선택적으로 사멸시키는데 이용될 수 있다. 하이브리드 단백질을 코드화하는 유전자를 완전히 합성하거나 적합한 유전자 단편을 다같이 스플라이싱함으로써 생성할 수 있다. 다양한 발현 시스템으로 이러한 유전자를 발현시킬 수 있다.

본 발명의 바람직한 유형은 관심 물질에 대하여 결합 활성을 코드화하는 신규 유전자 서열로서 항체 및 항체류 유전자의 가변 및 과도가변 영역을 대체하는 것이다. 이러한 방식으로, 관심 항원에 훨씬 큰 범위의 다양성의 부여가 가능하며; 동일 항원에 대한 단클론 항체의 제조방법 보다 스크리닝 방법이 훨씬 효율적이며 시간을 절약할 수 있다. 이들 통상의(custom) 하이브리드 항체 유전자는 다수의 유기체에서 발현되어 새로운 특이성 또는 특성을 가진 활성 항체를 생성할 수 있다.

XIV. 본 발명의 다른 상업적 용도

영역 시험에서 본 발명의 응용은 일클론/폴리클론 항체의 용도와 유사하며, 본 발명에서 기재된 신규 폴리펩티드의 분리는 상당히 적은 시간이 걸리므로(항체에 대하여 수개월에 대하여 일주일) 우선적으로 보다 유리하다. 이에 더하여, 다른 장점을 알 수 있다. 신규 폴리펩티드는 항체보다 상당히 적은 분자일 수 있다. 따라서, 항체에 비하여 신규 폴리펩티드의 합성, 정제, 및/또는 제조는 크게 단순하며 비용이 절감될 수 있다. 작은 크기는 안정성, 배합, 및 표적분자에 도달하는데 도움이 될 수 있다.

신규 폴리펩티드는 (1) 그들을 정량화 가능한 활성(이를테면 페록시다제 또는 다른 효소 활성)을 가진 생물학적 활성 펩티드에 융합시키고, (2) 상기에 기재된 바와 같이 현존 항체가 결합한다고 알려져 있는 ID 펩티드로서 그들을 합성하고, (3) 그들을 방사성물질로 표지하며, (4) 표시자, 이를테면 형광 염료 또는 금속 물질을 화학적으로 첨가하거나, 또는 (5) 상기의 조합에 의하여 확인될 수 있다. 신규 폴리펩티드의 진단 용도에서의 특이성을 증가시키기 위하여, 두가지 또는 그이상의 서로 다른 폴리펩티드가 사용될 수 있다. 이에 더하여, 항원 또는 기질에 경쟁결합에 의존하는 진단시험에서 신규 폴리펩티드가 경쟁적 결합 인자로 사용될 수 있다. 본 발명에 의하여 생성된 신규 폴리펩티드의 또다른 장점은, 몇몇 분자가 항체 형성을 일으키는 유기체의 거주 화합물에 너무 유사하거나 충분한 영역체를 형성하지 못하므로, 그들이 강한 면역반응을 일으키지 않는 다수 클라스의 분자에 결합할 수 있는 것이다. 이에 더하여, 진단 결합시험에서 신규 폴리펩티드 종래의 항체-기재방법의 용도보다 훨씬 넓은 범위의 용도를 가질 수 있다.

본 발명의 신규 폴리펩티드는 또한 최초로 분리된 채 또는 융합 단백질의 일부로서 치료에 사용될 수 있다. 예를 들어, 신규 폴리펩티드가 제공된 독소를 결합하는데 선택된다면, 그것은 또한 독소를 중화시킬 것이다. 신규 폴리펩티드가 세포막위의 비루스 수용체 부위 또는 비루스의 부착 기구에 결합된다면, 세포감염이 없어질 수 있다. 전술한 바와 같이, 독소뿐만 아니라 신규의 폴리펩티드 인식 서열을 운반하는 융합 단백질이, 질병 또는 악성 세포를 선택적으로 사멸시키는데 사용될 수 있다. 감염 또는 악성 세포에 신규 서열이 결합함으로써 세포-펩티드 복합체에 대한 면역 반응을 일으켜 질병억제에 유용하게 사용될 수 있다.

[실시예]

다음 실시예는 예시로만 제공되며 한정하지는 않는다. 실시예에서 활성을 오염하지 않는 (언제나 실제로) 표준 시약 및 완충액이 사용된다. 리보뉴클리아제 및 PCR 생성물의 오염을 방지하도록 주의하는 것이 바람직하다.

[실시예 1]

신규 유전자 라이브러리의 합성

신규 유전자 라이브러리를 생성하는 서열 및 방법은 본 기술에 숙련된 자에 의하여 주의깊은 계획을 필요로한다. 발현 유니트의 5' 미번역 영역은 RNA 폴리머라제 부위, 리보솜 결합부위, 개시코돈, 및 선택된 5' 미번역 서열을 함유한다. 본실시예에서 사용된 폴리머라제 결합 부위는 T7 프로모터 서열：TAATACGACTCACTATAGGGAGA (23-mer)이며, 이는 발현 유니트의 5' 말단에 위치한다. 토끼 망상 적혈구 시스템을 T7 프로모터로부터 합성된 RNA의 번역에 사용한다. 따라서, 리보솜 결합부위는 진핵 미번역 영역에 대한 공통 서열의 적어도 일부를 포함한다. 재검토 문헌에서, Kozak(ibid., 1987)은 매우 짧은 미번역 영역(10개 뉴클레오티드 이하)이 단백질 합성을 효과적으로 개시하지 못한다고 제안하고 있다. 36개 뉴클레오티드의 선택된 미번역 영역을 본 실시예에서 사용한다. 이와 같이 미번역 영역은 성체 토끼 헤모글로빈(알파-글로빈)의 자연-발생 (36-염기쌍) 상류 서열로부터 유래한다：

ACACTTCTGGTCCAGTCCGACTGAGAAGGAACCACCATGG

상기 서열에서 밑줄친 ATG는 메티오닌 개시 코돈에서 번역 시작을 나타낸다(Baralle, Nature 267：279-281, 1977). 토끼의 알파-글로빈 미번역 서열은 (1) 그것이 토끼의 망상 적혈구 시스템에서 유용한 기질이라고 예상되며 (2) 그것이 Kozak 모델 mRNA 의 중요한 모티프(motif)를 함유하므로 선택된다.

알파-글로빈 서열은 시험관내 유전자 발현을 위하여 다음 방식으로 번형된다. 첫째, 5'A(상기 밑줄)는 G로 대체되며, mRNA의 캡핑에 도움이 될 수 있다(Green 외, Cell 32：681-694, 1983). 둘째, G(알파-글로빈 서열에서 밑줄)는 A로서 대체되어 베타-글로빈 mRNA에 비하여 60%정도 단백질 합성의 개시를 감소시킨다고 가정되는 알파-글로빈의 미번역 영역에서 추정 제2구조를 제거하는데 도움이 된다(Baralle, ibid., 1977).이러한 2차 변화는 또한 5' 미번역 영역에서 적합한 GATC 제한 부위를 생성한다. 코딩 영역의 ATGG를 비롯하여 얻어진 리더 서열은 따라서 다음과 같다：

GCACTTCTGATCCAGTCCGACTGAGAAGGAACCACCATGG

이와 같은 리더 서열은 T7 프로모터로부터 바로 하류에 위치한다.

3'영역은 (1) 특이-프라이머-지시 DNA합성을 위하여 선택된 서열, (2) 관심 물질을 결합하는 발생기 폴리펩티드 공간 자유도를 제공하는 폴리글리신 사슬을 코드화 하는 GGG-생성영역, 및 (3) 얻어진 RNA 제2구조가 mRNA에서 리보솜의 전위를 방해할 수 있는 적합한 제한 부위를 함유한다. 폴리글리신 영역은 글리신에 대한 20개 코돈으로 이루어지며; 대부분의 글리신 코돈은 인접 GGG 삼중항이며, 이는 모든 번역 프레임에서 글리신을 코드화한다. 그러나, 몇가지 글리신 코돈은 적당한 레지스터에서 DNA사슬을 유지하는 GGT 또는 GGA 이다. Bam HI(GGATCC) 및 NotI(GCGGCCGC)에 대한 제한 부위는 유전자의 3' 말단에 매우 근접되게 위치하도록 선택되며; mRNA에서 이들 서열은 헤어핀 루프를 형성한다고 예상된다. NotI 서열에 의한(헤어핀 루프의) 제2-사슬 자기 프라이밍을 방지하기 위하여, AAAA의 첨가가 3' 말단에서 이루어진다. 따라서 3' 영역은 GGATCCGCGGCCGCAAAA에 이어진 일반 서열(GGG 또는 GGT/A)₂₀을 갖고 있다. 이러한 영역에 대한 특이 서열은 다음에 제시된다.

세미-랜덤 유전자 서열은 완전 기재된 5' 미번역 영역 및 3' 영역 세그먼트와 염기상 및 접합을 수행하는 공지의 5' 및 3' 꼬리부와 합성된다. 이 목적을 성취하기 위하여, 세미-랜덤 유전자가 5' 미번역 영역의 보충 사슬위에 옥타머 CCATGGTG와 염기쌍일 수 있는 5' CACCATGG와 합성된다. 개시 (처음)코돈, ATG는 세미-랜덤 서열의번역에 필요하다. 뒤이은 G는 제2코돈의 처음 위치이며 유전자의 전면 말단에서 NcoI 부위를 계속 보존한다. 이와 같은 제2코돈의 나머지 및 다음의 28개 코돈은 넌센스 삼중항을 감소시키기 위하여 이전에 요약된 규칙에 따라 합성된다. 즉, 제1코돈 위에서 C, A, 및 G의 동일 몰량이 사용되나 단지 T는 양 반이 사용된다. 제2코돈 위치에서, A의 양은 다른 세개 염기수준의 반으로 감소된다.

제3의 코돈 위치에서, 단지 G와 C가 동일 몰량으로 사용된다.

코돈 30이 합성된 후에 GGTGGGGG를 첨가한다. 이 서열은 두개의 글리신 잔기를 코드화하며 3' 영역에 세미-랜덤 서열을 접합하는데 사용되며, 반대쪽 사슬에 보충 CCCCCACC 오버행을 갖고 있다. 이러한 합성결과는 실제 모든 30개 아미노산 폴리펩티드(메티오닌으로 시작)를 코드화하며 폴리글리신 사슬을 가진 서열이다. 이러한 삼중항 사슬에서 비정지 코돈의 확률은 약 80%이다. 후속 번역중에 부분적으로 정제된 효모 티로신-삽입 UAG억제인자 tRNA (Pelham, ibid., 1978)를 사용함으로서 세미-랜덤 서열의 90% 이상이 완전-길이의 폴리펩티드를 코드화한다고 예상된다.

합성하는 특이 올리고뉴클레오티드가 다음에 제시된다.

I. T7 프로모터 및 글로빈 리더(유전자 합성 및 PCR 용);

5'TAATACGACTCACTATAGGGAGAGCACTTCTGATCCAGTCCGACTGAGAAGGAAC3'-OH

II. 항-T7 프로모터 및 글로빈리더(유전자 합성용)：

5'CCATGGTGGTTCCTTCTCAGTCGGACTGGATCAGAAGCTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA3'-OH (T4 폴리뉴클레오티드 키나제로서 키나제화된 5')

III. 세미-랜덤 유전자(유전자 합성용)：

5'CACCATGG...기재된 세미-랜덤 ...GGTGGGGG3'-OH(T4 폴리뉴클레오티드 키나제로서 키나제화된 5')

IV. 폴리-글리신 및 3' 제한 부위(유전자 합성용)：

5'-TGGGGGTGGTGGGGGGGGGGGGGAGGAGGGGGGGGGGGAGGGGGAGGTGGTGGATCCGCGGCCGCAAAA3'-OH

(T4 폴리뉴클레오티드 키나제로서 키나제화된 5')

V. 항-폴리-글리신 및 3' 부위(유전자 합성용)：

5'-TTTTGCGGCCGCGGATCCACCACCTCCCCCTCCCCCCCCCCCTCCTCCCCCCCCCCCCCCACCACCCCCACCCCCACC3'-OH

VI. 항-폴리-글리신 및 3' 부위(cDNA합성 및 PCR 용)：

5'TTTTGCGGCCGCGGATCCACCACCTCCC3'-OH

서열 I 및 II를 표준 TE 완충액에서 동일 멀량으로 혼합한 다음 65℃에서 5-10분간 가열한다. 보충 서열(5' 미번역 영역으로 이루어짐)를 50°-60℃에서 1시간 또는 그이상 동안 아닐시키고, 상온으로 천천히 냉각시키고, 그후 0°-4℃에서 저장한다. 서열 IV 및 V는 유사하게 처리되어 이중-사술 3' 영역을 형성한다. 이들 듀플릭스(duplex)는 서열 III의 공지 꼬리부에 보충되는 8개-염기, 단일-사슬 오버행 서열을 갖고 있다.

I/II 듀플릭스, IV/V 듀플릭스, 및 세미-랜덤 서열 III의 동일몰량을 리가제 완충액에서 T4 DNA리가제로서 13°-15℃에서 밤새 접합시킨다. 그후 접합 혼합물을 1.5% 아가로제 겔에 이동시켜 필요로한 접합 생성물을 분리해내며, 이는 약 200 염기쌍이다(완전히 이중 사슬될 때 233bp는 아님). 200bp DNA밴드를 NA45 페이퍼(S S)로서 또는 어떠한 여러가지 프로토콜에 의하여 겔 정제한다. 총 2.5μg(약 10¹³의 DNA 분자를 나타냄) 또는 그이상이 바람직하다.

신규 유전자의 완전 이중-사슬 코돈은 표준 방법을 이용하여 DNA폴리머라제 I, 클레노우(Klenow)로서 성취된다. 이중-사슬 3'영역은 세미-랜덤 서열의 제2-사슬 합성을 위한 프라이머를 제공한다. 새로 합성된 DNA를 서열 II로 결합하는데 DNA리가제를 사용하며, 따라서 제2사슬에 닉(nick)을 충전한다. DNA라이브러리를 페놀/클로로포름 추출하고 에탄올 침전시킨다.

완전 이중-사슬 DNA분자 10μg은 서열 다양성 4×10³이다. 이러한 라이브러리를 그후 T7 RNA 폴리머라제로서 전사하여 번역 가능한 mRNA를 얻는다. 그러나, 각 전사로서, DNA복사체가 만들어지지 않는다면 DNA라이브러리가 소모된다. DNA라이브러리를 복제하기 위하여, 100ng의 부분 표본을 각각 200-μl 반응에서 PCR 증폭을 위하여 500-μl 튜브에 분배한다. PCR 기술, pp. 18-19(Erlich, ibid., 1989)에 따라, 각각의 200-μl PCR 반응은 각 부분표본에서 DNA약 5.2μg--또는 약 50배 DNA복제물을 얻는다. 부분 표본을 결합한다. 결합된 시료는 평균 50 복사체의 각 세미-랜덤 서열을 함유하며 따라서 T7 RNA 폴리머라제로서 각 번역을 위한 큰 다양성 상실없이 반복적으로(예를 들어, 50회) 사용될 수 있다. 라이브러리가 PCR로서 복제된다면, 그후 상기에 기재된 클레노우 충진 및 접합단계는 Taq 폴리머라제가 갭을 충전할 수 있으며 닉-번역(nick translation)DNA이므로 필요치 않을 수 있다(D.H. Gelfand, PCR Workshop, Society of Industrial Microbiology Meeting, Seattle, Wash., 1989). 닉 번역후에, 유전자를 이중 사슬하며 PCR 증폭될 수 있다.

DNA라이브러리의 다를증폭을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머의 실예가 서열 I과 VI으로 상기에 기재되어 있다. 일반적으로, 25-30개 염기의 올리고뉴클레오티드가 PCR 증폭을 위하여 사용되며; 그러나, 보다 긴 프라이머가 사용될 수 있다. 프라이머가 상당한 상동성 또는 상보적인 3' 말단을 공유하지 않는다는 것이 중요하다. 서열 I 및 VI은 보통 말단 및 광범위한 명백한 상동영역을 갖고 있지않다. 이에 더하여, 이들 신규 유전자 서열의 번역후에, 얻어진 mRNA는 T7 프로모터 서열을 결핍하고 있다. 제1-사슬 cDNA합성을 위한 프라이머로서 서열 VI을 사용한다. 제2-사슬 합성을 위한 프라이머로서 서열 I을 사용하며 T7 프로모터를 cDNA로 복귀시킨다. 이러한 방식으로, 다음회의 번역은 선택된 신규 유전자 서열위에서 가능하다. 얻어진 cDNA가 비교적 소수라면 PCR 증폭이 필요할 수 있다.

[실시예 2]

신규 유전자의 전자

실시예 1에 기재된 DNA라이브러리 (또는 그들 서열의 대표적 부분표본)을 T7 RNA 폴리머라제로서 전사한다. 이러한 DNA2.5μg은 거의 10¹³의 서로 다를 폴리펩티드를 코트화한다. 제조업체의 사양에 따라 스트라타겐(Stratagene)의 mCAP^TM키트로서 전사중에 DNA를 캡시킨다. 약 5-10μg의 mRNA가 예상된다. 일반적으로, T7 RNA 폴리머라제로서 이와 같은 수준의 RNA 10 배가 합성되며; 그러나, 캡핑 반응을 위한 조건은 이 경우에 mRNA 생성을 제한한다. DNA를 키트로 제공된, DN 아제 I로서 제거한다. 캡mRNA를 페놀/클로로포름 추출하며 에탄올로 침전시킨다. RNA를 TE 10μl에 재현탁시키고 0°-4℃에서 저장한다.

[실시예 3]

신규 유전자의 번역

캡 mRNA를 모든 20개 아미노산과 함께 각각 312.5μmol/l에서 Boehringer Mannheim Biochemical 사의 토끼 망상 적혈구 키트로서 번역한다. 실시예 2로부터 캡 mRNA를 반응당 0.5μg에서 각 반응에 첨가하고 제조업체의 프로토콜에 따라 처리한다. 30℃에서 60분경후에, 시클로헥시미드를 최종 농도 1μg/ml로 첨가한다. MgCl₂를 5mM로 조정하고, 헤파린을 0.2mg/ml로 첨가한다. 반응물을 결합하고 Lynch(ibid., 1987)에 따라 불연속 수크로스 기울기로 넣는다. 폴리솜을 -70℃에 동결시키거나 바로 사용할 수 있다.

[실시예 4]

관심 물질로서 항체의 부동화

신규 결합 펩티드를 위하여 선택하는데 항체를 사용할 수 있다. 항체(항-id 펩티드)의 과도 가변/가변 영역에 결합하는 펩티드는 면역원으로서 사용된 초기 에피토프처럼 작용할 수 있다. 신규 항-id 펩티드가 초기 에피토프를 모방하므로, 이들 펩티드는 백신으로서 유용하며 그리고/또는 항-id 항체가 생물(때로 촉매)활성을 가진다고 보여진 것과 동일한 방식으로 생물활성을 입증할 수 있다.

유용한 항체의 일예는 항-히브로넥틴, 항-신경성장인자, 항-CD4, 및 항-종양 다를인자이며, 이들은 모두 Boehringer Mannheim Biochemicals 사로부터 얻을 수 있다. 일반적으로, 수용체 분자, 성장인자, 표면 항원, 및 생물 활성 펩티드에 대한 항체, 그외에 독소 및 질병에 대한 중화 항체는 둥근 또는 길항근 특성을 가지고 있거나 또는 백신으로서 작용할 수 있는 항-id 결합 펩티드를 분리하는 양호한 부호들이다.

항체를 Pluskal 외(BioTechniques 4：272-283, 1986)에 따라 Millipore Corporation 사로부터 임모빌론(Immobilon^TM) PVDF(폴리비닐리덴 디플루오라이드)에 부착한다. 예를 들어, 항-피브로넥틴 항체(클론 3E3으로부터, Boehringer Mannheim Biochemicals)를 PVDF의 0.5cm×0.5cm 스퀘어에 흡수시키고, 그것을 100% 메탄올로 습윤화하고 10mM 트리스 완충액 pH 7.4 (식염수 완충액)에서 0.9% (w/v) NaCl로서 2회 세척한 바 있다. 필요한 항체의 양은 필요로한 항-id 펩티드의 결합 변수에 의존하며; Immobilon^TMPVDF가 1gG 172μg/cm²를 결합한다고 보고되고 있다. 편리하게도, 식업수 완충액에서 항-피브로텍틴 IgG₁1μg을 상온에서 적어도 두시간 동안 배양함으로서 PVDF 스퀘어에 흡수시킨다. 그후 PVDF를 식염수 완충액으로 2회 세척한다. 젤라틴이 PVDF의 미점유 부위로 흡수되도록 세포막을 상온에서 적어도 두시간 동안 식염수 완충액내 5%(w/v) 젤라틴을 함유한 차단 용액으로 배양시킨다. 그후 세포막을 식염수 완충액내 0.1% 젤라틴으로 2회 세척한다. 유사한 처리를 10μg의 항-케라틴 항체(클론 AE1으로부터, Boehringer Mannheim Biochemicals)로서 수행하며, 이는 다음에 기재된 억제 IgG₁이다.

[실시예 5]

항체에 폴리솜 결합

발생기 세미-랜덤 펩티드가 있는 폴리솜을 1-ml 반응물에서 배양시키고, 각각은 PS 완충액(0.9% NaCl, 10mM Tris pH 7.다를, 1% 젤라틴, 15mM MgCl₂, 0.2mg/ml 헤파린, 및 1μg/ml 시클로헥시미드) 및 실시예 4에 기재된 10μg의 항-케라틴 IgG₁이 있는 PVDF 스퀘어를 함유한다. 이와 같은이와 같은수 단계를 0°-4℃에서 완속 교반하에 4시간 수행시켜 젤라틴 및 IgG₁에 폴리솜의 비특이 결합을 선택한다. 항-케라틴 PVDF 스퀘어를 보석가공인의 겸자로서 제거하고 항-피브로넥틴 PVDF 스퀘어로서 대치한다. 혼합물을 동일 조건하에 4시간 더 배양시켜 항-피브로넥틴 항체의 가변/과도 가변영역에 특히 폴리솜 결합을 허용한다. 항-피브로넥틴 PVDF 스퀘어를 제거하고 그것을 연속적으로 신선한 PS 완충액에 전이시킴으로서 3회 세척한다.

[실시예 6]

폴리솜으로부터 항-ID 펩티드를 코드화하는 신규 유전자의 회수

세척된 항체-결합 폴리솜을 보유하는 PVDF 막을 0.1mM EDTA 100μl 가 함유된 튜브에 전이시키고 상온에서 5-10분간 부드럽게 교반시켜 폴리솜을 분해하고 mRNA를 유리시킨다. PVDF를 제거하고, 0.1mM EDTA의 새 튜브에 넣은다음, 0°-4℃에서 밤새 또는 그이상 저장한다(백업으로서). 처음의 EDTA 처리로부터 유리된 mRNA를 역다를시키고; 얻어진 cDNA를 약간의 변형으로서 PCR Technology(ibid., 1989), p. 91에 따라 증폭시킨다. cDNA합성을 프라이밍하기 위하여 랜덤 헥사머를 이용하는 대신에, 공지의 3' 영역 보충 서열(이를테면 하류 프라이머로서 이전에 기록된 서열 VI)를 cDNA합성 및 PCR 반응 두가지 모두를 위하여 사용한다. 역 트란스크립타제 단계를 다른 시약의 적합한 상대량이 있는 PCR 완충액 100μl에서 수행한다(20-μl반응 대신에). 역 트란스크립타제 반응후, 혼합물을 20μl 부분 표본으로 분리하고; 각 부분표본을 서열 I 또는 유사 DNA상류 프라이머를 이용하여 PCR Technology에 기재된 바와 같이 바와 PCR 증폭후에, 5개의 부분표본을 결합하고, 페놀/클로로포름 추출한 다음, 에탄올 침전시킨다. 그후 이러한 cDNA를 TE에 재현탁시킨 다음 0°-4℃에 저장한다.

선택된 DNA를 T7 RNA 폴리머라제로서 다를한 다음 이전에 기재된 바와 같이 망상 적혈구 시스템에서 번역시킨다. 이러한 다를, 필요로 한 서열을 초기 DNA라이브러리와 비교하여 크게 증폭시킨다. 프로그램 가능한 워크스테이션의 이용을 통하여 크게 도움이된 이러한 사이클의 반복에 의하여, 유망한 신규 유전자를 종래의 클로닝 및 발현 방법이 실질적인 수준으로 농축시킨다. 이에 더하여, 유전자의 저 포이슨(Poisson) 분포로 희석에 의하여, 단일 신규 유전자를 분리하고, 증폭하며, 전자시킨 다음, 번역하여 유전자 산물의 특이 결합 능력을 제시할 수 있다. 일단 결합이 알려진다면, 분리된 유전자 및 폴리펩티드가 확인을 위하여 서열화될 수 있다.

신규 결합 펩티드의 서열이 알려진 후에, 본 발명에서 기재된 펩티드의 조작 및 대규모 합성에 대하여 많은 방법이 존재한다.

[실시예 7]

결합 펩티드에 대한 경쟁시험

결합 펩티드를 코드화하는 신규 유전자를 선택한 후에, 회수된 cDNA의 증폭 풀을 유전자 존재에 대하여 시험한다. ID 서열이 세미-랜덤 DNA서열로서 동시 발현되는 것이 의도적으로 포함되는 경우에 펩티드의 공지 부분에 대한 ELISA 또는 다른 면역시험이 관심 물질에 펩티드의 신규 부분의 결합을 검출하는데 이용된다. 그러나, ID 서열이 존재하지 않으며 그리고/또는 결합 특이성의 확인이 바람직한 때, 펩티드에 대한 경쟁시험을 수행한다. 경쟁 ELISA 시험을 비롯한 경쟁시험은 본 발명에 의하여 발생된 다양한 cDNA풀내에 결합 서열의 존재에 대하여 검측하는데 이용된다.

한가지 일예는 항-소이도모나스 엑소독소(항-PE) 항체를 결합하는 펩티드를 코드화하는 유전자에 대하여 cDNA풀의 스크리닝이다. 항-PE 항체에 결합하는 폴리솜에 대한 2회의 선택후에, 얻어진 cDNA풀의 서로 다른 부분표본을 각각 표준 조건하에 T7 RNA 폴리머라제 (30단위)로서 200-μl 반응에서 전사시키고, 약 200ng의 DNA로서 시작한다. mRNA 생성물을 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올 추출한 다음 -20°에서 나트륨 아세테이트 및 에탄올로 침전시킨다. 침전물을 각각 원심분리한 다음 증류수 16μl에 재현탁시키고 디에틸피로카르보네이트로서 처리되어 뉴클리아제를 제거한다.

재현탁 mRNA를 65°로 5분간 가열한 다음 얼음위에 넣는다. RNA를 제조업자의 권고에 따라 밀 배자키트(Boehringer Mannheim Biochemicals)로서 번역시켰다. 각 RNA 시료를 35S-메티오닌 25 마이크로큐리 및 RN아제 억제인자 0.5μl 와 50μl 번역 반응물에서 발현시켰다. 각 30°에서 15-60분간 반응시켰다. 번역 종료시에, 시료를 각각 동일하게 분리하였고：경쟁기질없이 한쪽 반을 관심물질을 결합하는데 사용하였고, 반면에 나머지 반쪽은 과량의 경쟁 물질의 존재하에 관심 물질을 결합하는데 사용하였다. 이러한 다를에, 관심 물질은 항-PE 항체이었다. 경쟁물질은 14-아미노산 펩티드(PE 펩티드)이었고, 이는 독소 단백질 서열로부터 유도되며 항체를 결합하는 것으로 알려져 있다. PE 펩티드 서열은 Val-Glu-Arg-Leu-Leu-Gln-Ala-His-Arg-Gln-Leu-Glu-Glu-Arg 이다(참조 Wozniak, 외, Proc. Natl. Acad. Sci., 85：8880-8884(1988).

편평한 밑면을 가진 96-웰 마이크로 접시내 얼음위에서 경쟁시험을 수행하였다. 표준 1/4 인치 홀펀치로서 임모빌론 PVDF 디스크를 만들었고 A 표지 웰에 넣었다. 메탄올 50μl를 A 디스크에 첨가시켜 세포막을 습윤화하고 살균하였다. 디스크를 겸자로서 전이시켜 식염수 완충액 플러스 10mM MgCl₂(TSM 완충액) 200μl를 함유한 웰 B에 전이시켰다. TSM 200 μl를 또한 함유한 웰 C에 디스크를 이동시킴으로서 디스크를 추가로 세척하였다. 그후 TSM 25μl 플러스 항-PE 항체 3μl(4.6μg/μl)를 함유한 웰 D에 이동시켰다. 항체를 완속 회전(플랫폼 교반기위 50-100 RPM)과 함께 얼음위에서 3시간 동안 디스크에 흡수시켰다. 후에, 2% 뉴클리아제 없는 BSA 75 μl를 D에 첨가한 다음 100 RPM에서 1hr 동안 흡수시켰다.

각 웰에서 TSM 200μl 플러스 0.1% BSA(웰 E 및 F)200μl로 30분간 디스크를 2회 세척한 다음 펩티드 결합을 준비하였다. 웰 G에서 TSM 플러스 0.1% BSA 26 μl를 상기에 기재된 각 번역 반응물 25μl -- 밀 배자 시스템 50μl의 반과 혼합하였다. G 웰의 각각 반쪽에 PE 펩티드 1μl (TSM에서 1mg/ml)를 첨가시켜 신규의 방사활성표지 펩티드의 항체결합을 경쟁적으로 억제하며; 이들 웰을 +펩티드로 표지하였다. 억제 G 웰에 다를 1μl를 첨가한 다음 그 웰을 펩티드 무로 표시하였다. 디스크를 적합한 G웰에 넣은 다음 부동화된 항체에 결합하는 펩티드에 대하여 얼음위에서 100 RPM에 3시간으로 배양시켰다.

결합 반응후에 각 디스크를 각 세척에 대하여 10분간 배양과 함께 0°에서 신선한 TSM 200μl에서 8회 연속 세척하였다. 각 디스크에 대하여 결합 방사활성을 Ecoscint 1ml 칵테일이 있는 액체 섬광 계수기에서 측정하였다. 다음의 표는 폴리솜의 항-PE 항체에 결합으로부터 얻다를DNA의 서로 다른 부분표본에 대한 경쟁시험 결과를 리스트한다.

각 경우에 경쟁 PE 펩티드는 펩티드 무 억제와 비교하여 선택된 cDNA풀의 방사활성 표지 번역 생성물의 결합량을 감소시켰다. 이들 결과는 항-PE 항체에 결합 펩티드를 코드화하는 유전자 서열의 존재를 나타낸다. 그후 이들 DNA서열의 분리 및 특성화를 각 유전자를 플라스미드, 이를테면 pUC18, pUC19, 블루에스크립트(Bluescript), 및 많은 다른 이용가능한 벡터로 클론화함으로서 수행한다.

이전부터 본 발명의 구체적 유형이 예시 목적으로 기재된 바 있지만, 여러가지 변형이 본 발명의 정신 및 범위로부터 벗어남이 없이 이루어질 수 있다. 따라서, 본 발명은 다음 청구범위에 의하여 예외로 국한되지 않는다.

Claims

RNA폴리머라제 결합 서열, 리보솜 결합서열, 번역개시신호를 함유하는 5' 미번역영역과, 한가지 또는 그 이상의 세미-랜덤 뉴클레오티드 서열로 구성된 세포외(in vitro) 발현 유니트에서 복제 또는 전사하여 m-RNA 라이브러리를 생성하는 단계; 부착된 폴리펩티드 사슬을 가진 폴리솜을 유지하는 조건하에서 m-RNA 라이브러리를 번역하는 단계; 관심 폴리펩티드와 특이적으로 반응할 수 있는 물질에 폴리솜을 접촉하는 단계; 및 관심 물질과 특이적으로 반응한 폴리솜으로 부터 m-RNA를 분리하는 단계로 이루어지는, 관심 폴리펩티드를 다를하는 뉴클레오티드 서열을 분리하는 방법.
제1항에 있어서, 추가로 폴리솜으로부터 분리된 mRNA로 부터 cDNA를 제조하는 것이 특징인 방법.
제1항에 있어서, 추가로 제조된 cDNA를 증폭하는 것을 포함하는 것이 특징인 방법.
제1항에 있어서, 상기 세미-랜덤 뉴클레오티드 서열이 DNA 또는 RNA인 것이 특징인 방법.
제1항에 있어서, 상기 발현 유니트가 하나 이상의 RNA-지시 RNA 폴리머라제 인식서열을 포함하는 것이 특징인 방법.
제1항에 있어서, 추가로 폴리솜으로 부터 분리된 mRNA를 RNA-지시 RNA 폴리머라제로 증폭하는 것을 포함하는 것이 특징인 방법.
제1항에 있어서, 상기 관심 물질에 결합되지 않은 폴리솜을 연속적인 희석 또는 병류 세척 단계로 제거하는 것이 특징인 방법.
제7항에 있어서, 비결합 폴리솜을 제거하는 단계 다음에, 관심물질이 결합된 상기 폴리솜을 선택된 가혹한 조건에 노출시켜 폴리솜을 관심물질로부터 유리시키는 것이 특징인 방법.
제1항에 있어서, 상기 발현유니트가 추가로 선택된 아미노-말단 인식(ID) 펩티드를 코드화하고 개시코돈의 3' 말단부에 위치하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것이 특징인 방법.
제1항에 있어서, 상기 발현 유니트가 제한효소부위, 회문형 서열, 인식 펩티드를 코드화하는 서열, 특이적-프라이머-지시 DNA 합성을 위한 서열, 폴리 A+ 또는 다른 호모폴리머 폴리뉴클레오티드 서열중에서 선택된 폴리뉴클레오티드의 3' 영역을 포함하는 것이 특징인 방법.
제1항에 있어서, 상기 발현 유니트가 T7폴리머라제, T3폴리머라제 또는 SP6 폴리머라제에 대한 프라이머 서열을 포함하는 것이 특징인 방법.
제1항에 있어서, 세미-랜덤 뉴클레오티드 서열이 자연-발생 DNA 또는 RNA를 기계적으로, 화학적으로 또는 효소적으로 단편화하여 생성되는 것이 특징인 방법.
제12항에 있어서, 상기 뉴클레오티드를 화학적으로 합성하는 단계가 (1) 첫번째 코돈위치에서 대체로 동등한 몰양으로 C, A, G를 그리고 대체로 동등한 몰양의 반만으로 T을 사용하는; (2) 두번째 코돈위치에서 대체로 동등한 몰양으로 C, T, G를 그리고 대체로 동등한 몰양의 반만으로 A을 사용하는; (3) 세번째 코돈에서 대체로 동등한 몰양으로 C 및 G 또는 T 및 G를 사용하는 단계로 이루어지는 것이 특징이 방법.
제1항에 있어서, 상기 관심 물질이 표면 항원, 수용체 단백질, 독소, 유기 중합체, 대사물질, 단백질 분자의 활성부위, 호르몬, 항체, 항체의 가변성/과도가변성 부위 및 오염물질로 구성된 군에서 선택되는 것이 특징인 방법.